CN1311819A - 胰岛素样生长因子结合蛋白变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及天然胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP－3)的变体。本发明公开了经过修饰、对水解具有抗性的IGFBP－3变体。本发明还公开了天然IGFBP－3中的核定位信号(NLS)被改变的IGFBP－3变体。此外,本发明公开了氨基端延伸的IGFBP－3,它们包括各种N－末端延伸,包括肽和核苷酸结合区域、特异性结合成员例如来自受体的配体结合区域或来自免疫球蛋白的抗原结合区域、以及肽和蛋白激素和生长因子。N－末端延伸的IGFBP－3可包含水解抗性或NLS变异的IGFBP－3。

Description

胰岛素样生长因子结合蛋白变体
本申请根据35U.S.C§119(e)要求1998年6月1日提交的美国临时申请No.60/087,559的优先权，该临时申请的内容在此全文引入作为参考。
                      技术领域
本发明涉及胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)变体的变体，特别是涉及对水解具有抗性的IGFBP-3变体、具有被改变的核定位序列的变体以及具有N-末端延伸的变体。
                      技术背景
生长因子是能够在靶细胞的确定群体中激发广泛的生物应答(例如DNA合成、细胞分裂、特殊基因表达等)的多肽。已经有多种生长因子得到了鉴定，包括转化生长因子β家族(TGF-βs)、表皮生长因子和转化生长因子(TGF-αs)、血小板衍生生长因子(PDGFs)、成纤维细胞生长因子家族(FGFs)以及胰岛素样生长因子家族(IGFs)，后者包括IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ。
IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ在氨基酸序列和结构上相关，它们各自的肽链都具有大约7.5千道尔顿(kDa)的分子量。IGF-Ⅰ介导生长激素的主要作用，并因而是出生后生长的主要介导者。IGF-Ⅰ也涉及各种其他生长因子的作用，因为用这些生长因子处理细胞可导致IGF-Ⅰ的产生增加。与此相对，IGF-Ⅱ被认为在胎儿生长中起主要作用。IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ都具有胰岛素样活性(它们因此而被命名)，并都对神经组织中的细胞具有丝分裂原性(刺激细胞分裂)。
几乎所有的IGF都在一种非共价连接的IGF-Ⅰ、胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)和一个被称为酸稳定亚基(ALS)的较大蛋白亚基的复合物中循环，这样只能检测到非常少的游离IGF-Ⅰ。这种三元复合物由等摩尔数的三种组分组成。ALS没有直接的IGF结合活性，并显示只与IGF/IGFBP-3复合物结合(Baxter等《生物化学杂志》264(20):11843-11848,1989)，虽然有些报道提出，IGFBP-3能够在没有IGF的情况下与大鼠ALS结合(Lee等《内分泌学》136:4982-4989,1995)。IGF/IGFBP-3/ALS三元复合物的分子量约为150kDa，并且与IGF/IGFBP-3二元复合物或单独的IGF相比，在循环中具有显著增加的半衰期(Adams等《生长因子研究进展》6(2-4):347-356,1995年收稿，1996年发表)。这种三元复合物被认为其作用为“IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ的库和缓冲，防止游离IGF浓度的快速改变”(Blum等(1991)《现代胰岛素样生长因子概念》中的“血浆IGFBP-3水平作为临床指标”381-393页，E.M.Spencer编辑，Elsevier,New York)。尽管循环中基本上没有过量的(未结合)IGFBP-3，但的确有相当过量的游离ALS存在(Baxter,《临床内分泌代谢杂志》67:26-272,1988)。
应当指出的是，尽管IGFBP-3是最丰富的IGF结合蛋白(“IGFBPs”)，但在各种组织和体液中至少已鉴定了5种其他不同的IGFBPs。虽然这些蛋白结合IGFs，但它们源于单独的基因，并具有不同的氨基酸序列。不象IGFBP-3，其他的循环IGFBPs没有被IGFs饱和。IGFBP-3是唯一能够与IGF和ALS形成150 kDa三元复合物的IGFBP。IGFBP-3的IGF和ALS结合区被认为位于蛋白的N-末端部分，因为从血清中分离的蛋白N-末端片段仍保留这些结合活性。但是，一些其他IGFBPs也已被建议与IGF-Ⅰ组合用作治疗药物。
IGF/IGFBP-3复合物已被建议用于治疗广泛不同的紊乱(见诸如，美国专利5,187,151、5,527,776、5,407,913、5,643,867、5,681,818和5,723,441以及国际专利申请WO95/03817、WO95/13823和WO96/02565。Celtris Pharmaceuticals,Inc.也正在开发IGF-I/IGFBP-3复合物用于治疗几种症状，包括烧伤恢复和髋骨骨折术后恢复。
IGFBP-3或任何蛋白用作一种药物的组分的前提是，该蛋白在贮存条件下是稳定的。许多蛋白在蛋白中含有“Asp-Pro”序列的位点对非酶促水解敏感，尽管不是所有含Asp-Pro的蛋白都敏感，也不是蛋白中所有Asp-Pro位点都对水解敏感(见诸如，Shahrohk等，1994《药物研究》11(7):936-944)。任何给定的Asp-Pro序列对水解的敏感性似乎依赖于该位点在折叠蛋白中的局部环境。如果Asp-Pro位点不在能够接近溶剂的位点，并且不受异构作用的限制，则该位点可能对水解敏感。非常明显，没有已知的三维结构，就无法预测蛋白中Asp-Pro序列对水解的敏感性。IGFBP-3还没有被报道对非酶促水解敏感，而且IGFBP-3的三维结构也不清楚，因此无法预测其敏感性。
几份报告提出，IGFBP-3具有自己的、与IFG受体分开的细胞受体，并且具有自己的一套生物活性(Nickerson等，1997,《生物化学生物物理研究通讯》237(3):690-69；Rajah等，1997,《生物化学杂志》272(18):12181-12188；Angelloz-Nicoud等，1996,《生长调节》6(3):130-136)。此外，已经显示，IGFBP-3在内在化后靶向核，并且在成熟的IGFBP-3的序列中已经鉴定了一个核定位信号(NLS)(Radulescu,1994《生物化学科学趋势》19(7):278；Jaques等，1997《内分泌学》138(4):1767-1770)。
许多治疗性化合物特别是“生物技术”化合物如反义寡核苷酸和蛋白激素都受到与靶向和半衰期有关的问题困扰。例如寡核苷酸就受到靶向和半衰期问题的困扰。使用“正常”碱基和键的寡核苷酸被血清中存在的核酸酶迅速从循环中清除。即使寡核苷酸用变化的核苷酸和/或键制备，它们仍被迅速地从循环中清除，主要是被肾脏和肝脏清除。许多以蛋白为基础的药物(例如抗体、蛋白激素和生长因子)受到非常短的半衰期的困扰，因为蛋白小到能够渗出，从而使其被肾脏或其他器官快速清除，或者它们可被肝脏特异性清除(例如抗体)。蛋白的共价修饰(例如pegylation)已被用来试图增加循环半衰期，但并不令人满意。
因此在本领域中需要IGFBP-3的稳定变体。
本领域还需要能够更有效传递的药物，使药物具有提高的半衰期和生物利用性。
                      发明公开
在一个实施方案中，本发明涉及能够对非酶促水解稳定的IGFBP-3变体。本发明的发明者们发现，IGFBP-3在该蛋白中Asp-Pro位点对非酶促水解敏感。此外，本发明的发明者们还惊奇地发现，蛋白中的第2个位点对非酶促水解敏感。本发明的发明者们设计了在这些位点对非酶促水解具有抗性的IGFBP-3变体。优选的水解抗性IGFBP-3变体包括残基116和/或135被改变成天冬氨酸以外的氨基酸残基的成熟IGFBP-3。
在另一个实施方案中，本发明涉及核定位信号被改变的IGFBP-3变体。优选的变体包括残基228和/或230被改变的成熟IGFBP-3。
在进一步的实施方案中，本发明涉及增加了一个N-末端延伸的IGFBP-3变体。N-末端延伸的IGFBP-3包括作为N-末端延伸的核苷酸结合序列、抗原结合区、蛋白激素和生长因子。本发明的发明者们惊奇地发现，较大N-末端延伸可加至IGFBP-3，而不影响延伸的IGFBP-3与IGF结合和与ALS形成一种三元复合物的能力。
在一个N-末端延伸实施方案中，N-末端延伸是一种核苷酸结合序列。此实施方案的延伸IGFBP-3可与IGF(优选一种“无效IGF”)以及N-末端延伸上结合的核苷酸形成一种复合物。这样给药的复合物可导致核苷酸的半衰期和生物利用性大大提高。
在一个进一步的N-末端延伸实施方案中，N-末端延伸是一种肽结合序列。此实施方案的N-末端延伸IGFBP-3可与IGF(优选一种“无效IGF”)以及肽形成一种复合物。这样给药的复合物可传递该肽，并导致该肽的半衰期和生物利用性大大提高。
在另一个N-末端延伸实施方案中，N-末端延伸是一种特异性结合成员。此实施方案的N-末端延伸IGFBP-3可与IGF(优选一种“无效IGF”)形成一种复合物，并给药于病人。
复合物与特异性结合成员N-末端延伸的靶结合，并且与抗体、可溶性受体及其他治疗性特异性结合成员相比，半衰期和生物利用性大大提高。
一个进一步的N-末端延伸实施方案利用一种蛋白生长因子或激素作为N-末端延伸。此实施方案的N-末端延伸IGFBP-3可与IGF(优选一种“无效IGF”)形成一种复合物，并给药于病人。N-末端延伸半分子可与其靶受体结合，并且作为IGF/IGFBP-3/ALS复合物的一部分，具有大大提高的半衰期和生物活性。
                     附图简述
图1显示了成熟人IGFBP-3的天然存在的Ala5变体的氨基酸序列(单字母氨基酸代码)。
              实施本发明的最佳模式定义：
“胰岛素样生长因子”或“IGF”包括一个因子家族，包括但不限于IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ。IGF多肽具有大约7.5Kd的分子量。IGF包括天然产生的(天然)IGF-Ⅰ或IGF-Ⅱ、其类似物或变体、以及IGF-Ⅰ或IGF-Ⅱ与其他氨基酸序列之间的融合体。IGF可以来自天然来源或用重组方法制备。
用于此处，术语“无效IGF”指在分子的一个或多个位点具有改变的氨基酸序列、保留了与IGFBP-3的结合能力、但改变了受体结合/活化活性(例如结合或激活Ⅰ型或Ⅱ型IGF受体或胰岛素受体)的IGF分子。无效IGF-Is的描述可见于Cascieri等(1988,《生物化学》27:3229-3233；1989,《生物化学杂志》264:2199-2202)、Bayne等(1990,《J.Biol.Chern.》265:15648-15652)和Baxter等(1992,《生物化学杂志》267:60-65)。无效IGF-Ⅰ的例子包括一个或多个IGF-Ⅰs的酪氨酸残基(即残基24、31或60，单独或组合)被非芳香族残基(即酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸以外的残基)取代的突变体、氨基酸残基49、50、51、53、55和56(单独或组合)被改变(例如残基49-50被改变为Thr-Ser-Ile或残基55-56被改变为Tyr-Gln)的突变体。
用于此处，“IGFBP-3”指胰岛素样生长因子结合蛋白3。IGFBP-3是胰岛素样生长因子结合蛋白家族的一个成员。IGFBP-3可来自任何种属，包括牛、绵羊、猪和人，可以是天然序列或变异形式，包括但不限于天然产生的等位变体(例如成熟蛋白的位置5已知可以是甘氨酸或丙氨酸)、糖基化变体如ND变体以及水解抗性变体。
术语“天然IGFBP-3”指具有特定种属的天然或野生型序列的IGFBP-3。术语天然IGFBP-3包括天然产生的变体(例如在天然产生蛋白的位置5的变异)。
用于此处，术语“糖基化变体IGFBP-3”的意思是N-连接糖基化位点的氨基酸残基(即成熟蛋白位置89、109和172)被改变(单独或组合)为非天冬酰胺的氨基酸残基的IGFBP-3s。例子包括N89B；N109B；N172B；N89B,N109B；N89B,N172B；N109B,N172B；和N89B,N109B,N172B变体，其中B是非天冬酰胺的任何氨基酸。一组优选的糖基化IGFBP-3变体是“ND变体IGFBP-3s”。ND变体IGFBP-3s是这样一组IGFBP-3变体，其中N-连接糖基化位点的氨基酸残基(即成熟蛋白位置89、109和172)被改变为天冬氨酸。ND变体IGFBP-3s包括诸如N89D；N109D；N172D；N89D,N109D；N89D,172D；N109D,N172D；以及N89D,N109D,N172D变体。
术语“水解抗性IGFBP-3变体”指天然序列被改变为对水解更具有抗性的IGFBP-3变体。水解抗性IGFBP-3s变体的特殊例子包括位置116和135的改变，它们在这些位置(单独或组合)改变为非天冬氨酸的氨基酸残基(例如D116J,D135J和D116J、D135J，其中J是非天冬氨酸的任何氨基酸)。优选的水解抗性IGFBP-3变体是这样一些变体，它们在成熟蛋白的位置116和135被改变为(单独或组合)谷氨酸(即D116E,D135E和D116E、D135E)。
“NLS变体IGFBP-3s”指具有改变的核定位信号的IGFBP-3变体。IGFBP-3的NLS位于蛋白的羧基端部分，包括残基215至232(Radulescu,1994《生物化学科学趋势》19(7):278)。优选的NLS变体IGFBP-3s是成熟蛋白的残基228和230被改变为其天然序列中的残基以外的残基的IGFBP-3变体(例如K228U1,R230U2，其中U1是赖氨酸以外的任何氨基酸，U2是精氨酸以外的任何氨基酸)，特别是位置228被改变为谷氨酸和/或位置230被改变为甘氨酸的变体(例如K228E、R230U2,K228U1、R230G和K228E、R230G)。其他优选的NLS变体包括位置215、216和231的变体。
“N-末端延伸的IGFBP-3s”指被改变成在蛋白的N-末端增加了另外序列的IGFBP-3s。N-末端延伸的IGFBP-3s可以使用任何IGFBP-3序列包括天然IGFBP-3或变体IGFBP-3序列来制备。N-末端延伸序列可以是各种类型，包括但不限于核苷酸结合序列、肽结合序列、特异性结合成员、蛋白激素序列、生长因子序列、酶等等。N-末端延伸序列可以从头设计或可以来自已知序列。对于来自天然产生的蛋白、cDNAs和基因的N-末端延伸序列，N-末端延伸序列优选来自与IGFBP-3序列相同的种属(例如对于人IGFBP-3的N-末端延伸序列，N-末端延伸序列优选来自一种人蛋白、cDNA或基因)。
“核苷酸结合序列”用于此处是指能够以序列特异性或非序列特异性方式与核苷酸聚合物结合的氨基酸序列。序列特异性核苷酸结合序列包括同转录因子中分立的DNA结合结构域，例如来自酵母MATα2同源域蛋白的同源域、来自D.melanogaster同源域蛋白如双胸复合物的同源域蛋白(BX-C,Martin等1995《美国科学院院刊》92(18):8398-8402)、退化的性梳(Scr,LeMotte等，1989,《EMBO J》8(1):219-227)、肌节同源盒(msh,D’Alessio等，1996《Mech.Dev.》58(1-2):217-231)、HOX基因及本领域所知的其他蛋白或基因的同源域、转录因子的锌指结构域等等。非序列特异性核苷酸结合序列包括完整或部分的蛋白，包括能非特异地结合单链DNA或双链DNA的分立的DNA结合区域，包括线粒体单链DNA结合蛋白(SSB,Tiranti等，1993《基因》126:219-225)、UPⅠ(Riva等，1986《EMBO J》5(9):2267-2273)、RecA等。
术语“肽结合序列”指能以非序列特异性方式结合肽或蛋白的氨基酸序列。肽结合序列可以是完整蛋白，或者可以是来自全蛋白的片段或结构域。含有肽结合序列的蛋白的例子包括已知为“伴侣分子”的蛋白，例如伴侣素、immunophilins和热休克蛋白(hsp)以及主要组织相容性复合物(MHC)蛋白。优选的肽结合序列包括gp96、hsp70、hsp90和MHCⅠ型和MHCⅡ型，特别是胞外结构域。在这里，大肠杆菌基因DsbA和DsbC以及它们的同源物的产物不包括在术语“肽结合序列”的范围内。
“特异性结合成员”是能够特异性结合靶序列的序列。靶序列可以是蛋白、碳水化合物、核苷酸或其他任何能被特异性结合成员使用的分子。抗体及其片段或组分(即抗原结合序列)是一组优选的特异性结合成员。抗原结合序列可以是完整的抗体重链、单链抗体、抗体片段如Fab和F(ab)2或抗体链的一个片段如重链的可变区(VH)、重链的Fd片段(包括VH区和第1恒定区)、sFv、免疫球蛋白重链中对靶序列特异的一个或多个互补决定区(CDRs)。此外，一种配体结合区域可以被用作特异性结合成员。配体结合序列可以来自细胞受体，并可包括受体的可溶性形式、胞外结构域或其片段。
术语“蛋白激素”和“生长因子”指以内分泌、旁分泌或自分泌形式起作用的肽和蛋白。蛋白激素和生长因子在本领域是熟知的，包括大量的家族。生长因子的例子包括但不限于，转化生长因子(TGFs)，包括TGF-αs如TGF-α、表皮生长因子(EGF)和TGF-αHⅢ以及TGF-β超家族，后者包括TGF-βs、骨形成蛋白(BMPs)、活化素、抑制素及其他；成纤维细胞生长因子(FGF)家族，包括FGF1至至少FGF18；血管内皮细胞生长因子(VEGF)家族，包括VEGF、VEGF2、VEGFC和VEGFD；血小板衍生生长因子(PDGF)家族，包括PDGF的AA、AB和BB同工型；胰岛素样生长因子(IGFs)，包括天然序列IGF-Ⅰ、天然序列IGF-Ⅱ、des(1-3)IGF-Ⅰ和本领域已知的其他IGF变体；以及本领域已知的其他生长因子。蛋白激素包括生长激素、神经肽如血管活性肠肽(VIP)、神经激肽A(NKA)、降钙素基因相关肽(CGRP)、垂体腺苷酸环化酶活化肽(PACAP)、神经肽Y(NPY)和抑生长素。
当N-末端延伸的IGFBP-3s含有一种酶时，该酶可以是任何能在一种靶细胞上作用的酶。在成熟蛋白的位置215、216、228、230和231具有天然序列的IGFBP-3已经显示被转运至分裂细胞而不是静止细胞的核(Li等，1997,《内分泌学》138:1763-1766)。应当注意，按照本发明用作N-末端延伸的酶不包括谷胱甘肽-S-转移酶或β-半乳糖苷酶。含有一种作为N-末端延伸的酶的IGFBP-3变体作为一种平台将N-末端延伸酶传递至快速分裂细胞的核。在一个优选的实施方案中，N-末端延伸酶是一种作用于核酸的酶，例如整合酶、核糖核酸酶(RNase)、限制内切酶或外切酶。能够切割或降解核酸的酶(如核酸酶)的传递可改变快速分裂细胞如癌细胞的生长动力学，甚至杀死细胞。在一个进一步的优选实施方案中，N-末端延伸酶是一种赋予靶细胞药物敏感性的酶，例如单纯疱疹病毒(HSV)或巨细胞病毒(CMV)胸苷激酶(TK)基因。表达HSV或CMV TK的细胞变得对药物无环鸟苷和9-(1,3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤敏感，因此在给药含有HSV或CMV TK的N-末端延伸IGFBP-3的同时或之后给药无环鸟苷或9-(1,3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤，靶细胞可能被杀死。
“治疗性核苷酸”是一种多聚或寡聚核苷酸，它可被给药来通过改变特殊基因和mRNAs的转录和/或翻译，引起一种药效。优选的治疗性核苷酸是反义寡核苷酸和核酶。反义寡核苷酸通常是一种单链的寡核苷酸，它被设计来与靶细胞中的一种特殊mRNA形成一种双链，导致靶mRNA的翻译抑制和/或降解。核酶是具有酶活性的核糖核苷酸，并可被设计来切割特异性序列(见诸如Lavrovsky等，1997《生物化学与分子医学》62(1):11-22)。可以使用未修饰的磷酸二酯寡核苷酸，它们较少使用，因为它们对血清中存在的核酸酶高度敏感。修饰的寡核苷酸(它们具有磷酸二酯以外的化学骨架，包括硫代磷酸酯和甲基膦酸酯)是用于本发明的优选寡核苷酸。
水解抗性的变体IGFBP-3可用于天然IGFBP-3能够使用的所有应用。NLS变体IGFBP-3也可以用于天然IGFBP-3能够使用的所有应用。这些变体IGFBP-3s可用作治疗剂来抑制IGF的作用，或者它们可作为与IGF的复合物进行给药来治疗广泛多种的紊乱。
N-末端延伸的IGFBP-3s有多种用途，这依赖于N-末端延伸的性质。例如含有一个核苷酸结合序列作为N-末端延伸的N-末端延伸IGFBP-3可用来传递以核苷酸为基础的药物，例如反义核苷酸。含有一个肽结合序列或一个特异性结合成员作为N-末端延伸的N-末端延伸IGFBP-3可用来，例如，传递以肽和蛋白为基础的药物，并作为一种缓释传递试剂用于免疫。含有一个蛋白激素或生长因子的N-末端延伸IGFBP-3可用于含有N-末端延伸的蛋白激素或生长因子的缓释传递。
本发明的变体IGFBP-3s优选用重组表达方法制备。一般来说，编码变体的DNA序列通过诸如从头合成或通过编码IGFBP-3的已经存在的DNA的定点诱变来制备。对于从头合成，编码变体IGFBP-3的DNA序列通常经过多个片段来制备(天然IGFBP-3为264个氨基酸，至少需要长度为792核苷酸的DNA分子)，将这些片段连接起来产生完整的DNA序列。在特殊DNA序列中产生特异性改变的方法已经知道得非常清楚，对本领域的技术人员来说非常明显，用于在DNA序列中产生改变的任何方法都可用于改变DNA序列来制备编码本发明的变体IGFBP-3的DNA序列。
变体IGFBP-3s可以融合蛋白的形式或通过“直接表达”(产生不含有相关的信号或分泌序列或融合伙伴的变体IGFBP-3)来制备。用于变体IGFBP-3s融合蛋白生产的合适融合伙伴包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、在重组宿主细胞中可操作的分泌信号序列以及美国专利No.5,629,172公开的溶解性增强融合伙伴(例如无前导肽的DsbA)。在以融合蛋白形式产生时，融合蛋白可以通过在宿主细胞内或在收集表达的融合蛋白之后的蛋白酶切割来除去融合伙伴。这种切割通常需要在融合伙伴与变体IGFBP-3序列之间存在插入的蛋白酶靶序列。任何能提供足够活性和特异性的靶序列/蛋白酶组合都可以使用，尽管优选的是遍在素/遍在素水解酶和HRV蛋白酶3C系统。
通常，编码变体IGFBP-3的DNA被插入一种表达载体(含有适当排列的、能够影响变体IGFBP-3的mRNA的转录和翻译的必需序列的DNA结构)，然后将这样的载体导入一种重组宿主细胞。重组表达载体通常含有对转录和翻译的起始来说必需的序列，包括启动子、操纵子、增强子、核糖体结合位点等等以及转录终止位点和对mRNA的适当加工所必需的序列(例如真核宿主细胞的poly-A的加入位点)。启动子、操纵子和/或增强子优选是诱导型的，这样变体IGFBP-3序列的表达可用特殊化合物的存在或缺乏来调节(例如使用lac操纵子可提供乳糖和乳糖类似物的调节)。用于真核宿主细胞的重组表达载体可进一步含有一种带有加工内含子的适当信号的异源内含子，因为这已经显示能在某些系统中增加mRNA的输出。用于原核细胞的优选表达构建体在国际专利申请No.WO 96/40772中公开。
用于本发明的实施的核酸操作的通用技术一般在诸如Sambrook等《分子克隆实验室指南》1-3卷(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2版，1989)；F.Ausubel等《当代分子生物学技术》(Green Publishingand Wiley-Interscience:New York,1987)和最近的期刊中介绍。用于核酸操作的试剂如限制内切酶、T7 RNA聚合酶、DNA连接酶等可从下列销售商处购买，如New England BioLabs、Boerhinger Mannheim、Amersham、Promega Biotec、US Biochemicals和New England Nuclear。
使用一种对宿主细胞来说合适的方法将表达构建体导入宿主细胞，这对本领域的技术人员来说非常明显。多种将核酸导入宿主细胞的方法在本领域是已知的，包括但不限于电穿孔、应用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE葡聚糖或其他物质的转染、微粒子轰击、脂质体转染和感染(载体是一种感染性试剂时，例如一种逆转录病毒基因组)。通常见Sambrook等，上文和Ausubel等，上文。
重组宿主细胞可以是真核或原核细胞，虽然原核宿主细胞优选用来生产本发明的变体IGFBP-3s。在原核宿主中，革兰氏阴性细菌是优选的，特别是大肠杆菌。其他的原核生物如枯草芽孢杆菌或假单胞菌也可以使用。哺乳动物或其他真核宿主细胞如酵母、丝状真菌、植物、昆虫、两栖类或禽类也可以使用。见《组织培养》(Kruse和Patterson编辑，Academic Press,1973)。有用的哺乳动物细胞系包括但不限于VERO和HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和W138、BHK以及COS细胞系。
一旦建立了重组宿主细胞株(即表达构建体已经导入宿主细胞，并且已经分离了含有适当表达构建体的宿主细胞)，就将重组宿主细胞株在适合IGFBP-3产生的条件下培养。对本领域的技术人员来说非常明显，重组宿主细胞株的培养方法将依赖于所用的表达构建体的性质和具体宿主细胞。重组宿主株通常在含有可同化的碳、氮和无机盐来源的液体培养基中使用本领域熟知的方法进行培养。转化的昆虫或哺乳动物细胞在含有可同化的碳、氮和无机盐来源并可选含有维生素、氨基酸、生长因子和其他本领域已知的蛋白培养补充物的液体培养基中培养。用于培养宿主细胞的液体培养基可选地含有用来防止不想要的微生物生长的抗生素或抗真菌剂和/或化合物，包括但不限于用来选择含有表达载体的宿主细胞的抗生素。
重组宿主细胞可以分批或连续方式培养，以分批或连续方式收获细胞(当变体IGFBP-3s在细胞内积累时)或收获培养上清。对于原核宿主细胞中的生产，优选分批培养和收获细胞。
本发明的变体IGFBP-3s通常在重组系统中表达后纯化。变体IGFBP-3可以通过本领域已知的各种方法从宿主细胞中纯化。通常，细菌宿主细胞中产生的变体IGFBP-3溶解性很差或不溶(包含体形式)。在不溶性蛋白时，蛋白可通过离心从宿主细胞裂解物中收集。在蛋白溶解性很差时，可以加入化合物包括但不限于聚乙烯亚胺(PEI)来诱导部分溶解的蛋白沉淀。然后可通过离心方便地收集沉淀的蛋白。
不溶性或沉淀的变体IGFBP-3可接着使用任何本领域已知的多种试剂进行溶解。IGF-Ⅰ或IGFBP-3优选用尿素或盐酸胍进行溶解。
当变体IGFBP-3以融合蛋白形式制备时，优选除去融合序列。融合序列的除去可通过酶促或化学切割来完成，优选通过酶促切割。融合序列的酶促除去可使用本领域熟知的方法来完成。除去融合序列的酶的选择将通过融合的特征来确定，并且反应条件通过酶的选择来特定，这对于本领域的技术人员来说将非常明显。切割的变体IGFBP-3优选用熟知的技术从切割的融合序列中纯化。这种方法将通过融合序列和变体IGFBP-3的特征和特性来确定，这对于本领域的技术人员来说非常明显。纯化的方法包括但不限于分子大小排阻色谱、疏水相互作用色谱、离子交换色谱或透析。
变体IGFBP-3还优选纯化来从蛋白溶液中除去DNA。DNA可通过本领域已知的几种方法中的任何方法来除去，例如沉淀或离子交换色谱，但优选通过用硫酸鱼精蛋白沉淀来除去。变体IGFBP-3可使用方法包括离心或过滤从沉淀的DNA中分离。
在用原核生物制备变体IGFBP-3时，这样生产的变体IGFBP-3经常是全部或多数错误折叠，并因而缺乏任何生物活性。蛋白的生物活性可通过“重新折叠”来恢复。一般来说，错误折叠的变体IGFBP-3通过如下方法来重新折叠：使用一种或多种离液剂(例如尿素和/或胍)和一种能够还原二硫键的试剂(例如二硫苏糖醇，DTT或2-巯基乙醇，2-ME)溶解(当变体IGFBP-3也是不溶性时)、去折叠并还原多肽链。在中等浓度的离液剂中加入一种氧化试剂(例如氧、胱氨酸或胱胺)，后者使链间二硫键重新形成。变体IGFBP-3可使用本领域已知的标准方法重新折叠，例如美国专利No.4,511,502和4.511,503中公开的方法。此外，变体IGFBP-3可在与IGF的共折叠反应中重新折叠，例如国际专利申请No.WO/96/40736(系列号PCT/US96/08113)中的介绍。
重新折叠之后，变体IGFBP-3优选被进一步纯化。变体IGFBP-3的纯化可使用本领域熟知的各种技术来完成，包括疏水相互作用色谱、大小排阻色谱、离子交换色谱、反向高效液相色谱、亲和色谱等。天然的变体IGFBP-3复合物优选通过阳离子交换色谱进行纯化，使用一种磺丙基衍生的柱色谱基质(例如SP-Sephadex,Pharmacia,Uppsala,Sweden)。此外，纯化也可包括一步纯化蛋白的干燥或沉淀。
纯化之后，变体IGFBP-3可交换至不同的缓冲液和/或通过本领域已知的各种方法中的任何方法进行浓缩，包括但不限于渗滤和透析。
纯化的变体IGFBP-3优选为至少90％纯(用反向高效液相色谱、RP-HPLC或十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS-PAGE测定)或至少95％纯，更优选至少98％纯，最优选至少99％纯。不管变体IGFBP-3纯度的准确数量值，变体IGFBP-3优选有足够的纯度用作一种药物产品。
IGFs包括天然IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ以及变体IGFs如无效IGFs可通过本领域已知的任何方法制备，并优选通过重组方法制备，优选使用国际专利申请No.WO96/40772中介绍的原核宿主细胞制备。当IGFs以不可溶和/或错误折叠的形式被制备时，IGFs可使用为一般蛋白重新折叠所介绍的任何方法重新折叠，或者它们可使用为IGF具体公开的方法重新折叠，例如美国专利No.5,288,931,5,410,026,5,663,304中所公开的方法，或者IGF可与IGFBP一起重新折叠，例如美国专利No.5,683,980和国际专利申请No.96/40772中的公开。
用于与本发明的变体IGFBP-3s形成复合物的IGF优选至少是部分纯化的。IGF和变体IGFBP-3的二元复合物可以是并且优选是在复合物形成后使用本领域已知的任何方法进一步纯化。IGF/变体IGFBP-3复合物纯化的精确方法和条件各不相同，这依赖于所用IGF和特殊IGFBP-3变体的形式，这对于本领域的技术人员来说将是明显的。
特定的变体IGFBP-3s(例如水解抗性IGFBP-3和NLS变异的IGFBP-3)可以在其他蛋白(除了赋形剂、载体和稳定剂，例如血清白蛋白)不存在的情况下用作治疗剂，或者它们可与一种IGF复合。IGF可以是天然序列的IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ或一种IGF变体例如一种无效IGF。变体IGFBP-3s与IGF的复合物的形成可通过将两种蛋白在溶液中简单混合来完成。变体IGFBP-3s保留了它们的IGF和ALS结合能力，因此将二元复合物IGF/IGFBP-3给药于被试者将导致IGF/IGFBP-3/ALS三元复合物的形成。三元复合物在循环中具有长半衰期，比IGF或IGFBP-3或二元复合物的半衰期要长得多。
N-末端延伸的IGFBP-3s将通常以IGF和变体IGFBP-3复合物的形式给药。对于特定的N-末端延伸IGFBP-3s,IGF/变体IGFBP-3复合物将以与第3种化合物的复合物形式进行给药。在核苷酸结合序列是N-末端延伸时，二元复合物将进一步包括一种治疗性核苷酸。在核苷酸结合序列是一种序列特异的核苷酸结合序列时，复合物中所包含的治疗性核苷酸将含有一种序列特异性核苷酸结合序列结合的序列(“结合靶序列”)。例如，如果核苷酸结合序列是MATα2同源域，治疗性核苷酸将优选含有MATα2同源域将结合的序列5’-ACATGTAATT-3’或其变体。但是，如果核苷酸结合序列不是序列特异性，治疗性核苷酸就不需要含有一个结合靶序列。
包含一种肽结合序列或一种特异性结合成员的N-末端延伸的IGFBP-3s也优选与IGF和一种第3种化合物复合后给药。在这种情况下，第3种化合物是一种肽、蛋白或其他能够结合N-末端延伸的化合物。N-末端延伸之间的结合可以是特异性的(如一种特异性结合成员中)或非特异性的，例如在肽结合序列是N-末端延伸时。
                         实施例实施例1:NLS变体IGFBP-3的表达构建体
编码一种NLS变体IGFBP-3(K228E,R230G,Ala5ND变体IGFBP-3)的DNA构建体通过聚合酶链反应定点诱变来制备。pKN72249(包括一个编码ND变体Ala5IGFBP-3的DNA序列)被用作2种不同PCR反应的模板。一个使用引物NLSF(5’-CAATGCCGTCCGAGTGAGGGTGGTAAACGAGGTTTTTGTTGGTG-3’)和CYC5’R(5’-CTCCAGTTCGATGTTACCAGCTGAGG-3’)，第2个使用NLSR(5’-ACAAAAACCTCGTTTACCACCCTCACTCGGACGGCATTGTTTC-3’)和BP3#1(5’-TTCATCCGTTGCACTCT-3’)。扩增按照制造商的指示进行。使用引物BP3#1和CYC5’R对每个反应的1 ul产物进行再扩增，产生0.8kb的扩增产物(它被预期含有NLS变体IGFBP-3 DNA的混合物)。
0.8kb的扩增产物通过琼脂糖凝胶和Geneclean(Bio101,LaJolla,CA)进行纯化，然后用SalⅠ和NsiⅠ限制酶消化。将限制酶消化产物走琼脂糖凝胶电泳，并通过凝胶电泳分离0.25kb的产物(此片段含有编码IGFBP-3的NLS区的序列)。pDM46908也用SalⅠ和NsiⅠ限制酶消化，并通过凝胶电泳分离4.6kb的载体骨架(也含有IGFBP-3序列的剩余部分)。
将两种DNA片段连接，接着转化进大肠杆菌菌株JM109，并在含有氨苄青霉素的营养培养基上培养(pDM46908携带b1a基因)。选择几个氨苄青霉素抗性克隆，小量制备质粒DNA。用BamHⅠ和NsiⅠ消化小量DNA，这将产生一个来自适当连接质粒的诊断性1.4kb条带。选择一个具有正确BamHⅠ/NisⅠ限制消化结果的分离物(命名为1-2)用于进一步的分析。
DNA的NLS区使用BP3#1作为测序引物进行测序，来检查1-2分离物含有预期的序列。在证实了正确序列之后，1-2分离物被用作DNA来源用于制备产生NLS变体Ala5ND变体IGFBP-3的表达构建体。
将来自NLS分离物1-2的0.25kb的SalⅠ-NsiⅠ片段在一个三步反应中与一个来自pKN72253的1.2kb XbaⅠ/SalⅠ片段和一个来自pDJ12887的5.5kb的片段连接，产生一个基本上与pDM46884-BP3(Zhang等，1998，《蛋白实验纯化》12:159-165)相同的质粒，除了IGFBP-3序列被新的NLS变体Ala5ND变体IGFBP-3序列取代。将连接反应物转化进JM109，并在含有氨苄青霉素和四环素的营养培养基上培养转化细胞，分离几个克隆，并用小量DNA的XbaⅠ/NsiⅠ消化进行筛选(正确的连接预期产生一个诊断性的1.4kb片段)。选择一个能产生适当的限制消化图谱的克隆，并制备质粒。将质粒DNA转化进大肠杆菌SB1076用于NLS变体IGFBP-3的表达。
整个公开引用的专利、专利申请和出版物在此全文引入作为参考。
本发明同时用直接描述和实施例来详细介绍。本发明的等价物和修饰对本领域的技术人员来说是明显的，并包含在本发明的范围内。
权利要求书
按照条约第19条的修改
1．一种稳定的IGFBP-3，其中位置135被改变为一种非天冬氨酸的氨基酸。
2．权利要求1的稳定IGFBP-3，其中位置135被改变为谷氨酸。
3．前述任一权利要求的稳定IGFBP-3，其中残基116被改变为非天冬氨酸的氨基酸。
4．权利要求3的稳定IGFBP-3，其中残基116被改变为谷氨酸。
5．权利要求1的任何稳定IGFBP-3，其中所说IGFBP-3还是一种糖基化变体IGFBP-3。
6．权利要求5的稳定IGFBP-3，其中所说糖基化变体IGFBP-3包含至少一个选自位置89、109和172的位置被改变为一种非天冬酰胺的氨基酸。
7．一种核定位信号(NLS)变体IGFBP-3，其中位置228被改变为谷氨酸。
8．权利要求7的NLS变体IGFBP-3，其中残基230被改变为一种非精氨酸的氨基酸。
9．权利要求8的NLS变体IGFBP-3，其中残基230被改变为甘氨酸。
10．权利要求7-9任一项的稳定IGFBP-3，其中所说IGFBP-3还是一种糖基化变体IGFBP-3。
11．权利要求10的稳定IGFBP-3，其中所说糖基化变体IGFBP-3包含至少一个选自位置89、109和172的位置被改变为一种非天冬酰胺的氨基酸。
12．一种N-末端延伸的胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)，包含：
一种选自核苷酸结合序列、肽结合序列、抗原或配体结合序列、蛋白激素、生长因子和酶的N-末端延伸序列，其中生长因子选自转化生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子和胰岛素样生长因子；和
IGFBP-3，其中所说的IGFBP-3连接于所说融合伙伴的羧基端，并且其中所说的N-末端延伸序列不是DsbA、无前导的DsbA、霍乱弧菌TcpG、DsbC或无前导的DsbC。
13．权利要求12的N-末端延伸IGFBP-3，其中所说的IGFBP-3包含图1的序列。
14．权利要求12的N-末端延伸IGFBP-3，其中所说的IGFBP-3包含图1的序列的一种变体。
15．权利要求14的N-末端延伸IGFBP-3，其中所说的变体包含图1的序列，且位置5改变为甘氨酸。
16．权利要求14的N-末端延伸IGFBP-3，其中所说的IGFBP-3包含一种ND变体IGFBP-3。
17．权利要求12-16的任何N-末端延伸IGFBP-3，其中所说的N-末端延伸是一种核苷酸结合序列。
18．权利要求12-16的N-末端延伸IGFBP-3，其中所说的N-末端延伸是一种酶。
19．权利要求18的N-末端延伸IGFBP-3，其中所说的酶不是谷胱甘肽-S-转移酶或β-半乳糖苷酶。

Claims (21)

1．一种稳定的IGFBP-3，它包含图1的序列，其中位置116被改变为一种非天冬氨酸的氨基酸。
2．权利要求1的稳定IGFBP-3，其中位置116被改变为谷氨酸。
3．一种稳定的IGFBP-3，它包含图1的序列，其中位置135被改变为一种非天冬氨酸的氨基酸。
4．权利要求3的稳定IGFBP-3，其中位置135被改变为谷氨酸。
5．权利要求4的稳定IGFBP-3，其中残基116被改变为一种非天冬氨酸的氨基酸。
6．权利要求5的稳定IGFBP-3，其中残基116被改变为谷氨酸。
7．一种核定位信号(NLS)变体IGFBP-3，其中NLS序列被改变。
8．权利要求7的NLS变体IGFBP-3，它包含图1的序列，其中残基228被改变为一种非赖氨酸的氨基酸。
9．权利要求8的NLS变体IGFBP-3，其中残基228被改变为谷氨酸。
10．权利要求7的NLS变体IGFBP-3，其中残基230被改变为一种非精氨酸的氨基酸。
11．权利要求10的NLS变体IGFBP-3，其中残基230被改变为甘氨酸。
12．权利要求7的NLS变体IGFBP-3，其中残基228被改变为一种非赖氨酸的氨基酸并且残基230被改变为一种非精氨酸的氨基酸。
13．权利要求12的NLS变体IGFBP-3，其中残基228被改变为谷氨酸并且残基230被改变为甘氨酸。
14．一种N-末端延伸的胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)，包含：
一种选自核苷酸结合序列、肽结合序列、抗原或配体结合序列、蛋白激素、生长因子和酶的N-末端延伸序列；和
IGFBP-3，其中所说的IGFBP-3连接于所说融合伙伴的羧基端，并且其中所说的N-末端延伸序列不是DsbA、无前导的DabA、霍乱弧菌TcpG、DsbC或无前导的DsbC。
15．权利要求14的N-末端延伸IGFBP-3，其中所说的IGFBP-3包含图1的序列。
16．权利要求14的N-末端延伸IGFBP-3，其中所说的IGFBP-3包含图1的序列的一种变体。
17．权利要求16的N-末端延伸IGFBP-3，其中所说的变体包含图1的序列，且位置5改变为甘氨酸。
18．权利要求16的N-末端延伸IGFBP-3，其中所说的IGFBP-3包含一种ND变体IGFBP-3。
19．权利要求14的N-末端延伸IGFBP-3，其中所说的N-末端延伸是一种核苷酸结合序列。
20．权利要求14的N-末端延伸IGFBP-3，其中所说的N-末端延伸是一种酶。
21．权利要求20的N-末端延伸IGFBP-3，其中所说的酶不是谷胱甘肽-S-转移酶或β-半乳糖苷酶。
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