CN105753983A - 胰岛素样生长因子特异性结合蛋白及其用途 - Google Patents

胰岛素样生长因子特异性结合蛋白及其用途 Download PDF

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Abstract

描述了针对IGF?II但与IGF?I有交叉反应性的结合蛋白，例如抗体，以及这类抗体的用途。具体地说，公开了针对IGF?II但与IGF?I有交叉反应性的全人单克隆抗体。还公开了编码重链和轻链免疫球蛋白分子的核苷酸序列和包含重链和轻链免疫球蛋白分子的氨基酸序列，尤其是对应于跨越构架区和/或互补决定区(CDR)、特别是从FR1到FR4或从CDR1到CDR3的连续重链和轻链序列的序列。

Description

胰岛素样生长因子特异性结合蛋白及其用途
本申请是2006年12月8日提交的题为“胰岛素样生长因子特异性结合蛋白及其用途”的国家申请号为200680052595.9(PCT/US2006/047059)的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
根据美国法典第35章第119条，本申请要求2005年12月13日申请的美国临时申请序号60/750,085、2005年12月14日申请的美国临时申请序号60/750,772、2005年2月17日申请的美国临时申请序号60/774,747以及2006年5月24日申请的美国临时申请序号60/808,183的优先权，所述各临时申请整体在此引入作为参考。
技术领域
本发明涉及能结合胰岛素样生长因子-2(IGF-II)但与胰岛素样生长因子-1(IGF-I)有交叉反应性的结合蛋白，以及这些结合蛋白的用途。更具体地讲，本发明涉及针对IGF-II但与IGF-I有交叉反应性的单克隆抗体以及这些抗体的用途。本发明的若干方面还涉及表达这些抗体的杂交瘤或其它细胞系。
背景技术
胰岛素样生长因子IGF-I和IGF-II是参与调节细胞增殖、存活、分化和转化的小多肽。IGF主要通过与特定细胞表面受体--IGF-I受体(IGF-IR)相互作用并激活多种胞内信号转导级联而发挥其多种作用。IGF在血清中循环，主要结合IGF-结合蛋白(IGFBP-1至IGFBP-6)。IGF与IGF-IR的相互作用受到IGFBP的调节，IGF一旦从IGFBP中释放出来(主要通过IGFBP的蛋白水解)，就可以只结合IGF-IR。IGF-I还可以结合由IGF-IR和胰岛素受体(IR)亚基组成的杂合受体。业已表明，IGF-II能结合胰岛素受体的“A”同等型(isoform)。
恶性转化包括诸如细胞生长、分化、凋亡和转化等多种过程的不平衡。IGF-I和IGF-II涉及多种病症的病理生理，被认为是由于受体IGF-IR介导的促有丝分裂和抗凋亡特性而在肿瘤发生中起作用。LeRoith和Roberts，Cancer Lett.195：127-137(2003)。
IGF-I是作为肝脏在垂体生长激素调控下产生的生长因子而被发现的，最初被称为生长调节素-C。Salmon等，J.Lab.Clin.Med.49：825-826(1957)。IGF-I和IGF-II均广泛表达，通过它们与IGF-IR的相互作用而充当内分泌、旁分泌和自分泌生长因子，IGF-IR为在结构和功能上与胰岛素受体(IR)相关的跨膜酪氨酸激酶。IGF-I主要通过激活IGF-IR起作用，而IGF-II可通过IGF-IR或通过IR-A同种型起作用。LeRoith和Roberts，Cancer Lett.195：127-137(2003)。另外，IGF-I和IGF-II这二者与IGF-结合蛋白相互作用可影响IGF的半衰期和生物利用度，以及在某些情况下影响它们与受体的直接相互作用。Rajaram等，Endocr.Rev.18：801-831(1997)。
IGF-I对细胞增殖、分化和凋亡具有长期影响。在培养的骨肉瘤和乳癌细胞中的试验提示，IGF-I是有效的有丝分裂原，通过增加DNA合成和通过刺激细胞周期蛋白D1的表达发挥其促有丝分裂作用，该作用加速了细胞周期由G1期向S期的进程。Furlanetto等，Mol.Endocrinol.8：510-517(1994)；Dufourny等，J.Biol.Chem.272：311663-31171(1997)。在胰腺癌细胞中细胞周期蛋白D1表达的抑制消除了IGF-I的促有丝分裂作用。Kornmann等，J.Clin.Invest.101：344-352(1998)。除了刺激细胞周期进程以外，IGF-I还抑制细胞凋亡。已表明，IGF-I刺激Bcl蛋白的表达，但抑制Bax的表达，这导致Bcl/Bax异二聚体的相对量的增加，由此阻断凋亡途径的启动。Minshall等，J.Immunol.159：1225-1232(1997)；Parrizas等，Endocrinology 138：1355-1358(1997)；Wang等，Endocrinology 139：1354-1360(1998)。
和IGF-I一样，IGF-II也具有促有丝分裂和抗凋亡作用，调节细胞增殖和分化。与IGF-I相比，高浓度的IGF-II在血清中循环。 已在结肠直肠癌患者中发现了高血清IGF-II浓度，在晚期疾病中具有向更高浓度发展的趋势。Renehan等，Br.J.Cancer 83：1344-1350。另外，大部分原发性肿瘤和转化细胞系过量表达IGF-II mRNA和IGF-II蛋白。Werner和LeRoith Adv.Cancer Res.68：183-223(1996)。在结肠癌中IGF-II过量表达与侵入型表型相关，IGF-II基因的印记丢失(丧失等位基因特异性表达)可能对结肠直肠癌发生很重要。Michell等，Br.J.Cancer 76：60-66(1997)；Takano等，Oncology 59：210-216(2000)。具有强烈转移趋势的癌细胞具有的IGF-II表达水平是具有低转移能力的那些细胞的4倍。Guerra等，Int.J.Cancer 65：812-820(1996)。
基础研究和临床研究已凸显了IGF家族成员在癌症的发生、维持和发展中的作用。已表明，许多癌细胞过量表达IGF-IR和/或IGF配体。例如，IGF-I和IGF-II对各种各样的癌细胞系是强有丝分裂原，包括肉瘤、白血病、前列腺癌、乳癌、肺癌、结肠癌、胃癌、食道癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、甲状腺癌、脑癌、卵巢癌和子宫癌。Macaulay等，Br.J.Cancer 65：311-320(1992)；Oku等，Anticancer Res.11：1591-1595(1991)；LeRoith等，Ann.Intern.Med.122：54-59(1995)；Yaginuma等，Oncology 54：502-507(1997)；Singh等，Endocrinology137：1764-1774(1996)；Frostad等，Eur.J.Haematol 62：191-198(1999)。当将IGF-I给予恶性结肠癌细胞时，这些细胞变得抗细胞因子诱导的凋亡。Remacle-Bonnet等，Cancer Res.60：2007-2017(2000)。
IGF在癌症中的作用还得到流行病学研究的支持，流行病学研究表明，高水平的循环IGF-I和低水平的IGFBP-3与一些常见的癌症(前列腺癌、乳癌、结肠直肠癌和肺癌)的发生风险增加有关。Mantzoros等，Br.J.Cancer 76：1115-1118(1997)；Hankinson等，Lancet351：1393-1396(1998)；Ma等，J.Natl.Cancer Inst.91：620-625(1999)；Karasik等，J.ClinEndocrinol Metab.78：271-276(1994)。这些结果提示，IGF-I和IGF-II充当了强有力的促有丝分裂和抗凋亡信号，它们的过量表达与几类癌症患者的预后不良有关联。
已有几个研究小组使用敲除小鼠模型进一步确定了IGF在肿瘤生长中的作用。随着组织特异性、条件性基因缺失技术的发展，已开发出肝脏IGF-I缺陷型(LID)小鼠模型。igf1基因的肝特异性缺失消除了IGF-I mRNA的表达，引起循环IGF-I水平急剧下降。Yakar等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：7324-7329(1999)。当在LID小鼠中诱发哺乳动物肿瘤时，降低的循环IGF-1水平导致癌的发生、生长和转移显著下降，而增加的循环IGF-1水平与增强的肿瘤生长相关。Wu等，Cancer Res.63：4384-4388(2003)。
有几篇论文已报告，抑制IGF-IR表达和/或信号转导在体外和体内均导致肿瘤生长抑制。还已经表明，抑制IGF信号转导增加肿瘤细胞对化疗药的敏感性。已开发出多种策略(反义寡核苷酸、可溶性受体、抑制性肽、显性失活受体突变体、抑制激酶活性的小分子和抗hIGF-IR抗体)来抑制肿瘤细胞中的IGF-IR信号转导途径。一种方法是用小分子抑制剂靶向IGF-IR的激酶活性。有两种化合物最近已被鉴定为能够选择性抑制IGF-IR的小分子激酶抑制剂。Garcia-Echeverria等，Cancer Cell 5：231-239(2004)；Mitsiades等，CancerCell 5：221-230(2004)。抑制IGF-IR激酶活性在MCF-7人乳癌细胞的软琼脂中消除了IGF-I介导的存活和集落形成。Garcia-Echeverria等，Cancer Cell 5：231-239(2004)。当将IGF-IR激酶抑制剂给予带有肿瘤异种移植物的小鼠时，肿瘤异种移植物中的IGF-IR信号转导被抑制，IGF-IR驱动的纤维肉瘤生长被显著降低。Garcia-Echeverria等，Cancer Cell 5：231-239(2004)。对血液恶性肿瘤、尤其是多发性骨髓瘤观察到类似的作用。在多发性骨髓瘤细胞中，与胰岛素受体相比，小分子IGF-IR激酶抑制剂表现出的抗IGF-1R效力高达16倍以上，抑制细胞生长和存活的有效性类似。Mitsiades等，Cancer Cell 5：221-230(2004)。将相同化合物腹膜内注射入小鼠，其抑制多发性骨髓瘤细胞生长，并增强小鼠存活。Mitsiades等，Cancer Cell 5：221-230(2004)。当与亚治疗剂量的其它化疗药联用时，IGF-IR激 酶活性的抑制协同地降低了肿瘤负荷。Mitsiades等，Cancer Cell 5：221-230(2004)。
另一种抑制IGF信号转导的方法是开发出针对受体IGF-IR的中和抗体。已有多个小组开发出IGF-IR抗体，其抑制受体IGF-I刺激的自身磷酸化、诱导受体内化和降解，并降低多种人癌细胞系的增殖和存活。Hailey等，Mol Cancer Ther.1：1349-1353(2002)；Maloney等，Cancer Res.63：5073-5083(2003)；Benini等，Clin.Cancer Res.7：1790-1797(2001)；Burtrum等，Cancer Res.63：8912-8921(2003)。另外，在异种移植肿瘤模型中，IGF-IR阻断导致乳腺肿瘤、肾肿瘤和胰腺肿瘤在体内的生长受到显著抑制。Burtrum等，CancerRes.63：8912-8921(2003)；Maloney等，Cancer Res.63：5073-5083(2003)。利用嵌合人源化IGF-IR抗体的试验获得了类似结果，在体外和肿瘤异种移植物中抑制乳癌细胞生长。Sachdev等，Cancer Res.63：627-635(2003)。其它人源化IGF-IR抗体在乳腺肿瘤和非小细胞肺肿瘤中以及在体内均阻断IGF-I诱导的酪氨酸磷酸化和生长抑制。Cohen等，Clin.Cancer Res.11：2063-2073(2005)；Goetsch等，Int.J.Cancer113：316-328(2005)。
增加的IGF-I水平还与几种非癌性病理状况有关，包括肢端肥大症和巨人症(Barkan，Cleveland Clin.J.Med.65：343，347-349，1998)，而异常的IGF-I/IGF-II受体功能涉及银屑病(Wraight等，Nat.Biotech.18：521-526，2000)、动脉粥样硬化和血管成形术后血管平滑肌再狭窄(Bayes-Genis等，Circ.Res.86：125-130，2000)。增加的IGF-I水平涉及糖尿病或糖尿病相关并发症，例如微脉管增生(Smith等，Nat.Med.5：1390-1395，1999)。
本领域已公开了针对IGF-I和IGF-II的抗体。参见例如Goya等，Cancer Res.64：6252-6258(2004)；Miyamoto等，Clin.Cancer Res.11：3494-3502(2005)。另外参见WO 05/18671、WO 05/28515和WO 03/93317。
发明概述
本发明的实施方案涉及特异性结合胰岛素样生长因子并降低肿瘤生长的结合蛋白。在一个实施方案中，结合蛋白是特异性结合胰岛素样生长因子并降低肿瘤生长的全人单克隆抗体或其结合片段。可实现上述效果的机制可以包括但不限于抑制IGF-I/II与其受体IGF-IR的结合、抑制IGF-I/II诱导的IGF-IR信号转导或其中降低IGF-I/II的有效浓度而增加IGF-I/II的清除。
因此，某些实施方案提供分离的全人特异性结合蛋白，其优先结合胰岛素样生长因子-II(IGF-II)，与胰岛素样生长因子I(IGF-I)有交叉反应性，并且中和IGF-I和IGF-II活性。在某些方面，结合蛋白结合IGF-II的亲和力是IGF-I的至少2.5倍。在其它方面，结合蛋白结合IGF-II的亲和力是IGF-I的至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少7倍、至少10倍、至少50倍、至少60倍、至少100倍或至少150倍。
在某些实施方案中，特异性结合蛋白在异位表达IGF-1R的NIH3T3细胞中抑制IGF-I依赖性IGF-I受体磷酸化的EC50不超过15nM。在某些方面，特异性结合蛋白在异位表达IGF-1R的NIH3T3细胞中抑制IGF-I依赖性IGF-I受体磷酸化的EC50不超过15nM、不超过10nM或不超过8nM。
在某些实施方案中，特异性结合蛋白在异位表达IGF-1R的NIH3T3细胞中抑制IGF-II依赖性IGF-I受体磷酸化的EC50不超过5nM、不超过4nM或不超过3nM。
在其它实施方案中，特异性结合蛋白以不超过25nM、不超过20nM、不超过15nM或不超过10nM的EC50抑制表达重组hIGF-IR的NIH3T3细胞的IGF-II依赖性增殖达70％以上。
在其它实施方案中，特异性结合蛋白以不超过40nM、不超过30nM或不超过25nM的EC50抑制表达重组hIGF-IR的 NIH3T3细胞的IGF-I依赖性增殖达70％以上。
在某些实施方案中，特异性结合蛋白竞争结合含有可变重链序列和可变轻链序列的单克隆抗体，所述可变重链序列选自SEQ ID NO.：2、SEQ ID NO.：6、SEQ ID NO.：10、SEQID NO.：14和SEQ ID NO.：18，所述可变轻链序列选自SEQ ID NO.：4、SEQ ID NO.：8、SEQ IDNO.：12和SEQ ID NO.：16。
本发明的一个实施方案为以低于500皮摩尔(pM)的Kd结合IGF-I的全人抗体。更优选地，抗体以低于450皮摩尔(pM)的Kd结合。更优选地，抗体以低于410皮摩尔(pM)的Kd结合。更优选地，抗体以低于350皮摩尔(pM)的Kd结合。甚至更优选地，抗体以低于300pM的Kd结合。亲和力(Affinity)和/或亲合力(avidity)检测可如本文所述通过测量。
本发明的又一个实施方案为以低于175皮摩尔(pM)的Kd结合IGF-II的全人单克隆抗体。更优选地，抗体以低于100皮摩尔(pM)的Kd结合。更优选地，抗体以低于50皮摩尔(pM)的Kd结合。更优选地，抗体以低于5皮摩尔(pM)的Kd结合。甚至更优选地，抗体以低于2pM的Kd结合。
在某些实施方案中，特异性结合蛋白是全人单克隆抗体或全人单克隆抗体的结合片段。结合片段可包括诸如Fab、Fab’或F(ab’)2和Fv的片段。
本发明的一个实施方案包括如在下文更详细论述的特异性结合IGF-I/II的全人单克隆抗体7.251.3(ATCC保藏号PTA-7422)、7.34.1(ATCC保藏号PTA-7423)和7.159.2(ATCC保藏号PTA-7424)，均于2006年3月7日保藏于美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA20110-2209USA)。
在某些实施方案中，能结合胰岛素样生长因子-II(IGF-II)但与胰岛素样生长因子-I(IGF-I)有交叉反应性的特异性结合蛋白或其结合片段，可包括具有SEQ ID NO.：6序列的重链多肽和具有SEQ ID NO.：8序列的轻链多肽。
特异性结合蛋白可包括具有SEQ ID NO.：10序列的重链多肽和具有SEQ ID NO.：12序列的轻链多肽。
本发明的特异性结合蛋白可包括具有SEQ ID NO.：14序列的重链多肽和具有SEQID NO.：16序列的轻链多肽。
在某些实施方案中，特异性结合蛋白可与药学上可接受的载体一起制成混合物。
另一个实施方案包括编码本文描述的任一种特异性结合蛋白的分离核酸分子、具有编码特异性结合蛋白的分离核酸分子的载体或用任一种这样的核酸分子和载体转化的宿主细胞。
在某些实施方案中，在IGF-II或IGF-I蛋白不结合胰岛素生长因子结合蛋白时，能结合胰岛素样生长因子-II(IGF-II)但与胰岛素样生长因子-I(IGF-I)有交叉反应性的特异性结合蛋白或其结合片段，不特异性结合IGF-II或IGF-I蛋白。
其它实施方案包括测定患者样品中的胰岛素样生长因子-II(IGF-II)和胰岛素样生长因子I(IGF-I)水平的方法。这些方法可包括提供患者样品；使该样品与能结合胰岛素样生长因子-II(IGF-II)但与胰岛素样生长因子-I(IGF-I)有交叉反应性的特异性结合蛋白或其结合片段接触；测定所述样品中的IGF-I和IGF-II水平。在某些方面，患者样品是血液。
另外的实施方案包括治疗哺乳动物的恶性肿瘤的方法。这些方法可包括选择需要治疗恶性肿瘤的哺乳动物；给予该哺乳动物治疗有效剂量的能结合胰岛素样生长因子-II(IGF-II)但与胰岛素样生长因子-I(IGF-I)有交叉反应性的特异性结合蛋白或其结合片段。在某些方面，所述动物是人。在某些方面，结合蛋白是全人单克隆抗体，选自mAb7.251.3(ATCC保藏号PTA-7422)、mAb 7.34.1(ATCC保藏号PTA-7423)和mAb 7.159.2(ATCC保藏号PTA-7424)。
可治疗的疾病可包括黑素瘤、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、甲状腺肿瘤、胃癌、前列腺癌、乳癌、卵巢癌、 膀胱癌、肺癌、成胶质细胞瘤、子宫内膜癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌和鳞状细胞癌。
其它的实施方案包括治疗哺乳动物的生长因子依赖性疾病的方法。这些方法包括选择需要治疗生长因子依赖性疾病的哺乳动物；给予所述哺乳动物治疗有效剂量的能结合胰岛素样生长因子-II(IGF-II)但与胰岛素样生长因子-I(IGF-I)有交叉反应性的特异性结合蛋白或其结合片段。在某些方面，哺乳动物可以是人。在某些方面，结合蛋白是全人单克隆抗体，选自mAb 7.251.3(ATCC保藏号PTA-7422)、mAb 7.34.1(ATCC保藏号PTA-7423)和mAb 7.159.2(ATCC保藏号PTA-7424)。
可治疗的生长因子依赖性疾病可包括骨质疏松症、糖尿病和心血管疾病。其它可治疗的病症包括肢端肥大症和巨人症、银屑病、动脉粥样硬化和血管平滑肌再狭窄以及糖尿病。
其它实施方案包括含有全人单克隆抗体或其结合片段和治疗剂的缀合物，所述全人单克隆抗体结合胰岛素样生长因子-II(IGF-II)但与胰岛素样生长因子-I(IGF-I)有交叉反应性。在某些方面，治疗剂可以是毒素、放射性同位素或药物组合物。
在其它实施方案中，本发明提供全人单克隆抗体或其结合片段，其结合胰岛素样生长因子-II(IGF-II)，与胰岛素样生长因子-I(IGF-I)有交叉反应性，并包含具有氨基酸序列“Ser Tyr Tyr Trp Ser”(SEQ ID NO：21)的重链互补决定区1(CDR1)；具有氨基酸序列“Tyr Phe Phe Tyr Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser”(SEQ ID NO：22)的重链互补决定区2(CDR2)；和具有氨基酸序列“Ile Thr Gly Thr Thr Lys Gly GlyMet Asp Val”(SEQ ID NO：23)的重链互补决定区3(CDR3)。
其它实施方案包括全人单克隆抗体或其结合片段，其含有具有氨基酸序列“ThrGly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His”(SEQ ID NO：24)的轻链互补决定区1(CDR1)。抗体在本文还可以包含具有氨基酸序列“Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser”(SEQ ID NO：25) 的轻链互补决定区2(CDR2)；和具有氨基酸序列“Gln Ser Phe Asp SerSer Leu Ser Gly Ser Val”(SEQ ID NO：26)的轻链互补决定区3(CDR3)。
在其它实施方案中，本发明提供全人单克隆抗体或其结合片段，其结合胰岛素样生长因子-II(IGF-II)，与胰岛素样生长因子-I(IGF-I)有交叉反应性，并含有具有氨基酸序列“Ser Tyr Tyr Trp Ser”(SEQ ID NO：27)的重链互补决定区1(CDR1)；具有氨基酸序列“Tyr Phe Phe Tyr Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser”(SEQ ID NO：28)的重链互补决定区2(CDR2)；和具有氨基酸序列“Ile Thr Gly Thr Thr Lys Gly GlyMet Asp Val”(SEQ ID NO：29)的重链互补决定区3(CDR3)。
其它实施方案包括全人单克隆抗体或其结合片段，其含有具有氨基酸序列“ThrGly Arg Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His”(SEQ ID NO：30)的轻链互补决定区1(CDR1)；具有氨基酸序列“Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser”(SEQ ID NO：31)的轻链互补决定区2(CDR2)；和具有氨基酸序列“Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly SerVal”(SEQ ID NO：32)的轻链互补决定区3(CDR3)。
在其它实施方案中，本发明提供全人单克隆抗体或其结合片段，其结合胰岛素样生长因子-II(IGF-II)，与胰岛素样生长因子-I(IGF-I)有交叉反应性，并包含具有氨基酸序列“Ser Tyr Asp Ile Asn”(SEQ ID NO：33)的重链互补决定区1(CDR1)；具有氨基酸序列“Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly”(SEQ IDNO：34)的重链互补决定区2(CDR2)；和具有氨基酸序列“Asp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr TyrGly Met Asp Val”(SEQ ID NO：35)的重链互补决定区3(CDR3)。
其它实施方案包括全人单克隆抗体或其结合片段，其含有具有氨基酸序列“SerGly Ser Ser Ser Asn Ile Glu Asn Asn His yal Ser”(SEQ ID NO：36)的轻链互补决定区1(CDR1)；具有氨基酸序列“Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser”(SEQ ID NO：37)的轻链互补决定区2(CDR2)；和具有氨基酸序列“Glu Thr Trp Asp Thr Ser Leu Ser Ala Gly ArgVal”(SEQ ID NO：38)的轻链互补决定区3(CDR3)。
在其它实施方案中，本发明提供全人单克隆抗体或其结合片段，其结合胰岛素样生长因子-II(IGF-II)，与胰岛素样生长因子-I(IGF-I)有交叉反应性，并包含具有氨基酸序列“Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly”(SEQ ID NO：81)的重链互补决定区1(CDR1)；具有氨基酸序列“Gly Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser”(SEQID NO：82)的重链互补决定区2(CDR2)；和具有氨基酸序列“Gln Arg Gly His Ser Ser GlyTrp Trp Tyr Phe Asp Leu”(SEQ ID NO：83)的重链互补决定区3(CDR3)。
其它实施方案包括全人单克隆抗体或其结合片段，其含有具有氨基酸序列“ArgAla Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Ala”(SEQ ID NO：84)的轻链互补决定区1(CDR1)；具有氨基酸序列“Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser”(SEQ ID NO：85)的轻链互补决定区2(CDR2)；和具有氨基酸序列“Gln Gln Ala Asn Asn Phe Pro Phe Thr”(SEQ ID NO：86)的轻链互补决定区3(CDR3)。
在其它实施方案中，本发明提供全人单克隆抗体或其结合片段，其结合胰岛素样生长因子-II(IGF-II)，与胰岛素样生长因子-I(IGF-I)有交叉反应性，并包含具有氨基酸序列“Ser Ser Ser Asn Tyr Trp Gly”(SEQ ID NO：87)的重链互补决定区1(CDR1)；具有氨基酸序列“Gly Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser”(SEQID NO：88)的重链互补决定区2(CDR2)；和具有氨基酸序列“Gln Arg Gly His Ser Ser GlyTrp Trp Tyr Phe Asp Leu”(SEQ ID NO：89)的重链互补决定区3(CDR3)。
其它实施方案包括全人单克隆抗体或其结合片段，其含有具有氨基酸序列“ArgAla Ser Arg Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala”(SEQ ID NO：90)的轻链互补决定区1(CDR1)；具有氨基酸序列“Thr Ala Ser Ser Leu Gln Ser”(SEQ ID NO：91)的轻链互补决定区2(CDR2)；和具有氨基酸序列“Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Phe Thr”(SEQ ID NO：92)的轻链 互补决定区3(CDR3)。
某些实施方案提供本文描述的特异性结合蛋白在制备用于治疗恶性肿瘤的药物中的用途。在某些方面，特异性结合蛋白可以是全人单克隆抗体。在某些方面，结合蛋白是mAb 7.251.3(ATCC保藏号PTA-7422)或mAb 7.34.1(ATCC保藏号PTA-7423)或mAb 7.159.2(ATCC保藏号PTA-7424)。在某些方面，所述药物与第二种抗肿瘤药物联用，所述第二种抗肿瘤药物选自抗体、化疗药和放射性药物。在某些方面，所述药物与常规手术、骨髓干细胞移植或外周干细胞移植同时使用或在其后使用。
恶性肿瘤例如可以是黑素瘤、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、甲状腺肿瘤、胃癌、前列腺癌、乳癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、成胶质细胞瘤、子宫内膜癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌和鳞状细胞癌。
其它实施方案提供本文所述的特异性结合蛋白在制备用于治疗生长因子依赖性疾病的药物中的用途。在某些方面，特异性结合蛋白是全人单克隆抗体，可选自mAb7.251.3(ATCC保藏号PTA-7422)、mAb 7.34.1(ATCC保藏号PTA-7423)和mAb 7.159.2(ATCC保藏号PTA-7424)。
生长因子依赖性疾病例如可以是骨质疏松症、糖尿病和心血管疾病。
优选地，抗体包括具有互补决定区(CDR)的重链氨基酸序列，其中一个或多个序列见表11。例如，抗体可包括具有表11所示的一个或多个序列的CDR1、CDR2或CDR3或其组合的重链氨基酸序列。需要指出的是，本领域普通技术人员很容易完成CDR测定。参见例如Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷。
本文描述的本发明的实施方案涉及结合IGF-I/II并影响IGF-I/II功能的单克隆抗体。其它实施方案涉及全人抗IGF-I/II抗体和 抗IGF-I/II抗体制品，其具有从治疗观点看需要的特性，包括对IGF-I/II的高结合亲和力、在体外和体内中和IGF-I/II的能力以及抑制IGF-I/II诱导的细胞增殖的能力。
附图简述
图1图示了与IgG2和PBS对照相比，采用mAb 7.159.2、7.34.1、7.251.3对裸鼠中表达IGF-II和IGF-IR的NIH3T3细胞(克隆32细胞)的异种移植肿瘤生长的抑制。y轴为平均肿瘤体积，x轴为移植后的时间。
图2图示了与IgG2和PBS对照相比，采用mAb 7.159.2、7.34.1、7.251.3治疗的克隆32异种移植小鼠的体重。y轴为平均体重，x轴为移植后的时间。
图3图示了与PBS对照相比，采用mAb 7.159.2对裸鼠中表达IGF-II和IGF-IR的NIH3T3细胞(P12细胞)的异种移植肿瘤生长的抑制。y轴为平均肿瘤体积，x轴为移植后的时间(以日期表示)。
发明详述
本文描述的本发明的实施方案涉及特异性结合IGF-II但与IGF-I有交叉反应性(在本文称为“IGFI/II”)的结合蛋白。在某些实施方案中，结合蛋白是抗体或其结合片段，其结合IGF-II，与IGF-I有交叉反应性，并抑制这些蛋白与它们的受体IGF-IR的结合。本发明的其它实施方案包括在治疗上有用并结合这两种胰岛素样生长因子的全人抗IGF-I/II中和抗体以及抗体制品。这类抗IGF-I/II抗体制品优选具有需要的治疗特性，包括对IGF-I/II的强结合亲和力、在体外中和IGF-I/II的能力以及在体内抑制IGF-I/II诱导的细胞增殖的能力。
本发明的实施方案还包括抗IGF-I/II抗体的分离的结合片段。优选地，结合片段来源于全人抗IGF-I/II抗体。如下文更详细的描述，示例性片段包括Fv、Fab’或其它众所周知的抗体片段。本发 明的实施方案还包括表达抗IGF-I/II的全人抗体的细胞。细胞的实例包括产生抗IGF-I/II抗体的杂交瘤，即重组产生的细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
另外，本发明的实施方案包括使用这些抗体治疗疾病的方法。抗IGF-I/II抗体可用于预防IGF-I/II介导的IGF-I/II信号转导，由此抑制细胞增殖。此抑制的作用机制可包括抑制IGF-I/II与其受体IGF-IR结合、抑制IGF-I/II诱导的IGF-IR信号转导或其中降低结合IGF-IR的IGF-I/II的有效浓度而增强IGF-I/II的清除。可通过此抑制机制治疗的疾病包括但不限于肿瘤疾病，例如黑素瘤、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、妇科肿瘤、头颈部癌、食道癌、成胶质细胞瘤，以及甲状腺、胃、前列腺、乳腺、卵巢、膀胱、肺、子宫、肾、结肠和胰腺、唾腺和结肠直肠的癌症和肿瘤。
本发明的其它实施方案包括用于特异性确定生物样品中的IGF-I/II量的诊断测定。测定试剂盒可包括抗IGF-I/II抗体以及检测这类抗体必需的标记。这些诊断测定可用于筛选与生长因子相关的疾病，包括但不限于肿瘤疾病，例如黑素瘤、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、妇科肿瘤、头颈部癌、食道癌、成胶质细胞瘤，以及甲状腺、胃、前列腺、乳腺、卵巢、膀胱、肺、子宫、肾、结肠和胰腺、唾腺和结肠直肠的癌症。其它非肿瘤病症可包括肢端肥大症和巨人症、银屑病、骨质疏松症、动脉粥样硬化和血管平滑肌再狭窄以及糖尿病。
关于抗IGF-I/II抗体的其它实施方案、特征等在下文另外详细提供。
序列表
本发明的实施方案包括在下表1列出的特异性抗IGF-I/II抗体。该表报告了每种抗IGF-I/II抗体的标识号连同对应的重链和轻链基因的序列标识号(SEQ ID NO.)。此外，由其获得每个重链 和轻链的种系序列也在下表1提供。
每种抗体都给出了标识号，其包括用1个或2个小数点间隔开的2个或3个数字。在某些情况下，制备了1种抗体的几个克隆。尽管克隆具有和亲本序列相同的核酸和氨基酸序列，但它们也可以单独列出，克隆编号由第2个小数点右侧的数字标出。因此，举例来说，抗体7.159.2的核酸和氨基酸序列与抗体7.159.1的序列相同。
通过对比序列表中的序列可以看出，SEQ ID NO.：1-20与SEQ ID NO.：39-58不同，因为SEQ ID NO.：39-58包括未翻译的信号肽以及每个经测序的重链或轻链的恒定区。
表1
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有科技术语都应具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。此外，除非文中另有要求，否则单数术语应包含复数形式，而复数术语应包括单数。一般而言，与本文描述的细胞和组织培养、分子生物学以及蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交关联使用的命名和技术是本领域众所周知并常用的。
对重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化使用标准技术(例如电穿孔、脂转染)。按照生产商的说明或如本领域通常实现的或如本文所述进行酶反应和纯化技术。一般按照本领域众所周知的常规方法和在整个本说明书中提及和论述的众多一般性和更具体的参考文献中所描述的，实施前述技术和方法。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(2001))，该文献通过引用结合到本文中。与本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学关联使用的命名以及实验室方法和技术是本领域众所周知并常用的。可对化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者治疗均使用标准技术。
除非另有说明，否则按照本文公开内容使用的下列术语应被理解为具有以下含义：
术语“IGF-I”指胰岛素样生长因子-I分子，术语“IGF-II”指胰岛素样生长因子-II分子。术语“IGF-I/II”指胰岛素样生长因子-I和II两种分子，并涉及优先结合IGF-II但与IGF-I有交叉反应性。因此，结合IGF-I/II的抗体将优先结合IGF-II，但与IGF-I有交叉反应，其结合IGF-II的亲和力高于IGF-I。例如，抗体结合IGF-II的亲和力可以是IGF-I的2.5倍。在某些实施方案中，抗体结合IGF-II的亲和力可以是IGF-I的至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍或至少150倍。
术语“中和”在涉及抗体时是指抗体消除或显著降低靶抗原的活性的能力。因此，抗IGF-I/II“中和”抗体能够消除或显著降低IGF-I/II的活性。IGF-I/II中和抗体例如可通过阻断IGF-I/II与其受体IGF-IR的结合起作用。通过阻断该结合，IGF-IR介导的信号转导被显著地或完全地消除。理想地，抗IGF-I/II中和抗体抑制细胞增殖。
本文使用的术语“分离的多核苷酸”应指已由其天然环境分离出来的多核苷酸。这样的多核苷酸可以是基因组、cDNA或合成多核苷酸。分离的多核苷酸优选与它们天然结合的多核苷酸的全部或部分不结合。分离的多核苷酸可与其天然不连接的另一个多核苷酸有效连接。另外，分离的多核苷酸优选不作为较大序列的一部分天然存在。
本文提到的术语“分离的蛋白质”是指已由其天然环境中分离出来的蛋白质。这些蛋白可来源于基因组DNA、cDNA、重组DNA、重组RNA或合成来源或其某些组合，“分离的蛋白质”依据其起源或来源，(1)不与天然存在的蛋白质结合，(2)没有同一来源的其它蛋白质，例如没有鼠类蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)不天然存在。
术语“多肽”在本文作为一般性术语用于指多肽序列的天然蛋白、片段或类似物。因此，天然蛋白、片段和类似物是多肽属的种。本发明的优选多肽包含人重链免疫球蛋白分子和人κ轻链免疫球蛋白分子，以及通过包含重链免疫球蛋白分子和轻链免疫球蛋白分子(例如κ或λ轻链免疫球蛋白分子，反之亦然)的组合形成的抗体分子，以及其片段和类似物。本发明的优选多肽还可以仅含有人重链免疫球蛋白分子或其片段。
本文使用的术语“天然的”在应用于对象时是指对象可天然存在的事实。例如，天然的多肽或多核苷酸序列存在于生物(包括病毒)中，可分离自天然来源，并且还没有在实验室被人有意修饰或以 其它方式修饰。
本文使用的术语“有效连接的”是指所述组分的位置关系允许它们以其预期方式起作用。例如，与编码序列“有效连接的”控制序列以在与控制序列相适的条件下实现编码序列表达的方式连接。
本文提及的术语“多核苷酸”是指长度为至少10个碱基的聚合形式的核苷酸，其或者为核糖核苷酸，或者为脱氧核糖核苷酸，或者为修饰形式的任一类核苷酸，或者为RNA-DNA异源双链体。该术语包括单链和双链形式的DNA。
本文提及的术语“寡核苷酸”包括通过天然键和非天然键连接在一起的天然的和修饰的核苷酸。寡核苷酸为多核苷酸亚类，其长度一般为200个碱基以下。优选地，寡核苷酸的长度为1-60个碱基，最优选长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20至40个碱基。寡核苷酸通常为单链的，例如寡核苷酸探针；但寡核苷酸可以是双链的，例如用于构建基因突变体的寡核苷酸。寡核苷酸可以是有义或反义寡核苷酸。
本文提及的术语“天然核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文提及的术语“修饰的核苷酸”包括具有修饰的或取代的糖基等的核苷酸。本文提及的术语“寡核苷酸键”包括诸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺基磷酸酯(phosphoraniladate)、氨基磷酸酯等的寡核苷酸键。参见例如LaPlanche等，Nucl.Acids Res.14：9081(1986)；Stec等，J.Am.Chem.Soc.106：6077(1984)；Stein等，Nucl.Acids Res.16：3209(1988)；Zon等，Anti-Cancer Drug Design 6：539(1991)；Zon等，Oligonucleotides and Analogues：APractical Approach，第87-108页(F.Eckstein编辑，Oxford University Press，OxfordEngland(1991))；Stec等，美国专利第5,151,510号；Uhlmann和Peyman，Chemical Reviews90：543(1990)，这些文献的公开内容在此引入作为 参考。如有需要，寡核苷酸可包含用于检测的标记。
本文提及的术语“选择性杂交”指可检测地且特异性地结合。在使可检测的非特异性核酸结合的可评估量最小的杂交和洗涤条件下，多核苷酸、寡核苷酸及其片段与核酸链选择性杂交。高严格条件可用于获得如本领域所知和本文论述的选择性杂交条件。一般来说，多核苷酸、寡核苷酸或抗体片段和目标核酸序列之间的核酸序列同源性为至少80％，更典型地优选具有至少85％、90％、95％、99％和100％的渐增同源性。
如果两个氨基酸序列在它们的序列之间有部分或完全的同一性，则它们是“同源的”。例如，85％的同源性指比对两个序列的最大匹配时85％的氨基酸相同。空位(在要匹配的两个序列的任一个当中)被允许用于最大化匹配；优选空位长度为5以下，更优选空位长度为2以下。或者和优选地，当该术语在本文使用时，如果使用采用突变数据矩阵和6以上的空位罚分的程序ALIGN，两个蛋白质序列(或来源于它们的长度至少约30个氨基酸的多肽序列)的比对分值为5以上(为标准偏差单位)，则它们是同源的。参见Dayhoff，M.O.，载于Atlas of Protein Sequence and Structure，第101-110页(第5卷，National BiomedicalResearch Foundation(1972))及该卷的附录2，第1-10页。如果在使用ALIGN程序最佳比对时两个序列或其部分的氨基酸有大于或等于50％同一性，则两个序列或其部分是更优选同源的。应当认识到的是，在两个直向同源序列中可存在不同的同源区。例如，小鼠和人的直向同源物的功能位点可具有高于非功能区的同源性程度。
术语“对应于”在本文用于指多核苷酸序列与全部或部分参比多核苷酸序列同源(即为相同的，在进化上不严格相关)，或者多肽序列与参比多肽序列相同。
相比之下，术语“与……互补”在本文用于指互补序列与全部或部分参比多核苷酸序列同源。举例说明，核苷酸序列“TATAC”对应于参比序列“TATAC”，而与参比序列“GTATA”互补。
以下术语用于描述两个或更多个多核苷酸或氨基酸序列之间的序列关系：“参比序列”、“比较窗”、“序列同一性”、“序列同一性百分率”和“显著同一性”。“参比序列”是用作序列比较基础的限定序列。参比序列可以是较大序列的一部分，例如作为全长cDNA或序列表中给出的基因序列的区段，或者可以包含完整的cDNA或基因序列。一般来说，参比序列的长度为至少18个核苷酸或6个氨基酸，通常长度为至少24个核苷酸或8个氨基酸，经常长度为至少为48个核苷酸或16个氨基酸。因为两个多核苷酸或氨基酸序列各自可以(1)包含在两个分子之间相似的序列(即完整多核苷酸或氨基酸序列的一部分)，和(2)还可以包含在两个多核苷酸或氨基酸序列之间不同的序列，两个(或更多个)分子之间的序列比较通常通过在“比较窗”内比较两个分子的序列进行，以鉴定和比较局部区域的序列相似性。本文使用的“比较窗”是指至少约18个连续核苷酸位置或约6个氨基酸的概念区段，其中多核苷酸序列或氨基酸序列与至少约18个连续核苷酸或6个氨基酸序列的参比序列比较，其中为了最佳比对两个序列，与参比序列(其不含添加或缺失)相比，比较窗中的多核苷酸序列部分可包含20％以下的添加、缺失、置换等(即空位)。用于比对比较窗的序列最佳比对可通过Smith和Waterman Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法、通过Pearson和LipmanProc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85：2444(1988)的相似性方法检索、通过这些算法的计算机实现(Wisconsin遗传软件包发布版7.0，(Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GENEWORKSTM或软件包)或通过目测进行，选出通过多种方法产生的最佳比对(即在比较窗内产生最高的同源性百分率)。
术语“序列同一性”指在比较窗中两个多核苷酸或氨基 酸序列是相同的(即以核苷酸计，或者以残基计)。术语“序列同一性百分率”如下计算：对比比较窗内的两个最佳比对序列，确定两个序列中存在相同核酸碱基(例如A、T、C、G、U或I)或氨基酸残基的位置数，得到匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗中的位置总数(即比较窗大小)，将结果乘以100，得到序列同一性百分率。本文使用的术语“显著同一性”表示多核苷酸或氨基酸序列的特征，其中在至少18个核苷酸(6个氨基酸)位的比较窗内，经常在至少24-48个核苷酸(8-16个氨基酸)位的窗内，多核苷酸或氨基酸序列含有的序列与参比序列相比具有至少85％的序列同一性，优选至少90-95％的序列同一性，更优选至少99％的序列同一性，其中可通过在比较窗内比较参比序列与可包含缺失或添加的序列计算序列同一性百分率，所述缺失或添加总计为参比序列的20％以下。参比序列可以是较大序列的一部分。
本文使用的20种常规氨基酸以及它们的缩写遵循常规用法。参见Immunology-ASynthesis(第2版，E.S.Golub和D.R.Gren编辑，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))，该文献在此引入作为参考。20种常规氨基酸的立体异构体(例如D氨基酸)，非天然氨基酸，例如α氨基酸、α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常规氨基酸，也可以为本发明多肽的适宜组分。非常规氨基酸的实例包括：4-羟基脯氨酸、γ-羰基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其它类似氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟基脯氨酸)。在本文使用的多肽符号中，按照标准用法和惯例，左侧方向为氨基端方向，右侧方向为羧基端方向。
类似地，除非另有明确说明，否则单链多核苷酸序列的左侧末端为5’端；双链多核苷酸序列的左侧方向被称为5’方向。初生RNA转录物的5’至3’添加方向被称为转录方向；在DNA链上与RNA具有相同序列并处于RNA转录物5’端的5’的序列区被称为“上游序列”；在DNA链上与RNA具有相同序列并处于RNA转录物3’端的 3’的序列区被称为“下游序列”。
术语“显著同一性”在应用于多肽时，是指两个肽序列在最佳比对时(例如通过使用默认空位权重的程序GAP或BESTFIT)共享至少80％的序列同一性，优选至少90％的序列同一性，更优选至少95％的序列同一性，最优选至少99％的序列同一性。优选地，不相同的残基位置差别在于保守氨基酸置换。保守氨基酸置换是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，一组具有脂肪族侧链的氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸为丝氨酸和苏氨酸；一组具有含酰胺侧链的氨基酸为天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳香族侧链的氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；一组具有含硫侧链的氨基酸为半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸置换组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。
如本文所论述的，设想将抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列的微小变异包含在本发明中，只要氨基酸序列的变异与本文所述抗体或免疫球蛋白分子保持至少75％、更优选至少80％、90％、95％和最优选99％的序列同一性。具体地说，考虑了保守氨基酸置换。保守置换是在具有相关侧链的氨基酸家族中发生的那些置换。遗传编码的氨基酸一般被分为几个家族：(1)酸性的＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性的＝赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性的＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电的极性的＝甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。更优选的家族为：丝氨酸和苏氨酸为脂肪族-羟基家族；天冬酰胺和谷氨酰胺为含酰胺的家族；丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸为脂肪族家族；而苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸为芳香族家族。例如，合理预期是用异亮氨酸或缬氨酸独立置换亮氨酸，用谷氨酸置换天冬氨酸，用丝氨酸置换苏氨酸，或者用对所获分子的结合功 能或特性没有重要影响的结构相关氨基酸类似地置换氨基酸，尤其是在置换不涉及构架位点内的氨基酸的情况下。氨基酸改变是否产生功能性肽可以通过测定多肽衍生物的特定活性容易地确定。测定在本文详细描述。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可由本领域普通技术人员容易地制备。片段或类似物的氨基端和羧基端优选出现在功能域的边界附近。结构域和功能域可通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公开的或专利性的序列数据库比较来鉴定。优选地，使用计算机化比较方法鉴定出现在已知结构和/或功能的其它蛋白中的序列基序或预测的蛋白构象域。鉴定折叠为已知三维结构的蛋白序列的方法是已知的。Bowie等，Science 253：164(1991)。因此，前述实例表明，本领域技术人员可识别序列基序和结构构象，其可用于限定符合本文所述抗体的结构域和功能域。
优选的氨基酸置换：(1)降低对蛋白水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变对形成的蛋白复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，和(5)赋予或修饰这些类似物的其它物理化学或功能特性。类似物可包括不是天然肽序列的序列的多种突变蛋白。例如，可在天然序列(优选在形成分子间接触的结构域之外的多肽部分)中产生单个或多个氨基酸置换(优选保守氨基酸置换)。保守氨基酸置换不应显著改变亲本序列的结构特征(例如置换氨基酸不应趋向于破坏亲本序列中存在的螺旋，或者破坏其它类型的表征亲本序列的二级结构)。本领域公知的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins，Structures andMolecular Principles(Creighton编辑，W.H.Freeman和Company，New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden和J.Tooze编辑，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))；和Thornton等，Nature 354：105(1991)，所述文献在此引入作为参考。
本文使用的术语“多肽片段”是指这样的多肽：其具有氨基端和/或羧基端缺失，但其中余下的氨基酸序列与例如由全长cDNA序列导出的天然序列中的对应位置相同。通常，片段的长度为 至少5、6、8或10个氨基酸，优选长度为至少14个氨基酸，更优选长度为至少20个氨基酸，通常长度为至少50个氨基酸，甚至更优选长度为至少70个氨基酸。本文使用的术语“类似物”是指包含至少25个氨基酸的区段的多肽，该区段与导出的氨基酸序列的一部分具有显著同一性，具有至少一种以下特性：(1)在适宜的结合条件下与IGF-I/II特异性结合，(2)能够阻断适宜的IGF-I/II结合，或(3)能够抑制IGF-I/II活性。通常，多肽类似物含有对天然序列来说保守的氨基酸置换(或添加或缺失)。类似物的长度通常为至少20个氨基酸，优选长度为至少50个氨基酸或更长，并常常可与全长天然多肽等长。
在制药工业中，肽类似物常常作为非肽药物使用，其特性类似于模板肽的特性。这些类型的非肽化合物称为“肽模拟物”(peptide mimetics或peptidomimetics)。Fauchere，J.Adv.Drug Res.15：29(1986)；Veber和Freidinger TINS第392页(1985)；和Evans等，J.Med.Chem.30：1229(1987)，所述文献在此引入作为参考。这些化合物经常借助于计算机化分子建模开发。在结构上类似于治疗有用肽的肽模拟物(peptide mimetics)可用于产生等同的治疗或预防作用。一般来说，肽模拟物(peptidomimetics)在结构上类似于范例多肽(即具有生物化学特性或药理学活性的多肽)，例如人抗体，但具有一个或多个肽键，所述肽键任选地通过本领域众所周知的方法被选自以下的键置换：-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-。用相同类型的D-氨基酸系统性取代共有序列的一个或多个氨基酸(例如D-赖氨酸代替L-赖氨酸)可用于产生更稳定的肽。另外，含有共有序列或显著相同的共有序列变异的限制肽可通过本领域已知方法产生(Rizo和Gierasch Ann.Rev.Biochem.61：387(1992)，该文献在此引入作为参考)；例如，通过加入能够形成环化肽的分子内二硫键的内部半胱氨酸残基。
本文使用的术语“抗体”指包含至少一个结合域的多肽或多肽组，所述结合域由具有三维结合空间的多肽链折叠形成，所述 三维结合空间具有与抗原的抗原决定簇特征互补的内部表面形状和电荷分布。抗体通常具有四聚体形式，包含两对相同的多肽链，每对都具有1条“轻链”和1条“重链”。每对轻链/重链的可变区形成抗体结合位点。
通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割产生抗体的“结合片段”。结合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和单链抗体。非“双特异性”或“双功能”抗体的抗体被理解为其结合位点的每一个都是相同的。在过量的抗体将结合反受体的受体量降低达至少约20％、40％、60％或80％以及更通常约85％以上时(根据体外竞争性结合测定中的检测)，抗体显著抑制受体与反受体的粘附。
本文使用的“结合蛋白”或“特异性结合蛋白”为特异性结合靶分子的蛋白。抗体和抗体结合片段为结合蛋白。
术语“表位”包括任何能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的蛋白决定簇。表位决定簇通常由诸如氨基酸或糖侧链的化学活性表面分子类别组成，并可以但不总是具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。在解离常数≤1μM、优选≤100nM和最优选≤10nM时，将抗体说成是特异性结合抗原。
术语“治疗剂”在本文用于指化合物、化合物的混合物、生物大分子或由生物材料制成的提取物。
关于IGF-I/II多肽的“活化的”或“活性”是指IGF-I/II多肽部分具有天然IGF-I/II多肽的生物活性或免疫活性。“生物的”在本文使用时是指由天然IGF-I/II多肽的活性产生的生物功能。优选的IGF-I/II生物活性包括例如IGF-I/II诱导的细胞增殖。
“哺乳动物”在本文使用时是指被视为哺乳动物的任何动物。优选地，哺乳动物是人。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，也称为“Fab”片段和“Fc”片段，该片段不具有抗原结合活性，但具有结晶能力。用胃蛋白酶消化抗体产生F(ab’)2片段，其中抗体分子的 两个臂保持连接，并含有两个抗原结合位点。F(ab’)2片段具有交联抗原的能力。
“Fv“在本文使用时是指保留了抗原识别位点和抗原结合位点这二者的抗体最小片段。
“Fab”在本文使用时是指含有轻链恒定区和重链CHl区的抗体片段。
术语“mAb”是指单克隆抗体。
“脂质体”在本文使用时是指可用于将药物传递给哺乳动物的小囊泡，所述药物可包括本发明的IGF-I/II多肽或此IGF-I/II多肽的抗体。
本文使用的“标记”或“标记的”是指在多肽上添加可检测部分，例如放射性标记、荧光标记、酶标记、化学发光标记基团或生物素化基团。放射性同位素或放射性核素可包括3H、14C、15N、 35S、90y、99Tc、111In、125I、131I，荧光标记可包括罗丹明、镧系元素磷光体或FITC，酶标记可包括辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶。
本文使用的术语“药剂或药物”是指在正确给予患者时能够诱发期望疗效的化合物或组合物。本文的其它化学术语按照本领域的常规用法使用，如The McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(Parker，S.编辑，McGraw-Hill，San Francisco(1985)(该文献在此引入作为参考)所例举的。
本文使用的“大致纯的”是指目标物质为主要存在物质(即以摩尔为基准其比组合物中的任何其它单种物质都更丰富)，优选大致纯的级分为其中目标物质占存在的所有大分子物质的至少约50％(以摩尔为基准)的组分。一般而言，大致纯的组分占组合物中存在的所有大分子物质的约80％以上，更优选约85％、90％、95％和99％以上。最优选地，目标物质被纯化至必需的均一性(组合物中的杂质物质通过常规检测方法检测不到)，其中组合物基本由单一大分子物质组 成。
术语“患者”包括人受试者和禽兽受试者。
人抗体和抗体的人源化
人抗体没有与具有小鼠或大鼠可变区和/或恒定区的抗体相关的一些问题。这些小鼠或大鼠衍生蛋白的存在可导致抗体被快速清除掉，或者可以导致患者产生抗抗体的免疫应答。为了避免使用小鼠或大鼠衍生化抗体，可通过将功能性人抗体基因座导入啮齿动物、其它哺乳动物或动物中而产生全人抗体，使得啮齿动物、其它哺乳动物或动物产生全人抗体。
一种产生全人抗体的方法是通过使用品系小鼠，其已被工程化，含有高达但不足1000kb大小的人重链基因座和κ轻链基因座的种系成形片段(germlineconfigured fragment)。参见Mendez等，Nature Genetics 15：146-156(1997)以及Green和Jakobovits J.Exp.Med.188：483-495(1998)。品系可得自Abgenix，Inc.(Fremont，CA)。
品系小鼠的生产还论述并描绘于1990年1月12日申请的美国专利申请序号07/466,008、1990年11月8日申请的07/610,515、1992年7月24日申请的07/919,297、1992年7月30日申请的07/922,649、1993年3月15日申请的08/031,801、1993年8月27日申请的08/112,848、1994年4月28日申请的08/234,145、1995年1月20日申请的08/376,279、1995年4月27日申请的08/430,938、1995年6月5日申请的08/464,584、1995年6月5日申请的08/464,582、1995年6月5日申请的08/463,191、1995年6月5日申请的08/462,837、1995年6月5日申请的08/486,853、1995年6月5日申请的08/486,857、1995年6月5日申请的08/486,859、1995年6月5日申请的08/462,513、1996年10月2日申请的08/724,752、1996年12月3日申请的08/759,620、2001年11月30日申请的美国公开号2003/0093820以及 美国专利第6,162,963、6,150,584、6,114,598、6,075,181和5,939,598号，以及日本专利号3 068 180B2、3 068 506 B2和3 068 507 B2。另参见1996年6月12日受让公开的欧洲专利号EP 0 463151 B1、1994年2月3日公开的国际专利申请号WO 94/02602、1996年10月31日公开的国际专利申请号WO 96/34096、1998年6月11日公开的wO 98/24893、2000年11月21日公开的WO 00/76310。上述每个专利、申请和参考文献的公开内容都整体在此引入作为参考。
在替代方法中，其他的人或公司，包括GenPharm International，Inc.，已使用“微小基因座”法。在微小基因座法中，通过包含Ig基因座的部分(单个基因)模拟外源Ig基因座。因此，一个或多个VH基因、一个或多个DH基因、一个或多个JH基因、μ恒定区以及通常第二个恒定区(优选γ恒定区)组成构建体，用于插入到动物中。该方法描述于授予Surani等的美国专利第5,545,807号以及每个均授予Lonberg和Kay的美国专利第5,545,806、5,625,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,877,397、5,874,299和6,255,458号，授予Krimpenfort和Berns的美国专利第5,591,669和6,023.010号，授予Berns等的美国专利第5,612,205、5,721,367和5,789,215号，授予Choi和Dunn的美国专利第5,643,763号，以及1990年8月29日申请的GenPharm International的美国专利申请序号07/574,748、1990年8月31日申请的07/575,962、1991年12月17日申请的07/810,279、1992年3月18日申请的07/853,408、1992年6月23日申请的07/904,068、1992年12月16日申请的07/990,860、1993年4月26日申请的08/053,131、1993年7月22日申请的08/096,762、1993年11月18日申请的08/155,301、1993年12月3日申请的08/161,739、1993年12月10日申请的08/165,699、1994年3月9日申请的08/209,741，所述文献的公开内容在此引入作为参考。另参见欧洲专利号0 546 073 B 1、国际专利申请号WO 92/03918、WO 92/22645、WO92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852和WO 98/24884以及美国专利号5,981,175，所述文献的公开内容整体在此引入作为参考。还参见Taylor等，1992，Chen等，1993，Tuaillon等，1993，Choi等，1993，Lonberg等，(1994)，Taylor等，(1994)，和Tuaillon等，(1995)，Fishwild等，(1996)，所述文献的公开内容整体在此引入作为参考。
Kirin也已经证实由小鼠产生人抗体，其中通过微细胞融合导入大部分染色体或完整染色体。参见欧洲专利申请号773 288和843 961，所述文献的公开内容在此引入作为参考。另外，已产生了KMTM小鼠，其是Kirin的Tc小鼠与Medarex的微小基因座(Humab)小鼠杂交育种的结果。这些小鼠具有Kirin小鼠的人IgH转染色体和Genpharm小鼠的κ链转基因(Ishida等，Cloning Stem Cells，(2002)4：91-102)。
人抗体还可以通过体外方法获得。适宜的实例包括但不限于噬菌体展示(CAT、Morphosys、Dyax、Biosite/Medarex、Xoma、Symphogen、Alexion(以前称为Proliferon)、Affimed)、核糖体展示(CAT)、酵母展示等。
抗体制备
如下所述，通过利用技术制备本文所述抗体。然后，这些小鼠能够产生人免疫球蛋白分子和抗体，但不能产生鼠免疫球蛋白分子和抗体。用于实现此目标的技术公开于在本文背景部分公开的专利、申请和参考文献。然而，具体地说，转基因生产小鼠和由其获得的抗体的优选实施方案公开于1996年12月3日申请的美国专利申请序号08/759,620、1998年6月11日公开的国际专利申请号WO 98/24893、2000年12月21日公开的WO00/76310，所述文献的公开内容在此引入作为参考。另参见Mendez等，Nature Genetics15：146-156(1997)，该文献的公开内容在此引入作为参考。
通过应用此技术，已产生针对多种抗原的全人单克隆抗 体。基本上，用目标抗原(例如IGF-I/II)免疫系小鼠，由超免小鼠回收淋巴细胞(例如B细胞)，将回收的淋巴细胞与骨髓类型的细胞系融合，制备无限增殖化杂交瘤细胞系。筛选并选择这些杂交瘤细胞系，以鉴别产生对目标抗原具有特异性的抗体的杂交瘤细胞系。本文提供用于生产产生IGF-I/II特异性抗体的多发性骨髓瘤细胞系的方法。此外，本文提供由这些细胞系产生的抗体的特征，包括这些抗体的重链和轻链的核苷酸和氨基酸序列分析。
或者，可直接测定B细胞，而不是与骨髓瘤细胞融合来产生杂交瘤。例如，可由超免疫小鼠分离出CD19+B细胞，并使其增殖并分化为分泌抗体的浆细胞。然后通过ELISA筛选细胞上清液中的抗体针对IGF-I/II免疫原的活性。还可以筛选上清液针对IGF-I/II片段的免疫反应性，以进一步对结合IGF-I/II上的功能性目标结构域的不同抗体作图。还可以筛选抗其它相关人趋化因子的抗体以及抗大鼠、小鼠和非人灵长类动物(例如猕猴)的IGF-I/II直系同源物的抗体，后述抗体用于测定物种的交叉反应性。可通过多种方法，包括融合，由单独的孔或合并的孔制备杂交瘤，或者通过用EBV感染或通过已知的无限增殖化基因转染，然后置于适宜的培养基中，使来自含有目标抗体的孔中的B细胞无限增殖。或者，然后使用IGF-I/II特异性溶血斑测定(Babcook等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：7843-48(1996))，分离出分泌具有期望特异性的抗体的单一浆细胞。裂解靶细胞优选为用IGF-I/II抗原包被的绵羊红细胞(SRBC)。
在含有分泌目标免疫球蛋白和补体的浆细胞的B细胞培养物存在下，形成了斑块就说明目标浆细胞周围的绵羊红细胞发生IGF-I/II介导的特异性裂解。可分离在斑块中心的单一抗原特异性浆细胞，编码抗体特异性的遗传信息由单个浆细胞分离。使用逆转录后接PCR(RT-PCR)，可以克隆编码抗体的重链和轻链可变区的DNA。此克隆的DNA然后可以进一步插入到适宜的表达载体中，优选诸如pcDNA的载体表达盒，更优选含有免疫球蛋白重链和轻链的恒定区的 此pcDNA载体。然后可将产生的载体转染到宿主细胞例如HEK293细胞、CHO细胞中，并在适宜改进的常规营养培养基中培养，用于诱导转录、选择转化体或扩增编码期望序列的基因。
一般来说，融合杂交瘤产生的抗体为具有全人κ或λ轻链的人IgG2重链。本文所述抗体具有人IgG4重链以及IgG2重链。抗体还可以为其它人同种型，包括IgG1。抗体在通过固相和溶液相技术检测时具有高亲和力，通常Kd为约10-6M至约10-12M或以下。优选KD至少为10-11M的抗体，以抑制IGF-I/II活性。
要认识到的是，抗IGF-I/II抗体可在非杂交瘤细胞系的细胞系中表达。编码特定抗体的序列可用于转化适宜的哺乳动物宿主细胞。转化可通过将多核苷酸导入宿主细胞中的任何已知方法进行，包括例如将多核苷酸包装在病毒中(或病毒载体中)，并用病毒(或载体)转导宿主细胞，或通过本领域已知的转染方法进行，如美国专利第4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455号(所述专利在此引入作为参考)所例举的。使用的转化方法取决于待转化的宿主。用于将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞中的方法在本领域众所周知，包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、凝聚胺(polybrene)介导的转染、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸在脂质体中囊化以及将DNA直接微注射到细胞核中。
可作为表达宿主的哺乳动物细胞系在本领域众所周知，包括许多可得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的无限增殖化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、人上皮肾293细胞以及许多其它细胞系。通过测定哪些细胞系具有高表达水平并产生具有组成型IGF-I/II结合特性的抗体，从中选出具有特定偏向性的细胞系。
抗IGF-I/II抗体可用于检测患者样品中的IGF-I/II，并因此可用作本文所述病症的诊断试剂。另外，基于抗IGF-I/II抗体显著 中和IGF-I/II活性的能力(在以下实施例中证实)，它们对治疗由IGF-I/II表达引起的症状和病症有治疗效果。在具体实施方案中，本文的抗体和方法涉及由IGF-I/II诱导的细胞增殖引起的症状的治疗。其它实施方案涉及使用本文所述抗体和方法治疗疾病，包括肿瘤疾病，例如黑素瘤、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、甲状腺肿瘤、胃癌、前列腺癌、乳癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、成胶质细胞瘤、子宫内膜癌、肾癌、结肠癌、妇科肿瘤、头颈部癌、食道癌和胰腺癌。其它非肿瘤病症可包括肢端肥大症和巨人症、银屑病、骨质疏松症、动脉粥样硬化和血管平滑肌再狭窄以及糖尿病。
治疗性给药和制剂
本发明的实施方案包括可用作疾病治疗的抗IGF-I/II抗体的无菌药物制剂。这些制剂应抑制IGF-I/II与其受体IGF-IR的结合，由此有效治疗其中例如血清或组织IGF-I/II异常升高的病症。抗IGF-I/II抗体优选具有足以有效中和IGF-I/II的亲和力，并优选具有足以允许人用时不要频繁给药的起效时程。延长的起效时程使得可以经由可变的胃肠外途径(例如皮下或肌内注射)实施低频率、更便利的给药程序。
无菌制剂可例如在冻干和重配抗体之前或之后通过除菌滤膜过滤而制成。抗体通常以冻干形式储存或储存在溶液中。治疗性抗体组合物一般被置于具有无菌入口的容器中，例如具有适配器的静脉内溶液袋或小瓶，所述适配器允许取回制剂，例如可被皮下注射针头穿透的塞子。
抗体给药途径依据已知方法，例如通过静脉内、腹膜内、脑内、肌内、眼内、动脉内、鞘内、吸入或病灶内途径注射或输注，或者通过如下指出的持续释放系统。抗体优选通过滴注或推注连续给药。
治疗上使用的抗体的有效量例如取决于治疗对象、给药 途径和患者病症。因此，优选治疗学家根据需要确定剂量和改变给药途径，以获得最佳疗效。典型地，临床医生将给予抗体，直至达到获得期望作用的剂量。该治疗的进展容易通过常规测定或本文所述测定监测。
本文所述抗体可与药学上可接受的载体一起制备成混合物。该治疗组合物可静脉内给予，或者通过鼻或肺给药，优选为液体或粉末气溶胶(冻干的)。组合物还可以根据需要胃肠外或皮下给药。当系统给予时，治疗性组合物应是无菌的、无热源的，并处于在pH、等渗性和稳定性方面适合的胃肠外可接受溶液中。这些条件是本领域技术人员已知的。简而言之，通过将具有需要纯度的本文所述化合物与药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，制备所述化合物的给药剂型，用于储存或给药。这些物质在所用剂量和浓度对接受者是无毒的，并包含缓冲剂，例如TRIS HCl、磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐和其它有机酸盐；抗氧化剂，例如抗坏血酸；低分子量(约10个残基以下)肽，例如聚精氨酸；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、二糖和其它糖，包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露糖醇或山梨糖醇；抗衡离子，例如钠，和/或非离子表面活性剂，例如吐温(TWEEN)、普流罗尼克(PLURONICS)或聚乙二醇。
注射用无菌组合物可按照常规药学实践配制，如在Remington：The Science andPractice of Pharmacy(第20版，Lippincott Williams&Wilkens Publishers(2003))中描述的。例如，可能需要将活性化合物溶解或悬浮在溶媒中，所述溶媒例如为水或天然植物油，例如芝麻油、花生油或棉籽油，或合成的脂肪溶媒，如油酸乙酯等。可按照公认的药学实践掺入缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂等。
持续释放制剂的适宜实例包括含有多肽的固体疏水聚合物的半透基质，所述基质为成形物品、薄膜或微胶囊的形式。持续 释放的基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-异丁烯酸酯)，参见Langer等，J.Biomed Mater.Res.，(1981)15：167-277和Langer，Cham.Tech.，(1982)12：98-105；或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利第3,773,919号、EP 58,481)、L-谷氨酸和γL-谷氨酸乙酯的共聚物(Sidman等，Biopolymers，(1983)22：547-556)、不可降解的乙烯醋酸乙烯酯(Langer等，出处同上)、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRONDepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。
尽管聚合物如乙烯醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能释放分子超过100天，但某些水凝胶在较短时间段内释放蛋白。当囊化蛋白在体内长期保留时，它们可由于在37℃接触水分而变性或聚集，导致失去生物活性，并可能改变免疫原性。可根据涉及的机制设计用于蛋白稳定化的合理策略。例如，如果发现聚集机制为通过二硫键交换形成分子间S-S键，则可如下实现稳定：修饰巯基残基，由酸性溶液冻干，控制含水量，使用适宜的添加剂，并开发特定聚合基质组成。
持续释放的组合物还包括制备抗体晶体，其悬浮在能够在悬浮液中保持晶体的适宜制剂中。这些制品在皮下或腹膜内注射时可产生持续释放作用。其它组合物还包括脂质体捕获的抗体。含有此抗体的脂质体通过本身已知的方法制备：美国专利号DE 3,218,121；Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1985)82：3688-3692；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1980)77：4030-4034；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP143,949；142,641；日本专利申请83-118008；美国专利第4,485,045和4,544,545号；以及EP102,324。
用于给定患者的抗体制剂剂量由主治医师考虑已知改变药物起效的多种因素后确定，所述因素包括疾病的严重性和类型、体重、性别、膳食、给药时间和途径、其它医学因素和其它相关临床因素。治疗有效剂量可通过体外或体内方法来确定。
治疗上使用的本文所述抗体的有效量例如取决于治疗 对象、给药途径和患者病症。因此，优选治疗学家根据需要确定剂量和改变给药途径，以获得最佳疗效。典型的每日剂量可在约0.001mg/kg至100mg/kg以上的范围内，这取决于上述因素。通常，临床医生将给予治疗性抗体，直至达到实现期望作用的剂量。该疗法的进展容易通过常规测定或如本文所述监测。
要认识到的是，给予符合本文的组合物和方法的治疗实体将与适宜的载体、赋形剂和掺入制剂中以提供改善的转移、递送、耐受性等的其它物质一起给药。这些制剂包括例如粉剂、膏剂、软膏剂、凝胶剂、蜡剂、油剂、脂质制剂、含有囊泡的脂质制剂(阳离子的或阴离子的)(例如LipofectinTM)、DNA缀合物、无水吸附膏剂(anhydrous absorption paste)、水包油乳剂和油包水乳剂、碳蜡型乳剂(emulsions carbowax)(多种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶剂和含碳蜡半固体合剂。任何前述混合物都适于本发明的治疗和治疗剂，只要制剂中的活性成分未被制剂失活，且制剂与给药途径是生理上相容的和可耐受的。关于与药物化学家众所周知的制剂、赋形剂和载体相关的其它信息，另参见Baldrick P.“Pharmaceutical excipient development：the need for preclinical guidance.”Regul.Toxicol.Pharmacol.32(2)：210-8(2000)，Wang W.“Lyophilization anddevelopment of solid protein pharmaceuticals.”Int.J.Pharm.203(1-2)：1-60(2000)，Charman WN“Lipids，lipophilic drugs，and oral drug delivery-someemerging concepts.”J Pharm Sci.89(8)：967-78(2000)，Powell等，“Compendium ofexcipients for parenteral formulations”PDA J Pharm Sci Technol.52：238-311(1998)和其中引用的参考文献。
其它治疗剂的设计和产生
按照本发明并基于本文产生和表征的针对IGF-I/II的抗体的活性，有利于设计其它治疗用药形式，并向本领域技术人员公开。这些用药形式包括但不限于高级抗体治疗剂，例如双特异性抗体、免 疫毒素、放射性标记的治疗剂和单抗体V结构域、基于非V区骨架的抗体样结合剂、肽类治疗剂的产生、基因疗法，尤其是胞内抗体，反义治疗剂和小分子。
关于高级抗体治疗剂的产生，在补体结合为期望的属性时，有可能通过使用例如双特异性、免疫毒素或放射性标记回避对用于细胞杀伤的补体的依赖性。
例如，可产生双特异性抗体，其包括(i)两种抗体，一种抗体对IGF-I/II具有特异性，另一种抗体对第二种分子具有特异性，这两种抗体缀合在一起，(ii)一种抗体，其一条链对IGF-I/II具有特异性，第二条链对第二种分子具有特异性，或(iii)单链抗体，其对IGF-I/II和另一种分子均具有特异性。此双特异性抗体可使用众所周知的技术产生；例如关于(i)和(ii)参见例如Fanger等，Immunol Methods 4：72-81(1994)以及Wright和Harris，出处同上，关于(iii)参见例如Traunecker等，Int.J.Cancer(增刊)7：51-52(1992)。在所有情况下，第二种特异性都可以根据需要产生。例如，可产生针对重链活化受体的第二种特异性，所述重链活化受体包括但不限于CD16或CD64(参见例如Deo等，18：127(1997))或CD89(参见例如Valerius等，Blood 90：4485-4492(1997))。
还可以利用本领域众所周知的技术修饰抗体，以用作免疫毒素。参见例如VitettaImmunol Tpdsy 14：252(1993)。另参见美国专利第5,194,594号。关于放射性标记的抗体的制备，这些修饰的抗体还可以使用本领域众所周知的技术容易地制备。参见例如Junghans等，载于Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686(第2版，Chafner和Longo编辑，Lippincott Raven(1996))。另参见美国专利第4,681,581、4,735,210、5,101,827、5,102,990(RE 35,500)、5,648,471和5,697,902号。每种免疫毒素和放射性标记的分子都应有可能杀死表达目标多聚酶亚基寡聚结构域的细胞。在某些实施方案中，提供药物组合物，其含有有效量的抗体以及药学上可接受的载体或稀释剂。
在某些实施方案中，抗IGF-I/II抗体与治疗剂(例如放射性同位素、药物组合物或毒素)连接。优选地，这些抗体可用于治疗疾病，这样的疾病可与表达IGF-I/II的细胞或过量表达IGF-I/II的细胞相关。例如，设想所述药物具有选自以下的药物特性：抗有丝分裂、烷基化、抗代谢、抗血管生成、凋亡、生物碱、COX-2和抗生素药物及其组合。所述药物可选自氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、蒽环类药物、紫杉烷(taxane)、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗代谢药、抗生素、酶、表鬼臼毒素、铂配位络合物、长春花生物碱、取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、拮抗剂、内皮抑制素、泰素(taxol)、喜树碱、奥沙利铂、多柔比星及其类似物，以及它们的组合。
毒素的实例还包括多花白树毒蛋白(gelonin)、假单胞菌外毒素(PE)、PE40、PE38、白喉毒素、蓖麻毒素、蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草毒素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素A、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、假单胞菌内毒素以及其衍生物、组合和修饰物。
放射性同位素的实例包括可用于定位和/或治疗的γ发射体、正电子发射体和x射线发射体，以及可用于治疗的β发射体和α发射体。先前描述的可用于诊断、预后和分期的放射性同位素也可用于治疗。抗癌或抗白血病药物的非限制性实例包括蒽环类药物，例如多柔比星(阿霉素)、柔红霉素(道诺霉素)、依达比星、地托比星、洋红霉素、表柔比星、依索比星及其吗啉代和取代的衍生物、组合和修饰物。示例性的药剂包括顺铂、泰素、卡奇霉素、长春新碱、阿糖胞苷(Ara-C)、环磷酰胺、泼尼松、柔红霉素、依达比星、氟达拉滨、苯丁酸氮芥、干扰素α、羟基脲、替莫唑胺、沙利度胺和博来霉素及其衍生物、组合和修饰物。优选地，抗癌或抗白血病的药剂为多柔比星、吗啉代多柔比星或吗啉代柔红霉素。
本领域技术人员会认识到，在以上实施方案中，尽管亲 和力值可能很重要，但其它因素可能同样重要或更重要，这取决于抗体的具体功能。例如，对于免疫毒素(与抗体结合相关的毒素)，抗体与靶结合的作用可能是有用的；然而，在某些实施方案中，毒素内化进入细胞才是理想的最终结果。因此，内化百分率较高的抗体在这些情况下可能是比较理想的。因此，在一个实施方案中，使用在内化方面效力较高的抗体。内化的高效性可以内化抗体百分率来确定，可以从低值到100％。例如，在不同的实施方案中，0.1-5％、5-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-45％、45-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-99％和99-100％可认为是高效的。本领域技术人员会认识到，理想的效率在不同的实施方案中可能不同，这取决于例如要结合的物质、可给予到某区域的抗体量、抗体-药物复合物的副作用、待治疗疾病的类型(例如癌症类型)和严重程度。
在其它实施方案中，本文公开的抗体提供用于检测哺乳动物组织或细胞中IGF-I/II表达的测定试剂盒，以便筛选出与IGF-I/II表达改变相关的疾病或障碍。所述试剂盒包括结合IGF-I/II的抗体以及指示抗体与抗原反应(如果存在的话)的工具。
在某些实施方案，提供包含容器的产品，容器中装有含有抗IGF-I/II抗体的组合物，以及注明该组合物可用于治疗IGF-I/II表达介导的疾病的包装说明书或标签。优选哺乳动物、更优选人接受抗IGF-I/II抗体。
联合用药
上文定义的抗IGF-I/II抗体可作为唯一的治疗剂应用，或者除了本发明的化合物之外，还可以包括应用常规的外科手术、或放射疗法或化学疗法。化学疗法可以包括应用一种或多种下列类型的抗肿瘤药物：
(i)医学肿瘤学中使用的抗增殖药物/抗肿瘤药物及其组合，例如烷化剂(例如顺铂、卡铂、环磷酰胺、氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、 白消安和亚硝基脲)；抗代谢药(例如抗叶酸类药物，例如氟嘧啶类，例如5-氟尿嘧啶和替加氟、雷替曲塞、甲氨蝶呤、阿糖胞苷和羟基脲；抗肿瘤抗生素(例如蒽环类药物，例如阿霉素、博来霉素、多柔比星、道诺霉素、表柔比星、依达比星、丝裂霉素C、放线菌素D和光神霉素)；抗有丝分裂药(例如长春花属生物碱，如长春新碱、长春碱、长春地辛和长春瑞滨，以及紫杉醇类，例如泰素和泰素帝)；和拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素，例如依托泊苷和替尼泊苷、安吖啶、托泊替康和喜树碱)；
(ii)细胞生长抑制剂，例如抗雌激素药(例如他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬和艾多昔芬(iodoxyfene))、雌激素受体下调药(例如氟维司群)、抗雄激素药(例如比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特和醋酸环丙孕酮(cyproterone acetate))、LHRH拮抗剂或LHRH激动剂(例如戈舍瑞林、亮丙瑞林和布舍瑞林)、孕激素(例如醋酸甲地孕酮)、芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑(vorazole)和依西美坦)和5α还原酶抑制剂，例如非那雄胺；
(iii)抑制癌细胞侵入的药物(例如金属蛋白酶抑制剂，如马立马司他，和尿激酶纤溶酶原活化物受体功能抑制剂)；
(iv)生长因子功能抑制剂，例如这类抑制剂包括生长因子抗体、生长因子受体抗体(例如抗erbb2抗体曲妥珠单抗[HerceptinTM]和抗erbb1抗体西妥昔单抗[C225])、法尼基转移酶抑制剂、MEK抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，例如表皮生长因子家族的抑制剂(例如EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂，例如N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉基丙氧基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼、AZD1839)、N-(3-乙炔基苯基)-6，7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(埃罗替尼、OSI-774)和6-丙烯酰氨基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉基丙氧基)喹唑啉-4-胺(CI 1033))，例如血小板衍生生长因子家族的抑制剂和例如肝细胞生长因子家族抑制剂；
(v)抗血管生成药，例如抑制血管内皮生长因子作用的那些药 药，(例如抗血管内皮细胞生长因子抗体贝伐单抗[AvastinTM]，诸如在国际专利申请WO 97/22596、WO 97/30035、WO97/32856和WO 98/13354中公开的化合物)，以及通过其它机制起作用的化合物(例如利诺胺(linomide)、整联蛋白αvβ3功能的抑制剂、血管生成抑制素和血管生成素(例如血管生成素1和血管生成素2)作用的抑制剂)；
(vi)血管损伤剂，例如风车子抑碱A4(Combretastatin A4)和在国际专利申请WO 99/02166、WO 00/40529、WO 00/41669、WO 01/92224、WO 02/04434和WO 02/08213中公开的化合物；
(vii)反义疗法，例如靶向上述靶的那些反义疗法，例如ISIS2503、为一种抗ras反义疗法；
(viii)基因疗法，包括例如置换异常基因(例如异常p53或异常BRCA1或BRCA2)的方法，GDEPT(基因指导的酶前药疗法)，例如使用胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶或细菌硝基还原酶的方法，以及提高患者对化疗或放疗耐受性的方法，例如多药耐药性基因疗法；
(ix)免疫疗法，包括例如提高患者肿瘤细胞免疫原性的离体(ex vivo)法或体内(invivo)法，例如用细胞因子(例如白介素2、白介素4或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)转染，降低T细胞无反应性的方法，使用转染免疫细胞(例如细胞因子转染的树突细胞)的方法，使用细胞因子转染的肿瘤细胞系的方法和使用抗独特型抗体的方法；
(x)细胞周期抑制剂，包括例如CDK抑制剂(例如黄酮吡多)和其它细胞周期关卡抑制剂(例如关卡激酶)；aurora激酶以及涉及有丝分裂和胞质分裂调节的其它激酶(例如有丝分裂驱动蛋白)的抑制剂；以及组蛋白脱乙酰酶抑制剂；
(xi)内皮缩血管肽拮抗剂，包括内皮缩血管肽A拮抗剂、内皮缩血管肽B拮抗剂以及内皮缩血管肽A和B拮抗剂；例如ZD4054和ZD1611(WO 96 40681)、阿曲生坦和YM598；以及
(xii)生物治疗性治疗方法，例如使用肽或蛋白质(例如抗体或可溶性外部受体结构域构建)的那些方法，所述肽或蛋白质隔离受体配 体、阻断配体与受体结合或降低受体信号转导(例如由于增强的受体降解或降低的表达水平)。
此联合疗法可通过同时、序贯或单独给予治疗的单独组分来实现。这些组合产品使用在前文所述剂量范围内的本发明化合物以及在其被批准的剂量范围内的其它药物活性剂。
实施例
提供以下的实施例，包括所做的试验和获得的结果，仅是为了说明目的，不得解释为对本文教导的限制。
实施例1
免疫和滴定
免疫
用重组人IGF-I和IGF-II(得自R&D Systems，Inc.(Minneapolis，MN，目录号分别为291-G1和292-G2))作为抗原。通过序贯免疫小鼠(XenoMouse品系XMG2和XMG4(3C-1品系)，Abgenix，Inc.Fremont，CA)产生抗IGF-I/II的单克隆抗体。XenoMouse动物对于所有注射都经爪垫途径免疫。每次注射的总体积为50μl/小鼠，25μl/爪垫。每组免疫共10只小鼠。每只小鼠每次注射10μg单独的IGF-I或IGF-II，或与作为载体的匙孔血蓝蛋白(KLH)抗原缀合的IGF-I或IGF-II，详见表2。第一次注射在Dulbecco’s PBS(DPBS)中制备，并与Titermax Gold佐剂(SIGMA，目录号T2684，批号K1599)以1∶1体积/体积混合。然后在27-38天的时间段内给予每只小鼠与25μg Adju-Phos(磷酸铝凝胶，目录号1452-250，批号8937，HCI Biosector)和10μg CpG(15μl ImmunEasy小鼠佐剂，目录号303101；批号11553042；Qiagen)混合的总共8-11次额外加强免疫，后接10μg抗原在无佐剂的无热源DPBS中的最后一次加强免疫。对于联合免疫(用IGF-I和IGF-II这二者免疫动物)，第二种抗原在最后2次加强免疫时给予。
表2.免疫概述
实施例2
淋巴细胞回收、B细胞分离、杂交瘤的融合和产生
通过颈椎脱臼法处死免疫小鼠，由每组收集引流淋巴结并合并。通过在DMEM中研磨离解淋巴细胞，以由组织释放细胞，并将细胞悬浮在DMEM中。统计细胞数，将0.9ml DMEM/1×108个淋巴细胞加入细胞沉淀，以温和但完全地重悬浮细胞。使用100μlCD90+磁珠/1×108个细胞，通过使细胞与磁珠于4℃孵育15分钟标记细胞。将含达108个阳性细胞(或总计达2×109个细胞)的磁性标记细胞悬浮液加到LS+柱上，用DMEM洗涤该柱。收集全部流出液，作为CD90阴性流分(预计这些细胞中的大部分为B细胞)。
通过将以上洗涤过的富集B细胞与购自ATCC的非分泌 性骨髓瘤P3X63Ag8.653细胞(目录号CRL 1580)以1∶1比率混合进行融合(Keamey等，J.Immunol.123，1979，1548-1550)。通过以800×g离心使细胞混合物温和地沉淀出来。在完全取出上清液后，用2-4mL链霉蛋白酶溶液(CalBiochem，目录号53702；0.5mg/ml的PBS溶液)处理细胞不超过2分钟。然后，加入3-5ml FBS，以终止酶活性，使用电细胞融合溶液(ECFS，0.3M蔗糖，Sigma，目录号S7903，0.1mM乙酸镁，Sigma，目录号M2545，0.1mM乙酸钙，Sigma，目录号C4705)将悬浮液调整至40ml总体积。离心后取出上清液，将细胞重悬浮在40ml ECFS中。重复该洗涤步骤，细胞在ECFS中再重悬浮至浓度为2×106个细胞/ml。
电细胞融合使用融合发生器(型号ECM2001，Genetronic，Inc.，San Diego，CA)进行。使用的融合室大小为2.0ml，使用以下仪器设置：
排队条件：电压：50V，时间：50秒。
穿膜：电压：3000V，时间：30微秒
融合后保持时间：3秒
在ECF后，在无菌条件下由融合室中小心取出细胞悬浮液，并转移至装有相同体积的补加L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、OPI(草酰乙酸盐、丙酮酸盐、牛胰岛素)(全部来自Sigma)和IL-6(Boehringer Mannheim)的杂交瘤培养基(DMEM，JRH Biosciences)、15％FBS(Hyclone)的无菌管中。将细胞于37℃孵育15-30分钟，然后以400×g(1000rpm)离心5分钟。将细胞温和地重悬浮在小体积的杂交瘤选择培养基(补加0.5x HA(Sigma，目录号A9666)的杂交瘤培养基)中，基于每块96孔板最终接种5×106个B细胞和200μl/孔，用更多的杂交瘤选择培养基适宜地调整体积。细胞进行温和地混合，并用移液管加到96孔板中，让其生长。在第7天或第10天，取出一半培养基，用杂交瘤选择培养基再饲养细胞。
实施例3
通过ELISA选择候选抗体
在培养14天后，筛选杂交瘤上清液的IGF-I/II特异性单克隆抗体。ELISA板(Fisher，目录号12-565-136)用在包被缓冲液(0.1M碳酸盐缓冲液，pH 9.6，NaHCO38.4g/L)中的50μl/孔人IGF-I或IGF-II(2μg/ml)包被，然后于4℃孵育过夜。孵育后，用洗涤缓冲液(0.05％吐温(Tween)20的PBS溶液)洗涤板3次。加入200μl/孔的封闭缓冲液(0.5％BSA、0.1％吐温20、0.01％硫柳汞的1x PBS溶液)，将板于室温孵育1小时。孵育后，用洗涤缓冲液洗涤板3次。加入50μl/孔的杂交瘤上清液以及阳性和阴性对照，将板于室温孵育2小时。
孵育后，用洗涤缓冲液洗涤板3次。加入100μl/孔的检测抗体山羊抗huIgGFc-HRP(目录号H10507)，将板于室温孵育1小时。在第二次筛选中，分两组筛选首次筛选中的阳性，一组用于人IgG(重链)检测，另一组用于人Ig κ轻链检测(山羊抗hIg κ-HRP(SouthernBiotechnology，目录号2060-05)，以便证实IgG和Ig κ的全人组成。孵育后，用洗涤缓冲液洗涤板3次。加入100μl/孔的TMB(BioFX Lab，目录号TMSK-0100-01)，使板显色约10分钟(直至阴性对照孔刚刚开始显色)。然后加入50μl/孔的终止溶液(TMB终止溶液，(BioFX Lab，目录号STPR-0100-01)，用ELISA读板器于450nm读板。如在表3中所示，总共有1,233个孔含有抗IGF-I和II的抗体。
通过ELISA对在ELISA测定中结合的所有抗体进行结合胰岛素的反向筛选，以便排除那些与胰岛素有交叉反应的抗体。ELISA板(Fisher，目录号12-565-136)用在包被缓冲液(0.1M碳酸盐缓冲液，pH 9.6，NaHCO3 8.4g/L)中的50μl/孔重组胰岛素(浓度：1μg/ml；Sigma，目录号I2643)包被，然后于4℃孵育过夜。最初的1233个抗体中总共有1,122个抗体的确与胰岛素有交叉反应，详见表3。
表3.筛选概述
最后，则通过ELISA测试在反向筛选中选择的抗体，以证实与小鼠IGF-I和IGF-II蛋白结合。鉴别出总共683个与小鼠IGF-I/II有交叉反应性的杂交瘤系。因此，这些表达抗体的杂交瘤系结合人IGF-I、人IGF-II、小鼠IGF-I和小鼠IGF-II，但不结合人胰岛素。
实施例4
抑制IGF-I和IGF-II与IGF-IR结合
本研究的目标是根据IGF-I和IGF-II与IGF-IR受体结合的抑制测定，筛选出683个抗IGF-I/II人IgG2和IgG4抗体在杂交瘤上清液阶段的中和活性。因此，受体/配体结合测定如下所述用过量表达人IGF-IR受体的NIH3T3细胞进行。
简而言之，用封闭缓冲液(含有10％BSA和0.02％NaN3的PBS)以200μL/孔于4℃过夜封闭多重筛选滤板(MultiScreen 0.65μM 96孔PVDF，Millipore，目录号MADV N0B 10)。用结合缓冲液(含有2％ BSA和0.02％ NaN3的PBS)将100μCi/ml和50nM的[125I]-标记的IGF(Amersham Life Sciences，目录号IM172(IGF-I)或IM238(IGF-II))稀释至适宜浓度(对于IGF-I为70pM终浓度，对于IGF-II为200pM终浓度)。用200μL PBS洗涤封闭缓冲液包被的滤板1次，将50μL抗IGF-I/II抗体上清液(用结合缓冲液稀释至25％终体积)与MultiScreen板中的25μL[125I]-IGF在冰上预孵育30-60分钟。用胰蛋白酶收集稳定表达hIGF-IR的亚汇合NIH3T3小鼠成纤维细胞(得自AstraZeneca)，并以6×106/ml重悬浮在冷的结合缓冲液中，向该板加入25μL细胞，在冰上孵育2小时。用200μL冷PBS洗涤板4次，过夜干燥。加入25μL/孔的闪烁体(SuperMix混合物，Wallac/Perkin Elmer，目录号1200-439)，使用MicrobetaTrilux读板器(Wallac)读板。
每块筛选板使用以下对照：无抗体(全部为结合的IGF)、50μg/ml(非特异性背景)和0.075-0.5μg/ml(约中和抗体的EC50值)的对照中和抗IGF-I(#05-172，Upstate)或抗IGF-II(#MAB292，R&D Systems)mAb，以及0.5μg/ml浓度(约中和抗体的EC50值)的同种型匹配的对照人IgG2(PK16.3.1，Abgenix，批号360-154)或IgG4(108.2.1，Abgenix，批号718-53A)mAb。每个筛选测定向1块板加入额外滴定的对照中和抗体和同种型匹配的对照人抗体(由50μg/ml(333.3nM)1/10连续稀释)。有或没有抗体的所有对照都在补加25％终体积的抗KLH人IgG2或IgG4耗尽上清液的结合缓冲液中制备。
抑制百分率如下求出：
％抑制＝([(结合的125I-IGF的平均总CPM)-(在抗体存在下结合的125I-IGF的平均CPM)]/[(结合的125I-IGF的平均总CPM)-(在过量对照中和抗体*存在下结合的125I-IGF的平均CPM)])×100
*用过量的对照中和抗IGF抗体(50μg/ml，333.3nM)的 细胞的CPM来确定非特异性背景，发现其等于过量的冷IGF(小于或等于10％总CPM)
因为放射性标记的配体利用度问题而依据同种型分配抗IGF-I/II上清液筛选。如在表4中所示，首先针对放射性标记的IGF-I筛选具有IgG2同种型的抗IGF-I/II抗体的上清液(总共293个)。对该筛选首先应用40％抑制的截取值(即选择以40％或以上抑制的杂交瘤系)，选择111个命中结果用于随后针对IGF-II的筛选。在111个命中结果中，以50％截取值发现总共91个系抑制IGF-II与其受体结合。通过采用中和50％的IGF-I和IGF-II活性的上清液总共选出71个最终命中结果。
最初针对放射性标记的IGF-II筛选表达IgG4同种型的所有上清液(总共390个)，具有50％抑制的截取值的232个命中结果随后针对IGF-I进行筛选。总共90个系能够以50％截取值抑制IGF-I与其受体结合。在合并针对IgG2(71)和IgG4(90)的命中结果后，得到总共161个抑制IGF-I和IGF-II达50％以上的系。
总之，用IGF-I或IGF-II首次筛选由683个初始上清液选择出343个(111个IgG2和232个IgG4，50.2％)。得到总共161个最终命中结果(初始系的23.6％)，它们能够以50％抑制的总截取标准阻断IGF-I和IGF-II与IGF-IR结合。
表4.抗IGF-I/II废弃上清液筛选汇总(50％截取值)
实施例5
高抗原和有限抗原的ELISA
为了测定在实施例4中选出的161个杂交瘤系中的相对亲和力以及每个系的上清液中的抗体浓度，进行高抗原(HA)和有限抗原(LA)ELISA测定。在HA定量测定中，高抗原浓度和孵育过夜限制了抗体亲和力的作用，允许定量每个样品中存在的抗原特异性抗体的相对量。在LA测定中的低抗原浓度限制抗体浓度的作用，产生基于其相对亲和力的抗体排列。
高抗原定量测定
用相对大量的IGF-I或IGF-II抗原(R&D Systems，Inc.，Minneapolis，MN，目录号分别为291-G1和292-G2)以500ng/ml(67 nM)包被ELISA板。在1∶50至1∶12200的稀释范围内滴定含抗体的杂交瘤上清液。使用已知IGF特异性抗体(R&D Systems，Inc.，Minneapolis，MN，目录号分别为MAB291和MAB292)的对照限定测定的线性范围。然后使用线性范围内的数据得到每个滴定样品中的IGF特异性抗体的相对浓度。
有限抗原测定
用低浓度抗原包被微量滴定板。向各孔加入50微升(μL)的64ng/ml、32ng/ml、16ng/ml、8ng/ml、4ng/ml和2ng/ml(覆盖8.5nM-0.26nM的范围)的IGF-I或IGF-II在1％脱脂乳/IX PBS pH 7.4/0.5％叠氮化物中的溶液。将该板孵育30分钟。
用水洗涤板4次(4X)，向各孔加入50μL用1％脱脂乳/1X PBS pH 7.4/0.5％叠氮化物以1∶25稀释的含待测抗体的杂交瘤上清液。用保鲜膜或石蜡膜紧密包裹板，并于室温振荡孵育过夜。
第2天，清洗所有板5次(5X)，向各孔加入50μL的0.5μg/ml浓度的山羊抗人IgG FcHRP多克隆抗体在1％牛奶、1X PBS pH 7.4中的溶液。所述板于室温孵育1小时。
洗涤板至少5次(5X，用自来水)。向各孔加入50微升(μL)HPR底物TMB，将该板孵育30分钟。通过向各孔加入50μL的1M磷酸终止HRP-TMB反应。对所述板的每个孔检测450nm的光密度(吸光度)。
数据分析
求出测试抗体OD值的平均值，并计算范围。选出具有最高信号和可接受的低标准偏差的抗体，作为具有比参比抗体高的抗原亲和力的抗体。
然后基于中和(实施例4)、功效(根据HA ELISA测定的低抗体浓度和高配体结合抑制)、亲和力(LA ELISA)或全部3个标准进 行分析，以选出最佳抗体。由该分析产生一组25个抗体。基于IGF-I和-II结合的平均抑制百分率和对IGF-I和IGF-II这二者的亲和力的单独分析产生第二组25个抗体。16个抗体是这两组共有的，产生最后一组40个抗体。这40个抗体的LA和HA结果汇总于表5。选择这40个系用于克隆，其中有33个被成功克隆。
表5.针对40个最佳抗体的高和有限抗原ELISA的结果
实施例6
抗体与结合IGFBP-3的IGF-I和IGF-II的结合
IGF-I和IGF-II在血清中循环，大部分结合IGF-结合蛋白(IGFBP)。一个目标是鉴定不识别IGFBP复合物中的IGF的抗体，以便避免抗IGF抗体的体内损耗。开发以下的测定形式用于表征在IGF-I或IGF-II与IGFBP-3复合时识别这些生长因子的抗体。具体地说，该测定测试IGF/抗IGF抗体复合物中的IGF结合IGFBP-3的能力。
抗体介导的对IGFBP-3捕获IGF的阻断
开发其中在IGF-I或IGF-II和前述实施例的IGF特异性抗体之间预先形成复合物的测定。这些复合物结合IGFBP-3的能力使用AlphaScreen测定技术(PerkinElmer)检验。在384孔板中，将10μL1∶20稀释的杂交瘤上清液与10μL 3nM生物素化IGF-I或IGF-II混合，并于室温孵育2小时。加入链霉抗生物素包被的AlphaScreen供体珠和偶联IGFBP-3的AlphaScreen受体珠(10μL混合物，用于1/60最终稀释度的杂交瘤上清液)，再继续孵育1小时。然后在Packard Fusion读板器中读取样品。
3种市售抗IGF单克隆抗体M23(Cell Sciences)、05-172 (Upstate)和MAB291(R&DSystems)显示出不同的抑制IGF结合IGFBP的能力，其IC50值在低ng/mL至100ng/mL的范围内。用直到10μg/mL的不相关小鼠IgG和人IgG未观察到对IGF-I与IGFBP-3结合的抑制，提示抗IGF-I作用是特异性的。市售单克隆抗体05-166(Upstate)和MAB292(R&D)在抑制IGF-II/IGFBP-3相互作用的亲和力方面显示出显著差异。这些试验表明，抗IGF mAb可阻断IGF与IGFBP-3的结合，产生可用于由杂交瘤系筛选纯化抗体的测定。下一步是评价废杂交瘤培养基对测定信号的作用。
在测定系统中检验连续稀释的杂交瘤培养基和抗KLH杂交瘤废上清液。当为准备与IGFI/II预孵育而1∶10稀释杂交瘤上清液(测定中的最终稀释度为1∶60)时，培养基对测定结果几乎没有影响。基于这些数据，稀释杂交瘤上清液，用于与IGF预孵育，在测定中提供优选的1/60最终稀释度。
检验683个对IGF-I和IGF-II结合阳性的废上清液抑制IGF与IGFBP-3结合的能力。对于IGF-I高于50％的抑制和对于IGF-II高于60％的抑制用作截取标准。使用这些截取值的筛选结果汇总见表6。
表6.在筛选中鉴定的阳性命中结果的数目
IGF-I IGF-II IGF-I/II
样品 抑制-＞ ＞50％ ＞60％
376 (板1-4) 48 51 19
307 (板5-8) 39 78 32
683 总计 87 129 51
使用AlphaScreen测定的IGFBP竞争测定，在683个被测上清液中鉴定出87个抑制IGF-I与IGFBP-3结合的样品以及129个抑制IGF-II与IGFBP-3结合的样品。51个样品表现出IGF-I和IGF-II双竞争。然而，为了更细致地重现抗体在体内的功能或行为，在主要进行IGF和IGFBP复合的情况下，还进行如实施例8所述的其它测定。
实施例7
使用BIACORE分析(低分辨率筛选)
测定抗IGF-I和IGF-II的抗体的亲和性
34个纯化的单克隆抗体的低分辨率筛选
使用无标记的表面等离子体共振(SPR)或Biacore检测抗体对抗原的亲和力。为此，使用常规胺偶联在CM5 Biacore芯片上制备高密度山羊抗人抗体表面。所有的mAb都用含100μg/ml BSA的HBS-P电泳缓冲液稀释至约20μg/ml。使用30秒接触时间以10μL/分钟将每个mAb捕获在独立面上，并洗涤5分钟，用于稳定mAb基线。
在所有表面上于23℃在120秒内以335.3nM注射IGF-I，接着使用100μL/分钟流速进行5分钟解离。样品在如上所述的HBS-P电泳缓冲液中制备。在每个捕获/注射循环后用1次15秒的146mM磷酸(pH 1.5)脉冲再生表面。对于每种抗体用114.7nM IGF-II重复相同的捕获/注射循环。如下制定34个mAb的漂移校正结合数据：扣除对照流动池的信号，并扣除就在每次抗原注射之前注射的缓冲液的基线漂移。使用CLAMP将数据全面拟合为1∶1交互作用模型，以确定结合动力学(David G.Myszka和Thomas Morton(1998)“abiosensor kinetic data analysis program，”TIBS 23，149-150)。在拟合数据时使用传质系数。IGF-I和IGF-II于25℃结合的动力学分析结果列于下表7。mAb按最高到最低亲和力顺序排列。
表7.34个单克隆抗体的IGF-I和IGF-II低分辨率BIACORE筛选
IGF-I结合数据
大部分mAb相当良好地拟合1∶1模型。mAb 4.90.2和4.141.1以极为复杂的数据为特征。这些mAb在表7中用星号标出，因为不能由1∶1模型拟合评估有意义的动力学常数。对于这两种mAb，看来后者的解离速度相非常慢(至少1×10-5秒-1)，这可能使这两种mAb可用作治疗性化合物。
IGF-II结合数据
大部分mAb相当好地拟合1∶1模型。mAb 7.159.2的解离速率在1×10-5秒-1保持恒定，因为没有足够的衰减数据来充分评价kd。
按照半定量排列法设计在本实施例中的低分辨率Biacore研究。为了获得有关单独mAb的特征速率常数和亲和力的更精确信息，如在实施例8中所述进行高分辨率Biacore研究。
实施例8
使用BIACORE分析(高分辨率筛选)
测定抗IGF-I和抗IGF-II抗体亲和力
进行高分辨率Biacore分析，以进一步检测抗体对抗原的亲和力。mAb 7.159.2、7.234.2、7.34.1、7.251.3和7.160.2各自被捕获，并各自注射在一定浓度范围内的IGF-I和IGF-II抗原。获得的结合常数列于表8。
表8.通过低和高分辨率BIACORE分析进行抗IGF抗体亲和力测定
因此，本发明的实施方案可以包括优先结合IGF-II但与IGF-I有交叉反应的抗体，其对IGF-II的结合亲和力高于IGF-I。例如，抗体结合IGF-II的亲和力可以是IGF-I的2.5倍。在某些实施方案中，抗体结合IGF-II的亲和力可以是IGF-I的至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍或至少150倍。
完成的IGF-I/GFBP-3复合物的筛选
在实施例6中描述的IGFBP竞争测定在683个被测上清液中鉴定出87个抑制IGF-I与IGFBP-3结合的样品和129个抑制IGF-II与IGFBP-3结合的样品。51个样品表现出IGF-I和IGF-II双竞争。然而，为了更细致地重现体内抗体的功能或行为，在应主要进行IGF和IGFBP复合的情况下，还对选定抗体进行以下的Biacore测定。
筛选6个选定抗体，以确定它们是否结合与IGFBP复合的IGF-I或IGF-II。使用常规胺偶联和Biacore 2000设备将全部6个选定mAb(7.159.2、7.146.3、7.34.1、7.251.3、7.58.3和不相关的对照抗体ABX-MA1)共价固定至两个CM5 Biacore芯片上的高表面容量(5,400-12,800RU)。活化并封闭每个CM5芯片上的1个流动池(没有固定的mAb)，用作对照表面。
接着，将IGF-I和IGFBP-3一起在Hepes缓冲盐水pH7.4、0.005％ P-20、100μg/mlBSA(HBS-P)中混合，以制备分别为193nM和454nM的最终溶液。将IGF-II和IGFBP-3混合在一起，以制备分别为192nM和455nM的最终溶液。在这些条件下，IGF-I和IGF-II被IGFBP-3以99.97％复合。在这些条件下于数分钟内就达到了平衡。复合的IGF-I/IGFBP-3和IGF-II/IGFBP-3的溶液于23℃以40μL/分钟流经多个mAb表面达180秒，接着进行120秒的解离。然后将未复合的IGF-I和IGF-II分别以193nM和192nM流经每个表面，IGFBP-3以454nM流经每个表面。所述表面用20秒脉冲的10mM甘氨酸pH2.0再生。
使用程序Scrubber，通过由固定mAb表面的结合信号扣除本体折射率变化和分析物与空白表面的任何非特异性结合信号处理传感图。在扣除空白校准后，通过扣除经特定流动池进行缓冲液注射的平均传感图第二次参比传感图。此“双重参比”校正了存在于特定流动池上的任何系统误差的mAb结合传感图。
复合的和未复合的IGF-I/IGFBP-3和IGF-II/IGFBP-3相当微弱地结合已结合的抗体，粗略估计对全部6种mAb的非特异性结合相互作用的KD＞1μM，包括阴性对照ABX-MA1(参见表9)。然而，采用ABX-MA1的IGF-I/II结合微弱，表明全部这3种分析物均存在非特异性结合相互作用。显然，IGF/IGFBP-3复合物比单独的IGFBP-3稍强结合所有这些mAb。然而，因为IGF-I、IGF-II和IGBP-3似乎均非特异性结合这些mAb自身，所以当它们结合在一起时，这产生甚至“更粘的”非特异性结合蛋白复合物，其解释了复合物的更大的结合信号。IGF-I/II/IGFBP-3复合物和结合对照表面的IGFBP-3也显著表明了这两种蛋白的非特异性。但是，在以下的传感图中，如上所述，该背景结合在数据处理当中在第一个参比中被扣除。
该试验提示，尽管先前表明51个样品抑制IGF-I/II与IGFBP3结合(实施例6)，但抗体还可以在体外结合IGF/IGFBP复合物。
表9.IGF-I/IGFBP-3和IGF-II/IGFBP-3结合6种mAb的结合概述
+，相对于IGF-I或IGF-II与mAb稍微结合
++，相对于IGF-I或IGF-II与mAb中等结合
+++，相对于IGF-I或IGF-II与mAb的结合强结合
*这些排列不表示这些相互作用的KD。
实施例9
使用BIACORE分析(低分辨率筛选)测定抗胰岛素抗体亲和力
通过检测mAb与人胰岛素的亲和力进一步研究抗体与IGF-I/II的交叉反应性。将IGF-I/II抗体固定至CM5 Biacore芯片，注射胰岛素溶液，用于测定结合速率和解离速率。在该试验中测试了5个mAb，包括7.234.2、7.34.1、7.159.2、7.160.2和7.251.3。在所有捕获表面上注射用电泳缓冲液稀释至502nM的胰岛素。
于502nM胰岛素未观察到胰岛素与任何mAb结合。这些结果提示，IGF-I/II mAb与胰岛素没有明显的交叉反应性。
实施例10
抗体分区(binning)
进行表位分区，以确定哪些抗IGF-I/II抗体会彼此交叉竞争，并因此有可能结合IGF-I/II上的同一表位。分区过程描述于美国专利申请20030175760，还描述于Jia等，J.Immunol.Methods，(2004)288：91-98，这两个文献均整体在此引入作为参考。简单地讲，按照在Luminex网站提供的蛋白质偶联方案将Luminex珠与小鼠抗huIgG(Pharmingen#555784)偶联。制备预偶联的珠，使用以下方法将其与未知一抗偶联，珠子避光保护。每个未知上清液均使用单独的管。需要的上清液体积使用下列公式计算：(nX2+10)×50μl(其中n＝样品总数)。在该测定中使用0.1μg/ml的浓度。温和涡旋珠子母液，并用上清液稀释至每孔50μl中每种珠子有2500个的浓度，或者0.5×105个珠子/ml的浓度。
将样品在黑暗中于室温在振荡器上孵育过夜。
通过每孔加入200μl洗涤缓冲液预润湿滤板，然后吸出缓冲液。将每种珠各50μl加入滤板的各个孔。通过加入100μl/孔洗涤缓冲液并吸出洗涤样品1次。以50μl/孔向滤板加入抗原和对照。给该板盖上盖子，在振荡器上于黑暗中孵育1小时，然后洗涤样品3 次。然后以50μl/孔加入未知二抗。对一抗使用0.1μg/ml的浓度。然后将板在黑暗中于室温在振荡器上孵育2小时，然后洗涤样品3次。加入50μl/孔以1∶500稀释的生物素化小鼠抗人IgG(Pharmingen #555785)，样品在黑暗中于室温振荡孵育1小时。
洗涤样品3次。加入以1∶1000稀释的50μl/孔链酶抗生物素蛋白-PE，样品在黑暗中于室温振荡孵育15分钟。在Luminex100上进行两轮洗涤后，洗涤样品3次。将每孔中的内容物重悬浮在80μl封闭缓冲液中。经几次吸打小心地将样品混合，以重悬浮珠子。然后用Luminex100分析样品。结果提供于下表10。
表10.在功能测定中呈阳性的34个最佳IGF-I/II抗体的区
实施例11
抗IGF-I/II抗体的结构分析
对几种抗体的可变重链和可变轻链进行测序，以确定它们的DNA序列。在序列表中提供抗IGF-I/II抗体的完整序列信息和每个γ和κ链组合的核苷酸和氨基酸序列。分析可变重链序列，确定了VH家族、D区序列和J区序列。然后翻译序列，确定了一级氨基酸序列，并与种系VH、D和J区序列对比，以评价体细胞超突变。
这些抗体与其种系基因的序列比对见下表。表11是比较抗体重链区与其关联种系重链区的表。表12是比较抗体κ轻链区与其关联种系轻链区的表。远离种系的突变作为新氨基酸显示。
免疫球蛋白链的可变(V)区由多个种系DNA区段编码，所述区段在B细胞个体发生过程中接入功能可变区(VHDJH或VKJK)中。详细研究了对IGF-I/II的抗体响应的分子和遗传多样性。这些测定揭示了抗IGF-I/II抗体特有的几个点。
分析对IGF-I/II特异性的5个单独抗体得到以下确定结果：抗体来源于3种不同种系的VH基因，其中有4个来自VH4家族，2个抗体得自VH4-39基因区段。表11和12显示了该分析的结果。
应当认识到，由每个杂交瘤收集的姊妹克隆间的氨基酸序列是相同的。例如，mAb7.159.2的重链和轻链序列与下表11和12所示的mAb 7.159.1的序列相同。
本发明抗体的重链CDR1具有如在表11中公开的序列。在表11中公开的CDR1属于Kabat定义。或者，CDR1可使用替代定义进行定义，以便包含FR1序列的最后5个残基。例如，对于抗体7.159.1，FR1序列为QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS(SEQ ID NO.：93)，CDR1序列为GYTFTSYDIN(SEQ ID NO.：94)；对于抗体7.158.1，FR1序列为QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS(SEQ ID NO.：95)，CDR1序列为GGSIRSSSYYWG(SEQ ID NO.：96)；对于抗体7.234.1，FR1序列为QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS(SEQ ID NO.：97)，CDR1序列为GGSINSSSNYWG(SEQ ID NO.：98)；对于抗体7.34.1，FR1序列为QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS(SEQ ID NO.：99)，CDR1序列为GGSISSYYWS(SEQ ID NO.：100)；对于抗体7.251.3，FR1序列为QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS(SEQ ID NO.：101)，CDR1序列为GGSISSYYWS(SEQ ID NO.：102)。
还应当认识到，在特定抗体于氨基酸水平上与其对应种系序列不同时，抗体序列可突变回种系序列。这样的矫正突变可使用标准分子生物学技术在1、2、3或更多个位置发生，或在任何组合突变位置发生。作为非限制性实例，表12表明，mAb 7.34.1的轻链序列(SEQ ID NO.：12)与对应的种系序列(SEQ ID NO.：80)从FR1区中的Pro至Ala突变(突变1)和FR2区中的经由Phe至Leu的突变(突变2)不同。因此，可修饰编码mAb 7.34.1轻链的氨基酸或核苷酸序列，以改变突变1，产生在突变1位点的种系序列。此外，可修饰编码mAb7.34.1轻链的氨基酸或核苷酸序列，以改变突变2，产生在突变2位点的种系序列。再者，可修饰编码mAb 7.34.1轻链的氨基酸或核苷酸序列，以改变突变1和突变2这二者，产生在突变1和2这二者的位点的种系序列。
实施例12
在NIH3T3细胞中异位表达的hIGF-IR的IGF-I和IGF-II诱导磷酸化的抑制
IGF配体通过激活IGF-IR受体中的受体酪氨酸激酶活性发挥其增殖和抗凋亡功能。为了评价抗IGF-I/II抗体抑制IGF诱导的IGF-IR磷酸化的能力，在以下测定中使用了异位表达hIGF-IR的NIH3T3细胞。
将异位表达人IGF-IR的NIH3T3细胞以10,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中，在饥饿培养基(1％活性炭处理的FBS)中孵育过夜。第2天，弃去生长培养基，用PBS温和洗涤各孔2次，加入100μL无血清培养基(0％FBS)，以使细胞饥饿。在1-2小时后，将100μl无血清培养基加入细胞，一式三份，所述无血清培养基中含有0.05％BSA，并含有IGF-I(10nM)或IGF-II(10nM)，于37℃与多种抗体浓度预孵育60分钟。于37℃进行10分钟的刺激，刺激后，取出培养基，向各孔加入100μL 3.7％甲醛的PBS/3％BSA溶液，并于室温孵育20分钟。然后用PBS洗涤细胞2次，向各孔加入100μL透化缓冲液(0.1％ Triton-X的3％ BSA/PBS溶液)。使其于室温孵育10分钟，弃去原溶液，加入100μl 0.6％过氧化氢的PBS/3％ BSA溶液，以使任何内源过氧化物酶活性失活。在室温下孵育20分钟后，用PBS/0.1％吐温-20洗涤细胞3次，并通过加入100μL 10％FBS的PBS/0.1％吐温-20溶液于室温封闭1小时。然后取出封闭缓冲液，向各孔加入50μL 1μg/ml的抗磷酸IGFIR抗体(目录号44-804，BioSource)在10％FBS/PBS-T中的溶液。在2小时室温孵育后，细胞用PBST洗涤3次，每次洗涤之间浸泡5分钟。在洗涤后，以50μl/孔向各孔加入以封闭缓冲液1∶250稀释的山羊抗兔IgGFc-HRP二抗。在1小时室温孵育后，如前用PBST洗涤细胞3次，每次5分钟，再拍干。然后加入50μl ECL试剂(DuoLux)，立即读取RLU。
筛选出32个抗体系，对每种抗原进行了两次独立测定。 最佳的10个抗体的结果概述于下表13。
表13.NIH3T3细胞中IGF依赖性IGF-IR磷酸化抑制的汇总
*这些测定可在抗原限制条件下进行，获得了IGF-I和IGF-II的mAb KD。
实施例13
hIGF-IR转染的NIH3T3细胞的IGF-I和IGF-II诱导增殖的抑制
如上所述，IGF-I/II中和抗体的其中一个标准是抑制IGF诱导增殖的能力。为了评价所述抗体抑制IGF诱导增殖的能力，在以下测定中使用异位表达hIGF-IR的MH3T3细胞。
将异位表达hIGF-IR的NIH3T3细胞以5000个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并在饥饿培养基(1％活性炭处理的FBS)中孵育过夜。第2天，弃去生长培养基，用无血清培养基温和洗涤各孔2次，加入100μL无血清培养基，以使细胞饥饿。向细胞加入100μL饥饿培养基，一式二份或一式三份，该饥饿培养基中含有15ng/ml IGFI或50ng/ml IGFII，与多种抗体浓度于37℃预孵育30分钟。在20小时孵育后，细胞用BrdU进行脉冲2小时，使用罗氏公司(Roche)的细胞增殖ELISA试剂盒(Roche，目录号1 647 229)定量掺入(增殖)程度。
总共筛选出32个抗体系，对每种抗原进行了2次或3次独立测定。最佳的10种抗体的结果汇总于下表14。
表14.NIH3T3/hIGF-IR细胞的IGF依赖性增殖的抑制汇总
*这些测定可在抗原限制条件下进行，获得了IGF-I和IGF-II的mAb KD。
实施例14
在BxPC3人肢腺肿瘤细胞中表达的hIGF-IR的IGF-I和IGF-II诱导磷酸化的抑制
IGF-I/II通过激活IGF-IR受体中的受体酪氨酸激酶活性发挥其增殖和抗凋亡功能。为了评价抗体抑制IGF诱导的IGF-IR磷酸化的能力，在以下测定中使用表达内源hIGF-IR的BxPC3人胰腺肿瘤细胞。
将BxPC3细胞以55,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中，在常规生长培养基中孵育过夜。第2天，弃去生长培养基，用无血清培养基温和洗涤各孔2次，加入100μL无血清培养基，以使细胞饥饿。在24小时后，弃去原培养基，用无血清培养基温和洗涤细胞1次。将含有0.05％ BSA并含有IGF-I(20ng/ml)或IGF-II(75ng/ml)的无血清培养基于37℃与多种抗体浓度预孵育30分钟，然后将100μL无血清培养基加入细胞，一式三份。将板于37℃孵育15分钟，随后用冷PBS漂洗。将100μL裂解缓冲液加入各孔，将板于4℃孵育30分钟。裂解物于4℃以2000rpm离心10分钟，收集上清液。IGF-IR磷酸化使用Duoset人磷酸IGF-IR ELISA试剂盒(R&D Systems，目录 号DYC1770)定量。
筛选出10个抗体系，每种抗原进行了2次独立测定。结果汇总于下表15。
表15.IGF依赖性IGF-IR磷酸化的抑制汇总
*后3种抗体为333nM。
N.D.：未测定
实施例15
BxPC3人胰腺肿瘤细胞的IGF-I和IGF-II诱导增殖的抑制
如上所述，中和IGF抗体的其中一个标准是抑制IGF诱导增殖的能力。为了评价所述抗体抑制IGF诱导增殖的能力，在以下测定中使用表达内源hIGF-IR的BxPC3人胰腺肿瘤细胞。
将BxPC3细胞以2000个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并在常规生长培养基中过夜培养。第2天，弃去生长培养基，用无血清培养基温和洗涤各孔2次，加入100μL含有10μg/ml转铁蛋白和0.1％BSA的无血清培养基(测定培养基)，以使细胞饥饿。24小时后，弃去原培养基，用无血清培养基温和洗涤细胞1次，向细胞加入100μL测定培养基，一式二份或一式三份，该测定培养基中含有20ng/ml IGF，与多种抗体浓度于37℃预孵育30分钟。所述板孵育3天，用CellTiter-Glo试剂(Promega)定量测定增殖。
筛选出10个抗体系，对每种抗原进行了2次或3次独立测定。结果汇总于下表16。基于以下的功能数据和实施例14的数据，选出4种最好的抗体。IGF-I诱导增殖测定数据因为观察到高测定可变性而被排除在选择标准之外。
表16.BxPC3人胰腺肿瘤细胞的IGF依赖性增殖的抑制汇总
*对于后3种抗体为333nM
N.D.：未测定
实施例16
与小鼠IGF-I、IGF-II和胰岛素的交叉反应性的测定
一个目的是开发对IGF-I和IGF-II具有特异性但对胰岛素没有交叉反应性的抗体。为了用动物进行以后的试验，抗体还应与鼠IGF-I/II有交叉反应，但与鼠胰岛素没有交叉反应。因此，进行ELISA测定，以确定选定的抗体是否能够与鼠IGF或胰岛素有交叉反应。
如在表17中所示，通过ELISA测试了最佳的10种抗体中的5种与小鼠或大鼠胰岛素的交叉反应性。ELISA表明，这些抗体与小鼠或大鼠胰岛素没有交叉反应性，与阴性对照抗体PK16.3.1相 仿，与阳性对照抗大鼠胰岛素抗体相反。
表17.与小鼠胰岛素的交叉反应性
实施例17
在NIH3T3细胞中异位表达的人IGF-IR的小鼠IGF-I和IGF-II诱导磷酸化的抑制
进一步测试了单克隆抗体与小鼠IGF-I和IGF-II的交叉反应性，以便确定它们抑制IGF诱导的IGF-IR磷酸化的程度。该测定如前所述使用异位表达hIGF-IR受体的NIH3T3细胞进行。该测定的结果概述于表18。
将异位表达人IGF-IR的NIH3T3细胞以10,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中，在饥饿培养基(1％活性炭处理的FBS)中孵育过夜。第2天，弃去生长培养基，用PBS温和洗涤各孔2次，加入100μL无血清培养基(0％FBS)，以使细胞饥饿。在1-2小时后，将100μl无血清培养基加入细胞，一式三份，所述无血清培养基中含有0.05％ BSA，并含有小鼠IGF-I(10nM)或IGF-II(10nM)(R&D Systems，Inc.，Minneapolis，MN，目录号分别为791-MG和792-MG)，于37℃与多种抗体浓度预孵育60分钟。于37℃进行10分钟刺激，在刺激后，取出培养基，向各孔加入100μL 3.7％甲醛的PBS/3％BSA溶液，并于室温孵育20分钟。然后用PBS洗涤细胞2次，向各孔加入100μL透化缓冲液(0.1％ Triton-X的3％ BSA/PBS溶液)。使其于室温孵育10分钟，弃去原溶液，加入100μl 0.6％过氧化氢的PBS/3％ BSA溶液， 以使任何内源过氧化物酶活性失活。在室温孵育20分钟后，用PBS/0.1％吐温-20洗涤细胞3次，并通过加入100μL 10％FBS的PBS/0.1％吐温-20溶液于室温封闭1小时。然后取出封闭缓冲液，向各孔加入50μL 1μg/ml的抗磷酸IGFIR抗体(目录号44-804，BioSource)在10％ FBS/PBS-T中的溶液。在2小时室温孵育后，细胞用PBST洗涤3次，每次洗涤之间浸泡5分钟。在洗涤后，以50μl/孔向各孔加入以封闭缓冲液1∶250稀释的山羊抗兔IgGFc-HRP二抗。在1小时室温孵育后，如前用PBST洗涤细胞3次，每次5分钟，再拍干。然后加入50μl ECL试剂(DuoLux)，立即读取RLU。
表18.小鼠IGF诱导的hIGF-IR磷酸化的抑制
实施例18
在裸鼠中体内表达IGF-II知IGF-1R的NIH3T3细胞生长的抑制
为了评价抗体在体内抑制IGF-II诱导增殖的能力，进行以下试验。
对6-8周龄的雌性裸鼠(由Charles River Laboratories，Wilmington，MA，USA提供)皮下移植5×106个克隆32细胞(异位过量表达人IGF-II和人IGF-1R的NIH3T3细胞)。将细胞悬浮在总接种体积330μl的PBS中。让肿瘤生长至100-200mm3，然后用单克隆抗体7.159.2、7.34.1和7.251.3治疗。从第22天开始，每周1次共4周以5mg/kg或50mg/kg将悬浮在PBS中的抗体或IgG2同种型对照抗体经腹膜内给予随机组，每组9只或12只小鼠。从第22天开始，每周1次共4周将PBS作为溶媒对照给予另一组的11只小鼠。每周检测2-3次肿瘤大小和体重。结果概述于图1和2。
观察到显著的肿瘤生长抑制(参见图1)，在任何组中都不存在显著的体重下降(参见图2)。抗体7.159.2、7.34.1和7.251.3以5mg/kg/周和50mg/kg/周显著抑制克隆32肿瘤的生长(参见图1)。
实施例19
在裸鼠中体内表达IGF-I和IGF-1R的NIH3T3细胞生长的抑制
在先前的实施例中，已表明抗体在体内抑制IGF-II诱导增殖。为了评价抗体在体内抑制IGF-I诱导增殖的能力，进行以下试验。
对雌性裸鼠(来源于Swiss nu/nu小鼠品系的Alderley Park品系，由AstraZeneca提供)在其左胁皮下移植5×106个活P12细胞[异位过量表达人IGF-I和人IGF-1R的NIH3T3细胞(Pietrzkowski等，Cell Growth&Differentiation，3，199-205，1992)]。将细胞悬浮在总接种体积0.1ml的PBS中。从NIH3T3细胞移植日开始，用mAb 7.159.2以1.0mg/小鼠每周2次或用等体积的PBS溶媒(0.3ml)按照相同时间表给予两组动物(每组n＝10只)。所有剂量都经腹膜内(i.p.)途径腹膜内给予。每天检测1次动物体重，肿瘤一经确认，就使用卡钳每周2次进行肿瘤检测。假定为卵形，由卡钳检测结果计算出所有可检测肿瘤的体积。结果汇总于图3。
如在图3中所示，在每周2次腹膜内给予1.0mg抗体/小鼠之后，用mAb 7.159.2观察到显著的肿瘤生长抑制。在任何动物组别都没有观察到显著的体重下降。
实施例20
抑制人类患者的肿瘤细胞生长
将诊断为患有胰腺癌的一组人类癌症患者随机分成若干治疗组。每周1次静脉内注射本文所述的mAb 7.159.2、7.34.1或7.251.3治疗每组患者。每名患者都用在50mg/kg至2，250mg/kg范围 内的有效量抗体给药4-8周。对照组仅给予标准化疗方案。
在治疗方案当中和之后定期通过核磁共振成像(MRI)评价肿瘤负荷。发现与未接受抗体治疗的患者相比，每周1次接受mAb7.159.2、7.34.1或7.251.3抗体治疗的患者表现出显著的肿瘤尺寸缩小。在某些受治疗患者中，肿瘤不再检测到。相比之下，在对照组中肿瘤尺寸增大或基本保持不变。
实施例21
抑制人类患者的肿瘤细胞生长
一名人类患者被诊断患有恶性肿瘤。在8周内以每周一次静脉内注射mAb 7.159.2治疗该患者。在治疗方案当中和之后定期通过核磁共振成像(MRI)评价肿瘤负荷。发现肿瘤尺寸显著缩小。
实施例22
治疗人类患者的肢端肥大症
一名成年男性被诊断患有肢端肥大症。在2年时间段内以每两周一次(bi-weekly)静脉内注射mAb 7.34.1治疗该患者。结果，该患者的肢端肥大症症状有显著减轻。
实施例23
治疗人类患者的银屑病
一名成年女性被诊断患有严重银屑病。在3周时间段内以每两周一次(bi-weekly)静脉内注射mAb 7.251.3治疗该患者。结果，该患者的银屑病症状有显著减轻。
实施例24
治疗人类患者的骨质疏松症
一名成年女性被诊断患有骨质疏松症。在一年时间段内以每两周一次静脉内注射mAb 7.159.2治疗该患者。结果，骨密度下 降有显著减轻。
实施例25
治疗人类患者的动脉粥样硬化
一名成年男性被诊断患有动脉粥样硬化。在一年时间段内以每两周一次静脉内注射mAb 7.34.1治疗该患者。结果，该患者的动脉粥样硬化症状如心绞痛出现减轻。
实施例26
治疗人类患者的再狭窄
一名成年男性接受血管成形术，以缓解阻塞的动脉。在血管成形术后，在一年时间段内以每两周一次静脉内注射mAb 7.251.3治疗该患者。结果，该患者没有出现已治疗动脉的再狭窄。
实施例27
治疗人类患者的糖尿病
一名成年女性被诊断患有糖尿病。在一年时间段内以每两周一次静脉内注射mAb7.159.2治疗该患者。结果，糖尿病症状减轻。
序列表
对亚克隆的杂交瘤进行了测序，以在核苷酸和氨基酸水平上确定它们的可变重链基因和可变轻链基因的一级结构。列于表1的抗IGF-I和IGF-II的单克隆抗体可变区的核苷酸和多肽序列在序列表中提供。
通过引用结合
本文引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等，以及其中引用的参考文献，就它们还没有被引入本文作为 参考的意义上，整体通过引用结合到本文中。
等同实施方案
所撰写的本说明书被认为足以使本领域技术人员能够实现本发明。前面的描述和实施例详述了本发明的某些优选实施方案，并描述了本发明人提出的最佳方式。但是，应当认识到，所述内容无论会怎样详细地出现在正文中，本发明都可以多种方式付诸实施，本发明应以随附权利要求及其任何等同实施方案为准。

Claims (24)

1.一种分离的全人抗体或其结合片段，其优先结合胰岛素样生长因子II(IGF-II)，与胰岛素样生长因子I(IGF-I)有交叉反应性，并且中和IGF-I和IGF-II活性，其中所述抗体或其结合片段包含：
重链互补决定区1(CDR1)，其包含氨基酸序列“Ser Tyr Tyr Trp Ser”(SEQ ID NO:21)；
重链互补决定区2(CDR2)，其包含氨基酸序列“Tyr Phe Phe Tyr Ser Gly Tyr ThrAsn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser”(SEQ ID NO:22)；
重链互补决定区3(CDR3)，其包含氨基酸序列“Ile Thr Gly Thr Thr Lys Gly GlyMet Asp Val”(SEQ ID NO:23)；
轻链互补决定区1(CDR1)，其包含氨基酸序列“Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile GlyAla Gly Tyr Asp Val His”(SEQ ID NO:24)；
轻链互补决定区2(CDR2)，其包含氨基酸序列“Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser”(SEQID NO:25)；和
轻链互补决定区3(CDR3)，其包含氨基酸序列“Gln Ser Phe Asp Ser Ser Leu SerGly Ser Val”(SEQ ID NO:26)。
2.分离的全人抗体或其结合片段，其优先结合胰岛素样生长因子II(IGF-II)，与胰岛素样生长因子I(IGF-I)有交叉反应性，并且中和IGF-I和IGF-II活性，其中所述抗体或其结合片段包含：
重链互补决定区1(CDR1)，其具有氨基酸序列“Ser Tyr Tyr Trp Ser”(SEQ ID NO:27)；
重链互补决定区2(CDR2)，其具有氨基酸序列“Tyr Phe Phe Tyr Ser Gly Tyr ThrAsn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser”(SEQ ID NO:28)；
重链互补决定区3(CDR3)，其具有氨基酸序列“Ile Thr Gly Thr Thr Lys Gly GlyMet Asp Val”(SEQ ID NO:29)；
轻链互补决定区1(CDR1)，其具有氨基酸序列“Thr Gly Arg Ser Ser Asn Ile GlyAla Gly Tyr Asp Val His”(SEQ ID NO:30)；
轻链互补决定区2(CDR2)，其具有氨基酸序列“Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser”(SEQID NO:31)；和
轻链互补决定区3(CDR3)，其具有氨基酸序列“Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu SerGly Ser Val”(SEQ ID NO:32)。
3.权利要求1-2中任一项所述的抗体或其结合片段，其中所述抗体或其结合片段结合IGF-II的亲和力是IGF-I的至少2.5倍。
4.权利要求3所述的抗体或其结合片段，其中所述抗体或其结合片段在异位表达IGF-1R的NIH3T3细胞中抑制IGF-I依赖性IGF-I受体磷酸化的EC50不超过15nM。
5.权利要求4所述的抗体或其结合片段，其中所述抗体或其结合片段在异位表达IGF-1R的NIH3T3细胞中抑制IGF-II依赖性IGF-I受体磷酸化的EC50不超过5nM。
6.权利要求5的抗体或其结合片段，其中所述抗体或其结合片段以不超过25nM的EC50抑制表达重组hIGF-IR的NIH3T3细胞的IGF-II依赖性增殖达70％以上。
7.权利要求6的抗体或其结合片段，其中所述抗体或其结合片段以不超过40nM的EC50抑制表达重组hIGF-IR的NIH3T3细胞的IGF-I依赖性增殖达70％以上。
8.权利要求7的抗体或其结合片段，其中所述抗体或其结合片段竞争结合含有选自以下的可变重链序列的单克隆抗体：SEQ ID NO.:2、SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:10、SEQ IDNO.:14和SEQ ID NO.:18。
9.权利要求3的抗体或其结合片段，其中所述单克隆抗体含有选自以下的可变轻链序列：SEQ ID NO.:4、SEQ ID NO.:8、SEQ ID NO.:12和SEQ ID NO.:16。
10.权利要求3的抗体或其结合片段，其中所述抗体或其结合片段结合IGF-I的KD低于4nM。
11.权利要求3的抗体或其结合片段，其中所述抗体或其结合片段结合IGF-I的KD低于650pM。
12.权利要求3的抗体或其结合片段，其中所述抗体或其结合片段结合IGF-II的KD低于300pM。
13.权利要求3的抗体或其结合片段，其中所述抗体或其结合片段是全人单克隆抗体。
14.权利要求13的抗体或其结合片段，其中所述抗体或其结合片段是全人单克隆抗体的结合片段。
15.权利要求14的抗体或其结合片段，其中所述结合片段选自Fab、Fab’或F(ab’)2和Fv。
16.权利要求1的抗体或其结合片段，其中所述抗体或其结合片段具有杂交瘤细胞系7.251.3(ATCC保藏号PTA-7422)产生的单克隆抗体的氨基酸序列。
17.权利要求2的抗体或其结合片段，其中所述抗体或其结合片段具有杂交瘤细胞系7.34.1(ATCC保藏号PTA-7423)产生的单克隆抗体的氨基酸序列。
18.权利要求2的抗体或其结合片段，其中所述抗体或其结合片段含有包含SEQ IDNO.:10序列的重链多肽，以及包含SEQ ID NO.:12序列的轻链多肽。
19.权利要求1的抗体或其结合片段，其中所述抗体或其结合片段含有包含SEQ IDNO.:14序列的重链多肽，以及包含SEQ ID NO.:16序列的轻链多肽。
20.权利要求1-2中任一项的抗体或其结合片段，所述抗体或其结合片段与药学上可接受的载体一起制成混合物。
21.一种核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1-2中任一项的抗体或其结合片段。
22.一种载体，所述载体包含权利要求21的核酸分子。
23.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求22的载体。
24.权利要求14的人单克隆抗体，其中当IGF-II或IGF-I蛋白结合胰岛素生长因子结合蛋白时，所述抗体不特异性结合所述IGF-II或IGF-I蛋白。
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