CN101466737B - 针对uPAR的定向结合剂及其用途 - Google Patents

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Abstract

描述了针对抗原uPAR的定向结合剂以及这种抗体的用途。具体地，针对抗原uPAR的全人单克隆抗体。编码包括重链和轻链免疫球蛋白分子的核苷酸序列和氨基酸序列，特别是与跨越构架区和/或互补性决定区(CDR)，尤其是从FR1到FR4或者从CDR1到CDR3的邻接的重链和轻链序列相对应的序列。表达这种免疫球蛋白分子和单克隆抗体的杂交瘤或其它细胞系。

Description

针对uPAR的定向结合剂及其用途
与相关申请的交叉参考
在35 U.S.C.§119下，本申请要求2006年4月10日申请的美国临时申请系列号No.60/790,642的优先权，在此以其整体引入作为参考。
领域
本发明涉及针对尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)的定向结合剂以及这种试剂的用途。更具体地，本发明涉及针对uPAR的全人单克隆抗体。所述的结合剂可用作诊断学以及用于治疗与uPAR的活性和/或超量产生相关的疾病。
背景
尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR，CD87)，GenBank登录号NP_002650，是一种55-60kDa的高度糖基化的313个残基的多肽，其通过糖磷脂酰肌醇(GPI)-锚与细胞膜的外小叶相连。该蛋白质折叠成三个高度同源的结构域，DI、DII和DIII(Huai等，Science311：656-659 2006)。uPAR的N末端提供尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)结合位点(DI)(Gardsvoll等，J Biol Chem 274：37995-38003 1999)。证据提示，结构域3中的残基参与配体结合位点的装配，且结构域2和3增加uPA与结构域1结合的亲和力(Liang等，J Biol Chem 276：28946-28953 2001)。加工C末端结构域(DIII)以添加包括残基ser282、gly283和ala284的糖磷脂酰肌醇(GPI)-锚。DI和DII之间的接头区中(Hoyer-Hansen等，Eur J Biochem 243：21-26 1997；Andolfo等，Thromb Hemost 88：298-306 2002)和C末端结构域内残基处(Beaufort等，J Immunol 172：5450-549 2004)的蛋白酶剪切导致出现包括DII和DIII的膜锚定型和包括DI-DIII或DII-DIII的可溶型的uPAR(suPAR)。糖酯锚的剪切也可以从细胞表面释放uPAR(Wilhelm等，J Cell Physiol 180：225-235  1999)。掺入DI的可溶的uPAR保持结合尿激酶的能力(Higazi等，J Biol Chem 270：17375-17380 1995)。
许多类型细胞的表面上都表达uPAR，包括循环的白细胞、血管平滑肌细胞、生血管内皮细胞、骨髓细胞和成纤维细胞。已经将细胞表面上uPAR表达的上调和纤溶酶原激活与许多状况联系起来，包括炎症、创伤修复、关节炎(Szekanecz等，J Clin Pathol 50：314-3191997)、动脉粥样硬化(Carmeliet等，Nature Genetics，17：439-444 1997)、血管发生以及肿瘤侵入和转移。已经表明，血浆中存在提高水平的可溶性uPAR在结肠直肠癌中是一种预后的标记(Stephens等，J NatlCancer Inst 91：869-874 1999)。
无活性的酶原纤溶酶原活化成丝氨酸蛋白酶纤溶酶是调节纤维蛋白溶解的关键事件。有两种纤溶酶原激活物，组织纤溶酶原激活物(tPA)和尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)。尽管tPA似乎是血浆中的关键纤溶酶原激活物，但uPA由于结合uPAR与细胞表面纤溶酶原激活有关。尿激酶是作为单链酶原(scuPA)被分泌的，其显示非常低的或者无内在的酶促活性。通过纤溶酶的酶切割后，scuPA转化成有活性的，二硫键连接的，双链高分子量(HMW)-uPA。该HMW-uPA，包含A链(1-158位氨基酸)和B链，或者LMW-uPA(159-411位氨基酸)。通过A链中位于氨基末端片段(ATF)中的uPA的生长因子结构域(GFD)1-48氨基酸介导uPA与uPAR的初级相互作用。已经鉴定了uPA中与uPAR相互作用的第二位点(连接肽，136-143位氨基酸)。
uPA对uPAR的结合亲和力是约1nM(Kd)。比较不同物种之间uPAR的一级结构，人uPAR与食蟹猴(Macaca fascicularis)的uPAR有95％相同，与小鼠(Mus musculus)的uPAR仅有60％相同。另外，uPA和uPAR的高亲和力结合是物种特异的。跨物种的uPA对uPAR的亲和力(例如人uPA与大鼠uPAR)至少相差两个数量级。
uPA向uPAR的细胞表面募集调节细胞表面纤溶酶原激活：当受体结合时，scuPA被更有效地激活(Ellis等，J Biol Chem 264：2185-2188 1989)；相对于溶液相中的uPA，受体结合的uPA的催化效率提高(Higazi等，J Biol Chem 270：17375-17380 1995)；作为受体结合的uPA的抑制剂，PAI-1效率较低(Ellis等，J Biol Chem 265：9904-9908 1990)。纤溶酶原反过来通过低和高亲和力相互作用被募集到细胞表面，且纤溶酶产生在细胞表面上进行得更有效并且也不易受其生理抑制剂影响。在肿瘤细胞表面，纤溶酶原激活便于有助于肿瘤进展的多种过程，包括基质-金属蛋白酶的激活、细胞外基质蛋白质的降解、驱动肿瘤生长和侵入的生长因子的释放和激活(Andreasen等，Int J Cancer 72：1-22 1997)。
除了在纤溶酶原激活中的公知作用，更新的证据已经确定uPAR的作用是作为玻连蛋白的粘附受体，一种涉及uPAR、uPA和PAI-1的复杂相互作用(Waltz和Chapman，J Biol Chem 269：14746-14750 1994；Czekay等，J Cell Biol 160：781-791 2003；Li等，J Biol Chem 278：29925-29932 2003)。细胞表面uPAR的剪切暴露了DII结构域上的表位，其已在体外表明是趋化性的表位(Degryse等，JBiol Chem 280：24792-24803 2005)。已报道了与整联蛋白受体的相互作用(例如，Wei等，J Cell Biol 168：501-511 2005；Wei等，Mol BiolCell 12：2975-2986 2001)，并且已经证明了由于uPA结合引起细胞信号传导途径的激活(综述见Blasi和Carmeliet，Nature Rev Mol Cell Biol3：932-943 2002)。
已经将uPAR和尿激酶的表达增强与一系列人类癌症内的肿瘤进展联系起来，包括乳腺癌、膀胱癌、胃癌、子宫内膜癌、结肠直肠癌(Edo de Bock和Wang，Med Res Reviews 24：13-39 2004)。肿瘤启动子、生长因子、细胞因子和激素以及致动脉粥样硬化的脂蛋白或缺氧增加uPAR基因表达。免疫组织化学和原位杂交研究已经显示uPA/uPAR复合物位于肿瘤侵入的边缘，(Pyke等，Am J Pathol 138：1059-1067 1991)并且与肿瘤侵入相关。将每个uPA、uPAR或PAI-1的高表达水平与不同类型肿瘤的不良预后联系起来(Duffy和Duggan，Clin Biochem 37：541-548 2004)。
其它人已经表明多克隆的尿激酶受体抗体可减小肿瘤体积并检测体内隐蔽的肿瘤转移的存在(Rabbani和Gladu，Cancer Res.62：2390-7 2002)。uPA-ATF的腺病毒介导的递送(Li等，Gene Therapy51105-1113 1998；Human Gene Therapy 16：1157-1167 2005)，uPA-ATF的稳定转染(Zhu等，DNA Cell Biol 20：297-305 2001)，反义uPAR(Mohan等，Cancer Res 59：3369-3373 1999)或者组合的反义uPAR/uPA(Gondi等，Oncogene 22：5967-5975 2003)导致uPAR活性的阻滞或丧失并且在体外抑制侵入以及在体内抑制肿瘤生长和侵入。另外，源于尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)的非受体结合区域的肽在体内抑制肿瘤进展和血管发生并且诱导肿瘤细胞死亡(Guo等，FASEB J.14：1400-1410 2000)。
概述
本发明的实施方案涉及特异性结合uPAR以及因此抑制纤溶酶原激活和某些基质金属蛋白酶的激活的全人定向结合剂。该定向结合剂也抑制肿瘤细胞粘附和/或侵入，和/或细胞转移。另外，定向结合剂可用于减少肿瘤生长。达到这个目的的机理可以包括且不限于抑制uPA与其受体uPAR的结合，抑制uPAR/uPA局限性uPA酶促活性，取消与整联蛋白或细胞外基质蛋白质如玻连蛋白的相互作用，因此减少uPAR的有效浓度。
因此，本发明的一个实施方案是特异性结合uPAR并且抑制uPA与uPAR结合的定向结合剂。该定向结合剂可以小于100μM、10μM、1μM、100nM、10nM、1nM、500pM、400pM、300pM、200pM、100pM或50pM的Kd结合uPAR。
另一个实施方案是定向结合剂，其结合uPAR并且以低至100μg/ml、10μμg/ml、8μg/ml、6μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml或100pg/ml或者更低的抗体浓度抑制90％以上U937细胞上的纤溶酶原激活。
另一个实施方案是定向结合剂，其结合uPAR并且以小于10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.08μg/ml、0.06μg/ml、0.04μg/ml、0.02μg/ml或者0.01μg/ml的IC50抑制U937细胞上的纤溶酶原激活。
另一个实施方案是定向结合剂，其结合uPAR并且以低至100μg/ml、10μg/ml、8μg/ml、6μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml或100pg/ml或者更低的定向结合剂浓度抑制90％以上uPAR介导的U937细胞与玻连蛋白的细胞粘附。另一个实施方案是定向结合剂，其结合uPAR并且以低至100μg/ml、10μg/ml、8μg/ml、6μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml或100pg/ml或者更低的定向结合剂浓度抑制80％以上uPAR介导的U937细胞与玻连蛋白的细胞粘附。
另一个实施方案是定向结合剂，其结合uPAR并且以低至1000μg/ml、100μg/ml、10μg/ml、8μg/ml、6μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml或100pg/ml或者更低的定向结合剂浓度抑制90％以上HT-1080细胞侵入通过MatrigelTM。
在另一个实施方案中，定向结合剂可包括包含如表18中所示互补性决定区(CDR)、CDR1、CDR2或CDR3序列中任何一种的序列。在另一个实施方案中，定向结合剂可包括包含如表18中所示CDR1、CDR2或CDR3序列中任意两种的序列(即CDR1和CDR2、CDR1和CDR3或者CDR2和CDR3)。在另一个实施方案中，定向结合剂可包括包含如表18中所示CDR1、CDR2和CDR3序列的序列。注意到，本领域的那些普通技术人员可很容易地完成CDR测定。见例如，Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，FifthEdition，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，vols.1-3。
在另一个实施方案中，定向结合剂可包括包含如表18中所示CDR1、CDR2或CDR3序列中任何一种的序列。在另一个实施方案中，定向结合剂可包括包含如表18中所示CDR1、CDR2或CDR3序列中任意两种的序列(即CDR1和CDR2、CDR1和CDR3或者CDR2和CDR3)。在另一个实施方案中，定向结合剂可包括包含如表18中所示CDR1、CDR2和CDR3序列的序列。
在另一个实施方案中，定向结合剂可包括包含如表19中所示CDR1、CDR2或CDR3序列中任何一种的序列。在另一个实施方案中，定向结合剂可包括包含如表19中所示CDR1、CDR2或CDR3序列中任意两种的序列(即CDR1和CDR2、CDR1和CDR3或者CDR2和CDR3)。在另一个实施方案中，定向结合剂可包括包含如表19中所示CDR1、CDR2和CDR3序列的序列。
在另一个实施方案中，定向结合剂可包括包含如表18中所示全人单克隆抗体2.19.2(ATCC编号PTA-7474)、2.6.1(ATCC编号PTA-7475)或4.18.1(ATCC编号PTA-7476)中任何一种的CDR1、CDR2或CDR3序列中任何一种的序列。在另一个实施方案中，定向结合剂可包括包含如表18中所示全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1或4.18.1的CDR1、CDR2或CDR3序列中任意两种的序列(即CDR1和CDR2、CDR1和CDR3或者CDR2和CDR3)。在另一个实施方案中，定向结合剂可包括包含如表18中所示全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1或4.18.1的CDR1、CDR2和CDR3序列的序列。
在另一个实施方案中，定向结合剂可包括包含如表19中所示全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1或4.18.1的CDR1、CDR2或CDR3序列中任何一种的序列。在另一个实施方案中，定向结合剂可包括包含如表19中所示全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1或4.18.1的CDR1、CDR2或CDR3序列中任意两种的序列(即CDR1和CDR2、CDR1和CDR3或者CDR2和CDR3)。在另一个实施方案中，定向结合剂可包括包含如表19中所示全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1或4.18.1的CDR1、CDR2和CDR3序列的序列。
在另一个实施方案中，定向结合剂包括包含如表18中所示CDR1、CDR2或CDR3序列中任何一种和如表19中所示CDR1、CDR2或CDR3序列中任何一种的序列。在另一个实施方案中，定向结合剂包括如表18中所示CDR1、CDR2或CDR3序列中任意两种和如表19中所示CDR1、CDR2或CDR3序列中任意两种(即CDR1和CDR2、CDR1和CDR3或者CDR2和CDR3)。在另一个实施方案中，定向结合剂包括如表18中所示CDR1、CDR2和CDR3序列和如表19中所示CDR1、CDR2和CDR3序列。
在另一个实施方案中，定向结合剂包括包含如表18中所示全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1或4.18.1的CDR1、CDR2或CDR3序列中任何一种，以及如表19中所示全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1或4.18.1的CDR1、CDR2或CDR3序列中任何一种的序列。在另一个实施方案中，定向结合剂包括如表18中所示全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1或4.18.1的CDR1、CDR2或CDR3序列中任意两种，以及如表19中所示全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1或4.18.1的CDR1、CDR2或CDR3序列中任意两种(即CDR1和CDR2、CDR1和CDR3或者CDR2和CDR3)。在另一个实施方案中，定向结合剂包括如表18中所示全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1或4.18.1的CDR1、CDR2和CDR3序列，以及如表19中所示全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1或4.18.1的CDR1、CDR2和CDR3序列。
在另一个实施方案中，定向结合剂包括包含如表18中所示全人单克隆抗体2.19.2的CDR1、CDR2和CDR3序列，以及如表19中所示全人单克隆抗体2.19.2的CDR1、CDR2和CDR3序列的序列。在另一个实施方案中，定向结合剂包括包含如表18中所示全人单克隆抗体2.6.1的CDR1、CDR2和CDR3序列，以及如表19中所示全人单克隆抗体2.6.1的CDR1、CDR2和CDR3序列的序列。在另一个实施方案中，定向结合剂包括包含如表18中所示全人单克隆抗体4.18.1的CDR1、CDR2和CDR3序列，以及如表19中所示全人单克隆抗体4.18.1的CDR1、CDR2和CDR3序列的序列。
在本发明的一个实施方案中，定向结合剂是抗体。在本发明的一个实施方案中，定向结合剂是单克隆抗体。在本发明的一个实施方案中，定向结合剂是全人单克隆抗体。
在另一个实施方案中，有结合uPAR并且包括包含如表19中所示CDR1、CDR2或CDR3序列中任何一种的轻链氨基酸序列的抗体。在另一个实施方案中，有结合uPAR并且包括包含如表19中所示CDR1、CDR2或CDR3序列中任意两种(即CDR1和CDR2、CDR1和CDR3或者CDR2和CDR3)的轻链氨基酸序列的抗体。在另一个实施方案中，有结合uPAR并且包括包含如表19中所示CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链氨基酸序列的抗体。在某些实施方案中，抗体是全人单克隆抗体。
另一个实施方案是结合uPAR并且包括包含如表18中所示CDR1、CDR2或CDR3序列中任何一种的重链氨基酸序列的抗体。在另一个实施方案中，有结合uPAR并且包括包含如表18中所示CDR1、CDR2或CDR3序列中任意两种(即CDR1和CDR2、CDR1和CDR3或者CDR2和CDR3)的重链氨基酸序列的抗体。在另一个实施方案中，有结合uPAR并且包括包含如表18中所示CDR1、CDR2和CDR3序列的重链氨基酸序列的抗体。在某些实施方案中，抗体是全人单克隆抗体。
在另一个实施方案中，结合uPAR的抗体可包括包含如表18中所示全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1或4.18.1的CDR1、CDR2或CDR3序列中任何一种的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体可包括包含如表18中所示全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1或4.18.1的CDR1、CDR2或CDR3序列中任意两种(即CDR1和CDR2、CDR1和CDR3或者CDR2和CDR3)的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体可包括包含如表18中所示全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1或4.18.1的CDR1、CDR2和CDR3序列的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，结合uPAR的抗体可包括包含如表19中所示全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1或4.18.1的CDR1、CDR2或CDR3序列中任何一种的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体可包括包含如表19中所示全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1或4.18.1的CDR1、CDR2或CDR3序列中任意两种(即CDR1和CDR2、CDR1和CDR3或者CDR2和CDR3)的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体可以包括包含如表19中所示全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1或4.18.1的CDR1、CDR2和CDR3序列的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，结合uPAR的抗体包括包含如表18中所示CDR1、CDR2或CDR3序列中任何一种的重链氨基酸序列以及包含如表19中所示CDR1、CDR2或CDR3序列中一种的轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体包括包含如表18中所示CDR1、CDR2或CDR3序列中任意两种的重链氨基酸序列以及包含如表19中所示CDR1、CDR2或CDR3序列中任意两种的轻链氨基酸序列(即CDR1和CDR2、CDR1和CDR3或者CDR2和CDR3)。在另一个实施方案中，抗体包括包含如表18中所示CDR1、CDR2和CDR3序列的重链氨基酸序列以及包含如表19中所示CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链氨基酸序列。
在另一个实施方案中，结合uPAR的抗体包括包含如表18中所示全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1或4.18.1的CDR1、CDR2或CDR3序列中任何一种的重链氨基酸序列以及包含如表19中所示全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1或4.18.1的CDR1、CDR2或CDR3序列中任何一种的轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体包括包含如表18中所示全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1或4.18.1的CDR1、CDR2或CDR3序列中任意两种的重链氨基酸序列以及包含如表19中所示全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1或4.18.1的CDR1、CDR2或CDR3序列中任意两种的轻链氨基酸序列(即CDR1和CDR2、CDR1和CDR3或者CDR2和CDR3)。在另一个实施方案中，抗体包括包含如表18中所示全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1或4.18.1的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链氨基酸序列以及包含如表19中所示全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1或4.18.1的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链氨基酸序列。
在另一个实施方案中，抗体包括包含如表18中所示全人单克隆抗体2.19.2的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链氨基酸序列以及包含如表19中所示全人单克隆抗体2.19.2的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体包括包含如表18中所示全人单克隆抗体2.6.1的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链氨基酸序列以及包含如表19中所示全人单克隆抗体2.6.1的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体包括包含如表18中所示全人单克隆抗体4.18.1的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链氨基酸序列以及包含如表19中所示全人单克隆抗体4.18.1的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链氨基酸序列。
本发明的另一个实施方案是与本发明的定向结合剂或抗体交叉竞争结合uPAR的定向结合剂。在本明的另一个实施方案中，有与本发明的定向结合剂或抗体交叉竞争结合uPAR的抗体。
在另一个实施方案中，定向结合剂或抗体与全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1和4.18.1中的任何一种交叉竞争结合uPAR。在本明的一个实施方案中，是与全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1和4.18.1中的任何一种交叉竞争结合uPAR的抗体。
本发明的另一个实施方案是与本发明的定向结合剂或抗体结合uPAR上相同表位的定向结合剂。在本明的另一个实施方案中，有与本发明的定向结合剂或抗体结合uPAR上相同表位的抗体。
在本发明的一个实施方案中，是与全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1和4.18.1中任何一种结合uPAR上相同表位的定向结合剂。在本明的一个实施方案中，是与全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1和4.18.1中任何一种结合uPAR上相同表位的抗体。
在一个实施方案中，定向结合剂包括如下面更详细讨论的，特异性结合uPAR的全人单克隆抗体2.19.2(ATCC编号PTA-7474)、2.6.1(ATCC编号PTA-7475)和/或4.18.1(ATCC编号PTA-7476)中的一种或多种。
在一个实施方案中，提供定向结合剂或由选自ATCC编号PTA-7474、ATCC编号PTA-7475和ATCC编号PTA-7476的杂交瘤所产生的抗体。在一个实施方案中，提供定向结合剂或可从由选自ATCC编号PTA-7474、ATCC编号PTA-7475和ATCC编号PTA-7476的杂交瘤所产生的抗体中衍生的抗体。
在一个实施方案中，定向结合剂包括可从全人单克隆抗体2.19.2(ATCC编号PTA-7474)、2.6.1(ATCC编号PTA-7475)和/或4.18.1(ATCC编号PTA-7476)中的一种或多种衍生的抗体。
在一个实施方案中，定向结合剂包括具有SEQ ID NO.：26、30或50序列的多肽。在一个实施方案中，定向结合剂包括具有SEQ IDNO.：28、32或52序列的多肽。在一个实施方案中，本发明的抗体包括具有SEQ ID NO.：26、30或50序列的重链多肽。在一个实施方案中，本发明的抗体包括具有SEQ ID NO.：28、32或52序列的轻链多肽。
在一个实施方案中，本发明的定向结合剂包括包含SEQ IDNO.：26的序列的多肽，其中该序列具有表15每行所示的种系和非种系残基的独特组合中的任何一种。在一个实施方案中，本发明的定向结合剂包括包含SEQ ID NO.：30的序列的多肽，其中该序列具有表13每行所示的种系和非种系残基的独特组合中的任何一种。在一个实施方案中，本发明的定向结合剂包括包含SEQ ID NO.：50的序列的多肽，其中该序列具有表17每行所示的种系和非种系残基的独特组合中的任何一种。在一个实施方案中，本发明的定向结合剂包括包含SEQ IDNO.：28的序列的多肽，其中该序列具有表14每行所示的种系和非种系残基的独特组合中的任何一种。在一个实施方案中，本发明的定向结合剂包括包含SEQ ID NO.：32的序列的多肽，其中该序列具有表12每行所示的种系和非种系残基的独特组合中的任何一种。在一个实施方案中，本发明的定向结合剂包括包含SEQ ID NO.：52的序列的多肽，其中该序列具有表16每行所示的种系和非种系残基的独特组合中的任何一种。
在一个实施方案中，本发明的抗体包括包含SEQ ID NO.：26的序列的重链多肽，其中该序列具有表15每行所示的种系和非种系残基的独特组合中的任何一种。在一个实施方案中，本发明的抗体包括包含SEQ ID NO.：30的序列的重链多肽，其中该序列具有表13每行所示的种系和非种系残基的独特组合中的任何一种。在一个实施方案中，本发明的抗体包括包含SEQ ID NO.：50的序列的重链多肽，其中该序列具有表17每行所示的种系和非种系残基的独特组合中的任何一种。在一个实施方案中，本发明的抗体包括包含SEQ ID NO.：28的序列的轻链多肽，其中该序列具有表14每行所示的种系和非种系残基的独特组合中的任何一种。在一个实施方案中，本发明的抗体包括包含SEQ ID NO.：32的序列的轻链多肽，其中该序列具有表12每行所示的种系和非种系残基的独特组合中的任何一种。在一个实施方案中，本发明的抗体包括包含SEQ ID NO.：52的序列的轻链多肽，其中该序列具有表16每行所示的种系和非种系残基的独特组合中的任何一种。
本发明进一步提供用于测定患者样品中uPAR水平的方法，包括将本发明的定向结合剂或抗uPAR抗体与患者的生物样品接触，以及检测所述样品中所述抗体和uPAR之间结合的水平。在更具体的实施方案中，生物样品是血液、血浆、唾液、脑脊液、骨髓或尿。
在其它实施方案中，本发明提供包括本发明的定向结合剂或其结合片段，以及药学上可接受的载体的组合物。在其它实施方案中，本发明提供包括本发明的抗体或其结合片段，以及药学上可接受的载体的组合物。
通过选择需要治疗恶性肿瘤的动物以及向动物施用治疗有效剂量的本发明的结合uPAR的定向结合剂，本发明提供治疗动物中恶性肿瘤的方法。在某些实施方案中，该动物是人。在某些实施方案中，定向结合剂是本发明的抗体并且可选自2.19.2(ATCC编号PTA-7474)、2.6.1(ATCC编号PTA-7475)和4.18.1(ATCC编号PTA-7476)。
在某些实施方案中，恶性肿瘤可选自黑色素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、甲状腺瘤、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、成胶质细胞瘤、子宫内膜癌、肾癌、结肠癌、胰癌、食道癌、头和颈癌、间皮瘤、肉瘤、胆(胆管癌)、小肠腺癌、儿科恶性肿瘤和表皮样癌。
本发明的另外的实施方案包括有效治疗患细胞粘附和/或侵入相关疾病的动物的方法，包括选择需要治疗细胞粘附和/或侵入相关疾病的动物，以及向动物施用治疗有效剂量的本发明的特异性结合uPAR的定向结合剂。在某些实施方案中，该动物是人。在某些实施方案中，定向结合剂是全人单克隆抗体。在某些实施方案中，细胞粘附或细胞侵入相关疾病是肿瘤转移。在某些实施方案中，定向结合剂是本发明的抗体并且可选自2.19.2(ATCC编号PTA-7474)、2.6.1(ATCC编号PTA-7475)和4.18.1(ATCC编号PTA-7476)。
可治疗的细胞粘附和侵入相关疾病包括肿瘤性疾病，如黑色素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、甲状腺瘤、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、成胶质细胞瘤、子宫内膜癌、肾癌、结肠癌、胰癌、食道癌、头和颈癌、间皮瘤、肉瘤、胆(胆管癌)、小肠腺癌、儿科恶性肿瘤和表皮样癌。
可治疗的细胞粘附和侵入相关疾病包括非肿瘤性疾病，如炎症，或过度增殖性疾病，包括但不限于关节炎、动脉粥样硬化、变应性结膜炎。
本发明的另外的实施方案包括在动物中抑制uPAR诱导的细胞粘附和/或侵入的方法。这些方法包括选择需要治疗uPAR诱导的细胞粘附和侵入的动物，以及向所述动物施用治疗有效剂量的本发明的定向结合剂或全人单克隆抗体，其中所述抗体特异性结合uPAR。
本发明的另外的实施方案包括本发明的定向结合剂或抗体在制备在动物中用于治疗细胞粘附或侵入相关疾病的药物中的用途，其中所述的单克隆抗体特异性结合uPAR。
在另外的实施方案中，这里所述的定向结合剂可用于制备在动物中有效治疗uPAR诱导的细胞粘附，和/或侵入的药物，其中所述的定向结合剂特异性结合uPAR。在另外的实施方案中，这里所述的抗体可用于制备在动物中有效治疗uPAR诱导的细胞粘附，和/或侵入的药物，其中所述的抗体特异性结合uPAR。
这里所描述的本发明的实施方案涉及结合uPAR并影响uPAR功能的定向结合剂。这里所描述的本发明的其它实施方案涉及结合uPAR并影响uPAR功能的单克隆抗体。其它实施方案涉及本发明的抗uPAR抗体，其具有期望的治疗前景的性质，包括对uPAR的高结合亲和力，在体外和体内中和uPAR的能力，以及抑制uPAR诱导的细胞粘附和/或侵入和/或肿瘤生长的能力。其它实施方案涉及本发明的抗uPAR抗体的制剂，其具有期望的治疗前景的性质，包括对uPAR的高结合亲和力，在体外和体内中和uPAR的能力，以及抑制uPAR诱导的细胞粘附和/或侵入和/或肿瘤生长的能力。其它实施方案涉及本发明的全人抗uPAR抗体，其具有期望的治疗前景的性质，包括对uPAR的高结合亲和力，在体外和体内中和uPAR的能力，以及抑制uPAR诱导的细胞粘附和/或侵入和/或肿瘤生长的能力。其它实施方案涉及本发明的全人抗uPAR抗体的制剂，其具有期望的治疗前景的性质，包括对uPAR的高结合亲和力，在体外和体内中和uPAR的能力，以及抑制uPAR诱导的细胞粘附和/或侵入和/或肿瘤生长的能力。
在一个实施方案中，本发明包括以非常高亲和力(Kd)结合uPAR的抗体。例如，能以低于，但不限于10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10或10-11M，或者其中任意范围或值的Kd结合uPAR的人、兔、小鼠、嵌合的或人源化的抗体。如这里所述的，可通过
Figure G2007800215957D0013153330QIETU
和/或
Figure G2007800215957D0013153403QIETU
测量亲和力和/或抗体亲抗原性测量值。
本发明的一个实施方案包括结合uPAR的分离的抗体，或者这些抗体的片段。如本领域已知的，抗体可以是，例如，多克隆、寡克隆、单克隆、嵌合的、人源化的和/或全人抗体。这里所述的本发明的实施方案也提供用于产生这些抗体的细胞。
将会意识到，本发明的实施方案不限于任何特定类型的抗体或者产生或生产的方法。例如，本发明的抗uPAR抗体可以是全长抗体(例如，具有完整人Fc区)或者抗体片段(例如，Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或Dab(Dab是人抗体的最小功能结合单元)。另外，可从分泌抗体的杂交瘤，或者从已被编码抗体的一种或多种基因转化或转染的重组产生的细胞中生产抗体。
本发明的其它实施方案包括分离的编码如这里所描述的定向结合剂、抗体或其片段中任何一种的核酸分子，具有分离的编码抗uPAR抗体的核酸分子的载体，或者用这种核酸分子中的任何一种所转化的宿主细胞。另外，本发明的一个实施方案是生产本发明的抗uPAR抗体的方法，其通过在其中核酸分子表达以产生抗体的条件下培养宿主细胞，随后回收抗体来实现。应当意识到，本发明的实施方案也包括编码本发明的抗体或抗体片段的任何核酸分子，包括当转染到宿主细胞内用于抗体生产时，最优化以用于提高抗体或其片段产量的核酸序列。
另外的实施方案包括生产对uPAR具有高亲和力的抗体的方法，其通过用人uPAR或其片段，以及一种或多种其直系同源序列或片段免疫哺乳动物。
其它的实施方案基于产生和鉴定特异性结合uPAR的分离的抗体。在细胞粘附和/或侵入相关疾病，如肿瘤性疾病中，uPAR以提高的水平表达。抑制uPAR的生物活性可防止uPAR诱导的细胞粘附和侵入以及其它期望的作用。
本发明的另一个实施方案包括诊断疾病或状况的方法，其中利用根据这里所述制备的抗体检测患者样品中uPAR的水平。在一个实施方案中，患者样品是血液或血清。在另外的实施方案中，提出用于鉴定风险因素、疾病诊断和疾病分期的方法，其包括使用抗uPAR抗体鉴定uPAR的超表达。
本发明的另一个实施方案包括诊断与细胞中uPAR的表达有关的状况的方法，其通过将血清或细胞与本发明的定向结合剂或抗uPAR抗体接触，以及其后检测uPAR的存在来实现。优选的状况包括细胞粘附和/或侵入相关疾病，包括，但不限于，肿瘤性疾病，如黑色素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、成胶质细胞瘤，以及甲状腺、胃、前列腺、乳腺、卵巢、膀胱、肺、子宫、肾、结肠和胰、唾液腺和结肠直肠的癌。
在另一个实施方案中，本发明包括用于检测哺乳动物组织、细胞或者体液中的uPAR以筛选uPAR相关疾病的测定试剂盒。该试剂盒包括本发明的结合uPAR的定向结合剂或抗体以及如果存在的话，用于指示抗体与uPAR反应的工具。在一个实施方案中，抗体是单克隆抗体。在另一个实施方案中，标记结合uPAR的抗体。在另一个实施方案中，抗体是未标记的第一抗体，且试剂盒进一步包括用于检测第一抗体的工具。在一个实施方案中，用于检测的工具包括是抗免疫球蛋白的标记的第二抗体。抗体可用选自荧光染料、酶、放射性核素和不透射线材料的标记进行标记。
本发明的其它实施方案包括在与药学上可接受的载体或稀释剂的混合物中具有有效量的本发明的定向结合剂或抗uPAR抗体的药物组合物。在其它实施方案中，将本发明的定向结合剂或抗uPAR抗体，或其片段与治疗剂缀合。该治疗剂可以是，例如，毒素或放射性同位素。
另一个实施方案包括用于治疗患者中与uPAR的表达相关的疾病或状况的方法，其通过向患者施用有效量的本发明的定向结合剂或抗uPAR抗体来实现。本发明的定向结合剂或抗uPAR抗体可单独施用，或者可与另外的抗体或化疗药物或放射疗法联合施用。例如，可将阻断细胞粘附和/或侵入的uPAR抗体的单克隆、寡克隆或多克隆混合物与显示直接抑制肿瘤细胞增殖的药物联合施用。该方法可在体内进行并且患者优选地是人类患者。在优选的实施方案中，该方法涉及与细胞粘附和/或侵入相关疾病的治疗，包括，但不限于肿瘤性疾病，如黑色素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、成胶质细胞瘤、以及甲状腺、胃、前列腺、乳腺、卵巢、膀胱、肺、子宫、肾、结肠和胰、唾液腺和结肠直肠的癌。
在另一个实施方案中，本发明提供包括容器的制品。该容器包括含有本发明的定向结合剂或抗uPAR抗体的组合物，以及指示该组合物可用于治疗特征为超表达uPAR的细胞粘附和/或侵入相关疾病的包装插页或标签。
在一些实施方案中，向患者施用本发明的定向结合剂或抗uPAR抗体，随后施用澄清剂以除去血液中过量循环的抗体。
另一个实施方案是本发明的定向结合剂或抗uPAR抗体在制备用于治疗如细胞粘附和/或侵入相关疾病的疾病的药物中的用途。在一个实施方案中，细胞粘附和/或侵入相关疾病包括癌，如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、结肠直肠癌、食道癌、甲状腺癌、胰癌、前列腺癌和膀胱癌。在另一个实施方案中，细胞粘附和/或侵入相关疾病包括，但不限于，肿瘤性疾病，如黑色素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、肉瘤、头和颈癌、间皮瘤、胆(胆管癌)、小肠腺癌、儿科恶性肿瘤和表皮样癌。
另一个实施方案是本发明的定向结合剂或抗uPAR抗体在制备用于在动物中治疗恶性肿瘤的药物中的用途。
本发明的另一个实施方案是本发明的定向结合剂或抗uPAR抗体在制备用于治疗非肿瘤性疾病的药物中的用途。本发明的另一个实施方案是本发明的定向结合剂或抗uPAR抗体在制备用于治疗炎症，或者过度增殖性疾病，包括但不限于关节炎、动脉粥样硬化、变应性结膜炎的药物中的用途。
附图简述
图1是显示纤溶酶原激活抑制测定中15个抗uPAR单克隆抗体的抑制作用的线形图。用图说明了每个mAb的剂量反应关系曲线。通过垂直括弧指出显示最高效力和潜能的8个抗体。粗体图例表示显示最强抑制的抗体。将抑制的百分率(“％抑制”)表示为具有Log[mAb](μg/ml)单位的抗体浓度的函数。
图2是显示uPAR mAb抑制U937细胞与玻连蛋白粘附的能力的线形图。显示8个mAb，以及人和山羊同种型阴性对照和山羊抗uPAR阳性对照的剂量反应关系曲线。将抑制百分率(“％抑制”)表示为具有Log[mAb](ng/ml)单位的抗体浓度的函数。
图3显示uPAR mAb对HT-1080侵入通过MatrigelTM膜制剂的抑制作用。测试0.1μg/ml(上图)、1.0μg/ml(中图)和10μg/ml(下图)浓度的抗体。标绘出了与同种型对照相比，由于治疗侵入MatrigelTM内超过60微米(μm)的细胞数的比率。
图4是显示抗uPAR单克隆抗体与293T细胞表面上所表达的猴(食蟹猴)uPAR结合的条形图。标绘出了从直方图峰值位移(peakshift)的FACS分析中获得的GeoMean值。
图5是显示抗uPAR mAb对肿瘤细胞侵入作用的条形图。对于所示的从0.1到100ng/ml范围浓度的每个抗体，显示了HT-1080细胞侵入通过MatrigelTM超过80微米(μM)的百分率。
图6显示通过蛋白质印迹的抗人uPAR mAb的表位结合分析的结果。在HEK293T细胞中表达人-鼠uPAR嵌合体(His-标记的)并且使用所示的抗人uPAR mAb检测uPAR表达。泳道1——鼠DI/DIII-人DII；泳道2——鼠DI/DII-人DIII；泳道3——鼠DI-人DII/DIII；泳道4——人DI/DII-鼠DIII；泳道5-人uPAR。
图7是显示抗uPAR mAb对MDA-MB231-GFP同位异种移植的实体瘤生长的作用的线形图。显示每个所检验的抗体以及IgG4同种型和阿霉素对照在移植后时间点(植入后周数)的平均肿瘤体积(cm3)。未处理的对照肿瘤生长(没有显示)与IgG4同种型对照没有显著性的差异。
图8A-F是显示在MDA-MB231-GFP同位异种移植的原发性肿瘤中所测量的抗uPAR单克隆抗体对肿瘤生物标记表达的活性的条形图。数据代表从每个处理组的6个动物的肿瘤中所测量的染色强度(密度)的平均值+/-标准差；ki-67(图8a)、CD31(图8b)、MAPK(图8c)、pMAPK(图8d)、FAK(图8e)、pFAK(图8f)，包括未处理的，阿霉素和IgG4对照。
图9A-B是代表在具有MDA-MB231-GFP同位异种移植的小鼠中，抗uPAR mAb抑制转移的活性的条形图。数据代表在所示的每个处理组的6个动物的肺(图9A)或肝(图9B)的组织切片中10个视野中的肿瘤病灶的平均值+/-标准差。
详述
本发明的实施方案涉及结合尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)的定向结合剂。在一些实施方案中，该结合剂结合uPAR并抑制尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)与其受体uPAR的结合。在一个实施方案中，定向结合剂是单克隆抗体，或其结合片段。
本发明的其它实施方案包括全人抗uPAR抗体，以及在治疗上有用的抗体制剂。在一个实施方案中，本发明的抗uPAR抗体制剂具有期望的治疗特性，包括对uPAR的强结合亲和力，体外抑制纤溶酶原激活的能力，以及在体外和体内抑制uPAR诱导的细胞粘附和侵入的能力。
本发明的实施方案也包括分离的抗uPAR抗体的结合片段。在一个实施方案中，结合片段来自全人抗uPAR抗体。示范性的片段包括如在下面更详细描述的Fv、Fab’、Dab或其它公知的抗体片段。本发明的实施方案也包括表达抗uPAR的全人抗体的细胞。细胞的实例包括产生抗uPAR抗体的杂交瘤，或重组产生的细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，CHO细胞的变体(例如，DG44)和NS0细胞。可在Andersen和Reilly(2004)Current Opinion in Biotechnology 15，456-462中发现关于CHO细胞变体的另外信息，其在此以其整体引入作为参考。
另外，本发明的实施方案包括使用这些抗体用于治疗疾病的方法。本发明的抗uPAR抗体用于预防uPAR介导的纤溶酶原激活，因此抑制细胞粘附和/或侵入。尽管不限于任何特定的理论，但是该抑制的作用机理可包括抑制uPA结合其受体，uPAR。本发明的抗uPAR抗体也可以抑制uPAR/uPA局限性uPA酶促活性，因此减少uPAR的有效浓度。本发明的抗uPAR抗体可以抑制细胞与玻连蛋白的uPAR依赖的粘附并且也可以破坏整联蛋白介导的细胞粘附的uPAR修饰。本发明的抗uPAR抗体可以由于抑制uPA结合uPAR或者破坏uPAR与整联蛋白和生长因子受体的相互作用，也修饰细胞内信号传导。可通过该抑制机理治疗的疾病包括，但不限于，肿瘤性疾病，如黑色素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、成胶质细胞瘤、以及甲状腺、胃、前列腺、乳腺、卵巢、膀胱、肺、子宫、肾、结肠和胰、唾液腺和结肠直肠的癌症和肿瘤。
本发明的其它实施方案包括用于特异性确定生物样品中uPAR的量的诊断测定。该测定试剂盒可包括本发明的抗uPAR抗体，连同检测这种抗体的必要标记。这些诊断测定可用于筛选细胞粘附和侵入相关疾病，包括，但不限于肿瘤性疾病，如黑色素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、成胶质细胞瘤、以及甲状腺、胃、前列腺、乳腺、卵巢、膀胱、肺、子宫、肾、结肠和胰、唾液腺和结肠直肠的癌。
本发明的另一个方面是uPAR的生物活性的拮抗剂，其中该拮抗剂结合uPAR。在一个实施方案中，该拮抗剂是定向结合剂，如抗体。该拮抗剂可结合：
i)uPAR；或
ii)uPA/uPAR复合物，
或者这些的组合。在一个实施方案中，拮抗剂能在体外和体内拮抗uPAR的生物活性。拮抗剂可选自这里所述的抗体，例如全人单克隆抗体2.19.2(ATCC编号PTA-7474)、2.6.1(ATCC编号PTA-7475)和4.18.1(ATCC编号PTA-7476)。
在一个实施方案中，uPAR的生物活性的拮抗剂可结合uPAR并且因此防止uPAR介导的纤溶酶原激活，因此抑制细胞粘附和/或侵入。该抑制的作用机理可包括拮抗剂结合uPAR以及抑制uPA与其受体uPAR的结合。不希望被任何特定的理论考虑所束缚，可达到拮抗uPAR的生物活性的机制包括，但不限于，抑制uPA结合受体uPAR，或者抑制uPAR/uPA局限性uPA酶促活性。
一个实施方案是与全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1或4.18.1结合一个或多个相同表位的定向结合剂。
一个实施方案是与全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1或4.18.1结合一个或多个相同表位的抗体。
在一个实施方案中，定向结合剂以低于1纳摩尔(nM)的Kd结合uPAR。定向结合剂可以以低于500皮摩尔(pM)的Kd结合。定向结合剂可以以低于400皮摩尔(pM)的Kd结合。定向结合剂可以以低于300皮摩尔(pM)的Kd结合。在另一个实施方案中，定向结合剂以低于200pM的Kd结合。
一个实施方案是产生上文所述定向结合剂的杂交瘤。在一个实施方案中是产生上文所述抗体的轻链和/或重链的杂交瘤。在一个实施方案中，杂交瘤产生全人单克隆抗体的轻链和/或重链。在另一个实施方案中，杂交瘤产生全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1或4.18.1的轻链和/或重链。可选择地，杂交瘤可产生与全人单克隆抗体2.19.2、2.6.1或4.18.1结合一个或多个相同表位的抗体。
另一个实施方案是编码上文所述定向结合剂的核酸分子。在一个实施方案中是编码上文所述抗体的轻链或重链的核酸分子。在一个实施方案中核酸分子编码全人单克隆抗体的轻链或重链。另一个实施方案是编码选自抗体2.19.2、2.6.1或4.18.1的全人单克隆抗体的轻链或重链的核酸分子。
本发明的另一个实施方案是包括上文所述的一个或多个核酸分子的载体，其中该载体编码上文所述的定向结合剂。在本发明的一个实施方案中是包括上文所述的一个或多个核酸分子的载体，其中该载体编码上文所述抗体的轻链和/或重链。
本发明的另一个实施方案是包括上文所述载体的宿主细胞。可选择地，该宿主细胞可包括一个以上载体。
另外，本发明的一个实施方案是生产本发明的定向结合剂的方法，其通过在其中表达核酸分子以产生定向结合剂的条件下培养宿主细胞，随后回收定向结合剂来实现。在本发明的一个实施方案中是生产本发明的抗体的方法，其通过在其中表达核酸分子以产生抗体的条件下培养宿主细胞，随后回收抗体来实现。
在一个实施方案中，本发明包括制备定向结合剂的方法，其通过用至少一种编码上文所述定向结合剂的核酸分子转染至少一种宿主细胞，在宿主细胞中表达该核酸分子以及分离该定向结合剂来实现。在一个实施方案中，本发明包括制备抗体的方法，其通过用至少一种编码上文所述抗体的核酸分子转染至少一种宿主细胞，在宿主细胞中表达该核酸分子以及分离抗体来实现。
根据另一个方面，本发明包括通过施用本文所述的拮抗剂，拮抗uPAR生物活性的方法。该方法可包括选择需要治疗疾病相关的细胞粘附和/或侵入的动物，以及向动物施用治疗有效剂量的uPAR生物活性的拮抗剂。
本发明的另一个方面包括通过施用上文所述的定向结合剂，拮抗uPAR的生物活性的方法。该方法可包括选择需要治疗疾病相关的细胞粘附和/或侵入的动物，以及向动物施用治疗有效剂量的拮抗uPAR生物活性的定向结合剂。
本发明的另一个方面包括通过施用上文所述的抗体拮抗uPAR生物活性的方法。该方法可包括选择需要治疗疾病相关的细胞粘附和/或侵入的动物，以及向动物施用治疗有效剂量的拮抗uPAR生物活性的抗体。
根据另一个方面，提供通过施用治疗有效量的uPAR生物活性的拮抗剂，在哺乳动物中治疗疾病相关的细胞粘附和/或侵入的方法。该方法可包括选择需要治疗疾病相关的细胞粘附和/或侵入的动物，以及向动物施用治疗有效剂量的uPAR生物活性的拮抗剂。
根据另一个方面，提供通过施用治疗有效量的拮抗uPAR生物活性的定向结合剂，在哺乳动物中治疗疾病相关的细胞粘附和/或侵入的方法。该方法可包括选择需要治疗疾病相关的细胞粘附和/或侵入的动物，以及向动物施用治疗有效剂量的拮抗uPAR生物活性的定向结合剂。该定向结合剂可单独施用，或者可与另外的抗体或化疗药物或放射疗法联合施用。
根据另一个方面，提供通过施用治疗有效量的拮抗uPAR生物活性的抗体，在哺乳动物中治疗疾病相关的细胞粘附和/或侵入的方法。该方法可包括选择需要治疗疾病相关的细胞粘附和/或侵入的动物，以及向动物施用治疗有效剂量的拮抗uPAR生物活性的抗体。该抗体可单独施用，或者可与另外的抗体或化疗药物或放射疗法联合施用。
根据另一个方面，提供通过施用治疗有效量的uPAR生物活性的拮抗剂，在哺乳动物中治疗癌症的方法。该方法可包括选择需要治疗癌症的动物，以及向动物施用治疗有效剂量的拮抗uPAR生物活性的拮抗剂。该拮抗剂可单独施用，或者可与另外的抗体或化疗药物或放射疗法联合施用。
根据另一个方面，提供通过施用治疗有效量的拮抗uPAR生物活性的定向结合剂，在哺乳动物中治疗癌症的方法。该方法可包括选择需要治疗癌症的动物，以及向动物施用治疗有效剂量的拮抗uPAR生物活性的定向结合剂。该定向结合剂可单独施用，或者可与另外的抗体或化疗药物或放射疗法联合施用。
根据另一个方面，提供通过施用治疗有效量的拮抗uPAR生物活性的抗体，在哺乳动物中治疗癌症的方法。该方法可包括选择需要治疗癌症的动物，以及向动物施用治疗有效剂量的拮抗uPAR生物活性的抗体。该抗体可单独施用，或者可与另外的抗体或化疗药物或放射疗法联合施用。
根据本发明的另一个方面，提供uPAR的生物活性的拮抗剂用于生产治疗疾病相关的细胞粘附和/或侵入的药物的用途。
根据本发明的另一个方面，提供拮抗uPAR生物活性的定向结合剂用于生产治疗疾病相关的细胞粘附和/或侵入的药物的用途。
根据本发明的另一个方面，提供拮抗uPAR生物活性的抗体用于生产治疗疾病相关的细胞粘附和/或侵入的药物的用途。
在一个实施方案中，本发明特别适用于在患有单独或部分依赖于uPAR受体的肿瘤的患者中拮抗uPAR。
本发明的另一个实施方案包括用于在哺乳动物组织、细胞或体液中检测uPAR以筛选细胞粘附和侵入相关疾病的测定试剂盒。该试剂盒包括结合uPAR的定向结合剂和如果存在的话，用于指示定向结合剂与uPAR反应的工具。在一个实施方案中，标记结合uPAR的定向结合剂。在另一个实施方案中，定向结合剂是未标记的并且试剂盒进一步包括用于检测定向结合剂的工具。优选地定向结合剂用选自荧光染料、酶、放射性核素和不透射线材料的标记进行标记。
本发明的另一个实施方案包括用于在哺乳动物组织、细胞或体液中检测uPAR以筛选细胞粘附和侵入相关疾病的测定试剂盒。该试剂盒包括结合uPAR的抗体和如果存在的话，用于指示抗体与uPAR反应的工具。该抗体可以是单克隆抗体。在一个实施方案中，标记结合uPAR的抗体。在另一个实施方案中，抗体是未标记的并且试剂盒进一步包括用于检测第一抗体的工具。在一个实施方案中，该工具包括是抗免疫球蛋白的标记的第二抗体。优选地抗体用选自荧光染料、酶、放射性核素和不透射线材料的标记进行标记。
下面另外详细提供关于抗uPAR抗体的另外的实施方案、特征等。
序列表
本发明的实施方案包括下面表1中所列的特异性的抗uPAR抗体。该表报告了每个抗uPAR抗体的鉴定号，连同相应的重链和轻链基因的可变结构域的SEQ ID编号。已经给了每个抗体的鉴定号，其包括用两个小数点隔开的三个数字。
                        表1
Figure G2007800215957D00221
Figure G2007800215957D00231
Figure G2007800215957D00241
定义
除非有其它定义，这里所使用的科学和技术术语应当具有本领域那些普通技术人员通常所理解的含义。此外，除非是由于上下文的其它需要，单数术语应当包括复数，且复数术语应当包括单数。通常，所用的与这里所述的细胞和组织培养、分子生物学、和蛋白质、以及寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交有关的命名法及其技术是本领域公知和常用的。
使用重组DNA、寡核苷酸合成、以及组织培养和转化的标准技术(例如，电穿孔、脂转染)。根据生产商的说明书或者如本领域通常实现的或者如这里所述进行酶促反应和纯化技术。根据本领域公知的常规方法和如在整个本发明的说明书中所引用和讨论的各种一般和更具体的参考资料中所述进行前述技术和程序。见，例如，Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第三版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001))，其在此引入作为参考。所用的与这里所述的分析化学、合成有机化学和医学和药学化学有关的命名法，以及其实验室程序和技术是本领域公知和常用的。使用化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者治疗的标准技术。
如根据本发明公开内容所使用的，下列术语，除非有其它说明，应当理解为具有下列含义：
拮抗剂可以是多肽、核酸、碳水化合物、脂质、小分子量化合物、寡核苷酸、寡肽、RNA干扰(RNAi)、反义、重组蛋白、抗体或其片段或者其缀合物或融合蛋白。对于RNAi的综述见Milhavet O，Gary DS，Mattson MP.(Pharmacol Rev.2003 Dec；55(4)：629-48.Review.)，且反义见Opalinska JB，Gewirtz AM.(Sci STKE.2003 Oct28；2003(206)：pe47.)。
疾病相关的细胞粘附和/或侵入可以是任何异常的、不期望的或病理性细胞粘附和/或侵入，例如肿瘤相关的细胞粘附和/或侵入。细胞粘附和/或侵入相关的疾病包括，但不限于，非实体肿瘤，如白血病、多发性骨髓瘤或淋巴瘤，以及实体肿瘤，如黑色素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、成胶质细胞瘤、甲状腺、胆管、骨、胃、脑/CNS、头和颈、肝系统、胃、前列腺、乳腺、肾、睾丸、卵巢、皮肤、子宫颈、肺、肌肉、神经元、食道、膀胱、肺、子宫、女阴、子宫内膜、肾、结肠直肠、胰、胸膜/腹膜、唾液腺和表皮(epidermous)的癌。
化合物指任何分子量小于约2000道尔顿的小分子量化合物。
术语“uPAR”指尿激酶型纤溶酶原激活物受体分子。
当指定向结合剂如抗体时，术语“中和”涉及抗体消除，或者显著减少靶抗原活性的能力。因此，本发明的“中和”抗uPAR抗体能消除或显著减少uPAR的活性。中和uPAR抗体可以，例如，通过阻断uPA与其受体uPAR的结合起作用。通过阻断该结合，显著地或完全消除uPA介导的纤溶酶原激活。理想地，抗uPAR的中和抗体抑制细胞粘附和/或侵入。
这里使用术语“多肽”作为通称指天然的蛋白质、片段或多肽序列的类似物。因此，天然蛋白质、片段和类似物是多肽属的种。根据本发明，优选的多肽包括人重链免疫球蛋白分子和人κ轻链免疫球蛋白分子，以及由包括具有轻链免疫球蛋白分子，如κ或λ轻链免疫球蛋白分子的重链免疫球蛋白分子，以及反过来的组合所形成的抗体分子，以及其片段和类似物。根据本发明，优选的多肽也可单独地包括人重链免疫球蛋白分子或其片段。
如这里所使用的，当应用于物体时，术语“天然存在的”指物体可在自然界中发现的事实。例如，在可从自然界的来源中分离的生物(包括病毒)中存在的，并且没有在实验室或其它地方中被人类有意修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
如这里所使用的，术语“可操作地连接的”指所描述的组分的位置，其处于允许它们以它们预期的方式发挥作用的关系。例如，将控制序列与编码序列以这样的一种方式“可操作地连接”，从而使得在与控制序列相容的条件下完成编码序列的表达。
这里所提到的术语“多核苷酸”意思是至少10个碱基长的核苷酸，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，或者任一型核苷酸的修饰形式，或者RNA-DNA异源双链体的聚合形式。该术语包括DNA的单链和双链形式。
这里所提到的术语“寡核苷酸”包括通过天然存在的和非天然存在的键连接在一起的天然存在的，以及修饰的核苷酸。寡核苷酸是通常包括长度为200个碱基或更短的多核苷酸亚群。优选地，寡核苷酸长10-60个碱基并且最优选地长12、13、14、15、16、17、18、19或20-40个碱基。寡核苷酸通常是单链，例如用作探针；尽管寡核苷酸可以是双链，例如，用于构建基因突变体。寡核苷酸可以是有义的或反义寡核苷酸。
这里所提到的术语“天然存在的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。这里所提到的术语“修饰的核苷酸”包括具有修饰的或取代的糖基等的核苷酸。这里所提到的术语“寡核苷酸键”包括寡核苷酸键如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phosphoraniladate、氨基磷酸酯等。见例如，LaPlanche等Nucl.AcidsRes.14：9081(1986)；Stec等J.Am.Chem.Soc.106：6077(1984)；Stein等Nucl.Acids Res.16：3209(1988)；Zon等Anti-Cancer Drug Design6：539(1991)；Zon等Oligonucleotides and Analogues：A PracticalApproach，pp.87-108(F.Eckstein编辑，Oxford University Press，OxfordEngland(1991))；Stec等美国专利No.5,151,510；Uhlmann和PeymanChemical Reviews 90：543(1990)，这些文献的公开内容在此引入作为参考。寡核苷酸可包括用于检测的标记，如果期望的话。
如果两个氨基酸序列之间有部分或完全的同一性，那么它们是“同源的”。例如，85％同源性意思是当将两个序列进行比对用于最大匹配时，85％的氨基酸是相同的。在进行最大化匹配中允许有缺口(在进行匹配的两个序列之一中)；优选5或更小的缺口长度，更优选2或者更小。可选择地和优选地，如该术语在这里所使用的，如果使用具有突变数据矩阵和缺口罚分为6或更高的程序ALIGN，两个蛋白质序列(或者从它们衍生的至少长约30个氨基酸的多肽序列)具有5以上(在标准差单位中)的比对得分，那么它们是同源的。见Dayhoff，M.O.，在Atlas of Protein Sequence and Structure，pp.101-110(Volume5，National Biomedical Research Foundation(1972))和该卷的增刊2，pp.1-10。如果当使用ALIGN程序进行最佳比对时，两个序列或其部分的氨基酸序列大于或等于50％相同，那么它们更优选地是同源的。应当意识到，在两个直系同源序列内可以有不同的同源性区域。例如，小鼠和人直系同源物(orthologue)的功能位点可具有比非功能区域更高程度的同源性。
这里使用术语“相应于”意思是多核苷酸序列与参考多核苷酸序列的全部或部分同源(即，是相同的，并非严格地在进化上相关)，或者多肽序列与参考多肽序列相同。
相对照的，这里使用术语“互补的”意思是互补序列与参考多核苷酸序列的全部或部分同源。例如，核苷酸序列“TATAC”与参考序列“TATAC”对应并且与参考序列“GTATA”互补。
术语“序列同一性”意思是在比较窗上两个多核苷酸或氨基酸序列是相同的(即，在核苷酸对核苷酸或残基对残基基础上)。通过下述计算术语“序列同一性百分率”，通过在比较窗上比较两个最佳比对序列，确定两个序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、U或I)或氨基酸残基的位置数以产生匹配的位置数，用匹配的位置数除以比较窗中的总的位置数(即，窗的大小)，并且将结果乘以100以产生序列同一性的百分率。如这里所使用的术语“相当大同一性”表示多核苷酸或氨基酸序列的特征，其中在至少18个核苷酸(6个氨基酸)位置的比较窗上，经常在至少24-48个核苷酸(8-16个氨基酸)位置的窗上与参考序列相比，多核苷酸或氨基酸包括具有至少85％序列同一性，优选地至少90-95％序列同一性，更优选地至少99％序列同一性的序列，其中通过在比较窗上将参考序列与可包括参考序列的总计20％或更低的缺失或添加的序列进行比较，计算序列同一性的百分率。参考序列可以是更大序列的亚群。
如这里所使用的，20个常规氨基酸和它们的缩写遵循常规用法。见Immunology-A Synthesis(第二版，E.S.Golub和D.R.Gren编辑，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))，其在此引入作为参考。20个常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸如α-，α-双取代的氨基酸，N-烷基氨基酸，乳酸，以及其它非常规氨基酸也可以是本发明多肽的适当组分。非常规氨基酸的实例包括：4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸，以及其它相似氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟脯氨酸)。在这里所使用的多肽符号中，根据标准用法和常规，左手方向是氨基末端方向，且右手方向是羧基末端方向。
类似地，除非有其它说明，单链多核苷酸序列的左手末端是5’末端；将双链多核苷酸序列的左手方向称作5’方向。将新生的RNA转录产物的5’至3’添加的方向称作转录方向；将DNA链上具有与RNA相同序列并且在RNA转录物的5’末端的5’的序列区称作“上游序列”；将DNA链上具有与RNA相同序列并且在RNA转录物的3’末端的3’的序列区称作“下游序列”。
如应用到多肽，术语“相当大同一性”意思是当进行最佳比对，如通过使用默认的缺口权重的程序GAP或BESTFIT时，两个多肽序列共有至少80％序列同一性，优选地至少90％序列同一性，更优选地至少95％序列同一性，以及最优选地至少99％序列同一性。优选地，不相同的残基位置由于保守的氨基酸取代而不同。保守氨基酸取代指具有相似侧链的残基的可交换性。例如，具有脂族侧链的氨基酸组是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂族羟基侧链的氨基酸组是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组是天冬酰胺和谷胺酰胺；具有芳族侧链的氨基酸组是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；且具有含硫侧链的氨基酸组是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
如这里所讨论的，倘若氨基酸序列中的变异维持在与这里所述的抗体或免疫球蛋白分子有至少75％，更优选地至少80％、90％、95％，以及最优选地99％序列同一性，那么预期本发明包含抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列中的较小变异。具体地，预期保守的氨基酸取代。保守取代是在具有相关侧链的氨基酸家族内发生的那些。通常地，将遗传编码的氨基酸分成几个家族：(1)酸性＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性＝赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；以及(4)不带电荷的极性＝甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。更优选的家族是：丝氨酸和苏氨酸是脂族羟基家族；天冬酰胺和谷胺酰胺是含酰胺的家族；丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸是脂族家族；且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸是芳族家族。例如，有理由期望用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，用丝氨酸取代苏氨酸的孤立的取代，或者用结构上相关氨基酸对氨基酸的相似取代将对所得分子的结合功能或特性没有较大作用，尤其是如果取代不包括构架位点内的氨基酸。可通过测定多肽衍生物的比活性，容易地确定氨基酸改变是否导致功能性肽。这里详细描述了测定。本领域的那些普通技术人员可容易地制备抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物。片段或类似物的优选的氨基和羧基末端接近功能域的边界。可通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共的或专有的序列数据库进行比较，鉴定结构域和功能域。优选地，使用计算机化的比较方法鉴定在其它已知结构和/或功能的蛋白质中存在的序列基序或预测的蛋白质构象域。鉴定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的。Bowie等Science 253：164(1991)。因此，前述实施例证明本领域的那些技术人员可认出可用于定义与这里所述的抗体一致的结构域和功能域的序列基序和结构构象。
优选的氨基酸取代是那些：(1)减少对蛋白酶解的易感性，(2)减少对氧化的易感性，(3)改变形成蛋白复合体的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，以及(4)赋予或修饰这种类似物的其它物理化学或功能性特征。类似物可包括除天然存在的肽序列之外的序列的各种突变蛋白。例如，可在天然存在的序列(优选地在形成分子间接触的结构域外的多肽部分中)中进行单个或多个氨基酸取代(优选地保守氨基酸取代)。保守氨基酸取代应当基本上不改变亲本序列的结构特性(例如，取代氨基酸不应当倾向于断裂亲本序列中存在的螺旋，或者破坏表征亲本序列的其它类型的二级结构)。在Proteins，Structuresand Molecular Principles(Creighton，编辑，W.H.Freeman andCompany，New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden和J.Tooze，编辑，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))；以及Thornton等Nature 354：105(1991)中描述了本领域公认的多肽二级和三级结构的实例，每一个在此引入作为参考。
如这里所使用的，术语“多肽片段”指具有氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽，但其中剩余的氨基酸序列与从例如，全长cDNA序列中所推断的天然存在的序列中的相应位置相同。片段一般是至少5、6、8或10个氨基酸长，优选地至少14个氨基酸长，更优选地至少20个氨基酸长，通常至少50个氨基酸长，甚至更优选地至少70个氨基酸长。如这里所使用的，术语“类似物”指包含与所推导的氨基酸序列的部分具有相当大同一性的至少25个氨基酸的片段并且其具有下列特性中的至少一种的多肽：(1)在适当的结合条件下与uPAR特异性结合，(2)能阻断适当的uPA/uPAR结合或者(3)能抑制uPA活性。一般地，多肽类似物包括关于天然存在的序列的保守氨基酸取代(或者添加或缺失)。类似物一般地是至少20个氨基酸长，优选地至少50个氨基酸长或者更长，并且常常可与全长天然存在的多肽一样长。
肽类似物常在制药工业中用作具有与模板肽类似特性的非肽药物。将这些类型的非肽化合物称作“拟肽(peptide mimetics)”或“肽模拟物(peptidomimetics)”。Fauchere，J.Adv.Drug Res.15：29(1986)；Veber和Freidinger TINS p.392(1985)；以及Evans等J.Med.Chem.30:1229(1987)，这些在此引入作为参考。常常借助于计算机化的分子建模开发这种化合物。在结构上与治疗上有用的肽相似的拟肽可用于产生等同的治疗或预防效果。一般地，肽模拟物在结构上与范例多肽(即，具有生物化学特性或药理学活性的多肽)如人抗体相似，但是具有任选地通过本领域公知的方法被选自--CH2NH--、--CH2S--、--CH2-CH2--、--CH＝CH--(顺式和反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--和-CH2SO--的键取代的一个或多个肽键。共有序列的一个或多个氨基酸被相同类型的D-氨基酸(例如，D-赖氨酸代替L-赖氨酸)的系统取代可用于产生更多个稳定的肽。另外，可通过本领域的已知方法(Rizo和Gierasch Ann.Rev.Biochem.61：387(1992)，在此引入作为参考)产生包括共有序列或基本上相同的共有序列变异的约束肽(constrainedpeptides)；例如，通过添加使肽环化的能形成分子内二硫键的内部半胱氨酸残基。
如这里所使用的，术语“抗体”指包含至少一个结合域的多肽或多肽组，其中结合域由具有与抗原的抗原决定簇的特征互补的内表面形状和电荷分布的三维结合空间的多肽链折叠形成。抗体一般具有四聚体形式，包括两个相同的多肽链对，每对具有一个“轻”链和一个“重”链。每个轻/重链对的可变区形成抗体结合部位。
如这里所使用的，定向结合剂、定向结合蛋白、特异性结合蛋白等术语指优先结合靶位点的抗体，或其结合片段。在一个实施方案中，定向结合剂仅对一个靶位点特异。在其它实施方案中，定向结合剂对一个以上的靶位点特异。在一个实施方案中，定向结合剂可以是单克隆抗体并且该靶位点可以是表位。
通过重组DNA技术，或者通过完整抗体的酶促或化学切割产生抗体的“结合片段”。结合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Dab和单链抗体。除“双特异”或“双功能”抗体之外的抗体应当被理解为其结合位点中的每一个都相同。当过量的抗体将与反受体结合的受体的量减少至少约20％、40％、60％或80％，以及更通常地高于约85％(如在体外竞争性结合测定中所测量的)时，抗体相当大地抑制受体与反受体的粘附。
抗体可以是寡克隆、多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR-嫁接的抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、催化性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、抗独特型抗体和可以以可溶型或结合型标记的抗体，以及它们的片段、变体或衍生物，单独地或与已知技术所提供的其它氨基酸序列组合。抗体可来自任何物种。术语抗体也包括本发明抗体的结合片段；示范性的片段包括Fv、Fab、Fab’、单链抗体(svFC)、二聚可变区(双抗体)和二硫键稳定的可变区(dsFv)。
术语“表位”包括任何能特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的蛋白决定簇。表位决定簇通常由分子的化学上有活性的表面定组(grouping)如氨基酸或糖侧链组成，并且可以，但不总是具有特定三维结构特征，以及特定电荷特征。当解离常数≤1μM，优选地≤100nM，且最优选地≤10nM时，认为抗体特异性结合抗原。
术语“试剂”在这里用于表示化合物、化合物的混合物、生物大分子，或者由生物材料制成的提取物。
关于uPAR多肽的“有活性的”或“活性”指具有天然uPAR多肽的生物学或免疫学活性的uPAR多肽的部分。这里所使用的“生物学”指由天然uPAR多肽的活性所产生的生物学功能。优选的uPAR生物学活性包括，例如，uPAR诱导的细胞粘附和侵入。
这里所使用的“哺乳动物”指任何被认为是哺乳动物的动物。优选的，哺乳动物是人。
抗体用木瓜蛋白酶的消化导致两个相同的抗原结合片段，也称作“Fab”片段，以及没有抗原结合活性但具有结晶能力的“Fc”片段。抗体用胃蛋白酶的消化导致F(ab’)2片段，其中抗体分子的两个臂仍然相连并且包括两个抗原结合部位。该F(ab’)2片段具有交联抗原的能力。
这里所使用的“Fv”指保持抗原识别和抗原结合部位的抗体的最小片段。
这里所使用的“Fab”指包括轻链的恒定域和重链的CH1域的抗体片段。
这里所使用的“Dab”指是人抗体的最小功能性结合单位的抗体片段。
术语“mAb”指单克隆抗体。
这里所使用的“脂质体”指可用于向哺乳动物递送药物的小泡，其中药物可包括本发明的uPAR多肽或抗这种uPAR多肽的抗体。
如这里所使用的，“标记”或“标记的”指向多肽添加可检测的部分，例如，放射性标记、荧光标记、酶促标记化学发光标记或生物素化基团。放射性同位素或放射性核素可包括3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I，荧光标记可包括罗丹明、镧系磷光体(lanthanidephosphor)或FITC，且酶促标记可包括辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶。
如这里所使用的，术语“药物试剂或药物”指当向患者正确施用时，能诱导期望治疗效应的化合物或组合物。根据本领域的常规用法，这里使用其它化学术语，如由The McGraw-Hill Dictionary ofChemical Terms(Parker，S.，编辑，McGraw-Hill，San Francisco(1985))所举例说明的，(在此引入作为参考)。
如这里所使用的，“基本上纯”意思是目标种类是存在的主要种类(即，在摩尔基础上，其在组合物中比任何其它个别种类更丰富)，并且优选地基本上纯化的级分是组合物，其中目标种类包括存在的所有大分子种类的至少约50％(在摩尔基础上)。一般地，基本上纯的组合物将包括组合物中存在的所有大分子种类的约80％以上，更优选地约85％、90％、95％和99％以上。更优选，目标种类纯化至基本上同质(通过常规检测方法在组合物中不能检测到污染物种类)，其中该组合物基本上由单一大分子种类组成。
术语“患者”包括人类和兽医学的受试者。
人抗体和抗体的人源化
人抗体避免了一些与具有鼠或大鼠可变区和/或恒定区的抗体有关的问题。这种鼠或大鼠来源的蛋白质的存在可导致抗体的迅速清除或者可导致患者产生针对抗体的免疫反应。为了避免利用鼠或大鼠来源的抗体，可产生全人抗体，其通过将功能性人抗体基因座引入啮齿类动物、其它哺乳动物或动物中，从而使得啮齿类动物、其它哺乳动物或动物生产全人抗体来实现。
产生全人抗体的一个方法是通过使用
Figure G2007800215957D00331
系小鼠，其已经被工程改造以含有最高达但小于1000kb大小的人重链基因座和K轻链基因座的种系构型的(configured)片段。见Mendez等NatureGenetics 15：146-156(1997)以及Green和Jakobovits J.Exp.Med.188：483-495(1998)。
Figure G2007800215957D00341
系可从Abgenix，Inc.(Fremont，CA)获得。
在1990年1月12日申请的美国专利申请序号07/466,008、1990年11月8日申请的07/610,515、1992年7月24日申请的07/919,297、1992年7月30日申请的07/922,649、1993年3月15日申请的08/031,801、1993年8月27日申请的08/112,848、1994年4月28日申请的08/234,145、1995年1月20日申请的08/376,279、1995年4月27日申请的08/430,938、1995年6月5日申请的08/464,584、1995年6月5日申请的08/464,582、1995年6月5日申请的08/463,191、1995年6月5日申请的08/462,837、1995年6月5日申请的08/486,853、1995年6月5日申请的08/486,857、1995年6月5日申请的08/486,859、1995年6月5日申请的08/462,513、1996年10月2日申请的08/724,752、1996年12月3日申请的08/759,620、2001年11月30日申请的美国公开2003/0093820以及美国专利Nos.6,162,963、6,150,584、6,114,598、6,075,181和5,939,598以及日本专利Nos.3 068 180 B2、3 068 506 B2和3 068 507 B2进一步讨论和描绘了小鼠
Figure G2007800215957D00342
系的生产。也见1996年6月12日授权公开的欧洲专利No.，EP 0 463 151 B1、1994年2月3日公开的国际专利申请No.，WO 94/02602、1996年10月31日公开的国际专利申请No.，WO 96/34096、1998年6月11日公开的WO98/24893、2000年12月21日公开的WO 00/76310。上面所引用的专利、申请和参考文献中的每一篇所公开的内容在此以其整体引入作为参考。
在可选择的方法中，其它人，包括GenPharm International，Inc.，已利用了“小基因座(minilocus)”方法。在小基因座方法中，通过Ig基因座片段(个别基因)的包含模拟外源Ig基因座。因此，将一个或多个VH基因，一个或多个DH基因，一个或多个JH基因，μ恒定区，以及通常地第二个恒定区(优选地γ恒定区)形成用于插入到动物内的构建体。该方法描述于授予Surani等的美国专利No.5,545,807以及授予Lonberg和Kay的美国专利Nos.5,545,806、5,625,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,877,397、5,874,299和6,255,458，授予Krimpenfort和Berns的美国专利No.5,591,669和6,023,010，授予Berns等的美国专利Nos.5,612,205、5,721,367和5,789,215，和授予Choi和Dunn的美国专利No.5,643,763，以及GenPharm International的于1990年8月29日申请的美国专利申请系列号Nos.07/574,748、1990年8月31日申请的07/575,962、1991年12月17日申请的07/810,279、1992年3月18日申请的07/853,408、1992年6月23日申请的07/904,068、1992年12月16日申请的07/990,860、1993年4月26日申请的08/053,131、1993年7月22日申请的08/096,762、1993年11月18日申请的08/155,301、1993年12月3日申请的08/161,739、1993年12月10日申请的08/165,699、1994年3月9日申请的08/209,741中，在此将这些文献的公开内容引入作为参考。也见欧洲专利No.0 546 073 B1、国际专利申请Nos.WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO97/13852和WO 98/24884以及美国专利No.5,981,175，在此将这些文献的公开内容以其整体引入作为参考。此外见Taylor等，1992、Chen等，1993、Tuaillon等，1993、Choi等，1993、Lonberg等，(1994)、Taylor等，(1994)，以及Tuaillon等，(1995)、Fishwild等，(1996)，在此将这些文献的公开内容以其整体引入作为参考。
Kirin也已经证明了从已通过微细胞融合引入大段的染色体，或者全部染色体的小鼠中产生人抗体。见欧洲专利申请Nos.773288和843 961，这些文献的公开内容在此引入作为参考。另外，已经产生了KMTM-小鼠，其是Kirin的Tc小鼠与Medarex的小基因座(Humab)小鼠的杂交繁育的结果。这些小鼠具有Kirin小鼠的人IgH转染色体(transchromosome)和Genpharm小鼠的κ链转基因(Ishida等，Cloning Stem Cells，(2002)4：91-102)。
人抗体也可通过体外方法获得。适当的实例包括但不限于噬菌体展示(CAT、Morphosys、Dyax、Biosite/Medarex、Xoma、Symphogen、Alexion(以前是Proliferon)、Affimed)、核糖体展示(CAT)、酵母展示，等等。
抗体的制备
通过利用如下面所描述的
Figure G2007800215957D00361
技术制备如这里所述的抗体。这种小鼠，接着，能生产人免疫球蛋白分子和抗体并且在鼠免疫球蛋白分子和抗体的生产中有缺陷。这里在背景部分所公开的专利、申请和参考文献中公开了所利用的用于达到所述目的的技术。然而，具体地，在1996年12月3日申请的美国专利申请系列号No.08/759,620以及1998年6月11日公开的国际专利申请Nos.WO98/24893和2000年12月21日公开的WO00/76310中公开了转基因生产小鼠和从其生产抗体的优选实施方案，这些文献的公开内容在此引入作为参考。也见Mendez等，Nature Genetics 15：146-156(1997)，其公开的内容在此引入作为参考。
通过使用这种技术，已经生产了抗多种抗原的全人单克隆抗体。基本上，用目的抗原(例如，uPAR)免疫
Figure G2007800215957D0036155138QIETU
系小鼠，从超免疫的小鼠中回收淋巴细胞(如B细胞)，以及将所回收的淋巴细胞与髓样型细胞系融合以制备无限增殖的杂交瘤细胞系。对这些杂交瘤细胞系进行筛选并选择，以鉴别产生对目的抗原特异性抗体的杂交瘤细胞系。这里提供用于生产产生对uPAR特异性抗体的多个杂交瘤细胞系的方法。此外，这里提供由这些细胞系所产生的抗体的表征，包括这种抗体的重链和轻链的核苷酸和氨基酸序列分析。
可选择地，不是与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，而是可直接对B细胞进行测定。例如，可从超免疫
Figure G2007800215957D00362
小鼠中分离CD19+B细胞并允许增殖和分化成分泌抗体的浆细胞。然后通过ELISA筛选细胞上清液中的抗体对uPAR免疫原的反应性。也可筛选上清液对uPAR片段的免疫反应性以进一步绘制不同抗体结合uPAR上功能性目的结构域的图谱。最后也可以针对其它相关的人类受体以及对uPAR的大鼠、小鼠和非人灵长类动物，如食蟹猴，直系同源物筛选抗体，以确定物种交叉反应性。可通过各种方法使含有目的抗体的孔中的B细胞无限增殖化，包括从个别孔或所汇集的孔的融合以制备杂交瘤，或者通过用EBV感染或通过已知的无限增殖化基因转染，然后铺平板于适当的培养基中。可选择地，然后使用uPAR特异性溶血噬斑测定(见例如Babcook等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：7843-48(1996))分离分泌具有期望特异性的抗体的单个浆细胞。靶向溶解的细胞优选地是用uPAR抗原包被的绵羊红细胞(SRBCs)。
在含有分泌目的免疫球蛋白和补体的浆细胞的B细胞培养物存在时，噬斑的形成表示目的浆细胞周围的绵羊红细胞的特异性uPAR介导的溶解。可分离噬斑中心的单个抗原特异性浆细胞，并且从单个浆细胞中分离编码抗体的特异性的遗传信息。使用随后进行PCR的反转录(RT-PCR)，可克隆编码抗体的重链和轻链可变区的DNA。然后可将这种克隆的DNA进一步插入到适当的表达载体内，优选地如pcDNA的载体盒，更优选地含有免疫球蛋白重链和轻链的恒定域的这种pcDNA载体。然后可将所产生的载体转染到宿主细胞内，例如，HEK293细胞、CHO细胞，并且在修饰的适于诱导转录、选择转化体或者扩增编码期望序列的基因的常规营养培养基中培养。
通常，通过融合的杂交瘤所产生的抗体是具有全人κ或λ轻链的人IgG2重链。这里所述的抗体具有人IgG4重链以及IgG2重链。抗体也可以是其它人类同种型的抗体，包括IgG1。抗体具有高亲和力，当通过固相和溶液相技术测量时，一般具有约10-6至约10-12M或者更低的Kd。优选地是具有至少10-11M KD的抗体以抑制uPAR的活性。
如将意识到的，抗体可在除杂交瘤细胞系之外的细胞系中表达。可使用编码特定抗体的序列转化适当的哺乳动物宿主细胞。可通过用于将多核苷酸引入到宿主细胞内的任何已知方法进行转化，包括，例如在病毒中包装多核苷酸(或进入病毒载体内)以及用病毒(或载体)转导宿主细胞或者通过本领域已知的转染方法，如美国专利Nos.4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455(这些专利在此引入作为参考)所举的例子。所使用的转化程序取决于将要转化的宿主。用于将异源多核苷酸引入到哺乳动物细胞内的方法是本领域公知的并且包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸被囊化到脂质体中，以及DNA直接显微注射到核内。
可用作表达宿主的哺乳动物细胞系是本领域公知的并且包括许多可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的无限增殖化的细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、人上皮肾293细胞，以及许多其它细胞系。通过测定哪些细胞系具有高表达水平并且产生具有组成型uPAR结合特性的抗体，选择特别偏好的细胞系。
根据mAb显著中和uPAR活性的能力(如在下面实施例中所证明的)，这些抗体将在治疗由于uPAR表达所导致的症状和状况中具有治疗作用。在特定的实施方案中，抗体和方法在这里涉及治疗由uPAR所诱导的细胞粘附、侵入和细胞内信号传导所产生的症状。
根据本发明的另一个方面，提供包括uPAR生物活性的拮抗剂和药学上可接受的载体的药物组合物。在一个实施方案中，拮抗剂包括抗体。根据本发明的另一个方面，提供包括uPAR生物活性的拮抗剂和药学上可接受的载体的药物组合物。在一个实施方案中，拮抗剂包括抗体。
抗uPAR抗体用于在患者样品中检测uPAR并且因此用作如这里所述的疾病状态的诊断学。另外，基于它们显著抑制uPA活性的能力(如在下面的实施例中所证明的)，抗uPAR抗体在治疗由于uPAR表达所导致的症状和状况中具有治疗作用。在具体的实施方案中，抗体和方法在这里涉及治疗由uPAR所诱导的细胞粘附、侵入和细胞内信号传导所产生的症状。另外的实施方案包括使用这里所述的抗体和方法以治疗细胞粘附和侵入相关的疾病，包括肿瘤性疾病，如黑色素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、甲状腺瘤、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、成胶质细胞瘤、子宫内膜癌、肾癌、结肠癌和胰癌。抗体也可用于治疗关节炎、动脉粥样硬化和包括血管发生的疾病中的细胞粘附和/或侵入。
治疗性施用和制剂
本发明的实施方案包括用作疾病治疗的抗uPAR抗体的无菌药物制剂。这种制剂可抑制uPA与其受体uPAR的结合，因此有效地治疗病理学状况，其中例如，血清或组织uPAR异常升高。抗uPAR抗体优选地具有足够的亲和力以有效地抑制uPA，优选地具有足够的作用持续时间以容许人不经常服药。通过可替代的肠胃外途径如皮下或肌内注射，延长的作用持续时间将容许不频繁和更方便的服药方案。
例如，可在抗体的冷冻干燥和重构之前或之后，通过经无菌过滤膜的过滤产生无菌制剂。抗体通常将以冻干的形式或以溶液贮藏。治疗性抗体组合物通常置于具有无菌入口的容器内，例如，具有允许取回制剂的衔接头，如可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
抗体施用的途径与已知方法一致，例如，通过静脉内、腹膜内、大脑内、肌内、眼内、动脉内、鞘内的注射或输注，吸入或病灶内的途径、直接注射到肿瘤部位，或者通过如下面所述的持续释放系统。抗体优选地通过输注或通过弹丸注射连续施用。
在治疗上将要使用的抗体的有效量将取决于，例如，治疗目的、施用的途径，以及患者的状况。因此，优选地医生根据需要滴定剂量并且修改施用的途径以便获得最佳治疗效果。一般地，临床医生将施用抗体直到达到获得期望效果的剂量。通过常规测定或者通过这里所述的测定，容易监控该治疗的进展。
如这里所述的，可将抗体与药学上可接受的载体制成混合物。可通过静脉内途径或者通过鼻或肺施用治疗组合物，优选地作为液体或粉末气溶胶(冻干的)。也可如所期望的通过肠胃外或皮下施用组合物。当全身施用时，治疗组合物应当是无菌、无致热原并且溶于充分考虑到pH、等渗性和稳定性的肠胃外可接受的溶液中。这些条件都是本领域技术人员已知的。简要地，通过将具有期望纯度程度的化合物与药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，制备这里所述化合物的用于贮藏或施用的剂量制剂。这种材料在所使用的剂量和浓度对于接受者是无毒性的，并且包括缓冲液如TRIS HCl、磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐和其它有机酸盐；抗氧化剂如抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)肽如聚精氨酸，蛋白质，如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或者精氨酸；单糖、二糖，以及其它碳水化合物，包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；平衡离子如钠和/或非离子型表面活性剂如TWEEN、PLURONICS或聚乙二醇。
可根据如在Remington：The Science and Practice ofPharmacy(第20版，Lippincott Williams & Wilkens Publishers(2003))中所描述的常规药物实践配制用于注射的无菌组合物。例如，活性化合物在药学上可接受的载体如水或天然存在的植物油如芝麻、花生或棉籽油或者合成的脂肪载体如油酸乙酯等中溶解或悬浮可以是期望的。可根据公认的药物实践掺入缓冲液、防腐剂、抗氧化剂等。
持续释放制剂的适当实例包括含有多肽的固体疏水聚合物的半透性基质，其中基质是有形物品、薄膜或微胶囊的形式。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，如Langer等，J.Biomed Mater.Res.，(1981)15：167-277和Langer，Chem.Tech.，(1982)12：98-105所述的聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)，或者聚乙烯醇)、聚交酯(美国专利No.3,773,919、EP 58,481)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等，Biopolymers，(1983)22：547-556)、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯(Langer等，同上)、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射的小球体)，以及聚-D-(-)-3-羟丁酸(EP 133,988)。
尽管聚合物如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸使得能持续100天以上释放分子，但是某些水凝胶在更短的时间段释放蛋白质。当所被囊化的蛋白质长期保持在体内时，它们由于在37℃暴露于水分可以变性或聚集，从而导致丧失生物活性和可能改变免疫原性。可设计合理的策略用于蛋白质稳定化，这取决于所涉及的机理。例如，如果发现聚集机理是通过二硫化物交换形成分子间S-S键的话，可通过修饰巯基残基、从酸性溶液冷冻干燥、控制水分含量、使用适当的添加剂以及发展特异性聚合物基质组合物达到稳定化。
持续释放的组合物也包括在能在悬浮液中维持晶体的适当制剂中悬浮的抗体的晶体制剂。当皮下或腹膜内注射时，这些制剂可产生持续释放效应。其它组合物也包括脂质体包载的抗体。通过本身已知方法制备含有这种抗体的脂质体，如美国专利No.DE3,218,121；Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1985)82：3688-3692；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1980)77：4030-4034；EP 52,322；EP36,676；EP 88,046；EP 143,949；142,641；日本专利申请83-118008；美国专利Nos.4,485,045和4,544,545；以及EP 102,324。
用于给定患者的抗体制剂的剂量将由主治医师考虑各种已知改变药物作用的因素后决定，包括疾病的严重性和类型、体重、性别、饮食、施用的时间和途径、其它附加药物和其它有关的临床因素。可通过体外或体内的方法确定治疗有效剂量。
治疗上将要使用的这里所述的抗体的有效量将取决于，例如治疗目的、施用途径以及患者的状况。因此，优选医生根据需要滴定剂量并且修改施用途径以获得最佳治疗效果。一般的每日剂量可以是从约0.001mg/kg、0.01mg/kg、0.1mg/kg、1mg/kg、10mg/kg至最高至100mg/kg、1000mg/kg、10000mg/kg，或者更高，这取决于上述因素。一般地，临床医生将施用治疗性抗体直到达到获得期望效果的剂量。通过常规测定或者如这里所述容易地监控该疗法的进展。
将会意识到，与这里的组合物和方法一致的治疗实体将与适当的载体、赋形剂以及掺合入制剂的其它试剂一起施用，以提供改良的转移、递送、耐受性等。这些制剂包括，例如，粉末、糊剂、软膏、凝胶剂、蜡、油、脂质、含有小泡的脂质(阳离子的或阴离子的)(如LipofectinTM)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、乳剂碳蜡(carbowax)(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶以及含有碳蜡的半固体混合物。倘若制剂中的活性成分没有被制剂灭活并且制剂与施用途径在生理上是相容和耐受的，那么前述混合物中的任何一种在根据本发明的治疗和疗法中都将是适当的。对于与药剂师公知的制剂、赋形剂和载体有关的附加信息，也见Baldrick P.“Pharmaceutical excipient development：the need for preclinicalguidance.”Regul.Toxicol.Pharmacol.32(2)：210-8(2000)，Wang W.“Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.”Int.J.Pharm.203(1-2)：1-60(2000)，Charman WN“Lipids，lipophilic drugs，and oral drug delivery-some emerging concepts.”J PharmSci.89(8)：967-78(2000)，Powell等“Compendium of excipients forparenteral formulations”PDA J Pharm Sci Technol.52：238-311(1998)以及其中的引用。
其它疗法的设计和产生
根据本发明和基于这里所产生和表征的关于uPAR的抗体的活性，便于超出抗体部分的其它治疗形式的设计。这种形式包括，不限于，高级抗体疗法，如双特异性抗体，免疫毒素和放射性标记的疗法，单结构域抗体，抗体片段，如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或Dab，肽疗法的产生，新支架结构中的uPAR结合域，基因疗法，独特的胞内抗体，反义疗法，以及小分子。
与产生高级抗体疗法有关，其中补体固定是期望的属性，可能通过使用例如，双特异性抗体、免疫毒素、或放射性标记回避对用于细胞杀伤的补体的依赖。
可产生双特异性抗体，其包括(i)缀合在一起的两个抗体，其中一个具有对uPAR的特异性，另一个具有对第二个分子的特异性，(ii)具有对uPAR特异的一个链和对第二个分子特异的第二个链的单个抗体，或者(iii)具有对uPAR和其它分子的特异性的单链抗体。可使用公知技术产生这种双特异性抗体；例如，与(i)和(ii)有关的见，例如，Fanger等Immunol Methods 4：72-81(1994)以及Wright和Harris，同上，且与(iii)有关的见，例如，Traunecker等Int.J.Cancer(增刊)7：51-52(1992)。在每个情况中，可制备对重链活化受体的第二个特异性，所述受体包括，不限于，CD16或CD64(见，例如，Deo等Immunol.Today 18：127(1997))或者CD89(见，例如，Valerius等Blood 90：4485-4492(1997))。
与免疫毒素有关，可利用本领域公知的技术修饰抗体以作为免疫毒素起作用。见，例如，Vitetta Immunol Today 14：252(1993)。也见美国专利No.5,194,594。与制备放射性标记的抗体有关，也可利用本领域公知的技术容易地制备这种修饰的抗体。见，例如，Junghans等，在Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686(第二版，Chafner和Longo编辑，Lippincott Raven(1996))。也见美国专利Nos.4,681,581、4,735,210、5,101,827、5,102,990(RE 35,500)、5,648,471和5,697,902。
组合
可将这里所定义的抗肿瘤治疗作为单独的疗法应用，或者除了本发明的化合物之外，可包括常规外科手术或放射疗法或者化疗。这种化疗可包括下列抗肿瘤剂类别中的一种或多种：
(i)其它抗增殖/抗瘤药物以及它们的组合，如在医学肿瘤学中所使用的，如，烷化剂(例如，顺铂、奥沙利铂、卡铂、环磷酰胺、氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、替莫唑胺和亚硝基脲)；抗代谢物(例如，吉西他滨和叶酸拮抗剂如氟嘧啶，如5-氟尿嘧啶和呋氟啶(tegafur)、雷替曲塞、氨甲蝶呤、阿糖胞苷和羟基脲)；抗肿瘤抗生素(例如蒽环霉素，如亚得里亚霉素、博来霉素、阿霉素、柔红霉素、表柔比星(epirubicin)、伊达比星、丝裂霉素-C、放线菌素D和光辉霉素)；抗有丝分裂剂(例如，长春花生物碱，如长春新碱、长春花碱、长春地辛和长春烯碱以及紫杉醇类(taxoids)，如紫杉醇和泰索帝(taxotere)和polo激酶抑制剂)；以及拓扑异构酶抑制剂(例如，足叶草乙甙，如依托泊甙(etoposide)和替尼泊苷(teniposide)、安吖啶、拓扑替康和喜树碱)；
(ii)细胞生长抑制剂如抗雌激素药(antioestrogen)(例如三苯氧胺、氟维司群(fulvestrant)、托瑞米芬(toremifene)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛西芬(droloxifene)和iodoxyfene)、抗雄激素物质(例如，比卡鲁胺(bicalutamide)、氟他胺、尼鲁米特(nilutamide)和醋酸环丙氟地孕酮)、LHRH拮抗剂或LHRH激动剂(例如，性瑞林(goserelin)、亮丙瑞林(leuprorelin)和布舍瑞林(buserelin))、孕激素(例如，醋酸甲地孕酮)、芳香酶抑制剂(例如，阿那曲唑(anastrozole)、来曲唑(letrozole)、伏罗唑(vorazole)和依西美坦(exemestane))和5α-还原酶的抑制剂如非那雄胺；
(iii)抗侵入剂(例如，c-Src激酶家族抑制剂，如4-(6-氯-2，3-亚甲基二氧基苯胺基)-7-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]-5-四氢吡喃-4-基羟喹唑啉(AZD0530；国际专利申请WO 01/94341)和N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-{6-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]-2-甲基嘧啶-4-基氨基}噻唑-5-氨甲酰(达沙替尼(dasatinib)，BMS-354825；J.Med.Chem.，2004，47，6658-6661)，以及金属蛋白酶抑制剂，如马马司他(marimastat)，尿激酶纤溶酶原激活物受体功能的其它抑制剂，或者，组织蛋白酶的抑制剂、丝氨酸蛋白酶例如，matriptase、hepsin、尿激酶的抑制剂、乙酰肝素酶的抑制剂)；
(iv)生长因子功能的抑制剂：例如，这种抑制剂包括生长因子抗体和生长因子受体抗体(例如，抗erbB2抗体司徒曼布(trastuzumab)[HerceptinTM]、抗EGFR抗体帕尼单抗(panitumumab)、抗erbB1抗体西妥昔单抗(cetuximab)[Erbitux，C225]和由Stern等Critical reviewsin oncology/haematology，2005，Vol.54，pp11-29所公开的任何生长因子或生长因子受体抗体)；这些抑制剂也包括酪氨酸激酶抑制剂，例如表皮生长因子家族的抑制剂(例如EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂如N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉基丙氧基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼(gefitinib)，ZD1839)、N-(3-乙炔基苯基)-6，7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(埃罗替尼(erlotinib)，OSI-774)和6-丙烯酰胺-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉基丙氧基)-喹唑啉-4-胺)(CI 1033)、erbB2酪氨酸激酶抑制剂如拉帕替尼(lapatinib)、肝细胞生长因子家族的抑制剂、血小板衍生生长因子家族的抑制剂如伊马替尼(imatinib)、丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制剂(例如，Ras/Raf信号传导抑制剂，如法尼基转移酶抑制剂，例如索拉非尼(sorafenib)(BAY 43-9006))、通过MEK和/或AKT激酶的细胞信号传导的抑制剂，肝细胞生长因子家族的抑制剂、c-kit抑制剂、ab1激酶抑制剂、IGF受体(胰岛素样生长因子)激酶抑制剂；aurora激酶抑制剂(例如，AZD1152、PH739358、VX-680、MLN8054、R763、MP235、MP529、VX-528和AX39459)以及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂如CDK2和/或CDK4抑制剂。
(v)抗血管生成剂如抑制血管内皮生长因子的作用的那些，[例如，抗血管内皮细胞生长因子抗体贝伐单抗(bevacizumab)(AvastinTM)和VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂如4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474；WO 01/32651中的实施利2)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171；WO 00/47212中的实施例240)、瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787；WO 98/35985)以及SU11248(舒尼替尼(sunitinib)；WO01/60814)，化合物如在国际专利申请WO97/22596、WO 97/30035、WO 97/32856和WO 98/13354中公开的那些，以及通过其它机理作用的化合物(例如，罗喹美克(linomide)，整联蛋白ανβ3功能和制管张素的抑制剂)]；
(vi)血管损伤剂如Combretastatin A4和在国际专利申请WO99/02166、WO 00/40529、WO 00/41669、WO 01/92224、WO 02/04434和WO 02/08213中所公开的化合物；
(vii)反义疗法，例如针对上面所列靶的那些，如ISIS 2503，抗ras反义；
(viii)基因治疗方法，包括例如，替换异常基因如异常的p53或者异常的BRCA1或BRCA2的方法，GDEPT(基因指导的酶前体药物疗法)法如使用胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶或细菌硝基还原酶的那些，以及提高患者对化疗或放疗耐受性的方法，如多药物抗性基因疗法；以及
(ix)免疫治疗方法，包括例如提高患者肿瘤细胞的免疫原性的先体外后体内和体内方法，如用细胞因子的转染，如白细胞介素2、白细胞介素4或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，降低T细胞无反应性的方法，使用已转染的免疫细胞的方法，如细胞因子转染的树突细胞，使用细胞因子转染的肿瘤细胞系的方法以及使用抗独特型抗体的方法。
在一个实施方案中，这里所定义的抗肿瘤治疗除了包括本发明的化合物外，还可包括用其它抗增殖/抗瘤药物和它们的组合的治疗，如在医学肿瘤学中所使用的，如烷化剂(例如，顺铂、奥沙利铂、卡铂、环磷酰胺、氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、替莫唑胺和亚硝基脲)；抗代谢物(例如，吉西他滨和叶酸拮抗剂如氟嘧啶，如5-氟尿嘧啶和呋氟啶、雷替曲塞、氨甲蝶呤、阿糖胞苷和羟基脲)；抗肿瘤抗生素(例如蒽环霉素，如亚得里亚霉素、博来霉素、阿霉素、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素-C、放线菌素D和光辉霉素)；抗有丝分裂剂(例如，长春花生物碱，如长春新碱、长春花碱、长春地辛和长春烯碱以及紫杉醇类，如紫杉醇和泰索帝和polo激酶抑制剂)；以及拓扑异构酶抑制剂(例如，足叶草乙甙，如依托泊甙和替尼泊苷、安吖啶、拓扑替康和喜树碱)。
在一个实施方案中，这里所定义的抗肿瘤治疗除了本发明的化合物外，还可包括用吉西他滨的治疗。
可通过治疗的个别组分的同时、顺序或分别给药的方式达到这种联合治疗。这种组合产品在上文所述剂量范围内使用本发明的化合物，或者其药学上可接受的盐，以及在其批准的剂量范围内使用其它药学上有活性的试剂。
实施例
提供下列包括所进行的实验和所获得的结果的实施例，仅用于说明目的，而不应当被解释为限制这里的教导。
实施例1
免疫和滴定
免疫
分别使用可溶性uPAR(重组人uPAR/His6，Cat.#807-UK-100，R&D Systems，Inc.)和细胞结合的uPAR(在细胞表面表达人uPAR的B300.19转染子)进行免疫。为了产生B300.19转染子，将人全长uPAR cDNA插入到pcDNA 3表达载体内。通过电穿孔瞬时转染B300.19细胞。通过荧光激活细胞分选仪(FACS)分析，证实人uPAR在细胞表面上的表达水平适于用于免疫。根据在1996年12月3日申请的美国专利申请系列号No.08/759,620以及在1998年6月11日公开的国际专利申请Nos.WO 98/24893和在2000年12月21日公开的WO 00/76310中所公开的方法，这些文献公开的内容在此引入作为参考，对于周期(Campaign)1，每只小鼠用10μg可溶性蛋白质，对于周期2，每只小鼠用1x107个B300.19转染的细胞在XenoMouseTM中进行免疫。在表2中总结了免疫程序。
通过滴度选择用于收获的动物
通过FACS检验抗人uPAR抗体的滴度。在免疫程序的终点，通过如在实施例2中所述的电穿孔的方法，使用小鼠骨髓瘤细胞和从所免疫的小鼠的脾和淋巴结中分离的淋巴细胞进行融合。
              表2：免疫程序的总结
Figure G2007800215957D00461
Figure G2007800215957D00471
“Fp”指“爪垫”
实施例2
淋巴细胞的回收、B细胞分离、融合以及杂交瘤的产生
通过颈脱位法处死免疫的小鼠，从每群组收获并汇集引流(draining)淋巴结。通过在DMEM中碾磨以从组织中释放细胞，解离淋巴样细胞，并且将细胞在DMEM中悬浮。计数细胞，向细胞沉淀中加入0.9ml DMEM/1亿个淋巴细胞，以将细胞轻轻地但却完全地重悬。每1亿个细胞使用100μl CD90+磁珠，通过在4℃将细胞与磁珠温育15分钟，对细胞进行标记。将含有最高达108个阳性细胞(或者最高达2x109个总细胞)的磁性标记的细胞悬浮液加载到LS+柱上，并将柱用DMEM洗涤。收集总流出物作为CD90阴性级分(期望这些细胞中的大多数细胞是B细胞)。
通过将上面洗涤的富集的B细胞和购自ATCC，cat.# CRL1580的非分泌骨髓瘤P3X63Ag8.653细胞(Kearney等，J.Immunol.123，1979，1548-1550)按照1:1的比率混合进行融合。通过800xg离心，将细胞混合物轻轻沉淀。完全取出上清液后，将细胞用2-4mL链霉蛋白酶溶液(CalBiochem，cat.# 53702；溶于PBS，0.5mg/ml)处理不过2分钟。然后加入3-5ml FBS终止酶活性并且使用电细胞融合溶液，(ECFS，0.3M蔗糖，Sigma，Cat# S7903，0.1mM乙酸镁，Sigma，Cat# M2545，0.1mM乙酸钙，Sigma，Cat# C4705)将悬浮液调整到40ml总体积。离心后取出上清液并将细胞在40ml ECFS中重悬。重复该洗涤步骤并将细胞再次在ECFS中重悬，配制成2x106细胞/ml的浓度。
使用融合发生器(ECM2001型，Genetronic，Inc.，SanDiego，CA)进行电细胞融合。所使用的融合室的大小为2.0ml，使用下列仪器设置：
调整条件：电压：50V，时间：50秒
膜破坏在：电压：3000V，时间：30微秒
融合后保持时间：3秒
ECF后，在无菌条件下小心地将细胞悬浮液从融合室中取出并转移到含有相同体积的，补加了L-谷胺酰胺、pen/strep、OPI(草酰乙酸、丙酮酸、牛胰岛素)(所有都购自Sigma)和IL-6(BoehringerMannheim)的杂交瘤培养基(DMEM，JRH Biosciences)、15％ FBS(Hyclone)的无菌管内。将细胞在37℃温育15-30分钟，然后在400xg(1000rpm)离心5分钟。将细胞在小体积的杂交瘤选择培养基(补加了0.5x HA的杂交瘤培养基(Sigma，cat.# A9666))中轻轻重悬，且根据每个96孔板最后总共铺平板5x106个B细胞和每孔200μl，用更多的杂交瘤选择培养基将体积进行适当地调整。将细胞轻轻混合，用移液管移液到96孔板内并允许生长。在第7或第10天，取出一半的培养基，且将细胞再次用杂交瘤选择培养基饲养。
根据常规方法使杂交瘤在选择培养基中生长。将从潜在地产生抗人uPAR抗体的杂交瘤中所收集的无遗漏的上清液进行随后的筛选测定。
实施例3
与细胞结合的hu-uPAR的结合
使用荧光微体积测定技术(FMAT)，用经转染以表达人uPAR的鼠前B细胞系B300.19(ATCC)检验抗体与细胞结合的uPAR的结合，且B300.19亲本细胞作为对照。使用5,000个细胞/孔用于测定。使用小鼠抗人uPAR mAb(R& E Systems，MAB807)作为阳性对照试剂，而使用G2KLH上清液(1:10)作为阴性对照试剂。使用400ng/ml的山羊抗人IgG Cy5缀合物检测所结合的抗体(山羊抗小鼠IgGCy5缀合物用作小鼠抗体对照)。通过分别用5μg/ml和2.5μg/ml的山羊抗人κ-PE或山羊抗人γ-Cy5缀合物(两个都购自Jackson ImmuneResearch)检测结合抗体的FACS分析，证实阳性系。对于每个染色的染料，将阳性和阴性细胞之间GeoMean值的比率制成表格。将1.95以上的比率认为是命中(hit)。表3中列出了每个融合的人γ和κ特异性命中的数目。
表3.通过FACS分析证实的与细胞结合的hu-uPAR结合的抗体的数目
Figure G2007800215957D00491
实施例4
竞争性结合
在该测定中，通过FACS分析检验抗体抑制人uPA与细胞结合的uPAR结合的能力。简要地，转染鼠成纤维细胞L929细胞(ATCC)以表达人uPAR。将具有99％生存力的转染子与1：2稀释的上清液在4℃过夜温育。洗涤后，将细胞与500ng/ml FITC标记的tc-uPA(购自Molecular Systems)温育1小时。使用与生物素缀合的兔抗FITC(2.5μg/ml，购自Molecular Probes)检测结合的FITC-uPA。为了扩大信号，使用第三个检测试剂，strapavidin-Cy5缀合物(SA-Cy5，2.5μg/ml，购自Jackson Immune Research)。使用单克隆抗人uPAR抗体MAB807(R&D Systems，中和受体-配体结合)作为阳性对照试剂。
检测总共433个杂交瘤系的上清液(粘合剂)，且将50％抑制认为是阳性的。在表4中总结了每个融合的阳性系(中和剂)。在四个融合中，有总共102个系能抑制uPA与uPAR的结合。
     表4.抑制uPA/uPAR结合的Abs的数目
Figure G2007800215957D00501
实施例5
与非人灵长类动物的交叉反应性
克隆来源于食蟹猴的uPAR并在CHOK1细胞表面上表达。在该测定中通过FACS分析检验抗体与细胞结合的食蟹猴uPAR的结合(亲本细胞作为阴性对照)。使用鼠抗人uPAR抗体MAB807(R&DSystems)作为阳性对照试剂。简要地，将具有99％生存力的CHOK1/cyno-uPAR转染子在4℃与1：2稀释的上清液温育。使用山羊抗人γ链Cy5缀合物(5μg/ml)和抗人κ链PE缀合物(2.5μg/ml)检测结合的人抗体，两者都购自Jackson Immunology Research。对每个染色的染料，找到阳性和阴性细胞之间GeoMean值的比率。将1.95以上的比率认为是命中。仅将证明对uPA/uPAR结合有抑制活性(中和剂)的系进行该测定。如在表5中所总结的，在检验的102个系中有90个显示与CHOK1细胞表面上所表达的cyno-uPAR的结合能力。如在下面实施例12中所示，克隆并纯化30个候选物后，证实与食蟹猴uPAR的交叉反应性。
  表5.结合表达食蟹猴uPAR的细胞的Abs的数目
Figure G2007800215957D00511
实施例6
动力学测定
高抗原(HA)定量(ELISA)
与下面所述的限量抗原定量测定(4.2μg/mL)相比，用更多量的uPAR包被ELISA板。将含有抗体(Ab)的样品在uPAR包被的ELISA板上滴定并且过夜温育以允许Ab结合接近平衡。样品中Ab的滴定覆盖1:200到1:19,531的稀释范围。使用已知浓度的uPAR特异性抗体的标准曲线限定测定的线性范围。使用线性范围内的数据以获得每个所滴定的样品中uPAR特异性Ab的相对浓度。高uPAR浓度和过夜温育限制Ab亲和力的效应，从而允许定量每个样品中所存在的uPAR特异性Ab的相对量。
限量抗原(LA)定量(ELISA)
与下面所述的高抗原定量测定(320、160、80、40和20ng/mL)相比，用更低量的uPAR包被ELISA板。将含有一个浓度的抗体(Ab)(1:25稀释)的样品过夜温育以允许Ab结合接近平衡。低抗原浓度限制抗体浓度的效应，从而允许根据它们的相对亲和力对抗体进行排列。
通过HA/LA动力学测定，检验具有抑制uPA/uPAR结合(中和剂)的能力的102个系。结合uPA/uPAR结合抑制的功效和基于FACS的结合，对结果进行分析。表6总结了30个具有期望的中和活性和优选的结合动力学的杂交瘤系的结果。
实施例7
特异性研究
与uPAR最接近的同源物是人Ly6e(约36％相似性)。在本研究中，鉴定并排除与Ly6e交叉反应的所有抗体。
根据标准规程，克隆人Ly6e(Genbank登记号No.BC119709)并在HEK293T细胞中表达。由于缺乏适当的检测抗体，通过探测在分子上所融合的myc标签，以及在蛋白质印迹上使用相同抗myc抗体证明所表达的蛋白质的正确的分子大小，证实Ly6e表达的真实性。
通过FACS分析，使用1:2杂交瘤上清液，确定抗体对被转染以表达Ly6e的HEK293T的反应性，并且用与Cy5缀合的山羊抗人γ链(2.5mg/ml，Jackson Immune Research)探测。抗myc抗体(10μg/ml，Invitrogen)与转染子的结合用作阳性对照，且该抗体与(Ly6e阴性)亲本细胞的结合用作阴性对照。使用阳性对阴性的GeoMean比率为1.95作为阈值。将1.95以上的读数认为是粘合剂。结果，在102个中和剂中，仅发现系4.67和4.50结合表达Ly6e的细胞。其它的对Ly6e没有交叉反应性。表6总结了所选择的用于克隆的30个系的特性。
     表6.对30个用于细胞克隆的系选择的总结
Figure G2007800215957D00521
通过初步的和第二次的筛选测定，如在表6中所总结的，根据它们结合细胞结合的人uPAR的能力、uPA/uPAR结合的抑制以及动力学排列，鉴定了总共30个杂交瘤系。在它们中，两个系不结合细胞表面上的cyno-uPAR。没有一个抗体与鼠uPAR反应，且没有一个所选择的系与uPAR的最接近的同源物Ly6e反应。
如下所述，克隆这30个系并进一步进行表征。
实施例8
纤溶酶原激活测定
使用已知表达uPAR的人组织细胞淋巴瘤细胞系U937(ATCC)用于该测定。在结合细胞表面uPAR后，单链尿激酶型纤溶酶原激活物(scuPA)可被活化成uPA，并且可切割纤溶酶原形成纤溶酶。后者切割D-Val-Leu-Lys7-氨基-4-甲基香豆素(VLK-AMC，Sigma目录号V3138)并且释放荧光AMC染料。因此，测定系统中荧光单位的强度表示与细胞表面uPAR结合的uPA的量。预计抗uPAR的中和性mAb抑制scuPA的结合，且因此抑制荧光。
在37℃，具有5％ CO2的条件下，将U937细胞在具有2mML-谷胺酰胺的调整为含有1.5g/L碳酸氢钠、4.5g/L葡萄糖、10mMHEPES、1.0mM丙酮酸钠和10％ FBS的RPMI 1640培养基中维持并繁殖。为了进行该测定，将U937细胞以60,000个细胞/孔的密度接种到V型底部的板内，并且通过以1,500rpm将细胞离心3分钟用冷反应缓冲液(0.05M Tris.HCl、0.1M NaCl，pH＝7.4，具有2％ BSA)洗涤。重悬后，在冰上将细胞用所显示终浓度的mAb处理一小时。将所处理的细胞悬浮液用终浓度为3nM的scuPA掺加。在用冷反应缓冲液洗涤前，将细胞悬浮液在冰上温育1小时。向体积调整到200μl的细胞悬浮液中加入50μl的1μM Glu-纤溶酶原和400μM VLK-AMC底物。将混合物转移到FMAT板上，用Tecan读数器进行荧光测定。
在纤溶酶原激活测定中最初检验了30个mAb。然后选择了15个具有比其它更高的纤溶酶原激活抑制活性的候选物用于进一步的检验。如图1中所示，通过在各种浓度检验它们的抑制活性，产生所选的15个mAb的剂量-反应关系曲线。对于每个mAb浓度，进行一式三份检验。在表11中包括每个mAb的定量指数，IC50。
注意到，抗体4.19.1和1.41.1的曲线之间有明显的间隙。间隙左侧的曲线(包括8个mAb，即，4.18.1、4.50.2、4.13.2、4.12.2、2.6.1、1.99.1、2.19.2和4.19.1)具有更高的功效和潜能。它们在低至1μg/ml的浓度抑制90％以上的纤溶酶原激活。因此，选择这8个mAb用于进一步表征。
实施例9
粘附测定
将96孔微量滴定板在4℃下用溶于磷酸钠(pH 9)的玻连蛋白(5μg/ml)进行过夜包被。然后在室温下将板用3％ BSA封闭至少1小时。使用2.5ml的50mM甘氨酸-HCl和100mM NaCl(pH 3.0)在冰上将U937细胞进行酸性剥离(acid strip)3分钟。然后将酸性细胞悬浮液用0.5ml的500mM HEPES和100mM NaCl(pH 7.0)进行中和。
然后将细胞用预加温的无血清培养基洗涤2次，再次用含有1％ BSA并且无Mn2+的HBBS洗涤两次，之后它们最终以180,000个细胞/100μL在HBBS中重悬。然后将酸性剥离的细胞在4℃用10μg/ml预先选择的mAb温育1小时。随后将细胞用25nM的scuPA掺加。
将50μl细胞和它们的预先选择的mAb添加到微量滴定板中每个玻连蛋白包被的孔内。在37℃允许细胞粘附到板40分钟。使用温HBSS洗掉未结合的细胞。通过将板置于-80℃1小时，冷冻结合的细胞。然后在室温下将细胞解冻。向每个孔中添加100ml CyQuant染色/溶解缓冲液，且在485nm激发和530nm发射下读取荧光。
最初将实施例8中所选的15个mAb在2μg/ml进行粘附测定。当发现抑制粘附的8个mAb时，如在图2中所示，一式三份获得它们的剂量-反应关系曲线。在所定义的实验条件下，剩下的7个mAb不显示明显的抑制作用。
无论人类同种型IgG还是山羊IgG对照都不抑制U937与玻连蛋白的粘附。与山羊抗uPAR相似，其是已知的中和剂(黑粗的点线，图2)，这8个抑制性mAb抑制细胞以剂量依赖方式粘附玻连蛋白。图中曲线的最左边的组由mAb 4.18.1、2.6.1、2.19.2和4.50.2组成。测定中所检验的最大mAb浓度是2μg/ml。在该浓度，至少mAb2.19.2和2.6.1达到90％抑制uPAR介导的细胞与玻连蛋白的粘附，而mAb 4.18.1接近90％抑制。将该实验重复三次，具有相似的结果。
在表11中总结了抗体的抗粘附活性与其它特征的相关性。
实施例10
侵入测定
在冰上将MatrigelTM(BD Biosciences Cat# 356237 Lot#007024-7.7mg/ml)在4℃冰箱中过夜解冻。将80μl凝胶加到BD24孔Transwell板中具有8μm孔径的每个孔中，并在细胞附着前在37℃温育90分钟。使用细胞解离溶液(Sigma)在DMEM(0.2％FCS)培养基中使HT-1080细胞以1x105细胞/ml重悬。将100μl(1x104细胞)细胞悬浮液等分试样到无菌eppendorf管中并与终浓度为0.1、1.0和10μg/ml的mAb在37℃预温育1小时，不定期的混合。也将未处理的对照样品在37℃预温育1小时，不定期的混合。
将750μl补加了0.1、1.0和10μg/ml mAb的DMEM(10％FCS)培养基添加到下面的transwell室的适当孔中。将750μl的DMEM(10％ FCS)培养基添加到对照样品的下面的室中。将上面的含有固化的MatrigelTM的室插入到下面的transwell室内，且将100μl(1x104细胞)预温育的细胞悬浮液等分试样到适当孔的上面的室中，并将这些室在37℃温育3天。通过在室温下浸于-20℃甲醇中20分钟，将transwell固定。在用Hoechst 33342(Sigma目录号B2261)(10μM)染色前，将transwell在PBS中洗涤两次。染色后，将孔用PBS洗涤两次。使用20x物镜，获得MatrigelTM顶部的细胞和在经过MatrigelTM的连续的20μm切片中所侵入的细胞的光学图象。使用Image-ProPlus(Media Cybernetics，Bethesda，MD)图象分析软件包计算每个切片上的细胞数目。对于每个样品，将数据表示为所有切片中存在的指定距离(60-200μm)上已侵入的细胞的百分比数目。
在mAb浓度为0.1、1.0和10μg/ml的测定中，连同同种型对照(PK16.3.1用于IgG2、108.2.1用于IgG4)一起，检验实施例8的15个mAb。将侵入超过60μm距离的细胞数对“对IgG2和IgG4同种型对照的倍数改变”进行标准化。图3中的三个图从上到下分别代表用浓度为0.1、1.0和10μg/ml的mAb所收集的数据。发现所检验的mAb中的大部分抑制细胞侵入。抗体2.19.1、2.6.1和4.18.1具有最好的功效和潜能。在10μg/ml浓度，mAb 2.19.1完全抑制超过60μm距离的侵入，且mAb 2.6.1和4.18.1达到90％抑制。随后，在0.1-100ng/ml的浓度范围进行2.6.1、2.19.2和4.18.1的分析，并且通过侵入通过80μM深的MatrigelTM的细胞数目确定侵入。如图5所证明的，发现100ng/ml浓度的mAb 2.6.1、2.19.2和4.18.1显著(>70％抑制)抑制细胞迁移到80μm。
实施例11
使用低和高分辨率BiacoreTM确定亲和力
低分辨率Biacore TM
对于低分辨率BiacoreTM检验，检验所选的31个杂交瘤细胞系产物或杂交瘤上清液用于亲和力测定。使用常规胺偶联，制备CM5BiacoreTM芯片上的高密度山羊抗人抗体表面。在含有100μg/ml BSA的HBS-P运行缓冲液(10mM HEPES[pH 7.4]，150nM NaCl，0.005％表面活性剂P20)中将所有mAb稀释到大约6μg/mL。使用30秒接触时间，以10μL/分使每个mAb捕获在单独的流动室上，随后以100μL/分的流速洗涤5分钟，用于mAb基线的稳定。其次，在所有表面上注射312nM(23℃)的hu-uPAR(R&D Systems，Lot ALH01402A)90秒钟，随后解离5分钟(100μL/分的流速)。用4分钟hu-uPAR注射(312nM，50μL/分的流速)，重新分析四个mAb。在运行缓冲液中制备所有抗原样品。在每个捕获/注射循环后再生表面，所述循环具有一次15秒钟的146mM磷酸(pH 1.5)脉冲。
对于每个循环，减去每个抗原注射前的缓冲液注射的基线位移。
使用CLAMP(David G.Myszka and Thomas Morton(1998)“CLAMP
Figure G2007800215957D0057161708QIETU
：a biosensor kinetic data analysis program，”TIBS 23，149-150)使数据全局拟合1:1相互作用模型以确定结合动力学。在使数据拟合中使用质量传递系数。在表7a中列出了动力学分析结果。也指出了分析中所使用的mAb上清液。将mAb按照亲和力由高到低的顺序排列。
表7a.低分辨率BiacoreTM来源的杂交瘤系的亲和力测定结果
 
样品 所捕获的Amt.(RU)         ka(M-1s-1) kd(s-1) KD(nM)
2.19 299 1.4X105 4.3X10-5 0.31
2.6 290 8.1X104 4.6X10-5 0.57
3.29 249 2.7X104 3.1X10-5 1.1
4.18 384 1.1X105 1.6X10-4 1.5
4.50 298 1.2X105 2.6X10-4 2.2
1.100 566 7.5X104 1.7X10-4 2.3
4.65 291 1.1X105 2.5X10-4 2.3
1.61 459 9.4X104 2.5X10-4 2.7
4.19 227 1.2X105 3.2X10-4 2.7
3.140 443 7.0X104 2.1X10-4 3.0
3.8 427 2.2X104 6.8X10-5 3.1
3.104 228 8.7X104 3.0X10-4 3.4
1.99 509 1.2X105 4.2X10-4 3.5
3.14 274 9.8X104 3.4X10-4 3.5
1.35 546 3.8X104 1.5X10-4 3.9
1.41 718 3.3X104 1.3X10-4 3.9
3.176(supe) 239 5.3X104 2.3X10-4 4.3
3.117(supe) 459 9.8X104 4.3X10-4 4.4
1.113 694 2.8X104 1.3X10-4 4.6
1.85 434 3.0X104 1.4X10-4 4.7
4.68 209 5.3X104 2.9X10-4 5.5
1.20 224 7.7X104 4.5X10-4 5.8
1.163 662 7.4X103 4.6X10-5 6.2
1.2(supe) 464 1.7X104 1.3X10-4 7.6
1.4 321 1.1X105 9.6X10-4 8.7
1.159 975 1.6X104 1.4X10-4 8.7
4.13 161 9.5X104 1.2X10-3 12.6
4.12 154 6.3X104 1.3X10-3 20.6
3.133 324 9.5X104 3.6X10-3 37.9
3.179 308 5.4X104 2.2X10-3 40.7
3.167 414 6.6X104 3.9X10-3 59.1
大多数Ab非常好地拟合1:1模型。mAb3.133和3.167的解离速率(off-rate)数据显示有些复杂，但是动力学参数是可接受的评估。因为缔合速率低(在103M-1s-1的数量级)，在mAb 1.163的分析中，更长的4分钟的注射时间在结合速率(on-rate)数据中仍然不产生显著的曲率。
高分辨率Biacore TM
考虑到大多数mAb非常好地拟合1:1模型，因此认为从低分辨率BiacoreTM系产物得到的亲和力排列是可靠的。在单独的实验中使用具有三个克隆的并且纯化的mAb的高分辨率BiacoreTM进行Kd测定。
将三个纯化的mAb(2.19.2、2.6.1和4.18.1)中的每一个胺偶联到CM5BiacoreTM芯片的不同的流动室表面上并且检验它们对人uPAR的结合亲和力。将所有mAb在10mM乙酸钠，pH 4.0中稀释，用于固定。用于所有实验的运行缓冲液和样品制备缓冲液是含有100μg/mL BSA的脱气的HBS-P(10mM HEPES[pH 7.4]，150nM NaCl，0.005％表面活性剂P20)。所有实验在23℃，100μL/分钟的流速下进行。一式三份随机注射系列稀释(2倍)的uPAR样品90秒钟，其中交替有几次缓冲液注射用于双重参照。BiacoreTM 2000生物传感器仪器用于所有高分辨率实验。数据全局拟合具有所包括的质量传递项的1:1相互作用模型。表7b中总结了所得的KD值。
表7b.从高分辨率BiacoreTM中获得的经克隆并纯化的mAb的亲和力测定结果
 
mAb KD(pM)
2.19.2 175
2.6.1 249
4.18.1 446
抗体2.19.2、2.6.1和4.18.1的Kd值分别是175pM、249pM和446pM。每个抗体通过高分辨率BiacoreTM获得的Kd排列与经低分辨率BiacoreTM获得的一致。
实施例12
对小鼠和猴uPAR的交叉反应性
为了测定小鼠交叉反应性，在使用过量可溶性小鼠uPAR的竞争测定中，检测与U937细胞表面上所表达的人uPAR结合的mAb。在测定中，在将mAb暴露于表达uPAR的细胞前，将过量的重组小鼠uPAR与mAb预温育。如果mAb与小鼠uPAR交叉反应，那么预温育将掩蔽mAb，因此，其将不结合人uPAR。
将小鼠uPAR/人IgG Fc嵌合体(uPARHuIgG)(R&DSystems，目录号531-PA-100)用于小鼠uPAR。将50μl浓度为1μg/mL的每个mAb与等体积的40μg/mL的小鼠uPARHuIgG混合。mAb和小鼠uPAR的终浓度分别为500ng/mL and 20μg/mL(Mo-uPARHuIg的分子量大约是66-90Kd)。混合物在FACS缓冲液(补加了1％ BSA和0.05％ NaN3的PBS)中，并且温育30分钟。随后，将20,000个U397细胞添加到混合物中，在冰上另外温育30分钟。在温育的终点，通过使用FACS缓冲液洗涤5次，彻底除去未结合的mAb。使用FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences，San Jose，CA)，用Cy5(Cy5-bis-OSU，N，N′-双羧戊基-5，5′-二磺酸吲哚二羰花青(disulfonatoindodicarbocyanine)，Amersham Life Science，目录号No.PA15000)标记的山羊抗Hu IgG Fc(5.0μg/mL)和7AAD(5.0μg/mL)检测结合的mAb。
结果显示，过量的可溶性重组小鼠uPAR不阻断任何mAb与细胞结合的人uPAR的结合(数据没有显示)，从而表明没有一种mAb与小鼠uPAR发生交叉反应。为了使小鼠交叉反应性结果无可置疑，使用FACS分析测量mAb与细胞结合的小鼠uPAR的直接结合。使用源自结缔组织的小鼠细胞系，NCTC L929，用于FACS分析。使用FACS缓冲液将所收获的细胞以50,000个细胞/孔重悬到置于冰上的V型底的板内。将终浓度为6.25μg/ml的uPAR mAb添加到孔内，并且在冰上温育1小时。洗涤后，添加5μg/ml的Cy5标记的山羊抗人IgG Fc和5μg/ml的7AAD。将混合物在冰上温育15分钟，在冷FACS缓冲液中洗涤并重悬，用于FACS分析。
表8总结了FACS结果。与小鼠抗原发生交叉反应的大鼠抗uPAR产生GeoMean值为248.07的大位移。相反，小鼠抗uPAR mAb(缺乏对小鼠抗原的反应性)，大鼠、小鼠和人的同种型的对照，连同用于检测的第二抗体的GeoMean值在3.14和13.07之间。与上述阴性对照中所见的背景相比，所有全人uPAR mAb显示GeoMean值在9和12之间。因此得出结论，没有一个mAb结合细胞表面的小鼠uPAR。
            表8.FACS分析结果的总结
Figure G2007800215957D00611
在克隆前，显示在所选的30个杂交瘤系中有两个(3.133和3.167)缺乏与猴uPAR的交叉反应性。克隆后，使用FACS分析证实与293T细胞表面上所重组表达的猴uPAR的交叉反应性。在图4中总结了FACS分析结果。
与阴性对照抗体相比，尽管GeoMean值变化很大，但是所有抗uPAR mAb都结合细胞结合的猴uPAR。弱粘合剂包括mAb1.159.1、1.163.1、3.14.1和mAb 1.100.1。发现mAb 2.19.2、2.6.1和4.18.1与猴抗原发生非常强的交叉反应(图4)。
实施例13
食蟹猴亲和力
使用法评估几种抗体的动力学测量值。该方法包括在平衡时正式亲和力测量的基于溶液的测定。将购自R&D systems的重组人uPAR(1-303位氨基酸)偶联到NHS-琼脂糖珠上。根据生产商的建议，将珠上的剩余活性基团用溶于1M Tris的10mg/mlBSA封闭并贮藏在封闭溶液中。使用自动的流动免疫测定系统，KinExA3000进行KinExA实验，其中与人uPAR偶联的珠用作固相。
如SEQ ID NO：81所示的核苷酸序列编码在C端具有符合读框的组氨酸标签的食蟹猴蛋白的细胞外域(ECD)。按照生产商的建议，使用蛋白质生产的Freestyle表达系统(Invitrogen)，通过在HEK293细胞中瞬时转染含有该核苷酸序列的表达载体生产食蟹猴uPAR。将该瞬时转染的条件培养基用于上述的亲和力测定。
简要地，将恒定量的2.6.1或2.19.2抗uPAR抗体(5nM或500pM)与从大约625nM开始的含有重组食蟹猴uPAR ECD的条件培养基的滴定浓度进行温育。将抗原/抗体复合物在室温下温育48小时-168小时以允许达到平衡。从偶联有人uPAR的珠中吸出混合物以积聚未结合的抗体。使用含有对样品缓冲液中的第二抗体特异的Cy5-缀合的山羊抗人IgG重链和轻链的溶液，检测所捕获的抗体。将结合信号转变成作为不存在hIL-13时对照的比例的相对值。对于所有的平衡实验，每个样品重复测量三次。将结果总结在下面的表9中。使用具有KinExA软件内所含有的未知配体浓度的一位点同质结合模型，从数据的非线性回归分析中获得平衡解离常数(KD)。该软件通过使数据点拟合理论的KD曲线，计算KD并且确定95％置信区间。95％置信区间作为KD低和KD高给出。
 表9.食蟹猴结合活性的KinExA结果的总结
 
抗体 KD KD低 KD高
2.6.1 1.09nM 478pM 2.46nM
2.19.2 346pM 234pM 508pM
实施例14
内化测定
使用U937细胞检验实施例8中的8个mAb诱导uPAR内化的能力。用移液管将含有100,000个细胞的上清液一式两份移液到V型底板的每个孔内。制备两个V型底板，将一个在由抗体复合物的内化期间保持在37℃，将另一个在4℃温育。将8个uPAR mAb中的每一个以5μg/ml与U937细胞在冰上温育15分钟。冰上的温育对于防止最初的mAb的内化是必要的。然后将细胞用冷FACS缓冲液洗涤。随后将细胞在冰上在溶于冷FACS缓冲液的100μl的5μg/ml alexa647-标记的山羊抗人F(ab)(Invitrogen目录号A21249)中温育15分钟。这允许山羊FAB与结合的uPAR mAb结合，而不允许任何内化。在冰上温育15分钟后，将一个板置于冰上，而将另一个板在37℃温育1小时。
与mAb-FAB复合物温育1小时后，将细胞用冷5％ FACS缓冲液洗涤两次，并向每个孔中添加200μl的三(2-羧乙基)膦HCl(TCEP)作为剥离剂。将板都与TCEP在冰上温育1小时，随后用FACS缓冲液洗涤并重悬。在进行FACS分析前向每个孔中添加4μl的7-氨基-放线菌素D(7AAD)，随后在冰上温育10分钟。
使用下述等式计算内化的百分率：
[(37剥离-4剥离)/(4无剥离-4剥离)]x100
其中‘37剥离’是在37℃时具有TCEP的geo平均值；
‘4剥离’是在冰上具有TCEP的geo平均值；
‘4无剥离’是在冰上而无TCEP的geo平均值(见表10)。
   表10.内化测定的总结
 
抗体 geo平均值冷+TCEP   geo平均值冷-TCEP   geo平均值37℃+TCEP ％内化
2.19.2 2 42.67 3.54 3.7
4.50.2 2.01 42.12 3.2 2.9
4.12.2 2 33.35 3.02 3.2
1.99.1 1.95 42.49 2.69 1.8
2.6.1 2.07 44.34 3.02 2.2
4.13.2 1.95 37.42 2.95 2.8
4.19.1 2.34 45.95 5.31 6.8
4.18.1 2.05 41.2 3.25 3.0
如在表10中所总结的，如果在37℃温育1小时后检测到非常少的内化，如果有的话。该实验重复了两次，得到相似的结果。
表11总结了实施例8的15个候选物的体外表征的结果。
Figure G2007800215957D00641
实施例15
UPar抗体的结构分析
测定抗体的可变重链和可变轻链的序列以确定它们的DNA序列。在具有每个γ和κ链组合的核苷酸和氨基酸序列的序列表中提供抗uPAR抗体的完整的序列信息。分析可变重链序列以确定VH家族、D区序列和J区序列。然后翻译该序列以确定一级氨基酸序列并与种系VH、D和J区序列比较以评估体细胞高变。
表18是将抗体重链区与它们的相关种系重链区进行比较的表。表19是将抗体κ轻链区与它们的相关种系轻链区进行的表。
免疫球蛋白链的可变(V)区由多个种系DNA片段编码，它们在B细胞个体发生期间连接起来形成有功能的可变区(VHDJH或VKJK)。详细研究了对uPAR反应的抗体的分子和遗传多样性。这些测定揭示了对抗uPAR抗体特异的几个点。
应当意识到，从每个杂交瘤中所收集的姐妹克隆中的氨基酸序列是相同的。作为例子，mAb 2.19.3的重链和轻链序列将与mAb2.19和2.19.1的序列相同。
根据测序数据，2.6.1和4.18.1的重链的一级结构相似，但是不相同。2.19.2在结构上与其它两个不同。
也应当意识到，在特定抗体在氨基酸水平上与其各自的种系序列不同时，可将抗体序列突变回到种系序列。使用标准分子生物学技术，这种矫正突变可发生在一个、两个、三个或更多位置上，或者所突变位置中任何一种的组合。作为非限制性实例，表19显示mAb4.18.1的轻链序列(SEQ ID NO.：52)不同于相应的种系序列(SEQ IDNO.：66)如下：在FR1区中Ser至Phe突变(突变1)、在FR1区中Val至Met突变(突变2)、在FR2区中Lys至Thr突变(突变3)、在FR3区中Ile至Phe突变(突变4)以及在FR3区中Ser至Ile突变(突变5)。因此，可在突变1的位点上修饰编码mAb 4.18.1轻链的氨基酸序列或核苷酸序列，以改变突变1以产生种系序列。进一步地，可在突变2或3的位点上修饰编码mAb 4.18.1轻链的氨基酸序列或核苷酸序列，以改变突变2或3以产生种系序列。进一步地，可在那些特定位点上修饰编码mAb 4.18.1轻链的氨基酸序列或核苷酸序列，以改变突变1和突变2，或者两个或更多个突变的任何其它组合，以产生种系序列。下面的表12-17举例说明了种系与mAb 2.19.2、2.6.1和4.18.1的这种变异的位置。每行代表粗体所示位置上种系和非种系残基的唯一组合。
表12.mAb 2.19.2轻链(SEQ ID NO：32)在所示残基编号上相对于种系的示范性突变
 
12 32 36 38 100 101 103
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S G K Y I T P
S G K Y I T W
S G K Y I F P
S G K Y I F W
S G K S 缺失 T P
S G K S 缺失 T W
S G K S 缺失 F P
S G K S 缺失 F W
S G K S I T P
S G K S I T W
S G K S I F P
S G K S I F W
S G R Y 缺失 T P
S G R Y 缺失 T W
 
S G R Y 缺失 F P
S G R Y 缺失 F W
S G R Y I T P
S G R Y I T W
S G R Y I F P
S G R Y I F W
S G R S 缺失 T P
S G R S 缺失 T W
S G R S 缺失 F P
S G R S 缺失 F W
S G R S I T P
S G R S I T W
S G R S I F P
S G R S I F W
表13.mAb 2.19.2重链(SEQ ID NO：30)在所示残基编号上相对于种系的示范性突变
 
99-100
DQ
缺失
表14.mAb 2.6.1轻链(SEQ ID NO：28)在所示残基编号上相对于种系的示范性突变
 
95-96 103
PL K
PL R
缺失 K
缺失 R
表15.mAb 2.6.1重链(SEQ ID NO：26)在所示残基编号上相对于种系的示范性突变
 
30 31 35 50 53 58 69 81 87 98
S S S V S Y I Q A 缺失
S S S V S Y I Q A E
S S S V S Y I Q V 缺失
S S S V S Y I Q V E
S S S V S Y I H A 缺失
S S S V S Y I H A E
S S S V S Y I H V 缺失
S S S V S Y I H V E
 
30 31 35 50 53 58 69 81 87 98
S S S V S Y V Q A 缺失
S S S V S Y V Q A E
S S S V S Y V Q V 缺失
S S S V S Y V Q V E
S S S V S Y V H A 缺失
S S S V S Y V H A E
S S S V S Y V H V 缺失
S S S V S Y V H V E
S S S V S S I Q A 缺失
S S S V S S I Q A E
S S S V S S I Q V 缺失
S S S V S S I Q V E
S S S V S S I H A 缺失
S S S V S S I H A E
S S S V S S I H V 缺失
S S S V S S I H V E
S S S V S S V Q A 缺失
S S S V S S V Q A E
S S S V S S V Q V 缺失
S S S V S S V Q V E
S S S V S S V H A 缺失
S S S V S S V H A E
S S S V S S V H V 缺失
S S S V S S V H V E
S S S V T Y I Q A 缺失
S S S V T Y I Q A E
S S S V T Y I Q V 缺失
S S S V T Y I Q V E
S S S V T Y I H A 缺失
S S S V T Y I H A E
S S S V T Y I H V 缺失
S S S V T Y I H V E
S S S V T Y V Q A 缺失
S S S V T Y V Q A E
S S S V T Y V Q V 缺失
S S S V T Y V Q V E
S S S V T Y V H A 缺失
S S S V T Y V H A E
S S S V T Y V H V 缺失
S S S V T Y V H V E
S S S V T S I Q A 缺失
S S S V T S I Q A E
S S S V T S I Q V 缺失
S S S V T S I Q V E
 
30 31 35 50 53 58 69 81 87 98
S S S V T S I H A 缺失
S S S V T S I H A E
S S S V T S I H V 缺失
S S S V T S I H V E
S S S V T S V Q A 缺失
S S S V T S V Q A E
S S S V T S V Q V 缺失
S S S V T S V Q V E
S S S V T S V H A 缺失
S S S V T S V H A E
S S S V T S V H V 缺失
S S S V T S V H V E
S S S I S Y I Q A 缺失
S S S I S Y I Q A E
S S S I S Y I Q V 缺失
S S S I S Y I Q V E
S S S I S Y I H A 缺失
S S S I S Y I H A E
S S S I S Y I H V 缺失
S S S I S Y I H V E
S S S I S Y V Q A 缺失
S S S I S Y V Q A E
S S S I S Y V Q V 缺失
S S S I S Y V Q V E
S S S I S Y V H A 缺失
S S S I S Y V H A E
S S S I S Y V H V 缺失
S S S I S Y V H V E
S S S I S S I Q A 缺失
S S S I S S I Q A E
S S S I S S I Q V 缺失
S S S I S S I Q V E
S S S I S S I H A 缺失
S S S I S S I H A E
S S S I S S I H V 缺失
S S S I S S I H V E
S S S I S S V Q A 缺失
S S S I S S V Q A E
S S S I S S V Q V 缺失
S S S I S S V Q V E
S S S I S S V H A 缺失
S S S I S S V H A E
S S S I S S V H V 缺失
S S S I S S V H V E
 
30 31 35 50 53 58 69 81 87 98
S S S I T Y I Q A 缺失
S S S I T Y I Q A E
S S S I T Y I Q V 缺失
S S S I T Y I Q V E
S S S I T Y I H A 缺失
S S S I T Y I H A E
S S S I T Y I H V 缺失
S S S I T Y I H V E
S S S I T Y V Q A 缺失
S S S I T Y V Q A E
S S S I T Y V Q V 缺失
S S S I T Y V Q V E
S S S I T Y V H A 缺失
S S S I T Y V H A E
S S S I T Y V H V 缺失
S S S I T Y V H V E
S S S I T S I Q A 缺失
S S S I T S I Q A E
S S S I T S I Q V 缺失
S S S I T S I Q V E
S S S I T S I H A 缺失
S S S I T S I H A E
S S S I T S I H V 缺失
S S S I T S I H V E
S S S I T S V Q A 缺失
S S S I T S V Q A E
S S S I T S V Q V 缺失
S S S I T S V Q V E
S S S I T S V H A 缺失
S S S I T S V H A E
S S S I T S V H V 缺失
S S S I T S V H V E
S S N V S Y I Q A 缺失
S S N V S Y I Q A E
S S N V S Y I Q V 缺失
S S N V S Y I Q V E
S S N V S Y I H A 缺失
S S N V S Y I H A E
S S N V S Y I H V 缺失
S S N V S Y I H V E
S S N V S Y V Q A 缺失
S S N V S Y V Q A E
S S N V S Y V Q V 缺失
S S N V S Y V Q V E
 
30 31 35 50 53 58 69 81 87 98
S S N V S Y V H A 缺失
S S N V S Y V H A E
S S N V S Y V H V 缺失
S S N V S Y V H V E
S S N V S S I Q A 缺失
S S N V S S I Q A E
S S N V S S I Q V 缺失
S S N V S S I Q V E
S S N V S S I H A 缺失
S S N V S S I H A E
S S N V S S I H V 缺失
S S N V S S I H V E
S S N V S S V Q A 缺失
S S N V S S V Q A E
S S N V S S V Q V 缺失
S S N V S S V Q V E
S S N V S S V H A 缺失
S S N V S S V H A E
S S N V S S V H V 缺失
S S N V S S V H V E
S S N V T Y I Q A 缺失
S S N V T Y I Q A E
S S N V T Y I Q V 缺失
S S N V T Y I Q V E
S S N V T Y I H A 缺失
S S N V T Y I H A E
S S N V T Y I H V 缺失
S S N V T Y I H V E
S S N V T Y V Q A 缺失
S S N V T Y V Q A E
S S N V T Y V Q V 缺失
S S N V T Y V Q V E
S S N V T Y V H A 缺失
S S N V T Y V H A E
S S N V T Y V H V 缺失
S S N V T Y V H V E
S S N V T S I Q A 缺失
S S N V T S I Q A E
S S N V T S I Q V 缺失
S S N V T S I Q V E
S S N V T S I H A 缺失
S S N V T S I H A E
S S N V T S I H V 缺失
S S N V T S I H V E
 
30 31 35 50 53 58 69 81 87 98
S S N V T S V Q A 缺失
S S N V T S V Q A E
S S N V T S V Q V 缺失
S S N V T S V Q V E
S S N V T S V H A 缺失
S S N V T S V H A E
S S N V T S V H V 缺失
S S N V T S V H V E
S S N I S Y I Q A 缺失
S S N I S Y I Q A E
S S N I S Y I Q V 缺失
S S N I S Y I Q V E
S S N I S Y I H A 缺失
S S N I S Y I H A E
S S N I S Y I H V 缺失
S S N I S Y I H V E
S S N I S Y V Q A 缺失
S S N I S Y V Q A E
S S N I S Y V Q V 缺失
S S N I S Y V Q V E
S S N I S Y V H A 缺失
S S N I S Y V H A E
S S N I S Y V H V 缺失
S S N I S Y V H V E
S S N I S S I Q A 缺失
S S N I S S I Q A E
S S N I S S I Q V 缺失
S S N I S S I Q V E
S S N I S S I H A 缺失
S S N I S S I H A E
S S N I S S I H V 缺失
S S N I S S I H V E
S S N I S S V Q A 缺失
S S N I S S V Q A E
S S N I S S V Q V 缺失
S S N I S S V Q V E
S S N I S S V H A 缺失
S S N I S S V H A E
S S N I S S V H V 缺失
S S N I S S V H V E
S S N I T Y I Q A 缺失
S S N I T Y I Q A E
S S N I T Y I Q V 缺失
S S N I T Y I Q V E
 
30 31 35 50 53 58 69 81 87 98
S S N I T Y I H A 缺失
S S N I T Y I H A E
S S N I T Y I H V 缺失
S S N I T Y I H V E
S S N I T Y V Q A 缺失
S S N I T Y V Q A E
S S N I T Y V Q V 缺失
S S N I T Y V Q V E
S S N I T Y V H A 缺失
S S N I T Y V H A E
S S N I T Y V H V 缺失
S S N I T Y V H V E
S S N I T S I Q A 缺失
S S N I T S I Q A E
S S N I T S I Q V 缺失
S S N I T S I Q V E
S S N I T S I H A 缺失
S S N I T S I H A E
S S N I T S I H V 缺失
S S N I T S I H V E
S S N I T S V Q A 缺失
S S N I T S V Q A E
S S N I T S V Q V 缺失
S S N I T S V Q V E
S S N I T S V H A 缺失
S S N I T S V H A E
S S N I T S V H V 缺失
S S N I T S V H V E
S T S V S Y I Q A 缺失
S T S V S Y I Q A E
S T S V S Y I Q V 缺失
S T S V S Y I Q V E
S T S V S Y I H A 缺失
S T S V S Y I H A E
S T S V S Y I H V 缺失
S T S V S Y I H V E
S T S V S Y V Q A 缺失
S T S V S Y V Q A E
S T S V S Y V Q V 缺失
S T S V S Y V Q V E
S T S V S Y V H A 缺失
S T S V S Y V H A E
S T S V S Y V H V 缺失
S T S V S Y V H V E
 
30 31 35 50 53 58 69 81 87 98
S T S V S S I Q A 缺失
S T S V S S I Q A E
S T S V S S I Q V 缺失
S T S V S S I Q V E
S T S V S S I H A 缺失
S T S V S S I H A E
S T S V S S I H V 缺失
S T S V S S I H V E
S T S V S S V Q A 缺失
S T S V S S V Q A E
S T S V S S V Q V 缺失
S T S V S S V Q V E
S T S V S S V H A 缺失
S T S V S S V H A E
S T S V S S V H V 缺失
S T S V S S V H V E
S T S V T Y I Q A 缺失
S T S V T Y I Q A E
S T S V T Y I Q V 缺失
S T S V T Y I Q V E
S T S V T Y I H A 缺失
S T S V T Y I H A E
S T S V T Y I H V 缺失
S T S V T Y I H V E
S T S V T Y V Q A 缺失
S T S V T Y V Q A E
S T S V T Y V Q V 缺失
S T S V T Y V Q V E
S T S V T Y V H A 缺失
S T S V T Y V H A E
S T S V T Y V H V 缺失
S T S V T Y V H V E
S T S V T S I Q A 缺失
S T S V T S I Q A E
S T S V T S I Q V 缺失
S T S V T S I Q V E
S T S V T S I H A 缺失
S T S V T S I H A E
S T S V T S I H V 缺失
S T S V T S I H V E
S T S V T S V Q A 缺失
S T S V T S V Q A E
S T S V T S V Q V 缺失
S T S V T S V Q V E
 
30 31 35 50 53 58 69 81 87 98
S T S V T S V H A 缺失
S T S V T S V H A E
S T S V T S V H V 缺失
S T S V T S V H V E
S T S I S Y I Q A 缺失
S T S I S Y I Q A E
S T S I S Y I Q V 缺失
S T S I S Y I Q V E
S T S I S Y I H A 缺失
S T S I S Y I H A E
S T S I S Y I H V 缺失
S T S I S Y I H V E
S T S I S Y V Q A 缺失
S T S I S Y V Q A E
S T S I S Y V Q V 缺失
S T S I S Y V Q V E
S T S I S Y V H A 缺失
S T S I S Y V H A E
S T S I S Y V H V 缺失
S T S I S Y V H V E
S T S I S S I Q A 缺失
S T S I S S I Q A E
S T S I S S I Q V 缺失
S T S I S S I Q V E
S T S I S S I H A 缺失
S T S I S S I H A E
S T S I S S I H V 缺失
S T S I S S I H V E
S T S I S S V Q A 缺失
S T S I S S V Q A E
S T S I S S V Q V 缺失
S T S I S S V Q V E
S T S I S S V H A 缺失
S T S I S S V H A E
S T S I S S V H V 缺失
S T S I S S V H V E
S T S I T Y I Q A 缺失
S T S I T Y I Q A E
S T S I T Y I Q V 缺失
S T S I T Y I Q V E
S T S I T Y I H A 缺失
S T S I T Y I H A E
S T S I T Y I H V 缺失
S T S I T Y I H V E
 
30 31 35 50 53 58 69 81 87 98
S T S I T Y V Q A 缺失
S T S I T Y V Q A E
S T S I T Y V Q V 缺失
S T S I T Y V Q V E
S T S I T Y V H A 缺失
S T S I T Y V H A E
S T S I T Y V H V 缺失
S T S I T Y V H V E
S T S I T S I Q A 缺失
S T S I T S I Q A E
S T S I T S I Q V 缺失
S T S I T S I Q V E
S T S I T S I H A 缺失
S T S I T S I H A E
S T S I T S I H V 缺失
S T S I T S I H V E
S T S I T S V Q A 缺失
S T S I T S V Q A E
S T S I T S V Q V 缺失
S T S I T S V Q V E
S T S I T S V H A 缺失
S T S I T S V H A E
S T S I T S V H V 缺失
S T S I T S V H V E
S T N V S Y I Q A 缺失
S T N V S Y I Q A E
S T N V S Y I Q V 缺失
S T N V S Y I Q V E
S T N V S Y I H A 缺失
S T N V S Y I H A E
S T N V S Y I H V 缺失
S T N V S Y I H V E
S T N V S Y V Q A 缺失
S T N V S Y V Q A E
S T N V S Y V Q V 缺失
S T N V S Y V Q V E
S T N V S Y V H A 缺失
S T N V S Y V H A E
S T N V S Y V H V 缺失
S T N V S Y V H V E
S T N V S S I Q A 缺失
S T N V S S I Q A E
S T N V S S I Q V 缺失
S T N V S S I Q V E
 
30 31 35 50 53 58 69 81 87 98
S T N V S S I H A 缺失
S T N V S S I H A E
S T N V S S I H V 缺失
S T N V S S I H V E
S T N V S S V Q A 缺失
S T N V S S V Q A E
S T N V S S V Q V 缺失
S T N V S S V Q V E
S T N V S S V H A 缺失
S T N V S S V H A E
S T N V S S V H V 缺失
S T N V S S V H V E
S T N V T Y I Q A 缺失
S T N V T Y I Q A E
S T N V T Y I Q V 缺失
S T N V T Y I Q V E
S 丁 N V T Y I H A 缺失
S T N V T Y I H A E
S T N V T Y I H V 缺失
S T N V T Y I H V E
S T N V T Y V Q A 缺失
S T N V T Y V Q A E
S T N V T Y V Q V 缺失
S T N V T Y V Q V E
S T N V T Y V H A 缺失
S T N V T Y V H A E
S T N V T Y V H V 缺失
S T N V T Y V H V E
S T N V T S I Q A 缺失
S T N V T S I Q A E
S T N V T S I Q V 缺失
S T N V T S I Q V E
S T N V T S I H A 缺失
S T N V T S I H A E
S T N V T S I H V 缺失
S T N V T S I H V E
S T N V T S V Q A 缺失
S T N V T S V Q A E
S T N V T S V Q V 缺失
S T N V T S V Q V E
S T N V T S V H A 缺失
S T N V T S V H A E
S T N V T S V H V 缺失
S T N V T S V H V E
 
30 31 3S 50 53 58 69 81 87 98
S T N I S Y I Q A 缺失
S T N I S Y I Q A E
S T N I S Y I Q V 缺失
S T N I S Y I Q V E
S T N I S Y I H A 缺失
S T N I S Y I H A E
S T N I S Y I H V 缺失
S T N I S Y I H V E
S T N I S Y V Q A 缺失
S T N I S Y V Q A E
S T N I S Y V Q V 缺失
S T N I S Y V Q V E
S T N I S Y V H A 缺失
S T N I S Y V H A E
S T N I S Y V H V 缺失
S T N I S Y V H V E
S T N I S S I Q A 缺失
S T N I S S I Q A E
S T N I S S I Q V 缺失
S T N I S S I Q V E
S T N I S S I H A 缺失
S T N I S S I H A E
S T N I S S I H V 缺失
S T N I S S I H V E
S T N I S S V Q A 缺失
S T N I S S V Q A E
S T N I S S V Q V 缺失
S T N I S S V Q V E
S T N I S S V H A 缺失
S T N I S S V H A E
S T N I S S V H V 缺失
S T N I S S V H V E
S T N I T Y I Q A 缺失
S T N I T Y I Q A E
S T N I T Y I Q V 缺失
S T N I T Y I Q V E
S T N I T Y I H A 缺失
S T N I T Y I H A E
S T N I T Y I H V 缺失
S T N I T Y I H V E
S T N I T Y V Q A 缺失
S T N I T Y V Q A E
S T N I T Y V Q V 缺失
S T N I T Y V Q V E
 
30 31 35 50 53 58 69 81 87 98
S T N I T Y V H A 缺失
S T N I T Y V H A E
S T N I T Y V H V 缺失
S T N I T Y V H V E
S T N I T S I Q A 缺失
S T N I T S I Q A E
S T N I T S I Q V 缺失
S T N I T S I Q V E
S T N I T S I H A 缺失
S T N I T S I H A E
S T N I T S I H V 缺失
S T N I T S I H V E
S T N I T S V Q A 缺失
S T N I T S V Q A E
S T N I T S V Q V 缺失
S T N I T S V Q V E
S T N I T S V H A 缺失
S T N I T S V H A E
S T N I T S V H V 缺失
S T N I T S V H V E
I S S V S Y I Q A 缺失
I S S V S Y I Q A E
I S S V S Y I Q V 缺失
I S S V S Y I Q V E
I S S V S Y I H A 缺失
I S S V S Y I H A E
I S S V S Y I H V 缺失
I S S V S Y I H V E
I S S V S Y V Q A 缺失
I S S V S Y V Q A E
I S S V S Y V Q V 缺失
I S S V S Y V Q V E
I S S V S Y V H A 缺失
I S S V S Y V H A E
I S S V S Y V H V 缺失
I S S V S Y V H V E
I S S V S S I Q A 缺失
I S S V S S I Q A E
I S S V S S I Q V 缺失
I S S V S S I Q V E
I S S V S S I H A 缺失
I S S V S S I H A E
I S S V S S I H V 缺失
I S S V S S I H V E
 
30 31 35 50 53 58 69 81 87 98
I S S V S S V Q A 缺失
I S S V S S V Q A E
I S S V S S V Q V 缺失
I S S V S S V Q V E
I S S V S S V H A 缺失
I S S V S S V H A E
I S S V S S V H V 缺失
I S S V S S V H V E
I S S V T Y I Q A 缺失
I S S V T Y I Q A E
I S S V T Y I Q V 缺失
I S S V T Y I Q V E
I S S V T Y I H A 缺失
I S S V T Y I H A E
I S S V T Y I H V 缺失
I S S V T Y I H V E
I S S V T Y V Q A 缺失
I S S V T Y V Q A E
I S S V T Y V Q V 缺失
I S S V T Y V Q V E
I S S V T Y V H A 缺失
I S S V T Y V H A E
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I S S V T S I Q A 缺失
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I S S V T S V H A E
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I S S I S Y I Q A E
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I S S I S Y I Q V E
 
30 31 35 50 53 58 69 81 87 98
I S S I S Y I H A 缺失
I S S I S Y I H A E
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I S S I S Y I H V E
I S S I S Y V Q A 缺失
I S S I S Y V Q A E
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I S S I T Y V Q A 缺失
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I S S I T S I Q A 缺失
I S S I T S I Q A E
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I S S I T S I Q V E
I S S I T S I H A 缺失
I S S I T S I H A E
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I S N V S S V H A 缺失
I S N V S S V H A E
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I S N V S S V H V E
I S N V T Y I Q A 缺失
I S N V T Y I Q A E
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I S N V T Y I H A 缺失
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30 31 35 50 53 58 69 81 87 98
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I T S V T S I Q A E
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I T S V T S I H V E
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I T S V T S V Q A E
I T S V T S V Q V 缺失
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I T S I S Y I Q A 缺失
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I T S I S Y I Q V 缺失
I T S I S Y I Q V E
I T S I S Y I H A 缺失
I T S I S Y I H A E
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I T S I S Y I H V E
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I T S I S Y V Q A E
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I T S I S Y V Q V E
 
30 31 35 50 53 58 69 81 87 98
I T S I S Y V H A 缺失
I T S I S Y V H A E
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I T S I S Y V H V E
I T S I S S I Q A 缺失
I T S I S S I Q A E
I T S I S S I Q V 缺失
I T S I S S I Q V E
I T S I S S I H A 缺失
I T S I S S I H A E
I T S I S S I H V 缺失
I T S I S S I H V E
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I T S I S S V Q A E
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I T S I T Y I Q V E
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30 31 35 50 53 58 69 81 87 98
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I T S I T S V Q A E
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I T S I T S V H A E
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I T N V S Y I Q A 缺失
I T N V S Y I Q A E
I T N V S Y I Q V 缺失
I T N V S Y I Q V E
I T N V S Y I H A 缺失
I T N V S Y I H A E
I T N V S Y I H V 缺失
I T N V S Y I H V E
I T N V S Y V Q A 缺失
I T N V S Y V Q A E
I T N V S Y V Q V 缺失
I T N V S Y V Q V E
I T N V S Y V H A 缺失
I T N V S Y V H A E
I T N V S Y V H V 缺失
I T N V S Y V H V E
I T N V S S I Q A 缺失
I T N V S S I Q A E
I T N V S S I Q V 缺失
I T N V S S I Q V E
I T N V S S I H A 缺失
I T N V S S I H A E
I T N V S S I H V 缺失
I T N V S S I H V E
I T N V S S V Q A 缺失
I T N V S S V Q A E
I T N V S S V Q V 缺失
I T N V S S V Q V E
I T N V S S V H A 缺失
I T N V S S V H A E
I T N V S S V H V 缺失
I T N V S S V H V E
I T N V T Y I Q A 缺失
I T N V T Y I Q A E
I T N V T Y I Q V 缺失
I T N V T Y I Q V E
 
30 31 35 50 53 58 69 81 87 98
I T N V T Y I H A 缺失
I T N V T Y I H A E
I T N V T Y I H V 缺失
I T N V T Y I H V E
I T N V T Y V Q A 缺失
I T N V T Y V Q A E
I T N V T Y V Q V 缺失
I T N V T Y V Q V E
I T N V T Y V H A 缺失
I T N V T Y V H A E
I T N V T Y V H V 缺失
I T N V T Y V H V E
I T N V T S I Q A 缺失
I T N V T S I Q A E
I T N V T S I Q V 缺失
I T N V T S I Q V E
I T N V T S I H A 缺失
I T N V T S I H A E
I T N V T S I H V 缺失
I T N V T S I H V E
I T N V T S V Q A 缺失
I T N V T S V Q A E
I T N V T S V Q V 缺失
I T N V T S V Q V E
I T N V T S V H A 缺失
I T N V T S V H A E
I T N V T S V H V 缺失
I T N V T S V H V E
I T N I S Y I Q A 缺失
I T N I S Y I Q A E
I T N I S Y I Q V 缺失
I T N I S Y I Q V E
I T N I S Y I H A 缺失
I T N I S Y I H A E
I T N I S Y I H V 缺失
I T N I S Y I H V E
I T N I S Y V Q A 缺失
I T N I S Y V Q A E
I T N I S Y V Q V 缺失
I T N I S Y V Q V E
I T N I S Y V H A 缺失
I T N I S Y V H A E
I T N I S Y V H V 缺失
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I T N I S S I Q V E
I T N I S S I H A 缺失
I T N I S S I H A E
I T N I S S I H V 缺失
I T N I S S I H V E
I T N I S S V Q A 缺失
I T N I S S V Q A E
I T N I S S V Q V 缺失
I T N I S S V Q V E
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I T N I S S V H A E
I T N I S S V H V 缺失
I T N I S S V H V E
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I T N I T Y I Q A E
I T N I T Y I Q V 缺失
I T N I T Y I Q V E
I T N I T Y I H A 缺失
I T N I T Y I H A E
I T N I T Y I H V 缺失
I T N I T Y I H V E
I T N I T Y V Q A 缺失
I T N I T Y V Q A E
I T N I T Y V Q V 缺失
I T N I T Y V Q V E
I T N I T Y V H A 缺失
I T N I T Y V H A E
I T N I T Y V H V 缺失
I T N I T Y V H V E
I T N I T S I Q A 缺失
I T N I T S I Q A E
I T N I T S I Q V 缺失
I T N I T S I Q V E
I T N I T S I H A 缺失
I T N I T S I H A E
I T N I T S I H V 缺失
I T N I T S I H V E
I T N I T S V Q A 缺失
I T N I T S V Q A E
I T N I T S V Q V 缺失
I T N I T S V Q V E
 
30 31 35 50 53 58 69 81 87 98
I T N I T S V H A 缺失
I T N I T S V H A E
I T N I T S V H V 缺失
I T N I T S V H V E
表16.mAb 4.18.1轻链(SEQ ID NO：52)在所示残基编号上相对于种系的示范性突变
 
7 13 32 39 55 58 65 92
S V N K A I S N
S V N K A I S G
S V N K A I I N
S V N K A I I G
S V N K A F S N
S V N K A F S G
S V N K A F I N
S V N K A F I G
S V N K S I S N
S V N K S I S G
S V N K S I I N
S V N K S I I G
S V N K S F S N
S V N K S F S G
S V N K S F I N
S V N K S F I G
S V N T A I S N
S V N T A I S G
S V N T A I I N
S V N T A I I G
S V N T A F S N
S V N T A F S G
S V N T A F I N
S V N T A F I G
S V N T S I S N
S V N T S I S G
S V N T S I I N
S V N T S I I G
S V N T S F S N
S V N T S F S G
S V N T S F I N
S V N T S F I G
S V S K A I S N
S V S K A I S G
S V S K A I I N
S V S K A I I G
S V S K A F S N
S V S K A F S G
S V S K A F I N
S V S K A F I G
S V S K S I S N
 
7 13 32 39 55 58 65 92
S V S K S I S G
S V S K S I I N
S V S K S I I G
S V S K S F S N
S V S K S F S G
S V S K S F I N
S V S K S F I G
S V S T A I S N
S V S T A I S G
S V S T A I I N
S V S T A I I G
S V S T A F S N
S V S T A F S G
S V S T A F I N
S V S T A F I G
S V S T S I S N
S V S T S I S G
S V S T S I I N
S V S T S I I G
S V S T S F S N
S V S T S F S G
S V S T S F I N
S V S T S F I G
S M N K A I S N
S M N K A I S G
S M N K A I I N
S M N K A I I G
S M N K A F S N
S M N K A F S G
S M N K A F I N
S M N K A F I G
S M N K S I S N
S M N K S I S G
S M N K S I I N
S M N K S I I G
S M N K S F S N
S M N K S F S G
S M N K S F I N
S M N K S F I G
S M N T A I S N
S M N T A I S G
S M N T A I I N
S M N T A I I G
S M N T A F S N
 
7 13 32 39 55 58 65 92
S M N T A F S G
S M N T A F I N
S M N T A F I G
S M N T S I S N
S M N T S I S G
S M N T S I I N
S M N T S I I G
S M N T S F S N
S M N T S F S G
S M N T S F I N
S M N T S F I G
S M S K A I S N
S M S K A I S G
S M S K A I I N
S M S K A I I G
S M S K A F S N
S M S K A F S G
S M S K A F I N
S M S K A F I G
S M S K S I S N
S M S K S I S G
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S M S K S F I N
S M S K S F I G
S M S T A I S N
S M S T A I S G
S M S T A I I N
S M S T A I I G
S M S T A F S N
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S M S T S I S N
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S M S T S I I N
S M S T S I I G
S M S T S F S N
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S M S T S F I N
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F V N K A I S N
 
7 13 32 39 55 58 65 92
F V N K A I S G
F V N K A I I N
F V N K A I I G
F V N K A F S N
F V N K A F S G
F V N K A F I N
F V N K A F I G
F V N K S I S N
F V N K S I S G
F V N K S I I N
F V N K S I I G
F V N K S F S N
F V N K S F S G
F V N K S F I N
F V N K S F I G
F V N T A I S N
F V N T A I S G
F V N T A I I N
F V N T A I I G
F V N T A F S N
F V N T A F S G
F V N T A F I N
F V N T A F I G
F V N T S I S N
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表17.mAb 4.18.1重链(SEQ ID NO：50)在所示残基编号上相对于种系的示范性突变
 
30 31 35 53 75 98-99 103 117
 
30 31 35 53 75 98-99 103 117
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30 31 35 53 75 98-99 103 117
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Figure G2007800215957D01071
Figure G2007800215957D01091
Figure G2007800215957D01101
实施例16
uPAR结合表位的鉴定
由于抗uPAR抗体不与小鼠uPAR发生交叉反应，因此我们产生了许多小鼠uPAR-人uPAR嵌合蛋白以便鉴定在抗体结合中所涉及的结构域。在HEK293T细胞中表达作为分泌蛋白的嵌合人-鼠uPAR，其包括鼠D1/人D2D3；鼠D1/人D2/MuD3；以及人D1D2/鼠D3uPAR，其中每个都具有C末端组氨酸标签。通过培养物上清液的蛋白质印迹确定2.6.1、2.19.2和4.18.1的结合位点；通过使用抗His mAb的检测证明适当的重组蛋白的表达。2.19.2的结合表位位于结构域I，2.6.1主要与结构域II/III内的表位相互作用，且4.18.1与结构域II中的表位相互作用(见图6)。
在下面的表20中阐述了编码用于表位装箱(binning)的蛋白质的核苷酸序列以及所翻译的氨基酸序列。
表20.用于表位装箱(binning)的核苷酸和氨基酸序列
 
uPAR ECD嵌合体 序列 SEQ ID NO：
鼠D1/人D2D3 核苷酸序列 SEQ ID NO：83
氨基酸序列 SEQ ID NO：84
人D1D2/鼠D3 核苷酸序列 SEQ ID NO：85
氨基酸序列 SEQ ID NO：86
鼠D1/人D2/鼠D3 核苷酸序列 SEQ ID NO：87
氨基酸序列 SEQ ID NO：88
鼠D1D2/人D3 核苷酸序列 SEQ ID NO：89
氨基酸序列 SEQ ID NO：90
实施例17
体内肿瘤生长和转移的抑制
在培养物中培养稳定地表达GFP的MDA MB231细胞(MDA MB231-GFP细胞)并在85％汇合时收获。将溶于生理盐水/20％MatrigelTM的总共5x105个肿瘤细胞接种到雌性Balb/c nu/nu小鼠的乳房脂肪垫内。移植后三天，小鼠接受下列物质：对照非特异性同种型匹配的(matrched)IgG4；阿霉素Rx，每公斤5mg，腹膜内(i.p.)，每周一次，持续两周；在实验持续期间每只小鼠每周一次腹膜内对照或抗人uPAR mAb 0.5mg。使用卡尺每周测量一次肿瘤生长并且根据式(a x b2/2)计算肿瘤体积，其中a是长直径的长度，b是垂直小直径的宽度(图7)。未处理的对照肿瘤生长(图7中未显示)与IgG4同种型对照相比，没有显著不同。
在研究结束时，将原发肿瘤固定，取下对照和实验动物的肺、肝和脾用于进一步分析。使用标准免疫组织化学技术将组织切片对下列蛋白质进行染色：Ki67；CD31；MAPK；磷酸-MAPK；FAK；磷酸-FAK。使用BioQuant图像分析软件测量染色强度，并且记录每个治疗组6个动物的数据(图8)。
类似地处理肺、肝和脾组织并且通过荧光显微镜术鉴定肿瘤细胞以及记录转移的数目(图9)。
如图7-9所示，抗uPAR抗体抑制原发肿瘤生长并且显著抑制转移到远处器官的发生率。原发肿瘤的免疫组织化学检查显示对增殖标记Ki67没有作用，但是与对照相比，在pMAPK和pFAK水平上有一致的抑制。出乎意料地，尽管不存在抗体与鼠uPAR的交叉反应性，但是CD31染色在染色强度上也显示有些降低，由于局部肿瘤相关的uPA活性，该机理被假定是间接的。
实施例18
免疫组织化学
在冷冻细胞沉淀和正常人组织微阵列(TriStar TechnologyGroup)上，连同IgG4同种型对照抗体一起，评估2.6.1、2.19.2和4.18.1的结合概况。在研究中，American Diagnostica Inc.，(Cat#：3936，Lot#：041223)的小鼠抗uPAR是阳性对照Ab。使用0-3+等级(±表示不明确的染色；1+表示弱染色；2+表示中等染色；3+表示强染色)，通过肉眼估计染色强度。PC3人前列腺癌的冷冻细胞沉淀和U937人组织细胞淋巴瘤U937细胞沉淀用作阳性对照，且观察两者的膜和细胞质的染色(见表21)。如果观察到背景被阴性对照抗体染色，或者染色是在不被阴性对照抗体染色的检验组织内的细胞中，那么当染色强于背景和/或可从背景中区分时，仅报道阳性染色(见下表23)。
表21.细胞沉淀中的染色强度
 
Abs IgG4对照 2.6.1 2.19.2 4.18.1
PC-3 - 2+ ± 3+
U937 - 2+ 2+ 1+
对于人组织微阵列的染色，将2.6.1、2.19.2和4.18.1与生物素缀合，重新评估与U937细胞的结合(见下面的表22)，然后用于组织微阵列染色。
表22.细胞沉淀中使用生物素缀合的mAb的染色强度
 
Abs IgG4对照 2.6.1 2.19.2 4.18.1
U937 - 2+ 2+ 2+
将组织微阵列用20μg/ml浓度的生物素缀合的抗体染色。结果显示于表23中。其中所示的c为细胞质染色模式，且m为膜染色模式。
表23 组织微阵列染色模式
 
组织类型 2.6.120ug 2.19.220ug 418.120ug
肝 炎症细胞3+(c) 炎症细胞3+(c) 炎症细胞2+(m，c)
肝 炎症细胞3+(c) 炎症细胞3+(c) 炎症细胞2+(m，c)
肝 炎症细胞3+(c) 炎症细胞2+(c) 炎症细胞1+(c)
肝 炎症细胞2+(c)，基质+ 炎症细胞1+(c)，基质+ 炎症细胞1+(c)
肝 炎症细胞3+(c) 炎症细胞2+(c) 炎症细胞1+(c)
肝 炎症细胞3+(c) 炎症细胞2+(c) 炎症细胞1+(c)
胰 腺泡细胞2+(c) 腺泡细胞2+(c) 腺泡细胞1+(c)
胰 腺泡细胞3+(c) 腺泡细胞2+(c) 腺泡细胞1+(c)
 
胰 腺泡细胞2+(c) 腺泡细胞2+(c) 腺泡细胞1+(c)
胰 腺泡细胞1+(c) 腺泡细胞2+(c) 腺泡细胞1+(c)
胰 腺泡细胞1+(c) 成纤维细胞1+(c) 炎症细胞2+(c)
胰 腺泡细胞1+(c) 腺泡细胞1+(c) 炎症细胞1+(c)
结肠粘膜 上皮1+ 阴性 炎症细胞2+(c)
结肠粘膜 上皮1+ 上皮1+(c) 炎症细胞2+(m，c)
结肠粘膜 阴性 阴性 阴性
结肠粘膜 上皮1+ 炎症细胞1+(c) 炎症细胞2+(m，c)
结肠粘膜 上皮1+ 上皮1+(c) 上皮1+(c)，炎症细胞1+(c)              
结肠粘膜 上皮1+ 上皮1+(c) 上皮1+(c)，炎症细胞1+(c)              
结肠肌层 阴性 阴性 炎症细胞1+(c)
结肠肌层 淋巴细胞1+(c) 阴性 炎症细胞1+(c)
结肠肌层 阴性 炎症细胞1+(c) 阴性
结肠肌层 阴性 神经1+ 阴性
结肠肌层 阴性 炎症细胞1+(c) 炎症细胞1+(c)
结肠肌层 神经1+ 神经1+ 阴性
肾皮质 阴性 阴性 阴性
肾皮质 阴性 阴性 阴性
肾皮质 肾小球1+(c) 肾小球1+(c) 肾小球1+(c)
肾皮质 肾小球1+(c) 肾小球1+(c) 肾小球1+(c)
肾皮质 肾小球1+(c) 阴性 炎症细胞1+(c)
肾皮质 肾小球1+(c) 炎症细胞1+(c) 炎症细胞1+(c)
肾髓质 阴性 阴性 阴性
肾髓质 阴性 炎症细胞1+(c) 炎症细胞1+(c)
肾髓质 阴性 阴性 阴性
肾髓质 阴性 阴性 阴性
肾髓质 阴性 阴性 阴性
肾髓质 阴性 阴性 炎症细胞1+(c)
 
肺泡 上皮2+(m) 上皮2+(m，c) 上皮1+(m，c)，炎症细胞1+(c)             
肺泡 上皮3+(m，c) 上皮3+(m，c) 上皮2+(m，c)，炎症细胞2+(c)             
肺泡 上皮3+(m，c) 上皮3+(m，c) 上皮2+(m，c)，炎症细胞2+(c)             
肺支气管 上皮1+(c)
肺支气管 阴性 阴性
肺支气管 上皮1+(c) 上皮1+(c) 炎症细胞1+(c)
肺支气管 非特异性染色 炎症细胞2+(c) 炎症细胞1+(c)
肺支气管 上皮1+(c) 炎症细胞2+(c) 炎症细胞1+(c)
淋巴结 淋巴细胞3+(m.c) 淋巴细胞2+(m.c) 淋巴细胞1+(m.c)
淋巴结 淋巴细胞3+(m.c) 淋巴细胞3+(m.c) 淋巴细胞1+(m.c)
淋巴结 淋巴细胞2+(m.c) 淋巴细胞2+(m.c) 淋巴细胞1+(m.c)
淋巴结 淋巴细胞2+(m.c) 淋巴细胞2+(m.c) 淋巴细胞1+(m.c)
淋巴结 淋巴细胞2+(m.c) 淋巴细胞3+(m.c) 淋巴细胞1+(m.c)
心 阴性 阴性 阴性
心 阴性 阴性 炎症细胞1+(c)
心 阴性 阴性 炎症细胞1+(c)
心 阴性 阴性 炎症细胞1+(c)
心 阴性 阴性 阴性
实施例19
人类患者中肿瘤细胞生长的抑制
将一组诊断为患有胰癌的人类癌症患者随机分到治疗组内。每个患者组用每周一次静脉注射这里所述的mAb 2.6.1、2.19.2或4.18.1进行治疗。每个患者用从5mg/kg/周至15mg/kg/周范围的有效量的抗体给药，持续4-8个月。对照组仅给予标准化疗方案。
在治疗方案的期间和之后的定期时间，通过磁共振成像(MRI)评估肿瘤负荷。发现与不接受抗体治疗的患者相比，接受每周一次用mAb 2.6.1、2.19.2或4.18.1的抗体治疗的患者显示肿瘤大小显著减小、进展时间延迟或者延长生存。在一些治疗的患者中，肿瘤不再可检测到。相反，在对照组中，肿瘤大小增加或者仍然基本上为原样。
实施例20
人类患者中肿瘤细胞生长的抑制
将一组诊断为患有甲状腺癌的人类癌症患者随机分入治疗组内。每个患者组用每三周一次(3-weekly)静脉注射这里所述的mAb2.6.1、2.19.2或4.18.1和吉西他滨治疗。每个患者用从5mg/kg/周至15mg/kg/周范围的有效量的抗体给药，持续4-8个月，以及有效治疗剂量的吉西他滨。对照组仅给予标准化疗方案。在治疗方案的期间和之后的定期时间，通过磁共振成像(MRI)评估肿瘤负荷。发现与不接受抗体和吉西他滨治疗的患者相比，接受每三周一次用mAb 2.6.1、2.19.2或4.18.1和吉西他滨的抗体治疗的患者显示肿瘤大小显著减小、进展时间延迟或者延长生存。在一些治疗的患者中，肿瘤不再可检测到。相反，在对照组中，肿瘤大小增加或者仍然基本上为原样。
实施例21
人类患者中肿瘤转移的抑制
将一组诊断为患有非小细胞肺癌的人类癌症患者随机分到治疗组内。除了标准化疗方案外，每个患者组用每周一次静脉注射这里所述的mAb 2.6.1、2.19.2或4.18.1进行治疗。每个患者用从5mg/kg/周至15mg/kg/周范围的有效量的抗体给药，持续2-8个月。对照组仅给予标准化疗方案。
在治疗方案的期间和之后的定期时间，通过正电子发射体层摄影术(PET)评估转移病灶。发现与不接受抗体治疗的患者相比，接受每周一次用mAb 2.6.1、2.19.2或4.18.1的抗体治疗的患者显示在转移病灶的数目和大小上显著减小。
实施例22
人类患者中雌激素受体阳性乳腺癌的治疗
成年女性被诊断为患有雌激素受体阳性乳腺癌。在2-8个月时间段中，对该患者每2周用静脉注射mAb 2.19.2和抗激素剂进行治疗。结果，该患者无肿瘤进展存活延长。
实施例23
人类患者中HER2阳性乳腺癌的治疗
成年女性被诊断为患有HER2阳性乳腺癌。在2-8个月时间段中，对该患者每周用静脉注射mAb 2.19.2和抗her2剂进行治疗。结果，该患者肿瘤大小显著减少。
实施例24
人类患者中表达EGFR的肺癌的治疗
成年男性被诊断为患有表达EGFR的肺癌。在2-8个月时间段中，对该患者每周一次用静脉注射mAb 2.19.2和受体酪氨酸激酶抑制剂进行治疗。结果，该患者肿瘤进展时间显著延迟。
实施例25
人类患者中关节炎的治疗
成年男性被诊断为患有严重的关节炎。在3周时间段中，对该患者每2周用静脉注射mAb 2.19.2进行治疗。结果，该患者关节炎症状显著减少。
实施例27
人类患者中动脉粥样硬化的治疗
成年男性被诊断为患有动脉粥样硬化。在1年时间段中，对该患者每隔一周用静脉注射mAb 4.18.1进行治疗。结果，该患者动脉粥样硬化的症状，如心绞痛减少。
引入作为参考
将这里所引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、文章、教科书等等，以及其中所引用的参考文献，在它们不已经引入的程度上(to the extent that they are not already)，在这里以其整体引入作为参考。
等同方案
认为前面所写的说明书足以使本领域的技术人员能够实施本发明。前面的描述和实施例详细描述了本发明的某些优选的实施方案并且描述了本发明人所预期的最佳方式。然而，将会意识到，无论在正文中前面的描述怎样详细，都可以以许多方式实施本发明并且将根据所附的权利要求和其任何等同方案解释本发明。
序列表
<110>Zhou，Qing
     Emery，Stephen Charles
     Paul Elvin
<120>针对uPAR的定向结合剂及其用途
<130>ABXAZ.005A
<140>Unknown
<141>
<150>60/790642
<151>2006-04-10
<160>90
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>384
<212>DNA
<213>人
<400>1
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<210>2
<211>128
<212>PRT
<213>人
<400>2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ala Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys
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65                  70                  75                  80
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                85                  90                  95
Arg Glu Gly Asp Tyr Ser Asn Tyr Phe Thr Met Val Arg Gly Val Thr
            100                 105                 110
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<210>3
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<212>DNA
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Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ala Lys Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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acttactact actactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360
tca                                                               363
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<400>6
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Pro Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Gln Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Met Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly
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<210>8
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<212>PRT
<213>人
<400>8
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Lys
            20                  25                  30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Ala Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys
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<212>DNA
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<210>12
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<400>12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Lys Tyr
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Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
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Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Arg Ser Asn
            20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Ser Val Ile Tyr Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Glu Gly Ala Val Ala Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>15
<211>321
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<400>15
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gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tatactaact ggcctctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a                                           321
<210>16
<211>107
<212>PRT
<213>人
<400>16
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
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                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>17
<211>351
<212>DNA
<213>人
<400>17
gaggtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttgctccagc ctggggggtc cctgagactc  60
tcctgtgcag cctctgggtt caccgtcaga aacaattaca tgaactgggt ccgccaggct  120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt atttataccg gtggtagcac atactacgca  180
gactccgtga agggccgctt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctt  240
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agaggggaag  300
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<211>117
<212>PRT
<213>人
<400>18
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Arg Asn Asn
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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
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Glu Glu Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu
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<210>21
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ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatcta 300
gcagctctct actactacta cggtatgcac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360
tcctca                                                        366
<210>22
<211>122
<212>PRT
<213>人
<400>22
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Leu Ala Ala Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met His Val Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
    115                 120
<210>23
<211>321
<212>DNA
<213>人
<400>23
gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagttttagc agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag aataataact ggcctcggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a                                           321
<210>24
<211>107
<212>PRT
<213>人
<400>24
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Phe Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Arg
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>25
<211>359
<212>DNA
<213>人
<400>25
gaggtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctgggtt caccgtcatt accaactaca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccaggaaagg ggctggagtg ggtctcaatt atttataccg gtggtagcac atcctacgca 180
gactccgtga agggccgatt caccgtctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctt 240
cacatgaaca gcctgagagt cgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agagatagca 300
gtggctggct actacggtat ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctc  359
<210>26
<211>119
<212>PRT
<213>人
<400>26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ile Thr Asn
            20                  25                  30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ile Ile Tyr Thr Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
His Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Glu Ile Ala Val Ala Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
        115
<210>27
<211>321
<212>DNA
<213>人
<400>27
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatagtt acccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaggg tggagatcaa a                                           321
<210>28
<211>107
<212>PRT
<213>人
<400>28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
 1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
            20                  25                  30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>29
<211>365
<212>DNA
<213>人
<400>29
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatcag 300
catattgtgg tggtgactgc tattcttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcctc                                                             365
<210>30
<211>122
<212>PRT
<213>人
<400>30
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Gln His Ile Val Val Val Thr Ala Ile Leu Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>31
<211>341
<212>DNA
<213>人
<400>31
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctgtctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tatggctcca acaataggaa ctccttggct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctccc aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttatagtatt 300
tttccgtgga cgttcggcca agggaccaag gtggaaatca a                     341
<210>32
<211>114
<212>PRT
<213>人
<400>32
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Gly
            20                  25                  30
Ser Asn Asn Arg Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
                85                  90                  95
Tyr Tyr Ser Ile Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
            100                 105                 110
Ile Lys
<210>33
<211>377
<212>DNA
<213>人
<400>33
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacttttagt agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaagcaac atggaagtga gaaatactat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaggag 300
gcttattatt atgataatag tggttactac tggtacttcg atctctgggc tcgtggcacc 360
ctggtcactg tctcctc                                          377
<210>34
<211>126
<212>PRT
<213>人
<400>34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Asn Ile Lys Gln His Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Glu Ala Tyr Tyr Tyr Asp Asn Ser Gly Tyr Tyr Trp Tyr
            100                 105                 110
Phe Asp Leu Trp Ala Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>35
<211>322
<212>DNA
<213>人
<400>35
gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctataggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaaaccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tacaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctgacagtt tcccgtggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa ac                                          322
<210>36
<211>107
<212>PRT
<213>人
<400>36
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Ile Gly
 1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>37
<211>372
<212>DNA
<213>人
<400>37
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtc actactggag ctggatccgc 120
cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagaacctac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagat 300
ggggggactg gggattacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct ca                                                     372
<210>38
<211>123
<212>PRT
<213>人
<400>38
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
 1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
            20                  25                  30
Gly His Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr AlaAla Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Asp Gly Thr Gly Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>39
<211>338
<212>DNA
<213>人
<400>39
gacatcgtga tgacccagtc tccaacctcc ctgactgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataggaa cttcttagct 120
tggtaccagc agaaaccaag acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttatactact 300
ccgctcactt tcggcggagg gaccaaggtg gagatcaa                         338
<210>40
<211>113
<212>PRT
<213>人
<400>40
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
            20                  25                  30
Ser Asn Asn Arg Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Gln
        35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
                85                  90                  95
Tyr Tyr Thr Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
            100                 105                 110
Lys
<210>41
<211>369
<212>DNA
<213>人
<400>41
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggacgg ggctggattg ggtggccaac ataaaccaag atggaagtga gagatactat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcaccgcat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgttt attactgtgc gagagaggga 300
agcggtggca ggtacggagg ctggtacttc gatctctggg gccgtggcac cctggtcact 360
gtctcctca                                                         369
<210>42
<211>123
<212>PRT
<213>人
<400>42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Thr Gly Leu Asp Trp Val
        35                  40                  45
Ala Asn Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Arg Tyr Tyr Val Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Pro His
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Ser Gly Gly Arg Tyr Gly Gly Trp Tyr Phe Asp Leu
            100                 105                 110
Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>43
<211>342
<212>DNA
<213>人
<400>43
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagttcca acaataagaa cttcttagct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagtc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttatagtact 300
cctccgatca ccttcggcca agggacacga ctggagatta aa                    342
<210>44
<211>114
<212>PRT
<213>人
<400>44
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
            20                  25                  30
Ser Asn Asn Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
                85                  90                  95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu
            100                 105                 110
Ile Lys
<210>45
<211>366
<212>DNA
<213>人
<400>45
gaggtgcagt tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtcttaggt attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatggc 300
tacggtgact acgtaggctg gtatttcgat ctctggggcc gtggcaccct ggtcactgtc 360
tcctca                                                            366
<210>46
<211>122
<212>PRT
<213>人
<400>46
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Leu Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Asp Gly Tyr Gly Asp Tyr Val Gly Trp Tyr Phe Asp Leu Trp
            100                 105                 110
Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>47
<211>339
<212>DNA
<213>人
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gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa cttcttagct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctactca tttactgggc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcaacc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcaacaatt ttatagtact 300
cctccgacgt tcggccaagg gaccaaggtg gagatcaga                        339
<210>48
<211>113
<212>PRT
<213>人
<400>48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
            20                  25                  30
Ser Asn Asn Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Asn Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
                85                  90                  95
Phe Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val GluIle
            100                 105                 110
Arg
<210>49
<211>351
<212>DNA
<213>人
<400>49
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ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt atttataccg gtggtagcac atactacgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaggaacac gctgtatctt 240
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agaaggggca 300
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<210>50
<211>117
<212>PRT
<213>人
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Arg Asn Asn
            20                  25                  30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Val Ile Tyr Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Glu Gly Ala Val Ala Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Leu
        115
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<212>DNA
<213>人
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<210>52
<211>107
<212>PRT
<213>人
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Glu Ile Val Met Thr Gln Phe Pro Ala Thr Leu Ser Met Ser Pro Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ser Thr Gly Phe Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ile Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Asn Trp Pro Leu
            85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
        100                 105
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<211>351
<212>DNA
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tcctgtgcag cctctgggtt ctccgtcagt agcaactaca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt atttataccg gtggtagcac atactacgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac cctgtatctt 240
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgag agatacttac 300
ctctacggta tggacgtctg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc a          351
<210>54
<211>117
<212>PRT
<213>人
<400>54
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Val Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Val Ile Tyr Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Asp Thr Tyr Leu Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
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<211>321
<212>DNA
<213>人
<400>55
gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagcgccacc 60
ctctcctgca ggaccagtca gagtgttagc agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120
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aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tattataact ggcctctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a                                           321
<210>56
<211>107
<212>PRT
<213>人
<400>56
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
 1               5                  10                  15
Glu Ser Ala Thr Leu Ser Cys Arg Thr Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Thr Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Gly Ala Ser Ala Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Trp Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>57
<211>366
<212>DNA
<213>人
<400>57
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaagactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatatg 300
atagtagtgg ttattactta tgcttttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360
tcttca                                                            366
<210>58
<211>122
<212>PRT
<213>人
<400>58
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Met Ile Val Val Val Ile Thr Tyr Ala Phe Asp Ile Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
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<213>人
<400>59
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttagct 120
tggtaccagc agaaatcagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttactact gtcagcaata ttataggact 300
cctccgacgt tcggccaagg gaccagggtg gaaatcaaa                        339
<210>60
<211>113
<212>PRT
<213>人
<400>60
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
            20                  25                  30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln
        35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
                85                  90                  95
Tyr Tyr Arg Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Val Glu Ile
            100                 105                 110
Lys
<210>61
<211>113
<212>PRT
<213>人
<400>61
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
            20                  25                  30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
                85                  90                  95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
            100                 105                 110
Lys
<210>62
<211>114
<212>PRT
<213>人
<400>62
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
            20                  25                  30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
                85                  90                  95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu
            100                 105                 110
Ile Lys
<210>63
<211>107
<212>PRT
<213>人
<400>63
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
 1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>64
<211>107
<212>PRT
<213>人
<400>64
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Arg
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>65
<211>107
<212>PRT
<213>人
<400>65
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>66
<211>107
<212>PRT
<213>人
<400>66
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>67
<211>105
<212>PRT
<213>人
<400>67
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
 1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
            20                  25                  30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Thr Phe
                85                  90                  95
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>68
<211>111
<212>PRT
<213>人
<400>68
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
            20                  25                  30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
                85                  90                  95
Tyr Tyr Ser Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>69
<211>107
<212>PRT
<213>人
<400>69
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
 1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>70
<211>124
<212>PRT
<213>人
<400>70
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
 1               5              10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Asp Tyr Ser Asn Tyr Thr Met Val Arg Gly Val Tyr Gly Met Asp
            100                 105                 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>71
<211>118
<212>PRT
<213>人
<400>71
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Tyr Gly Asp Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>72
<211>121
<212>PRT
<213>人
<400>72
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Met Ile Val Val Val Ile Thr Ala Phe Asp Ile Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>73
<211>118
<212>PRT
<213>人
<400>73
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>74
<211>114
<212>PRT
<213>人
<400>74
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe ThrIle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Ala Val Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
            100                 105                 110
Ser Ser
<210>75
<211>112
<212>PRT
<213>人
<400>75
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
            100                 105                 110
<210>76
<211>117
<212>PRT
<213>人
<400>76
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Trp Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>77
<211>120
<212>PRT
<213>人
<400>77
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Ile Val Val Val Thr Ala Ile Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>78
<211>118
<212>PRT
<213>人
<400>78
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Ile Ala Val Ala Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Thr Val Thr Val Ser
        115
<210>79
<211>123
<212>PRT
<213>人
<400>79
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu
            100                 105                 110
Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>80
<211>119
<212>PRT
<213>人
<400>80
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
 1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
            20                  25                  30
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>81
<211>990
<212>DNA
<213>食蟹猴
<400>81
atgggtcacc cgctgctgct gccactgctg ctgctgctcc acacctgcgt cccagcctct 60
tggggcctgc ggtgcatgca gtgtaagagc aacggggatt gccgggtgga agagtgcgcc 120
ctaggacagg acctctgcag gaccacgatc gtgcgcatgt gggaagaagg ggaagagctg 180
gagctggtgg agaaaagctg tacccactca gagaagacca acaggaccat gagctatcgg 240
actggcttga agatcaccag ccttaccgag gttgtgtgtg ggttagactt gtgcaaccag 300
ggcaactctg gccgggctgt caccttttcc cgaagccgtt accttgaatg catttcctgt 360
ggctcatcag acatgagctg tgagaggggc cggcaccaga gcctgcaatg ccgcagccct 420
gaagaacagt gcctggacgt ggtgacccac tggatccagg agggtgaaga agggcgtcca 480
aaggatgacc gccacctccg aggctgtggc taccttccca gctgcccagg ctccagtggt 540
ttccacaaca acgacacctt ccacttcctg aagtgttgca acaccaccaa atgcaacgag 600
ggcccaatcc tggagcttga aaatctgcca cagaatggcc accagtgtta cagctgcaag 660
gggaacagca cccatggatg ctcctctgaa gagactttcc tcattgactg ccgaggcccc 720
atgaatcaat gtctggtagc caccggcact tacgaaccga aaaaccaaag ctatatggta 780
agaggctgtg taactgcctc aatgtgccaa cgtgcccacc tgggtgacgc cttcagcatg 840
caccacatca atgtctcctg ctgtactgaa agtggctgta accacccaga cctggatatc 900
cagtaccgcg ctcgaggagg gcccgaacaa aaactcatct cagaagagga tctgaatagc 960
gccgtcgacc atcatcatca tcatcattga                                  990
<210>82
<211>329
<212>PRT
<213>食蟹猴
<400>82
Met Gly His Pro Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu His Thr Cys
 1               5                  10                  15
Val Pro Ala Ser Trp Gly Leu Arg Cys Met Gln Cys Lys Ser Asn Gly
            20                  25                  30
Asp Cys Arg Val Glu Glu Cys Ala Leu Gly Gln Asp Leu Cys Arg Thr
        35                  40                  45
Thr Ile Val Arg Met Trp Glu Glu Gly Glu Glu Leu Glu Leu Val Glu
    50                  55                  60
Lys Ser Cys Thr His Ser Glu Lys Thr Asn Arg Thr Met Ser Tyr Arg
65                  70                  75                  80
Thr Gly Leu Lys Ile Thr Ser Leu Thr Glu Val Val Cys Gly Leu Asp
                85                  90                  95
Leu Cys Asn Gln Gly Asn Ser Gly Arg Ala Val Thr Phe Ser Arg Ser
            100                 105                 110
Arg Tyr Leu Glu Cys Ile Ser Cys Gly Ser Ser Asp Met Ser Cys Glu
        115                 120                 125
Arg Gly Arg His Gln Ser Leu Gln Cys Arg Ser Pro Glu Glu Gln Cys
    130                 135                 140
Leu Asp Val Val Thr His Trp Ile Gln Glu Gly Glu Glu Gly Arg Pro
145                 150                 155                 160
Lys Asp Asp Arg His Leu Arg Gly Cys Gly Tyr Leu Pro Ser Cys Pro
                165                 170                 175
Gly Ser Ser Gly Phe His Asn Asn Asp Thr Phe His Phe Leu Lys Cys
            180                 185                 190
Cys Asn Thr Thr Lys Cys Asn Glu Gly Pro Ile Leu Glu Leu Glu Asn
        195                 200                 205
Leu Pro Gln Asn Gly His Gln Cys Tyr Ser Cys Lys Gly Asn Ser Thr
    210                 215                 220
His Gly Cys Ser Ser Glu Glu Thr Phe Leu Ile Asp Cys Arg Gly Pro
225                 230                 235                 240
Met Asn Gln Cys Leu Val Ala Thr Gly Thr Tyr Glu Pro Lys Asn Gln
                245                 250                 255
Ser Tyr Met Val Arg Gly Cys Val Thr Ala Ser Met Cys Gln Arg Ala
            260                 265                 270
His Leu Gly Asp Ala Phe Ser Met His His Ile Asn Val Ser Cys Cys
        275                 280                 285
Thr Glu Ser Gly Cys Asn His Pro Asp Leu Asp Ile Gln Tyr Arg Ala
    290                 295                 300
Arg Gly Gly Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser
305                 310                 315                 320
Ala Val Asp His His His His His His
                325
<210>83
<211>996
<212>DNA
<213>嵌合体
<400>83
atgggactcc caaggcggct gctgctgctg ctgttgctgg cgactacctg tgtcccagcc 60
tcccagggcc tgcagtgcat gcagtgtgag agtaaccaga gctgcctggt agaggagtgt 120
gctctgggcc aggacctctg caggactacc gtgcttcggg aatggcaaga tgatagagag 180
ctggaggtgg tgacaagagg ctgtgcccac agcgaaaaga ccaacaggac catgagttac 240
cgcatgggct ccatgatcat cagcctgaca gagaccgtgt gcgccacaaa cctctgcaac 300
aggcccagac ccggagcccg aggccgtgct ttccctcagg gccgttacct cgagtgtatt 360
tcctgtggct catcagacat gagctgtgag aggggccggc accagagcct gcagtgccgc 420
agccctgaag aacagtgcct ggatgtggtg acccactgga tccaggaagg tgaagaaggg 480
cgtccaaagg atgaccgcca cctccgtggc tgtggctacc ttcccggctg cccgggctcc 540
aatggtttcc acaacaacga caccttccac ttcctgaaat gctgcaacac caccaaatgc 600
aacgagggcc caatcctgga gcttgaaaat ctgccgcaga atggccgcca gtgttacagc 660
tgcaagggga acagcaccca tggatgctcc tctgaagaga ctttcctcat tgactgccga 720
ggccccatga atcaatgtct ggtagccacc ggcactcacg aaccgaaaaa ccaaagctat 780
atggtaagag gctgtgcaac cgcctcaatg tgccaacatg cccacctggg tgacgccttc 840
agcatgaacc acattgatgt ctcctgctgt actaaaagtg gctgtaacca cccagacctg 900
gatatccagt accgcgctca aggagggccc gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg 960
aatagcgccg tcgaccatca tcatcatcat cattga                           996
<210>84
<211>331
<212>PRT
<213>嵌合体
<400>84
Met Gly Leu Pro Arg Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Thr Thr
 1               5                  10                  15
Cys Val Pro Ala Ser Gln Gly Leu Gln Cys Met Gln Cys Glu Ser Asn
            20                  25                  30
Gln Ser Cys Leu Val Glu Glu Cys Ala Leu Gly Gln Asp Leu Cys Arg
        35                  40                  45
Thr Thr Val Leu Arg Glu Trp Gln Asp Asp Arg Glu Leu Glu Val Val
    50                  55                  60
Thr Arg Gly Cys Ala His Ser Glu Lys Thr Asn Arg Thr Met Ser Tyr
65                  70                  75                  80
Arg Met Gly Ser Met Ile Ile Ser Leu Thr Glu Thr Val Cys Ala Thr
                85                  90                  95
Asn Leu Cys Asn Arg Pro Arg Pro Gly Ala Arg Gly Arg Ala Phe Pro
            100                 105                 110
Gln Gly Arg Tyr Leu Glu Cys Ile Ser Cys Gly Ser Ser Asp Met Ser
        115                 120                 125
Cys Glu Arg Gly Arg His Gln Ser Leu Gln Cys Arg Ser Pro Glu Glu
    130                 135                 140
Gln Cys Leu Asp Val Val Thr His Trp Ile Gln Glu Gly Glu Glu Gly
145                 150                 155                 160
Arg Pro Lys Asp Asp Arg His Leu Arg Gly Cys Gly Tyr Leu Pro Gly
                165                 170                 175
Cys Pro Gly Ser Asn Gly Phe His Asn Asn Asp Thr Phe His Phe Leu
            180                 185                 190
Lys Cys Cys Asn Thr Thr Lys Cys Asn Glu Gly Pro Ile Leu Glu Leu
        195                 200                 205
Glu Asn Leu Pro Gln Asn Gly Arg Gln Cys Tyr Ser Cys Lys Gly Asn
    210                 215                 220
Ser Thr His Gly Cys Ser Ser Glu Glu Thr Phe Leu Ile Asp Cys Arg
225                 230                 235                 240
Gly Pro Met Asn Gln Cys Leu Val Ala Thr Gly Thr His Glu Pro Lys
                245                 250                 255
Asn Gln Ser Tyr Met Val Arg Gly Cys Ala Thr Ala Ser Met Cys Gln
            260                 265                 270
His Ala His Leu Gly Asp Ala Phe Ser Met Asn His Ile Asp Val Ser
        275                 280                 285
Cys Cys Thr Lys Ser Gly Cys Asn His Pro Asp Leu Asp Ile Gln Tyr
    290                 295                 300
Arg Ala Gln Gly Gly Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
305                 310                 315                 320
Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His
                325                 330
<210>85
<211>972
<212>DNA
<213>嵌合体
<400>85
atgggtcacc cgctgctgct gccgctgctg ctgctgctcc acacctgcgt cccagcctct 60
tggggcctgc ggtgcatgca gtgtaagacc aacggggatt gccgtgtgga agagtgcgcc 120
ctgggacagg acctctgcag gaccacgatc gtgcgcttgt gggaagaagg agaagagctg 180
gagctggtgg agaaaagctg tacccactca gagaagacca acaggaccct gagctatcgg 240
actggcttga agatcaccag ccttaccgag gttgtgtgtg ggttagactt gtgcaaccag 300
ggcaactctg gccgggctgt cacctattcc cgaagccgtt acctcgaatg catttcctgt 360
ggctcatcag acatgagctg tgagaggggc cggcaccaga gcctgcagtg ccgcagccct 420
gaagaacagt gcctggatgt ggtgacccac tggatccagg aaggtgaaga agggcgtcca 480
aaggatgacc gccacctccg tggctgtggc taccttcccg gctgcccggg ctccaatggt 540
ttccacaaca acgacacctt ccacttcctg aaatgctgca acaccaccaa atgcaacgag 600
ggcccaatcc tggagcttga aaatctgccg cagaatggcc gccagtgtta cagctgtgag 660
gggaacaata cccttgggtg ttcctccgaa gaggcgtctc tcatcaactg ccggggacca 720
atgaatcagt gcctggtggc tacaggctta gatgtgctgg gaaaccggag ttataccgta 780
agaggctgcg ccacggcttc ctggtgccaa ggctcccacg tggcagactc cttcccgacc 840
cacctcaacg tctctgtctc ctgctgccac ggcagcggct gtaacagccc cacacgagga 900
gggcccgaac aaaaactcat ctcagaagag gatctgaata gcgccgtcga ccatcatcat 960
catcatcatt ga                                                     972
<210>86
<211>323
<212>PRT
<213>嵌合体
<400>86
Met Gly His Pro Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu His Thr Cys
 1               5                  10                  15
Val Pro Ala Ser Trp Gly Leu Arg Cys Met Gln Cys Lys Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Asp Cys Arg Val Glu Glu Cys Ala Leu Gly Gln Asp Leu Cys Arg Thr
        35                  40                  45
Thr Ile Val Arg Leu Trp Glu Glu Gly Glu Glu Leu Glu Leu Val Glu
    50                  55                  60
Lys Ser Cys Thr His Ser Glu Lys Thr Asn Arg Thr Leu Ser Tyr Arg
65                  70                  75                  80
Thr Gly Leu Lys Ile Thr Ser Leu Thr Glu Val Val Cys Gly Leu Asp
                85                  90                  95
Leu Cys Asn Gln Gly Asn Ser Gly Arg Ala Val Thr Tyr Ser Arg Ser
            100                 105                 110
Arg Tyr Leu Glu Cys Ile Ser Cys Gly Ser Ser Asp Met Ser Cys Glu
        115                 120                 125
Arg Gly Arg His Gln Ser Leu Gln Cys Arg Ser Pro Glu Glu Gln Cys
    130                 135                 140
Leu Asp Val Val Thr His Trp Ile Gln Glu Gly Glu Glu Gly Arg Pro
145                 150                 155                 160
Lys Asp Asp Arg His Leu Arg Gly Cys Gly Tyr Leu Pro Gly Cys Pro
                165                 170                 175
Gly Ser Asn Gly Phe His Asn Asn Asp Thr Phe His Phe Leu Lys Cys
            180                 185                 190
Cys Asn Thr Thr Lys Cys Asn Glu Gly Pro Ile Leu Glu Leu Glu Asn
        195                 200                 205
Leu Pro Gln Asn Gly Arg Gln Cys Tyr Ser Cys Glu Gly Asn Asn Thr
    210                 215                 220
Leu Gly Cys Ser Ser Glu Glu Ala Ser Leu Ile Asn Cys Arg Gly Pro
225                 230                 235                 240
Met Asn Gln Cys Leu Val Ala Thr Gly Leu Asp Val Leu Gly Asn Arg
                245                 250                 255
Ser Tyr Thr Val Arg Gly Cys Ala Thr Ala Ser Trp Cys Gln Gly Ser
            260                 265                 270
His Val Ala Asp Ser Phe Pro Thr His Leu Asn Val Ser Val Ser Cys
        275                 280                 285
Cys His Gly Ser Gly Cys Asn Ser Pro Thr Arg Gly Gly Pro Glu Gln
    290                 295                 300
Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His
305                 310                 315                 320
His His His
<210>87
<211>978
<212>DNA
<213>嵌合体
<400>87
atgggactcc caaggcggct gctgctgctg ctgttgctgg cgactacctg tgtcccagcc 60
tcccagggcc tgcagtgcat gcagtgtgag agtaaccaga gctgcctggt agaggagtgt 120
gctctgggcc aggacctctg caggactacc gtgcttcggg aatggcaaga tgatagagag 180
ctggaggtgg tgacaagagg ctgtgcccac agcgaaaaga ccaacaggac catgagttac 240
cgcatgggct ccatgatcat cagcctgaca gagaccgtgt gcgccacaaa cctctgcaac 300
aggcccagac ccggagcccg aggccgtgct ttccctcagg gccgttacct cgagtgtatt 360
tcctgtggct catcagacat gagctgtgag aggggccggc accagagcct gcagtgccgc 420
agccctgaag aacagtgcct ggatgtggtg acccactgga tccaggaagg tgaagaaggg 480
cgtccaaagg atgaccgcca cctccgtggc tgtggctacc ttcccggctg cccgggctcc 540
aatggtttcc acaacaacga caccttccac ttcctgaaat gctgcaacac caccaaatgc 600
aacgagggcc caatcctgga gcttgaaaat ctgccgcaga atggccgcca gtgttacagc 660
tgtgagggga acaataccct tgggtgttcc tccgaagagg cgtctctcat caactgccgg 720
ggaccaatga atcagtgcct ggtggctaca ggcttagatg tgctgggaaa ccggagttat 780
accgtaagag gctgcgccac ggcttcctgg tgccaaggct cccacgtggc agactccttc 840
ccgacccacc tcaacgtctc tgtctcctgc tgccacggca gcggctgtaa cagccccaca 900
cgaggagggc ccgaacaaaa actcatctca gaagaggatc tgaatagcgc cgtcgaccat 960
catcatcatc atcattga                                               978
<210>88
<211>325
<212>PRT
<213>嵌合体
<400>88
Met Gly Leu Pro Arg Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Thr Thr
 1               5                  10                  15
Cys Val Pro Ala Ser Gln Gly Leu Gln Cys Met Gln Cys Glu Ser Asn
            20                  25                  30
Gln Ser Cys Leu Val Glu Glu Cys Ala Leu Gly Gln Asp Leu Cys Arg
        35                  40                  45
Thr Thr Val Leu Arg Glu Trp Gln Asp Asp Arg Glu Leu Glu Val Val
    50                  55                  60
Thr Arg Gly Cys Ala His Ser Glu Lys Thr Asn Arg Thr Met Ser Tyr
65                  70                  75                  80
Arg Met Gly Ser Met Ile Ile Ser Leu Thr Glu Thr Val Cys Ala Thr
                85                  90                  95
Asn Leu Cys Asn Arg Pro Arg Pro Gly Ala Arg Gly Arg Ala Phe Pro
            100                 105                 110
Gln Gly Arg Tyr Leu Glu Cys Ile Ser Cys Gly Ser Ser Asp Met Ser
        115                 120                 125
Cys Glu Arg Gly Arg His Gln Ser Leu Gln Cys Arg Ser Pro Glu Glu
    130                 135                 140
Gln Cys Leu Asp Val Val Thr His Trp Ile Gln Glu Gly Glu Glu Gly
145                 150                 155                 160
Arg Pro Lys Asp Asp Arg His Leu Arg Gly Cys Gly Tyr Leu Pro Gly
                165                 170                 175
Cys Pro Gly Ser Asn Gly Phe His Asn Asn Asp Thr Phe His Phe Leu
            180                 185                 190
Lys Cys Cys Asn Thr Thr Lys Cys Asn Glu Gly Pro Ile Leu Glu Leu
        195                 200                 205
Glu Asn Leu Pro Gln Asn Gly Arg Gln Cys Tyr Ser Cys Glu Gly Asn
    210                 215                 220
Asn Thr Leu Gly Cys Ser Ser Glu Glu Ala Ser Leu Ile Asn Cys Arg
225                 230                 235                 240
Gly Pro Met Asn Gln Cys Leu Val Ala Thr Gly Leu Asp Val Leu Gly
                245                 250                 255
Asn Arg Ser Tyr Thr Val Arg Gly Cys Ala Thr Ala Ser Trp Cys Gln
            260                 265                 270
Gly Ser His Val Ala Asp Ser Phe Pro Thr His Leu Asn Val Ser Val
        275                 280                 285
Ser Cys Cys His Gly Ser Gly Cys Asn Ser Pro Thr Arg Gly Gly Pro
    290                 295                 300
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His
305                 310                 315                 320
His His His His His
                325
<210>89
<211>987
<212>DNA
<213>嵌合体
<400>89
atgggactcc caaggcggct gctgctgctg ctgttgctgg cgactacctg tgtcccagcc 60
tcccagggcc tgcagtgcat gcagtgtgag agtaaccaga gctgcctggt agaggagtgt 120
gctctgggcc aggacctctg caggactacc gtgcttcggg aatggcaaga tgatagagag 180
ctggaggtgg tgacaagagg ctgtgcccac agcgaaaaga ccaacaggac catgagttac 240
cgcatgggct ccatgatcat cagcctgaca gagaccgtgt gcgccacaaa cctctgcaac 300
aggcccagac ccggagcccg aggccgtgct ttccctcagg gccgttacct cgagtgtgcg 360
tcctgcacct ctttggacca gagctgtgag aggggccggg agcaaagcct gcaatgccgc 420
tatcctacag agcactgtat tgaagtggtg accctccaga gcacagaaag gagcttgaag 480
gatgaggact acacccgagg ctgtggcagt cttcccggat gcccaggcac agcaggtttc 540
catagcaacc agacctttca cttcctgaag tgttgcaact acacccactg caatggtggc 600
ccagttctgg atcttcagag ctttccaccg aatggcttcc agtgttacag ctgcaagggg 660
aacagcaccc atggatgctc ctctgaagag actttcctca ttgactgccg aggccccatg 720
aatcaatgtc tggtagccac cggcactcac gaaccgaaaa accaaagcta tatggtaaga 780
ggctgtgcaa ccgcctcaat gtgccaacat gcccacctgg gtgacgcctt cagcatgaac 840
cacattgatg tctcctgctg tactaaaagt ggctgtaacc acccagacct ggatatccag 900
taccgcgctc taggagggcc cgaacaaaaa ctcatctcag aagaggatct gaatagcgcc 960
gtcgaccatc atcatcatca tcattga                                     987
<210>90
<211>328
<212>PRT
<213>嵌合体
<400>90
Met Gly Leu Pro Arg Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Thr Thr
 1               5                  10                  15
Cys Val Pro Ala Ser Gln Gly Leu Gln Cys Met Gln Cys Glu Ser Asn
            20                  25                  30
Gln Ser Cys Leu Val Glu Glu Cys Ala Leu Gly Gln Asp Leu Cys Arg
        35                  40                  45
Thr Thr Val Leu Arg Glu Trp Gln Asp Asp Arg Glu Leu Glu Val Val
    50                  55                  60
Thr Arg Gly Cys Ala His Ser Glu Lys Thr Asn Arg Thr Met Ser Tyr
65                  70                  75                  80
Arg Met Gly Ser Met Ile Ile Ser Leu Thr Glu Thr Val Cys Ala Thr
                85                  90                  95
Asn Leu Cys Asn Arg Pro Arg Pro Gly Ala Arg Gly Arg Ala Phe Pro
            100                 105                 110
Gln Gly Arg Tyr Leu Glu Cys Ala Ser Cys Thr Ser Leu Asp Gln Ser
        115                 120                 125
Cys Glu Arg Gly Arg Glu Gln Ser Leu Gln Cys Arg Tyr Pro Thr Glu
    130                 135                 140
His Cys Ile Glu Val Val Thr Leu Gln Ser Thr Glu Arg Ser Leu Lys
145                 150                 155                 160
Asp Glu Asp Tyr Thr Arg Gly Cys Gly Ser Leu Pro Gly Cys Pro Gly
                165                 170                 175
Thr Ala Gly Phe His Ser Asn Gln Thr Phe His Phe Leu Lys Cys Cys
            180                 185                 190
Asn Tyr Thr His Cys Asn Gly Gly Pro Val Leu Asp Leu Gln Ser Phe
        195                 200                 205
Pro Pro Asn Gly Phe Gln Cys Tyr Ser Cys Lys Gly Asn Ser Thr His
    210                 215                 220
Gly Cys Ser Ser Glu Glu Thr Phe Leu Ile Asp Cys Arg Gly Pro Met
225                 230                 235                 240
Asn Gln Cys Leu Val Ala Thr Gly Thr His Glu Pro Lys Asn Gln Ser
                245                 250                 255
Tyr Met Val Arg Gly Cys Ala Thr Ala Ser Met Cys Gln His Ala His
            260                 265                 270
Leu Gly Asp Ala Phe Ser Met Asn His Ile Asp Val Ser Cys Cys Thr
        275                 280                 285
Lys Ser Gly Cys Asn His Pro Asp Leu Asp Ile Gln Tyr Arg Ala Leu
    290                 295                 300
Gly Gly Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala
305                 310                 315                 320
Val Asp His His His His His His
                325

Claims (8)

1.分离的抗体或其结合片段，所述抗体或其结合片段特异性结合尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)并且抑制尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)与尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)的结合，其中所述抗体是单克隆抗体，其具有由在ATCC以登记号PTA-7475保藏的杂交瘤产生的抗体的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的抗体，其中所述抗体包括包含SEQ ID NO.：26的序列的重链多肽和包含SEQ ID NO.：28的序列的轻链多肽。
3.根据权利要求1或2的抗体，其中所述的结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和Dab。
4.编码权利要求1-3中任一项的抗体的核酸分子。
5.包括权利要求4的核酸分子的载体。
6.包括权利要求5的载体的宿主细胞。
7.权利要求1-3中任一项的抗体在制备用于治疗乳腺癌的药物中的用途。
8.生产权利要求1-3中任何一项的抗体的方法，其通过在其中表达核酸分子以产生抗体的条件下培养权利要求6的宿主细胞，随后回收抗体来实现。
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