ES2746571T3 - Anticuerpos de unión al receptor de CGRP humano - Google Patents

Anticuerpos de unión al receptor de CGRP humano Download PDF

Info

Publication number
ES2746571T3
ES2746571T3 ES16199717T ES16199717T ES2746571T3 ES 2746571 T3 ES2746571 T3 ES 2746571T3 ES 16199717 T ES16199717 T ES 16199717T ES 16199717 T ES16199717 T ES 16199717T ES 2746571 T3 ES2746571 T3 ES 2746571T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antigen
group
seq
sequence
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16199717T
Other languages
English (en)
Inventor
Thomas Charles Boone
David W Brankow
Colin V Gegg
Shaw-Fen Sylvia Hu
Chadwick T King
Hsieng Sen Lu
Licheng Shi
Cen Xu
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Amgen Inc
Original Assignee
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Inc filed Critical Amgen Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2746571T3 publication Critical patent/ES2746571T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/06—Antimigraine agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2869—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against hormone receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/32—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency specific for a neo-epitope on a complex, e.g. antibody-antigen or ligand-receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)

Abstract

Un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al receptor de CGRP humano, comprendiendo dicho receptor de CGRP humano un polipéptido CRLR humano y un polipéptido RAMP1 humano, en el que el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un epítopo formado de residuos de aminoácido de ambos polipéptidos CRLR y RAMP1, y en el que el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo compite por la unión al receptor de CGRP humano con un anticuerpo de referencia, comprendiendo dicho anticuerpo de referencia (i) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 161, 163, 164, 166 y 168; y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 140, 143, 146, 148 y 150.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos de unión al receptor de CGRP humano
Antecedentes
La superfamilia de péptidos de calcitonina incluye al menos cinco miembros conocidos: calcitonina, amilina, adrenomedulina y dos péptidos relacionados con el gen de la calcitonina (“CGRP”), CGRP1 (también conocido como ctCGRP o CGRP) y CGRP2 (también conocido como pCGRP). CGRP es un neuropéptido vasoactivo de 37 aminoácidos expresado en los sistemas nerviosos tanto central como periférico, y se ha mostrado que es un potente vasodilatador en la periferia, donde neuronas que contienen CGRP están estrechamente asociadas con vasos sanguíneos. La vasodilatación mediada por CGRP también está asociada con la inflamación neurogénica, como parte de una cascada de acontecimientos que da como resultado la extravasación de plasma y vasodilatación de la microvasculatura y está presente en la migraña. La amilina también tiene sitios de unión específicos en el SNC y se piensa que regula el vaciado gástrico y tiene un papel en el metabolismo de hidratos de carbono. La adrenomedulina es un potente vasodilatador. La adrenomedulina tiene receptores específicos en astrocitos y su ARN mensajero está regulado por incremento en tejidos del SNC que se someten a isquemia. (Zimmermann, et al., Identification of adrenomedullin receptors in cultured rat astrocytes and in neuroblastoma glioma hybrid cells (NG108-15), Brain Res., 724:238-245 (1996); Wang et al., Discovery of adrenomedullin in rat ischemic cortex and evidence for its role in exacerbating focal brain ischemic damage, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11480-11484 (1995)).
La calcitonina está implicada en el control del metabolismo óseo y también es activa en el sistema nervioso central (SNC). Las actividades biológicas de CGRP incluyen la regulación de uniones neuromusculares, de presentación de antígeno dentro del sistema inmunitario, del tono vascular y de la neurotransmisión sensorial. (Poyner, D. R., Calcitonina gene-related peptide: multiple actions, multiple receptors, Pharmacol. Ther., 56:23-51 (1992); Muff et al., Calcitonin, calcitonin gene related peptide, adrenomedullin and amylin: homologous peptides, separate receptors and overlapping biological actions, Eur. J. Endocrinol., 133: 17-20 (1995)). También se han identificado tres péptidos estimuladores de receptor de calcitonina (CRSP) en varias especies de mamíferos; los CRSP pueden formar una nueva subfamilia en la familia de CGRP. (Katafuchi, T y Minamino, N, Structure and biological properties of three calcitonin receptor-stimulating peptides, novel members of the calcitonin gene-related peptide family, Peptides, 25(11):2039- 2045 (2004)).
Los péptidos de la superfamilia de calcitonina actúan a través de receptores acoplados a proteínas G con siete dominios transmembrana (GPCR). El receptor de calcitonina (“CT”, “CTR” o “receptor de CT”) y los receptores de CGRP son GPCR de tipo II (“familia B “), familia que incluye otros GPCR que reconocen péptidos reguladores tales como secretina, glucagón y polipéptido intestinal vasoactivo (VIP). Las variantes de corte y empalme mejor caracterizadas del receptor de calcitonina humana difieren dependiendo de la presencia (anteriormente conocido como CTRII+ o CTR1 , y ahora como CT(b)) o ausencia (la principal variante de corte y empalme, anteriormente conocida como CTRii- o CTR2, y ahora como CT(a)) de 16 aminoácidos en el primer bucle intracelular. (Gom et al., Expression of two human skeletal calcitonin receptor isoforms cloned from a giant cell tumor of bone: the first intracellular domain modulates ligand binding and signal transduction, J. Clin. Invest., 95:2680-2691 (1995); Hay et al., Amylin receptors: molecular composition and pharmacology, Biochem. Soc. Trans., 32:865-867 (2004); Poyner et al., 2002). Se había propuesto la existencia de al menos dos subtipos de receptor de CGRP a partir de las potencias como agonista y afinidades como antagonista diferenciales en una variedad de bioensayos in vivo e in vitro. (Dennis et al., CGRP8-37, A calcitonin gene-related peptide antagonist revealing calcitonin gene-related peptide receptor heterogeneity in brain and periphery, J. Pharmacol. Exp. Ther., 254:123-128 (1990); Dennis et al., Structure-activity profile of calcitonin gene-related peptide in peripheral and brain tissues. Evidence for multiplicity, J. Pharmacol. Exp. Ther., 251:718-725 (1989); Dumont et al., A potent and selective CGRP2 agonist, [Cys(Et)2,7]hCGRP: comparison in prototypical CGRP1 and CGRP2 in vitro assays, Can. J. Physiol. Pharmacol., 75:671-676 (1997)).
Se encontró que el subtipo de receptor de CGRP1 era sensible al fragmento antagonista CGRP(8-37). (Chiba et al., Calcitonin gene-related peptide receptor antagonist human CGRP(8-37), Am. J. Physiol., 256:E331-E335 (1989); Dennis et al. (1990); Mimeault et al., Comparative affinities and antagonistic potencies of various human calcitonin gene-related peptide fragments on calcitonin gene-related peptide receptors in brain and periphery, J. Pharmacol. Exp. Ther., 258:1084-1090 (1991)). En cambio, el receptor de CGRP2 era sensible a análogos lineales de CGRP humano (hCGRP), en los que los residuos de cisteína en las posiciones 2 y 7 se derivatizaron (por ejemplo, con acetoaminometilo [Cys(ACM)2,7] o etilamida [Cys(Et)2,7]) pero el receptor de CGRP2 era insensible al fragmento CGRP(8-37). (Dennis et al. (1989); Dennis et al. (1990); Dumont et al. (1997)).
La especificidad de ligando del receptor de calcitonina y el receptor similar a calcitonina (“CL”, “CLR” o “CRLR”) dependen de la coexpresión de miembros de una familia de proteínas auxiliares denominadas las proteínas modificadoras de la actividad de receptor (RAMP). La familia de RAMP incluye tres polipéptidos (RAMP1, RAMP2 y RAMP3) que actúan como moduladores de receptor que determinan la especificidad de ligando de receptores por los miembros de la familia de la calcitonina. Las RAMP son proteínas transmembrana de tipo I que comparten aproximadamente el 30% de identidad de secuencia de aminoácidos y una topología predicha común, con cortos extremos C-terminales citoplasmáticos, un dominio transmembrana y grandes extremos N-terminales extracelulares que son responsables de la especificidad. (McLatchie et al., (1998) RAMPs regulate the transport and ligand specificity of the calcitonin-receptor-like receptor, Nature, 393:333-339; Fraser et al., (1999) The amino terminus of receptor activity modifying proteins is a critical determinant of glycosylation state and ligand binding of calcitonin receptor-like receptor, Molecular Pharmacology, 55: 1054-1059).
En 1998, se identificó el receptor de CGRP1 como un heterodímero compuesto por una proteína auxiliar de un único dominio transmembrana novedosa, proteína modificadora de la actividad de receptor 1 (RAMP1) y CRLR. (McLatchie et al., citado anteriormente). Algunos experimentos de reticulación sugirieron que el receptor de CGRP consistía en una disposición estequiométrica de uno a uno de CRLR y RAMP1 (Hilairet et al. JBC 276, 42182-42190 (2001) ), estudios más recientes usando varias metodologías tales como BRET y BiFC revelaron que el complejo de receptor de CGRP funcional puede componerse de un homooligómero asimétrico de CRLR y monómero de RAMP1 (Heroux et al. JBC 282, 31610-31620 (2007)).
Se ha mostrado que un dominio N-terminal de CRLR purificado se une específicamente a 125I-CGRP (Chauhan et al. Biochemistry 44, 782 (2005)), confirmando la interacción importante y directa entre el CRLR con el ligando de CGRP. En particular, se cree que Leu 24 y Leu 34 de CRLR constituyen el sitio de anclaje de la Phe37 del extremo C-terminal de CGRP (Banerjee et al. BMC Pharmacol. 6, 9 (2006)). Además, Koller et al. (FEBS Lett. 531,464-468 (2002) ) obtuvieron evidencias de que los 18 residuos de aminoácido N-terminales de CRLR contribuyen a la interacción selectiva con CGRP o adrenomedulina, e Ittner et al (Biochemistry 44, 5749-5754 (2005)) sugirieron que los residuos de aminoácido 23-60 N-terminales de CRLR median en la asociación con RAMP1.
Un análisis de estructura-función de RAMP1 identificó los residuos 91-103, que se correlacionan con la “hélice 3” (Simms et al. Biophys. J. 91, 662-669 (2006)), como posiblemente significativos en la interacción con CRLR, y los residuos Trp74 y Phe92 como que interaccionan posiblemente con el ligando de CGRP en relación con su unión al complejo de receptor de CGRP. Unos estudios de unión a ligando usando una quimera de RAMP1 humana/de rata sugieren que el sitio de unión para determinados inhibidores de molécula pequeña de CGRP R (por ejemplo, BIBN4096BS), está ubicado dentro de una región que incluye los aminoácidos 66-102 de RAMP1 (Mallee et al. JBC 277, 14294-14298 (2002)).
CRLR tiene una identidad de la secuencia de aminoácidos global del 55% con CTR, aunque los dominios transmembrana son idénticos casi al 80%. (McLatchie et al. (1998); Poyner et al., International Union of Pharmacology. XXXII. The mammalian calcitonin gene-related peptides, adrenomedullin, amylin and calcitonin receptors, Pharmacol. Rev., 54:233-246 (2002)).
Se ha mostrado que CRLR forma un receptor de alta afinidad para CGRP, cuando se asocia con RAMP1, o, que se une preferentemente a adrenomedulina cuando se asocia con RAMP2 o RAMP3. (McLatchie et al. (1998); Sexton et al., Receptor activity modifying proteins, Cellular Signaling, 13:73-83 (2001); Conner et al., Interaction of calcitoningene-related peptide with its receptors, Biochemical Society Transactions 30(Part 4): 451-454 (2002)). El estado de glicosilación de CRLR está asociado con su farmacología. Las RAMP 1, 2, y 3 transportan CRLR a la membrana plasmática con eficiencias similares, sin embargo RAMP1 presenta CRLR como una glicoproteína glicosilada de manera terminal, madura y un receptor de CGRP, mientras que las RAMP 2 y 3 presentan CRLR como un receptor de adrenomedulina glicosilado central, inmaduro (“AM” o “AMR” o “receptor de AM”. (Fraser et al. (1999)). La caracterización de los receptores CRLR/RAMP2 y CRLR/RAMP3 en células T HEK293 mediante unión de radioligandos (125I-adrenomedulina como radioligando), ensayo funcional (medición de AMPc) o análisis bioquímico (electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida) revelaron que eran indistinguibles, aunque las RAMP 2 y 3 solo comparten el 30% de identidad de secuencia de aminoácidos (Fraser et al. 1999). Sin embargo, se han observado diferencias en la farmacología para CRLR expresado con RAMP 2 frente a RAMP 3. Tanto CGRP como CGRP8-37, así como adrenomedulina y el péptido derivado de adrenomedulina AM 22-52, son activos en el heterodímero de RAMP 3, lo que indica que este complejo puede actuar como receptor tanto de CGRP como de AM. (Howitt et al., British Journal of Pharmacology, 140:477-486 (2003); Muff et al., Hypertens. Res., 26:S3-S8 (2003)). La coexpresión de CRLR humano con RAMP1 de rata, y viceversa, sugirió que la especie de RAMP1 determinaba las características farmacológicas del complejo CRLR/RAMP1 con respecto a varios antagonistas de receptor de CGRP de molécula pequeña sometidos a prueba. (Mallee et al., Receptor Activity-Modifying Protein 1 determines the species selectivity of non-peptide CGRP receptor antagonists, J. Biol. Chem., 277(16):14294-14298 (2002)). A menos que se asocie con una RAMP, no se conoce que CRLR se una a ningún ligando endógeno; actualmente es el único GPCR que se cree que se comporta de este modo. (Conner et al., A key role for transmembrane prolines in calcitonin receptor-like agonist binding and signaling: implications for family B G-protein-coupled receptors, Molec. Pharmacol., 67(1):20-31 (2005)).
También se ha demostrado que el receptor de calcitonina (CT) forma complejos heterodiméricos con las RAMP, que se conocen como receptores de amilina (“AMY”, “AMY R” o “receptor de AMY”). Generalmente, los receptores de CT/RAMP1 (denominados “AMY1” o “AMY1”) tienen una alta afinidad por calcitonina, amilina y CGRP de salmón y menor afinidad por calcitoninas de mamíferos. Para los receptores de CT/RAMP2 (“AMY2” o “AMY2”) y los receptores de CT/RAMP3 (“AMY3” o “AMY3”), se observa principalmente un patrón similar, aunque la afinidad por CGRP es menor y puede no ser significativa a concentraciones de ligando fisiológicamente relevantes. El fenotipo de receptor preciso depende del tipo celular y variante de corte y empalme de CTR (CT(a) o CT(b)), particularmente para receptores de amilina generados a partir de RAMP2. Por ejemplo, una población pura de células similares a osteoclastos expresaron supuestamente RAMP2, CTR y CRLR, pero no rAm P1 o RAMP3. (Hay et al. (2004); Christopoulos et al., Múltiple amylin receptors arise from receptor activity-modifying protein interaction with the calcitonin receptor gene product, Molecular Pharmacology, 56:235-242 (1999); Muff et al., An amylin receptor is revealed following cotransfection of a calcitonin receptor with receptor activity modifying proteins-1 o -3, Endocrinology, 140:2924-2927 (1999); Sexton et al. (2001); Leuthauser et al., Receptor activity-modifying protein 1 forms heterodimers with two G-protein-coupled receptors to define ligand recognition, Biochem. J., 351:347-351 (2000); Tilakaratne et al., Amylin receptor phenotypes derived from human calcitonin receptor/RAMP co-expression exhibit pharmacological differences dependent on receptor isoform and host cell environment, J. Pharmacol. Exp. Ther., 294:61-72 (2000); Nakamura et al., Osteoclast-like cells express receptor activity modifying protein 2: application of laser capture microdissection, J. Molec. Endocrinol., 34:257-261 (2005)).
La tabla 1, a continuación, resume la relación de los componentes de receptor comentados anteriormente.
Tabla 1
Figure imgf000004_0001
Se han propuesto usos terapéuticos de antagonistas de CGRP. Noda et al. describieron el uso de CGRP o derivados de CGRP para inhibir la agregación plaquetaria y para el tratamiento o la prevención de arteriosclerosis o trombosis (documento EP 0385712 B1). Liu et al. dieron a conocer agentes terapéuticos que modulan la actividad de CTR, incluyendo péptidos conjugados con vehículo tales como calcitonina y aCGRP humano (documentos WO 01/83526 A2; US 2002/0090646 A1). Se dieron a conocer antagonistas del péptido vasoactivo Cg Rp y su uso en un método para inhibir la unión de CGRP a receptores de CGRP por Smith et al.; se mostró que tales antagonistas del péptido CGRP inhibían la unión de CGRP a membranas de arteria coronaria y relejaban arterias coronarias de cerdo tratadas con capsaicina (patente estadounidense n.° 6.268.474 B1; y patente estadounidense n.° 6.756.205 B2). Rist et al. dieron a conocer análogos peptídicos con actividad antagonista de receptor de CGRP y su uso en un fármaco para el tratamiento y la profilaxis de una variedad de trastornos (documento DE 19732944 A1).
CGRP es un potente vasodilatador que se ha implicado en la patología de varios síntomas vasomotores, tales como todas las formas de cefalea vascular, incluyendo migrañas (con o sin aura) y cefalea en racimos. Durham, N. Engl. J. Med. 350:1073-1075,2004. La fisiopatología de la migraña implica la activación de los ganglios del trigémino, donde se localiza CGRP, y los niveles de CGRP aumentan significativamente durante un ataque de migraña. Esto fomenta, a su vez, la dilatación de vasos sanguíneos craneales y sensibilización e inflamación neurogénica. (Doods, H., Curr. Opin. Investig. Drugs, 2:1261-1268 (2001)). Además, los niveles en suero de CGRP en la vena yugular externa están elevados en pacientes durante una cefalea migrañosa. Goadsby et al., Ann. Neurol. 28:183-7, 1990. La administración intravenosa de ci-CGRP humano indujo cefalea y migraña en pacientes que padecían migraña sin aura, lo que respalda la opinión de que CGRP desempeña un papel causal en la migraña (Lassen et al, Cephalalgia 22:54-61,2002).
La migraña es un estado neurológico común, complejo, que se caracteriza por ataques episódicos intensos de cefalea y características asociadas, que pueden incluir náuseas, vómitos, sensibilidad a la luz, el sonido o el movimiento. En algunos pacientes, la cefalea está precedida o acompañada por un aura. El dolor de la cefalea puede ser intenso y también puede ser unilateral en determinados pacientes. Los ataques de migraña son perturbadores para la vida diaria. En EE.UU. y Europa occidental, la prevalencia global de personas que padecen migraña es del 11% de la población general (el 6% de hombres; el 15-18% de mujeres). Además, la mediana de frecuencia de ataques en un individuo es de 1,5/mes. Aunque existen varios tratamientos disponibles para aliviar o reducir los síntomas, se recomienda terapia preventiva para aquellos pacientes que tienen más de 3-4 ataques de migraña al mes. Goadsby, et al. New Engl. J. Med. 346(4): 257-275, 2002. Algunos pacientes con migraña se han tratado con topiramato, un anticonvulsivante que bloquea los canales de sodio dependientes de voltaje y determinados receptores de glutamato (AMPA-kainato), potencia la actividad de receptor de GABA-A y bloquea la anhidrasa carbónica. El éxito relativamente reciente de agonistas de receptores de serotonina 5HT-I B/ID y/o 5HT-1 a, tales como sumatriptán, en algunos pacientes ha conducido a los investigadores a proponer una etiología serotoninérgica del trastorno. Desafortunadamente, aunque algunos pacientes responden bien a este tratamiento, otros son relativamente resistentes a sus efectos.
La posible implicación de CGRP en la migraña ha sido la base para el desarrollo y las pruebas de varios compuestos que inhiben la liberación de CGRP (por ejemplo, sumatriptán), antagonizan en el receptor de CGRP (por ejemplo, derivado dipeptídico BIBN4096BS (Boehringer Ingelheim); CGRP(8-37)) o interaccionan con una o más de las proteínas asociadas a receptor, tales como, RAMP1. Brain, S. et al., Trends in Pharmacological Sciences 23:51-53, 2002. Los subtipos de receptor adrenérgico alfa-2 y receptores de adenosina A1 también controlan (inhiben) la liberación de CGRP y la activación del trigémino (Goadsby et al., Brain 125:1392-401, 2002). Por otra parte, el tratamiento con compuestos que inhiben exclusivamente la inflamación neurogénica (por ejemplo, antagonistas de receptor de taquicinina NKI) o la activación del trigémino (por ejemplo, agonistas de receptor de 5HT10) parece ser relativamente ineficaz como tratamientos con una sola dosis para la migraña, lo que conduce a algunos a cuestionarse si inhibir la liberación de CGRP es la base de tratamientos eficaces contra la migraña. Arulmani et al., Eur. J. Pharmacol. 500:315-330, 2004.
Aunque aún no se entiende bien la fisiopatología precisa de la migraña, se ha propuesto el uso terapéutico de antagonistas de CGRP y aptámeros de selección como diana de CGRP para el tratamiento de migraña y otros trastornos. (Por ejemplo, Olesen et al., Calcitonin gene-related peptide receptor antagonist BIBN 4096 BS for the acute treatment of migraine, New Engl. J. Med., 350:1104-1110 (2004); Perspective: CGRP-receptor antagonists--a fresh approach to migraine, New Engl. J. Med., 350:1075 (2004); Vater et al., Short bioactive Spiegelmers to migraine-associated calcitonin gene-related peptide rapidly identified by a novel approach: tailored-SELEX, Nuc. Acids Res., 31(21 e130):1-7 (2003); documento w O 96/03993). Además, se ha mostrado que un potente antagonista de CGRP de molécula pequeña alivia ataques de migraña de moderados a intensos, incluyendo el dolor de la migraña y síntomas asociados a la migraña, en un ensayo clínico de fase III reciente (Connor, et al. Efficacy and Safety of telcagepant (MK-0974), a Novel Oral CGRP Receptor Antagonist, for Acute Migraine Attacks. Poster, European Headache and Migraine Trust International Congress, Londres, Inglaterra, septiembre de 2008).
CGRP también puede estar implicado en síndromes de dolor crónico distintos de la migraña. En roedores, CGRP administrado por vía intratecal induce dolor intenso, y los niveles de CGRP están potenciados en varios modelos de dolor. Además, los antagonistas de CGRP bloquean parcialmente la nocicepción en pancreatitis aguda en roedores (Wick, et al., (2006) Surgery, volumen 139, número 2, páginas 197-201). Conjuntamente, estas observaciones implican que un antagonista de receptor de CGRP potente y selectivo puede ser un agente terapéutico eficaz para el tratamiento de dolor crónico, incluyendo migraña. McLatchie et al., Nature (1998), 333-339 dan a conocer la expresión recombinante de RAMP1 y CRLR en células HEK293. Las células se utilizan además para ensayos de unión que implican péptidos CGRP, amilina y calcitonina y el homodímero RAMP1+CRLR (es decir, CGRP-R). Durham et al, New England Journal of Medicine, Massachusetts Medical Society, Boston, MA, EE.UU., 350, 11, 2004, 1073-1075 dan a conocer antagonistas de receptor de CGRP y el posible uso en terapia contra la migraña. Chauhan et al, Biology of Reproduction, 2004, 70, 1658-1663 dan a conocer la producción de anticuerpos policlonales antagonistas de rata anti-CRLR de rata.
Sumario
En el presente documento se describen anticuerpos aislados, fragmentos de unión a antígeno de los mismos y otras proteínas de unión a antígeno aisladas tal como se reivindican (es decir, un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo) que se unen a CGRP R, particularmente CGRP R de primate, por ejemplo, CGRP R humano. Tal anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede inhibir selectivamente CGRP R de primate (en comparación con receptores de AM1, AM2, CT o amilina de primate) y puede unirse a los componentes tanto de CRLR como de RAMP1 de CGRP R. Se encontró que las proteínas de unión a CGRP R inhiben, interfieren en o modulan al menos una de las respuestas biológicas relacionadas con CGRP R, y como tales, son útiles para mejorar los efectos de enfermedades o trastornos relacionados con CGRP R. Por tanto, la unión de determinadas proteínas de unión a antígeno a CGRP R puede tener una o más de las siguientes actividades: inhibir, interferir en o modular CGRP R, inhibir la vasodilatación, disminuir la inflamación neurogénica, y aliviar, mejorar, tratar, prevenir o reducir síntomas de dolor crónico o migraña.
Son realizaciones de la invención:
1. Un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al receptor de CGRP humano, comprendiendo dicho receptor de CGRP humano un polipéptido CRLR humano y un polipéptido RAMP1 humano, en el que el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un epítopo formado de residuos de aminoácido de ambos polipéptidos CRLR y RAMP1, y
en el que el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo compite por la unión al receptor de CGRP humano con un anticuerpo de referencia, comprendiendo dicho anticuerpo de referencia (i) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 161, 163, 164, 166 y 168; y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en s EQ ID NO: 140, 143, 146, 148 y 150.
2. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según la realización 1, en el que el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente al receptor de CGRP humano con una Kd á 100 nM tal como se determina usando un ensayo de unión mediante FACS.
3. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según la realización 1, en el que el anticuerpo de referencia comprende una cadena pesada y una cadena ligera definidas mediante uno de los siguientes pares de secuencias:
SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 15:
SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 18;
SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 21;
SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 23; y
SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 25.
4. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según la realización 1, en el que el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe selectivamente el receptor de CGRP humano en comparación con los receptores de AM1, AM2 y AMY1 humanos con una razón de selectividad de 100 o más tal como se determina mediante un ensayo de inhibición de AMPc.
5. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las realizaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo completamente humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico o un fragmento de unión a antígeno de los mismos. 6. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las realizaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo de tipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
7. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las realizaciones 1 a 6, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe la unión de CGRP al receptor de CGRP humano.
8. Un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las realizaciones 4 o 7 para su uso en la inhibición de la vasodilatación en un paciente que lo necesite.
9. Un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las realizaciones 4 o 7 para su uso en el tratamiento de un estado asociado con el receptor de CGRP, en el que el estado es cefalea. 10. Un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las realizaciones 4 o 7 para su uso en el tratamiento de un estado asociado con el receptor de CGRP, en el que el estado es migraña. 11. Un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las realizaciones 4 o 7 para su uso en el tratamiento de un estado asociado con el receptor de CGRP, en el que el estado es cefalea en racimos.
El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede inhibir selectivamente el receptor de CGRP humano (en comparación con los receptores de AM1, AM2 o amilina humanos). En algunas realizaciones el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede inhibir selectivamente el receptor de CGRP humano con una razón de selectividad de 50 o más, 75 o más, 100 o más, 150 o más, 200 o más, 250 o más, 300 o más, 400 o más, 500 o más, 750 o más o 1.000 o más. El grado de inhibición selectiva puede determinarse usando cualquier método adecuado, por ejemplo, usando un ensayo de AMPc tal como se describe en los ejemplos en el presente documento. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica se une específicamente tanto a CRLR humano como a RAMP1 humana, y no se une específicamente a AM1 humana, AM2 humana o un receptor de amilina humano (por ejemplo, AMY1 o AMY2). Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede unirse específicamente a CGRP R humano con una KD < 1 mM, < 100 nM, < 10 nM o < 5 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno aislada se une específicamente a CGRP R humano con una KD < 1 mM, < 100 nM, < 10 nM o < 5 nM tal como se determina usando un ensayo de unión mediante FACS y se analiza, por ejemplo, usando métodos descritos en Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica tiene una Ki de < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,5 nM o < 0,1 nM en un ensayo de competencia de unión de CGRP. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica tiene una Ki de < 100 nM, < 50 nM, < 20 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,5 nM o < 0,1 nM en un ensayo de competencia de unión de 125I-CGRP radiomarcado a membranas de células que expresan CGRP R humano, por ejemplo, el ensayo descrito en el ejemplo 5 en el presente documento.
En otro aspecto a modo de ejemplo, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica compite por la unión a CGRP R humano, por ejemplo, la parte extracelular de CGRP R, con un anticuerpo de referencia que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 161, 163, 164, 166 y 168 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 140, 143, 146, 148 y 150. En algunas realizaciones, se evalúa la competencia por la unión usando ensayos de unión, por ejemplo, usando un análisis mediante Biacore, por ejemplo, tal como se describe en el ejemplo 7 en el presente documento. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica compite por la unión a CGRP R humano con un anticuerpo de referencia, comprendiendo el anticuerpo de referencia (i) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 161, 163, 164, 166 y 168; y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 140, 143, 146, 148 y 150. En determinadas realizaciones, el anticuerpo de referencia comprende (i) una cadena pesada definida por una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 32, 34, 35, 37 y 39; y (ii) una cadena ligera definida por una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15, 18, 21,23 y 25. En realizaciones más específicas, el anticuerpo de referencia comprende una cadena pesada y una cadena ligera definidas por uno de los siguientes pares de secuencias: (i) SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 15; (ii) SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 18; (iii) SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 21; (iv) SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 23; y (v) SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 25. En una realización de este tipo, el anticuerpo de referencia comprende una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 32 y una cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 15. En otra realización de este tipo, el anticuerpo de referencia comprende una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 18. En otra realización de este tipo, el anticuerpo de referencia comprende una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 35 y una cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 21. En otra realización de este tipo, el anticuerpo de referencia comprende una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 37 y una cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 23. En otra realización de este tipo, el anticuerpo de referencia comprende una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 39 y una cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 25.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica que compite por la unión a CGRP R humano también puede inhibir selectivamente el receptor de CGRP humano, por ejemplo, con una razón de selectividad de 100 o más, 250 o más, 500 o más, 750 o más, 1.000 o más, 2.500 o más, 5.000 o más o 10.000 o más, y tal selectividad puede determinarse, por ejemplo, usando un ensayo de AMPc tal como se describe en los ejemplos en el presente documento. En realizaciones relacionadas preferidas, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica que compite por la unión a CGRP R humano se une específicamente a CGRP R humano con una Kd < 100 nM, < 10 nM o < 5 nM, por ejemplo, tal como se determina usando un ensayo de unión mediante FACS y se analiza, por ejemplo, usando métodos descritos en Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013. En realizaciones relacionadas, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica que compite por la unión a CGRP R humano puede tener una Ki de < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,5 nM o < 0,1 nM en un ensayo de competencia de unión de CGRP, por ejemplo, en un ensayo de competencia de unión de 125I-CGRP radiomarcado a membranas de células que expresan CGRP R humano, por ejemplo, el ensayo descrito en el ejemplo 5 en el presente documento.
En cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica que compite por la unión a CGRP R humano puede ser, por ejemplo, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano (por ejemplo, completamente humano), un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, o un fragmento de unión a antígeno de los mismos. Además, el fragmento de anticuerpo el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que compite por la unión a CGRP R humano puede ser un fragmento Fab, un fragmento Fab’, un fragmento F(ab’)2, un fragmento Fv, un diacuerpo o una molécula de anticuerpo de cadena sencilla; y puede ser, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humano, por ejemplo, un anticuerpo de tipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En determinadas realizaciones, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica que compite por la unión a CGRP R humano pueden ser proteínas de unión a antígeno neutralizantes.
En ciertos aspectos ilustrativos tal como se reivindican, los anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos pueden comprender (A) una o más regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDRH) seleccionadas del grupo que consiste en: (i) una CDRH1 que tiene la SEQ ID NO: 134; (ii) una CDRH2 que tiene la SEQ ID NO: 135; (iii) una CDRH3 que tiene la SEQ ID NO: 136; y opcionalmente (iv) una CDRH de (i), (ii) y (iii) que contiene una o más sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones que suman en total de forma colectiva no más de cuatro aminoácidos; (B) una o más regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (CDRL) seleccionadas del grupo que consiste en: (i) una CDRL1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 107, 111 y 118; (ii) una CDRL2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 108, 112 y 119; (iii) una CDRL3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 109, 113 y 120; y opcionalmente (iv) una CDRL de (i), (ii) y (iii) que contiene una o más, por ejemplo, una, dos, tres, cuatro o más sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones que suman en total de forma colectiva no más de cuatro aminoácidos; o (C) una o más CDRH de cadena pesada de (A) y una o más CDRL de cadena ligera de (B).
En algunas realizaciones tal como se reivindican, las CDRH se pueden seleccionar además del grupo que consiste en: (i) una CDRH1 que tiene la SEQ ID NO: 131; (ii) una CDRH2 que tiene la SEQ ID NO: 132; (iii) una CDRH3 que tiene la SEQ ID NO: 133; y opcionalmente (iv) una CDRH de (i), (ii) y (iii) que contiene una o más, por ejemplo, una, dos, tres, cuatro o más sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones que suman en total de forma colectiva no más de tres aminoácidos. En realizaciones relacionadas, las CDRH se seleccionan además del grupo que consiste en: (i) una CDRH1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 76, 88, 100, 121, 125 y 128; (ii) una CDRH2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 89, 101, 122, 124, 126 y 129; (iii) una CDRH3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 78, 90, 102, 123, 127 y 130; y opcionalmente (iv) una CDRH de (i), (ii) y (iii) que contiene una o más, por ejemplo, una, dos, tres, cuatro o más sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones que suman en total de forma colectiva no más de dos aminoácidos. En otras realizaciones relacionadas, las CDRH se seleccionan además del grupo que consiste en: (i) una CDRH1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97 y 100; (ii) una CDRH2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101 y 129; (iii) una CDRH3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102 y 123; y opcionalmente (iv) una CDRH de (i), (ii) y (iii) que contiene una o más, por ejemplo, una, dos, tres, cuatro o más sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones que suman en total de forma colectiva no más de dos aminoácidos.
En algunas realizaciones tal como se reivindican, las CDRL se seleccionan además del grupo que consiste en: (i) una CDRL1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 107,111 y 115; (ii) una CDRL2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 108, 112 y 116; (iii) una CDRL3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 109,103 y 117; y opcionalmente (iv) una CDRL de (i), (ii) y (iii) que contiene una o más, por ejemplo, una, dos, tres, cuatro o más sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones. En algunas realizaciones, las sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones suman en total de forma colectiva no más de tres aminoácidos por CDRL. En algunas realizaciones, las sustituciones de aminoácido, deleciones o inserciones suman en total de forma colectiva no más de dos aminoácidos por CDRL. En realizaciones relacionadas, las CDRL se seleccionan además del grupo que consiste en: (i) una CDRL1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 42, 45, 51, 57, 62, 69, 103 y 110; (ii) una CDRL2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 43, 52, 55, 58, 63, 70, 104, 108 y 114; (iii) una CDRL3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 44, 47, 53, 56, 59, 64, 105 y 106; y opcionalmente (iv) una CDRL de (i), (ii) y (iii) que contiene una o más, por ejemplo, dos, tres, cuatro o más sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones que suman en total de forma colectiva no más de dos aminoácidos. En realizaciones relacionadas adicionales, las CDRL se seleccionan además del grupo que consiste en: (i) una CDRL1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66 y 69; (ii) una CDRL2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67 y 70; (iii) una CDRL3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71 y 72; y opcionalmente (iv) una CDRL de (i), (ii) y (iii) que contiene una o más, por ejemplo, una, dos, tres, cuatro o más sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones. En una realización, el número total de sustituciones de aminoácido, deleciones o inserciones no es más de dos aminoácidos por CDR. En otra realización, las sustituciones de aminoácido son sustituciones conservativas.
En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende al menos una o dos CDRH de cualquiera de las (A) mencionadas anteriormente y al menos una o dos CDRL de cualquiera de las (B) mencionadas anteriormente. En otra realización más, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende (i) al menos tres CDRH de cualquiera de las (A) mencionadas anteriormente, en las que las tres CDRH incluyen CDRH1, una CDRH2 y una CDRH3, y (ii) al menos tres CDRL de cualquiera de las (B) mencionadas anteriormente, en las que las tres CDRL incluyen CDRL1, una CDRL2 y una CDRL3. En realizaciones adicionales, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica descrito anteriormente comprende una primera secuencia de aminoácidos que comprende al menos una CDRH y una segunda secuencia de aminoácidos que comprende al menos una CDRL. En una realización, la primera y la segunda secuencia de aminoácidos están unidas covalentemente entre sí.
En otro aspecto, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica incluye una CDRH1, una CDRH2 y una CDRH3. En una realización, CDRH1 comprende SEQ ID NO:73, CDRH2 comprende SEQ ID NO:74 y CDRH3 comprende SEQ ID NO:75. En otra realización, CDRH1 comprende SEQ ID NO:76, CDRH2 comprende SEQ ID NO:77 y CDRH3 comprende SEQ ID NO:78. En otra realización, CDRH1 comprende SEQ ID NO:79, CDRH2 comprende SEQ ID NO:80 y CDRH3 comprende SEQ ID NO:81. En otra realización, CDRH1 comprende SEQ ID NO:82, CDRH2 comprende SEQ ID NO:83 y CDRH3 comprende SEQ ID NO:84. En otra realización, CDRH1 comprende SEQ ID NO:85, CDRH2 comprende SEQ ID NO:86 y CDRH3 comprende SEQ ID NO:87. En otra realización, CDRH1 comprende SEQ ID NO:88, CDRH2 comprende SEQ ID NO:89 y CDRH3 comprende SEQ ID NO:90. En otra realización, CDRH1 comprende SEQ ID NO:76, CDRH2 comprende SEQ ID NO:91 y CDRH3 comprende SEQ ID NO:78. En otra realización, CDRH1 comprende SEQ ID NO:92, CDRH2 comprende SEQ ID NO:93 y CDRH3 comprende SEQ ID NO:94. En otra realización, CDRH1 comprende SEQ ID NO:76, CDRH2 comprende SEQ ID NO:95 y CDRH3 comprende SEQ ID NO:78. En otra realización, CDRH1 comprende SEQ ID NO:73, CDRH2 comprende SEQ ID NO:74 y CDRH3 comprende SEQ ID NO:96. En otra realización, CDRH1 comprende SEQ ID NO:97, CDRH2 comprende SEQ ID NO:98 y CDRH3 comprende SEQ ID NO:99. En otra realización, CDRH1 comprende SEQ ID NO: 100, CDRH2 comprende SEQ ID NO:101 y CDRH3 comprende SEQ ID NO:102.
En otro aspecto, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica incluye una secuencia de CDRL1, una secuencia de CDRL2 y una secuencia de CDRL3. En una realización, CDRL1 comprende SEQ ID NO:42, CDRL2 comprende SEQ ID NO:43 y CDRL3 comprende SEQ ID NO:44. En otra realización, CDRL1 comprende SEQ ID NO:45, CDRL2 comprende SEQ ID NO:46 y CDRL3 comprende SEQ ID NO:47. En otra realización, CDRL1 comprende SEQ ID NO:48, CDRL2 comprende SEQ ID NO:49 y CDRL3 comprende SEQ ID NO:50. En otra realización, CDRL1 comprende SEQ ID NO:51, CDRL2 comprende SEQ ID NO:52 y CDRL3 comprende SEQ ID NO:53. En otra realización, CDRL1 comprende SEQ ID NO:54, CDRL2 comprende SEQ ID NO:55 y CDRL3 comprende SEQ ID NO:56. En otra realización, CDRL1 comprende SEQ ID NO:57, CDRL2 comprende SEQ ID NO:58 y CDRL3 comprende SEQ ID NO:59. En otra realización, CDRL1 comprende SEQ ID NO:60, CDRL2 comprende SEQ ID NO:55 y CDRL3 comprende SEQ ID NO:56. En otra realización, CDRL1 comprende SEQ ID NO:45, CDRL2 comprende SEQ ID NO:61 y CDRL3 comprende SEQ ID NO:47. En otra realización, CDRL1 comprende SEQ ID NO:62, CDRL2 comprende SEQ ID NO:63 y CDRL3 comprende SEQ ID NO:64. En otra realización, CDRL1 comprende SEQ ID NO:65, CDRL2 comprende SEQ ID NO:55 y CDRL3 comprende SEQ ID NO:56. En otra realización, CDRL1 comprende SEQ ID NO:66, CDRL2 comprende SEQ ID NO:67 y CDRL3 comprende SEQ ID NO:68. En otra realización, CDRL1 comprende SEQ ID NO:69, CDRL2 comprende SEQ ID NO:70 y CDRL3 comprende SEQ ID NO:71. En otra realización, CDRL1 comprende SEQ ID NO:69, CDRL2 comprende SEQ ID NO:70 y CDRL3 comprende SEQ ID NO:72.
En otro aspecto, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica incluye una secuencia de CDRL1, una secuencia de CDRL2 y una secuencia de CDRL3, una secuencia de CDRH1, una secuencia de CDRH2 y una secuencia de CDRH3. En una realización, CDRL1 comprende SEQ ID NO:42, CDRL2 comprende SEQ ID No :43, CDRL3 comprende SEQ ID NO:44, CDRH1 comprende SEQ ID NO:73, CDRH2 comprende SEQ ID NO:74 y CDRH3 comprende SEQ ID NO:75. En otra realización, CDRL1 comprende SEQ ID NO:45, CDRL2 comprende SEQ ID NO:46, CDRL3 comprende SEQ ID NO:47, CDRH1 comprende SEQ ID NO:76, CDRH2 comprende SEQ ID NO:77 y CDRH3 comprende SEQ ID NO:78. En otra realización, CDRL1 comprende SEQ ID NO:48, CDRL2 comprende SEQ ID NO:49, CDRL3 comprende SEQ ID NO:50, CDRH1 comprende SEQ ID NO:79, CDRH2 comprende SEQ ID NO:80 y c DrH3 comprende SEQ ID NO:81. En otra realización, CDRL1 comprende SEQ ID NO:51, CDRL2 comprende SEQ ID No :52, CDRL3 comprende SEQ ID NO:53, CDRH1 comprende SEQ ID NO:82, CDRH2 comprende SEQ ID NO:83 y CDRH3 comprende SEQ ID NO:84. En otra realización, CDRL1 comprende SEQ ID NO:54, CDRL2 comprende SEQ ID NO:55, CDRL3 comprende SEQ ID NO:56, CDRH1 comprende SEQ ID NO:85, CDRH2 comprende SEQ ID NO:86 y CDRH3 comprende SEQ ID NO:87. En otra realización, CDRL1 comprende SEQ ID NO:57, CDRL2 comprende SEQ ID NO:58, CDRL3 comprende SEQ ID NO:59, CDRH1 comprende SEQ ID NO:88, CDRH2 comprende SEQ ID NO:89 y CDRH3 comprende SEQ ID NO:90. En otra realización, CDRL1 comprende SEQ ID NO:60, CDRL2 comprende SEQ ID NO:55, CDRL3 comprende SEQ ID NO:56, CDRH1 comprende SEQ ID NO:85, CDRH2 comprende SEQ ID NO:86 y CDRH3 comprende SEQ ID NO:87. En otra realización, CDRL1 comprende SEQ ID NO:45, CDRL2 comprende SeQ ID NO:61, CDRL3 comprende SEQ ID NO:47, CDRH1 comprende SEQ ID NO:76, CDRH2 comprende SEQ ID NO:91 y CDRH3 comprende SEQ ID NO:78. En otra realización, CDRL1 comprende SEQ ID NO:62, CDRL2 comprende SEQ ID NO:63, CDRL3 comprende SEQ ID NO:64, CDRH1 comprende SEQ ID NO:92, CDRH2 comprende SEQ ID NO:93 y CDRH3 comprende SEQ ID NO:94. En otra realización, CDRL1 comprende SEQ ID NO:45, CDRL2 comprende SeQ ID NO:61, CDRL3 comprende SEQ ID NO:47, CDRH1 comprende SEQ ID NO:76, CDRH2 comprende SEQ ID NO:95 y CDRH3 comprende SEQ ID NO:78. En otra realización, CDRL1 comprende SEQ ID NO:65, CDRL2 comprende SEQ ID NO:55, CDRL3 comprende SEQ ID NO:56, CDRH1 comprende SEQ ID NO:85, CDRH2 comprende SEQ ID NO:86 y CDRH3 comprende SEQ ID NO:87. En otra realización, CDRL1 comprende SEQ ID NO:42, CDRL2 comprende SEQ ID NO:43, CDRL3 comprende SEQ ID NO:44, CDRH1 comprende SEQ ID NO:73, CDRH2 comprende SEQ ID NO:74 y CDRH3 comprende SEQ ID NO:96. En otra realización, CDRL1 comprende SEQ ID NO:66, CDRL2 comprende SEQ ID NO:67, CDRL3 comprende SEQ ID NO:68, CDRH1 comprende SEQ ID NO:97, CDRH2 comprende SEQ ID NO:98 y CDRH3 comprende SEQ ID NO:99. En otra realización, CDRL1 comprende SEQ ID NO:69, CDRL2 comprende SEQ ID NO:70, CDRL3 comprende SEQ ID NO:71, CDRH1 comprende SEQ ID NO:100, CDRH2 comprende SEQ ID NO:101 y CDRH3 comprende SEQ ID NO:102. En otra realización, CDRL1 comprende SEQ ID NO:69, CDRL2 comprende SEQ ID NO:70, CDRL3 comprende SEQ ID NO:72, CDRH1 comprende SEQ ID NO:100, CDRH2 comprende SEQ ID NO:101 y CDRH3 comprende SEQ ID NO:102.
En cualquiera de las realizaciones definidas por secuencias mencionadas anteriormente, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede ser, por ejemplo, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano (por ejemplo, completamente humano), un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, o un fragmento de unión a antígeno de los mismos. Además, el fragmento de anticuerpo del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede ser un fragmento Fab, un fragmento Fab’, un fragmento F(ab’)2, un fragmento Fv, un diacuerpo o una molécula de anticuerpo de cadena sencilla. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede ser un anticuerpo monoclonal humano, y puede ser, por ejemplo, un anticuerpo de tipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Además, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede ser proteínas de unión a antígeno neutralizantes.
En cualquiera de las realizaciones definidas por secuencias mencionadas anteriormente, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede unirse específicamente tanto a CRLR humano como a RAMP1 humana y no unirse específicamente a AM1, AM2 o un receptor de amilina humano (por ejemplo, AMY1), por ejemplo, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede unirse específicamente a CGRP R humano con una Kd < 1 pM, < 100 nM, < 10 nM o < 5 nM, por ejemplo, tal como se determina usando un ensayo de unión mediante FACS y se analiza, por ejemplo, usando métodos descritos en Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013. En cualquiera de las realizaciones definidas por secuencias mencionadas anteriormente, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede inhibir selectivamente CGRP R humano, con relación a los receptores de AM1, AM2 o AMY1 humanos, por ejemplo, con una razón de selectividad de 100 o más, 250 o más, 500 o más, 750 o más, 1.000 o más, 2.500 o más, 5.000 o más o 10.000 o más, pudiendo determinarse el grado de inhibición selectiva usando cualquier método adecuado, por ejemplo, usando un ensayo de AMPc tal como se describe en los ejemplos en el presente documento. En cualquiera de las realizaciones definidas por secuencias mencionadas anteriormente, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede tener una Ki de <100 nM, <10 nM, <1 nM, <0,5 nM o <0,1 nM en un ensayo de competencia de unión de CGRP, por ejemplo, en un ensayo de competencia de unión de 125I-CGRP radiomarcado a membranas de células que expresan CGRP R humano, por ejemplo, el ensayo descrito en el ejemplo 5 en el presente documento.
Otro conjunto de realizaciones incluyen un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica que incluye una o una combinación de CDR que tienen las secuencias consenso que se describen a continuación y se unen a CGRP R humano. Las secuencias consenso derivan de secuencias de CDR filogenéticamente relacionadas. En un aspecto, las CDR de los diferentes grupos se pueden mezclar y unir en cualquier anticuerpo monoclonal particular o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica que se una a CGRP R humano. En otro aspecto, la proteína de unión a antígeno comprende CDR de cadena ligera y pesada que derivan del mismo grupo filogenéticamente relacionado de clones de anticuerpo. Secuencias consenso de CDR a modo de ejemplo ilustradas en el presente documento son tal como sigue:
Secuencia consenso de K1
CDR1 RASQGIRX1DLG (SEQ ID NO: 103), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en N y K.
CDR2 X1ASSLQS (SEQ ID NO: 104), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en A y G.
CDR3 LQYNX1X2 PWT (SEQ ID NO: 105), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en I y S, y X2 se selecciona del grupo que consiste en Y y F.
Secuencia consenso de K4
CDR3 QQYGNSLX1R (SEQ ID NO: 106), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en S y C.
Secuencia consenso de K1,4
CDR1 RASQX1X2X3X4GX5LX6 (SEQ ID NO: 107), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en S y G, X2 se selecciona del grupo que consiste en V y I, X3 se selecciona del grupo que consiste en S y R, X4 se selecciona del grupo que consiste en S, N y K, X5 se selecciona del grupo que consiste en Y y D, y X6 se selecciona del grupo que consiste en T y G.
CDR2 X1ASSX2X3X4 (SEQ ID NO: 108), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en G y A, X2 se selecciona del grupo que consiste en R y L, X3 se selecciona del grupo que consiste en A y Q, y X4 se selecciona del grupo que consiste en T y S.
CDR3 X1QYX2X3X4X5X6X7 (SEQ ID NO: 109), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en Q y L, X2 se selecciona del grupo que consiste en G y N, X3 se selecciona del grupo que consiste en N y T, X4 se selecciona del grupo que consiste en S, Y y F, X5 se selecciona del grupo que consiste en L y P, X6 se selecciona del grupo que consiste en C, W y S, y X7 se selecciona del grupo que consiste en R y T.
Secuencia consenso de K3
CDR1 KSSQSLLHSX1GX2X3YLY (SEQ ID NO: 110), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en D y A, X2 se selecciona del grupo que consiste en R y K, y X3 se selecciona del grupo que consiste en N y T.
Secuencia consenso de K2,3
CDR1 X1SSQSLLHSX2GX3X4YLX5 (SEQ ID NO: 111), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en R y K, X2 se selecciona del grupo que consiste en F, D y A, X3 se selecciona del grupo que consiste en Y, R y K, X4 se selecciona del grupo que consiste en N y T, y X5 se selecciona del grupo que consiste en D e Y.
CDR2 X1X2SNRX3S (SEQ ID NO: 112), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en L y E, X2 se selecciona del grupo que consiste en G y V, y X3 se selecciona del grupo que consiste en A y F.
CDR3 MQX1X2X3X4PX5T (SEQ ID NO: 113), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en A y S, X2 se selecciona del grupo que consiste en L y F, X3 se selecciona del grupo que consiste en Q y P, X4 se selecciona del grupo que consiste en T y L, y X5 se selecciona del grupo que consiste en F y L.
Secuencia consenso de Lm3
CDR2 RX1NQRPS (SEQ ID NO: 114), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en N y S.
Secuencia consenso de Lm1,2,3
CDR1 SGSSSNIGX1NX2VX3 (SEQ ID NO: 115), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en N y S, X2 se selecciona del grupo que consiste en Y y T, y X3 se selecciona del grupo que consiste en S, N e Y.
CDR2 X1X2NX3RPS (SEQ ID NO: 116), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en D, T y R, X2 se selecciona del grupo que consiste en N y S, y X3 se selecciona del grupo que consiste en K y Q.
CDR3 X1X2X3DX4X5LX6X7W (SEQ ID NO: 117), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en G y A, X2 se selecciona del grupo que consiste en T y A, X3 se selecciona del grupo que consiste en W y R, X4 se selecciona del grupo que consiste en S y D, X5 se selecciona del grupo que consiste en R y S, X6 se selecciona del grupo que consiste en S y N, y X7 se selecciona del grupo que consiste en A y G.
Secuencia consenso de LmA11
CDR1 X1GX2X3SX4X5X6X7X8X9X10X11 (SEQ ID NO: 118), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en S y Q, X2 está presente o ausente, y si está presente, es S, X3 se selecciona del grupo que consiste en S y D, X4 está presente o ausente, y si está presente, es N, X5 se selecciona del grupo que consiste en I y L, X6 se selecciona del grupo que consiste en G y R, X7 se selecciona del grupo que consiste en N y S, X8 se selecciona del grupo que consiste en N y F, X9 se selecciona del grupo que consiste en Y y T, X10 se selecciona del grupo que consiste en V y A, y X11 se selecciona del grupo que consiste en S, N e Y.
CDR2 X1X2NX3RPS (SEQ ID NO: 119), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en D, G, T, y R, X2 se selecciona del grupo que consiste en N, K y S, y X3 se selecciona del grupo que consiste en K, N y Q.
CDR3 X1X2X3DX4X5X6X7X8X9V (SEQ ID NO: 120), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en G, N y A, X2 se selecciona del grupo que consiste en T, S y A, X3 se selecciona del grupo que consiste en W y R, X4 se selecciona del grupo que consiste en S y D, X5 se selecciona del grupo que consiste en R y S, X6 se selecciona del grupo que consiste en L y V, X7 se selecciona del grupo que consiste en S, Y y N, X8 se selecciona del grupo que consiste en A, H y G, y X9 se selecciona del grupo que consiste en V y L.
Secuencia consenso de HC1
CDR1 X1YYMX2 (SEQ ID NO: 121), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en G y D, X2 se selecciona del grupo que consiste en H e Y.
CDR2 WIX1 PNSGGTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 122), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en N y S. CDR3 X1X2X3SX4X5XsX7X8GX9X10X11X12YYX13GMDV (SEQ ID NO: 123), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en D y G, X2 se selecciona del grupo que consiste en Q y G, X3 se selecciona del grupo que consiste en M e Y, X4 se selecciona del grupo que consiste en I y G, X5 se selecciona del grupo que consiste en I e Y, X6 se selecciona del grupo que consiste en M y A, X7 está presente o ausente, y si está presente, es L, X8 está presente o ausente, y si está presente, es R, X9 se selecciona del grupo que consiste en V y L, X10 se selecciona del grupo que consiste en F e Y, X11 se selecciona del grupo que consiste en P y S, X12 se selecciona del grupo que consiste en P y H, y X13 está presente o ausente, y si está presente, es Y.
Secuencia consenso de HC2
CDR2 RIKSX1TDGGTTDYX2APVKG (SEQ ID NO: 124), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en K y T, y X2 se selecciona del grupo que consiste en T y A.
Secuencia consenso de HC3
CDR1 X1YX2MX3 (SEQ ID NO: 125), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en T y S, X2 se selecciona del grupo que consiste en S y A, y X3 se selecciona del grupo que consiste en N y S.
CDR2 X1 ISX2SX3X4X5X6YYADSVKG (SEQ ID NO: 126), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en S y A, X2 se selecciona del grupo que consiste en S y G, X3 se selecciona del grupo que consiste en S y G, X4 se selecciona del grupo que consiste en S y G, X5 se selecciona del grupo que consiste en Y y R, y X6 se selecciona del grupo que consiste en R y T.
CDR3 X1X2SX3X4X5X6X7 PYSX8X9WYDYYYGMDV (SEQ ID NO: 127), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en E y D, X2 se selecciona del grupo que consiste en G y Q, X3 se selecciona del grupo que consiste en V y R, X4 se selecciona del grupo que consiste en S y E, X5 se selecciona del grupo que consiste en G y V, X6 se selecciona del grupo que consiste en S y G, X7 está presente o ausente, y si está presente, es S, X8 se selecciona del grupo que consiste en I y S, y X9 se selecciona del grupo que consiste en S y G.
Secuencia consenso de HC4
CDR1 SX1GMH (SEQ ID NO: 128), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en F e Y.
CDR2 VISX1 DGSX2KYX3X4DSVKG (SEQ ID NO: 129), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en F e Y, X2 se selecciona del grupo que consiste en I y H, X3 se selecciona del grupo que consiste en S e Y, y X4 se selecciona del grupo que consiste en V y A.
CDR3 X1RX2X3X4X5X6SX7X8YYX9X10X11YYGX12X13V (SEQ ID NO: 130), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en D y E, X2 se selecciona del grupo que consiste en L y K, X3 se selecciona del grupo que consiste en N y R, X4 se selecciona del grupo que consiste en Y y V, X5 se selecciona del grupo que consiste en Y y T, X6 se selecciona del grupo que consiste en D y M, X7 se selecciona del grupo que consiste en S y T, X8 se selecciona del grupo que consiste en G y L, X9 se selecciona del grupo que consiste en H e Y, X10 está presente o ausente, y si está presente, es Y, X11 se selecciona del grupo que consiste en K y F, X12 se selecciona del grupo que consiste en M y L, y X13 se selecciona del grupo que consiste en A y D.
Secuencia consenso de HCA
CDR1 X1X2X3MX4 (SEQ ID NO: 131), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en N y S, X2 se selecciona del grupo que consiste en A, Y y F, X3 se selecciona del grupo que consiste en W, A y G, y X4 se selecciona del grupo que consiste en S y H.
CDR2 X1 IX2X3X4X5X6GX7X8X9X10X11X12X13X14VKG (SEQ ID NO: 132), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en R, A y V, X2 se selecciona del grupo que consiste en K, S y W, X3 se selecciona del grupo que consiste en S, G, F e Y, X4 está presente o ausente, y si está presente, se selecciona del grupo que consiste en K y T, X5 está presente o ausente, y si está presente, es T, X6 se selecciona del grupo que consiste en D y S, X7 se selecciona del grupo que consiste en G y S, X8 se selecciona del grupo que consiste en T, R, I, N y H, X9 se selecciona del grupo que consiste en T y K, X10 se selecciona del grupo que consiste en D e Y, X11 se selecciona del grupo que consiste en Y y S, X12 se selecciona del grupo que consiste en T, A y V, X13 se selecciona del grupo que consiste en A y D, y X14 se selecciona del grupo que consiste en P y S.
CDR3 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17GX18X19V (SEQ ID NO: 133), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en D, A y E, X2 se selecciona del grupo que consiste en R, Q y G, X3 se selecciona del grupo que consiste en T, R, L, G y K, X4 se selecciona del grupo que consiste en G, E, N, I y R, X5 se selecciona del grupo que consiste en Y, V y A, X6 se selecciona del grupo que consiste en S, G, Y, A y T, X7 se selecciona del grupo que consiste en I, P, D, A y M, X8 está presente o ausente, y si está presente, se selecciona del grupo que consiste en S e Y, X9 está presente o ausente, y si está presente, se selecciona del grupo que consiste en W, S y T, X10 se selecciona del grupo que consiste en S, G y L, X11 se selecciona del grupo que consiste en S, G, L e Y, X12 está presente o ausente, y si está presente, se selecciona del grupo que consiste en W e Y, X13 se selecciona del grupo que consiste en Y y H, X14 está presente o ausente, y si está presente, se selecciona del grupo que consiste en Y y D, X15 se selecciona del grupo que consiste en Y, K y F, X16 está presente o ausente, y si está presente, es Y, X17 está presente o ausente, y si está presente, es Y, X18 se selecciona del grupo que consiste en M y L, y X19 se selecciona del grupo que consiste en D y A.
Secuencia consenso de HCB
CDR1 X1X2Xs X4X5 (SEQ ID NO: 134), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en N, G, D, S y A, X2 se selecciona del grupo que consiste en A, F e Y, X3 se selecciona del grupo que consiste en W, Y, A y G, X4 se selecciona del grupo que consiste en M y L, y X5 se selecciona del grupo que consiste en S y H.
CDR2 X1 IX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17G (SEQ ID NO: 135), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en R, W, A, V, S y F, X2 se selecciona del grupo que consiste en K, N, S, W y R, X3 se selecciona del grupo que consiste en S, P, G, F e Y, X4 está presente o ausente, y si está presente, se selecciona del grupo que consiste en K, T y R, X5 está presente o ausente, y si está presente, se selecciona del grupo que consiste en T y A, X6 se selecciona del grupo que consiste en D, N, H, S e Y, X7 se selecciona del grupo que consiste en G y S, X8 se selecciona del grupo que consiste en G y S, X9 se selecciona del grupo que consiste en T, G, R, I, N, H e Y, X10 se selecciona del grupo que consiste en T, K, R y P, X11 se selecciona del grupo que consiste en D, N, Y y E, X12 se selecciona del grupo que consiste en Y y S, X13 se selecciona del grupo que consiste en T, A y V, X14 se selecciona del grupo que consiste en A, Q y D, X15 se selecciona del grupo que consiste en P, K y S, X16 se selecciona del grupo que consiste en V y F, y X17 se selecciona del grupo que consiste en K y Q.
CDR3 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X16X16GX17X18V (SEQ ID NO: 136), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en D, G, A y E, X2 se selecciona del grupo que consiste en R, G y Q, X3 se selecciona del grupo que consiste en T, M, Y, R, L, G y K, X4 se selecciona del grupo que consiste en G, S, E, N, I y R, X5 se selecciona del grupo que consiste en Y, I, G, V y A, X6 se selecciona del grupo que consiste en S, I, Y, G, A y T, X7 se selecciona del grupo que consiste en I, M, A, P y D, X8 está presente o ausente, y si está presente, se selecciona del grupo que consiste en S, L e Y, X9 está presente o ausente, y si está presente, se selecciona del grupo que consiste en W, R, S y T, X10 se selecciona del grupo que consiste en S, G y L, X11 se selecciona del grupo que consiste en S, V, L, G e Y, X12 está presente o ausente, y si está presente, se selecciona del grupo que consiste en F, Y y W, X15 se selecciona del grupo que consiste en Y, P, S y H, X14 está presente o ausente, y si está presente, se selecciona del grupo que consiste en Y, P, D y H, X15 se selecciona del grupo que consiste en Y, K y F, X16 está presente o ausente, y si está presente, es Y, X17 está presente o ausente, y si está presente, es Y y X18 se selecciona del grupo que consiste en M y L.
En cualquiera de las realizaciones definidas por secuencias consenso mencionadas anteriormente,el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como puede ser, por ejemplo, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano (por ejemplo, completamente humano), un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, o un fragmento de unión a antígeno de los mismos. Además, el fragmento de anticuerpo del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede ser un fragmento Fab, un fragmento Fab’, un fragmento F(ab’)2, un fragmento Fv, un di antícuerpo o una molécula de anticuerpo de cadena sencilla. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede ser un anticuerpo monoclonal humano, y puede ser, por ejemplo, un anticuerpo de tipo IgG 1, IgG2, IgG3 o IgG4. Además, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede ser proteínas de unión a antígeno neutralizantes.
En cualquiera de las realizaciones definidas por secuencias consenso mencionadas anteriormente, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede unirse específicamente tanto a CRLR humano como a RAMP1 humana y no unirse específicamente a AM1, AM2 o un receptor de amilina humano (por ejemplo, AMY1), por ejemplo, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede unirse específicamente a CGRP R humano con una Kd < 1 pM, < 100 nM, < 10 nM o < 5 nM, por ejemplo, tal como se determina usando un ensayo de unión mediante FACS y se analiza, por ejemplo, usando métodos descritos en Rathanaswarni, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013. En cualquiera de las realizaciones definidas por secuencias consenso mencionadas anteriormente, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede inhibir selectivamente CGRP R humano, con relación a los receptores de AM1, AM2 o AMY1 humanos, por ejemplo, con una razón de selectividad de 100 o más, 250 o más, 500 o más, 750 o más, 1.000 o más, 2.500 o más, 5.000 o más o 10.000 o más, pudiendo determinarse el grado de inhibición selectiva usando cualquier método adecuado, por ejemplo, usando un ensayo de AMPc tal como se describe en los ejemplos en el presente documento. En cualquiera de las realizaciones definidas por secuencias consenso mencionadas anteriormente, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede tener una Ki de < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,5 nM o < 0,1 nM en un ensayo de competencia de unión de CGRP, por ejemplo, en un ensayo de competencia de unión de 125I-CGRP radiomarcado a membranas de células que expresan CGRP R humano, por ejemplo, el ensayo descrito en el ejemplo 5 en el presente documento.
Algún anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica descrito comprende una secuencia de la región variable de cadena pesada (Vh) que tiene al menos el 80%, el 85% y el 90% o el 95% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 158-170. Algún anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo tal como se reivindica descrito comprende una secuencia de la región variable de cadena ligera (Vl) que tiene al menos el 80%, el 85% y el 90% o el 95% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 137-153. Algún anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica descrito comprende una secuencia VH que tiene al menos el 80%, el 85% y el 90% o el 95% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 158-170 y una VL que tiene al menos el 80%, el 85% y el 90% o el 95% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 137-153. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende (A) una región variable de cadena pesada (Vh) que comprende una secuencia (i) seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 158-170, o (ii) tal como se define en (i) y que contiene una o más (por ejemplo, cinco, diez, quince o veinte) sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones; (B) una Vl que comprende una secuencia (iii) seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 137-153, o (iv) tal como se define en (iii) que contiene una o más (por ejemplo, cinco, diez, quince o veinte) sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones; o (C) una VH de (A) y una VL de (B). En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 158-170 y una Vl que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 137-153.
En una realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 158, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones. En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una Vh que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 159, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones. En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una Vh que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 160, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones. En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una Vh que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 161, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones. En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una Vh que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 162, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones. En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una Vh que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 163, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones. En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una Vh que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 164, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones. En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una Vh que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 165, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones. En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una Vh que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 166, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones. En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una Vh que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 167, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones. En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una Vh que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 168, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones. En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 169, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones. En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una Vh que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 170, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones.
En una realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 137, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones. En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una Vl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 138, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones. En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una Vl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 139, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones. En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una VL que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 140, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones. En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una Vl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 141, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones. En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una VL que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 142, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones. En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una Vl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 143, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones. En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una VL que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 144, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones. En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una Vl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 145, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones. En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una Vl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 146, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones. En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una Vl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 147, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones. En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una Vl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 148, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones. En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una Vl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 149, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones. En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una Vl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 150, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones. En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una Vl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 151, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones. En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una Vl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 152, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones. En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una Vl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 153, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones.
En cualquiera de las realizaciones definidas por las secuencias de Vl y Vh mencionadas anteriormente, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede ser, por ejemplo, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano (por ejemplo, completamente humano), un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico o un fragmento de unión a antígeno de los mismos. Además, el fragmento de anticuerpo del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede ser un fragmento Fab, un fragmento Fab’, un fragmento F(ab’)2, un fragmento Fv, un diacuerpo o una molécula de anticuerpo de cadena sencilla. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede ser un anticuerpo monoclonal humano, y puede ser, por ejemplo, un anticuerpo de tipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Además, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede ser proteínas de unión a antígeno neutralizantes.
En cualquiera de las realizaciones definidas por las secuencias de Vl y Vh mencionadas anteriormente, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede unirse específicamente tanto a CRLR humano como a RAMP1 humana y no unirse específicamente a AM1, AM2 o un receptor de amilina humano (por ejemplo, AMY1), por ejemplo, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede unirse específicamente a CGRP R humano con una Kd < 1 mM, < 100 nM, < 10 nM o < 5 nM, por ejemplo, tal como se determina usando un ensayo de unión mediante FACS y se analiza, por ejemplo, usando métodos descritos en Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013. En cualquiera de las realizaciones definidas por las secuencias de Vl y Vh mencionadas anteriormente, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede inhibir selectivamente CGRP R humano, con relación a los receptores de AM1, AM2 o AMY1 humanos, por ejemplo, con una razón de selectividad de 100 o más, 250 o más, 500 o más, 750 o más, 1.000 o más, 2.500 o más, 5.000 o más o 10.000 o más, pudiendo determinarse el grado de inhibición selectiva usando cualquier método adecuado, por ejemplo, usando un ensayo de AMPc tal como se describe en los ejemplos en el presente documento. En cualquiera de las realizaciones definidas por las secuencias de VL y VH mencionadas anteriormente, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede tener una Ki de <100 nM, <10 nM, <1 nM, <0,5 nM o <0,1 nM en un ensayo de competencia de unión de CGRP, por ejemplo, en un ensayo de competencia de unión de 125I-CGRP radiomarcado a membranas de células que expresan CGRP R humano, por ejemplo, el ensayo descrito en el ejemplo 5 en el presente documento.
En un aspecto, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una secuencia de cadena pesada que tiene al menos el 80%, el 85%, el 90% o el 95% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 29-41. Algún anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica descrito comprende una secuencia de cadena ligera que tiene al menos el 80%, el 85%, el 90% o el 95% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12-28. Algún anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una secuencia de cadena pesada que tiene al menos el 80%, el 85%, el 90% o el 95% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 29-41 y una secuencia de cadena ligera que tiene al menos el 80%, el 85%, el 90% o el 95% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12-28. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende (A) una cadena pesada que comprende una secuencia (i) seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 29-41, o (ii) tal como se define en (i) y que contiene una o más (por ejemplo, cinco, diez, quince o veinte) sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones; (B) una cadena ligera que comprende una secuencia (iii) seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12-28, o (iv) tal como se define en (iii) que contiene una o más (por ejemplo, cinco, diez, quince o veinte) sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones; o (C) una cadena pesada de (A) y una cadena ligera de de (B). En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende una cadena pesada que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 29-41 y una cadena ligera que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12-28.
En una realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende (A) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:29, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones; y (B) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:12, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones.
En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende (A) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:30, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones; y (B) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:13, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones.
En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende (A) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:31, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones; y (B) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:14, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones.
En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende (A) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:32, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones; y (B) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:15, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones.
En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende (A) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:33, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones; y (B) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:16, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones.
En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende (A) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:29, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones; y (B) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:17, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones.
En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende (A) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:34, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones; y (B) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:18, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones.
En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende (A) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:33, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones; y (B) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:19, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones.
En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende (A) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:29, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones; y (B) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:20, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones.
En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende (A) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:35, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones; y (B) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:21, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones.
En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende (A) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:36, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones; y (B) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:22, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones.
En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende (A) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:37, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones; y (B) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:23, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones.
En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende (A) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:38, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones; y (B) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:23, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones.
En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende (A) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:33, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones; y (B) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:24, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones.
En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende (A) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:39, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones; y (B) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:25, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones.
En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende (A) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:40, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones; y (B) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:26, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones.
En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende (A) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:41, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones; y (B) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:27, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones.
En otra realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica comprende (A) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:41, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones; y (B) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO:28, (ii) una secuencia que es idéntica en al menos el 90% o el 95% a la secuencia definida por (i), y (iii) una secuencia tal como se define en (i) que contiene hasta diez sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones.
En cualquiera de las realizaciones definidas por secuencias de cadena ligera y pesada mencionadas anteriormente, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede comprender la secuencia de cadena pesada y/o ligera especificada, pero con un péptido señal diferente o sin péptido señal. En cualquiera de las realizaciones definidas por secuencias de cadena ligera y pesada mencionadas anteriormente, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede ser, por ejemplo, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano (por ejemplo, completamente humano), un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, o un fragmento de unión a antígeno de los mismos. Además, el fragmento de anticuerpo del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede ser un fragmento Fab, un fragmento Fab’, un fragmento F(ab’)2, un fragmento Fv, un diacuerpo o una molécula de anticuerpo de cadena sencilla. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede ser un anticuerpo monoclonal humano, y puede ser, por ejemplo, un anticuerpo de tipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Además, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede ser proteínas de unión a antígeno neutralizantes.
En cualquiera de las realizaciones definidas por secuencias de cadena ligera y pesada mencionadas anteriormente, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede unirse específicamente tanto a CRLR humano como a RAMP1 humana y no unirse específicamente a AM1, AM2 o un receptor de amilina humano (por ejemplo, AMY1), por ejemplo, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede unirse específicamente a CGRP R humano con una Kd < 1 pM, < 100 nM, < 10 nM o < 5 nM, por ejemplo, tal como se determina usando un ensayo de unión mediante FACS y se analiza, por ejemplo, usando métodos descritos en Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013. En cualquiera de las realizaciones definidas por secuencias de cadena ligera y pesada mencionadas anteriormente, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede inhibir selectivamente CGRP R humano, con relación a los receptores de AM1, AM2 o AMY1 humanos, por ejemplo, con una razón de selectividad de 100 o más, 250 o más, 500 o más, 750 o más, 1.000 o más, 2.500 o más, 5.000 o más o 10.000 o más, pudiendo determinarse el grado de inhibición selectiva usando cualquier método adecuado, por ejemplo, usando un ensayo de AMPc tal como se describe en los ejemplos en el presente documento. En cualquiera de las realizaciones definidas por secuencias de cadena ligera y pesada mencionadas anteriormente, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede tener una Ki de < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,5 nM o < 0,1 nM en un ensayo de competencia de unión de CGRP, por ejemplo, en un ensayo de competencia de unión de 125I-CGRP radiomarcado a membranas de células que expresan CGRP R humano, por ejemplo, el ensayo descrito en el ejemplo 5 en el presente documento. En un aspecto adicional, también se proporcionan polinucleótidos de ácido nucleico aislados que codifican para cualquiera de las proteínas de unión a antígeno de CGRP R tal como se reivindican. En algunos casos, las moléculas de ácido nucleico aisladas están operativamente unidas a una secuencia de control. En realizaciones relacionadas, los polinucleótidos aislados se incorporan en un vector de expresión.
También se incluyen líneas celulares transformadas con vectores de expresión que comprenden polinucleótidos aislados tal como se describió anteriormente. En un aspecto relacionado, también se proporcionan vectores de expresión y células huésped transformadas o transfectadas con los vectores de expresión que comprenden las moléculas de ácido nucleico aisladas mencionadas anteriormente que codifican para proteínas de unión a antígeno de CGRP R descritas anteriormente.
En otro aspecto, también se proporciona un método de preparación del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica que incluye la etapa de preparación de la proteína de unión a antígeno a partir de una célula huésped que secreta la proteína de unión a antígeno. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno se genera usando un inmunógeno que comprende receptor de CGRP soluble. En algunas realizaciones, tal receptor de CGRP soluble se obtiene coexpresando y purificando un dominio extracelular (ECD) N-terminal de CRLR humano y un ECD de RAMP1 humana, por ejemplo, un ECD de CRLR humano que comprende SEQ ID NO: 6 y un ECD de RAMP1 que comprende SEQ ID NO: 8, por ejemplo, tal como se describe en los ejemplos 1 y 2 en el presente documento.
En aún otro aspecto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización, la composición farmacéutica puede comprender un agente activo adicional que se selecciona del grupo que consiste en un radioisótopo, radionúclido, una toxina o un grupo terapéutico o quimioterápico.
En un aspecto, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindicaes eficaz para inhibir la vasodilatación y/o disminuir la inflamación neurogénica cuando se administra a un paciente. En una realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica es eficaz para reducir la frecuencia y/o intensidad de cefaleas, por ejemplo, cefaleas migrañosas. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede usarse como tratamiento en una sola dosis de migraña, y/o como tratamiento profiláctico para prevenir o reducir la frecuencia y/o intensidad de síntomas, particularmente síntomas de dolor, asociados con un ataque de migraña.
Se ilustran métodos para tratar o prevenir un estado asociado con CGRP R en un paciente, que comprende administrar a un paciente una cantidad eficaz de al menos un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica resumido anteriormente. El estado puede ser cefalea, por ejemplo, una cefalea migrañosa o una cefalea en racimos u otro tipo de dolor, por ejemplo, un dolor crónico; en otra realización, es diabetes mellitus (tipo II); alternativamente, es inflamación, particularmente inflamación neurogénica; alternativamente, es una trastorno cardiovascular; alternativamente, es una alteración hemodinámica asociada con endotoxemia y septicemia; alternativamente, es vasodilatación.
También se ilustra un método de inhibición de la unión de CGRP a CGRP R humano, por ejemplo, la parte extracelular de CGRP R, en un paciente que comprende administrar una cantidad eficaz de al menos una proteína de unión a antígeno proporcionada en el presente documento y/o resumida anteriormente.
Estos y otros aspectos se describirán en mayor detalle en el presente documento. Cada uno de los aspectos proporcionados puede abarcar diversas realizaciones proporcionadas en el presente documento. Por tanto, se prevé que cada una de las realizaciones que implican un elemento o combinaciones de elementos puede incluirse en cada aspecto descrito, y se consideran expresamente todas de tales combinaciones de los aspectos y realizaciones anteriores. Otras características, objetos y ventajas de la invención resultan evidentes en la siguiente descripción detallada.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra una alineación de secuencias de RAMP-1 de ser humano, macaco cangrejero y rata.
La figura 2 muestra una alineación de secuencias de CRLR de ser humano, macaco cangrejero y rata.
Las figuras 3A y 3B muestran alineaciones de secuencias de base filogenética de las CDR de cadena ligera de los clones de anticuerpo anti-receptor de CGRP indicados que tienen cadenas ligeras kappa, y determinadas secuencias consenso correspondientes.
La figura 4 muestra alineaciones de secuencias de base filogenética de las CDR de cadena ligera de los clones de anticuerpo anti-receptor de CGRP indicados que tienen cadenas ligeras lambda, y determinadas secuencias consenso correspondientes.
Las figuras 5A, 5B, 5C, 5D y 5E muestran alineaciones de secuencias de base filogenética de las CDR de cadena pesada de los clones de anticuerpo anti-receptor de CGRP indicados, y determinadas secuencias consenso correspondientes.
La figura 5F muestra secuencias consenso de CDR de cadena pesada anticuerpo anti-receptor de CGRP a modo de ejemplo dadas a conocer en el presente documento.
La figura 6 es una representación gráfica de datos de dos experimentos que muestran el porcentaje de inhibición de la unión de ligando marcado a CGRP R por 1092 sobrenadantes de hibridoma anti-CGRP R (rombos) y 68 sobrenadantes de control negativo (cuadrados).
Las figuras 7A-D muestran datos de CI50 de ensayo de AMPc a modo de ejemplo de células que expresan receptor de hCGRP (figura 7A), hAM1 (figura 7B), hAM2 (figura 7C) y receptores de amilina humanos (figura 7D) para tres AcM anti-CGRP R indicados.
La figura 8 muestra un ejemplo de datos de unión de 125I-CGRP tal como puede usarse para determinar la Ki de los AcM contra receptor de CGRP humano.
Las figuras 9A-D muestran datos de competencia de Biacore para anticuerpos seleccionados dados a conocer en el presente documento.
La figura 10 muestra una determinación de Kd mediante FACS del AcM 12G8.
La figura 11 muestra una alineación de secuencias de RAMP1 de macaco cangrejero, ser humano, quimeras humanas, ratas y macaco rhesus.
Las figuras 12A-B muestran una alineación de secuencias de CRLR de ser humano, macaco cangrejero, macaco rhesus, rata, quimera humana y consenso.
Las figuras 13A-13C muestran datos de FACS representativos de diferentes receptores de CGRP quiméricos que se unen a anticuerpos anti-CGRP R.
La figura 14 muestra mapas peptídicos derivados de digestiones con AspN de CGRP R solo (cromatograma A) y de la digestión de una muestra de control que contiene anticuerpo monoclonal contra CGRP R 12G8 (cromatograma B). La figura 15 muestra digestiones con AspN de CGRP R en presencia de diferentes concentraciones de anticuerpo neutralizante contra CGRP R.
La figura 16 muestra digestiones con AspN de CGRP R en presencia de diferente concentración de anticuerpo neutralizante contra CGRP R, 4E4.
La figura 17 muestra la intensidad de tinción de inmunohistoquímica de células que expresan diversos componentes de receptor con el anticuerpo 32H7.
Descripción detallada
Los encabezados de sección usados en el presente documento son solo para fines organizativos y no deben interpretarse como que limitan el contenido descrito.
A menos que se definan de otro modo en el presente documento, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente solicitud tendrán los significados que entienden habitualmente los expertos habituales en la técnica. Además, a menos que el contexto lo requiera de otro modo, los términos en singular incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular.
Generalmente, las nomenclaturas usadas en relación con, y las técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química de proteínas y ácidos nucleicos e hibridación descritas en el presente documento se conocen bien y se usan con frecuencia en la técnica. Los métodos y las técnicas de la presente solicitud se realizan generalmente según métodos convencionales bien conocidos en la técnica y tal como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y comentan en la totalidad de la presente memoria descriptiva a menos que se indique de otro modo. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Asociates (1992), y Harlow y Lane Anticuerpos: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Se realizan reacciones enzimáticas y técnicas de purificación según las especificaciones del fabricante, tal como se consigue con frecuencia en la técnica o tal como se describe en el presente documento. La terminología usada en relación con, y los procedimientos y las técnica de laboratorio de, química analítica, química orgánica de síntesis y química médica y farmacéutica descritos en el presente documento son los que se conocen bien y se usan con frecuencia en la técnica. Pueden usarse técnicas convencionales para síntesis químicas, análisis químicos, preparación, formulación y administración farmacéuticas, y tratamiento de pacientes.
Debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, los protocolos y reactivos particulares, etc., descritos en el presente documento y como tal pueden variar. La terminología usada en el presente documento es con el fin de describir realizaciones particulares únicamente, y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que se define solamente por las reivindicaciones.
De forma distinta a en los ejemplos operativos, o cuando se indique de otro modo, todos los números que expresan cantidades de componentes o condiciones de reacción usados en el presente documento deben entenderse como modificados en todos los casos por el término “aproximadamente”. El término “aproximadamente” cuando se usa en relación con porcentajes significa ±1 %.
Definiciones
El término “polinucleótido” o “ácido nucleico” incluye polímeros de nucleótidos tanto monocatenarios como bicatenaterios. Los nucleótidos que comprende el polinucleótido pueden ser ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. Dichas modificaciones incluyen modificaciones de bases tales como derivados de bromouridina y inosina, modificaciones de ribosa tales como 2’,3’-didesoxirribosa, y modificaciones de enlaces internucleotídicos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato y fosforoamidato.
El término “oligonucleótido” significa un polinucleótido que comprende 200 nucleótidos o menos. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos tienen de 10 a 60 bases de longitud. En otras realizaciones, los oligonucleótidos tienen 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o de 20 a 40 nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos pueden ser mono o bicatenarios, por ejemplo, para su uso en la construcción de un gen mutante. Los oligonucleótidos pueden ser oligonucleótidos sentido o antisentido. Un oligonucleótido puede incluir un marcador, incluyendo un radiomarcador, un marcador fluorescente, un hapteno o un marcador antigénico, para ensayos de detección. Pueden usarse oligonucleótidos, por ejemplo, como cebadores de PCR, cebadores de clonación o sondas de hibridación.
Una “molécula de ácido nucleico aislada” significa un ARN o ADN de origen genómico, ARNm, ADNc o sintético o alguna combinación de los mismos que no se asocie con la totalidad o una parte de un polinucleótido en el que el polinucleótido aislado se encuentra en la naturaleza, o se une a un polinucleótido al que no se une en la naturaleza. Con los fines de esta divulgación, debe entenderse que “una molécula de ácido nucleico que comprende” una secuencia de nucleótidos particular no abarca cromosomas intactos. Moléculas de ácido nucleico aisladas “que comprenden” secuencias de ácido nucleico especificadas pueden incluir, además de las secuencias especificadas, secuencias codificantes para hasta diez o incluso hasta veinte de otras proteínas o partes de las mismas, o pueden incluir secuencias reguladoras operativamente unidas que controlan la expresión de la región codificante de las secuencias de ácido nucleico citadas, y/o pueden incluir secuencias de vector.
A menos que se especifique de otro modo, el extremo a la izquierda de cualquier secuencia de polinucleótido monocatenaria comentada en el presente documento es el extremo 5’; el sentido hacia la izquierda de secuencias de polinucleótido bicatenarias se denomina el sentido 5’. El sentido de adición de 5’ a 3’ de transcritos de ARN nacientes se denomina el sentido de transcripción; regiones de secuencia en la hebra de ARN que tiene la misma secuencia que el transcrito de ARN que están en 5’ con respecto al extremo 5’ del transcrito de ARN se denominan “secuencias en el sentido de 5’;” regiones de secuencia en la hebra de ARN que tiene la misma secuencia que el transcrito de ARN que están en 3’ con respecto al extremo 3’ del transcrito de ARN se denominan “secuencias en el sentido de 3’”.
El término “secuencia de control” se refiere a una secuencia de polinucleótido que puede afectar a la expresión y el procesamiento de secuencias codificantes a las que se liga. La naturaleza de tales secuencias de control puede depender del organismo huésped. En realizaciones particulares, las secuencias de control para procariotas pueden incluir un promotor, un sitio de unión al ribosoma y una secuencia de terminación de la transcripción. Por ejemplo, las secuencias de control para eucariotas pueden incluir promotores que comprenden uno o una pluralidad de sitios de reconocimiento para factores de transcripción, secuencias potenciadoras de la transcripción y secuencias de terminación de la transcripción. Las “secuencias de control” pueden incluir secuencias líder y/o secuencias de pareja de fusión.
El término “vector” significa cualquier molécula o entidad (por ejemplo, ácido nucleico, plásmido, bacteriófago o virus) usada para transferir información de codificación de proteínas en una célula huésped.
El término “vector de expresión” o “constructo de expresión” se refiere a un vector que es adecuado para la transformación de una célula huésped y contiene secuencias de ácido nucleico que dirigen y/o controlan (junto con la célula huésped) la expresión de una o más regiones codificantes heterólogas unidas operativamente a las mismas. Un constructo de expresión puede incluir, pero no se limita a, secuencias que afectan o controlan la transcripción, traducción y, si están presentes intrones, afectan al corte y empalme de ARN de una región codificante operativamente unida a las mismas.
Tal como se usa en el presente documento, “operativamente unido” significa que los componentes a los que se aplica el término están en una relación que permite que lleven a cabo sus funciones intrínsecas en condiciones adecuadas. Por ejemplo, una secuencia de control en un vector que está “operativamente unido” a una secuencia codificante de proteína se une a la misma de modo que la expresión de la secuencia codificante de proteína se consigue en condiciones compatibles con la actividad transcripcional de las secuencias de control.
El término “célula huésped” significa una célula que se ha transformado, o que puede transformarse, con una secuencia de ácido nucleico y expresar de ese modo un gen de interés. El término incluye la progenie de la célula parental, ya sea idéntica o no la progenie en cuanto a morfología o en la composición genética a la célula parental original, siempre que esté presente el gen de interés.
El término “transducción” significa la transferencia de genes de una bacteria a otra, habitualmente por un bacteriófago. “Transducción” también se refiere a la adquisición y transferencia de secuencias de células eucariotas mediante retrovirus defectuosos para la replicación.
El término “transfección” significa la captación de ADN foráneo o exógeno por una célula, y una célula se ha “transfectado” cuando el ADN exógeno se ha introducido en el interior de la membrana celular. Se conocen bien varias técnicas de transfección en la técnica y se dan a conocer en el presente documento. Véanse, por ejemplo, Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, citado anteriormente; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al., 1981, Gene 13:197. Tales técnicas pueden usarse para introducir uno o más restos de ADN exógeno en células huésped adecuadas.
El término “transformación” se refiere a un cambio en las características genéticas de una célula, y una célula se ha transformado cuando se ha modificado para que contenga nuevo ADN o ARN. Por ejemplo, una célula se transforma cuando se modifica genéticamente a partir de su estado nativo introduciendo nuevo material genético mediante transfección, transducción, u otras técnicas. Tras la transfección o transducción, el ADN transformante puede recombinarse con el de la célula integrándose físicamente en un cromosoma de la célula, o puede mantenerse transitoriamente como elemento episómico sin replicarse, o puede replicarse independientemente como plásmido. Se considera que una célula se ha “transformado de manera estable” cuando se replica el ADN transformante con la división de la célula.
Los términos “polipéptido” o “proteína” se usan de manera intercambiable en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácido. Los términos también se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácido es un análogo o mimético de un aminoácido que se produce de manera natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos que se producen de manera natural. Los términos también pueden abarcar polímeros de aminoácidos que se han modificado, por ejemplo, mediante la adición de residuos de hidratos de carbono para formar glicoproteínas o fosforilados. Pueden producirse polipéptidos y proteínas por una célula que se produce de manera natural y no recombinante; o se produce por una célula modificada mediante ingeniería genética o recombinante, y comprenden moléculas que tienen la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa, o moléculas que tienen deleciones de, adiciones a, y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de la secuencia nativa. Los términos “polipéptido” y “proteína” abarcan específicamente proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, proteínas de unión a antígeno de CGRP R, proteínas de unión a CGRP R, anticuerpos o secuencias que tienen deleciones de, adiciones a, y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de una proteína de unión a antígeno. El término “fragmento de polipéptido” se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino-terminal, una deleción carboxi-terminal y/o una deleción interna en comparación con la proteína de longitud completa. Tales fragmentos también pueden contener aminoácidos modificados en comparación con la proteína de longitud completa. En determinadas realizaciones, los fragmentos tienen aproximadamente de cinco a 500 aminoácidos de largo. Por ejemplo, los fragmentos pueden tener al menos 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350,400 o 450 aminoácidos de largo. Fragmentos de polipéptido útiles incluyen fragmentos inmunológicamente funcionales de anticuerpos, incluyendo dominios de unión. En el caso de un anticuerpo de unión a CGRP R, fragmentos útiles incluyen pero no se limitan a una región CDR, un dominio variable de una cadena pesada o ligera, una parte de una cadena de anticuerpo o solamente su dominio variable que incluye dos CDR, y similares. El “receptor de CGRP”, o “CGRP R”, se entiende que comprende RAMP1 y CRLR.
El término “proteína aislada” (por ejemplo, proteína aislada de unión a antígeno), “polipéptido aislado” o “anticuerpo aislado” significa que una proteína, un polipéptido o anticuerpo objeto (1) está libre de al menos algunas otras proteínas con las que se encontrará normalmente, (2) está esencialmente libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, de la misma especie, (3) se expresa por una célula de una especie diferente, (4) se ha separado de al menos aproximadamente el 50 por ciento de polinucleótidos, lípidos, hidratos de carbono, u otros materiales con los que se asocia en la naturaleza, (5) está operativamente asociado (mediante interacción covalente o no covalente) con un polipéptido con el que no se asocia en la naturaleza, o (6) no se produce en la naturaleza. Normalmente, una “proteína aislada”, un “polipéptido aislado” o “anticuerpo aislado” constituye al menos aproximadamente el 5%, al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 25%, o al menos aproximadamente el 50% de una muestra dada. ADN genómico, ADNc, ARNm u otro ARN, de origen sintético, o cualquier combinación de los mismos puede codificar para una proteína aislada de este tipo. Preferiblemente, la proteína, el polipéptido o anticuerpo aislado está sustancialmente libre de otras proteínas u otros polipéptidos u otros contaminantes que se encuentran en su entorno natural que interferirían en su uso terapéutico, de diagnóstico, profiláctico, de investigación u otro.
Una “variante” de un polipéptido (por ejemplo, una proteína de unión a antígeno, o un anticuerpo) comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o más residuos de aminoácido se insertan en, se delecionan de y/o se sustituyen en la secuencia de aminoácidos con relación a otra secuencia de polipéptido. Las variantes incluyen proteínas de fusión.
Un “derivado” de un polipéptido es un polipéptido (por ejemplo, una proteína de unión a antígeno, o un anticuerpo) que se ha modificado químicamente de alguna manera distinta de variantes de inserción, deleción o sustitución, por ejemplo, mediante conjugación a otro resto químico.
El término “que se produce de manera natural” tal como se usa en la totalidad de la memoria descriptiva en relación con materiales biológicos tales como polipéptidos, ácidos nucleicos, células huésped, y similares, se refiere a materiales que se encuentran en la naturaleza.
Una “proteína de unión a antígeno” tal como se usa en el presente documento significa una proteína que se une específicamente a un antígeno diana especificado, tal como CGRP R, particularmente de primate, por ejemplo, CGRP R humano. Una proteína de unión a antígeno de CGRP R se une específicamente al receptor de CGRP humano.
Una proteína de unión a antígeno se dice que “se une específicamente a” su diana cuando la constante de disociación (KD) es <10-6 M. El anticuerpo se une específicamente al antígeno diana con “alta afinidad” cuando la KD es < 1 x 10-8 M. En una realización, los anticuerpos se unirán a CGRP R, o CGRP R humano con una KD <5x 10-7; en otra realización los anticuerpos se unirán con una Kd <lx 10-7; en otra realización los anticuerpos se unirán con una Kd < 5 x 10-8; en otra realización los anticuerpos se unirán con una KD <1 x 10-8; en otra realización los anticuerpos se unirán con una KD < 5 x 10-9; en otra realización los anticuerpos se unirán con una KD < 1 x 10-9; en otra realización los anticuerpos se unirán con una Kd < 5 x 10-10; en otra realización los anticuerpos se unirán con una Kd < 1 x 10-10.
Un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o proteína de unión a antígeno “inhibe selectivamente” un receptor específico con relación a otros receptores cuando la CI50 del anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o proteína de unión a antígeno en un ensayo de inhibición del receptor específico es al menos 50 veces menor que la CI50 en un ensayo de inhibición de otro receptor de “referencia”. La “razón de selectividad” es la CI50 del receptor de referencia dividida entre la CI50 del receptor específico. Un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o proteína de unión a antígeno inhibe selectivamente el receptor de CGRP humano si la CI50 del anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o proteína de unión a antígeno en un ensayo de AMPc, por ejemplo, el ensayo de inhibición de AMPc tal como se describe en el ejemplo 4 en el presente documento, es al menos 50 veces menor que la CI50 de ese mismo anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o proteína de unión a antígeno en un ensayo de inhibición de AM1, AM2 o un receptor de amilina humano (por ejemplo, AMY1). A modo de ejemplo no limitativo, si la CI50 de un anticuerpo anti-CGRP R específico en un ensayo de AMPc de hCGRP R es, por ejemplo, de entre 0,1 nM y 20 nM, y la CI50 del mismo anticuerpo en un ensayo de AMPc de receptor de hAM 1, hAM2 o AMY1 humano es de 1000 nM o más, ese anticuerpo inhibe selectivamente el receptor de hCGRP. Una proteína de unión a antígeno que inhibe selectivamente un receptor específico también se entiende que es una proteína de unión a antígeno neutralizante con respecto a ese receptor.
“Región de unión a antígeno” significa una proteína, o una parte de una proteína, que se une específicamente a un antígeno especificado. Por ejemplo, aquella parte de una proteína de unión a antígeno que contiene los residuos de aminoácido que interaccionan con un antígeno y confiere a la proteína de unión a antígeno su especificidad y afinidad por el antígeno se denomina “región de unión a antígeno”. Una región de unión a antígeno incluye normalmente una o más “regiones de unión complementarias” (“CDR”). Determinadas regiones de unión a antígeno también incluyen una o más regiones de “marco”. Una “CDR” es una secuencia de aminoácidos que contribuye a la especificidad y afinidad de unión a antígeno. Las regiones de “marco” pueden ayudar a mantener la conformación apropiada de las CDR para fomentar la unión entre la región de unión a antígeno y un antígeno.
En determinados aspectos, se proporcionan proteínas de unión a antígeno recombinantes que se unen a la proteína CGRP R o CGRP R humano. En este contexto, una “proteína recombinante” es una proteína producida usando técnicas recombinantes, es decir, a través de la expresión de un ácido nucleico recombinante tal como se describe en el presente documento. Se conocen bien en la técnica métodos y técnicas para la producción de proteínas recombinantes.
El término “anticuerpo” se refiere a una inmunoglobulina intacta de cualquier isotipo, o un fragmento de unión a antígeno de la misma que puede competir con el anticuerpo intacto por la unión específica al antígeno diana, e incluye, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, humanizados, completamente humanos y biespecíficos. Un “anticuerpo” como tal es una especie de proteína de unión a antígeno. Un anticuerpo intacto comprenderá generalmente al menos dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa, pero en algunos casos puede incluir menos cadenas tales como anticuerpos que se producen de manera natural en camélidos que pueden comprender solo cadenas pesadas. Pueden derivarse anticuerpos solamente de una única fuente, o pueden ser “quiméricos”, es decir, diferentes partes del anticuerpo pueden derivarse de dos anticuerpos diferentes tal como se describe adicionalmente a continuación. Las proteínas de unión a antígeno, anticuerpos o fragmentos de unión pueden producirse en hibridomas, mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. A menos que se indique de otro modo, el término “anticuerpo” incluye, además de anticuerpos que comprenden dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa, derivados, variantes, fragmentos y mutaciones de los mismos, de los que se describen ejemplos a continuación.
El término “cadena ligera” incluye una cadena ligera de longitud completa y fragmentos de la misma que tienen suficiente secuencia de región variable para conferir especificidad de unión. Una cadena ligera de longitud completa incluye un dominio de región variable, VL, y un dominio de región constante, CL. El dominio de región variable de la cadena ligera está en el extremo amino-terminal del polipéptido. Las cadenas ligeras incluyen cadenas kappa y cadenas lambda.
El término “cadena pesada” incluye una cadena pesada de longitud completa y fragmentos de la misma que tienen suficiente secuencia de región variable para conferir especificidad de unión. Una cadena pesada de longitud completa incluye un dominio de región variable, VH, y tres dominios de región constante, CH1, CH2 y CH3. El dominio VH dominio está en el extremo amino-terminal del polipéptido, y los dominios CH están en el extremo carboxiterminal, siendo el CH3 el más próximo al extremo carboxi-terminal del polipéptido. Las cadenas pesadas pueden ser de cualquier isotipo, incluyendo IgG (incluyendo los subtipos IgG1, lgG2, IgG3 e IgG4), IgA (incluyendo los subtipos IgA1 e IgA2), IgM e IgE.
El término “secuencia señal”, “secuencia líder” o “péptido señal” se refiere a una cadena peptídica corta (3-60 aminoácidos de largo) que dirige el transporte de una proteína. Los péptidos señal también pueden denominarse señales de direccionamiento, secuencias señal, péptidos de tránsito o señales de localización. Algunos péptidos señal se escinden de la proteína por una peptidasa señal después de transportarse las proteínas, de tal manera que la forma biológicamente activa de la proteína (por ejemplo, una proteína de unión a antígeno tal como se describe en el presente documento) es la forma más corta, escindida. Por consiguiente, términos tales como “anticuerpo que comprende una cadena pesada... “, “anticuerpo que comprende una cadena ligera... “, etc., en los que el anticuerpo se caracteriza por que tiene una cadena pesada y/o ligera con una secuencia identificada particular, se entienden que incluyen anticuerpos que tienen las secuencias identificadas específicas excepto porque las secuencias señal se reemplazan por secuencias señal diferentes, así como anticuerpos que tienen las secuencias identificadas, menos cualquier secuencia señal.
El término “fragmento de unión a antígeno” (o simplemente “fragmento”) de un anticuerpo o cadena de inmunoglobulina (cadena pesada o ligera), tal como se usa en el presente documento, comprende una parte (independientemente de cómo se obtenga o sintetice esa parte) de un anticuerpo que carece de al menos algunos de los aminoácidos presentes en una cadena de longitud completa pero que puede unirse específicamente a un antígeno. Tales fragmentos son biológicamente activos porque se unen específicamente al antígeno diana y pueden competir con otras proteínas de unión a antígeno, incluyendo anticuerpos intactos, para la unión específica a un epítopo dado. En un aspecto, un fragmento de este tipo conservará al menos una CDR presente en la cadena ligera o pesada de longitud completa, y en algunas realizaciones comprenderá una única cadena pesada y/o cadena ligera o parte de las mismas. Estos fragmentos biológicamente activos pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante, o pueden producirse mediante la escisión enzimática o química de proteínas de unión a antígeno, incluyendo anticuerpos intactos. Los fragmentos de inmunoglobulina inmunológicamente funcionales incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab’, F(ab’)z, Fv, anticuerpos de dominio y anticuerpos de cadena sencilla, y pueden derivarse de cualquier fuente de mamíferos, incluyendo pero sin limitarse a ser humano, ratón, rata, camélido o conejo. Se contempla además que una parte funcional de las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer en el presente documento, por ejemplo, una o más CDR, podría unirse covalentemente a una segunda proteína o a una molécula pequeña para crear un agente terapéutico dirigido a una diana particular en el organismo, que presenta propiedades terapéuticas bifuncionales, o que tienen una semivida en suero prolongada.
Un “fragmento Fab” se compone de una cadena ligera y las regiones Ch1 y variable de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula de Fab no puede formar un enlace disulfuro con otra molécula de cadena pesada. Una región “Fc” contiene dos fragmentos de cadena pesada que comprenden los dominios Ch1 y Ch2 de un anticuerpo. Los dos fragmentos de cadena pesada se mantienen juntos mediante dos o más enlaces disulfuro y mediante interacciones hidrófobas de los dominios CH3.
Un “fragmento Fab’” contiene una cadena ligera y una parte de una cadena pesada que contiene el dominio VH y el dominio CH1 y también la región entre los dominios CH1 y CH2, de tal manera que puede formarse un enlace disulfuro intercatenario entre las dos cadenas pesadas de dos fragmentos Fab’ para formar una molécula de F(ab’)2. Un “fragmento F(ab’)2” contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que contienen una parte de la región constante entre los dominios Ch1 y Ch2, de tal manera que se forma un enlace disulfuro intercatenario entre las dos cadenas pesadas. Un fragmento F(ab’)2 se compone de dos fragmentos Fab’ que se mantienen juntos mediante un enlace disulfuro entre las dos cadenas pesadas.
La “región Fv” comprende las regiones variables de ambas cadenas pesadas y ligeras, pero carece de las regiones constantes.
“Anticuerpos de cadena sencilla” son moléculas de Fv en las que las regiones variables de cadena pesada y ligera se han conectado mediante un ligador flexible para formar una única cadena de polipéptido, que forma una región de unión a antígeno. Se comentan los anticuerpos de cadena sencilla en detalle en la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 88/01649 y las patentes estadounidenses n.° 4.946.778 y n.° 5.260.203.
Un “anticuerpo de dominio” es un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional que contiene solo la región variable de una cadena pesada o la región variable de una cadena ligera. En algunos casos, dos o más regiones Vh se unen covalentemente con un ligador peptídico para crear un anticuerpo de dominio bivalente. Las dos regiones Vh de un anticuerpo de dominio bivalente pueden seleccionar como diana los mismos antígenos o diferentes.
Una “proteína de unión a antígeno bivalente” o “anticuerpo bivalente” comprende dos sitios de unión a antígeno. En algunos casos, los dos sitios de unión tienen las mismas especificidades de antígeno. Las proteínas de unión a antígeno bivalentes y los anticuerpos bivalentes puede ser biespecíficos, véase más adelante.
Una “proteína de unión a antígeno multiespecífica” o “anticuerpo multiespecífico” es uno que selecciona como diana más de un antígeno o epítopo.
Una proteína de unión a antígeno o anticuerpo “biespecífico”, “específico dual” o “bifuncional” es una proteína de unión a antígeno o anticuerpo híbrido, respectivamente, que tienen dos sitios de unión a antígeno diferentes. Las proteínas de unión a antígeno y anticuerpos biespecíficos son una especie de proteína de unión a antígeno multiespecífica o anticuerpo multiespecífico y pueden producirse mediante una variedad de métodos incluyendo, pero sin limitarse a, fusión de hibridomas o unión de fragmentos Fab’. Véase, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. lmmunol. 148:1547-1553. Los dos sitios de unión de una proteína de unión a antígeno o anticuerpo biespecífico se unirán a dos epítopos diferentes, que pueden residir en las mismas dianas proteicas o diferentes.
El término “proteína de unión a antígeno neutralizante” o “anticuerpo neutralizante” se refiere a una proteína de unión a antígeno o un anticuerpo, respectivamente, que se une a un ligando, impide la unión del ligando a su pareja de unión e interrumpe la respuesta biológica que resultaría si no de la unión del ligando a su pareja de unión. En la evaluación de la unión y especificidad de una proteína de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno inmunológicamente funcional del mismo, un anticuerpo o fragmento inhibirá sustancialmente la unión de un ligando a su pareja de unión cuando un exceso de anticuerpo reduce la cantidad de pareja de unión unida al ligando en al menos aproximadamente el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 97%, el 99% o más (tal como se mide en un ensayo de unión competitiva in vitro). En el caso de una proteína de unión a CGRP R, tal molécula neutralizante disminuirá la capacidad de CGRP R para unirse a CGRP.
El término “competir”, cuando se usa en el contexto de proteínas de unión a antígeno que pueden unirse a la misma región en un antígeno diana, significa competencia entre proteínas de unión a antígeno se determina mediante un ensayo en el que la proteína de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno inmunológicamente funcional del mismo) a prueba impide o inhibe la unión específica de una proteína de unión a antígeno de referencia (por ejemplo, un ligando, o un anticuerpo de referencia) a un antígeno común (por ejemplo, CGRP R o un fragmento de unión a antígeno del mismo). Cualquiera de varios ensayos de unión competitiva puede usarse, por ejemplo: radioinmunoensayo (RIA) de fase sólida directo o indirecto, inmunoensayo (EIA) enzimático de fase sólida directo o indirecto, ensayo de competencia de tipo sándwich (véase, por ejemplo, Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 2.:242-253); EIA de biotina-avidina de fase sólida directo (véase, por ejemplo, Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619), ensayo marcado de fase sólida directo, ensayo de tipo sándwich marcado de fase sólida directo (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA marcado de fase sólida directo usando marcadores de I-125 (véase, por ejemplo, Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15); EIA de biotina-avidina de fase sólida directo (véase, por ejemplo, Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552); y RIA marcado directo (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82). Un ensayo de este tipo puede implicar el uso de antígeno purificado unido a una superficie sólida o células que portan cualquiera de estos, una proteína de unión a antígeno de prueba sin marcar y una proteína de unión a antígeno de referencia marcada. La inhibición competitiva puede medirse determinando la cantidad de marcador unido a la superficie sólida o las células en presencia de la proteína de unión a antígeno de prueba. Las proteínas de unión a antígeno identificadas mediante un ensayo de competencia (proteínas de unión a antígeno que compiten) incluyen proteínas de unión a antígeno que se unen al mismo epítopo que las proteínas de unión a antígeno de referencia y proteínas de unión a antígeno que se unen a un epítopo adyacente suficientemente proximal al epítopo unido por la proteína de unión a antígeno de referencia para que se produzca impedimento estérico. Habitualmente, cuando está presente en exceso una proteína de unión a antígeno que compite, inhibirá la unión específica de una proteína de unión a antígeno de referencia a un antígeno común en al menos el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70% o el 75%. En algunos casos, se inhibe la unión en al menos el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 97% o más. También puede medirse la inhibición competitiva inmovilizando una proteína de unión a antígeno de referencia en un sustrato, por ejemplo, un “chip de sensor”, capturando el antígeno sobre el sustrato mediante la unión al anticuerpo de referencia, y sometiendo a ensayo si una proteína de unión a antígeno diferente (una proteína de unión a antígeno que compite) puede unirse adicionalmente al antígeno. Un ejemplo de este último ensayo de unión competitiva emplea un análisis mediante Biacore, y se describe en el ejemplo 7 en el presente documento.
El término “antígeno” o “inmunógeno” se refiere a una molécula o una parte de una molécula que puede unirse por un agente de unión selectivo, tal como una proteína de unión a antígeno (incluyendo, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno inmunológico funcional del mismo), y adicionalmente que puede usarse en un animal para producir anticuerpos que pueden unirse a ese antígeno. Un antígeno puede presentar uno o más epítopos que pueden interaccionar con diferentes proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, anticuerpos.
El término “epítopo” es la parte de una molécula que se une por una proteína de unión a antígeno (por ejemplo, un anticuerpo). El término incluye cualquier determinante que puede unirse específicamente a una proteína de unión a antígeno, tal como un anticuerpo o a un receptor de células T. Un epítopo puede ser contiguo o no contiguo (por ejemplo, (i) en un polipéptido monocatenario, residuos de aminoácido que no son contiguos entre sí en la secuencia de polipéptido pero que dentro del contexto de la molécula se unen por la proteína de unión a antígeno, o (ii) en un receptor multimérico, por ejemplo, CGRP R, que comprende dos o más componentes individuales, por ejemplo, RAMP1 y CRLR, residuos de aminoácido presentes en dos o más de los componentes individuales, pero que dentro del contexto del receptor multimérico se unen por la proteína de unión a antígeno). En determinadas realizaciones, los epítopos puede ser miméticos porque comprenden una estructura tridimensional que es similar a un epítopo usado para generar la proteína de unión a antígeno, aún comprenden ninguno o solo algunos de los residuos de aminoácido que se encuentran en ese epítopo usados para generar la proteína de unión a antígeno. Con la mayor frecuencia, los epítopos residen en proteínas, pero en algunos casos pueden residir en otras clases de moléculas, tales como ácidos nucleicos. Los determinantes epitópicos pueden incluir agrupamientos de superficie químicamente activos de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, grupos fosforilo o sulfonilo, y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, y/o características de carga específicas. Generalmente, anticuerpos específicos para un antígeno diana particular reconocerán preferentemente un epítopo en el antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.
El término “identidad” se refiere a una relación entre las secuencias de dos o más moléculas de polipéptido o dos o más moléculas de ácido nucleico, tal como se determina alineando y comparando las secuencias. “Porcentaje de identidad” significa el porcentaje de residuos idénticos entre los aminoácidos o nucleótidos en las moléculas comparadas y se calcula basándose en el tamaño de la menor de las moléculas que estén comparándose. Para estos cálculos, deben tratarse los huecos en las alineaciones (si los hubiera) mediante un modelo matemático o programa informático particular (es decir, un “algoritmo”). Los métodos que pueden usarse para calcular la identidad de los ácidos nucleicos o polipéptidos alineados incluyen los descritos en Computational Molecular Biology, (Lesk, A.M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis Of Sequence Data, Part I, (Griffin, A.M., y Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. y Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; y Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073.
En el cálculo del porcentaje de identidad, las secuencias que se comparan se alinean de modo que se proporcione la mayor coincidencia entre las secuencias. El programa informático usado para determinar el porcentaje de identidad es el paquete de programas de GCG, que incluye GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, Universidad de Wisconsin, Madison, WI. Se usa el algoritmo informático GAP para alinear los dos polipéptidos o polinucleótidos para los que se va a determinar el porcentaje de identidad de secuencia. Las secuencias se alinean para una coincidencia óptima de sus aminoácidos o nucleótidos respectivos (el “tramo coincidente”, tal como se determina por el algoritmo). Una penalización por apertura de hueco (que se calcula como 3x la diagonal promedio, en la que la “diagonal promedio” es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que esté usándose; la “diagonal” es la puntuación o el número asignado a cada coincidencia perfecta de aminoácidos por la matriz de comparación particular) y una penalización por extensión de hueco (que es habitualmente 1/10 veces la penalización por apertura de hueco), así como una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62 se usan junto con el algoritmo. En determinadas realizaciones, una matriz de comparación convencional (véase, Dayhoff et al., 1978, Atlas de Protein Sequence and Structure 5:345-352 para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919 para la matriz de comparación BLOSUM 62) también se usa por el algoritmo.
Los parámetros recomendados para determinar el porcentaje de identidad para polipéptidos o secuencias de nucleótidos usando el programa GAP son los siguientes:
Algoritmo: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453;
Matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff et al., 1992, citado anteriormente;
Penalización por hueco: 12 (pero sin penalización para huecos de extremo)
Penalización por longitud de hueco: 4
Umbral de similitud: 0
Determinados esquemas de alineación para alinear dos secuencias de aminoácidos pueden dar como resultado la coincidencia de solo una región corta de las dos secuencias, y esta pequeña región alineada puede tener una identidad de secuencia muy alta aunque no exista una relación significativa entre las dos secuencias de longitud completa. Por consiguiente, el método de alineación seleccionado (programa GAP) puede ajustarse si se desea dar como resultado una alineación que abarque al menos 50 aminoácidos contiguos del polipéptido diana.
Tal como se usa en el presente documento, “sustancialmente puro” significa que la especie de molécula descrita es la especie predominante presente, es decir, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la misma mezcla. En determinadas realizaciones, una molécula sustancialmente pura es una composición en la que la especie objeto comprende al menos el 50% (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. En otras realizaciones, una composición sustancialmente pura comprenderá al menos el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 99% de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. En otras realizaciones, se purifica la especie objeto esencialmente hasta homogeneidad en la que no pueden detectarse especies contaminantes en la composición mediante métodos de detección convencionales y, por tanto, la composición consiste en una única especie macromolecular detectable.
El término “tratar” se refiere a cualquier indicio de éxito en el tratamiento o mejora de una lesión, patología o estado, incluyendo cualquier parámetro objetivo o subjetivo tal como reducción; remisión; disminuir los síntomas o hacer que la lesión, patología o el estado sea más tolerable para el paciente; ralentizar la velocidad de degeneración o deterioro; hacer que el punto final de degeneración sea menos debilitante; mejorar el bienestar físico o mental de un paciente. El tratamiento o la mejora de los síntomas puede basarse en parámetros objetivos o subjetivos; incluyendo los resultados de una exploración física, exploraciones neuropsiquiátricas y/o una evaluación psiquiátrica. Por ejemplo, determinados métodos presentados en el presente documento tratan satisfactoriamente cefaleas migrañosas o bien de manera profiláctica o bien como tratamiento en una sola dosis, disminuyendo la frecuencia de las cefaleas migrañosas, disminuyendo la intensidad de las cefaleas migrañosas, y/o mejorando un síntoma asociado con cefaleas migrañosas.
Una “cantidad eficaz” es generalmente una cantidad suficiente para reducir la intensidad y/o frecuencia de síntomas, eliminar los síntomas y/o la causa subyacente, prevenir la aparición de síntomas y/o su causa subyacente, y/o mejorar o remediar el daño que resulta de o está asociado con la cefalea migrañosa. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz es una cantidad terapéuticamente eficaz o una cantidad profilácticamente eficaz. Una “cantidad terapéuticamente eficaz” es una cantidad suficiente para remediar un estado patológico (por ejemplo cefalea migrañosa) o síntomas, particularmente un estado o síntomas asociados con el estado patológico, o si no prevenir, dificultar, retardar o revertir la progresión del estado patológico o cualquier otro síntoma no deseado asociado con la enfermedad de cualquier modo posible. Una “cantidad profilácticamente eficaz” es una cantidad de una composición farmacéutica que, cuando se administra a un sujeto, tendrá el efecto profiláctico pretendido, por ejemplo, prevenir o retrasar la aparición (o reaparición) de cefalea migrañosa, o reducir la probabilidad de aparición (o reaparición) de cefalea migrañosa o síntomas de cefalea migrañosa. El efecto terapéutico o profiláctico completo no se produce necesariamente mediante la administración de una dosis, y puede producirse solo después de la administración de una serie de dosis. Por tanto, una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz puede administrarse en una o más administraciones.
“Aminoácido” incluye su significado normal en la técnica. Los veinte aminoácidos que se producen de manera natural y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase, Immunology-A Synthesis, 2a edición, (E. S. Golub y D. R. Green, eds.), Sinauer Asociates: Sunderland, Mass. (1991). Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos a-,a-disustituidos, N-alquil-aminoácidos, y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para polipéptidos y se incluyen en la expresión “aminoácido”. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, g-carboxiglutamato, e-N,N,N-trimetil-lisina, e-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, o-N-metilarginina, y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos usada en el presente documento, el sentido hacia la izquierda es el sentido amino-terminal y el sentido hacia la derecha es el sentido carboxi-terminal, según el uso y el convenio convencionales.
Visión general
Se proporcionan en el presente documento proteínas de unión a antígeno que se unen a la proteína CGRP R, incluyendo proteína CGRP R humana (hCGRP R). Las proteínas de unión a antígeno proporcionadas son polipéptidos en los que se introducen y/o se unen una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR), tal como se describe en el presente documento. En algunas proteínas de unión a antígeno, las CDR se incluyen en una región de “marco”, que orienta la(s) CDR de tal manera que se logran las propiedades apropiadas de unión a antígeno de la(s) CDR. En general, las proteínas de unión a antígeno que se proporcionan pueden interferir en, bloquear, reducir o modular la interacción entre CGRP y CGRP R.
Determinadas proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento son anticuerpos o se derivan de anticuerpos. En determinadas realizaciones, la estructura de polipéptido de las proteínas de unión a antígeno se basa en anticuerpos, incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos, minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (denominados a veces en el presente documento “miméticos de anticuerpo”), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, fusiones de anticuerpo (denominadas a veces en el presente documento “conjugados de anticuerpo”), y fragmentos de los mismos. Las diversas estructuras se describen adicionalmente a continuación en el presente documento.
Se han demostrado que las proteínas de unión a antígeno proporcionadas en el presente documento se unen a CGRP R, en particular CGRP R humano. Tal como se describe adicionalmente en los ejemplos a continuación, se sometieron a prueba determinadas proteínas de unión a antígeno y se encontró que se unían a epítopos diferentes de los unidos por varios otros anticuerpos dirigidos contra uno o los demás componentes de CGRP R. Las proteínas de unión a antígeno que se proporcionan compiten con CGRP e impiden de ese modo que se una CGRP a su receptor. Como consecuencia, las proteínas de unión a antígeno proporcionadas en el presente documento pueden inhibir la actividad de CGRP R. En particular, las proteínas de unión a antígeno que se unen a estos epítopos pueden tener una o más de las siguientes actividades: inhibir, entre otros, la inducción de rutas de transducción de señales de CGRP R, inhibir la vasodilatación, provocar vasoconstricción, disminuir la inflamación, por ejemplo, la inflamación neurogénica, y otros efectos fisiológicos inducidos por CGRP R tras la unión a CGRP.
Las proteínas de unión a antígeno que se dan a conocer en el presente documento tienen una variedad de utilidades. Algunas de las proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, son útiles en ensayos de unión específica, purificación por afinidad de CGRP R, en particular hCGRP R o sus ligandos y en ensayos de selección para identificar otros antagonistas de la actividad de CGRP R. Algunas de las proteínas de unión a antígeno son útiles para inhibir la unión de CGRP a CGRP R.
Las proteínas de unión a antígeno pueden usarse en una variedad de aplicaciones de tratamiento, tal como se explica en el presente documento. Por ejemplo, determinadas proteínas de unión a antígeno de CGRP R son útiles para tratar estados asociados con la señalización medida por CGRP R, tal como reducir, aliviar o tratar la frecuencia y/o intensidad de la cefalea migrañosa, reducir, aliviar o tratar cefalea en racimos, reducir, aliviar o tratar dolor crónico, aliviar o tratar la diabetes mellitus (tipo II), reducir, aliviar o tratar trastornos cardiovasculares, y reducir, aliviar o tratar alteraciones hemodinámicas asociadas con endotoxemia y septicemia en un paciente. Otros usos para las proteínas de unión a antígeno incluyen, por ejemplo, diagnóstico de enfermedades o estados asociados a CGRP R y ensayos de selección para determinar la presencia o ausencia de CGRP R. Algunas de las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento son útiles en el tratamiento de las consecuencias, los síntomas y/o la patología asociados con la actividad de CGRP R. Estos incluyen, pero no se limitan a, diversos tipos de cefaleas migrañosas.
Receptor de CGRP
Las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer en el presente documento se unen a CGRP R, en particular CGRP R humano. CGRP R es un multímero que incluye tanto CRLR como RAMP1. La secuencia de nucleótidos de CRLR humano se proporciona en el presente documento como SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos de CRLR humano se proporciona en el presente documento como SEQ ID NO: 2. La secuencia de nucleótidos de RAMP1 humana se proporciona en el presente documento como SEQ ID NO: 3. La secuencia de aminoácidos de RAMP1 humana se proporciona en el presente documento como SEQ ID NO: 4. Las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento se unen a la parte extracelular de CGRP R, que comprende las partes extracelulares de CRLR y RAMP1. Un dominio extracelular (“ECD”) a modo de ejemplo de CRLR humano está codificado por la secuencia de nucleótidos presentada como SEQ ID NO: 5, y tiene la secuencia de aminoácidos presentada como SEQ ID NO: 6. Esta secuencia incluye un péptido señal; un ECD de CRLR maduro a modo de ejemplo (menos el péptido señal) tiene la secuencia de aminoácidos presentada como SEQ ID NO: 10. Un ECD de RAMP1 humana a modo de ejemplo está codificado por la secuencia de nucleótidos presentada como SEQ ID NO: 7, y tiene la secuencia de aminoácidos presentada como SEQ ID NO: 8. Esta secuencia incluye un péptido señal; un ECD de RAMP1 madura a modo de ejemplo (menos el péptido señal) tiene la secuencia de aminoácidos presentada como SEQ ID NO: 11. Tal como se describe a continuación, las proteínas CGRP R también pueden incluir fragmentos. Tal como se usa en el presente documento, los términos se usan de manera intercambiable para significar un receptor, en particular, a menos que se especifique de otro modo, un receptor humano que se une específicamente a CGRP.
El término CGRP R también incluye modificaciones postraduccionales de la secuencia de aminoácidos de CGRP R, por ejemplo, posibles sitios de glicosilación de unión a N. Por tanto, las proteínas de unión a antígeno pueden unirse a o generarse a partir de proteínas glicosiladas en una o más de las posiciones.
Proteínas de unión a receptor de CGRP
Se proporciona una variedad de agentes de unión selectivos útiles para regular la actividad de CGRP R. Estos agentes incluyen, por ejemplo, proteínas de unión a antígeno que contienen un dominio de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos de dominio, inmunoadhesiones, y polipéptidos con una región de unión a antígeno) y que se unen específicamente a CGRP R, en particular CGRP R humano. Algunos de los agentes, por ejemplo, son útiles en la inhibición de la unión de CGRP a CGRP R y, por tanto, pueden usarse para inhibir, interferir en o modular una o más actividades asociadas con la señalización de CGRP R.
En general, las proteínas de unión a antígeno que se proporcionan comprenden normalmente una o más CDR tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5 o 6). En algunos casos, la proteína de unión a antígeno comprende (a) una estructura de polipéptido y (b) una o más CDR que se insertan en y/o se unen a la estructura de polipéptido. La estructura de polipéptido puede adoptar una variedad de diferentes formas. Por ejemplo, puede ser, o comprender, la región de marco de un anticuerpo que se produce de manera natural, o fragmento o variante del mismo, o puede ser completamente sintético en la naturaleza. Se describen adicionalmente a continuación ejemplos de diversas estructuras de polipéptido.
En determinadas realizaciones, la estructura de polipéptido de las proteínas de unión a antígeno es un anticuerpo o se deriva de un anticuerpo, incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos, minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (denominados a veces en el presente documento “miméticos de anticuerpo”), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, fusiones de anticuerpo (denominadas a veces “conjugados de anticuerpo”), y partes o fragmentos de cada uno, respectivamente. En algunos casos, la proteína de unión a antígeno es un fragmento inmunológico de un anticuerpo (por ejemplo, un Fab, un Fab’, un F(ab’)2 o un scFv). Las diversas estructuras se describen y definen adicionalmente en el presente documento.
Algunas de las proteínas de unión a antígeno tal como se proporcionan en el presente documento se unen específicamente a CGRP R humano. En una realización específica, la proteína de unión a antígeno se une específicamente a la proteína CGRP R humano que comprende CRLR humano que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y RAMP1 humana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
En realizaciones en las que la proteína de unión a antígeno se usa para aplicaciones terapéuticas, una proteína de unión a antígeno puede inhibir, interferir en o modular una o más actividades biológicas de CGRP R. En este caso, una proteína de unión a antígeno se une específica y/o inhibe sustancialmente la unión de CGRP R humano a CGRP cuando un exceso de anticuerpo reduce la cantidad de CGRP R humano unido a CGRP, o viceversa, en al menos aproximadamente el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 97%, el 99% o más (por ejemplo midiendo la unión en un ensayo de unión competitiva in vitro).
Estructura de anticuerpo que se produce de manera natural
Algunas de las proteínas de unión a antígeno que se proporcionan tienen la estructura asociada normalmente con anticuerpos que se producen de manera natural. Las unidades estructurales de estos anticuerpos comprenden normalmente uno o más tetrámeros, compuesto cada uno por dos duplas idénticas de cadenas de polipéptido, aunque algunas especies de mamíferos también producen anticuerpos que tienen solo una única cadena pesada. En un anticuerpo típico, cada par o dupla incluye una cadena “ligera” de longitud completa (en determinadas realizaciones, de aproximadamente 25 kDa) y una cadena “pesada” de longitud completa (en determinadas realizaciones, de aproximadamente 50-70 kDa). Cada cadena de inmunoglobulina individual se compone de varios “dominios de inmunoglobulina”, que consiste cada uno en aproximadamente de 90 a 110 aminoácidos y que expresan un patrón de plegamiento característico. Estos dominios son las unidades básicas de las que se componen los polipéptidos de anticuerpo. La parte amino-terminal de cada cadena incluye normalmente un dominio variable que es responsable del reconocimiento de antígeno. La parte carboxi-terminal está más conservada evolutivamente que el otro extremo de la cadena y se denomina la “región constante” o “región C”. Las cadenas ligeras humanas se clasifican generalmente como cadenas ligeras kappa y lambda, y cada una de estas contiene un dominio variable y un dominio constante. Las cadenas pesadas se clasifican normalmente como cadenas mu, delta, gamma, alfa o épsilon, y estas definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. IgG tiene varios subtipos, incluyendo, pero sin limitarse a, IgG1, lgG2, IgG3 e IgG4. Los subtipos lgM incluyen IgM e IgM2. Los subtipos IgA incluyen lgAl e lgA2. En seres humanos, los isotipos IgA e IgD contienen cuatro cadenas pesadas y cuatro cadenas ligeras; los isotipos lgG e IgE contienen dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras; y el isotipo IgM contiene cinco cadenas pesadas y cinco cadenas ligeras. La región C de cadena pesada comprende normalmente uno o más dominios que pueden ser responsables de la función efectora. El número de dominios de región constante de cadena pesada dependerá del isotipo. Las cadenas pesadas de IgG, por ejemplo, contienen cada una tres dominios de región C conocidos como Ch1, Ch2 y Ch3. Los anticuerpos que se proporcionan pueden tener cualquiera de estos isotipos y subtipos. En determinadas realizaciones, el anticuerpo contra CGRP R es del subtipo lgG1, IgG2 o IgG4.
En cadenas ligeras y pesadas de longitud completa, las regiones variables y constantes se unen mediante una región “J” de aproximadamente doce o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región “D” de aproximadamente diez o más aminoácidos. Véase, por ejemplo, Fundamental Immunology, 2a ed., cap. 7 (Paul, W., ed.) 1989, Nueva York: Raven Press. Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman normalmente el sitio de unión a antígeno.
Un ejemplo de un dominio constante de cadena pesada de IgG2 de un anticuerpo monoclonal contra CGRP R a modo de ejemplo tiene la secuencia de aminoácidos:
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP
AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAP
PVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK
PREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQV
YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFL
YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (|0S últimos 326 residuos de la secuencia mostrados como SEQ ID NO:29).
Un ejemplo de un dominio constante de cadena ligera kappa de un anticuerpo monoclonal contra CGRP R a modo de ejemplo tiene la secuencia de aminoácidos:
ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (|0S últimos 107 residuos de la secuencia mostrados como SEQ ID NO: 14).
Las regiones variables de cadenas de inmunoglobulina presentan generalmente la misma estructura global, que comprende regiones de marco (FR) relativamente conservadas unidas mediante tres regiones hipervariables, más de diez regiones denominadas “regiones determinantes de complementariedad” o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par de cadena pesada/cadena ligera mencionado anteriormente se alinean normalmente mediante las regiones de marco para formar una estructura que se une específicamente con un epítopo específico en la proteína diana (por ejemplo, CGRP R). Desde el extremo N-terminal al C-terminal, las ajustan regiones variables de cadena ligera y pesada que se producen de manera natural se ajustan ambas normalmente al siguiente orden de estos elementos: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Se ha diseñado un sistema de numeración para asignar números a los aminoácidos que ocupan posiciones en cada uno de estos dominios. Este sistema de numeración se define en Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987 y 1991, NIH, Betesda, MD), o Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883.
Las diversas regiones variables de cadena pesada y cadena ligera proporcionadas en el presente documento se representan en la tabla 3. Cada una de estas regiones variables puede unirse a las anteriores regiones constantes de cadena pesada y ligera para formar una cadena pesada y ligera de anticuerpo completa, respectivamente. Además, cada una de las secuencias de cadena pesada y ligera así generadas puede combinarse para formar una estructura de anticuerpo completa. Debe entenderse que las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera proporcionadas en el presente documento también pueden unirse a otros dominios constantes que tienen secuencias diferentes a las secuencias a modo de ejemplo enumeradas anteriormente.
En las tablas 2A y 2B, se resumen ejemplos específicos de algunas de las cadenas ligeras y pesadas de longitud completa de los anticuerpos que se ilustran y sus secuencias de aminoácidos correspondientes. La tabla 2A muestra secuencias de cadena ligera a modo de ejemplo, y la tabla 2B muestra secuencias de cadena pesada a modo de ejemplo.
Tabla 2A - Secuencias de aminoácidos de cadena ligera de anticuerpo a modo de ejemplo
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000035_0001
Tabla 2B - Secuencias de aminoácidos de cadena pesada de anticuerpo a modo de ejemplo
Figure imgf000035_0002
_______
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000038_0001
Figure imgf000039_0001
Los primeros 22 aminoácidos de cada una de las secuencias de cadena ligera en la tabla 2A, excepto 32H7 y 32H7 CS, es una secuencia señal. En el caso de 32H7 y 32H7 CS, la secuencia señal tiene 20 aminoácidos. De manera similar, los primeros 22 aminoácidos de cada una de las secuencias de cadena pesada en la tabla 2B es una secuencia señal. Los péptidos señal pueden cambiarse a péptidos señal que tienen diferentes secuencias, por ejemplo, para una expresión más óptima en determinadas células huésped. Por tanto, se entenderá que la invención también incluye anticuerpos que tienen las secuencias de cadena ligera y/o pesada tal como se especifica en las tablas 2A y 2B, pero con diferentes secuencias señal.
De nuevo, cada una de las cadenas pesadas a modo de ejemplo (H1, H2, H3 etc.) enumeradas en la tabla 2B puede combinarse con cualquiera de las cadenas ligeras a modo de ejemplo mostradas en la tabla 2A para formar un anticuerpo. Los ejemplos de tales combinaciones incluyen H1 combinada con cualquiera de L1 a L17; H2 combinada con cualquiera de L1 a L17; H3 combinada con cualquiera de L1 a L17, etcétera. En algunos casos, los anticuerpos incluyen al menos una cadena pesada y una cadena ligera de las enumeradas en las tablas 2A y 2B. En algunos casos, los anticuerpos comprenden dos cadenas pesadas diferentes y dos cadenas ligeras diferentes enumeradas en las tablas 2A y 2B. En otros casos, los anticuerpos contienen dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Como ejemplo, un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional puede incluir dos cadenas pesadas H1 y dos cadenas ligeras L1, o dos cadenas pesadas H2 y dos cadenas ligeras L2, o dos cadenas pesadas H3 y dos cadenas ligeras L3 y otras combinaciones similares de pares de cadenas ligeras y pares de cadenas pesadas como se enumeran en las tablas 2A y 2B.
Otras proteínas de unión a antígeno que se ilustran son variantes de anticuerpos formadas mediante combinación de las cadenas pesadas y ligeras mostradas en las tablas 2A y 2B y comprenden cadenas ligeras y/o pesadas que tienen cada una al menos el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 97% o el 99% de identidad con las secuencias de aminoácidos de estas cadenas. En algunos casos, tales anticuerpos incluyen al menos una cadena pesada y una cadena ligera, mientras que en otros casos las formas de variante contienen dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas.
Dominios variables de anticuerpos
También se ilustran proteínas de unión a antígeno que contienen una región variable de cadena pesada de anticuerpo seleccionada del grupo que consiste en Vh1, Vh2, Vh3, Vh4, Vh5, Vh6, Vh7, Vh8, Vh9, Vh10, Vh11, Vh12 y Vh13, y/o una región variable de cadena ligera de anticuerpo seleccionada del grupo que consiste en Vl1, Vl2, Vl3, Vl4, Vl5, Vl6, Vl7, Vl8, Vl9, Vl10, Vl11, Vl12, Vl13, Vl14, Vl15, Vl16 y Vl17, tal como se muestra en la tabla 3 a continuación, y fragmentos inmunológicamente funcionales, derivados, muteínas y variantes de estas regiones variables de cadena ligera y cadena pesada.
Se proporcionan alineaciones de secuencias de las diversas regiones variables de cadena pesada y ligera, respectivamente, en las figuras 1A y 1B.
Las proteínas de unión a antígeno de este tipo pueden designarse generalmente mediante la fórmula “ VHx/ Vi_y”, en la que “x” corresponde al número de regiones variables de cadena pesada e “y” corresponde al número de regiones variables de cadena ligera.
Tabla 3: Secuencias de aminoácidos de cadenas Vh y Vl a modo de ejemplo
Figure imgf000040_0001
Figure imgf000041_0001
Figure imgf000042_0001
Figure imgf000043_0001
Figure imgf000044_0001
Figure imgf000045_0001
Cada una de las regiones variables de cadena pesada enumeradas en la tabla 3 puede combinarse con cualquiera de las regiones variables de cadena ligera mostradas en la tabla 3 para formar una proteína de unión a antígeno.
Los ejemplos de tales combinaciones incluyen Vh1 combinada con cualquiera de Vl1, Vl2, Vl3, Vl4, Vl5, Vl6, Vl7,
Vl8, Vl9, Vl10, Vl11, Vl12, Vl13, Vl14, Vl15, Vl16 o Vl17; Vh2 combinada con cualquiera de Vl1, Vl2, Vl3, Vl4,
Vl5, Vl6, Vl7, Vl8, Vl9, Vl10, Vl11, Vl12, Vl13, Vl14, Vl15, Vl16 o Vl17; Vh3 combinada con cualquiera de Vl1,
Vl2, Vl3, Vl4, Vl5, Vl6, Vl7, Vl8, Vl9, Vl10, Vl11, Vl12, Vl13, Vl14, Vl15, Vl16 o Vl17; etcétera.
En algunos casos, la proteína de unión a antígeno incluye al menos una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera de las enumeradas en la tabla 3. En algunos casos, la proteína de unión a antígeno incluye al menos dos regiones variables de cadena pesada y/o regiones variables de cadena ligera diferentes de las enumeradas en la tabla 3. Un ejemplo de una proteína de unión a antígeno de este tipo comprende (a) una Vh1, y
(b) una de Vh2, Vh3, Vh4, Vh5, Vh6, Vh7, Vh8, Vh9, Vh10, Vh11, Vh12 o Vh13. Otro ejemplo comprende (a) una Vh2, y (b) una de Vh1, Vh3, Vh4, Vh5, Vh6, Vh7, Vh8, Vh9, Vh10, Vh11, Vh12 o Vh13. De nuevo otro ejemplo comprende
(a) una Vh3, y (b) una de Vh1, Vh2, Vh4, Vh5, Vh6, Vh7, Vh8, Vh9, Vh10, Vh11, Vh12 o Vh13, etc. De nuevo otro ejemplo de una proteína de unión a antígeno de este tipo comprende (a) una Vl1, y (b) una de Vl2, Vl3, Vl4, Vl5,
Vl6, Vl7, Vl8, Vl9, Vl10, Vl1 1, Vl12, Vl13, Vl14, Vl15, Vl16 o Vl17, Vl18, Vl19 ejemplo de una proteína de unión a antígeno de este tipo comprende (a) una Vl2, y (b) una de Vl1, Vl3, Vl1, Vl5,
Vl6, Vl7, Vl8, Vl9, Vl10, Vl11, Vl12, Vl13, Vl14, Vl15, Vl16, Vl17, Vl18, Vl19, Vl20 o Vl21. De nuevo otro ejemplo de una proteína de unión a antígeno de este tipo comprende (a) una Vl3, y (b) una de Vl1, Vl2, Vl4, Vl5, Vl6, Vl7,
Vl8, Vl9, Vl10, Vl11, Vl12, Vl13, Vl14, Vl15, Vl16, Vl17, Vl18, Vl19, Vl20 o Vl21, etc.
Las diversas combinaciones de regiones variables de cadena pesada pueden combinarse con cualquiera de las diversas combinaciones de regiones variables de cadena ligera tal como resulta evidente para un experto en la técnica.
En otros casos, la proteína de unión a antígeno contiene dos regiones variables de cadena ligera idénticas y/o dos regiones variables de cadena pesada idénticas. Como ejemplo, la proteína de unión a antígeno puede ser un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional que incluye dos regiones variables de cadena ligera y dos regiones variables de cadena pesada en combinaciones de pares de regiones variables de cadena ligera y pares de regiones variables de cadena pesada como las enumeradas en la tabla 3.
Algunas proteínas de unión a antígeno que se ilustran comprenden un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de un dominio variable de cadena pesada seleccionado de Vh1, Vh2, Vh3, Vh4, Vh5, Vh6, Vh7, Vh8, Vh9, Vh10, Vh11, Vh12 y Vh13 en solo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,
9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 residuos de aminoácido, en el que cada una de tales diferencias de secuencia es independientemente o bien una deleción, o bien una inserción o bien una sustitución de un aminoácido, dando como resultado las deleciones, inserciones y/o sustituciones de no más de 15 cambios de aminoácido con relación a las secuencias de dominio variable anteriores. La región variable de cadena pesada en algunas proteínas de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el
95%, el 97% o el 99% de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de Vh1, Vh2, Vh3, Vh4, Vh5, Vh6, Vh7, Vh8, Vh9, Vh10, Vh11, Vh12 y Vh13.
Determinadas proteínas de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de un dominio variable de cadena ligera seleccionado de Vl1,
Vl2, Vl3, Vl4, Vl5, Vl6, Vl7, Vl8, Vl9, Vl10, Vl11, Vl12, Vl13, Vl14, Vl15, Vl16 o Vl17 en solo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,
9, 10, 11, 12, 13, 14 o15 residuos de aminoácido, en el que cada una de tales diferencias de secuencia es independientemente o bien una deleción, o bien una inserción o bien una sustitución de un aminoácido, dando como resultado las deleciones, inserciones y/o sustituciones de no más de 15 cambios de aminoácido con relación a las secuencias de dominio variable anteriores. La región variable de cadena ligera en algunas proteínas de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 97% o el 99% de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de Vl1, Vl2, Vl3, Vl4, Vl5, Vl6, Vl7, Vl8, Vl9, Vl10, Vl11, Vl12, Vl13, Vl14, Vl15, Vl16 o Vl17.
En casos adicionales, las proteínas de unión a antígeno comprenden los siguientes emparejamientos de dominios variables de cadena ligera y cadena pesada: Vl1 con Vh1, Vl2 con Vh2, Vl3 con Vh3, Vl4 con Vh4, Vl5 con Vh5, Vl6 con Vh1, Vl7 con Vh6, Vl8 con Vh5, Vl9 con Vh1, Vl10 con Vh7, Vl11 con, H8, Vl12 con Vh9, Vl12 con Vh10, Vl13 con Vh5, Vl14 con Vh11, Vl15 con Vh12, Vl16 con Vh13 y Vl17 con Vh13. En algunos casos, las proteínas de unión a antígeno en los emparejamientos anteriores pueden comprender secuencias de aminoácidos que tienen el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 97% o el 99% de identidad de secuencia con los dominios variables especificados.
Todavía otras proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos inmunológicamente funcionales, incluyen formas de variante de una cadena pesada variante y una cadena ligera variante tal como acaba de describirse.
CDR
Las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer en el presente documento son polipéptidos en los que se injertan, insertan y/o unen una o más CDR. Una proteína de unión a antígeno puede tener 1, 2, 3, 4, 5 o 6 CDR. Por tanto, una proteína de unión a antígeno puede tener, por ejemplo, una cadena pesada CDR1 (“CDRH1 “) y/o una cadena pesada CDR2 (“CDRH2”) y/o una cadena pesada c Dr3 (“CDRH3”) y/o una cadena ligera CDR1 (“CDRL1”), y/o una cadena ligera CDR2 (“CDRL2”) y/o una cadena ligera CDR3 (“CDRL3”). Algunas proteínas de unión a antígeno incluyen tanto una CDRH3 como una CDRL3. Se identifican CDR de cadena pesada y ligera específicas en las tablas 4A y 4B, respectivamente.
Pueden identificarse regiones determinantes de complementariedad (CDR) y regiones de marco (FR) de un anticuerpo dado usando el sistema descrito por Kabat et al. en Sequences of Proteins of Inmunological Interest, 5a ed., Dpto. de Salud y Servicios Humanos de EE.UU., PHS, NIH, Publicación de NIH n.° 91-3242, 1991. Determinados anticuerpos que se dan a conocer en el presente documento comprenden una o más secuencias de aminoácidos que son idénticas o tienen una identidad de secuencia sustancial con las secuencias de aminoácidos de una o más de las CDR presentadas en la tabla 4A (CDRH) y la tabla 4B (CDRL).
Tabla 4A: Secuencias de aminoácidos CDR de cadena pesada a modo de ejemplo
Figure imgf000046_0001
Figure imgf000047_0001
Figure imgf000048_0001
Tabla 4B: Secuencias de aminoácidos CDR de cadena ligera a modo de ejemplo
Figure imgf000049_0001
Figure imgf000050_0002
Figure imgf000050_0001
La estructura y las propiedades de las CDR dentro de un anticuerpo que se produce de manera natural se han descrito, anteriormente. En resumen, en un anticuerpo tradicional, las CDR se incluyen dentro de una región de marco en la región variable de cadena pesada y ligera en la que constituyen las regiones responsables del reconocimiento y la unión a antígeno. Una región variable comprende al menos tres CDR de cadena pesada o ligera, véase, citado anteriormente (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Inmunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD; véase también Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883), dentro de una región de marco (regiones de marco designadas como 1-4, FRl, FR2, FR3 y FR4, por Kabat et al., 1991, citado anteriormente; véase también Chothia y Lesk, 1987, citado anteriormente,). Las CDR proporcionadas en el presente documento, sin embargo, no solo pueden usarse para definir el dominio de unión a antígeno de una estructura de anticuerpo tradicional, sino que pueden incluirse en una variedad de otras estructuras de polipéptido, tal como se describe en el presente documento.
En un aspecto, las CDR proporcionadas son (a) una CDRH seleccionada del grupo que consiste en (i) una CDRH1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97 y 100; (ii) una CDRH2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101 y 129; (iii) una CDRH3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102 y 123; y (iv) una CDRH de (i), (ii) y (iii) que contiene una o más, por ejemplo, una, dos, tres, cuatro o más sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones de no más de cinco, cuatro, tres, dos o un aminoácido(s); (B) una CDRL seleccionada del grupo que consiste en (i) una CDRL1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66 y 69; (ii) una CDRL2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67 y 70; (iii) una CDRL3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71 y 72; y (iv) una CDRL de (i), (ii) y (iii) que contiene una o más, por ejemplo, una, dos, tres, cuatro o más sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservativas), deleciones o inserciones de no más de cinco, cuatro, tres, dos o un aminoácido(s).
En otro aspecto, una proteína de unión a antígeno incluye 1, 2, 3, 4, 5 o 6 formas de variante de las CDR enumeradas en las tablas 4A y 4B, que tienen cada una al menos el 80%, el 85%, el 90% o el 95% de identidad de secuencia con una secuencia de c Dr enumerada en las tablas 4A y 4B. Algunas proteínas de unión a antígeno incluyen 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de las CDR enumeradas en las tablas 4A y 4B, difiriendo cada una en no más de 1, 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos de las CDR enumeradas en estas tablas.
Las CDR dadas a conocer en el presente documento incluyen secuencias consenso derivadas de grupos de anticuerpos monoclonales relacionados. Tal como se describe en el presente documento, una “secuencia consenso” se refiere a secuencias de aminoácidos que tienen aminoácidos conservados comunes entre varias secuencias y aminoácidos variables que varían dentro de una secuencia de aminoácidos dada. Las secuencias consenso de CDR proporcionadas incluyen CDR correspondientes a cada una de CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3.
Una proteína de unión a antígeno puede incluir las siguientes asociaciones de CDRL1, CDRL2 y CDRL3: SEQ ID NO: 42, 43 y 44; SEQ ID NO: 45, 46 y 47; SEQ ID NO: 48, 49 y 50; SEQ ID NO: 51, 52 y 53; SEQ ID NO: 54, 55 y 56; SEQ ID NO: 57, 58 y 59; SEQ ID NO: 60, 55 y 56; SEQ ID NO: 45, 61 y 47; SEQ ID NO: 62, 63 y 64; SEQ ID NO: 65, 55 y 56; SEQ ID NO: 66, 67 y 68; SEQ ID NO: 69, 70 y 71; y SEQ ID NO: 69, 70 y 72.
Una proteína de unión a antígeno puede incluir las siguientes asociaciones de CDRH1, CDRH2 y CDRH3: SEQ ID NO: 73, 74 y 75; SEQ ID NO: 76, 77 y 78; SEQ ID NO: 79, 80 y 81; SEQ ID NO: 82, 83 y 84; SEQ ID NO: 85, 86 y 87; SEQ ID NO: 88, 89 y 90; SEQ ID NO: 76, 91 y 78; SEQ ID NO: 92, 93 y 94; SEQ ID NO: 76, 95 y 78; SEQ ID NO: 73, 74 y 96; SEQ ID NO: 97, 98 y 99; y SEQ ID NO: 100, 101 y 102.
Una proteína de unión a antígeno puede incluir las siguientes asociaciones de CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con CDRH1, CDRH2 y CDRH3: SEQ ID NO: 42, 43 y 44 con SEQ ID NO: 73, 74 y 75; SEQ ID NO: 45, 46 y 47 con SEQ ID NO: 76, 77 y 78; SEQ ID NO: 48, 49 y 50 con SEQ ID NO: 79, 80 y 81; SEQ ID NO: 51, 52 y 53 con SEQ ID NO: 82, 83 y 84; SEQ ID NO: 54, 55 y 56 con SEQ ID NO: 85, 86 y 87; SEQ ID NO: 57, 58 y 59 con SEQ ID NO: 88, 89 y 90; SEQ ID NO: 60, 55 y 56 con SEQ ID NO: 85, 86 y 87; SEQ ID NO: 45, 61 y 47 con SEQ ID NO: 76, 91 y 78; SEQ ID NO: 62, 63 y 64 con SEQ ID NO: 92, 93 y 94; SEQ ID NO: 45, 61 y 47 con SEQ ID NO: 76, 95 y 78; SEQ ID NO: 65, 55 y 56 con SEQ ID NO: 85, 86 y 87; SEQ ID NO: 42, 43 y 44 con SEQ ID NO: 73, 74 y 96; SEQ ID NO: 66, 67 y 68 con SEQ ID NO: 97, 98 y 99; SEQ ID NO: 69, 70 y 71 con SEQ ID NO: 100, 101 y 102; y SEQ ID NO: 69, 70 y 72 con SEQ ID NO: 100, 101 y 102.
Se determinaron las secuencias consenso usando análisis de filogenia convencionales de las CDR correspondientes a Vh y Vl de anticuerpos anti-CGRP R. Las secuencias consenso se determinaron manteniendo las CDR contiguas dentro de la misma secuencia correspondiente a una Vh o Vl.
Tal como se ilustra en las figuras 3A, 3B, 4, 5A, 5B, 5C, 5D y 5E, el análisis de linaje de una variedad de las proteínas de unión a antígeno proporcionadas en el presente documento dio como resultado grupos de secuencias relacionadas, designados como grupos de CDR de cadena ligera K1, K2, K3 y K4 (figuras 3A y 3B), grupos de CDR de cadena ligera L1, L2, L3 y L4 (figura 4), y grupos de CDR de cadena pesada HC1 (figura 5A), HC2 (figura 5B), HC3 (figura 5C), HC4 (figura 5C), HC5 (figura 5D) y HC6 (figura 5E). Algunos de los grupos anteriores se usaron para generar secuencias consenso adicionales, tal como se ilustra en las figuras 3A, 3B, 4 y 5F, para producir grupos de CDR de cadena ligera K1,4 (figura 3A), K2,3 (figura 3B), L1,2,3 (figura 4) y LAII (figura 4), y grupos de CDR de cadena pesada HCA y HCB (figura 5F).
Las secuencias consenso de los diversos grupos de regiones de CDR se proporcionan a continuación:
Secuencia consenso de K1
CDR1 RASQGIRX1DLG (SEQ ID NO: 103), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en N y K.
CDR2 X1ASSLQS (SEQ ID NO: 104), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en A y G.
CDR3 LQYNX1X2PWT (SEQ ID NO: 105), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en I y S, y X2 se selecciona del grupo que consiste en Y y F.
Secuencia consenso de K4
CDR3 QQYGNSLX1R (SEQ ID NO: 106), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en S y C.
Secuencia consenso de K1,4
CDR1 RASQX1X2X3X4GX5LX6 (SEQ ID NO: 107), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en S y G, X2 se selecciona del grupo que consiste en V y I, X3 se selecciona del grupo que consiste en S y R, X4 se selecciona del grupo que consiste en S, N y K, X5 se selecciona del grupo que consiste en Y y D, y X6 se selecciona del grupo que consiste en T y G.
CDR2 X1ASSX2X3X4 (SEQ ID NO: 108), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en G y A, X2 se selecciona del grupo que consiste en R y L, X3 se selecciona del grupo que consiste en A y Q, y X4 se selecciona del grupo que consiste en T y S.
CDR3 X1QYX2X3X4X5X6X7 (SEQ ID NO: 109), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en Q y L, X2 se selecciona del grupo que consiste en G y N, X3 se selecciona del grupo que consiste en N y T, X4 se selecciona del grupo que consiste en S, Y y F, X5 se selecciona del grupo que consiste en L y P, X6 se selecciona del grupo que consiste en C, W y S, y X7 se selecciona del grupo que consiste en R y T.
Secuencia consenso de K3
CDR1 KSSQSLLHSX1GX2X3YLY (SEQ ID NO: 110), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en D y A, X2 se selecciona del grupo que consiste en R y K, y X3 se selecciona del grupo que consiste en N y T.
Secuencia consenso de K2,3
CDR1 X1SSQSLLHSX2GX3X4YLX5 (SEQ ID NO: 111), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en R y K, X2 se selecciona del grupo que consiste en F, D y A, X3 se selecciona del grupo que consiste en Y, R y K, X4 se selecciona del grupo que consiste en N y T, y X5 se selecciona del grupo que consiste en D e Y.
CDR2 X1X2SNRX3S (SEQ ID NO: 112), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en L y E, X2 se selecciona del grupo que consiste en G y V, y X3 se selecciona del grupo que consiste en A y F.
CDR3 MQX1X2X3X4PX5T (SEQ ID NO: 113), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en A y S, X2 se selecciona del grupo que consiste en L y F, X3 se selecciona del grupo que consiste en Q y P, X4 se selecciona del grupo que consiste en T y L, y X5 se selecciona del grupo que consiste en F y L.
Secuencia consenso de Lm3
CDR2 RX1NQRPS (SEQ ID NO: 114), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en N y S.
Secuencia consenso de Lm1,2,3
CDR1 SGSSSNIGX1NX2VX3 (SEQ ID NO: 115), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en N y S, X2 se selecciona del grupo que consiste en Y y T, y X3 se selecciona del grupo que consiste en S, N e Y.
CDR2 X1X2NXsRPS (SEQ ID NO: 116), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en D, T y R, X2 se selecciona del grupo que consiste en N y S, y X3 se selecciona del grupo que consiste en K y Q.
CDR3 X1X2X3DNXsLX6X7W (SEQ ID NO: 117), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en G y A, X2 se selecciona del grupo que consiste en T y A, X3 se selecciona del grupo que consiste en W y R, X4 se selecciona del grupo que consiste en S y D, X5 se selecciona del grupo que consiste en R y S, X6 se selecciona del grupo que consiste en S y N, y X7 se selecciona del grupo que consiste en A y G.
Secuencia consenso de LAll
CDR1 X1GX2X3SX4X5X6X7 X8XgX10X11 (SEQ ID NO: 118), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en S y Q, X2 está presente o ausente, y si está presente, es S, X3 se selecciona del grupo que consiste en S y D, X4 está presente o ausente, y si está presente, es N, X5 se selecciona del grupo que consiste en I y L, X6 se selecciona del grupo que consiste en G y R, X7 se selecciona del grupo que consiste en N y S, X8 se selecciona del grupo que consiste en N y F, X9 se selecciona del grupo que consiste en Y y T, X10 se selecciona del grupo que consiste en V y A, y X11 se selecciona del grupo que consiste en S, N e Y.
CDR2 X1X2NX3RPS (SEQ ID NO: 119), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en D, G, T y R, X2 se selecciona del grupo que consiste en N, K y S, y X3 se selecciona del grupo que consiste en K, N y Q.
CDR3 X1X2X3DX4X5X6X7X8X9V (SEQ ID NO: 120), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en G, N y A, X2 se selecciona del grupo que consiste en T, S y A, X3 se selecciona del grupo que consiste en W y R, X4 se selecciona del grupo que consiste en S y D, X5 se selecciona del grupo que consiste en R y S, X6 se selecciona del grupo que consiste en L y V, X7 se selecciona del grupo que consiste en S, Y y N, X8 se selecciona del grupo que consiste en A, H y G, y X9 se selecciona del grupo que consiste en V y L.
Secuencia consenso de HC1
CDR1 X1YYMX2 (SEQ ID NO: 121), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en G y D, X2 se selecciona del grupo que consiste en H e Y.
CDR2 WIX1PNSGGTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 122), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en N y S. CDR3 X1X2X3SX4X5X6X7X8GX9X10X11X12YYX13GMDV (SEQ ID NO: 123), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en D y G, X2 se selecciona del grupo que consiste en Q y G, X3 se selecciona del grupo que consiste en M e Y, X4 se selecciona del grupo que consiste en I y G, X5 se selecciona del grupo que consiste en I e Y, X6 se selecciona del grupo que consiste en M y A, X7 está presente o ausente, y si está presente, es L, X8 está presente o ausente, y si está presente, es R, X9 se selecciona del grupo que consiste en V y L, X10 se selecciona del grupo que consiste en F e Y, X11 se selecciona del grupo que consiste en P y S, X12 se selecciona del grupo que consiste en P y H, y X13 está presente o ausente, y si está presente, es Y.
Secuencia consenso de HC2
CDR2 RIKSX1TDGGTTDYX2APVKG (SEQ ID NO: 124), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en K y T, y X2 se selecciona del grupo que consiste en T y A.
Secuencia consenso de HC3
CDR1 X1YX2MX3 (SEQ ID NO: 125), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en T y S, X2 se selecciona del grupo que consiste en S y A, y X3 se selecciona del grupo que consiste en N y S.
CDR2 X1ISX2SX3X4XsX6YYADSVKG (SEQ ID NO: 126), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en S y A, X2 se selecciona del grupo que consiste en S y G, X3 se selecciona del grupo que consiste en S y G, X4 se selecciona del grupo que consiste en S y G, X5 se selecciona del grupo que consiste en Y y R, y X6 se selecciona del grupo que consiste en R y T.
CDR3 X1X2X3X4X8X4X5X6X7PYSX8X9WYDYYYGMDV (SEQ ID NO: 127), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en E y D, X2 se selecciona del grupo que consiste en G y Q, X3 se selecciona del grupo que consiste en V y R, X4 se selecciona del grupo que consiste en S y E, X5 se selecciona del grupo que consiste en G y V, X6 se selecciona del grupo que consiste en S y G, X7 está presente o ausente, y si está presente, es S, X8 se selecciona del grupo que consiste en I y S, y X9 se selecciona del grupo que consiste en S y G.
Secuencia consenso de HC4
CDR1 SX1GMH (SEQ ID NO: 128), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en F e Y.
CDR2 VISX1DGSX2KYX3X4DSVKG (SEQ ID NO: 129), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en F e Y, X2 se selecciona del grupo que consiste en I y H, X3 se selecciona del grupo que consiste en S e Y, y X4 se selecciona del grupo que consiste en V y A.
CDR3 X1RX2X3X4X5X6SX7X8YYX9X10X11YYGX12X13V (SEQ ID NO: 130), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en D y E, X2 se selecciona del grupo que consiste en L y K, X3 se selecciona del grupo que consiste en N y R, X4 se selecciona del grupo que consiste en Y y V, X5 se selecciona del grupo que consiste en Y y T, X6 se selecciona del grupo que consiste en D y M, X7 se selecciona del grupo que consiste en S y T, X8 se selecciona del grupo que consiste en G y L, X9 se selecciona del grupo que consiste en H e Y, X10 está presente o ausente, y si está presente, es Y, X11 se selecciona del grupo que consiste en K y F, X12 se selecciona del grupo que consiste en M y L, y X13 se selecciona del grupo que consiste en A y D.
Secuencia consenso de HCA
CDR1 X1X2X3MX4 (SEQ ID NO: 131), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en N y S, X2 se selecciona del grupo que consiste en A, Y y F, X3 se selecciona del grupo que consiste en W, A y G, y X4 se selecciona del grupo que consiste en S y H.
CDR2 X1IX2X3X4X5X6GX7X8X9X10X11X12X13X14VKG (SEQ ID NO: 132), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en R, A y V, X2 se selecciona del grupo que consiste en K, S y W, X3 se selecciona del grupo que consiste en S, G, F e Y, X4 está presente o ausente, y si está presente, se selecciona del grupo que consiste en K y T, X5 está presente o ausente, y si está presente, es T, X6 se selecciona del grupo que consiste en D y S, X7 se selecciona del grupo que consiste en G y S, X8 se selecciona del grupo que consiste en T, R, I, N y H, X9 se selecciona del grupo que consiste en T y K, X10 se selecciona del grupo que consiste en D e Y, X11 se selecciona del grupo que consiste en Y y S, X12 se selecciona del grupo que consiste en T, A y V, X13 se selecciona del grupo que consiste en A y D, y X14 se selecciona del grupo que consiste en P y S.
CDR3 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17GX18X19V (SEQ ID NO: 133), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en D, A y E, X2 se selecciona del grupo que consiste en R, Q y G, X3 se selecciona del grupo que consiste en T, R, L, G y K, X4 se selecciona del grupo que consiste en G, E, N, I y R, X5 se selecciona del grupo que consiste en Y, V y A, X6 se selecciona del grupo que consiste en S, G, Y, A y T, X7 se selecciona del grupo que consiste en l, P, D, A y M, X8 está presente o ausente, y si está presente, se selecciona del grupo que consiste en S e Y, X9 está presente o ausente, y si está presente, se selecciona del grupo que consiste en W, S y T, X10 se selecciona del grupo que consiste en S, G y L, X11 se selecciona del grupo que consiste en S, G, L e Y, X12 está presente o ausente, y si está presente, se selecciona del grupo que consiste en W e Y, X13 se selecciona del grupo que consiste en Y y H, X14 está presente o ausente, y si está presente, se selecciona del grupo que consiste en Y y D, X15 se selecciona del grupo que consiste en Y, K y F, X16 está presente o ausente, y si está presente, es Y, X17 está presente o ausente, y si está presente, es Y, X18 se selecciona del grupo que consiste en M y L, y X19 se selecciona del grupo que consiste en D y A.
Secuencia consenso de HCB
CDR1 X1X2X3X4X5 (SEQ ID NO: 134), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en N, G, D, S y A, X2 se selecciona del grupo que consiste en A, F e Y, X3 se selecciona del grupo que consiste en W, Y, A y G, X4 se selecciona del grupo que consiste en M y L, y X5 se selecciona del grupo que consiste en S y H.
CDR2 X1IX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17G (SEQ ID NO: 135), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en R, W, A, V, S y F, X2 se selecciona del grupo que consiste en K, N, S, W y R, X3 se selecciona del grupo que consiste en S, P, G, F e Y, X4 está presente o ausente, y si está presente, se selecciona del grupo que consiste en K, T y R, X5 está presente o ausente, y si está presente, se selecciona del grupo que consiste en T y A, X6 se selecciona del grupo que consiste en D, N, H, S e Y, X7 se selecciona del grupo que consiste en G y S, X8 se selecciona del grupo que consiste en G y S, X9 se selecciona del grupo que consiste en T, G, R, I, N, H e Y, X10 se selecciona del grupo que consiste en T, K, R y P, X11 se selecciona del grupo que consiste en D, N, Y y E, X12 se selecciona del grupo que consiste en Y y S, X13 se selecciona del grupo que consiste en T, A y V, X14 se selecciona del grupo que consiste en A, Q y D, X15 se selecciona del grupo que consiste en P, K y S, X16 se selecciona del grupo que consiste en V y F, y X17 se selecciona del grupo que consiste en K y Q.
CDR3 X1X2X3X4X5SX6X7X8X9 X10X11X12X13X14X15X16GX17X18V (SEQ ID NO: 136), en la que X1 se selecciona del grupo que consiste en D, G, A y E, X2 se selecciona del grupo que consiste en R, G y Q, X3 se selecciona del grupo que consiste en T, M, Y, R, L, G y K, X4 se selecciona del grupo que consiste en G, S, E, N, I y R, X5 se selecciona del grupo que consiste en Y, I, G, V y A, X6 se selecciona del grupo que consiste en S, I, Y, G, A y T, X7 se selecciona del grupo que consiste en I, M, A, P y D, X8 está presente o ausente, y si está presente, se selecciona del grupo que consiste en S, L e Y, X9 está presente o ausente, y si está presente, se selecciona del grupo que consiste en W, R, S y T, X10 se selecciona del grupo que consiste en S, G y L, X11 se selecciona del grupo que consiste en S, V, L, G e Y, X12 está presente o ausente, y si está presente, se selecciona del grupo que consiste en F, Y y W, X13 se selecciona del grupo que consiste en Y, P, S y H, X14 está presente o ausente, y si está presente, se selecciona del grupo que consiste en Y, P, D y H, X15 se selecciona del grupo que consiste en Y, K y F, X16 está presente o ausente, y si está presente, es Y, X17 está presente o ausente, y si está presente, es Y, y X18 se selecciona del grupo que consiste en M y L.
En algunos casos la proteína de unión a antígeno comprende al menos una CDR1, CDR2 o CDR3 de cadena pesada que tiene una de las secuencias consenso anteriores. En algunos casos, la proteína de unión a antígeno comprende al menos una CDR1, CDR2 o CDR3 de cadena ligera que tiene una de las secuencias consenso anteriores. En otros casos, la proteína de unión a antígeno comprende al menos dos CDR de cadena pesada según las secuencias consenso anteriores, y/o al menos dos CDR de cadena ligera según las secuencias consenso anteriores. En todavía otros casos, la proteína de unión a antígeno comprende al menos tres CDR de cadena pesada según las secuencias consenso anteriores, y/o al menos tres CDR de cadena ligera según las secuencias consenso anteriores.
Proteínas de unión a antígeno a modo de ejemplo
Se ilustra un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica que se une a CGRP R que comprende (A) una o más regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDRH) seleccionadas del grupo que consiste en: (i) una CDRH1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97 y 100; (ii) una Cd Rh2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101 y 129; (iii) una CDRH3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102 y 123; y (iv) una CDRH de (i), (ii) y (iii) que contiene una o más, por ejemplo, una, dos, tres, cuatro o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácido de no más de cinco, cuatro, tres, cuatro, dos o un aminoácido(s); (B) una o más regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (CDRL) seleccionadas del grupo que consiste en: (i) una CDRL1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66 y 69; (ii) una c DrL2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67 y 70; (iii) una CDRL3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71 y 72; y (iv) una CDRL de (i), (ii) y (iii) que contiene una o más, por ejemplo, una, dos, tres, cuatro o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácido de no más de cinco, cuatro, tres, cuatro, dos o un aminoácido(s); o (C) una o más CDRH de cadena pesada de (A) y una o más CDRL de cadena ligera de (B).
El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindicapuede comprender (A) una CDRH seleccionada del grupo que consiste en (i) una CDRH1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97 y 100; (ii) una CDRH2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101 y 129; y (iii) una CDRH3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102 y 123; (B) una CDRL seleccionada del grupo que consiste en (i) una CDRL1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66 y 69; (ii) una CDRL2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67 y 70; y (iii) una CDRL3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71 y 72; o (C) una o más CDRH de cadena pesada de (A) y una o más CDRL de cadena ligera de (B). En una realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica puede incluir (A) una CDRH1 de SEQ ID NO:73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97 y 100, una CDRH2 de SEQ ID NO: 74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101 y 129, y una CDRH3 de SEQ ID NO: 75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102 y 123, y (B) una CDRL1 de SEQ ID NO: 42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66 y 69, una CDRL2 de SEQ ID NO: 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67 y 70, y una CDRL3 de SEQ ID NO:44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71 y 72.
En otra realización, la región variable de cadena pesada (Vh) tiene al menos el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 97% o el 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 158-170 y/o la Vl tiene al menos el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 97% o el 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 137-153. en una realización adicional, la Vh se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 158-170 y/o la Vl se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 137-153.
También se proporciona un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica que se une específicamente a un epítopo formado de residuos de aminoácido de ambos componentes CRLR y RAMP1 del CGRP R.
En otra realización más, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica descrito anteriormente en el presente documento comprende una primera secuencia de aminoácidos que comprende al menos una de las secuencias consenso de CDRH que se dan a conocer en el presente documento y una segunda secuencia de aminoácidos que comprende al menos una de las secuencias consenso de CDRL que se dan a conocer en el presente documento. En un aspecto, la primera secuencia de aminoácidos comprende al menos dos de las secuencias consenso de CDRH y/o la segunda secuencia de aminoácidos comprende al menos dos de las secuencias consenso de CDRL.
En ciertas realizaciones, la primera y la segunda secuencia de aminoácidos están unidas covalentemente entre sí.
En una realizacióna adicional, la primera secuencia de aminoácidos puede incluir las CDRH3 de SEQ ID NO: 75, 78, 81,84, 87, 90, 96, 99, 102 y 123, CDRH2 de SEQ ID NO: 74, 77, 80, 83, 86, 89, 91,93, 95, 98, 101 y 129 y CDRH1 de SEQ iD NO: 73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97 y 100, y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada puede comprender las CDRL3 de SEQ ID NO: 44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71 y 72, CDRL2 de SEQ ID NO: 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67 y 70 y CDRL1 de SEQ ID NO: 42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66 y 69.
La proteína de unión a antígeno puede comprender al menos dos secuencias de CDRH de las secuencias de cadena pesada H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12 o H13, tal como se muestra en la tabla 5A.
Además, la proteína de unión a antígeno puede comprender al menos dos secuencias de CDRL de las secuencias de cadena ligera L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10, L11, L12, L13, L14, L15, L16 o L17, tal como se muestra en la tabla 5B. Además, la proteína de unión a antígeno puede comprender al menos dos secuencias de CDRH de las secuencias de cadena pesada H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12 o H13, tal como se muestra en la tabla 5A, y al menos dos CDRL de las secuencias de cadena ligera L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10, L11, L12, L13, L14, L15, L16 o L17, tal como se muestra en la tabla 5B.
Además, la proteína de unión a antígeno puede comprender las secuencias de CDRH1, CDRH2 y CDRH3 de las secuencias de cadena pesada H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12 o H13, tal como se muestra en la tabla 5A. Además, la proteína de unión a antígeno puede comprender las secuencias de CDRL1, CDRL2 y CDRL3 de las secuencias de cadena ligera L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10, L11, L12, L13, L14, L15, L16 o L17, tal como se muestra en la tabla 5B.
Además, la proteína de unión a antígeno puede comprender las seis CDR de L1 y H1 o L2 y H2 o L3 y H3 o L4 y H4 o L5 y H5 o L6 y H1 o L7 y H6 o L8 y H5 o L9 y H1 o L10 y H7 o L11 y H8 o L12 y H9 o L12 y H10 o L13 y H5 o L14 y H11 o L15 y H12 o L16 y H13 o L17 y H13, tal como se muestra en las tablas 5A y 5B.
Tabla 5A - Regiones de secuencia de aminoácidos de cadena pesada a modo de ejemplo
Figure imgf000056_0001
Figure imgf000057_0001
Tabla 5B - Regiones de secuencia de aminoácidos de cadena ligera a modo de ejemplo
Figure imgf000057_0002
Figure imgf000058_0001
En un aspecto, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica proporcionado en el presente documento puede ser un un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano, un anticuerpo huanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico o un fragmento de unión a antígeno de anticuerpo de los mismos.
En otra realización, el fragmento de unión a antígeno aisladas proporcionadas en el presente documento puede ser un fragmento Fab, un fragmento Fab’, un fragmento F(ab’)2, un fragmento Fv, un diacuerpo o una molécula de anticuerpo de cadena sencilla.
En una realización adicional, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica proporcionado en el presente documento es un anticuerpo humano y puede ser del tipo de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
En otra realización, la proteína de unión a antígeno consiste solamente en un polipéptido de cadena ligera o pesada tal como se expone en las tablas 5A-5B. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno consiste solamente en un dominio variable de cadena ligera o de cadena pesada tal como los enumerados en las tablas 5A-5B. Tales proteínas de unión a antígeno pueden pegilarse con una o más moléculas de PEG.
En aún otro aspecto, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica proporcionado en el presente documento puede acoplarse a un grupo de marcaje y puede competir por la unión a la parte extracelular de CGRP R humano con una proteína de unión a antígeno de uno de los anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno de los mismos tal como se reivindican proporcionados en el presente documento. En una realización, el anticuerpo monoclonal o feagmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica proporcionada en el presente documento puede reducir la quimiotaxia de monocitos, inhibir la migración de monocitos a tumores o inhibir la acumulación y función de macrófagos asociados a tumor en un tumor cuando se administra a un paciente.
Tal como apreciarán los expertos en la técnica, para cualquier proteína de unión a antígeno con más de una CDR de las secuencias representadas, cualquier combinación de CDR seleccionadas independientemente de las secuencias representadas es útil. Por tanto, pueden generarse proteínas de unión a antígeno con una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR seleccionadas independientemente. Sin embargo, como apreciarán los expertos en la técnica, realizaciones específicas utilizan generalmente combinaciones de CDR que no son repetitivas, por ejemplo, las proteínas de unión a antígeno no se producen generalmente con dos regiones CDRH2, etc.
Algunas de las proteínas de unión a antígeno proporcionadas se comentan con más detalle a continuación.
Proteínas de unión a antígeno y epítopos de unión y dominios de unión tal como se reivindican
Cuando se dice que una proteína de unión a antígeno se une a un epítopo, tal como uno o ambos componentes de CGRP R, o el dominio extracelular de CGRP R, por ejemplo, lo que quiere decirse es que la proteína de unión a antígeno se une específicamente a una parte especificada de CGRP R, que puede estar en CRLR, RAMP1, o abarcar partes tanto de CRLR como de RAMP1. En casos en los que la proteína de unión a antígeno se une solo a CRLR (y no a RAMP1), no se esperaría que la proteína de unión a antígeno se una selectivamente a CGRP R porque CRLR se comparte, entre otros, con AM1 y receptores de AM1. De manera similar, en casos en los que la proteína de unión a antígeno se une solo a RAMP1 (y no a CRLR), no se esperaría que la proteína de unión a antígeno se una selectivamente a CGRP R porque RAMP1 se comparte, entre otros, con el receptor de AMY1. En casos en los que la proteína de unión a antígeno interacciona tanto con CRLR como con RAMP1, se espera que la proteína de unión a antígeno se una a residuos o secuencias de residuos, o regiones tanto en CRLR como en RAMP1. En ninguna de las realizaciones anteriores se espera que una proteína de unión a antígeno entre en contacto con cada residuo dentro de CRLR o RAMP1. De manera similar, no se espera que cada sustitución o deleción de aminoácido dentro de CRLR, RAMP1 o los dominios extracelulares afecte significativamente a la afinidad de unión.
Pueden usarse los métodos detallados, por ejemplo, en el ejemplo 10, para evaluar qué regiones de receptores multiméricos, tales como CGRP R, pueden estar implicadas en la unión a proteínas de unión a antígeno seleccionadas.
Proteínas de unión a antígeno que compiten tal como se reivindica
En otro aspecto, se proporcionan proteínas de unión a antígeno que compiten con uno de los anticuerpos ejemplificados, o de “referencia” o fragmentos funcionales que se unen al epítopo descrito anteriormente para la unión específica a CGRP R. Tales proteínas de unión a antígeno también pueden unirse al mismo epítopo que una de las proteínas de unión a antígeno ejemplificadas en el presente documento, o un epítopo solapante. Se espera que las proteínas de unión a antígeno y fragmentos que compiten con o se unen al mismo epítopo que las proteínas de unión a antígeno de referencia muestren propiedades funcionales similares. Las proteínas de unión a antígeno y fragmentos ejemplificados incluyen aquellos con las cadenas pesadas y ligeras, dominios de regiones variables Vl1 -Vl17 y Vh1 - Vh13 y CDR incluidos en las tablas 2A, 2B, 3, 4A, 4B, 5A y 5B. Por tanto, como ejemplo específico, las proteínas de unión a antígeno que se proporcionan incluyen aquellas que compiten con un anticuerpo que tiene: (a) las 6 CDR enumeradas para un anticuerpo enumeradas en las tablas 5A y 5B; (b) una Vh y una Vl seleccionadas de VL1 - Vl 17 y VH1 - Vh13 y enumeradas para un anticuerpo enumeradas en las tablas 5A y 5B; o (c) dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas tal como se especifica para un anticuerpo enumeradas en las tablas 5A y 5B. Otros ejemplos de anticuerpos de referencia adecuados incluyen aquellos que tienen una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia correspondiente a cualquiera de las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 158-170 y una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia correspondiente a cualquiera de las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 137-153.
Puede evaluarse la competencia de unión, por ejemplo, usando un ensayo de unión, tales como el ensayo de Biacore descrito en el ejemplo 7, a continuación. En ese ejemplo, se sometieron a prueba 19 anticuerpos descritos en el presente documento frente a cada uno de seis anticuerpos de “referencia”: cinco anticuerpos neutralizantes (11011, 3B6, 4H6, 12G8 y 9F5) y un anticuerpo no neutralizante (34E3). Los resultados de ensayo, mostrados en la tabla 13, indican que todos los anticuerpos neutralizantes sometidos a prueba (1E11, 1H7, 2E7, 3B6, 3C8, 4E4, 4H6, 5F5, 9D4, 9F5, 10E4, 11D11, 11H9, 12E8, 12G8, 13H2 y 32H7) se unen esencialmente a la misma región de CGRP R, que es distinta de la región de CGRP R que se une por los anticuerpos no neutralizantes sometidos a prueba (32H8, 33B5, 33E4 y 34E3). Basándose en estos datos, cualquiera de los anticuerpos neutralizantes produciría proteínas de unión a antígeno de referencia a modo de ejemplo en un ensayo de competencia, particularmente cualquiera de los anticuerpos neutralizantes que se inmovilizaron en el ensayo descrito en el ejemplo 7: 11D11, 3B6, 4H6, 12G8 y 9F5.
Anticuerpos monoclonales
Las proteínas de unión a antígeno que se proporcionan son anticuerpos monoclonales (o fragmentos de unión a antígeno de los mismos) que se unen a CGRP R. Pueden producirse anticuerpos monoclonales usando cualquier técnica conocida en la técnica, por ejemplo, mediante la inmortalización de células de bazo recogidas del animal transgénico tras completarse el programa de inmunización. Las células de bazo pueden inmortalizarse usando cualquier técnica conocida en la técnica, por ejemplo, fusionándolas con células de mieloma para producir hibridomas. Las células de mieloma para su uso en procedimientos de fusión de producción de hibridomas preferiblemente no producen anticuerpos, tienen alta eficiencia de fusión y deficiencias enzimáticas que hacen que no puedan crecer en determinados medios selectivos que soportan el crecimiento solo de las células fusionadas deseadas (hibridomas). Los ejemplos de líneas celulares adecuadas para su uso en fusiones de ratón incluyen Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XXO Bul; ejemplos de líneas celulares usadas en fusiones de rata incluyen R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210. Otras líneas celulares útiles para fusiones celulares son U-266, GM1500-GRG2, LICRLON-HMy2 y UC729-6. Un método de preparación de anticuerpos monoclonales a modo de ejemplo se describe en el ejemplo 2, a continuación.
En algunos casos, se produce una línea celular de hibridoma inmunizando un animal (por ejemplo, un animal transgénico que tiene secuencias de inmunoglobulina humana) con un inmunógeno de CGRP R; recogiendo células de bazo del animal inmunizado; fusionando las células de bazo recogidas con una línea celular de mieloma, generando de ese modo células de hibridoma; estableciendo líneas celulares de hibridoma a partir de las células de hibridoma, e identificando una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo que se une a CGRP R (por ejemplo, tal como se describe en los ejemplos 1-3, a continuación). Tales líneas celulares de hibridoma, y anticuerpos monoclonales anti-CGRP R producidos por las mismas, son aspectos de la presente solicitud.
Los anticuerpos monoclonales secretados por una línea celular de hibridoma pueden purificarse usando cualquier técnica conocida en la técnica. Los hibridomas o AcM pueden examinarse además para identificar AcM con propiedades particulares, tales como la capacidad para unirse a células que expresan CGRP, la capacidad para bloquear o interferir en la unión del ligando de CGRP o el péptido CGRP8-37, o la capacidad para bloquear funcionalmente el receptor, por ejemplo, usando un ensayo de AMPc, por ejemplo, tal como se describe a continuación.
Anticuerpos quiméricos y humanizados
También se proporcionan anticuerpos quiméricos y humanizados basándose en las secuencias anteriores. Los anticuerpos monoclonales para su uso como agentes terapéuticos pueden modificarse de varios modos antes de su uso. Un ejemplo es un anticuerpo quimérico, que es un anticuerpo que se compone de segmentos de proteína de diferentes anticuerpos que se unen covalentemente para producir cadenas ligeras o pesadas de inmunoglobulina funcionales o partes inmunológicamente funcionales de las mismas. Generalmente, una parte de la cadena pesada y/o cadena ligera es idéntica a u homóloga con respecto a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la (s) cadena(s) es/son idénticas a u homóloga(s) con respecto a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo. Para métodos relacionados con anticuerpos quiméricos, véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 4.816.567; y Morrison et al., 1985, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 81:6851 -6855. Se describe el injerto de CDR, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.° 6.180.370, n.25.693.762, n.25.693.761, n.25.585.089 y n.25.530.101.
Generalmente, el objetivo de producir un anticuerpo quimérico es crear una quimera en la que se maximiza el número de aminoácidos de la especie del paciente pretendido. Un ejemplo es el anticuerpo “con CDR injertada”, en el que el anticuerpo comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una especie particular o perteneciente a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de cadena(s) del anticuerpo es/son idénticas a u homóloga(s) con respecto a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo. Para su uso en seres humanos, la región variable o CDR seleccionadas de un anticuerpo de roedor se injertan con frecuencia en un anticuerpo humano, reemplazando las regiones variables que se producen de manera natural o CDR del anticuerpo humano.
Un tipo útil de anticuerpo quimérico es un anticuerpo “humanizado”. Generalmente, un anticuerpo humanizado se produce a partir de un anticuerpo monoclonal producido inicialmente en un animal no humano. Determinados residuos de aminoácido en este anticuerpo monoclonal, normalmente de partes sin reconocimiento de antígeno del anticuerpo, se modifican para que sean homólogos con respecto a residuos correspondientes en un anticuerpo humano de isotipo correspondiente. La humanización puede realizarse, por ejemplo, usando diversos métodos sustituyendo al menos una parte de una región variable de roedor para las regiones correspondientes de un anticuerpo humano (véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.° 5.585.089 y n.° 5.693.762; Jones et al.,
1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-27; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536).
En un aspecto, las CDR de las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos proporcionados en el presente documento (véase la tabla 4) se injertan en regiones de marco (FR) de anticuerpos de la misma especie filogenética o una diferente. Por ejemplo, las CDR de las regiones variables de cadena pesada y ligera Vh1, Vh2,
Vh3, Vh4, Vh5, Vh6, Vh7, Vh8, Vh9, Vh10, Vh11, Vh12 y Vh13 y/o Vl1, Vl2, Vl3, Vl4, Vl5, Vl11, Vl12, Vl13, Vl14, Vl15, Vl16 y Vl17 pueden injertase en FR humanas de secuencia consenso. Para crear FR humanas de secuencia consenso, pueden alinearse FR de varias secuencias de aminoácidos de cadena pesada o de cadena ligera humanas para identificar una secuencia de aminoácidos consenso. En otras realizaciones, se reemplazan las FR de una cadena pesada o cadena ligera dadas a conocer en el presente documento por las FR de una cadena pesada o cadena ligera diferente. En un aspecto, no se reemplazan aminoácidos poco frecuentes en las FR de las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo anti-CGRP R, mientras que se reemplazan el resto de aminoácidos de FR. Un “aminoácido poco frecuente” es un aminoácido específico que está en una posición en la que este aminoácido particular no se encuentra habitualmente en una FR. Alternativamente, las regiones variables injertadas de una cadena pesada o ligera pueden usarse con una región constante que es diferente de la región constante de esa cadena pesada o ligera particular tal como se da a conocer en el presente documento. En otras realizaciones, las regiones variables injertadas forman parte de un anticuerpo Fv de cadena sencilla.
En determinadas realizaciones, pueden usarse regiones constantes de especies distintas de la humana junto con la(s) región/regiones variable(s) humana(s) para producir anticuerpos híbridos.
Anticuerpos completamente humanos
También se proporcionan anticuerpos completamente humanos. Están disponibles métodos para producir anticuerpos completamente humanos específicos para un antígeno dado sin exponer a los seres humanos al antígeno (“anticuerpos completamente humanos”). Un medio específico proporcionado para implementar la producción de anticuerpos completamente humanos es la “humanización” del sistema inmunitario humoral del ratón. La introducción de loci de inmunoglobulina (lg) humana en ratones en los que se han inactivado los genes de Ig endógenos es un medio de producción de anticuerpos monoclonales (AcM) completamente humanos en el ratón, un animal que puede inmunizarse con cualquier antígeno deseado. Usando anticuerpos completamente humanos puede minimizarse las inmunogénicas y alérgicas respuestas que pueden estar provocadas a veces por la administración de AcM de ratón o derivados de ratón a seres humanos como agentes terapéuticos.
Pueden producirse anticuerpos completamente humanos inmunizando animales transgénicos (habitualmente ratones) que pueden producir un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Los antígenos para este fin tienen normalmente seis o más aminoácidos contiguos, y opcionalmente se conjugan con un portador, tal como un hapteno. Véanse, por ejemplo, Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555; Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-258; y Bruggermann et al., 1993, Year in Immunol. 7:33. En un ejemplo de un método de este tipo, se producen animales transgénicos incapacitando los loci de inmunoglobulina de ratón endógena que codifican para las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina de ratón en los mismos, e insertándolos en los fragmentos grandes de genoma de ratón de ADN de genoma humano que contiene loci que codifican para proteínas de cadena pesada y ligera humanas. Entonces se someten a fecundación cruzada animales parcialmente modificados, que tienen menos que el complemento completo de loci de inmunoglobulina humana, para obtener un animal que tiene todas las modificaciones deseadas del sistema inmunitario. Cuando se administra un inmunógeno, estos animales transgénicos producen anticuerpos que son inmunoespecíficos para el inmunógeno pero tienen secuencias de aminoácidos humanas en vez de murinas, incluyendo las regiones variables. Para detalles adicionales de tales métodos, véanse, por ejemplo, los documentos WO96/33735 y WO94/02602. Se describen métodos adicionales relativos a ratones transgénicos para producir anticuerpos humanos en las patentes estadounidenses n.° 5.545.807; n.° 6.713.610; n.° 6.673.986; n.° 6.162.963; n.° 5.545.807; n.26.300.129; n.26.255.458; n.25.877.397; n.25.874.299 y n.25.545.806; en las publicaciones PCT WO91/10741, WO90/04036 y en los documentos EP 546073B1 y EP 546073A1.
Los ratones transgénicos descritos anteriormente, denominados en el presente documento ratones “AcMHu”, contienen un minilocus de gen de inmunoglobulina humana que codifica para secuencias de inmunoglobulina no reorganizadas de cadena pesada ([mu] y [gamma]) y cadena ligera [kappa], junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci endógenos de cadena [mu] y [kappa] (Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859). Por consiguiente, los ratones presentan una reducción de la expresión de [kappa] o IgM de ratón y en respuesta a la inmunización, y los transgenes introducidos de cadena pesada y ligera humana experimentan cambio de clase y mutación somática para generar anticuerpos monoclonales de IgG [kappa] humana de alta afinidad (Lonberg et al., citado anteriormente.; Lonberg y Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding y Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546). La preparación de ratones AcMHu se describe en detalle en Taylor et al., 1992, Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen et al., 1993, International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al., 1994, J. Immunol.
152:2912-2920; Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113:49-101; Taylor et al., 1994, International Immunology 6:579-591; Lonberg y Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding y Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546; Fishwild et al., 1996, Nature Biotechnology 14:845-851. Véanse, además las patentes estadounidenses n.° 5.545.806; n.° 5.569.825; n.° 5.625.126; n.° 5.633.425; n.° 5.789.650; n.2 5.877.397; n.2 5.661.016; n.2 5.814.318; n.2 5.874.299; y n.25.770.429; así como la patente estadounidense n.° 5.545.807; las publicaciones internacionales n os WO 93/1227; WO 92/22646; y WO 92/03918. Las tecnologías utilizadas para producir anticuerpos humanos en estos ratones transgénicos se dan a conocer también en el documento Wo 98/24893 y Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15:146-156. Por ejemplo, pueden usarse las cepas de ratones transgénicos HCo7 y HCo12 para generar anticuerpos anti-CGRP R. Se proporcionan detalles adicionales referentes a la producción de anticuerpos humanos usando ratones transgénicos en los ejemplos a continuación.
Usando la tecnología del hibridoma, pueden producirse AcM humanos específicos de antígeno con la especificidad deseada y seleccionarse de los ratones transgénicos tales como los descritos anteriormente. Tales anticuerpos pueden clonarse y expresarse usando un vector y una célula huésped adecuados, o los anticuerpos pueden recogerse de células de hibridoma en cultivo.
También pueden derivarse anticuerpos completamente humanos de bibliotecas de presentación en fago (como las dadas a conocer en Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol. 227:381; y Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581). Las técnicas de presentación en fago imitan la selección inmunitaria a través de la presentación de repertorios de anticuerpos en la superficie de un bacteriófago filamentoso, y la posterior selección de fago mediante su unión a un antígeno de elección. Se describe una técnica de este tipo en la publicación PCT n.° WO 99/10494, que describe el aislamiento de anticuerpos de alta afinidad y agonistas funcionales para receptores de MPL y msk usando un enfoque de este tipo.
Proteínas de unión a antígeno biespecíficas o bifuncionales
Las proteínas de unión a antígeno que se proporcionan también incluyen anticuerpos biespecíficos y bifuncionales que incluyen una o más CDR o una o más regiones variables tal como se describió anteriormente. Un anticuerpo biespecífico o bifuncional en algunos casos es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadena pesada/ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes. Pueden producirse anticuerpos biespecíficos mediante una variedad de métodos incluyendo, pero sin limitarse a, fusión de hibridomas o unión de fragmentos Fab’. Véanse, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol.
148:1547-1553.
Otras formas diversas
Algunas de las proteínas de unión a antígeno que se proporcionan son formas de variante de las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer anteriormente (por ejemplo, aquellas que tienen las secuencias enumeradas en las tablas 2-5). Por ejemplo, algunas de las proteínas de unión a antígeno tienen una o más sustituciones de aminoácido conservativas en una o más de las cadenas pesadas o ligeras, regiones variables o CDR enumeradas en las tablas 2-5.
Los aminoácidos que se producen de manera natural pueden dividirse en clases basándose en propiedades comunes de cadena lateral:
1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
3) ácidos: Asp, Glu;
4) básicos: His, Lys, Arg;
5) residuos que influyen en la orientación de cadena: Gly, Pro; y
6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones de aminoácido conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases con otro miembro de la misma clase. Las sustituciones de aminoácido conservativas pueden abarcar residuos de aminoácido que no se producen de manera natural, que se incorporan normalmente mediante síntesis química de péptidos en vez de mediante síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen peptidomiméticos y otras formas revertidas o invertidas de restos de aminoácido.
Las sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una de las clases anteriores por un miembro de otra clase. Tales residuos sustituidos pueden introducirse en regiones del anticuerpo que son homólogas con anticuerpos humanos, o en las regiones no homólogas de la molécula.
Al realizar tales cambios, según determinadas realizaciones, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. El perfil hidropático de una proteína se calcula asignando a cada aminoácido un valor numérico (“índice de hidropatía”) y luego promediando repetitivamente estos valores a lo largo de la cadena del péptido. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático basándose en sus características de hidrofobicidad y carga. Son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+ 1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).
Se entiende en la técnica la importancia del perfil hidropático al conferir una función biológica interactiva a una proteína (véase, por ejemplo, Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-131). Se sabe que determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen una puntuación o índice hidropático similar y todavía conservan una actividad biológica similar. Al realizar estos cambios basándose en el índice hidropático, en determinadas realizaciones, se incluye la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ±2. En algunos aspectos, se incluyen aquellas que están dentro de ±1, y en otros aspectos, se incluyen aquellas dentro de ±0,5. También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede realizarse eficazmente basándose en la hidrofilicidad, particularmente cuando la proteína o el péptido biológicamente funcional creado de ese modo está destinado para su uso en realizaciones inmunológicas, como en el presente caso. En determinadas realizaciones, la mayor hidrofilicidad promedio local de una proteína, ya que está regida por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y unión a antígeno o inmunogenicidad, es decir, con una propiedad biológica de la proteína.
Se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a estos residuos de aminoácido: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0±1); glutamato (+3,0±1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4 ); prolina (-0,5±1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina(-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) y triptófano (-3,4). Al realizar cambios basándose en valores de hidrofilicidad similares, en determinadas realizaciones, se incluye la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ±2, en otras realizaciones, se incluyen aquellas que están dentro de ±1, y en todavía otras realizaciones, se incluyen aquellas que están dentro de ±0,5. En algunos casos, también pueden identificarse epítopos a partir de secuencias de aminoácidos primarias basándose en la de hidrofilicidad. Estas regiones también se denominan “regiones centrales epitópicas”.
En la tabla 6 se exponen sustituciones de aminoácidos conservativas a modo de ejemplo.
Tabla 6: Sustituciones de aminoácidos conservativas
Figure imgf000063_0001
Un experto en la técnica podrá determinar variantes de polipéptidos adecuadas tal como se expone en el presente documento usando técnicas bien conocidas. Un experto en la técnica puede identificar zonas adecuadas de la molécula que pueden cambiarse sin destruir la actividad seleccionando como diana regiones que no se cree que sean importantes para la actividad. El experto en la técnica también podrá identificar residuos y partes de las moléculas que están conservadas entre polipéptidos similares. En realizaciones adicionales, incluso zonas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden someterse a sustituciones de aminoácidos conservativas sin destruir la actividad biológica o sin afectar de manera adversa a la estructura de polipéptido.
Adicionalmente, un experto en la técnica puede revisar estudios de estructura y función que identifican residuos en polipéptidos similares que son importantes para la actividad o estructura. A la vista de una comparación de este tipo, puede predecirse la importancia de residuos de aminoácido en una proteína que corresponden a residuos de aminoácido importantes para la actividad o estructura en proteínas similares. Un experto en la técnica puede optar por sustituciones de aminoácidos químicamente similares para tales residuos de aminoácido importantes predichos.
Un experto en la técnica también puede analizar la estructura tridimensional y la secuencia de aminoácidos en relación con la estructura en polipéptidos similares. A la vista de tal información, un experto en la técnica puede predecir la alineación de residuos de aminoácido de un anticuerpo con respecto a su estructura tridimensional. Un experto en la técnica puede elegir no realizar cambios radicales en los residuos de aminoácido que se predice que están en la superficie de la proteína, ya que tales residuos pueden estar implicados en interacciones importantes con otras moléculas. Además, un experto en la técnica puede generar variantes de prueba que contienen una única sustitución de aminoácido en cada residuo de aminoácido deseado. Entonces pueden examinarse estas variantes usando ensayos para determinar actividad neutralizante de CGRP R (véanse los ejemplos a continuación) proporcionando así información referente a qué aminoácidos pueden cambiarse y cuáles no deben cambiarse. En otras palabras, basándose en información recopilada a partir de tales experimentos de rutina, un experto en la técnica puede determinar fácilmente las posiciones de aminoácido en las que deben evitarse sustituciones adicionales o bien solas o bien en combinación con otras mutaciones.
Varias publicaciones científicas se han dedicado a la predicción de la estructura secundaria. Véase, Moult, 1996, Curr. Op. in Biotech. 7:422-427; Chou et al., 1974, Biochem. 13:222-245; Chou et al., 1974, Biochemistry 113:211-222; Chou et al., 1978, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-148; Chou et al., 1979, Ann. Rev. Biochem.
47:251-276; y Chou et al., 1979, Biophys. J. 26:367-384. Además, actualmente hay programas informáticos disponibles para ayudar a predecir la estructura secundaria. Un método de predecir la estructura secundaria se basa en modelado de homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tienen una identidad de secuencia de más del 30% o una similitud de más del 40% pueden tener topologías estructurales similares. El reciente aumento de la base de datos estructural de proteínas (PDB) ha proporcionado una predictibilidad potenciada de la estructura secundaria, incluyendo el posible número de pliegues dentro de la estructura de un polipéptido o una proteína. Véase, Holm et al., 1999, Nucl. Acid. Res. 27:244-247. Se ha sugerido (Brenner et al., 1997, Curr. Op. Struct. Biol.
7:369-376) que hay un número limitado de pliegues en un polipéptido o proteína dado y que una vez resuelto un número crítico de estructuras, la predicción estructural se volverá drásticamente más precisa.
Métodos adicionales de predicción de la estructura secundaria incluyen “reconocimiento de plegamiento” (Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol.7:377-387; Sippl et al., 1996, Structure 4: 15-19), “análisis de perfil” (Bowie et al., 1991, Science 253: 164-170; Gribskov et al., 1990, Met. Enzym. 183: 146-159; Gribskov et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci.
84:4355-4358), y “conexión evolutiva” (véase, Holm, 1999, citado anteriormente; y Brenner, 1997, citado anteriormente).
En algunas realizaciones, se realizan sustituciones de aminoácidos que: (1) reducen la sensibilidad a la proteólisis, (2) reducen la sensibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteínas, (4) alteran las afinidades de unión a ligando o antígeno, y/o (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales en tales polipéptidos. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de aminoácidos individuales o múltiples (en determinadas realizaciones, sustituciones de aminoácidos conservativas) en la secuencia que se produce de manera natural. Pueden realizarse sustituciones en la parte del anticuerpo que se encuentra fuera del/de los dominio(s) que forma(n) contactos intermoleculares. En tales realizaciones, pueden usarse sustituciones de aminoácidos conservativas que no cambian sustancialmente las características estructurales de la secuencia original (por ejemplo, uno o más aminoácidos de sustitución que no alteran la estructura secundaria que caracteriza la proteína de unión a antígeno original o nativa). Se describen ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed.), 1984, W. H. New York: Freeman and Company; Introduction to Protein Structure (Branden y Tooze, eds.), 1991, New York: Garland Publishing; y Thornton et al., 1991, Nature 354:105.
Las variantes de anticuerpo preferidas adicionales incluyen variantes de cisteína en las que uno o más residuos de cisteína en la secuencia de aminoácidos original o nativa se eliminan o se sustituyen por otro aminoácido (por ejemplo, serina). Las variantes de cisteína son útiles, entre otras cosas, cuando deben volver a plegarse anticuerpos para dar una conformación biológicamente activa. Las variantes de cisteína pueden tener menos residuos de cisteína que el anticuerpo nativo, y normalmente tienen un número par para minimizar las interacciones resultantes de cisteínas no emparejadas.
Las cadenas pesada y ligera, los dominios de regiones variables y las CDR que se dan a conocer pueden usarse para preparar polipéptidos que contienen una región de unión a antígeno que puede unirse específicamente a CGRP R. Por ejemplo, puede incorporarse una o más de las CDR indicadas en las tablas 4 y 5 en una molécula (por ejemplo, un polipéptido) de manera covalente o no covalente para producir una inmunoadhesión. Una inmunoadhesión puede incorporar la(s) CDR como parte de una cadena de polipéptido más grande, puede unir de manera covalente la(s) CDR a otra cadena de polipéptido o puede incorporar la(s) CDR de manera no covalente. La(s) CDR permite(n) que la inmunoadhesión se una específicamente a un antígeno de interés particular (por ejemplo, CGRP R o epítopo del mismo).
También se proporcionan miméticos (por ejemplo, “miméticos peptídicos” o “peptidomiméticos”) basados en los dominios de región variable y las CDR que se describen en el presente documento. Estos análogos pueden ser péptidos, distintos de péptidos o combinaciones de regiones peptídicas y no peptídicas. Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15:29; Veber y Freidinger, 1985, TINS pág. 392; y Evans et al., 1987, J. Med. Chem. 30:1229. Los miméticos peptídicos que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles pueden usarse para producir un efecto terapéutico o profiláctico similar. Tales compuestos se desarrollan con frecuencia con ayuda de modelado molecular informático. Generalmente, los peptidomiméticos son proteínas que son estructuralmente similares a un anticuerpo que presenta una actividad biológica deseada, tal como en este caso la capacidad para unirse específicamente a CGRP R, pero tienen uno o más enlaces peptídicos sustituidos opcionalmente por un enlace seleccionado de: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH-CH-(cis y trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-y -CH2SO-, mediante métodos bien conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso por un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) puede usarse en determinadas realizaciones para generar proteínas más estables. Además, pueden generarse péptidos restringidos que comprenden una secuencia consenso o una variación de secuencia consenso sustancialmente idéntica mediante métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61:387), por ejemplo, añadiendo residuos de cisteína internos que pueden formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclizan el péptido.
También se proporcionan derivados de las proteínas de unión a antígeno que se describen en el presente documento. Las proteínas de unión a antígeno derivatizadas pueden comprender cualquier molécula o sustancia que confiera una propiedad deseada al anticuerpo o fragmento, tal como semivida aumentada en un uso particular. La proteína de unión a antígeno derivatizada puede comprender, por ejemplo, un resto detectable (o de marcaje) (por ejemplo, una molécula radiactiva, colorimétrica, antigénica o enzimática, una perla detectable (tal como una perla magnética o electrodensa (por ejemplo, de oro)), o una molécula que se une a otra molécula (por ejemplo, biotina o estreptavidina)), un resto terapéutico o de diagnóstico (por ejemplo, un resto radiactivo, citotóxico o farmacéuticamente activo), o una molécula que aumenta la idoneidad de la proteína de unión a antígeno para un uso particular (por ejemplo, administración a un sujeto, tal como un sujeto humano, u otros usos in vivo o in vitro). Los ejemplos de moléculas que pueden usarse para derivatizar una proteína de unión a antígeno incluyen albúmina (por ejemplo, albúmina sérica humana) y polietilenglicol (PEG). Pueden prepararse derivados de proteínas de unión a antígeno unidos a albúmina o pegilados usando técnicas bien conocidas en la técnica. Determinadas proteínas de unión a antígeno incluyen un polipéptido pegilado de una sola cadena tal como se describe en el presente documento. En una realización, la proteína de unión a antígeno está conjugada o unida de otro modo a transtiretina (TTR) o una variante de TTR. La TTR o variante de TTR puede modificarse químicamente, por ejemplo, con un compuesto químico seleccionado del grupo que consiste en dextrano, poli(n-vinilpirrolidona), polietilenglicoles, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de poli(óxido de propileno/óxido de etileno), polioles polioxietilados y poli(alcoholes de vinilo).
Otros derivados incluyen conjugados covalentes o agregantes de proteínas de unión a CGRP R con otras proteínas o polipéptidos, tales como mediante expresión de proteínas de fusión recombinantes que comprenden polipéptidos heterólogos fusionados al extremo N-terminal o C-terminal de una proteína de unión a CGRP R. Por ejemplo, el péptido conjugado puede ser un polipéptido señal heterólogo (o líder), por ejemplo, el líder de factor alfa de levadura, o un péptido tal como una etiqueta de epítopo. Las proteínas de fusión que contienen proteína de unión a antígeno de CGRP pueden comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación o identificación de la proteína de unión a CGRP R (por ejemplo, poli-His). Un proteína de unión a CGRP R también puede unirse al péptido FLAG tal como se describe en Hopp et al., 1988, Bio/Technology 6:1204; y la patente estadounidense n.° 5.011.912. El péptido FLAG es altamente antigénico y proporciona un epítopo al que se une de manera reversible un anticuerpo monoclonal (AcM) específico, permitiendo un ensayo rápido y una purificación fácil de proteína recombinante expresada. Hay reactivos útiles para preparar proteínas de fusión en las que se fusiona el péptido FLAG a un polipéptido dado disponibles comercialmente (Sigma, St. Louis, MO).
Pueden emplearse oligómeros que contienen una o más proteínas de unión a CGRP R como antagonistas de CGRP R. Los oligómeros pueden estar en forma de dímeros, trímeros u oligómeros superiores unidos por enlaces covalentes o enlaces no covalentes. Se contemplan para su uso oligómeros que comprenden dos o más proteínas de unión a CGRP R, siendo un ejemplo un homodímero. Otros oligómeros incluyen heterodímeros, homotrímeros, heterotrímeros, homotetrámeros, heterotetrámeros, etc.
Una realización se refiere a oligómeros que comprenden múltiples polipéptidos de unión a CGRP R unidos mediante interacciones covalentes o no covalentes entre restos peptídicos fusionados a las proteínas de unión a CGRP R. Tales péptidos pueden ser ligadores peptídicos (espaciadores), o péptidos que tienen la propiedad de promover la oligomerización. Las cremalleras de leucina y determinados polipéptidos derivados de anticuerpos se encuentran entre los péptidos que pueden promover la oligomerización de proteínas de unión a CGRP R unidas a los mismos, tal como se describe en más detalle a continuación.
En realizaciones particulares, los oligómeros comprenden desde dos hasta cuatro proteínas de unión a CGRP R. Los restos de proteína de unión a CGRP R del oligómero pueden estar en cualquiera de las formas descritas anteriormente, por ejemplo, variantes o fragmentos. Preferiblemente, los oligómeros comprenden proteínas de unión a CGRP R que tienen actividad de unión a CGRP R.
En una realización, se prepara un oligómero usando polipéptidos derivados de inmunoglobulinas. La preparación de proteínas de fusión que comprenden determinados polipéptidos heterólogos fusionados a diversas partes de polipéptidos derivados de anticuerpo (incluyendo el dominio Fc) ha sido descrita, por ejemplo, por Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535; Bym et al., 1990, Nature 344:677; y Hollenbaugh et al., 1992 “Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins”, en Current Protocols in Immunology, Sup. 4, páginas 10.19.1­ 10.19.11.
Una realización se refiere a un dímero que comprende dos proteínas de fusión creadas fusionando una proteína de unión a CGRP R a la región Fc de un anticuerpo. El dímero puede prepararse, por ejemplo, insertando una fusión génica que codifica para la proteína de fusión en un vector de expresión apropiado, expresando la fusión génica en células huésped transformadas con el vector de expresión recombinante y permitiendo que la proteína de fusión expresada se ensamble al igual que moléculas de anticuerpo, tras lo cual se forman enlaces disulfuro intercatenarios entre los restos de Fc para producir el dímero.
El término “Fc polipéptido” tal como se usa en el presente documento incluye formas nativas y de muteína de polipéptidos derivados de la región Fc de un anticuerpo. También se incluyen formas truncadas de tales polipéptidos que contienen la región de bisagra que promueve la dimerización. Las proteínas de fusión que comprenden restos de Fc (y oligómeros formados a partir de las mismas) ofrecen la ventaja de una purificación fácil mediante cromatografía por afinidad sobre columnas de proteína A o proteína G.
Un polipéptido de Fc adecuado, descrito en la solicitud PCT WO 93/10151 y las patentes estadounidenses n.° 5.426.048 y n.° 5.262.522, es un polipéptido de una sola cadena que se extiende desde la región de bisagra N-terminal hasta el extremo C-terminal nativo de la región Fc de un anticuerpo de tipo IgG1 humano. Otro polipéptido de Fc útil es la muteína de Fc descrita en la patente estadounidense n.° 5.457.035, y en Baum et al., 1994, EMBO J.
13:3992-4001. La secuencia de aminoácidos de esta muetína es idéntica a la de la secuencia de Fc nativa presentada en el documento WO 93/10151, excepto porque se ha cambiado el aminoácido 19 de Leu a Ala, se ha cambiado el aminoácido 20 de Leu a Glu, y se ha cambiado el aminoácido 22 de Gly a Ala. La muteína muestra una afinidad reducida por receptores de Fc.
En otras realizaciones, la parte variable de las cadenas pesada y/o ligera de una proteína de unión a CGRP R tal como se da a conocer en el presente documento puede sustituirse por la parte variable de una cadena pesada y/o ligera de anticuerpo.
Alternativamente, el oligómero es una proteína de fusión que comprende múltiples proteínas de unión a CGRP R, con o sin ligadores peptídicos (péptidos espaciadores). Entre los ligadores peptídicos adecuados se encuentran los descritos en las patentes estadounidenses n.° 4.751.180 y n.° 4.935.233.
Otro método para preparar derivados de proteína de unión a CGRP R oligoméricos implica el uso de una cremallera de leucina. Los dominios de cremallera de leucina son péptidos que promueven la oligomerización de las proteínas en las que se encuentran. Las cremalleras de leucina se identificaron originalmente en varias proteínas de unión a ADN (Landschulz et al., 1988, Science 240:1759), y desde entonces se han encontrado en una variedad de proteínas diferentes. Entre las cremalleras de leucina conocidas se encuentran péptidos que se producen de manera natural y derivados de los mismos que se dimerizan o trimerizan. Se describen ejemplos de dominios de cremallera de leucina adecuados para producir proteínas oligoméricas solubles en la solicitud PCT WO 94/10308, y se describe la cremallera de leucina derivada de proteína tensioactiva D (SPD) de pulmón en Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191. El uso de una cremallera de leucina modificada que permite la trimerización estable de una proteína heteróloga fusionada a la misma se describe en Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-278. En un enfoque, se expresan proteínas de fusión recombinantes que comprenden un fragmento o derivado de proteína de unión a CGRP R fusionado a un péptido de cremallera de leucina en células huésped adecuadas, y se recuperan los fragmentos o derivados de proteína de unión a CGRP R oligoméricos solubles que se forman del sobrenadante de cultivo.
En determinadas realizaciones, la proteína de unión a antígeno tiene una KD (afinidad de unión en equilibrio) de menos de 1 pM, 10 pM, 100 pM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM o 50 nM.
Otro aspecto proporciona una proteína de unión a antígeno que tiene una semivida de al menos un día in vitro o in vivo (por ejemplo, cuando se administra a un sujeto humano). En una realización, la proteína de unión a antígeno tiene una semivida de al menos tres días. En otra realización, el anticuerpo o parte del mismo tiene una semivida de cuatro días o más. En otra realización, el anticuerpo o parte del mismo tiene una semivida de ocho días o más. En otra realización, el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo se derivatiza o modifica de tal manera que tiene una semivida más larga en comparación con el anticuerpo sin derivatizar o sin modificar. En otra realización, la proteína de unión a antígeno contiene mutaciones puntuales para aumentar la semivida en suero, tal como se describe en el documento WO 00/09560, publicado el 24 de febrero de 2000.
Glicosilación
La proteína de unión a antígeno puede tener un patrón de glicosilación que es diferente o está alterado con respecto al encontrado en la especie nativa. Tal como se conoce en la técnica, los patrones de glicosilación pueden depender tanto de la secuencia de la proteína (por ejemplo, la presencia o ausencia de residuos de aminoácido de glicosilación particulares, comentado a continuación), o la célula huésped o el organismo en el que se produce la proteína. A continuación se comentan sistemas de expresión particulares.
La glicosilación de polipéptidos está normalmente o bien unida a N o bien unida a O. Unido a N se refiere a la unión del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para unión enzimática del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un posible sitio de glicosilación. La glicosilación con unión a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa, a un hidroxiaminoácido, lo más comúnmente serina o treonina, aunque también puede usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.
La adición de sitios de glicosilación a la proteína de unión a antígeno se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de tal manera que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para sitios de glicosilación con unión a N). La alteración también puede realizarse mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia de partida (para sitios de glicosilación con unión a O). Por facilidad, la secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno puede alterarse mediante cambios a nivel del ADN, particularmente mutando el ADN que codifica para el polipéptido diana en bases preseleccionadas de tal manera que se generan codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.
Otros medios de aumentar el número de restos de hidratos de carbono en la proteína de unión a antígeno es mediante acoplamiento químico o enzimático de glicósidos a la proteína. Estos procedimientos son ventajosos porque no requieren la producción de la proteína en una célula huésped que tenga capacidades de glicosilación para glicosilación con unión a N y O. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, el/los azúcar(es) puede(n) unirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de glutamina. Estos métodos se describen en el documento WO 87/05330 publicado el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, 1981, CRC Crit. Rev, Biochem., págs.
259-306.
La eliminación de restos de hidratos de carbono presentes en la proteína de unión a antígeno de partida puede lograrse de manera química o enzimática. La desglicosilación química requiere exposición de la proteína al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la escisión de la mayoría o la totalidad de los azúcares excepto el azúcar de unión (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), al tiempo que se deja el polipéptido intacto. La desglicosilación química se describe en Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 y por Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131. La escisión enzimática de restos de hidratos de carbono en polipéptidos puede lograrse mediante el uso de una variedad de endo y exo-glicosidasas tal como se describe en Thotakura et al., 1987, Met. Enzymol. 138:350. La glicosilación en posibles sitios de glicosilación puede prevenirse mediante el uso del compuesto tunicamicina tal como se describe por Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105. La tunicamicina bloquea la formación de uniones proteína-N-glicósido.
Por tanto, los aspectos incluyen variantes de glicosilación de las proteínas de unión a antígeno en las que el número y/o tipo de sitio(s) de glicosilación se ha alterado en comparación con las secuencias de aminoácidos del polipéptido original. En determinadas realizaciones, variantes de proteína de anticuerpo comprenden un mayor o menor número de sitios de glicosilación con unión a N que el anticuerpo nativo. Un sitio de glicosilación con unión a N se caracteriza por la secuencia: Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en la que el residuo de aminoácido designado mediante X puede ser cualquier residuo de aminoácido excepto prolina. La sustitución de residuos de aminoácido para crear esta secuencia proporciona un posible nuevo sitio para la adición de una cadena de hidrato de carbono con unión a N. Alternativamente, las sustituciones que eliminan o alteran esta secuencia prevendrán la adición de una cadena de hidrato de carbono con unión a N presente en el polipéptido nativo. Por ejemplo, la glicosilación puede reducirse mediante la deleción de una Asn o sustituyendo la Asn por un aminoácido diferente. En otras realizaciones, se crean uno o más nuevos sitios con unión a N. Los anticuerpos tienen normalmente un sitio de glicosilación con unión a N en la región Fc.
Etiquetas y grupos efectores
En algunas realizaciones, la parte de unión a antígeno comprende una o más etiquetas. El término “grupo de marcaje con etiqueta” o “etiqueta” significa cualquier etiqueta detectable. Los ejemplos de grupos de marcaje con etiqueta adecuados incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), grupos fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánidos), grupos enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa del rábano, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), grupos quimioluminiscentes, grupos biotinilo, o epítopos de polipéptido predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, etiquetas de epítopo). En algunas realizaciones, el grupo de marcaje con etiqueta está acoplado a la proteína de unión a antígeno mediante brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir la posibilidad de impedimento estérico. En la técnica se conocen diversos métodos para marcar proteínas y pueden usarse según se considere apropiado.
El término “grupo efector” significa cualquier grupo acoplado a una proteína de unión a antígeno que actúa como agente citotóxico. Ejemplos de grupos efectores adecuados son radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I). Otros grupos adecuados incluyen toxinas, grupos terapéuticos o grupos quimioterápicos. Los ejemplos de grupos adecuados incluyen calicheamicina, auristatinas, geldanamicina y maitansina. En algunas realizaciones, el grupo efector se acopla a la proteína de unión a antígeno mediante brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el posible impedimento estérico.
En general, las etiquetas se dividen en una variedad de clases, dependiendo del ensayo en el que van a detectarse: a) etiquetas isotópicas, que pueden ser isótopos radiactivos o pesados; b) etiquetas magnéticas (por ejemplo, partículas magnéticas); c) restos activos redox; d) colorantes ópticos; grupos enzimáticos (por ejemplo peroxidasa del rábano, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina); e) grupos biotinilados; y f) epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, etiquetas de epítopo, etc.). En algunas realizaciones, el grupo de marcaje con etiqueta se acopla a la proteína de unión a antígeno mediante brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir la posibilidad de impedimento estérico. En la técnica se conocen diversos métodos para marcar proteínas.
Las etiquetas específicas incluyen colorantes ópticos, incluyendo, pero sin limitarse a, cromóforos, fósforos y fluoróforos, siendo estos últimos específicos en muchos casos. Los fluoróforos pueden ser o bien fluoróforos de “molécula pequeña” o bien fluoróforos proteicos.
Por “etiqueta fluorescente” quiere decirse cualquier molécula que puede detectarse mediante sus propiedades fluorescentes inherentes. Las etiquetas fluorescentes adecuadas incluyen, pero no se limitan a, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metil-cumarinas, pireno, verde de malaquita, estilbeno, amarillo Lucifer, Cascade BlueJ, rojo Texas, IAEDANS, EdAnS, BODIPY FL, Lc rojo 640, Cy 5, Cy 5.5, LC rojo 705, verde Oregon, los colorantes Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), azul Cascade, amarillo Cascade y R-ficoeritrina (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, rodamina, y rojo Texas (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Se describen colorantes ópticos adecuados, incluyendo fluoróforos, en MOLECULAR PROBES HANDBOOK de Richard P. Haugland.
Las etiquetas fluorescentes proteicas adecuadas también incluyen, pero no se limitan a, proteína fluorescente verde, incluyendo especies de Renilla, Ptilosarcus o Aequorea de GFP (Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805), EGFP (Clontech Labs., Inc., número de registro de Genbank U55762), proteína fluorescente azul (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc., Quebec, Canadá; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol.
6:178-182), proteína fluorescente amarilla potenciada (EYFP, Clontech Labs., Inc.), luciferasa (lchiki et al., 1993, J. Immunol. 150:5408-5417), p-galactosidasa (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607) y Renilla (documentos W092/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, patentes estadounidenses n.2 5292658, n.25418155, n.25683888, n.25741668, n.25777079, n.25804387, n.25874304, n.25876995, n.25925558).
Secuencias de ácido nucleico que codifican para proteínas de unión a antígeno de CGRP
También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican para las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento, o partes de las mismas, incluyendo ácidos nucleicos que codifican para una o ambas cadenas de un anticuerpo, o un fragmento, derivado, muteína o variante del mismo, polinucleótidos que codifican para regiones variables de cadena pesada o solo CDR, polinucleótidos suficientes para su uso como sondas de hibridación, cebadores de PCR o cebadores de secuenciación para identificar, analizar, mutar o amplificar un polinucleótido que codifica para un polipéptido, ácidos nucleicos antisentido para inhibir la expresión de un polinucleótido, y secuencias complementarias de los anteriores. Los ácidos nucleicos pueden tener cualquier longitud. Por ejemplo, pueden tener 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1.000, 1.500 o más nucleótidos de longitud, y/o pueden comprender una o más secuencias adicionales, por ejemplo, secuencias reguladoras, y/o ser parte de un ácido nucleico más grande, por ejemplo, un vector. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios y pueden comprender nucleótidos de ARN y/o ADN, y variantes artificiales de los mismos (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos).
La tabla 7 muestra secuencias de ácido nucleico a modo de ejemplo que codifican para una región constante de cadena pesada de IgG2, una región constante de cadena ligera kappa y una región constante de cadena ligera lambda hCL-1. Cualquier región variable proporcionada en el presente documento puede unirse a estas regiones constantes para formar secuencias completas de cadena pesada y ligera. Sin embargo, debe entenderse que estas secuencias de regiones constantes se proporcionan solo como ejemplos específicos, un experto en la técnica puede emplear otras regiones constantes, incluyendo región constante de cadena pesada de IgG1, regiones constantes de cadena pesada de IgG3 o IgG4, cualquiera de las siete regiones constantes de cadena ligera lambda, incluyendo hCL-1, hCL-2, hCL-3 y hCL-7; regiones constantes que se han modificado para mejorar la estabilidad, expresión, facilidad de fabricación u otras características deseadas, y similares. En algunas realizaciones, las secuencias de región variable se unen a otras secuencias de región constante que se conocen en la técnica. En la tabla 8 se proporcionan secuencias de ácido nucleico a modo de ejemplo que codifican para regiones variables de cadena pesada y ligera.
Tabla 7: Secuencias de ácido nucleico de región constante de cadena pesada y ligera a modo de ejemplo
Figure imgf000069_0001
La tabla 8 muestra secuencias de ácido nucleico a modo de ejemplo que codifican para regiones variables de cadena pesada y cadena ligera, en las que se incorporan las diversas secuencias de CDRL1, CDRL2 y CDRL3, o CDRH1, CDRH2 y CDRH3.
Tabla 8: Secuencias de ácido nucleico de región variable de cadena ligera y pesada a modo de ejemplo
Figure imgf000070_0001
Figure imgf000071_0001
Figure imgf000072_0001
Figure imgf000073_0001
Figure imgf000074_0001
Figure imgf000075_0001
Figure imgf000076_0001
Figure imgf000077_0001
La tabla 9 muestra las SEQ ID NO de secuencias de ácido nucleico a modo de ejemplo que codifican para cadenas pesada y ligera completas, así como regiones variables de cadena pesada y ligera, del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se reivindica a modo de ejemplo, específicamente, proteínas de unión a hCGRP R, dadas a conocer en el presente documento.
Tabla 9 - SEQ ID NO de secuencias de ácido nucleico de HC, LC, Vh y Vl a modo de ejemplo
Figure imgf000078_0001
Pueden aislarse ácidos nucleicos que codifican para determinadas proteínas de unión a antígeno, o partes de las mismas (por ejemplo, anticuerpo de longitud completa, cadena pesada o ligera, dominio variable, o CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, o CDRL3) de células B de ratones que se han inmunizado con CGRP R o componentes inmunógenos del mismo, por ejemplo, inmunizando con CGRP R de longitud completa (que comprende tanto CRLR como RAMP1), con el dominio extracelular de CGRP R (que comprende dominios extracelulares de CRLR y RAMP1), con células completas que expresan CGRP R, con membranas preparadas a partir de células que expresan CGRP R, con proteínas de fusión, por ejemplo, fusiones con Fc, que comprenden CRLR, RAMP1 (o dominios extracelulares de los mismos) fusionados a Fc, y otros métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, tal como se describe en los ejemplos 1-3 en el presente documento. El ácido nucleico puede aislarse mediante procedimientos convencionales tales como reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La presentación en fagos es otro ejemplo de una técnica conocida mediante la cual pueden prepararse derivados de anticuerpos y otras proteínas de unión a antígeno. En un enfoque, se expresan polipéptidos que son componentes de una proteína de unión a antígeno de interés en cualquier sistema de expresión recombinante adecuado, y se permite que los polipéptidos expresados se ensamblen para formar moléculas de proteína de unión a antígeno.
Los ácidos nucleicos proporcionados en las tablas 7-9 son solo a modo de ejemplo. Debido a la degeneración del código genético, cada una de las secuencias de polipéptido indicadas en las tablas 2-5 o representadas de otro modo en el presente documento también se codifican por un gran número de otras secuencias de ácido nucleico además de las proporcionadas. Por tanto, un experto habitual en la técnica apreciará que la presente solicitud proporciona una descripción escrita adecuada y facilitación para cada secuencia de nucleótidos degenerada que codifica para cada proteína de unión a antígeno.
Un aspecto proporciona además ácidos nucleicos que se hibridan con otros ácidos nucleicos (por ejemplo, ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos indicada en la tabla 7, tabla 8, tabla 9 y/o SEQ ID NO: 224­ 258) en condiciones de hibridación particulares. En la técnica se conocen bien métodos para hibridar ácidos nucleicos. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Tal como se define en el presente documento, una condición de hibridación moderadamente rigurosa usa una disolución de prelavado que contiene 5x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC), SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), tampón de hibridación de formamida a aproximadamente el 50%, 6x SSC, y una temperatura de hibridación de 55°C (u otras disoluciones de hibridación similares, tales como una que contiene formamida a aproximadamente el 50%, con una temperatura de hibridación de 42°C), y condiciones de lavado de 60°C, en 0,5x SSC, SDS al 0,1%. Una condición de hibridación rigurosa hibrida en 6x SSC a 45°C, seguido por uno o más lavados en 0,1x SSC, SDS al 0,2% a 68°C. Además, un experto en la técnica puede manipular las condiciones de hibridación y/o lavado para aumentar o reducir la rigurosidad de hibridación de manera que ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que son idénticas en al menos el 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% entre sí permanecen normalmente hibridadas entre sí.
Los parámetros básicos que afectan a la elección de las condiciones de hibridación y directrices para diseñar condiciones adecuadas son expuestos, por ejemplo, por Sambrook, Fritsch y Maniatis (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., citado anteriormente; y Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4), y pueden determinarlas fácilmente los expertos habituales en la técnica basándose, por ejemplo, en la longitud y/o composición de base del ácido nucleico.
Pueden introducirse cambios mediante mutación en un ácido nucleico, conduciendo así a cambios en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo o derivado de anticuerpo) para la que codifica. Pueden introducirse mutaciones usando cualquier técnica conocida en la técnica. En una realización, se cambian uno o más residuos de aminoácido particulares usando, por ejemplo, un protocolo de mutagénesis dirigida al sitio. En otra realización, se cambian uno o más residuos seleccionados al azar usando, por ejemplo, un protocolo de mutagénesis al azar. Independientemente de cómo se prepare, un polipéptido mutante puede expresarse y examinarse para determinar una propiedad deseada.
Pueden introducirse mutaciones en un ácido nucleico sin alterar significativamente la actividad biológica de un polipéptido para el que codifica. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de nucleótido que conducen a sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácido no esenciales. Alternativamente, pueden introducirse una o más mutaciones en un ácido nucleico que cambia selectivamente la actividad biológica de un polipéptido para el que codifica. Por ejemplo, la mutación puede cambiar cuantitativa o cualitativamente la actividad biológica. Los ejemplos de cambios cuantitativos incluyen aumentar, reducir o eliminar la actividad. Los ejemplos de cambios cualitativos incluyen cambiar la especificidad de antígeno de un anticuerpo. En una realización, un ácido nucleico que codifica para cualquier proteína de unión a antígeno descrita en el presente documento puede mutarse para alterar la secuencia de aminoácidos usando técnicas de biología molecular que están bien establecidas en la técnica.
Otro aspecto proporciona moléculas de ácido nucleico que son adecuadas para su uso como cebadores o sondas de hibridación para la detección de secuencias de ácido nucleico. Una molécula de ácido nucleico puede comprender solo una parte de una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de longitud completa, por ejemplo, un fragmento que puede usarse como sonda o cebador o un fragmento que codifica para una parte activa (por ejemplo, una parte de unión a CGRP R) de un polipéptido.
Pueden usarse sondas basadas en la secuencia de un ácido nucleico para detectar el ácido nucleico o ácidos nucleicos similares, por ejemplo, transcriptos que codifican para un polipéptido. La sonda puede comprender un grupo de etiqueta, por ejemplo, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático. Tales sondas pueden usarse para identificar una célula que expresa el polipéptido.
Otro aspecto proporciona vectores que comprenden un ácido nucleico que codifica para un polipéptido o una parte del mismo (por ejemplo, un fragmento que contiene una o más CDR o uno o más dominios de región variable). Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, vectores virales, vectores de mamífero no episomales y vectores de expresión, por ejemplo, vectores de expresión recombinante. Los vectores de expresión recombinante pueden comprender un ácido nucleico en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped. Los vectores de expresión recombinante incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas basándose en las células huésped que van a usarse para la expresión, que están operativamente unidas a la secuencia de ácido nucleico que va a expresarse. Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped (por ejemplo, potenciador de gen temprano de SV40, promotor del virus del sarcoma de Rous y promotor de citomegalovirus), aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos únicamente en determinadas células huésped (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido, véase Voss et al., 1986, Trends Biochem. Sci.11:287, Maniatis et al., 1987, Science 236:1237), y aquellas que dirigen la expresión inducible de una secuencia de nucleótidos en respuesta a tratamiento o condición particular (por ejemplo, el promotor de metalotionina en células de mamífero y el promotor sensible a tet y/o sensible a estreptomicina en sistemas tanto procariotas como eucariotas (véase citado anteriormente). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que va a transformarse, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Los vectores de expresión pueden introducirse en células huésped para así producir proteínas o péptidos, incluyendo péptidos o proteínas de fusión, codificados por ácidos nucleicos tal como se describe en el presente documento.
Otro aspecto proporciona células huésped en las que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Una célula huésped puede ser cualquier célula procariota (por ejemplo, E. coli) o célula eucariota (por ejemplo, células de levadura, de insecto o de mamífero (por ejemplo, células CHO)). Puede introducirse ADN de vector en las células procariotas o eucariotas mediante técnicas convencionales de transformación o transfección. Para la transfección estable de células de mamífero, se conoce que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección usados, solo una pequeña fracción de células pueden integrar el ADN foráneo en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, generalmente se introduce un gen que codifica para un marcador seleccionable (por ejemplo, para resistencia a antibióticos) en las células huésped junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen los que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. Las células transfectadas de manera estable con el ácido nucleico introducido pueden identificarse mediante selección con fármaco (por ejemplo, las células que han incorporado el gen de marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán), entre otros métodos.
Preparación de proteínas de unión a antígeno
Los anticuerpos no humanos que se proporcionan pueden derivarse, por ejemplo, de cualquier animal que produce anticuerpos, tal como ratón, rata, conejo, cabra, asno o primate no humano (tal como macaco (por ejemplo, macaco cangrejero o macaco rhesus) o simio (por ejemplo, chimpancé)). Pueden usarse anticuerpos no humanos, por ejemplo, en cultivo celular in vitro y aplicaciones basadas en cultivo celular, o cualquier otra aplicación en la que no se produce una respuesta inmunitaria al anticuerpo o es insignificante, puede prevenirse, no supone una preocupación o se desea. En determinadas realizaciones, los anticuerpos pueden producirse inmunizando animales usando métodos conocidos en la técnica, tal como se describió anteriormente y/o en los ejemplos 1-3 a continuación. Los ejemplos describen la generación de anticuerpos anti-CGRP R usando tres preparaciones inmunógenas diferentes: (i) células completas que expresan versiones de longitud completa de dos componentes principales de CGRP R: RAMP1 y CRLR; (ii) extractos de membrana de tales células; y (iii) CGRP R soluble obtenido expresando conjuntamente y purificando los dominios extracelulares N-terminales de CRLR y RAMP1. Los anticuerpos pueden ser policlonales, monoclonales o pueden sintetizarse en células huésped expresando ADN recombinante. Pueden prepararse anticuerpos completamente humanos tal como se describió anteriormente inmunizando animales transgénicos que contienen loci de inmunoglobulina humana o seleccionando una biblioteca de presentación en fagos que expresa un repertorio de anticuerpos humanos.
Los anticuerpos monoclonales (AcM) pueden producirse mediante una variedad de técnicas, incluyendo metodología convencional de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, le técnica convencional de hibridación de células somáticas de Kohler y Milstein, 1975, Nature 256:495. Alternativamente, pueden emplearse otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo, la transformación viral u oncogénica de linfocitos B. Un sistema de animal adecuado para preparar hibridomas es el sistema murino, que es un procedimiento muy bien establecido. En la técnica se conocen protocolos de inmunización y técnicas para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para fusión y se describen enfoques ilustrativos en los ejemplos, a continuación. Para tales procedimientos, normalmente se fusionan células B de ratones inmunizados con una pareja de fusión inmortalizada adecuada, tal como una línea celular de mieloma murino. Si se desea, pueden inmunizarse además ratas u otros mamíferos en lugar de ratones y pueden fusionarse células B de tales animales con la línea celular de mieloma murino para formar hibridomas. Alternativamente, puede usarse una línea celular de mieloma de una fuente distinta de ratón. También se conocen bien procedimientos de fusión para preparar hibridomas.
Los anticuerpos de cadena sencilla que se proporcionan pueden formarse uniendo fragmentos de dominio variable de cadena pesada y ligera (región Fv) mediante un puente de aminoácidos (ligador peptídico corto), dando como resultado una única cadena de polipéptido. Tales Fv de cadena sencilla (scFv) pueden prepararse fusionando ADN que codifica para péptido ligador peptídico entre ADN que codifican para los dos polipéptidos de dominio variable (Vl y VH). Los polipéptidos resultantes pueden volver a plegarse sobre sí mismos para formar monómeros de unión a antígeno, o pueden formar multímeros (por ejemplo, dímeros, trímeros o tetrámeros), dependiendo de la longitud de un ligador flexible entre los dos dominios variables (Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10:423; Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18:95-108). Combinando diferentes polipéptidos que comprenden Vl y Vh, pueden formarse scFv multiméricos que se unen a diferentes epítopos (Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng. 18:31-40). Las técnicas desarrolladas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla incluyen las descritas en la patente estadounidense n.° 4.946.778; Bird, 1988, Science 242:423; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879; Ward et al., 1989, Nature 334:544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol Biol. 178:379-387. Los anticuerpos de cadena sencilla derivados de anticuerpos proporcionados en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, scFv que comprenden las combinaciones de dominio variable de las regiones variables de cadena pesada y ligera representadas en la tabla 3, o combinaciones de dominios variables de cadena ligera y pesada que incluyen CDR representadas en las tablas 4A y 4B.
Los anticuerpos proporcionados en el presente documento que son de una subclase pueden cambiarse por anticuerpos de una subclase diferente usando métodos de cambio de subclase. Por tanto, los anticuerpos IgG pueden derivarse de un anticuerpo IgM, por ejemplo, y viceversa. Tales técnicas permiten la preparación de nuevos anticuerpos que presentan las propiedades de unión a antígeno de un anticuerpo dado (el anticuerpo original), pero también muestran propiedades biológicas asociadas con un isotipo o subclase de anticuerpo diferente de aquel del anticuerpo original. Pueden emplearse técnicas de ADN recombinante. Puede emplearse ADN clonado que codifica para polipéptidos de anticuerpo particulares en tales procedimientos, por ejemplo, ADN que codifica para el dominio constante de un anticuerpo del isotipo deseado. Véase, por ejemplo, Lantto et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178:303-316.
Por consiguiente, los anticuerpos que se proporcionan incluyen aquellos que comprenden, por ejemplo, las combinaciones de dominios variables descritas, citadas anteriormente, que tienen un isotipo deseado (por ejemplo, IgA, IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE e IgD) así como fragmentos Fab o F(ab’)2 de los mismos. Además, si se desea una IgG4, también puede desearse introducir una mutación puntual (CPSCP->CPPCP) en la región de bisagra tal como se describe en Bloom et al., 1997, Protein Science 6:407 para aliviar una tendencia a formar enlaces disulfuro dentro de la cadena H que pueden conducir a heterogenicidad en los anticuerpos de tipo IgG4.
Además, también se conocen técnicas para derivar anticuerpos que tienen diferentes propiedades (es decir, afinidades variables por el antígeno al que se unen). Una técnica de este tipo, denominada reorganización de cadena, implica presentar repertorios de genes de dominio variable de inmunoglobulina sobre la superficie de bacteriófagos filamentosos, con frecuencia denominado presentación en fagos. Se ha usado la reorganización de cadena para preparar anticuerpos de alta afinidad frente al hapteno 2-feniloxazol-5-ona, tal como se describe en Marks et al., 1992, BioTechnology 10:779.
Pueden realizarse modificaciones conservativas en las regiones variables de cadena pesada y ligera descritas en la tabla 3, o las CDR descritas en las tablas 4A y 4B (y modificaciones correspondientes a los ácidos nucleicos codificantes) para producir una proteína de unión a CGRP R que tiene determinadas características funcionales y bioquímicas deseables. Anteriormente se describieron métodos para lograr tales modificaciones.
Las proteínas de unión a antígeno de CGRP pueden modificarse además de diversas maneras. Por ejemplo, si van a usarse para fines terapéuticos, pueden conjugarse con polietilenglicol (pegilarse) para prolongar la semivida en suero o para potenciar el suministro de proteína. Alternativamente, puede fusionarse la región V de los anticuerpos objeto o fragmentos de los mismos con la región Fc de una molécula de anticuerpo diferente. La región Fc usada para este fin puede modificarse de modo que no se une al complemento, reduciendo por tanto la probabilidad de inducir lisis celular en el paciente cuando se usa la proteína de fusión como agente terapéutico. Además, los anticuerpos objeto o fragmentos funcionales de los mismos pueden conjugarse con albúmina sérica humana para potenciar la semivida sérica del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. Otra pareja de fusión útil para las proteínas de unión a antígeno o fragmentos de las mismas es transtiretina (TTR). TTR tiene la capacidad de formar un tetrámero, por tanto una proteína de fusión anticuerpo-TTR puede formar un anticuerpo multivalente lo que puede aumentar su avidez de unión.
Alternativamente, pueden lograrse modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o bioquímicas de las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento creando sustituciones en la secuencia de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera que difieren significativamente en cuanto a su efecto sobre el mantenimiento (a) de la estructura del esqueleto molecular en la zona de la sustitución, por ejemplo, como conformación de hoja o hélice, (b) de la carga o hidrofobia de la molécula en el sitio diana, o (c) del volumen ocupado de la cadena lateral. Una “sustitución de aminoácidos conservativa” puede implicar una sustitución de un residuo de aminoácido nativo por un residuo no nativo que tiene poco o ningún efecto sobre la polaridad o la carga del residuo de aminoácido en esa posición. Véase la tabla 4, citada anteriormente. Además, también puede sustituirse cualquier residuo nativo en el polipéptido por alanina, tal como se describió anteriormente para la mutagénesis de exploración con alanina.
Los expertos en la técnica pueden implementar sustituciones de aminoácidos (ya sean conservativas o no conservativas) de los anticuerpos objeto aplicando técnicas de rutina. Pueden usarse sustituciones de aminoácidos para identificar residuos importantes de los anticuerpos proporcionados en el presente documento, o para aumentar o reducir la afinidad de estos anticuerpos por CGRP R humano o para modificar la afinidad de unión de otras proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento.
Métodos de expresión de proteínas de unión a antígeno
En el presente documento también se proporcionan sistemas de expresión y constructos en forma de plásmidos, vectores de expresión, casetes de transcripción o expresión que comprenden al menos un polinucleótido tal como se describió anteriormente, así como células huésped que comprenden tales sistemas de expresión o constructos. Las proteínas de unión a antígeno proporcionadas en el presente documento pueden prepararse mediante cualquiera de varias técnicas convencionales. Por ejemplo, pueden producirse proteínas de unión a antígeno de CGRP R mediante sistemas de expresión recombinante, usando cualquier técnica conocida en la técnica. Véase, por ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.) Plenum Press, Nueva York (1980); y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988).
Pueden expresarse proteínas de unión a antígeno en líneas celulares de hibridoma (por ejemplo, en particular pueden expresarse anticuerpos en hibridomas) o en líneas celulares distintas de hibridomas. Pueden usarse constructos de expresión que codifican para los anticuerpos para transformar una célula huésped de mamífero, de insecto o microbiana. Puede realizarse la transformación usando cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula huésped, incluyendo, por ejemplo empaquetar el polinucleótido en un virus o bacteriófago y transducir una célula huésped con el constructo mediante procedimientos de transfección conocidos en la técnica, tal como se muestra a modo de ejemplo en la patente estadounidense n.° 4.399.216; n.° 4.912.040; n.° 4.740.461; n.° 4.959.455. El procedimiento de transformación óptimo usado dependerá de qué tipo de célula huésped esté transformándose. En la técnica se conocen bien métodos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero e incluyen, pero no se limitan a, transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplasto, electroporación, encapsulación del polinucleótido(s) en liposomas, mezclado de ácido nucleico con lípidos cargados positivamente, y microinyección directa del ADN en núcleos.
Los constructos de expresión recombinantes comprenden normalmente una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende uno o más de los siguientes: una o más CDR proporcionadas en el presente documento; una región constante de cadena ligera; una región variable de cadena ligera; una región constante de cadena pesada (por ejemplo, Ch1, Ch2 y/o Ch3); y/u otra parte de andamiaje de una proteína de unión a antígeno de CGRP R. Estas secuencias de ácido nucleico se insertan en un vector de expresión apropiado usando técnicas de ligación convencionales. En una realización, la región constante de cadena pesada o ligera se añade al extremo C-terminal de la región variable de cadena pesada o ligera específica anti-CGRP R y se liga en un vector de expresión. El vector se selecciona normalmente para ser funcional en la célula huésped particular empleada (es decir, el vector es compatible con la maquinaria de la célula huésped, permitiendo que pueda producirse la amplificación y/o expresión del gen). En algunas realizaciones, se usan vectores que emplean ensayos de complementación de fragmento de proteína usando indicadores proteicos, tales como dihidrofolato reductasa (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 6.270.964). Pueden adquirirse vectores de expresión adecuados, por ejemplo, de Invitrogen Life Technologies o BD Biosciences (anteriormente “Clontech”). Otros vectores útiles para clonar y expresar los anticuerpos y fragmentos incluyen los descritos en Bianchi y McGrew, 2003, Biotech. Biotechnol. Bioeng. 84:439-44. Se comentan vectores de expresión adecuados adicionales, por ejemplo, en Methods Enzymol., vol. 185 (D. V. Goeddel, ed.), 1990, New York: Academic Press.
Normalmente, los vectores de expresión usados en cualquiera de las células huésped contendrán secuencias para el mantenimiento de plásmido y para la clonación y expresión de secuencias de nucleótidos exógenas. Tales secuencias, denominadas de manera colectiva “secuencias flanqueantes” en determinadas realizaciones, incluirán normalmente una o más de las siguientes secuencias de nucleótidos: un promotor, una o más secuencias de potenciador, un origen de replicación, una secuencia de terminación transcripcional, una secuencia intrónica completa que contiene un sitio de corte y empalme donador y aceptor, una secuencia que codifica para una secuencia líder para la secreción de polipéptido, un sitio de unión a ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región de poliligador para insertar el ácido nucleico que codifica para el polipéptido que va a expresarse, y un elemento de marcador seleccionable. A continuación se comenta cada una de estas secuencias.
Opcionalmente, el vector puede contener una secuencia que codifica para “etiqueta”, es decir, una molécula de oligonucleótido ubicada en el extremo 5’ o 3’ de la secuencia que codifica para proteína de unión a CGRP R; la secuencia de oligonucleótido codifica para poliHis (tal como hexaHis), u otra “etiqueta” tal como FLAG®, HA (virus influenza con hemaglutinina), o myc, para las que existen anticuerpos disponibles comercialmente. Esta etiqueta se fusiona normalmente con el polipéptido tras la expresión del polipéptido, y puede servir como medio para purificación por afinidad o detección de la proteína de unión a CGRP R a partir de la célula huésped. La purificación por afinidad puede lograrse, por ejemplo, mediante cromatografía en columna usando anticuerpos frente a etiqueta como matriz de afinidad. Opcionalmente, la etiqueta puede eliminarse posteriormente de la proteína de unión a CGRP R purificada mediante diversos medios tales como usando determinadas peptidasas para escisión.
Las secuencias flanqueantes pueden ser homólogas (es decir, de la misma especie y/o cepa que la célula huésped), heterólogas (es decir, de una especie distinta de la especie o cepa de la célula huésped), híbridas (es decir, una combinación de secuencias flanqueantes de más de una fuente), sintéticas o nativas. Como tales, la fuente de una secuencia flanqueante puede ser un organismo procariota o eucariota, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, siempre que la secuencia flanqueante sea funcional en, y pueda activarse por, la maquinaria de la célula huésped.
Pueden obtenerse secuencias flanqueantes útiles en los vectores mediante cualquiera de varios métodos bien conocidos en la técnica. Normalmente, las secuencias flanqueantes útiles en el presente documento se habrán identificado anteriormente mediante mapeo y/o mediante digestión con endonucleasa de restricción y por tanto pueden aislarse de la fuente tisular apropiada usando las endonucleasas de restricción apropiadas. En algunos casos, puede conocerse la secuencia de nucleótidos completa de una secuencia flanqueante. En este caso, la secuencia flanqueante puede sintetizarse usando los métodos descritos en el presente documento para la síntesis o clonación de ácido nucleico.
Tanto si se conoce la totalidad o solo una parte de la secuencia flanqueante, puede obtenerse usando reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y/o examinando una biblioteca genómica con una sonda adecuada tal como un oligonucleótido y/o fragmento de secuencia flanqueante de la misma u otra especie. Cuando no se conoce la secuencia flanqueante, puede aislarse un fragmento de ADN que contiene una secuencia flanqueante a partir de un fragmento más grande de ADN que puede contener, por ejemplo, una secuencia codificante o incluso otro gen o genes. El aislamiento puede lograrse mediante digestión con endonucleasa de restricción para producir el fragmento de ADN apropiado seguido por aislamiento usando purificación en gel de agarosa, cromatografía Qiagen® en columna (Chatsworth, CA) u otros métodos conocidos por el experto en la técnica. La selección de enzimas adecuadas para lograr este fin resultará fácilmente evidente para un experto habitual en la técnica.
Un origen de replicación es normalmente una parte de los vectores de expresión procariotas adquiridos comercialmente, y el origen ayuda en la amplificación del vector en una célula huésped. Si el vector de elección no contiene un sitio de origen de replicación, puede sintetizarse uno químicamente basándose en una secuencia conocida y ligarse en el vector. Por ejemplo, el origen de replicación del plásmido pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) es adecuado para la mayoría de las bacterias gram-negativas, y diversos orígenes virales (por ejemplo, SV40, polioma, adenovirus, virus de estomatitis vesicular (VSV), o papilomavirus tales como HPV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. Generalmente, el componente de origen de replicación no se necesita para vectores de expresión de mamífero (por ejemplo, con frecuencia el origen de SV40 se usa únicamente porque también contiene el promotor temprano del virus).
Una secuencia de terminación de la transcripción está ubicada normalmente en 3’ con respecto al extremo de una región que codifica para polipéptido y sirve para terminar la transcripción. Habitualmente, una secuencia de terminación de la transcripción en células procariotas es un fragmento rico en G-C seguido por una secuencia de poli-T. Aunque la secuencia se clona fácilmente a partir de una biblioteca o incluso se adquiere comercialmente como parte de un vector, también puede sintetizarse fácilmente usando métodos para la síntesis de ácido nucleico tales como los descritos en el presente documento.
Un gen de marcador seleccionable codifica para una proteína necesaria para la supervivencia y el crecimiento de una célula huésped que se hace crecer en un medio de cultivo selectivo. Los genes de marcador de selección típicos codifican para proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina o canamicina para células huésped procariotas; (b) complementan deficiencias auxotróficas de la célula; o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles a partir de medios complejos o definidos. Marcadores seleccionables específicos son el gen de resistencia a la canamicina, el gen de resistencia a la ampicilina y el gen de resistencia a la tetraciclina. Ventajosamente, también puede usarse un gen de resistencia a la neomicina para la selección en células huésped tanto procariotas como eucariotas.
Otros genes seleccionables pueden usarse para amplificar el gen que se expresará. La amplificación es el proceso en el que genes que se requieren para la producción de una proteína crítica para el crecimiento o la supervivencia celular se repiten en tándem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. Los ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero incluyen dihidrofolato reductasa (DHFR) y genes de timidina cinasa sin promotor. Se colocan transformantes de células de mamífero bajo presión de selección en la que solo los transformantes están adaptados de manera única para sobrevivir gracias al gen seleccionable presente en el vector. Se impone presión de selección cultivando las células transformadas en condiciones en las que la concentración de agente de selección en el medio se aumenta sucesivamente, conduciendo de ese modo a la amplificación tanto del gen seleccionable como del ADN que codifica para otro gen, tal como una proteína de unión a antígeno que se une a un CGRP R. Como resultado, se sintetizan cantidades aumentadas de un polipéptido tal como una proteína de unión a antígeno a partir del ADN amplificado.
Habitualmente se necesita un sitio de unión a ribosoma para el inicio de la traducción de ARNm y se caracteriza por una secuencia de Shine-Dalgarno (procariotas) o una secuencia de Kozak (eucariotas). El elemento está normalmente ubicado en 3’ con respecto al promotor y en 5’ con respecto a la secuencia codificante del polipéptido que va a expresarse.
En algunos casos, tales como cuando se desea glicosilación en un sistema de expresión de célula huésped eucariota, pueden manipularse las diversas pre o prosecuencias para mejorar la glicosilación o el rendimiento. Por ejemplo, puede alterarse el sitio de escisión de peptidasa de un péptido señal particular, o añadir prosecuencias, que también pueden afectar a la glicosilación. El producto de proteína final puede tener, en la posición -1 (con respecto al primer aminoácido de la proteína madura), uno o más aminoácidos adicionales que inciden sobre la expresión, que pueden no haberse retirado totalmente. Por ejemplo, el producto de proteína final puede tener uno o dos residuos de aminoácido que se encuentran en el sitio de escisión de peptidasa, unidos al extremo amino-terminal. Alternativamente, el uso de algunos sitios de escisión de enzimas puede dar como resultado una forma ligeramente truncada del polipéptido deseado, si la enzima corta en tal zona dentro del polipéptido maduro.
La expresión y clonación contendrán normalmente un promotor que es reconocido por el organismo huésped y operativamente unido a la molécula que codifica para una proteína de unión a CGRP R. Los promotores son secuencias no transcritas ubicadas aguas arriba (es decir, en sentido 5’) con respecto al codón de inicio de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 a 1000 pb) que controlan la transcripción del gen estructural. Los promotores se agrupan convencionalmente en una de dos clases: promotores inducibles y promotores constitutivos. Los promotores inducibles inician niveles aumentados de transcripción a partir de ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, tal como la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. Por otro lado, los promotores constitutivos transcriben de manera uniforme un gen al que están operativamente unidos, es decir, con poco o ningún control sobre la expresión génica. Se conoce un gran número de promotores, reconocidos por una variedad de posibles células huésped. Un promotor adecuado está operativamente unido al ADN que codifica para la cadena pesada o cadena ligera que comprende una proteína de unión a CGRP R eliminando el promotor del ADN fuente mediante digestión con enzima de restricción e insertando la secuencia de promotor deseada en el vector.
En la técnica también se conocen promotores adecuados para su uso con huéspedes de levadura. Ventajosamente se usan potenciadores de levadura con promotores de levadura. Se conocen bien promotores adecuados para su uso con células huésped de mamífero e incluyen, pero no se limitan a, los obtenidos a partir de los genomas de virus tales como virus del polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, retrovirus, virus de la hepatitis B, y virus de simio 40 (SV40). Otros promotores de mamífero adecuados incluyen promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, promotores de choque térmico y el promotor de actina.
Los promotores adicionales que pueden ser de interés incluyen, pero no se limitan a: promotor temprano de SV40 (Benoist y Chambon, 1981, Nature 290:304-310); promotor de CMV (Thomsen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. U.S.A.
81:659-663); el promotor contenido en la repetición terminal larga en 3’ de virus del sarcoma de Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797); promotor de timidina cinasa del herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-1445); secuencias de promotor y reguladoras del gen de metalotionina (Prinster et al., 1982, Nature 296:39-42); y promotores procariotas tales como el promotor de beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731); o el promotor de tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21 -25). También son de interés las siguientes regiones de control de la transcripción animales, que muestran especificidad tisular y se han usado en animales transgénicos: la región de control del gen de elastasa I que es activa en células acinosas pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Omitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 1:425-515); la región de control del gen de insulina que es activa en células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315: 115-122); la región de control del gen de inmunoglobulina que es activa en células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 1:1436-1444); la región de control del virus de tumor de mama de ratón que es activa en células testiculares, de mama, linfoides y mastocitos (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495); la región de control del gen de albúmina que es activa en hígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276); la región de control del gen de alfa-fetoproteína que es activa en hígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 253:53-58); la región de control del gen de alfa 1-antitripsina que es activa en hígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171); la región de control del gen de beta-globina que es activa en células mieloides (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); la región de control del gen de proteína básica de mielina que es activa en oligodendrocitos en el cerebro (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); la región de control del gen de cadena ligera 2 de miosina que es activa en músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-286); y la región de control del gen de hormona liberadora gonadotrópica que es activa en el hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234: 1372-1378).
Puede insertarse una secuencia de potenciador en el vector para aumentar la transcripción de ADN que codifica para cadena ligera o cadena pesada que comprende una proteína de unión a CGRP R humano por eucariotas superiores. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, habitualmente de aproximadamente 10­ 300 pb de longitud, que actúan sobre el promotor para aumentar la transcripción. Los potenciadores son relativamente independientes de la orientación y la posición, habiéndose encontrado en posiciones tanto en 5’ como en 3’ con respecto a la unidad de transcripción. Se conocen varias secuencias de potenciador disponibles de genes de mamífero (por ejemplo, globina, elastasa, albúmina, alfa-feto-proteína e insulina). Sin embargo, normalmente se usa un potenciador de un virus. El potenciador de SV40, el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma y potenciadores de adenovirus conocidos en la técnica son elementos de potenciación a modo de ejemplo para la activación de promotores eucariotas. Aunque un potenciador puede situarse en el vector o bien en 5’ o bien en 3’ con respecto a una secuencia codificante, normalmente se ubica en un sitio en 5’ del promotor. Puede incorporarse una secuencia que codifica para una secuencia señal nativa o heteróloga apropiada (secuencia líder o péptido señal) en un vector de expresión, para promover la secreción extracelular del anticuerpo. La elección de péptido señal o líder depende del tipo de células huésped en las que va a producirse el anticuerpo, y una secuencia señal heteróloga puede sustituir a la secuencia señal nativa. Los ejemplos de péptidos señal que son funcionales en células huésped de mamífero incluyen los siguientes: la secuencia señal para interleucina 7 (IL-7) descrita en la patente estadounidense n.° 4.965.195; la secuencia señal para el receptor de interleucina 2 descrita en Cosman et al., 1984, Nature 312:768; el péptido señal de receptor de interleucina 4 descrito en la patente EP n.° 0 367566; el péptido señal de receptor de interleucina 1 tipo I descrito en la patente estadounidense n.° 4.968.607; el péptido señal de receptor de interleucina 1 tipo II descrito en la patente EP n.° 0460846.
Los vectores de expresión que se proporcionan pueden construirse a partir de un vector de partida tal como un vector disponible comercialmente. Tales vectores pueden contener o no la totalidad de las secuencias flanqueantes deseadas. Cuando una o más de las secuencias flanqueantes descritas en el presente documento no están ya presentes en el vector, pueden obtenerse individualmente y ligarse en el vector. Un experto en la técnica conoce bien métodos usados para obtener cada una de las secuencias flanqueantes.
Tras construirse el vector y haberse insertado una molécula de ácido nucleico que codifica para cadena ligera, una cadena pesada o una cadena ligera y una cadena pesada que comprende una secuencia de unión a antígeno de CGRP R en el sitio apropiado del vector, el vector completado puede insertarse en una célula huésped adecuada para amplificación y/o expresión de polipéptido. La transformación de un vector de expresión para una proteína de unión a antígeno en una célula huésped seleccionada puede lograrse mediante métodos bien conocidos incluyendo transfección, infección, coprecipitación con fosfato de calcio, electroporación, microinyección, lipofección, transfección mediada por DEAE-dextrano u otras técnicas conocidas. El método seleccionado será en parte una función del tipo de célula huésped que va a usarse. Estos métodos y otros métodos adecuados son muy conocidos por el experto en la técnica, y se exponen, por ejemplo, en Sambrook et al., 2001, citado anteriormente.
Una célula huésped, cuando se cultiva en condiciones apropiadas, sintetiza una proteína de unión a antígeno que puede recogerse posteriormente del medio de cultivo (si la célula huésped se secreta en el medio) o directamente de la célula huésped que la produce (si no se secreta). La selección de una célula huésped apropiada dependerá de diversos factores, tales como niveles de expresión deseados, modificaciones de polipéptido que son deseables o necesarias para la actividad (tales como glicosilación o fosforilación) y facilidad de plegamiento para dar una molécula biológicamente activa.
En la técnica se conocen bien líneas celulares de mamífero disponibles como huéspedes para la expresión e incluyen, pero no se limitan a, líneas celulares inmortalizadas disponibles de la colección americana de cultivos tipo (ATCC), incluyendo, pero sin limitarse a, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2) y varias otras líneas celulares. En determinadas realizaciones, pueden seleccionarse líneas celulares mediante determinación de qué líneas celulares tienen altos niveles de expresión y producen constitutivamente proteínas de unión a antígeno con propiedades de unión a CGRP R. En otra realización, puede seleccionarse una línea celular del linaje de células B que no produce su propio anticuerpo pero que tiene capacidad para producir y secretar un anticuerpo heterólogo.
Uso de proteínas de unión a antígeno de CGRP humano para fines de diagnóstico y terapéuticos
Las proteínas de unión a antígeno son útiles para la detección de CGRP R en muestras biológicas e identificación de células o tejidos que producen CGRP R. Por ejemplo, las proteínas de unión a antígeno de CGRP R pueden usarse en ensayos de diagnóstico, por ejemplo, ensayos de unión para detectar y/o cuantificar CGRP R expresado en un tejido o célula. Las proteínas de unión a antígeno que se unen específicamente a CGRP R también pueden usarse en el tratamiento de enfermedades relacionadas con CGRP R en un paciente que lo necesita. Además, pueden usarse proteínas de unión a antígeno de CGRP R para evitar que CGRP R forme un complejo con su ligando CGRP, modulando así la actividad biológica de CGRP R en una célula o tejido. Los ejemplos de actividades que pueden modularse incluyen, pero no se limitan a, inhibir la vasodilatación y/o reducir la inflamación neurogénica. Las proteínas de unión a antígeno que se unen a CGRP R pueden por tanto modular y/o bloquear la interacción con otros compuestos de unión y como tales pueden tener uso terapéutico en la mejora de enfermedades relacionadas con CGRP R.
Indicaciones
Una enfermedad o un estado asociado con CGRP R humano incluye cualquier enfermedad o estado cuya aparición en un paciente está provocada, al menos en parte, por la interacción de CGRP R con su ligando, CGRP. La intensidad de la enfermedad o el estado también puede aumentarse o reducirse mediante la interacción de CGRP R con CGRP. Los ejemplos de enfermedades y estados que pueden tratarse con las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento incluyen cefaleas, tales como cefaleas en racimos, migraña, incluyendo cefaleas migrañosas, dolor crónico, diabetes mellitus tipo II, inflamación, por ejemplo, inflamación neurogénica, trastornos cardiovasculares y alteración hemodinámica asociada con endotoxemia y septicemia.
En particular, las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento pueden usarse para tratar migraña, como tratamiento de una sola dosis que comienza tras haber comenzado un ataque de migraña y/o como tratamiento profiláctico administrado, por ejemplo, diariamente, semanalmente, bisemanalmente, mensualmente, bimensualmente, bianualmente, etc.) para prevenir o reducir la frecuencia y/o intensidad de los síntomas, por ejemplo, síntomas de dolor, asociados con ataques de migraña.
Métodos de diagnóstico
Las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento pueden usarse para fines de diagnóstico para detectar, diagnosticar o monitorizar enfermedades y/o estados asociados con CGRP R. También se proporcionan métodos para la detección de la presencia de CGRP R en una muestra usando métodos inmunohistológicos clásicos conocidos por los expertos en la técnica (por ejemplo, Tijssen, 1993, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Vol 15 (Eds R.H. Burdon and P.H. van Knippenberg, Elsevier, Ámsterdam); Zola, 1987, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, págs. 147-158 (CRC Press, Inc.); Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol. 101:976-985; Jalkanen et al., 1987, J. Cell Biol. 105:3087-3096). La detección de CGRP R puede realizarse in vivo o in vitro.
Las aplicaciones de diagnóstico proporcionadas en el presente documento incluyen el uso de las proteínas de unión a antígeno para detectar la expresión de CGRP R y la unión de los ligandos a CGRP R. Los ejemplos de métodos útiles en la detección de la presencia de CGRP R incluyen inmunoensayos, tales como el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA).
Para aplicaciones de diagnóstico, la proteína de unión a antígeno se marcará normalmente con un grupo de marcaje detectable. Los grupos de marcaje adecuados incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), grupos fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánidos), grupos enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa del rábano, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), grupos quimioluminiscentes, grupos biotinilo, o epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, etiquetas epitópicas). En algunas realizaciones, el grupo de marcaje se acopla a la proteína de unión a antígeno mediante brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir la posibilidad de impedimento estérico. En la técnica se conocen diversos métodos para marcar proteínas y pueden usarse.
En otro aspecto, puede usarse una proteína de unión a antígeno para identificar una célula o células que expresan CGRP R. En una realización específica, la proteína de unión a antígeno está marcada con un grupo de marcaje y se detecta la unión de la proteína de unión a antígeno marcada a CGRP R. En una realización específica adicional, la unión de la proteína de unión a antígeno a CGRP R se detecta in vivo. En una realización específica adicional, la proteína de unión a antígeno de CGRP R se aísla y se mide usando técnicas conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, 10 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor (ed. 1991 y suplementos periódicos); John E. Coligan, ed., 1993, Current Protocols In Immunology New York: John Wiley & Sons.
Otro aspecto proporciona la detección de la presencia de una molécula de prueba que compite por la unión a CGRP R con las proteínas de unión a antígeno proporcionadas. Un ejemplo de un ensayo de este tipo implicará detectar la cantidad de proteína de unión a antígeno libre en una disolución que contiene una cantidad de CGRP R en presencia o ausencia de la molécula de prueba. Un aumento de la cantidad de proteína de unión a antígeno libre (es decir, la proteína de unión a antígeno no unida a CGRP R) indicará que la molécula de prueba puede competir por la unión a CGRP R con la proteína de unión a antígeno. En una realización, la proteína de unión a antígeno está marcada con un grupo de marcaje. Alternativamente, la molécula de prueba está marcada y la cantidad de molécula de prueba libre se monitoriza en presencia y ausencia de una proteína de unión a antígeno.
Métodos de tratamiento: formulaciones farmacéuticas, vías de administración
También se ilustran métodos de uso de las proteínas de unión a antígeno. En algunos métodos, se proporciona una proteína de unión a antígeno a un paciente. La proteína de unión a antígeno inhibe la unión de CGRP a CGRP R humano.
También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de una o una pluralidad de las proteínas de unión a antígeno y un diluyente, portador, solubilizante, emulsionante, conservante y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. Además, se incluyen métodos de tratamiento de un paciente, por ejemplo, para migraña, mediante administración de tal composición farmacéutica. El término “paciente” incluye pacientes humanos.
Los materiales de formulación aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas. En realizaciones específicas, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de proteínas de unión a antígeno de CGRP R humano.
En determinadas realizaciones, los materiales de formulación aceptables son preferiblemente no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas. En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, la osmolaridad, viscosidad, claridad, el color, la isotonicidad, el olor, la esterilidad, estabilidad, las velocidad de disolución o liberación, la adsorción o penetración de la composición. En tales realizaciones, los materiales de formulación adecuados incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina); antimicrobianos; antioxidantes (tal como ácido ascórbico, sulfito de sodio o hidrogenosulfito de sodio); tampones (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos); agentes de carga (tales como manitol o glicina); agentes quelantes (tales como ácido etilendiamino-tetraacético (EDTA)); agentes complejantes (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina); cargas; monosacáridos; disacáridos; y otros hidratos de carbono (tales como glucosa, mañosa o dextrinas); proteínas (tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas); agentes colorantes, saborizantes y diluyentes; agentes emulsionantes; polímeros hidrófilos (tales como polivinilpirrolidona); polipéptidos de bajo peso molecular; contraiones de formación de sales (tales como sodio); conservantes (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno); disolventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol); alcoholes de azúcar (tales como manitol o sorbitol); agentes de suspensión; tensioactivos o agentes humectantes (tales como Pluronics, PEG, ésteres de sorbitano, polisorbatos tales como polisorbato 20, polisorbato, tritón, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes potenciadores de la estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol); agentes potenciadores de la tonicidad (tales como haluros de metales alcalinos, preferiblemente cloruro de sodio o potasio, manitol-sorbitol); vehículos de administración; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. Véase, REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a edición, (A.R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company.
En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica óptima la determinará un experto en la técnica dependiendo, por ejemplo, de la vía de administración prevista, formato de administración y dosificación deseada. Véase, por ejemplo, ReMiNGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, citado anteriormente. En determinadas realizaciones, tales composiciones pueden influir en el estado físico, la estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de aclaramiento in vivo de las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer. En determinadas realizaciones, el vehículo o portador primario en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza o bien acuosa o bien no acuosa. Por ejemplo, un vehículo o portador adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o líquido cefalorraquídeo artificial, posiblemente complementado con otros materiales comunes en composiciones para administración parenteral. Solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con albúmina sérica son vehículos a modo de ejemplo adicionales. En realizaciones específicas, las composiciones farmacéuticas comprenden tampón Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5, o tampón acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5, y pueden incluir además sorbitol o un sustituto adecuado. En determinadas realizaciones, pueden prepararse composiciones de proteína de unión a antígeno de CGRP R humano para almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tiene el grado de pureza deseado con agentes de formulación opcionales (REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, citado anteriormente) en forma de una torta liofilizada o una disolución acuosa. Además, en determinadas realizaciones, la proteína de unión a antígeno de CGRP R humano puede formularse como liofilizado usando excipientes apropiados tales como sacarosa.
Las composiciones farmacéuticas pueden seleccionarse para administración parenteral. Alternativamente, las composiciones pueden seleccionarse para inhalación o para administración a través del tracto digestivo, tal como por vía oral. La preparación de tales composiciones farmacéuticamente aceptables se encuentra dentro de los conocimientos de la técnica.
Los componentes de formulación están presentes preferiblemente en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. En determinadas realizaciones, se usan tampones para mantener la composición a pH fisiológico o a un pH ligeramente inferior, normalmente dentro de un intervalo de pH de desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 8.
Cuando se contempla la administración parenteral, las composiciones terapéuticas pueden proporcionarse en forma de una disolución acuosa libre de pirógenos, aceptable por vía parenteral, que comprende la proteína de unión a CGRP R humano deseada en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para inyección parenteral es agua destilada estéril en la que se formula la proteína de unión a antígeno de CGRP R humano como disolución isotónica estéril, conservada de manera apropiada. En determinadas realizaciones, la preparación puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bioerosionables, compuestos poliméricos (tales como poli(ácido láctico) o poli(ácido glicólico)), perlas o liposomas, que pueden proporcionar liberación controlada o sostenida del producto que puede administrarse mediante inyección en depósito. En determinadas realizaciones, también puede usarse ácido hialurónico, que tiene el efecto de fomentar la duración sostenida en la circulación. En determinadas realizaciones, pueden usarse dispositivos de administración de fármacos implantables para introducir la proteína de unión a antígeno deseada.
Determinadas composiciones farmacéuticas se formulan para inhalación. En algunas realizaciones, se formulan proteínas de unión a antígeno de CGRP R humano como polvo seco, inhalable. En realizaciones específicas, también pueden formularse disoluciones para inhalación de proteína de unión a antígeno de CGRP R humano con un propelente para administración en aerosol. En determinadas realizaciones, pueden nebulizarse disoluciones. Algunas formulaciones pueden administrarse por vía oral. Las proteínas de unión a antígeno de CGRP R humano que se administran de esta manera pueden formularse con o sin portadores habitualmente usados en la producción de formas de dosificación sólidas tales como comprimidos y cápsulas. En determinadas realizaciones, puede diseñarse una cápsula para liberar la parte activa de la formulación en el punto del tracto gastrointestinal en el que se maximiza la biodisponibilidad y se minimiza la degradación presistémica. Pueden incluirse agentes adicionales para facilitar la absorción de la proteína de unión a antígeno de CGRP R humano. También pueden emplearse diluyentes, saborizantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes de disgregación de comprimidos y aglutinantes.
Algunas composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad eficaz de una o una pluralidad de proteínas de unión a antígeno de CGRP R humano en una mezcla con excipientes no tóxicos que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Al disolver los comprimidos en agua estéril u otro vehículo apropiado, pueden prepararse disoluciones en forma de dosis unitaria. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato o bicarbonato de sodio, lactosa o fosfato de calcio; o agentes aglutinantes, tales como almidón, gelatina o goma arábiga; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco.
Composiciones farmacéuticas adicionales resultarán evidentes para los expertos en la técnica, incluyendo formulaciones que impliquen proteínas de unión a antígeno de CGRP R humano en formulaciones de administración sostenida o controlada. Los expertos en la técnica también conocen técnicas para formular una variedad de otros medios de administración sostenida o controlada, tales como portadores de liposomas, micropartículas bioerosionables o perlas porosas e inyecciones en depósito. Las preparaciones de liberación sostenida pueden incluir matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, polilactidas (tal como se da a conocer en la patente estadounidense n.° 3.773.919 y la publicación de solicitud de patente europea n.° EP 058481), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de gamma-etilo (Sidman et al., 1983, Biopolymers 2:547-556), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 y Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), etileno-acetato de vinilo (Langer et al., 1981, citado anteriormente) o poli(ácido D(-)-3-hidroxibutírico) (publicación de solicitud de patente europea n.° EP 133.988). Las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas que pueden prepararse mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3688-3692; publicaciones de solicitud de patente europea n.os Ep 036.676; EP 088.046 y EP 143.949.
Las composiciones farmacéuticas usadas para la administración in vivo se proporcionan normalmente como preparaciones estériles. La esterilización puede lograrse mediante filtración a través de membranas de esterilización por filtración. Cuando se liofiliza la composición, la esterilización usando este método puede realizarse o bien antes o bien después de la liofilización y reconstitución. Las composiciones para administración parenteral pueden almacenarse en forma liofilizada o en una disolución. Las composiciones parenterales se colocan generalmente en un recipiente que tiene un orificio de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa para disolución intravenosa o vial que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica.
En determinadas realizaciones, células que expresan una proteína de unión a antígeno recombinante tal como se da a conocer en el presente documento se encapsulan para su administración (véase, Invest. Ophthalmol Vis Sci 43:3292-3298, 2002 y Proc. Natl. Acad. Sciences 103:3896-3901,2006).
En determinadas formulaciones, una proteína de unión a antígeno tiene una concentración de al menos 10 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ ml o 150 mg/ml. Algunas formulaciones contienen un tampón, sacarosa y polisorbato. Un ejemplo de una formulación es una que contiene 50-100 mg/ml de proteína de unión a antígeno, acetato de sodio 5-20 mM, sacarosa al 5-10% p/v, y polisorbato al 0,002-0,008% p/v. Determinadas formulaciones, por ejemplo, contienen 65-75 mg/ml de una proteína de unión a antígeno en tampón acetato de sodio 9-11 mM, sacarosa al 8-10% p/v y polisorbato al 0,005-0,006% p/v. El pH de determinadas de tales formulaciones está en el intervalo de 4,5-6. Otras formulaciones tienen un pH de 5,0­ 5,5 (por ejemplo, pH de 5,0, 5,2 o 5,4).
Una vez que se ha formulado la composición farmacéutica, puede almacenarse en viales estériles como disolución, suspensión, gel, emulsión, sólido, cristal o como polvo deshidratado o liofilizado. Tales formulaciones pueden almacenarse o bien en una forma lista para usar o bien en una forma (por ejemplo, liofilizada) que se reconstituye antes de su administración. También se proporcionan kits para producir una unidad de administración de dosis única. Determinados kits contienen un primer recipiente que tiene una proteína secada y un segundo recipiente que tiene una formulación acuosa. En determinadas realizaciones, se proporcionan kits que contienen jeringas precargadas de una única y de múltiples cámaras (por ejemplo, jeringas para líquidos y jeringas Lyosyringe). La cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que contiene proteína de unión a antígeno de CGRP R humano que va a emplearse dependerá, por ejemplo, del contexto y los objetivos terapéuticos. Un experto en la técnica apreciará que los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento variarán dependiendo, en parte, de la molécula administrada, la indicación para la que está usándose la proteína de unión a antígeno de CGRP R humano, la vía de administración, y el tamaño (peso corporal, superficie corporal y tamaño de órgano) y/o condición (la edad y salud general) del paciente. En determinadas realizaciones, el médico puede valorar la dosificación y modificar la vía de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo.
Una dosificación típica puede oscilar entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 30 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En realizaciones específicas, la dosificación puede oscilar entre 10 mg/kg y aproximadamente 30 mg/kg, opcionalmente entre 0,1 mg/kg y aproximadamente 30 mg/kg, alternativamente entre 0,3 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg. En algunas aplicaciones, la dosificación es de desde 0,5 mg/kg hasta 20 mg/kg. En algunos casos, una proteína de unión a antígeno se administra a una dosis de 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg o 20 mg/kg. El programa de dosificación en algunos regímenes de tratamiento es a una dosis de 0,3 mg/kg cada semana, 0,5 mg/kg cada semana, 1 mg/kg cada semana, 3 mg/kg cada semana, 10 mg/kg cada semana o 20 mg/kg cada semana.
La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos de la proteína de unión a antígeno de CGRP R humano particular en la formulación usada. Normalmente, un médico clínico administra la composición hasta que se alcanza una dosificación que logra el efecto deseado. Por tanto, la composición puede administrarse como una única dosis o como dos o más dosis (que pueden contener o no la misma cantidad de la molécula deseada) a lo largo del tiempo, o como una infusión continua a través de un dispositivo de implantación o catéter. Pueden determinarse dosificaciones apropiadas mediante el uso de datos de respuesta a la dosis apropiados. En determinadas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno pueden administrarse a pacientes a lo largo de un periodo de tiempo prolongado. La administración a largo plazo de una proteína de unión a antígeno minimiza la respuesta inmunitaria o alérgica adversa comúnmente asociada con proteínas de unión a antígeno que no son totalmente humanas, por ejemplo un anticuerpo preparado contra un antígeno humano en un animal no humano, por ejemplo, un anticuerpo que no es completamente humano o anticuerpo no humano producido en una especie no humana.
La vía de administración de la composición farmacéutica es según métodos conocidos, por ejemplo, por vía oral, mediante inyección por vía intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimatosa), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, intraportal o intralesional; mediante sistemas de liberación sostenida o mediante dispositivos de implantación. En determinadas realizaciones, las composiciones pueden administrarse mediante inyección en bolo o de manera continua mediante infusión, o mediante dispositivo de implantación.
La composición también puede administrarse de manera local mediante implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado sobre el que se ha absorbido o encapsulado la molécula deseada. En determinadas realizaciones, cuando se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u órgano adecuado, y la administración de la molécula deseada puede realizarse mediante difusión, bolo de liberación controlada o administración continua.
También puede ser deseable usar composiciones farmacéuticas de proteína de unión a antígeno de CGRP R humano ex vivo. En tales casos, se exponen células, tejidos u órganos que se han extraído del paciente a composiciones farmacéuticas de proteína de unión a antígeno de CGRP R humano tras lo cual se implantan de nuevo posteriormente las células, los tejidos y/u órganos en el paciente.
En particular, pueden administrarse proteínas de unión a antígeno de CGRP R humano implantando determinadas células que se han modificado por ingeniería genética, usando métodos tales como los descritos en el presente documento, para expresar y secretar el polipéptido. En determinadas realizaciones, tales células pueden ser células animales o humanas, y pueden ser autólogas, heterólogas o xenogénicas. En determinadas realizaciones, las células pueden inmortalizarse. En otras realizaciones, con el fin de reducir la posibilidad de una respuesta inmunológica, las células pueden encapsularse para evitar la infiltración de tejidos circundantes. En realizaciones adicionales, los materiales de encapsulación son normalmente membranas o recintos poliméricos, biocompatibles, semipermeables, que permiten la liberación del/de los producto(s) de proteína pero impiden la destrucción de las células por el sistema inmunitario del paciente o por otros factores perjudiciales de los tejidos circundantes.
EJEMPLO 1
GENERACIÓN DE RECEPTOR DE CGRP COMO ANTÍGENOS
A. Clonación molecular de CRLR y RAMP1 humanos
Se clonaron ADNc de CRLR humano (n.° de registro de GenBank U17473; SEQ ID NO: 1) y ADNc de RAMP1 (n.° de registro de GenBank AJ001014; SEQ ID NO: 3) en los vectores de expresión de células de mamífero pcDNA3.1-Zeo y pcDNA3.1-Hyg (Invitrogen, Carlsbad, CA), respectivamente, para transfecciones de células HEK 293EBNA (Invitrogen) tal como se describe a continuación. También se clonaron el ADNc de hCRLR y ADNc de hRAMP1 en el vector pDSRa24 (Kim, H. Y. et al. J. Inv. Derm. Symp. Proc. (2007) 12: 48-49) para transfecciones de células AM-1 CHO (patente estadounidense número 6.210.924).
B. Líneas celulares transfectadas de manera estable
1. Expresión estable de CGRP R humano en células 293EBNA
Se sembraron células HEK 293EBNA (disponibles de ATCC o Invitrogen) a una densidad de 1,5x106 células por placa de 100 mm. Tras 24 horas, se transfectaron conjuntamente las células con 6 mg de ADN linealizados de huRAMP1/pcDNA3.1-Hyg y huCRLR/pcDNA3.1-Zeo con FuGene6 (Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo las instrucciones suministradas por Invitrogen. Después de dos días, se tripsinizaron las células y se subcultivaron en medio de crecimiento que contenía higromicina 400 mg/ml zeocina 250 mg/ml. Después de dos semanas, se tripsinizaron las colonias resistentes a fármaco resultantes y se combinaron para dar combinaciones. Se sometieron las combinaciones a cuatro rondas de FACS clasificando un análogo peptídico de CGRP8-37 marcado con Alexa 647 (descrito a continuación). Se recogió el 5% superior de las células que presentaban expresión en cada ronda.
2. Expresión estable de CGRP R humano en células AM-1 CHO
Se sembraron células AM-1 CHO (una variante adaptada a medios de crecimiento libres de suero de la línea celular deficiente para CHO DHFR descrita en Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 4216 (1980)), a 1,5x106 células por placa de 100 mm. Tras 24 horas, se transfectaron conjuntamente las células con 4 mg de ADN linealizado de cada uno de pDSRa24/huRAMP1 y pDSRa24/huCRLR con FuGene6 (Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo las instrucciones suministradas por Invitrogen. Se tripsinizaron las células transfectadas 2 días tras la transfección y se sembraron en medio de crecimiento selectivo de CHO DHFR que contenía FBS dializado al 10% y sin suplemento de hipoxantina/timidina. Después de 2 semanas, se tripsinizaron las colonias transfectadas resultantes y se combinaron. Se sometieron las combinaciones a análisis de clasificación de FACS.
3. Expresión estable de adrenomedulina humana (AM1) en células HEK 293EBNA
Se sembraron células 293EBNA en placas de 100 mm a 1,5x106 células/placa en DMEM (alto contenido en glucosa)+ FBS al 5% aminoácidos no esenciales de MEM al 1% piruvato de sodio al 1%. Al día siguiente se transfectaron conjuntamente las células usando reactivo de transfección FuGENE 6 (Roche) con pcDNA3.1/zeocin/huCRLR más pcDNA3.1/hygromycin/huRAMP2. Se linealizaron ambos constructos de ADN con Fspl. Tras 48 horas se subcultivaron las células en placas de 100 mm a 3 densidades celulares (8 x 105, 3,2 x 105 y 8 x 104 células/placa) en medio de crecimiento que contenía zeocina 200 mg/ml. Se cambió el medio dos veces por semana. Tras una semana se alimentó a las placas medio que contenía higromicina 200 mg/ml zeocina 200 mg/ml. Después de dos semanas, se aislaron 96 colonias con anillos de clonación. Se recogieron las colonias restantes en un único cultivo de combinación. Se sometieron a ensayo los clones y las combinaciones para determinar su respuesta a la estimulación mediante agonista de receptor o forskolina. Varios clones mostraron una buena respuesta y se seleccionó uno para su uso en experimentos posteriores.
4. Expresión estable de cyno CGRP R en células HEK 293EBNA
Se sembraron células 293EBNA en placas de 100 mm a 1,5x106 células/placa en DMEM (alto contenido en glucosa) FBS al 5% aminoácidos no esenciales de MEM al 1% piruvato de sodio al 1%. Al día siguiente se transfectaron conjuntamente las células usando FuGENE 6 con pcDNA3.1/zeocin/cynoCRLR más pcDNA3.1/hygromycin/cynoRAMP1. Se linealizaron ambos constructos con Fspl. Tras 48 horas se subcultivaron las células en medio de crecimiento que contenía zeocina 200 mg/ml higromicina 400 mg/ml a diluciones de 1:20, 1:40, 1:100 y 1:200. Se cambió el medio dos veces por semana. Después de dos semanas, se aislaron 96 colonias transfectadas usando anillos de clonación. Se sometieron a ensayo los clones para determinar su respuesta a la estimulación mediante ligando de CGRP. Varios clones mostraron altos niveles de respuesta similares y se seleccionó uno para su uso en experimentos posteriores.
C. Aislamiento de células con alta expresión de receptor de CGRP
Se sintetizó un análogo peptídico de CGRP8-37 (Midwest Bio-Tech Inc. Fishers, IN) con la siguiente secuencia:
Se marcó el péptido con Alexa 647-NHS siguiendo las instrucciones del fabricante (Molecular Probes, Inc. Cat A 2006). CGRP8-37 marcado con Alexa 647 mostró tinción específica de células transfectadas con receptor de CGRP y no de las células parenterales no transfectadas y se usó como reactivo de FACS.
Se clasificaron repetidas veces las combinaciones de células 293EBNA y AM-1 CHO transfectadas con receptor de huCGRP (generadas como anteriormente) hasta cuatro veces con péptido CGRP8-37 marcado con Alexa 647. Se recogieron las células con alta expresión en cada clasificación, se expandieron y tras la clasificación final se congelaron en viales. Se usaron las células AM-1 CHO/huCGRP R para la inmunización tal como se describe a continuación, y se usaron las células 293EBNA/huCGRP R para la titulación de sueros de ratón tras la inmunización y en exámenes de unión de los sobrenadantes de hibridoma.
D. Generación de receptor de CGRP soluble
Se generaron polipéptidos de receptor de CGRP soluble que contenían los dominios extracelulares N-terminales (ECD) de Cr Lr humano (SEQ ID NO: 6) y RAMP1 humano (SEQ ID NO: 8) mediante transfección conjunta transitoria de células 293 6E (Durocher, et al., Nucleic Acids Res. 30:E9 (2002)) con vectores que contenían los ADNc correspondientes (SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7) tal como se describe a continuación. Se emplearon etiquetas usadas comúnmente (poliHis, Flag, HA y/o Fc) para facilitar la secreción y/o posterior purificación.
Se preparó un ECD de CGRP R heterodimérico soluble fusionado a Fc mediante clonación por PCR con los cebadores apropiados en el vector de expresión transitoria pTT5 (Durocher, et al., citado anteriormente). El ECD N-terminal de CRLR-Fc consistía en el dominio extracelular N-terminal de CRLR (SEQ ID NO: 6) fusionado a Fc de IgG1 humana. El ECD de RAMP1-Fc contiene el dominio extracelular de RAMP1 (SEQ ID NO: 8) fusionado a Fc de IgG1 humana. En ambos casos, había un ligador que consistía en cinco glicinas consecutivas entre el dominio ECD y Fc.
Se expresó el receptor de CGRP heterodimérico soluble transfectando conjuntamente los dos constructos de la siguiente manera. Se transfectaron células 293-6E a 1 x 106 células/ml en matraces de agitación con ADN 0,5 mg/l (ECD N-ter de hCRLR-Fc/pTT5 y ECD de huRAMP1 -Fc/pTT5) con 3 ml de PEI/mg de ADN en medios FreeStyle 293 (Invitrogen). Se hicieron crecer las células en suspensión en medio de expresión FreeStyle 293 suplementado con Pluronic F68 al 0,1% y Geneticin 50 mg/ml durante 7 días y se recogieron para su purificación.
Se realizaron purificaciones a partir de medios condicionados (“CM”) tamponando los CM con la adición de Tris 50 mM, citrato de sodio 400 mM y ajustando el pH a 8,5. Después se hicieron pasar los CM tamponados sobre una columna de afinidad de proteína A equilibrada en Tris 50 mM, citrato de sodio 400 mM y pH ajustado a pH 8,5. Se lavó la columna de proteína A con PBS y se eluyó la proteína de fusión de Fc con HOAc 0,1 N. El pico eluido contenía componentes tanto CRLR como RAMP1 cuando se sometió a prueba mediante inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos individuales específicos o bien para CRLR o bien para RAMP1. Además, la CL-EM y secuenciación N-terminal confirmaron la presencia tanto de heterodímero CRLR:RAMP1 como de homodímero CRLR:CRLR en una razón de aproximadamente (2:3). Se mostró que este “receptor de CGRP soluble” competía con la unión a CGRPb-37 marcado con Alexa647 de receptor de células recombinantes que expresaban CGRP en el análisis de FMAT, aunque no logró unirse a ligando de CGRP según se determinó usando pruebas de Biacore. Se usó el material como inmunógeno tal como se describe en el ejemplo, a pesar, entre otras cosas, de su heterogenicidad y falta de unión a ligando de CGRP.
E. Generación de extractos de membrana a partir de células que expresan receptor de CGRP recombinantes
Se prepararon extractos de membrana a partir de células que expresaban receptor de CGRP usando un método descrito por Bosse, R. et al., (Journal of Biomolecular Screening, 3(4): 285-292 (1998)). En resumen, se sedimentaron aproximadamente 5 gramos de pasta celular en 50 ml de PBS a 3.000 rpm durante 10 min a 4°C y se resuspendieron en 30 ml de tampón de lisis frío (HEPES 25 mM, pH 7,4, MgCl23 mM más un comprimido de cóctel de inhibidores de proteasa de Roche/50 ml). Se homogeneizó el lisado con Glas-Col (homogeneizador de teflónvidrio) con ~20 golpes a 5.000 rpm y se centrifugó en un rotor JA21 a 20.000 rpm durante 15 min a 4°C. Se repitió este procedimiento una vez más y se resuspendió el sedimento final en ~1-5 ml de tampón de “sedimento final” (HEPES 25 mM, pH 7,4, MgCl23 mM, sacarosa al 10% (p/v) más un comprimido de cóctel de inhibidores de proteasa de Roche/50 ml). Se sometieron los extractos de membrana a cizalladura haciéndolos pasar a través de agujas de 16 G y 25 G 2-3 veces. Se determinó la concentración total de proteína de membrana con un ensayo de proteínas BCA en microplaca (Pierce).
EJEMPLO 2
GENERACIÓN DE ANTICUERPOS FRENTE A RECEPTOR DE CGRP
A. Inmunización
Se llevaron a cabo inmunizaciones usando las siguientes formas de antígenos de receptor de CGRP, preparados tal como se describió en el ejemplo 1:
(i) transfectantes de AM-1 CHO que expresaban CRLR y RAMP1 humanos de longitud completa en la superficie celular, obtenidos mediante transfección conjunta de células CHO con ADNc de CRLR de longitud completa humano (SEQ ID NO: 1) que codifica para un polipéptido que tiene la secuencia SEQ ID NO: 2, y ADNc de RAMP1 (SEQ ID NO: 3) que codifica para un polipéptido que tiene la secuencia SEQ ID NO: 4
(ii) extracto de membrana de las células descritas en (i) anteriormente; y
(iii) receptor de CGRP soluble obtenido mediante expresión conjunta y purificación del ECD N-terminal de CRLR (SEQ ID NO: 6) y el dominio extracelular (ECD) de RAMP1 (SEQ ID NO: 8) tal como se describió en el ejemplo 1.
Se inmunizaron animales XENOMOUSE con proteína de receptor de CGRP soluble purificada y membranas de CGRP R purificadas preparadas a partir de células AM-1 CHO que expresaban de manera estable CGRP R de la misma manera usando dosis de 10 mg/ratón y 150 mg/ratón respectivamente. Se prepararon membranas de CGRP usando métodos descritos anteriormente.
Se administraron refuerzos posteriores a dosis de diez mg/ratón de CGRP R soluble o 75 mg de membranas de CGRP R purificadas. También se inmunizaron animales XENOMOUSE con células que expresaban receptor de CGRP usando dosis de 3,4 x 106 células transfectadas con CGRP R/ratón y se realizaron refuerzos posteriores de 1,7 x 106 células transfectadas con CGRP R /ratón. Los sitios de inyección usados fueron combinaciones de base de la cola subcutánea e intraperitoneal. Se realizaron inmunizaciones según los métodos dados a conocer en la patente estadounidense número 7.064.244, presentada el 19 de febrero de 2002. Se prepararon adyuvantes TiterMax Gold (Sigma; n.° de cat. T2684), Alum (E.M. Sergent Pulp and Chemical Co., Clifton, Nj , n.° de cat. 1452-250) según las instrucciones del fabricante y se mezclaron en una razón 1:1 de emulsión de adyuvante con respecto a disolución de antígeno.
Se recogieron los sueros 4 - 6 semanas después de la primera inyección y se determinaron títulos específicos mediante tinción de FACS de células 293EBNA que expresaban receptor de CGRP recombinantes.
Se inmunizaron ratones o bien con células/membranas que expresaban células con CGRP R de longitud completa o bien con dominio extracelular de CGRP R soluble, con un intervalo de 11 - 17 inmunizaciones a lo largo de un periodo de aproximadamente uno a tres meses y medio. Se identificaron los ratones con el mayor título en suero y se prepararon para la generación de hibridoma. Se realizaron las inmunizaciones en grupos de múltiples ratones, normalmente diez. Se combinaron normalmente tejidos de bazo y ganglios linfáticos poplíteos e inguinales de cada grupo para generar fusiones.
B. Preparación de anticuerpos monoclonales
Se identificaron animales que mostraban títulos adecuados y se obtuvieron linfocitos de ganglios linfáticos drenantes y, si era necesario, se combinaron para cada cohorte. Se disociaron los linfocitos a partir de tejido linfoide en un medio adecuado (por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco; DMEM; que puede obtenerse de Invitrogen, Carlsbad, CA) para liberar las células de los tejidos, y se suspendieron en DMEM. Se seleccionaron células B y/o se expandieron usando un método adecuado, y se fusionaron con una pareja de fusión adecuada, por ejemplo, células P3X63Ag8.653 de mieloma no secretoras (colección americana de cultivos tipo CRL 1580; Kearney et aI, J. Immunol. 123, 1979, 1548-1550).
Se mezclaron los linfocitos con células de pareja de fusión a una razón 1:4. Se sedimentó suavemente la mezcla de células mediante centrifugación a 400 x g durante 4 minutos, se decantó el sobrenadante y se mezcló suavemente la mezcla de células usando una pipeta de 1 ml. Se indujo la fusión con PEG/DMSO (polietilenglicol/dimetilsulfóxido; obtenido de Sigma-Aldrich, St. Louis MO; 1 ml por millón de linfocitos). Se añadió lentamente PEG/DMSO con agitación suave a lo largo de un minuto seguido por un minuto de mezclado. Después se añadió IDMEM (DMEM sin glutamina; 2 ml por millón de células B) a lo largo de 2 minutos con agitación suave, seguido por IDMEM adicional (8 ml por millón de células B) que se añadió a lo largo de 3 minutos.
Se sedimentaron suavemente las células fusionadas (400 x g, 6 minutos) y se resuspendieron en 20 ml de medios de selección (por ejemplo, DMEM que contenía azaserina e hipoxantina [HA] y otros materiales complementarios según fuera necesario) por millón de células B. Se incubaron las células durante 20-30 minutos a 37°C y después se resuspendieron en 200 ml de medios de selección y se cultivaron durante de tres a cuatro días en matraces T175 antes de sembrarse en placas de 96 pocillos.
Se distribuyeron las células en placas de 96 pocillos usando técnicas convencionales para maximizar la clonalidad de las colonias resultantes. Tras varios días de cultivo, se recogieron los sobrenadantes de hibridoma y se sometieron a ensayos de examen según se detalla en los siguientes ejemplos, incluyendo confirmación de unión a receptor de CGRP humano, identificación de anticuerpos bloqueantes mediante un ensayo de competencia de unión a ligando y evaluación de reactividad cruzada con otros receptores relacionados con el receptor de CGRP (por ejemplo, receptor de adrenomedulina humano). Se seleccionaron adicionalmente las células positivas y se sometieron a técnicas convencionales de clonación y subclonación. Se expandieron las líneas clonales in vitro y se obtuvieron los anticuerpos humanos secretados para su análisis.
C. Análisis de secuencia de anticuerpos monoclonales seleccionados
Se secuenciaron anticuerpos monoclonales subclonados seleccionados usando métodos convencionales de RT-PCR. La tabla 2A muestra las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras de anticuerpos a modo de ejemplo dados a conocer en el presente documento. La tabla 2B muestra las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas de anticuerpos a modo de ejemplo dados a conocer en el presente documento.
Se alinearon las secuencias de aminoácidos correspondientes a regiones de CDR de anticuerpos secuenciados y se usaron las alineaciones para agrupar los clones por similitud.
Las alineaciones de secuencias de CDR de cadena ligera de clones que tenían cadenas ligeras kappa, y determinadas secuencias consenso correspondientes, se muestran en las figuras 3A y 3B.
Las alineaciones de secuencias de CDR de cadena ligera de clones que tenían cadenas ligeras lambda, y determinadas secuencias consenso correspondientes, se muestran en la figura 4.
Las alineaciones de secuencias de CDR de cadena pesada de anticuerpos a modo de ejemplo dados a conocer en el presente documento, y determinadas secuencias consenso correspondientes, se muestran en las figuras 5A, 5B, 5C, 5D y 5E.
Determinadas secuencias consenso de CDR de cadena pesada a modo de ejemplo dadas a conocer en el presente documento se muestran en la figura 5F.
EJEMPLO 3
IDENTIFICACIÓN DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS PARA RECEPTOR DE CGRP
A. Selección de anticuerpos de unión específicos para receptor de CGRP mediante FMAT
Después de 14 días de cultivo, se examinaron sobrenadantes de hibridoma para detectar anticuerpos monoclonales específicos para CGRP R mediante tecnología de ensayo de microvolumen fluorimétrico (FMAT) (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se examinaron los sobrenadantes frente a o bien las células AM-1 CHO huCGRP R o bien células HEK 293 recombinantes que se transfectaron con CGRP R humano y se contraexaminaron frente a células HEK293 parenterales (preparadas tal como se describió en el ejemplo 1).
En resumen, las células en medios Freestyle (Invitrogen, Carlsbad, CA) se sembraron en placas de FMAT de 384 pocillos en un volumen de 50 pl/pocillo a una densidad de aproximadamente 4000 células/pocillo para los transfectantes estables, y a una densidad de aproximadamente 16.000 células/pocillo para las células parentales, y se incubaron las células durante la noche a 37°C. Después se añadieron 10 pl/pocillo de sobrenadante y se incubaron las placas durante aproximadamente una hora a 4°C, tras lo cual se añadieron 10 pl/pocillo de anticuerpo secundario anti-IgG-Cy5 humana (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) a una concentración de 2,8 pg/ml (concentración final de 400 ng/ml). Después se incubaron las placas durante una hora a 4°C, y se leyó la fluorescencia usando un explorador macroconfocal de FMAT (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Para contraexámenes, se sembraron las células AM-1 CHO o células HEK 293 parentales de manera similar y se examinaron los sobrenadantes mediante FMAT en estas células en paralelo para diferenciar y eliminar hibridomas que se unían a proteínas celulares, pero no al receptor de CGRP.
B. Identificación de anticuerpos bloqueantes mediante ensayo de competencia de unión a ligando mediante FMAT
Se desarrolló un método de competencia de unión a ligando para identificar anticuerpos (en los sobrenadantes de hibridoma) que se unían a receptor de CGRP y bloqueaban la unión a ligando de CGRP. Se prepararon placas de 384 pocillos (Corning Costar, n.° de cat. 3712) con 5.000 células AM-1 huCGRP R Pool2 y 20.000 células CHO-S sin transfectar en cada pocillo. Se añadieron 20 pl de sobrenadante de hibridoma anti-CGRP R a cada pocillo, y se incubaron las placas durante 1 h a temperatura ambiente. Después se añadieron 10 pl de péptido Alexa647-CGRPe-372,8 pg/ml a cada pocillo y se incubaron las placas durante 3 horas adicionales a temperatura ambiente. Se sometió a ensayo la cantidad de Alexa647-CGRPs-37 unido a las células en un sistema de detección celular FMAT 8200 (Applied Biosystems). Los datos emitidos eran tanto un valor de FL1 numérico de intensidad de señal (valores de FL1 superiores indican intensidad de señal superior) como también una imagen de las células.
Los experimentos incluyeron sobrenadantes de hibridoma de control negativo. El valor de FL1 promedio observado en estos experimentos de control negativo se adoptó como la máxima señal posible para el ensayo. Se compararon sobrenadantes experimentales con esta señal máxima y se calculó un porcentaje de inhibición para cada pocillo (inhibición en % = (1 -(FL1 del sobrenadante de hibridoma anti-CGRP R / señal de FL1 máxima)).
En la figura 6 se muestra un resumen de los datos. En este experimento, se sometieron a prueba 1092 sobrenadantes anti-CGRP R usando el ensayo de ligando de receptor. Se ordenaron los datos usando el porcentaje de inhibición promedio. Noventa sobrenadantes tenían una inhibición promedio >25%, 31 de ellos tenían >50% y 7 tenían una inhibición promedio > 70%.
En la tabla 10 a continuación se muestra un conjunto de datos abreviado. Las ID de muestra n.os 1-5 ilustran ejemplos de sobrenadantes de hibridoma anti-CGRP R que inhibían la unión de péptido Alexa647-CGRPe-37 a receptor de CGRP y las ID de muestra n.os 536 - 540 ilustran ejemplos de sobrenadantes de hibridoma anti-CGRP R que no inhibían la unión del péptido Alexa647-CGRPe-37 al receptor de CGRP.
Tabla 10 - Datos a modo de ejemplo de ensayo de competencia de unión a ligando mediante FMAT
Figure imgf000094_0001
Basándose en los ensayos de competencia de unión, se seleccionaron aproximadamente 30 sobrenadantes para su caracterización adicional.
EJEMPLO 4
ACTIVIDAD DE ANTICUERPOS MONOCLONALES BLOQUEANTES ESPECÍFICOS PARA RECEPTOR DE CGRP EN UN ENSAYO FUNCIONAL DE AMPc
A. Actividad de anticuerpos para receptor de CGRP.
Se examinaron anticuerpos contra receptor de CGRP seleccionados en un ensayo de AMPc mediado por receptor de CGRP in vitro para determinar la potencia intrínseca. El ensayo de AMPc in vitro empleó una línea celular derivada de neuroblastoma humano (SK-N-MC; Spengler, et al., (1973) In vitro 8: 410) obtenida de ATCC (número de ATCC HTB-10; “células HTB-10”). Las células HTB-10 expresan CRLR y RAMP1, que forman el receptor de CGRP (L. M. McLatchie et al, 1998). Se generó una línea celular 293EBNA que expresaba CGRP R de macaco cangrejero recombinante tal como se describió en el ejemplo 1, y se obtuvo una línea celular L6 de rata que expresaba receptor de CGRP de rata de ATCC (CRL-1458).
Se usó el kit de ensayo de AMPc LANCE (PerkinElmer, Boston, MA) en el examen. Se realizaron los ensayos en placas de 96 pocillos blancas en un volumen total de 60 pl. En resumen, en el día del ensayo, se descongelaron las células HTB-10 congeladas a 37°C, se lavaron las células una vez con tampón de ensayo y se añadieron 12 pl de suspensión celular que contenía 10000 células mezcladas con anticuerpo anti-AMPc marcado con Alexa en placas blancas de media área de 96 pocillos. Tras añadir 12 pl de anticuerpo contra receptor de CGRP, se incubó la mezcla durante 30 min a temperatura ambiente. Después se añadieron 12 pl de a-CGRP humano agonista de receptor de CGRP (concentración final de 1 nM) y se incubaron adicionalmente durante 15 min a temperatura ambiente. Tras la estimulación con a-CGRP humano, se añadieron 24 pl de mezcla de detección y se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente y se leyeron las placas con un instrumento EnVision (PerkinElmer, Boston, MA) a Em 665 nM. Se procesaron los datos y se analizaron mediante Prizm (GraphPad Software Inc.) o ActivityBase (IDBS).
La figura 7A muestra datos a modo de ejemplo obtenidos tal como se describió anteriormente usando la línea celular HTB-10 que expresaba receptor de hCGRP para tres anticuerpos, 3C8, 13H2 y 1E11. Se representan los datos gráficamente como porcentaje con respecto al control (“POC”) en función de la concentración de anticuerpo (3C8, 13H2 o 1E11), y se ajustan con curvas de regresión no lineal convencionales para proporcionar los valores de CI50 mostrados en la parte inferior de la figura.
B. Falta de actividad de anticuerpo en receptores relacionados.
Se usaron células que expresaban receptores relacionados AM1 (células HEK 293 que expresaban hCRLR+hRAMP2; D. R. Poyner, et al, Pharmacological review, 54:233-246, 2002), AM2 (células CHO que expresaban hCRLR+hRAMP3; D. R. Poyner, et al, Pharmacological review, 54:233-246, 2002) o receptor de amilina humano AMY1 (células MCF-7 hCTR+hRAMP1; Wen-Ji Chen, et al, Molecular Pharmacology, 52: 1164-1175, 1997) para determinar la selectividad de los anticuerpos sometidos a prueba. Se generó la línea celular HEK 293 que expresaba AM1 tal como se describió en el ejemplo 1, anteriormente. Se adquirió la línea celular CHO que expresaba AM2 de EuroScreen (ahora PerkinElmer, Inc.); y se obtuvo la línea celular MCF-7 que expresaba receptor de amilina AMY1 (Zimmermann, et al, Journal of Endocrinology, 423-431, 1997) de ATCC (HTB-22). Se muestran resultados a modo de ejemplo, representados gráficamente tal como se describió anteriormente, en las figuras 7B (células hAM1-HEK), 7C (células hAM2-CHO) y 7D (células hAMY-MCF-7). Obsérvese que ninguno de los anticuerpos sometidos a prueba tenía actividad inhibidora significativa frente a receptores hAM1, hAM2 o hAMY1 a lo largo del intervalo sometido a prueba.
Se realizaron experimentos similares usando células HEK recombinantes que expresaban receptores de CGRP de macaco cangrejero y células L6 de rata que expresaban receptor de CGRP de rata (ATCC). En las columnas “AMPc” en la tabla 11 a continuación se muestran datos de estos estudios, así como datos de CI50 adicionales obtenidos tal como se describió en la parte A de este ejemplo. Obsérvese que los valores de CI50 frente a los receptores de CGRP humano y de macaco cangrejero no están en el intervalo nanomolar, mientras que las actividades frente al receptor de CGRP de rata, y receptores de AM1, AM2 y AMY1 humanos, así como células MCF7 que expresaban calcitonina (datos no mostrados) son todos mayores de 1 micromolar. La diferencia en la CI50 entre receptor de CGRP humano y receptores de AM1, AM2, amilina y calcitonina humanos ilustra la alta selectividad de estos anticuerpos para el receptor de CGRP con respecto a receptores relacionados formados en parte por los mismos componentes de receptor. Las CI50 obtenidas usando receptores de CGRP humano y de macaco cangrejero fueron similares, mientras que los anticuerpos sometidos a prueba no parecieron reaccionar de manera cruzada con receptor de CGRP de rata.
Tabla 11
Figure imgf000095_0001
Figure imgf000096_0001
EJEMPLO 5
ENSAYO DE UNIÓN DE CGRP CON RADIOLIGANDO PARA LA DETERMINACIÓN DE Ki
ANTICUERPOS BLOQUEANTES DE RECEPTOR
Se usaron CGRP marcado con 125I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) y membranas celulares de células HTB-10 (PerkinElmer Inc., Waltham, Massachusetts) para un experimento de unión a radioligando en presencia de diversas concentraciones de los anticuerpos de prueba para determinar los valores de Ki correspondientes. El ensayo de unión a CGRP se configuró a temperatura ambiente en placas de 96 pocillos que contenían: 110 ml de tampón de unión (Tris-HCl 20 mM, pH7,5, MgSO4 5,0 mM, BSA al 0,2% (Sigma), 1 comprimido de CompleteTM/50 ml de tampón (un inhibidor de proteasa)); 20 ml de compuesto de prueba (10X); 20 ml de 125I-haCGRP (Amersham Biosciences; 10X); y 50 ml de suspensión de membrana de células de neuroblastoma humanas (HTB-10) (10 mg por pocillo, PerkinElmer). Se incubaron las placas a temperatura ambiente durante 2 horas con agitación a 60 rpm y después se filtró el contenido de cada pocillo sobre placas de filtro de 96 pocillos GF/C tratadas con polietilenimina (PEI) al 0,5% (durante al menos una hora). Se lavaron las placas de filtro GF/C seis veces con Tris 50 mM enfriado con hielo, pH 7,5, y se secaron en un horno a 55°C durante 1 hora. Después se sellaron los fondos de las placas GF/C. Se añadieron 40 ml de Microscint™ 20 a cada pocillo, se sellaron las partes superiores de las placas GF/C con TopSeal™-A (una película sellante adhesiva a presión) y se realizó el recuento en las placas GF/C con TopCount NXT (Packard). Se analizaron los datos usando Prizm (GraphPad Software Inc.)
En la figura 8 se muestran datos a modo de ejemplo y valores de Ki obtenidos usando los anticuerpos 3C8, 12H2 y 1E11.
La columna más a la derecha en la tabla 11 anterior indica los valores de Ki de los AcM indicados en el ensayo de unión de competencia a 125I-CGRP radiomarcado para membranas de células HTB-10. Los datos demuestran que los anticuerpos contra receptor de CGRP eran altamente competitivos (todos en el intervalo inferior al nanomolar) frente a la unión a CGRP.
EJEMPLO 6
ENSAYO DE UNIÓN A FACS PARA LA DETERMINACIÓN DE KD DE ANTICUERPOS BLOQUEANTES CONTRA RECEPTOR DE CGRP
Se determinaron las afinidades de AcM anti-CGRP R para receptores de CGRP expresados en células usando un método de FACS. En resumen, se sembraron células que expresaban AM-1 CHO huCGRP R, preparadas tal como se describió anteriormente, en placas de 96 pocillos a densidades de 16.000 o 160.000 células por pocillo en medio DMEM que contenía FBS al 10%, NEAA, PS, L Glut, NaPyr y azida de sodio al 0,05%. Se titularon anticuerpos contra receptor de CGRP en el mismo medio a desde 50 nM hasta 1 pM y se incubaron con células. Tras una incubación durante la noche a 4°C en un volumen total de 120 ml, en un agitador de placas, se lavaron las células 2 veces con PBS+FBS al 2%, centrifugando y descartando el sobrenadante cada vez. Después se añadieron 100 ml/pocillo de G anti-Hu Fc Cy5 (5 mg/ml; Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, EE.UU.) que contenían 7AAD (5 ml/pocillo) y se incubó a 4°C durante 40 min. Se lavaron las células 2 veces con PBS+FBS al 2%, centrifugando y descartando el sobrenadante cada vez. Después se añadieron 100 ml de tampón PBS+FBS al 2% y se analizaron mediante FACS para determinar la media geométrica de unión. Se calculó la Kd usando software KinExA tomando la media geométrica negativa a cada concentración de anticuerpo como la cantidad de Ac libre presente, Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013. Se analizaron los datos obtenidos a las dos concentraciones celulares diferentes mediante análisis de n curvas para determinar la Kd y el intervalo de confianza del 95% tal como se describe en Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013.
En la figura 10 se muestran datos a modo de ejemplo con ajustes de curva correspondientes para el anticuerpo 12G8.2. En la tabla 12 se muestran los datos de ocho anticuerpos bloqueantes generados para respaldar la presente divulgación. Uno de los anticuerpos (3B6) se analizó en dos días diferentes. La razón de 0,9 obtenida para el experimento con 16.000 células indica que se predice que la concentración de antígeno es de 0,9 veces la Kd y por tanto la curva obtenida mediante este experimento es una curva controlada por Kd. Puede apreciarse que los valores de Kd obtenidos de esta manera estaban en el intervalo nanomolar inferior de un único dígito para todos los anticuerpos sometidos a prueba.
Tabla 12
Figure imgf000097_0001
EJEMPLO 7
UNIÓN DE ANTICUERPOS BLOQUEANTES CONTRA RECEPTOR DE CGRP MEDIANTE COMPETENCIA DE UNIÓN CON BIACORE
Se llevaron a cabo análisis de Biacore (Karlsson, R. et al., Methods; A Companion to Methods in Enzymology, 6: 99­ 110 (1994)) de la siguiente manera. Se realizó la inmovilización de anticuerpos anti-receptor de CGRP en la superficie de chip sensor CM5 según las instrucciones del fabricante, usando un flujo continuo de HEPES 10 mM, NaCl 0,15 M, EDTA 3,4 mM, P-20 al 0,005%, pH 7,4 (tampón HBS-EP). Se activaron los grupos carboxilo en las superficies de chip sensor inyectando 60 pl de una mezcla que contenía N-etil-N’-(dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) 0,2 M y N-hidroxisuccinimida (NHS) 0,05 M. Se obtuvieron superficies específicas inyectando 180 pl de anticuerpo anti-receptor de CGRP diluido en acetato 10 mM, pH 4,0 a una concentración de 30 pg/ml. Se desactivaron los grupos reactivos en exceso en las superficies inyectando 60 pl de etanolamina 1 M. Los niveles inmovilizados finales para los anticuerpos individuales fueron los siguientes:
Anticuerpo Unidades de resonancia (UR)
11D11 ~5.900
3B6 ~7.200
4H6 ~8.000
12G8 ~7.800
9F5 ~6.600
34E3 ~3.700
También se preparó una superficie de referencia sometida a acoplamiento simulado, de blanco, en el chip sensor. Se capturó receptor de huCGRP soluble a una concentración de 100 nM en chips sensores que tenían uno de los seis anticuerpos inmovilizados mencionados anteriormente (11D11, 3B6, 4H6, 12G8, 9F5 o 34E3). Después se inyectó cada uno de los 20 anticuerpos anti-CGRP R de prueba sobre el receptor de huCGRP capturado. Si el anticuerpo inyectado reconocía un epítopo distinto con respecto al reconocido por el anticuerpo inmovilizado, se observaría un segundo acontecimiento de unión. Si los anticuerpos reconocían epítopos iguales o muy similares, solo se observaría la unión del receptor de huCGRP.
En la figura 9A se muestran datos a modo de ejemplo obtenidos usando un chip sensor recubierto con anticuerpo 3B6 inmovilizado. Los cuatro perfiles son datos obtenidos usando los anticuerpos 1E11, 4E4, 2E7 y 12G8 en la disolución inyectada. Los acontecimientos durante el experimento se representan mediante letras, correspondiendo “A” a la inyección de huCGRP R-Fc, correspondiendo “B” al final de la inyección de huCGRP R-Fc, correspondiendo “C” a la inyección de segundo AcM y correspondiendo “D” al final de la inyección del segundo AcM y comienzo del lavado con tampón. Obsérvese que no hay ninguna indicación de ninguna señal de unión de ninguno de los anticuerpos inyectados sobre la superficie con anticuerpo inmovilizado, lo que indica que los cuatro anticuerpos inyectados reconocen aparentemente epítopo(s) igual(es) o muy similar(es) al del anticuerpo inmovilizado. Se observaron esencialmente los mismos resultados con todos los anticuerpos bloqueantes sometidos a prueba lavados sobre cada una de las cinco superficies con anticuerpo neutralizante inmovilizado, lo que indica que todos los anticuerpos bloqueantes anti-receptor de huCGRP sometidos a prueba reconocen epítopo(s) igual(es) o muy similar(es) y fuertemente solapante(s).
En cambio, tal como se muestra en parte en las figuras 9B, 9C y 9D, ninguno de los cuatro anticuerpos específicos de receptor de CGRP no bloqueantes sometidos a prueba 32H8, 33B5, 33E4 y 34E3 logró competir con 11D11 (datos no mostrados), 3B6 (figura 9B), 12G8 (figura 9C) y 9F5 (datos no mostrados) aunque 34E3 pudo competir con 4H6 (figura 9D) y débilmente con 32H7 (datos no mostrados). 32H8 no pudo competir con 3B6, 4H6, 12G8, 9F5 o el anticuerpo no bloqueante 34E3, pero 33B5 y 33E4 pudieron competir con el anticuerpo no bloqueante 34E3. Los datos para todos los anticuerpos no bloqueantes y bloqueantes se resumen en la tabla 13, a continuación. “NB” indica ausencia de unión; “+” indica unión significativa; y “Débil” indica unión débil.
Tabla 13
Figure imgf000098_0001
Figure imgf000099_0001
Tal como puede apreciarse a partir de los datos, todos los anticuerpos bloqueantes o neutralizantes sometidos a prueba se unen a la misma región que los cinco anticuerpos bloqueantes inmovilizados; es decir, todos los anticuerpos neutralizantes sometidos a prueba se unen a la misma región de la molécula de CGRP R. Por otro lado, los anticuerpos no bloqueantes no compitieron generalmente con los anticuerpos bloqueantes inmovilizados, lo que indica que los anticuerpos no bloqueantes se unen principalmente a una región diferente de CGRP R.
EJEMPLO 8
UNIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA RECEPTOR DE CGRP A RECEPTOR DE CGRP SOLUBLE EN INMUNOTRANSFERENCIA DE TIPO WESTERN
Se sometieron a prueba tres anticuerpos bloqueantes contra receptor de CGRP representativos usando inmunotransferencias de tipo Western para determinar la unión a una proteína de fusión de receptor de CGRP soluble-muFc.
Se diluyeron 100 ng de CGRP R-muFc purificado (producido y purificado tal como se describió anteriormente para CGRP R-huFc excepto porque se usó Fc de ratón y se cambió el ligador entre ECD de CRLR o RAMP1 y muFc por “GGGGGVDGGGg Gv ” (SEQ ID NO: 213)) en pBs con tampón de muestra de PAGE con (reducida) o sin (no reducida) beta-mercaptoetanol (PME) a una concentración del 13,3%. Después se sometió a ebullición la muestra que contenía pME durante 4 min. Se cargaron las muestras reducida y no reducida en geles de Tris al 4-20%-glicina separados (Invitrogen) con carriles alternantes de proteína CGRP R-Fc y marcadores de peso molecular (Invitrogen). Se sometieron los geles a electrotransferencia sobre filtros de nitrocelulosa de 0,2 pm (Invitrogen). Se lavaron las transferencias con solución salina tamponada con Tris Tween 20 al 1% (TBST) y después se bloquearon con TBST leche desnatada en polvo al 5% durante 30 min. Se cortaron las transferencias en tiras a lo largo de los carriles de marcador de peso molecular. Se incubó una tira con cada uno de CGRP R-muFc reducido y no reducido con anticuerpos contra huCGRP R purificados 4E4, 9F5 o 3B6 (dilución 1:500 en TBST leche al 5%), anticuerpo de cabra anti-huRAMP1 N-20 (1:500; Santa Cruz Biotechnology, Inc), anticuerpo de conejo anti-IgG de ratón-Fc-HRP (1:10.000) (Pierce), o anticuerpo de cabra anti-IgG humana-Fc-HRP (1:10.000) (Pierce). Se incubaron las transferencias con los anticuerpos durante una hora seguido por 3 lavados de 10 min con TBST leche al 1%. Después, las transferencias tratadas con los anticuerpos contra huCGRP R se incubaron con anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón-Fc-HRP (1:10.000 en TBST leche al 1%) y las transferencias tratadas con anticuerpo antihuRAMP1 (N-20, anticuerpo policlonal de cabra anti-RAMP1, Santa Cruz Biotech, CA) se incubaron con anticuerpo de conejo anti-IgG de cabra-Fc-HRP (1:10.000) durante 20min. Se lavaron las transferencias 3x15 min con TBST. Se trataron las transferencias de huCGRP R y anticuerpo anti-huRAMP1 con reactivo de detección Supersignal West Pico de Pierce, y se trataron las transferencias de anticuerpo anti-ratón y anticuerpo anti-IgG humana-Fc-HRP con reactivo de detección convencional de Pierce (1 min). Después se expusieron las transferencias a película de rayos X Biomax MS de Kodak.
Los tres anticuerpos contra receptor de CGRP, 4E4, 9F5 y 3B6, pudieron detectar CGRP R soluble-muFc (que contenía ECD de RAMP1 y ECD de CRLR) en condiciones no reductoras pero no en condiciones reductoras, lo que indica que el epítopo de unión de estos anticuerpos contra CGRP R era conformacional y sensible a los enlaces disulfuro (3 pares en ECD de RAMP1 y 3 pares en ECD N-ter de CRLR). En cambio, el anticuerpo anti-RAMP1 comercial N-20 (Santa Cruz Biotech) se unió a RAMP1 en condiciones tanto reductoras como no reductoras, lo que indica que el sitio de unión para el anticuerpo N-20 era principalmente lineal y no sensible a enlaces disulfuro.
EJEMPLO 9
UNIÓN DE ANTICUERPOS BLOQUEANTES CONTRA RECEPTOR DE CGRP A RECEPTORES QUIMÉRICOS
Se usaron receptores de CGRP formados o bien por RAMP1 nativa con CRLR quimérico, o bien por CRLR nativo con RAMP1 quimérica, para identificar secuencias de receptor de CGRP implicadas en la unión a anticuerpo. Dado que ninguno de los anticuerpos bloqueantes contra receptor de CGRP humano logró mostrar actividad funcional frente al receptor de CGRP de rata, los componentes quiméricos contenían regiones de secuencia de rata en un contexto de secuencia humana. Se generaron las siguientes quimeras para análisis de unión mediante FACS:
Quimera n.° 1 de RAMP1 (de Q28 a A34); SEQ ID NO: 217
Se sustituyeron los residuos de aminoácido de Q28 a A34 en la RAMP1 humana por las secuencias correspondientes de RAMP1 de rata. Este tramo incluyó cinco residuos de aminoácido que son diferentes entre RAMP1 humana y de rata.
Quimera n.° 2 de RAMP1 (de Q43 a E53); SEQ ID NO: 218
Se sustituyeron los residuos de aminoácido de Q43 a E53 en la RAMP1 humana por las secuencias correspondientes de RAMP1 de rata. Este tramo incluyó seis residuos de aminoácido que son diferentes entre RAMP1 humana y de rata.
Quimera n.° 3 de RAMP1 (de R67 a E78); SEQ ID NO: 219
Se sustituyeron los residuos de aminoácido de R67 a E78 en la RAMP1 humana por las secuencias correspondientes de RAMP1 de rata. Este tramo incluyó siete residuos de aminoácido que son diferentes entre RAMP1 humana y de rata.
Quimera n.° 1 de CRLR (de L24 a Q33); SEQ ID NO: 223
Se sustituyeron los residuos de aminoácido de L24 a Q33 en el CRLR humano por las secuencias correspondientes de CRLR de rata. Este tramo incluyó ocho residuos de aminoácido que son diferentes entre CRLR humano y de rata.
La figura 11 muestra una alineación de secuencias de aminoácidos de RAMP1 de macaco cangrejero (SEQ ID NO: 215), ser humano (SEQ ID NO: 4), rata (SEQ ID NO: 214) y macaco rhesus (SEQ ID NO: 216), junto con secuencias de quimera n.21 (SEQ ID NO: 217), quimera n.22 (SEQ ID NO: 218) y quimera n.23 (SEQ ID NO: 219) de RAMP1. Las figuras 12A y 12B muestran una alineación de secuencias de aminoácidos de CRLR de ser humano (SEQ ID NO: 2), macaco cangrejero (SEQ ID NO: 221), macaco rhesus (SEQ ID NO: 222), rata (SEQ ID NO: 220) y, así como la secuencia de aminoácidos de la quimera n.° 1 de CRLR (SEQ ID NO: 223).
Se transfectaron células 293-6E de manera transitoria con constructos de ADN de quimera de CGRP R (CRLR wt RAMP1 Q28-A34; CRLR wt RAMP1 Q43-E53; CRLR wt RAMP1 R67-E78; CRLR L24-Q33 RAMP wt; CRLR wt RAMP1 wt; control de vector pTT5). Se recogieron las células tras 72 h, se lavaron con PBS BSA al 0,5% y se contaron. Se resuspendió cada línea celular transfectada a una dilución de 5 x 105 células por 100 pl de PBS/BSA. Se transfirieron alícuotas de 100 pl de suspensión celular por pocillo a una placa de fondo redondo de 96 pocillos (Falcon). Se sedimentaron las células a 1200 rpm durante 5 min. Se retiró el sobrenadante y se sustituyó por 100 pl que contenían 0,5 pg de anticuerpos contra huCGRP R purificados 1H7, 2E7, 3B6, 9F5, 4H6, 12G8, 3C8, 10E4, 11D11, 32H8 o 33B5. Se trataron pocillos de control con anticuerpo anti-DNP huIgG2 (0,5 pg), Alexa647-péptido CGRP (0,5 pg) o PBS/BSA solo. Se incubaron las células sobre hielo durante 1 h y después se lavaron dos veces con PBS/BSA. Se resuspendieron las células en 100pl/pocillo de PBS/BSA que contenía anticuerpo anti-hug-Fc-FITC (0,5 pg) (excepto por las células tratadas con Alexa647-CGRP). Se incubaron las células sobre hielo en la oscuridad durante 1 h y después se lavaron dos veces con PBS/BSA. Se resuspendieron las células en 200 pl de PBS/BSA y se analizaron usando un instrumento FACS Calibur.
Se sometieron a prueba diez anticuerpos bloqueantes representativos (3B6, 9F5, 4H6, 12G8, 3C8, 10E4, 32H7, 4E4, 11D11 y 1H7) y dos anticuerpos no bloqueantes (32H8 y 33B5). En las figuras 13A, 13B y 13C se muestran datos representativos (anticuerpo 9F5). La figura 13A muestra la unión al receptor de CGRP silvestre; la figura 13B muestra la unión a receptores de CGRP que contienen la quimera CRLR L24-Q33, y la figura 13C muestra la unión a receptores de CGRP que contienen la quimera Q28-A34 de RAMP1. El análisis mediante FACS mostró que los 12 anticuerpos se unen a control de receptor de CGRP humano silvestre tal como se esperaba. Los 12 anticuerpos mostraron una unión significativamente reducida a cualquiera de las tres quimeras de RAMP1 (Q28-A34), (Q43-E53) y (R67-E78). Esto podía resultar de que (1) el nivel de expresión del receptor de quimera era mucho menor, (2) la quimera de RAMP1 afectaba al plegamiento con CRLR humano y alteraba la conformación del complejo de receptor, y/o (3) estas tres regiones seleccionadas en RAMP1 están directamente implicadas en la unión de estos anticuerpos a receptor de CGRP.
Cuando se regularon los perfiles de FACS para incluir únicamente las poblaciones celulares “con expresiones” muy pequeñas, los anticuerpos no bloqueantes 33B5 y 32H8 parecieron unirse sistemáticamente peor (medias geométricas inferiores) a la quimera Q43-E53 de RAMP1 en comparación con los anticuerpos bloqueantes, lo que sugiere que la unión a la región Q43-E53 de RAMP1 puede ser más importante para los anticuerpos no bloqueantes. Por otro lado, 33B5 y 32H8 se unieron sistemáticamente mejor a la quimera R67-E78 de RAMP1 que los anticuerpos bloqueantes, lo que sugiere que la secuencia R67-E78 de RAMP1 puede ser más importante para los anticuerpos bloqueantes.
Todos los anticuerpos contra receptor de CGRP sometidos a prueba se unieron razonablemente bien a la quimera de CRLR (L24-Q33), lo que sugiere que este sitio no es esencial para la unión de anticuerpos bloqueantes.
En resumen, los datos muestran que las tres regiones discontinuas en RAMP1 ((Q28-A34), (Q43-E53) y (R67-E78)) podían estar implicadas en la unión a anticuerpo contra receptor de CGRP, siendo (R67-E78) más importante para los anticuerpos bloqueantes. Las secuencias N-terminales (L24-Q33) de CRLR no parecieron estar implicadas de manera crítica en la unión para los anticuerpos contra receptor de CGRP según se analiza mediante este método. Este enfoque no descarta sitios de unión adicionales que comparten secuencias idénticas o similares entre receptores de CGRP humano y de rata que no se seleccionaron como diana en el análisis.
EJEMPLO 10
IDENTIFICACIÓN DE EPÍTOPOS DE CGRP R HUMANO PARA ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES ANTI-CGRP R MEDIANTE ENSAYO DE PROTECCION DE PROTEASA
La parte de CRLR en la forma madura de la molécula de fusión CRLR-Fc (con el péptido señal retirado; dada a conocer en el presente documento como SEQ ID NO: 10) contiene 116 aminoácidos (que preceden al ligador de glicina) y tiene tres estructuras de bucle grande creadas mediante la formación de tres enlaces disulfuro. Los tres enlaces disulfuro en CRLR son Cys1 en la posición de secuencia 26 (todas las posiciones de secuencia de CRLR indicadas en este párrafo son con respecto a la secuencia madura presentada como SEQ ID NO: 10) unida a Cys3 en la posición de secuencia 52 (denominado CRLR C1-C3), Cys2 en la posición de secuencia 43 unida a Cys5 en la posición de secuencia 83 (denominado CRLR C2-C5), Cys4 en la posición de secuencia 66 unida a Cys6 en la posición de secuencia 105 (denominado CRLR C4-C6). La parte de RAMP1 en la forma madura de la molécula de fusión RAMP1-Fc contiene 91 aminoácidos (SEQ ID NO: 11) que preceden al ligador de glicina, que también forma tres enlaces disulfuro intramoleculares. Los tres enlaces disulfuro en RAMP1 son Cys1 en la posición de secuencia 1 (todas las posiciones de secuencia de RAMP1 indicadas en este párrafo son con respecto a la secuencia madura presentada como SEQ ID NO: 11) unida a Cys5 en la posición de secuencia 56 (denominado RAMP1 C1-C5), Cys2 en la posición de secuencia 14 unida a Cys4 en la posición de secuencia 46 (denominado RAMP1 C2-C4), Cys3 en la posición de secuencia 31 unida a Cys6 en la posición de secuencia 78 (denominado RAMP1 C3-C6).
Se identificaron las regiones de la proteína de receptor de CGRP humano a las que se unen anticuerpos monoclonales neutralizantes anti-CGRP mediante fragmentación de h CGRP R para dar péptidos con proteasas específicas, y determinando la secuencia de los péptidos de h CGRP R resultantes (es decir, tanto fragmentos peptídicos que contenían enlaces disulfuro como que no contenían enlaces disulfuro para las partes de CRLR y RAMP1). Después se realizó un ensayo de protección de proteasa para determinar la digestión proteolítica de hCGRP R en presencia de anticuerpos monoclonales de unión. El principio general de este ensayo es que la unión de un AcM a CGRP R puede dar como resultado la protección de determinados sitios de escisión de proteasa específicos y esta información puede usarse para determinar la región o parte de CGRP R a la que se une el AcM. En resumen, se sometieron los digestos peptídicos a mapeo de péptidos mediante HPLC; se recogieron los picos individuales y se identificaron y mapearon los péptidos mediante análisis de CL-EM con ionización por electropulverización en línea (ESI-CL-EM) y/o mediante secuenciación N-terminal. Todos los análisis de HPLC para estos estudios se realizaron usando una columna C18 de fase inversa de diámetro interior estrecho (2,1 mm de d.i. x 15 cm de longitud; Zorbax 300SB, 5 pm, Agilent Technologies) para análisis fuera de línea y usando una columna C18 de fase inversa capilar (0,5 mm de d.i. x 25 cm, Vydac C18 MS, 5 pm; The Separation Group) para CL-EM. Se realizó el mapeo de péptidos mediante HPLC con un gradiente lineal de desde ácido trifluoroacético al 0,05% (fase móvil A) hasta el 90% de acetonitrilo en ácido trifluoroacético al 0,05%. Se desarrollaron las columnas a lo largo de 90 minutos a una velocidad de flujo de 0,25 ml/min para HPLC de diámetro interior estrecho para análisis de CL-EM fuera de línea y en línea, y de 0,018 ml/min para HPLC capilar para análisis de CL-EM en línea.
Se digirió la forma madura de CGRP R humano con AspN (que escinde después de ácido aspártico y algunos residuos de ácido glutámico en el extremo amino) incubando aproximadamente 100 pg de CGRP R a 1,0 mg/ml en fosfato de sodio 0,1 M (pH 6,5) durante 20 h a 37°C con 2 pg de AspN.
La cromatografía HPLC de los digestos de AspN generó un perfil de péptidos tal como se muestra la figura 14 (cada muestra de 30 mg inyectada), cromatograma marcado como A para CGRP R solo (concentración de 1 mg/ml), mientras que una digestión de control con una cantidad similar de anticuerpo neutralizante contra CGRP R, clon 12G8, muestra que el anticuerpo es esencialmente resistente a la endoproteinasa AspN (cromatograma marcado como B; razón de CGRP R:anticuerpo de 100:2; 100:7; 100:20, peso en peso, respectivamente). Se llevaron a cabo análisis de secuencia mediante CL-EM/EM en línea y mediante secuenciación de Edman con los picos de péptidos recuperados de HPLC. Se realizaron análisis de ESI CL-EM en línea de los digestos peptídicos para determinar la masa y secuencia precisas de los péptidos que se separaron mediante HPLC. De ese modo se determinaron las identidades de varios péptidos presentes en los picos de péptidos a partir de la digestión con AspN (indicados como picos numerados en la figura 14). La tabla 14 a continuación muestra las ubicaciones de estas secuencias peptídicas en el componente correspondiente (CRLR o RAMP1) de hCGRP R. Una letra mayúscula C seguida por un número o X representa un péptido identificado como péptido de CRLR; una letra mayúscula R seguida por un número o X es un péptido de RAMP1 y “Fc” representa el fragmento Fc grande, sin digerir, liberado de las moléculas de fusión CRLR-Fc y RAMP1-Fc.
Tabla 14
Péptidos de CRLR y RAMP1 identificados mediante mapeo de péptidos de digestión con AspN de CGRP R
Figure imgf000102_0001
La figura 15 muestra una comparación de un experimento de digestión con AspN (cada muestra de 30 mg inyectada) con CGRP R solo (cromatograma marcado como A) con uno realizado en presencia de anticuerpo neutralizante 12G8 (cromatograma marcado como B). La razón en peso de CGRP R:anticuerpo fue de 1: 1. Varios picos (C5, C6 y C7) muestran una reducción de la altura de pico en el cromatograma B con respecto al cromatograma A, mientras que otros dos picos (C-X y R-X) muestran un aumento de la altura de pico en el cromatograma B con respecto al cromatograma A. También se observó un mapa peptídico similar si estaba presente un anticuerpo neutralizante anti-CGRP R diferente (10E4, 3B6, 3C8 o 4E4) en una cantidad similar en la muestra de digestión tal como se observa en el cromatograma marcado como C. Tanto C6 como C7 son péptidos con enlaces disulfuro que cubren una parte principal de la molécula de CRLR mientras que C5 es un péptido de CRLR sin enlaces disulfuro que reside en el extremo N-terminal de la molécula y es penúltimo con respecto al péptido con enlaces disulfuro C7. El pico C-X contiene tres enlaces disulfuro de CRLR con múltiples secuencias, lo que indica que al menos de dos a tres péptidos están unidos entre sí mediante enlaces disulfuro. El hecho de que el pico C-X tenga una altura de pico aumentada en un digesto de CGRP R en presencia de anticuerpo neutralizante contra CGRP indica que el anticuerpo ha protegido a CGRP R frente a la digestión por AspN en varios sitios de escisión relacionados con Glu25 y Asp55. El anticuerpo no parece tener un efecto de protección significativo sobre Asp33 y Asp72 ya que la intensidad de pico para los péptidos C2 y C4 no disminuyó en absoluto. Por tanto, el anticuerpo parece unirse a una región de CRLR que incluye la región con enlaces disulfuro CRLR C1-C3 y CRLR C4-C6 junto con la región de bucle entre Cys53 y Cys66.
El mapeo mediante AspN de hCGRP R también identificó un péptido con enlaces disulfuro de RAMP1 (R2) y un péptido sin enlaces disulfuro de RAMP1 (R1) (véase la tabla 14 y la figura 14). En presencia de cualquiera de los anticuerpos neutralizantes mencionados anteriormente (12G8, 10E4, 4E4, 3B6 o 3C8), se recuperó péptido R-X con una intensidad de pico significativamente mayor de lo que se obtuvo de la digestión sin anticuerpo en la muestra. Los análisis de masa y secuencia mostraron que R-x contiene una única cadena de polipéptido correspondiente a la secuencia de RAMP1 entre Cys1 y Arg86. Estos experimentos indican que un anticuerpo neutralizante contra CGRP R puede proteger una región significativa de RAMP1 frente a digestión proteolítica con AspN.
Para evaluar si el efecto protector frente a proteólisis con AspN de CGRP R es específico para anticuerpos neutralizantes (bloqueantes) contra CGRP R (en comparación con anticuerpos no neutralizantes anti-CGRP R), se realizó una digestión con AspN de CGRP R en presencia de un anticuerpo monoclonal de control no relacionado que no neutraliza la actividad de CGRP R. Los resultados se muestran en la figura 15, en el cromatograma D. El anticuerpo no neutralizante no muestra ningún efecto de bloqueo significativo sobre la proteólisis con AspN de CGRP R; de hecho, el perfil de mapa peptídico (cromatograma D) casi no puede distinguirse en los aspectos relevantes del perfil derivado de la digestión de CGRP R solo (cromatograma A).
El efecto de protección frente a proteólisis fue dependiente de la concentración añadida a la muestra de digestión. Tal como se observa en la figura 16, se llevó a cabo una cantidad de CGRP R fijada en la muestra (100 mg) con cantidades variables de anticuerpo neutralizante anti-CGRP R 4E4 (razón de CGRP R:anticuerpo en microgramos, 100:2; 100:7; 100:20, peso en peso, respectivamente) para la proteólisis con Aspen. Puede observarse el perfil de protección y la protección depende de la concentración de anticuerpo.
Tomados en conjunto, estos datos demuestran que anticuerpos bloqueantes o neutralizantes anti-CGRP R dados a conocer en el presente documento pueden bloquear CGRP R (en componentes tanto CRLR como RAMP1) frente a la proteólisis con AspN, lo que sugiere que los anticuerpos bloqueantes se unen tanto a CRLR como a RAMP1 cuando se unen estos anticuerpos al receptor de CGRP. Además, el efecto de protección depende de la concentración de anticuerpo. Estos resultados también indican que anticuerpos neutralizantes contra CGRP R se unen a regiones comunes en CGRP R humano que están cerca de los sitios de escisión de Asp N.
EJEMPLO 11
ANTICUERPOS ANTI-RAMP1 Y ANTI-CRLR DISPONIBLES COMERCIALMENTE EN UN ENSAYO FUNCIONAL DE AMPc
Se examinaron anticuerpos disponibles comercialmente dirigidos contra uno u otro de los componentes (RAMP1 o CRLR) del receptor de CGRP humano en el ensayo de AMPc mediado por receptor de CGRP usando células HTB-10 tal como se describió en el ejemplo 4, anteriormente, para determinar si los anticuerpos tenían actividad biológica. Los datos se presentan en la tabla 15 a continuación. Los anticuerpos tenían actividad biológica no detectable (“ND”), muy débil (“VW”) o débil (“W”) a lo largo de un intervalo de concentración en el que los anticuerpos a modo de ejemplo dados a conocer en el presente documento tenían fuerte actividad biológica.
Tabla 15: Actividad de anticuerpos disponibles comercialmente
Figure imgf000103_0001
Figure imgf000104_0001
EJEMPLO 12
Tinción inmunohistoquímica de células que expresan diferentes componentes de receptor
Se inyectaron 2-4 x 106 células por Collaplug (Integra LifeSciences Co., Plainsboro, NJ). Se incorporaron los dispositivos Collaplug en medio OCT (Sakura Finetek Inc., Torrance, CA), se congelaron a -20°C y se cortaron en secciones de 20 pm usando un criostato. Se fijaron las secciones con paraformaldehído al 4% durante 1 hora a temperatura ambiente (TA) y posteriormente se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se bloqueó la peroxidasa endógena con H2O2 al 3%/PBS durante 15 min y se incubaron las secciones en disolución de bloqueo (PBS con suero de cabra normal al 3% (Vector Labs, Burlingame, CA) y Triton X-100 al 0,3%) durante 1 hora. Posteriormente, se incubaron las secciones en anticuerpo primario humano anti-receptor de CGRP (32H7, 0,03 -0,1 pg/ml) a 4°C durante la noche, se lavaron en PBS y se incubaron en anticuerpo secundario (anticuerpo de cabra biotinilado anti-fragmento Fc de IgG humana, 1:800, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) en suero de cabra normal al 1%/PBS durante 1 hora a TA. Se amplificó la inmunorreactividad usando el kit Vector Elite según las instrucciones del fabricante (Vector Labs, Burlingame, CA) y se reveló la tinción usando 3,3’-diaminobencidina-níquel como cromógeno (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Se aclararon las secciones con xileno y se cubrieron con Permount (Fisher Chemicals, Fair Lawn, NJ). Se analizó la inmunorreactividad usando un microscopio Nikon E-800 y software asociado (Nikon, Melville, NY).
Datos de células que expresaban diferentes componentes de receptor (tal como se identifican a continuación) usando anticuerpo 32H7 tal como se describió anteriormente revelaron tinción pronunciada de células CHO que expresaban receptor de CGRP humano recombinante (CRLR+RAMP1; “células CHO/CGRP R”) y tinción más débil de células SK-N-MC que expresan de manera endógena receptores de CGRP (debido a una densidad de receptor mucho menor). No se observó ninguna tinción en la línea celular CHO original, células CHO que expresaban una proteína recombinante no relacionada (TRPM8), células CHO/CGRP R tras absorción previa con el antígeno de 32H7 correspondiente, células CHO que expresaban receptor de adrenomedulina humano 2 recombinante (CRLR+RAMP3), células MCF-7 que expresaban de manera endógena receptores de amilina, células HEK que expresaban receptor de adrenomedulina humano 1 recombinante (CRLR+RAMP2), o las células HEK parentales. Los datos de estos experimentos se resumen en la tabla 16 a continuación.
Tabla 16: Intensidad de tinción inmunohistoquímica de células indicadas
Figure imgf000104_0002

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al receptor de CGRP humano, comprendiendo dicho receptor de CGRP humano un polipéptido CRLR humano y un polipéptido RAMP1 humano, en el que el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un epítopo formado de residuos de aminoácido de ambos polipéptidos CRLR y RAMP1, y
en el que el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo compite por la unión al receptor de CGRP humano con un anticuerpo de referencia, comprendiendo dicho anticuerpo de referencia (i) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 161, 163, 164, 166 y 168; y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en s EQ ID NO: 140, 143, 146, 148 y 150.
2. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente al receptor de CGRP humano con una Kd < 100 nM tal como se determina usando un ensayo de unión mediante FACS.
3. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo de referencia comprende una cadena pesada y una cadena ligera definidas mediante uno de los siguientes pares de secuencias:
SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 15:
SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 18;
SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 21;
SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 23; y
SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 25.
4. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe selectivamente el receptor de CGRP humano en comparación con los receptores de AM1, AM2 y AMY1 humanos con una razón de selectividad de 100 o más tal como se determina mediante un ensayo de inhibición de AMPc.
5. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo completamente humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico o un fragmento de unión a antígeno de los mismos.
6. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo de tipo IgG 1, IgG2, IgG3 o IgG4.
7. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe la unión de CGRP al receptor de CGRP humano.
8. Un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 7 para su uso en la inhibición de la vasodilatación en un paciente que lo necesite.
9. Un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 7 para su uso en el tratamiento de un estado asociado con el receptor de CGRP, en el que el estado es cefalea.
10. Un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 7 para su uso en el tratamiento de un estado asociado con el receptor de CGRP, en el que el estado es migraña.
11. Un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 7 para su uso en el tratamiento de un estado asociado con el receptor de CGRP, en el que el estado es cefalea en racimos.
ES16199717T 2008-12-23 2009-12-18 Anticuerpos de unión al receptor de CGRP humano Active ES2746571T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US20356908P 2008-12-23 2008-12-23
US26462209P 2009-11-25 2009-11-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2746571T3 true ES2746571T3 (es) 2020-03-06

Family

ID=41718325

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16199717T Active ES2746571T3 (es) 2008-12-23 2009-12-18 Anticuerpos de unión al receptor de CGRP humano
ES09775072.3T Active ES2643835T3 (es) 2008-12-23 2009-12-18 Anticuerpos de unión a receptor de CGRP humano

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES09775072.3T Active ES2643835T3 (es) 2008-12-23 2009-12-18 Anticuerpos de unión a receptor de CGRP humano

Country Status (40)

Country Link
US (6) US9102731B2 (es)
EP (3) EP3184546B8 (es)
JP (6) JP5761805B2 (es)
KR (4) KR101853393B1 (es)
CN (2) CN106084045B (es)
AR (1) AR074857A1 (es)
AU (2) AU2009330175C1 (es)
BR (2) BRPI0922505B1 (es)
CA (1) CA2746858C (es)
CL (1) CL2011001578A1 (es)
CO (1) CO6400232A2 (es)
CR (1) CR20110400A (es)
CY (3) CY1119465T1 (es)
DK (2) DK2379594T3 (es)
EA (2) EA031320B1 (es)
ES (2) ES2746571T3 (es)
HR (2) HRP20171690T1 (es)
HU (3) HUE045966T2 (es)
IL (2) IL213429A (es)
JO (2) JO3382B1 (es)
LT (3) LT2379594T (es)
LU (1) LUC00095I2 (es)
MA (1) MA32982B1 (es)
ME (1) ME03601B (es)
MX (1) MX2011006804A (es)
MY (1) MY180564A (es)
NL (1) NL300961I2 (es)
NO (2) NO2379594T3 (es)
NZ (2) NZ623541A (es)
PE (1) PE20120427A1 (es)
PL (2) PL3184546T3 (es)
PT (2) PT3184546T (es)
RS (2) RS56567B1 (es)
SG (2) SG172307A1 (es)
SI (2) SI2379594T1 (es)
TN (1) TN2011000283A1 (es)
TW (4) TWI574697B (es)
UA (1) UA108066C2 (es)
WO (1) WO2010075238A1 (es)
ZA (1) ZA201105418B (es)

Families Citing this family (110)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0618705B8 (pt) 2005-11-14 2021-05-25 Labrys Biologics Inc anticorpos antagonistas humanizados direcionados contra peptídeo relacionado ao gene da calcitonina, composição farmacêutica e uso dos mesmos
WO2009070243A2 (en) * 2007-11-21 2009-06-04 Amgen Inc. Wise binding agents and epitopes
EP2265287B1 (en) 2008-03-04 2018-09-05 Teva Pharmaceuticals International GmbH Methods of treating chronic pain
JO3382B1 (ar) * 2008-12-23 2019-03-13 Amgen Inc أجسام مضادة ترتبط مع مستقبل cgrp بشري
EP2470207A1 (en) 2009-08-28 2012-07-04 Rinat Neuroscience Corporation Methods for treating visceral pain by administering antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide
EA033109B1 (ru) 2011-05-20 2019-08-30 Олдербайо Холдингз Ллк Способы ингибирования, профилактики или лечения диареи и/или поддержания соответствующих уровней электролитов и жидкости в толстой кишке субъекта, подвергающегося связанному с диареей состоянию, с помощью антитела против cgrp или фрагмента антитела против cgrp
EA201891284A1 (ru) 2011-05-20 2018-11-30 Олдербайо Холдингз Ллк Композиции антител против cgrp и их применение
CN108014334B (zh) 2011-05-20 2021-11-30 H.伦德贝克公司 抗cgrp抗体和抗体片段用于在有需要的受试者中预防或抑制畏光或厌光的用途
AU2014236867A1 (en) * 2013-03-15 2015-09-24 Amgen Inc. Methods and compositions relating to anti-CCR7 antigen binding proteins
AU2014228924B2 (en) 2013-03-15 2019-04-18 Amgen Inc. Human PAC1 antibodies
KR102291045B1 (ko) 2013-08-05 2021-08-19 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 드 노보 합성된 유전자 라이브러리
SG11201602876WA (en) 2013-10-24 2016-05-30 Amgen Inc Injector and method of assembly
EP3060281B1 (en) 2013-10-24 2019-01-30 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
US10556945B2 (en) 2014-03-21 2020-02-11 Teva Pharmaceuticals International Gmbh Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same
JP6568099B2 (ja) 2014-03-21 2019-08-28 テバ・ファーマシューティカルズ・インターナショナル・ゲーエムベーハーＴｅｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＧｍｂＨ カルシトニン遺伝子関連ペプチドに対するアンタゴニスト抗体及びその使用方法
US10722655B2 (en) 2014-05-07 2020-07-28 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
CN106470716B (zh) 2014-06-03 2020-07-17 安姆根有限公司 可控制药物递送系统和使用方法
MX2017003247A (es) 2014-09-15 2017-11-30 Amgen Inc Proteina de union a antigenos, bi-especificos del receptor anti-cgrp/receptor pac1 y usos de las mismas.
CA2957960C (en) 2014-10-14 2023-08-22 Amgen, Inc. Drug injection device with visual and audible indicators
EP3233159B1 (en) 2014-12-19 2020-03-04 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
ES2898469T3 (es) 2014-12-19 2022-03-07 Amgen Inc Dispositivo de administración de medicamentos con sensor de proximidad
KR20170128234A (ko) 2015-01-16 2017-11-22 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 Ror1에 특이적인 항체 및 키메라 항원 수용체
WO2016126882A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Twist Bioscience Corporation Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly
JP6484345B2 (ja) 2015-02-17 2019-03-20 アムジエン・インコーポレーテツド 固定及び／または戻りが真空によって支援された薬物送達装置
US11806509B2 (en) 2015-02-27 2023-11-07 Amgen Inc. Drug delivery device having a needle guard mechanism with a turnable threshold of resistance to needle guard movement
US9981239B2 (en) 2015-04-21 2018-05-29 Twist Bioscience Corporation Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis
JOP20200116A1 (ar) * 2015-04-24 2017-06-16 Amgen Inc طرق لعلاج أو الوقاية من الصداع النصفي
US10464983B2 (en) 2015-05-13 2019-11-05 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Variants of adrenomedullin and calcitonin gene-related peptide and methods of use
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
US10844373B2 (en) 2015-09-18 2020-11-24 Twist Bioscience Corporation Oligonucleic acid variant libraries and synthesis thereof
CN108698012A (zh) 2015-09-22 2018-10-23 特韦斯特生物科学公司 用于核酸合成的柔性基底
US11351308B2 (en) 2015-12-09 2022-06-07 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
US11154661B2 (en) 2016-01-06 2021-10-26 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
EP3411408B1 (en) 2016-02-02 2021-12-08 Fred Hutchinson Cancer Research Center Anti-ror1 antibodies and uses thereof
EP4035711A1 (en) 2016-03-15 2022-08-03 Amgen Inc. Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices
WO2017181031A2 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Anti-pacap antibodies and uses thereof
US11541168B2 (en) 2016-04-29 2023-01-03 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
US10988284B2 (en) 2016-05-13 2021-04-27 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
EP3458988B1 (en) 2016-05-16 2023-10-18 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
EP3465124A1 (en) 2016-06-03 2019-04-10 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
EP3478342A1 (en) 2016-07-01 2019-05-08 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
US20190328965A1 (en) 2016-08-17 2019-10-31 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
US10417457B2 (en) 2016-09-21 2019-09-17 Twist Bioscience Corporation Nucleic acid based data storage
KR20220031944A (ko) 2016-09-23 2022-03-14 테바 파마슈티컬스 인터내셔널 게엠베하 불응성 편두통의 치료
CA3037661A1 (en) 2016-09-23 2018-03-29 Teva Pharmaceuticals International Gmbh Treating cluster headache
US20200261643A1 (en) 2016-10-25 2020-08-20 Amgen Inc. On-body injector
WO2018132572A1 (en) * 2017-01-11 2018-07-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University R-spondin (rspo) surrogate molecules
AU2018210301A1 (en) 2017-01-17 2019-08-01 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
EP3574019A4 (en) 2017-01-26 2021-03-03 Surrozen, Inc. TISSUE SPECIFIC, WNT SIGNAL REINFORCEMENT MOLECULES AND USES THEREOF
MX2019009625A (es) 2017-02-17 2019-10-09 Amgen Inc Dispositivo de administracion de farmacos con trayectoria de flujo de fluido esteril y metodo relacionado de ensamblaje.
US11369736B2 (en) 2017-02-17 2022-06-28 Amgen Inc. Cannula insertion and retraction mechanisms
CA3054303A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Twist Bioscience Corporation Nucleic acid based data storage
KR20190133174A (ko) 2017-03-02 2019-12-02 베쓰 이스라엘 디코니스 메디칼 센터 인크 칼시토닌 유전자 관련 펩티드에 대해 지시되는 항체에 반응하는 두통 환자를 선택하는 방법
WO2018165143A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Amgen Inc. Drug delivery device with activation prevention feature
EP3592402A1 (en) 2017-03-07 2020-01-15 Amgen Inc. Needle insertion by overpressure
MX2019010671A (es) 2017-03-09 2019-10-21 Amgen Inc Mecanismo de insercion para dispositivo de administracion de farmacos.
BR112019020053B1 (pt) 2017-03-28 2023-10-10 Amgen Inc Máquina para acoplar uma haste de êmbolo a um conjunto de seringa e método de utilização da referida máquina
US11904143B2 (en) 2017-06-08 2024-02-20 Amgen Inc. Torque driven drug delivery device
AU2018280054B2 (en) 2017-06-08 2023-07-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
CA3063920A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Amgen Inc. Device activation impact/shock reduction
US11395880B2 (en) 2017-06-23 2022-07-26 Amgen Inc. Electronic drug delivery device
MA49562A (fr) 2017-07-14 2020-05-20 Amgen Inc Système d'insertion-rétractation d'aiguille présentant un système à ressort en double torsion
EP3655063A1 (en) 2017-07-21 2020-05-27 Amgen Inc. Gas permeable sealing member for drug container and methods of assembly
EP4085942A1 (en) 2017-07-25 2022-11-09 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
US11484648B2 (en) 2017-07-25 2022-11-01 Amgen Inc. Drug delivery device with container access system and related method of assembly
MA49838A (fr) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc Systèm de administration de médicaments avec pression hydraulique-pneumatique de chambre
EP3668567A1 (en) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
MA50611A (fr) 2017-10-04 2020-08-12 Amgen Inc Adaptateur d'écoulement destiné à un dispositif d'administration de médicament
WO2019070552A1 (en) 2017-10-06 2019-04-11 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE COMPRISING A LOCKOUT ASSEMBLY AND ASSOCIATED ASSEMBLY METHOD
US11464903B2 (en) 2017-10-09 2022-10-11 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
WO2019079769A1 (en) 2017-10-20 2019-04-25 Twist Bioscience Corporation HEATED NANOWELLS FOR THE SYNTHESIS OF POLYNUCLEOTIDES
EP3703778A1 (en) 2017-11-03 2020-09-09 Amgen Inc. System and approaches for sterilizing a drug delivery device
CA3079197A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
US20200338271A1 (en) 2017-11-06 2020-10-29 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
CN116832271A (zh) 2017-11-10 2023-10-03 安进公司 用于药物递送装置的柱塞
MX2020004996A (es) 2017-11-16 2020-08-27 Amgen Inc Un mecanismo de pestillo de puerta para un dispositivo de administracion de farmacos.
JP7339262B2 (ja) 2018-01-12 2023-09-05 アムジェン インコーポレイテッド Ｐａｃ１抗体及びその使用
US11407838B2 (en) 2018-04-02 2022-08-09 Amgen Inc. Erenumab compositions and uses thereof
MX2020010724A (es) 2018-04-12 2020-11-06 Amgen Inc Metodos para preparar composiciones proteicas estables.
SG11202011467RA (en) 2018-05-18 2020-12-30 Twist Bioscience Corp Polynucleotides, reagents, and methods for nucleic acid hybridization
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
MA53379A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
US20210260279A1 (en) 2018-07-24 2021-08-26 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with optional grip portion and related method of preparation
WO2020023451A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
US20210228797A1 (en) 2018-07-31 2021-07-29 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
AU2019347710A1 (en) 2018-09-24 2021-02-04 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
CA3110371A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
MA53815A (fr) 2018-10-02 2022-01-05 Amgen Inc Systèmes d'injection pour administration de médicament avec transmission de force interne
US20210338936A1 (en) 2018-10-05 2021-11-04 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
US20200114082A1 (en) 2018-10-15 2020-04-16 Amgen Inc. Drug delivery device having damping mechanism
TW202031306A (zh) 2018-10-15 2020-09-01 美商安進公司 用於藥物遞送裝置之平台組裝方法
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
WO2020091981A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
WO2020091956A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
JP2022516956A (ja) * 2019-01-08 2022-03-03 ハー・ルンドベック・アクチエゼルスカベット 抗ｃｇｒｐ抗体を用いた頭痛の急性治療及び迅速治療
CN113766930A (zh) * 2019-02-26 2021-12-07 特韦斯特生物科学公司 Glp1受体的变异核酸文库
AU2020263289A1 (en) 2019-04-24 2021-09-16 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
CN114127110B (zh) * 2019-05-30 2022-07-01 山东博安生物技术股份有限公司 抗cgrp抗体及其应用
US20220363770A1 (en) 2019-06-28 2022-11-17 Amgen Inc. Anti-cgrp receptor/anti-pac1 receptor bispecific antigen binding proteins
US20220273887A1 (en) 2019-08-23 2022-09-01 Amgen Inc. Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
US20240139171A1 (en) 2021-03-02 2024-05-02 Cgrp Diagnostics Gmbh Treatment and/or reduction of occurrence of migraine
EP4341161A1 (en) 2021-05-21 2024-03-27 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container
WO2023026205A1 (en) 2021-08-24 2023-03-02 Cgrp Diagnostics Gmbh Preventative treatment of migraine
WO2023215829A1 (en) * 2022-05-05 2023-11-09 Amgen Inc. Heteromultimer binding dll3 and cd3
WO2024102742A1 (en) 2022-11-07 2024-05-16 Amgen Inc. Methods for treating obesity

Family Cites Families (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
DE3374837D1 (en) 1982-02-17 1988-01-21 Ciba Geigy Ag Lipids in the aqueous phase
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
EP0143949B1 (en) 1983-11-01 1988-10-12 TERUMO KABUSHIKI KAISHA trading as TERUMO CORPORATION Pharmaceutical composition containing urokinase
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
EP0272253A4 (en) 1986-03-07 1990-02-05 Massachusetts Inst Technology METHOD FOR IMPROVING GLYCOPROTE INSTABILITY.
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
ATE87659T1 (de) 1986-09-02 1993-04-15 Enzon Lab Inc Bindungsmolekuele mit einzelpolypeptidkette.
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5011912A (en) 1986-12-19 1991-04-30 Immunex Corporation Hybridoma and monoclonal antibody for use in an immunoaffinity purification system
US4965195A (en) 1987-10-26 1990-10-23 Immunex Corp. Interleukin-7
US4968607A (en) 1987-11-25 1990-11-06 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
WO1990005183A1 (en) 1988-10-31 1990-05-17 Immunex Corporation Interleukin-4 receptors
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
JPH02229119A (ja) 1989-02-28 1990-09-11 Toyo Jozo Co Ltd 動脈硬化予防および治療剤
US5683888A (en) 1989-07-22 1997-11-04 University Of Wales College Of Medicine Modified bioluminescent proteins and their use
US5292658A (en) 1989-12-29 1994-03-08 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Boyd Graduate Studies Research Center Cloning and expressions of Renilla luciferase
EP1690935A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6713610B1 (en) 1990-01-12 2004-03-30 Raju Kucherlapati Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
AU651596B2 (en) 1990-06-05 1994-07-28 Immunex Corporation Type II interleukin-1 receptors
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DK0546073T3 (da) 1990-08-29 1998-02-02 Genpharm Int Frembringelse og anvendelse af transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
JP3126980B2 (ja) 1991-03-11 2001-01-22 ザ・ユニバーシテイ・オブ・ジヨージア・リサーチ・フアウンデーシヨン・インコーポレーテツド レニラ（ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼのクローニング及び発現
JPH06508035A (ja) 1991-06-14 1994-09-14 ディーエヌエックス　コーポレーション トランスジェニックブタにおけるヒトヘモグロビンの生産
CA2113113A1 (en) 1991-07-08 1993-01-21 Simon W. Kantor Thermotropic liquid crystal segmented block copolymer
US5262522A (en) 1991-11-22 1993-11-16 Immunex Corporation Receptor for oncostatin M and leukemia inhibitory factor
ES2131107T3 (es) * 1992-03-17 1999-07-16 Novartis Ag Anticuerpos obtenidos mediante ingenieria genetica.
WO1994002602A1 (en) 1992-07-24 1994-02-03 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
CA2146559A1 (en) 1992-10-23 1994-05-11 Melanie K. Spriggs Methods of preparing soluble, oligomeric proteins
US5766880A (en) * 1992-10-27 1998-06-16 Queen's University At Kingston Isolated nucleic acid molecules encoding multidrug resistance proteins
US5457035A (en) 1993-07-23 1995-10-10 Immunex Corporation Cytokine which is a ligand for OX40
KR960705209A (ko) 1993-09-10 1996-10-09 잭 엠. 그랜노위츠 녹색 형광 단백의 용도
WO1995021191A1 (en) 1994-02-04 1995-08-10 William Ward Bioluminescent indicator based upon the expression of a gene for a modified green-fluorescent protein
WO1996003993A2 (en) 1994-08-05 1996-02-15 The Rockefeller University Modulation of thymocyte and t cell functional activity
DE69433747D1 (de) * 1994-08-16 2004-06-03 Human Genome Sciences Inc Calcitoninrezeptor
US5777079A (en) 1994-11-10 1998-07-07 The Regents Of The University Of California Modified green fluorescent proteins
DE69637481T2 (de) 1995-04-27 2009-04-09 Amgen Fremont Inc. Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8
US5874304A (en) 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods
US5804387A (en) 1996-02-01 1998-09-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP)
US5876995A (en) 1996-02-06 1999-03-02 Bryan; Bruce Bioluminescent novelty items
US5925558A (en) 1996-07-16 1999-07-20 The Regents Of The University Of California Assays for protein kinases using fluorescent protein substrates
US5976796A (en) 1996-10-04 1999-11-02 Loma Linda University Construction and expression of renilla luciferase and green fluorescent protein fusion genes
US6255455B1 (en) * 1996-10-11 2001-07-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rh(D)-binding proteins and magnetically activated cell sorting method for production thereof
ATE387495T1 (de) 1996-12-03 2008-03-15 Amgen Fremont Inc Vollkommen humane antikörper die egfr binden
US6458547B1 (en) 1996-12-12 2002-10-01 Prolume, Ltd. Apparatus and method for detecting and identifying infectious agents
CA2196496A1 (en) 1997-01-31 1998-07-31 Stephen William Watson Michnick Protein fragment complementation assay for the detection of protein-protein interactions
DE19732944A1 (de) 1997-07-31 1999-02-04 Thomae Gmbh Dr K Peptidische CGRP-Antagonisten
US6342220B1 (en) 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
DE69938293T2 (de) 1998-03-27 2009-03-12 Bruce J. Beverly Hills Bryan Luciferase, gfp fluoreszenzproteine, kodierende nukleinsaüre und ihre verwendung in der diagnose
US6268474B1 (en) 1998-04-30 2001-07-31 Creighton University Peptide antagonists of CGRP-receptor superfamily and methods of use
US6210924B1 (en) 1998-08-11 2001-04-03 Amgen Inc. Overexpressing cyclin D 1 in a eukaryotic cell line
CA2341029A1 (en) 1998-08-17 2000-02-24 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
CA2396460A1 (en) * 1999-12-02 2001-06-07 Myriad Genetics, Inc. Protein-protein interactions
US20020090646A1 (en) 2000-05-03 2002-07-11 Amgen Inc. Calcitonin-related molecules
FR2821080B1 (fr) 2001-02-20 2003-12-19 Sanofi Synthelabo Anticorps specifique de l'adrenomedulline humaine, composition pharmaceutique le contenant, ses applications therapeutiques
AU2002314495A1 (en) * 2001-06-20 2003-01-02 Prochon Biotech Ltd. Antibodies that block receptor protein tyrosine kinase activation, methods of screening for and uses thereof
EP1438325B1 (en) 2001-09-27 2009-12-30 Merck & Co., Inc. Isolated dna molecules encoding humanized calcitonin gene-related peptide receptor, related non-human transgenic animals and assay methods
US7658924B2 (en) * 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
AR039067A1 (es) * 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
CA2473733C (en) * 2002-01-18 2014-09-09 Zymogenetics, Inc. Cytokine receptor zcytor17 multimers
US20040110170A1 (en) * 2002-05-18 2004-06-10 The Regents Of The University Of California Cloning and characterization of calcitonin gene related peptide receptors
US20070071744A1 (en) * 2002-06-07 2007-03-29 Gotz Munch Agents which bind to epitopes of glycoprotein VI
JP2006501216A (ja) * 2002-08-12 2006-01-12 スヴェインソン・ビルキル 乾癬の治療のためのｃｇｒｐアンタゴニスト化合物の使用
US20040176577A1 (en) * 2002-09-10 2004-09-09 Eva Rojer Immunoassays for specific determination of SCCA isoforms
WO2004097421A2 (en) 2003-04-29 2004-11-11 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with calcitonin receptor-like receptor (calcrl)
CN103897066A (zh) * 2004-02-11 2014-07-02 安米林药品有限责任公司 具有可选择特性的杂合多肽
US7423128B2 (en) * 2004-11-03 2008-09-09 Amgen Fremont Inc. Anti-properdin antibodies, and methods for making and using same
KR101017301B1 (ko) * 2004-12-21 2011-02-28 메드임뮨 리미티드 앤지오포이에틴-2에 대한 항체 및 그의 용도
JP4993606B2 (ja) 2005-06-16 2012-08-08 隆行 新藤 Ｒａｍｐ２を標的とする血管構造の安定化剤及び血管新生剤
GB0521139D0 (en) * 2005-10-18 2005-11-23 Univ Sheffield Therapeutic agent
US8168592B2 (en) 2005-10-21 2012-05-01 Amgen Inc. CGRP peptide antagonists and conjugates
BRPI0618705B8 (pt) 2005-11-14 2021-05-25 Labrys Biologics Inc anticorpos antagonistas humanizados direcionados contra peptídeo relacionado ao gene da calcitonina, composição farmacêutica e uso dos mesmos
WO2007076336A1 (en) * 2005-12-22 2007-07-05 Eli Lilly And Company Treatment of migraine with anti-cgrp antibodies
RU2009107277A (ru) * 2006-08-03 2010-09-10 Астразенека Аб (Se) АНТИТЕЛА, НАЦЕЛЕННЫЕ НА αVβ6, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
GB0708002D0 (en) * 2007-04-25 2007-06-06 Univ Sheffield Antibodies
US8298536B2 (en) 2008-03-04 2012-10-30 Pfizer Limited Methods of treating inflammatory pain
FR2934597B1 (fr) 2008-07-31 2013-04-19 Univ Aix Marseille Ii Anticorps se liant aux recepteurs de l'adrenomedulline et leurs utilisations comme medicament.
JO3382B1 (ar) * 2008-12-23 2019-03-13 Amgen Inc أجسام مضادة ترتبط مع مستقبل cgrp بشري
EP2470207A1 (en) 2009-08-28 2012-07-04 Rinat Neuroscience Corporation Methods for treating visceral pain by administering antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide
JP5782185B2 (ja) 2012-06-01 2015-09-24 日本電信電話株式会社 パケット転送処理方法およびパケット転送処理装置
US9300829B2 (en) 2014-04-04 2016-03-29 Canon Kabushiki Kaisha Image reading apparatus and correction method thereof
MX2017003247A (es) * 2014-09-15 2017-11-30 Amgen Inc Proteina de union a antigenos, bi-especificos del receptor anti-cgrp/receptor pac1 y usos de las mismas.
JOP20200116A1 (ar) * 2015-04-24 2017-06-16 Amgen Inc طرق لعلاج أو الوقاية من الصداع النصفي
US11385238B2 (en) * 2017-06-30 2022-07-12 Amgen Inc. Methods of protein clips recovery
US11407838B2 (en) * 2018-04-02 2022-08-09 Amgen Inc. Erenumab compositions and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
AU2009330175C1 (en) 2018-10-04
KR101853393B1 (ko) 2018-05-02
IL213429A (en) 2016-02-29
JO3382B1 (ar) 2019-03-13
CL2011001578A1 (es) 2012-01-20
KR101740615B1 (ko) 2017-05-26
CN106084045A (zh) 2016-11-09
SG10201401879TA (en) 2014-06-27
US20180142029A1 (en) 2018-05-24
PT3184546T (pt) 2019-09-16
CN102348722B (zh) 2016-06-08
EP3184546B1 (en) 2019-07-17
HRP20191341T1 (hr) 2019-10-18
IL243784A (en) 2016-11-30
CY1122658T1 (el) 2021-03-12
AR074857A1 (es) 2011-02-16
KR20180043850A (ko) 2018-04-30
IL243784A0 (en) 2016-04-21
TN2011000283A1 (en) 2012-12-17
WO2010075238A1 (en) 2010-07-01
BRPI0922505A2 (pt) 2016-07-05
PL2379594T3 (pl) 2018-01-31
SI2379594T1 (sl) 2017-12-29
EA201891500A2 (ru) 2018-11-30
HUE034506T2 (en) 2018-02-28
HRP20171690T1 (hr) 2017-12-15
JP2021036912A (ja) 2021-03-11
NZ623541A (en) 2015-12-24
EA201891500A3 (ru) 2019-03-29
EA031320B1 (ru) 2018-12-28
JP2014210815A (ja) 2014-11-13
CY1119465T1 (el) 2018-03-07
US20130071410A1 (en) 2013-03-21
KR20110106409A (ko) 2011-09-28
JP6261132B2 (ja) 2018-01-17
LT3184546T (lt) 2019-09-10
AU2009330175A1 (en) 2011-06-23
RS56567B1 (sr) 2018-02-28
DK3184546T3 (da) 2019-09-30
US20210179723A1 (en) 2021-06-17
TW201703796A (zh) 2017-02-01
LUC00095I1 (es) 2018-12-28
CN102348722A (zh) 2012-02-08
EP3184546A1 (en) 2017-06-28
TWI754176B (zh) 2022-02-01
SG172307A1 (en) 2011-07-28
TWI688403B (zh) 2020-03-21
JP2016026224A (ja) 2016-02-12
EP2379594B1 (en) 2017-08-09
US20100172895A1 (en) 2010-07-08
JP2023116783A (ja) 2023-08-22
LTPA2018017I1 (lt) 2019-01-10
TWI574697B (zh) 2017-03-21
ME03601B (me) 2020-07-20
CA2746858A1 (en) 2010-07-01
AU2013205271C1 (en) 2018-10-04
CY2018032I2 (el) 2019-07-10
BRPI0922505B1 (pt) 2021-08-03
AU2009330175B2 (en) 2014-01-16
NL300961I2 (nl) 2019-01-15
ES2643835T3 (es) 2017-11-24
US9862771B2 (en) 2018-01-09
EA201100892A1 (ru) 2012-01-30
US20150376286A1 (en) 2015-12-31
SI3184546T1 (sl) 2019-09-30
CR20110400A (es) 2011-10-12
KR20170061182A (ko) 2017-06-02
IL213429A0 (en) 2011-07-31
JOP20190017A1 (ar) 2017-06-16
HUE045966T2 (hu) 2020-01-28
KR20190054181A (ko) 2019-05-21
MX2011006804A (es) 2011-09-27
CO6400232A2 (es) 2012-03-15
TW201032823A (en) 2010-09-16
CY2018032I1 (el) 2019-07-10
TW202026312A (zh) 2020-07-16
EP2379594A1 (en) 2011-10-26
PL3184546T3 (pl) 2019-12-31
ZA201105418B (en) 2012-02-29
HRP20191341T8 (hr) 2020-02-07
BR122020010360B1 (pt) 2022-08-16
AU2013205271B2 (en) 2016-07-14
RS59343B1 (sr) 2019-10-31
JP2012513214A (ja) 2012-06-14
PT2379594T (pt) 2017-11-16
NO2018042I1 (no) 2018-12-17
PE20120427A1 (es) 2012-05-13
TW202241950A (zh) 2022-11-01
MA32982B1 (fr) 2012-01-02
EP3184546B8 (en) 2019-10-30
MY180564A (en) 2020-12-02
DK2379594T3 (en) 2017-10-30
EP2379594B8 (en) 2020-12-30
JP5761805B2 (ja) 2015-08-12
HUS1800047I1 (hu) 2018-12-28
EP3569620A1 (en) 2019-11-20
JOP20190017B1 (ar) 2023-03-28
LTC2379594I2 (lt) 2020-04-10
NZ606090A (en) 2014-08-29
AU2013205271A1 (en) 2013-05-02
CA2746858C (en) 2017-10-03
CN106084045B (zh) 2020-02-11
LUC00095I2 (es) 2019-12-24
US9102731B2 (en) 2015-08-11
NO2379594T3 (es) 2018-01-06
JP2019062907A (ja) 2019-04-25
LT2379594T (lt) 2017-11-27
UA108066C2 (uk) 2015-03-25
US20210179722A1 (en) 2021-06-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2746571T3 (es) Anticuerpos de unión al receptor de CGRP humano
ES2633810T3 (es) Proteínas de unión a antígeno humanas que se unen a beta-Klotho, receptores de FGF y complejos de los mismos
US10294298B2 (en) Human PAC1 antibodies
AU2018203471B2 (en) Human CGRP receptor binding proteins