JPH06508035A

JPH06508035A - トランスジェニックブタにおけるヒトヘモグロビンの生産

Info

Publication number: JPH06508035A
Application number: JP5501048A
Authority: JP
Inventors: ローガン，ジョン　エス．; ホルツマン，スティーブン; オードネル，ジェイ．ケヴィン; ピルダー，ステファン　エイチ．; ピンカート，カール　エイ．; スワンソン，マーク　イー．; ケラー，ヒラリー
Original assignee: ディーエヌエックス　コーポレーション
Priority date: 1991-06-14
Filing date: 1992-06-15
Publication date: 1994-09-14
Also published as: CA2111348A1; WO1992022646A1; EP0590076A1; EP0590076A4; AU2249592A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】トランスジェニックブタにおけるヒトヘモグロビンの生産１、序文本発明はヒトヘモグロビンの生産のためのトランスジェニックブタの使用に関する。本発明のトランスジェニックブタは、ヒトの輸血や他の医学的応用に用いることのできる無細胞ヒトヘモグロビンの効率的かつ経済的な材料として用いることができる。

２、発明の背景２．１．ヘモグロビン肺を通して吸収された酸素は、輸送赤血球中のヘモグロビンによって体中の組織に運ばれる。高酸素圧、例えば肺付近においては、酸素はヘモグロビンに結合するが、酸素が必要な低酸素圧部分では放出される。

それぞれのヘモグロビン分子は２つのアルファグロビンと２つのベータグロビンのサブユニットを含む。さらに、それぞれのサブユニットは酸素分子を輸送できる鉄含有ヘム基に非共有的に結合している。従って、それぞれのヘモグロビン４量体は４分子の酸素と結合できる。これらのサブユニットは、肺と組織における酸素の取込みと放出を促進する２つの配座状態間をスイッチして共同的に働く。

この効果は通常はヘム−ヘム相互作用または協同作用と呼ばれている。

多くの動物のヘモグロビンは酸素の結合と放出をさらに促進できる生物的なエフェクター分子との相互作用が可能である。この促進はヘモグロビンの２つのコンホメーション状態間のアロステリックな平衡に影響を与える変化において明らかに示されている。

例えば、ヒトとブタのヘモグロビンは、４ｌ体の２つの配座状態間の平衡に影響を与える２、３ジホスホグリセレート（２，３ＤＰＧ）に結合することができ、酸素に対する全体的な親和性を組織レベルで低下させる最終的な効果を有する。

その結果、２．３−ＤＰＧは組織への酸素輸送の効率を高める。

２．２．グロビン遺伝子の発現ヘモグロビンタンパク質は、赤血球細胞において全細胞タンパク責の約９０パーセントを占めて組織特異的に発現される。従って、赤血球はその核を失い、かつ最小数のオルガネラ以外はすべて失っており、効果的に酸素輸送のために働く膜に包まれたヘモグロビンの束である。

ヒトおよび多様な他の種は、胚、胎児、および成人の発達期間中に異なるタイプのヘモグロビンを作る。従って、グロビン遺伝子発現に影響を与える因子は、グロビン発現に関する組織特異的調節、量的調節、および発達的制御調節を達成可能でなければならない。

ヒトグロビン遺伝子は、アルファ（α）グロビンの染色体１６上とベータ（β）グロビンの染色体ｌｌ上のクラスター中に認められた。ヒトベータグロビン遺伝子クラスターは、ニブシロン（ε）グロビンをコードしている１つの胚遺伝子、ガンマ（γ）ＧとガンマＡグロビンをコードする２つの胎児遺伝子、およびデルタ（δ）とベータ（β）グロビンをコードする２つの成人遺伝子をこの順序で含む約５０ｋｂのＤＮＡからなる（Ｆｒｉｔｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ。

、１９８０．　Ｃｅ１ｌす：９５９−９７２）。

βグロビン翻訳開始部位の上流と下流の両方のＤＮＡ配列はβグロビン遺伝子発現の制御に関与していることが発見された（Ｗｒｉｇｈｔ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４．　Ｃｅ１ｌ　３８：２６３）　。特に、ヒトベータグロビン遺伝子の約５０キロベース上流に位置する一連の４つのＤｎａｓｅ　１超過散性部位（現在は座調節領域またはＬＣＲと呼ばれている）は、適当に制御されたベータグロビン−座発現を引き出す際に非常に重要である（Ｔｕａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ。

Ａ、８３：１３５９−１３６３；　ＰＣＴ　Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ＷＯ８９０１５１７ｂｙ　Ｇｒ最近、グロビン遺伝子発現の分子的特徴はさらに大きな興味と遭遇しているが、これは提供者により作られた血液の危険性を避けるような合成血液を作るために研究者が遺伝子工学を用いる試みを行なっているためである。１９８８年には、１２．０００．０００〜１４．０００．０００単位の血液が米国だけで用いられ（Ａｎｄｒｅｗｓ、　１９９０年２月１８日付けのＮｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ｔｉｍｅｓ）　、ばく大な量が不安定なボランティアの血液提供に依存している。約５パーセントの提供血液が肝炎ウィルスにより感染されており（同新聞）　、ＨＩＶ感染のスクリーニング操作は一般的に効果的ではあるものの、輸血関連のエイズにかかる見込みは依然としてかなり恐れられている一つの可能性である。さらに、輸血血液は輸血を受ける者の血液型に適合しなければならない：　提供血液の供給は稀な血液型を持つ個人に輸血が提供できないかもしれない。対照的に、遺伝子工学により作られるヘモグロビンは血液型の適合を必要とせず、無ウィルスであり、潜在的に無制限の量が利用できるであろう。いくつかの研究グループが微生物でのヘモグロビン発現の可能性を検討している。

例えば、ヒトグロビンタンパク質の大腸菌での生産を実施例で示しているＨｏｆｆｍａｎとＮａｇａｉによる国際出願Ｎｏ、　ＰＣＴ／ＵＳ８８１０１５３４を参トランスジェニック動物は、トランスジーンと呼ばれる少なくとも一つの外来遺伝子を遺伝物質中に有している非ヒトの動物である。好適には、トランスジーンは動物の子孫に伝えられるように、動物の生殖系に含まれる。トランスジーンの受精卵の前核へのマイクロインジェクションおよび胚幹細胞のマニピユレーションなどの、しかしこれらに限定されない多くの技術を用いてトランスジーンを動物の遺伝物質中に導入することができる（Ｕ、Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、　４．８７３，１９１　ｂｙ　Ｗａｇｎｅｒ　ａｎｄ　Ｈｏｐｐｅ；　Ｐａ１ｍ１ｔｅｒ　ａｎｄ　Ｂｒ１ｎｓｔｅｒ、１９８６．　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、２０：４６５−４９９；　１９８７年８月７日公告のＦｒｅｎｃｈ　ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　２５９３８２７）　Ｑ　トランスジェニック動物は、すべての細胞中にトランスジーンを有してもよいし、または遺伝的にモザイクであってもよい。

はとんどの研究はトランスジェニックマウスにかかわるものであったが、他の種のトランスジェニック動物、例えばウサギ、ヒびニワトリ（Ｓａｌｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１５７：２３６−２４０）も作られてきた。トランスジェニック動物は、有用な薬剤化合物製造のバイオリアクターとして役立てられるように現在開発中である（Ｖａｎ　Ｂｒｕｎｔ、　１９８８．　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：１１４９−１１５４；　ｗｉｌｍｕｔ　ｅｔ　ａｌ、、１９８８．　Ｎｅｗ　５ｃｉｅｎｔｉｓｔ　（７月７日号）　ｐｐ、５６−５９）。

トランスジェニック家畜による組み換えタンパク質の発現方法は組み換えバクテリアや酵母でのタンパク質の生産よりも重要な理論的利点を有している７　つまり、それは、グリコジル化、リン酸化、サブユニットアセンブリ等を含めた翻訳後修飾が分子活性にとって非常に重要である大きく複雑なタンパク質を作れることにある。

しかし、実際はトランスジェニック家畜の創作は問題があることが証明されている。トランスジェニック胚を作ることは技術的に困難なだけではなく、著しい量の組み換えタンパク質を作る成熟トランスジェニックブタは生存できないことを示すことができる。特にブタにおいては、経験的には、成長ホルモンをコードするトランスジーン（本発明以前にブタ中に導入された唯一のトランスジーン）を有するブタは、激しい関節炎、後ろ足の共同的運動の欠如、ストレス敏感、雌ブタの無発情および雄ブタの性衝動の欠如を含む多くの健康的問題にさらされていた（上記のＷｉｌ＋ｎｕｔｅｔａ１．）。このことは、健全に見えて成長ホルモントランスジーンを有するトランスジェニックマウスとは対照的である（Ｐａｌｍｉｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８２．　Ｎａｔｕｒｅ　３０東６１１−６１５）　Ｏ従って、本発明以前には（自らのトランスジーンを効率的に発現している）健康なトランスジェニックブタは作られてはいない。

２、　５．　ｌ−ランスジェニック動物におけるグロビン遺伝子の発現ヒトグロビントランスジーンを有するトランスジェニックマウスはグロビン遺伝子発現に関する分子生物学の研究に用いられてきた。ハイブリッドマウス／ヒト成人ベータグロビン遺伝子は１９８５年にＭａｇｒａｍらにより記載された（Ｎａｔｕｒｅ　３１５：３３８−３４０）　、次に、Ｋｏｌｌｉａｓらは、トランスジェニックマウスでのヒトガンマＡ、ベータ、およびハイブリッドベータ／ガンマグロビン遺伝子の制御された発現を報告した（１９８６．　Ｃｅ１ｌ　４６：８９− ９４）　、ヒト胎児ガンマグロビンを発現するトランスジェニックマウスは、Ｅｎｖｅｒら（ｌ。トランスジェニックマウス中でスイッチするヒト胚グロビン遺伝子の自律的な発達調節はＲａ１ｃｈらにより観察された（１９９０．５ｃｉｅｎｃｅ　２５０：１１４７−１１４９）　。

ヘモグロビンまたはヘモグロビン発現の多様な疾患のトランスジェニックマウスモデルが開発されてきており、それには鎌状赤続性（Ｔａｎａｋａ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　Ａｎｎ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）６１２：１６７−１７８）がある。

ヒトアルファおよびベータグロビンの同時発現によってトランスジェニックマウスにおけるヒトヘモグロビンの生産かもたらさベータではない）グロビンをコードするトランスジーンの高いコピー数を持つトランスジェニック胎児は激しい貧血を示して生れる前に死ぬことがＨａｎｓｃｏｍｂｅら（上記文献）により観察された。

ベータグロビンＬＣＲの制御下のヒトのアルファグロビン遺伝子およびベータグロビン遺伝子の両方を有する構築物を用いて、低いコピー数の生きたマウスが得られた（同文献）。代謝標識実験は均衡のとれたマウスグロビン合成を示したが、不均衡なヒトグロビン合成を示し、約０．６のアルファ／ベータ生合成率を有していた（同文献）。

３、発明の要約本発明はヒトヘモグロビンおよび／またはヒトグロビンの生産のためのトランスジェニックブタの使用に関する。それは赤血球中にヒトヘモグロビンを発現し、かつ異種のヘモグロビン生産の結果として有害な影響を受けることのない健康なトランスジェニックブタを作ることができるという発見に少なくとも一部は基づいている。

特別な実施態様において、本発明はヒトグロビン遺伝子を発現するトランスジェニックブタを提供する。そのような動物は、（ｉ）ブタにおける妊娠と性的成熟の比較的短い期間、（ｉｉ）一度に生れる子の大きさと頻度、（ｉｉｉ）比率的に高い収率のヘモグロビンを提供するブタの比較的大きなサイズ；　および（ｉｖ）　トランスジェニックブタを高いレベルのヒトヘモグロビンの存在下で健全であり続けることを可能とする酸素結合親和性の制御でのブタヘモグロビンとヒトヘモグロビンとの機能的近似性という観点より、ヒトヘモグロビンの特に効率的かつ経済的な材料として用いることができる。

本発明はトランスジェニックブタを作るために用いることのできる組み換え核酸構築物も提供する。好適な実施態様において、そのような構築物は、グロビン鎖不均衡の有害効果および／または不適当な細胞タイプ（例えば未発達な赤血球）における構成βグロビンプロモータ活性による転写因子の測定を避けるために、同じプロモータ下にヒトのアルファグロビン遺伝子およびベータグロビン遺伝子を置いている。

さらに別の実施態様において、本発明はヒトαグロビンおよびブタβグロビンからなるハイブリッドヘモグロビンを提供する。

このハイブリッドへモグロビンを発現するトランスジェニックブタの全血液は、天然のヒトまたはブタ血液よりも有利に高いＲ５゜を示すよってある。

さらに、本発明は（１）適当な１つのプロモータまたは複数のプロモータの制御下のヒトアルファグロビンとヒトベータグロビンの遺伝子をブタの遺伝物質に導入して、ヒトヘモグロビンを少なくとも幾つかの赤血球細胞中で発現させるトランスジェニックブタを作り；（ｉｉ）トランスジェニックブタから赤血球細胞を集め：　（ｉｉｉ）集められた赤血球細胞の内容物を放出させ：そして（ｉｖ）赤血球細胞の放出された内容物をブタヘモグロビンからヒトヒトヘモグロビンを実質的に分離させる精製操作に供することを含む、ヒトヘモグロビンの製造方法を提供する。本発明の好適な実施態様において、ヒトヘモグロビンはＤＥＡＥ陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによりブタヘモグロビンから分離することができる。

４、図面の説明図１１組み換え核酸構築物Ａ、構築物ααβ（ｒｌ１６Ｊ構築物）；Ｂ、構築物αｐβ（ｒ１８５Ｊ構築物）；Ｃ１構築物βｐα（「２９卸構築物）：Ｄ、構築物εｐζβα；Ｅ、構築物 ζｐεαｐβ：Ｆ、β１０８Ａｓｎ−＞Ａｓｐ変異を有する構築物αｐβ（「ヘモグロビンヨシズカ構築物Ｊ）：Ｇ、β１０８Ａｓｎ−＞Ｌｙｓ変異を有する構築物αｐβ（「ヘモグロビンプレスビテリアン構築物」）；Ｈ、ＬＣＲαと共にインジェクトされた構築物αｐβ（△α）（「２８５」構築物）　；　Ｉ　、ａ　１３４Ｔｈｒ−＞Ｃｙｓ変異を有する構築物（Ｚｌ）β（ｒ２２７Ｊ構築物）　；　Ｊ　、ａ　１０４ｃｙｓ−＞Ｓｅｒ変異（「２２７」構築物）、β９３Ｃｙｓ−＞Ａｌａ変異、およびβ１１２Ｃｙｓ−＞Ｖａｌ変異（ｒ２２８Ｊ構築物）を有する構築物αｐβ、に、構築物αｐδ（ｒ２６３Ｊ構築物）；　およびり、　ＬＣＲαと共にインジェクトされた構築物αｐδ（△α’Ｉ　（ｒ２７４Ｊ構築物）；　Ｍ、　ＬＣＲεβと共にインジェクトされた構築物ＬＣＲα（ｒ２４０Ｊ構築物）、Ｎ、β６１Ｌｙｓ−＞Ｍｅｔ変異を有する構築物αｐβ（「ヘモグロビンホロンガ」構築物）：Ｏ１構築物ＬＣＲεαβ（Ｒ３１８」構築物）：Ｐ、構築物ＬＣＲαεβ（Ｒ３１９Ｊ構築物）：Ｑ、構築物ＬＣＲααεβ（Ｒ３２９Ｊ構築物）：Ｒ６構築物ＬＣＲαε（°“′βｐ）β（Ｒ３３９Ｊ構築物）；Ｓ、ａ　７５Ａｓｐ−＞Ｃｙｓ変異を有する構築物（Ｚｌ）β（Ｒ３４０Ｊ構築物）　；　Ｔ　、ａ　４２Ｔｙｒ−＞Ａｒｇ変異を有する構築物αｐβＣＲ３４１」構築物）；Ｕ、構築物ＬＣＲεβαα（Ｒ３４３Ｊ構築物）：ｖ、構築物ＬＣＲｔ：βα（Ｒ３４７Ｊ構築物）　；　Ｗ、α４２Ｔｙｒ−＞Ｌｙｓ変異を有する構築物αｐβ；　Ｘ　、ａ　４２Ｔｙｒ−＞Ａｒｇ変異およびβ９９Ａｓｐ−＞Ｇｌｕ変異を有する構築物αｐβ；　Ｙ、　ａ　４２Ｔｙｒ−＞Ｌｓｙ変異およびβ９９Ａｓｐ−＞Ｇｌｕ変異を有する構築物α９８図２．トランスジエニツクブタ図３．トランスジェニックブタにおけるヒトヘモグロビン発現の実証。Ａ９等電点電気泳動ゲル分析。Ｂ、ヒト血液を示す赤血球細胞溶血物のトリトン−酸尿素ゲル（レーン１）；　トランスジェニックブタ１２〜ｌの血液（レーン２）、９〜３（レーン３）、および６〜３（レーン４）；　そしてブタ血液（レーン５）はトランスジェニック動物におけるヒトαグロビンに比較した発現下のヒトβグロビンを示す。

図４．ヒトヘモグロビンとブタヘモグロビンのＤＥＡＥクロマトグラフィーによる分離。Ａ、ヒトとブタの赤血球細胞の溶血混合物：Ｂ、トランスジェニックブタ６〜３から集められた赤血球細胞の溶血物。Ｃ，ヒトとマウスのヘモグロビンはこれらの条件下ではＤＥＡＥクロマトグラフィーにより分離しない。

Ｄ、ブタへモグロビンから精製されたヒトヘモグロビンの等電点電気泳動。

図５．再結合したブタヘモグロビンの等電点電気泳動ゲル（レーンｌ）：　再結合したブタ／ヒトヘモグロビン混合物（レーン２およびレーン４）；　再結合したヒトヘモグロビン（レーン３）：　およびトランスジェニックブタヘモグロビン（レーン５）。

図６．ヒトヘモグロビンのＱＣＩＰクロマトグラフィーによる分離。

図７．トランスジェニックヘモグロビンの酸素親和性。

（本頁以下余白）５、発明の詳細な記述本発明は、トランスジェニックブタ（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｉｇ）を利用したヒトヘモグロビンの製造方法、グロビンをコードする新規核酸構築物、そしてヒトヘモグロビンを発現するトランスジェニックブタを提供するものである。限定するためではなく、記述を明確にする目的で、発明の詳細な記述を以下の分節に分ける＝（１）グロビン遺伝子構築物の作製：（ｉｉ）　トランスジェニックブタの作製；（ｉｉｉ）ヒトヘモグロビンの調製およびブタヘモグロビンからのヒトヘモグロビンの分離；そして（ｉｖ）ヒト／ブタハイブリッドヘモグロビンの調製。

５．１．グロビン遺伝子構築物の作製本発明は、トランスジェニックブタ内でヒトグロビンおよび／またはヘモグロビンを製造する方法を提供する。ここではヒトヘモグロビンを、グロビン鎖コード化ヒトグロビン遺伝子（アルファ、ベータ、デルタ、ガンマ、イプシロンおよびゼータ遺伝子を含む）形成された天然のまたは遺伝子工学の産物としてのヘモグロビンまたはその変異型として定義する。これらの変異型は天然のヒトヘモグロビンに対しアミノ酸配列において少なくとも９０％の相同性を有するものである。好ましい態様において、本発明のヒトヘモグロビンはヒトアルファグロビンおよびヒトベータグロビン鎖を含むものである。本発明のヒトヘモグロビンは少なくとも２つの異なるグロビン鎖を含むが、２つ以上のグロビン鎖を含んでもよく、例えば４量体分子、８量体分子などを形成する。本発明の好ましい例においては、ヒトヘモグロビンは２本のヒトアルファグロビン鎖および２本のヒトベータグロビン鎖からなっている。以下に述べるように、本発明はヒトαグロビンとブタβグロビンからなるハイブリッドヘモグロビンをも提供する。

本発明の特定の態様によれば、ブタの遺伝物質中に、ヒトアルファおよび／またはヒトベータグロビン遺伝子などの、少なくとも１つのヒトグロビン遺伝子を、適当な１以上のプロモーターの制御下に挿入し、赤血球中の少なくともいくつかにヒトグロビンを保有するトランスジェニックブタを作製する。これには相当する組み換え核酸配列の作製を必要とする。この発明の好ましい態様において、ヒトαおよびヒトβ遺伝子の両方が発現される。別の態様では、ヒトαグロビンのみが発現される。さらに別の態様では、ヒト胚または胎児グロビン遺伝子が発現され、またこれらが成体遺伝子の発生発現調節剤として使用される。

ヒトアルファおよびベータグロビン遺伝子は、例えばＳｗａｎｓｏｎｅｔ　ａｌ、　、１９９２　、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ１．１０：５３７−５５９に記載されているような一般に入手できるクローンから得ることができる。ヒトアルファおよびベータグロビン蛋白質をコードする核酸配列が、１つはヒトアルファグロビンをコードし、もう１つはヒトベータグロビンをコードする、２つの異種の組換え構築物によって、ある動物中に導入される。または、そしてこの方が好ましいが、アルファおよびベータの両方をコードする配列が同じ組換え構築物中に含まれるものでもよい。

本発明によれば、適当なプロモーターは、赤血球中でヒトアルファおよびベータグロビン遺伝子の転写を支配し得るプロモーターである。このプロモーターは赤芽細胞中で選択的に活性であるものが好ましい。これには、ヒトアルファ、ベータ、デルタ、イプシロンまたはゼータプロモーターのようなグロビン遺伝子プロモーター、あるいは他の種からのグロビンプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、ブタグロビンプロモーター配列を使用するのも有用であろう。ヒトアルファおよびベータグロビン遺伝子を異なるプロモーターの制御下においてもよいが、大幅に異なるレベルのグロビン鎖の生成は致命性に関わると考えられてきているので、ヒトアルファおよびベータグロビン遺伝子は同一のプロモーター配列の制御下に置くほうが好ましいと思われる。不適正な細胞型中に存在する構成βグロビンプロモーター活性による鎖不均衡および／または転写因子の測定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ　）を避けるため、ヒトアルファおよびベータグロビン遺伝子が発生中に同時にまた量的に同レベルで同調的に発現されるような構築物を設計することが望ましい。

本発明の、限定するわけてはないが、特定の態様として、ααβ構築物を含む構築物（”１１６”構築物とも称される；　Ｓｗａｎｓｏｎ　ｅｔａｌ、　、１９９２．　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ１．ＩＯ＋５５７−５５９；図２Ａ参照）が利用され得る。この構築物は、高コピー数のトランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）として存在すると、マウス中で有害な影響を及ぼすことがわかっているにもかかわらず、健康なトランスジェニックブタを製造するのに使用されている（下記第６節の実施例参照）。

本発明の、限定するわけてはない、別の特定の態様として、図ＩＢに示されるような、αｐβ配列を含む構築物（”１８５”構築物とも称される）が使用され得る。この構築物は、アルファおよびベータグロビンをコードする配列の両方を同しプロモーター（アルファグロビンプロモーター）の制御下に置くことができるという利点を有している。

さらに特定の態様において、本発明は以下の構築物を提供する＝　（ｉ）ヒトアルファおよびベータグロビン遺伝子がヒトベータグロビンプロモーターの別々のコピーによって作動される構築物βｐα（図ＩＣ）　；　（ｉｉ）イプシロンプロモーターの制御下にヒト胚遺伝子ゼータおよびイプシロンを、そしてベータプロモーターの制御下にアルファおよびベータ遺伝子の両方を含むεｐζβｐα構築物（図ＩＤ）　；　（ｉｉｉ　）ゼータプロモーターの制御下にヒト胚遺伝子ゼータおよびイプシロンを、そしてアルファプロモーターの制御下にアルファおよびベータ遺伝子の両方を含むζｐεαｐβ構築物（図ＩＥ）　；　（ｉｖ）β グロビンタンパク質のアミノ酸番号１０８が（アスパラギン残基の代わりに）アスパラギン酸残基に変わった変異を保有し、ヘモグロビン・ヨシズカ（Ｙｏｓｈｉｚｕｋａ　）を生成するαｐβ構築物（図ＩＦ）；　（ｖ）βグロビンタンパク質のアミノ酸番号１０８が（アスパラギン残基の代わりに）リシン残基に変わった変異を保有し、ヘモグロビン・プレスビテリアン（Ｐｒｅｓｂｙｔｅｒｉａｎ）を生成するαｐβ構築物（図ＩＧ）；（ｖｉ）ＬＣＲαがともに注入されたもので、ヒトαグロビンプロモーターの制御下にヒトβグロビン遺伝子を、そしてヒトαグロビン遺伝子をそれ自体のプロモーターの制御下に含む別個の核酸フラグメントを含むαｐβ（Δα）構築物（図ＩＨ）　；　（ｖｉｉ）αグロビンタンパク質のアミノ酸番号１３４が（トレオニン残基の代わりに）システィン残基に変わった変異を保有するαｐβ構築物（図Ｉ　Ｉ）　；　（ｖｉｉｉ）αグロビンタンパク質のアミノ酸番号１０４が（システィン残基の代わりに）セリン残基に、βグロビンタンパク質のアミノ酸番号９３が（システィン残基の代わりに）アラニン残基に、そしてβグロビンタンパク質のアミノ酸番号１１２が（システィン残基の代わりに）バリン残基に変わった変異を保有するαｐβ構築物（図Ｉ　Ｊ）　；　（ｉｘ）ヒト成人αグロビン遺伝子をそれ自体のプロモーター下に、そしてヒト成人αグロビンプロモーターの制御下にヒトδグロビン遺伝子を含むαｐδ構築物（図ＩＫ）；　（ｘ）ＬＣＲαがともに注入されたもので、ヒトαグロビンプロモーターの制御下にヒトδグロビン遺伝子を、そしてヒトα グロビン遺伝子をそれ自体のプロモーターの制御下に含む別個の核酸フラグメントを含む構築物αｐδ（Δα）（図ＩＬ）；（ｘｉ）ＬＣＲεβがともに注入されたもので、ヒトαグロビン遺伝子をそれ自体のプロモーターの制御下に、ヒト胚εグロビン遺伝子とヒト成人βグロビン遺伝子をそれら自体のプロモーターの制御下に含む別個の核酸フラグメントを含む構築物ＬＣＲα（図ＩＭ）　；　（ｘｉｉ）αグロビンタンパク質のアミノ酸番号６１が（リシン残基の代わりに）メチオニン残基に変わった変異を保有するαｐβ構築物（図ＩＮ）　；　（ｘｉｉｉ）　５°から３°に縦列に連鎖したヒト胚イプシロン遺伝子、ヒト成人アルファグロビン遺伝子およびヒト成人ベータグロビン遺伝子を含むεαβ構築物（図１０）：（ｘｉｖ）　５　’　から３′　に縦列に連鎖したヒト成人アルファグロビン遺伝子、ヒト胚イプシロングロビン遺伝子およびヒト成人ベータグロビン遺伝子を含むαεβ構築物（図Ｉ　Ｐ）　；　（ｘｖ）　５’　から３′に縦列に連鎖した、２コピーのヒト成人アルファグロビン遺伝子、ヒト胚イプシロングロビン遺伝子およびヒト成人ベータグロビン遺伝子を含むααεβ構築物（図Ｉ　Ｑ）　；　（ｘｖｉ）５°から３′に縦列に連鎖した、ヒト成人アルファグロビン遺伝子、ヒト胚イプシロングロビン遺伝子およびヒト成人ベータグロビン遺伝子をすべて内在性ブタ成体ベータグロビンプロモーターの制御下に含むαε （°“６βｐ）β構築物（図Ｉ　Ｒ）　：　（ｘｖｉｉ）αグロビンタンパク質のアミノ酸番号７５が（アスパラギン酸残基の代わりに）システィン残基に変わった変異を保有するαｐβ構築物（図Ｉ　Ｓ）　；　（ｘｖｉｉｉ）αグロビンタンパク質のアミノ酸番号４２が（チロシン残基の代わりに）アルギニン残基に変わった変異を保有するαｐβ構築物（図ＩＴ）　；　（ｘｉｘ）５°から３′ に縦列に連鎖した、ヒト胚イプシロングロビン遺伝子、ヒト成人ベータグロビン遺伝子および２コピーのヒト成人アルファグロビン遺伝子を含むＬＣＲεβαα 構築物（図Ｉ　Ｕ）　；　（ｘｘ）　５°から３′に縦列に連鎖した、ヒト胚イプシロングロビン遺伝子、ヒト成人ベータグロビン遺伝子およびヒト成人アルファグロビン遺伝子を含むＬＣＲεβα構築物（図ＩＶ）　；　（ｘｘｉ）αグロビンタンパク質のアミノ酸番号４２が（チロシン残基の代わりに）リシン残基に変わった変異を保有するαｐβ構築物（図ＩＷ）　；　（ｘｘｉｉ）αグロビンタンパク質のアミノ酸番号４２が（チロシン残基の代わりに）アルギニン残基に、そしてβグロビンタンパク質のアミノ酸番号９９が（アスパラギン酸残基の代わりに）グルタミン酸残基に変わった変異を保有するαｐβ構築物　（図ＩＸ）：および（ｘｘｉｉｉ）αグロビンタンパク質のアミノ酸番号４２が（チロシン残基の代わりに）リシン残基に、モしてβグロビンタンパク質のアミノ酸番号９９が（アスパラギン酸残基の代わりに）グルタミン酸残基に変わった変異を保有するαｐβ構築物（図ＩＹ）。

上記の組換え核酸構築物は、例えばＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９゜Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

Ｎ、　Ｙ、に記載されているような、当分野で既知の方法を用いて、増幅のため、適当なプラスミド、バクテリオファージまたはウィルスベクターのいずれにでも挿入し、そして増殖させることができる。下記の実施例においては、ＰＵＣベクター（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎｅｔ　ａｌ、、１９８５．　Ｇｅｎｅ　１０３−１１９）が利用された。

トランスジェニックブタの作製のためには、構築物を直鎖状化する口とが望ましい。ベクター配列は除去する方が望ましい。

５、　２．　ｌ−ランスジェニックブタの作製トランスジェニックブタを作製するためには、上記の組換え構築物を、マイクロインジェクション、赤芽幹（Ｅ　Ｓ）細胞操作法、エレクトロポレーション、セルガン、トランスフェクション、トランスダクション、レトロウィルス感染その他を含む当分野で既知の方法のいずれによっても使用することができるが、これに限定されるわけではない。各種構築物は個別にまたは２種またはそれ以上の構築物のグループとして導入することができる。

本発明の好ましい特定の態様として、下記第６節の実施例で述べる方法によって、トランスジェニックブタが作製される。簡単に述べると、性的に成熟した若い未妊娠の雌ブタ（〉７力月令）に、１２から１４日間活性プロゲストゲン（アリルトレンボロン（ａｌｌｙｌ　ｔｒｅｎｂｏｌｏｎｅ）、Ａ　Ｔ　：　１５ｍｇ／ブタ／日）を経口的に与えることにより、発情期を一致させる。ＡＴ投与の最終日、８時および１６時に、すべての雌ブタに、プロスタグランジンＦ２．（ルタジーゼ（Ｌｕｔａｌｙｓｅ）　：　１０ｍｇ／　１注射）を筋肉注射（ＩＭ）する。

ＡＴ摂取の最終日の２４時間後、すべてのドナー雌ブタに、妊娠した雌ウマの血清ゴナドトロピン（ＰＭＳ　Ｇ　：　１５００Ｉ　Ｕ）を１回ＩＭ注射する。ＰＭＳＧ後８０時間目、すべてのドナーにヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ＨＣＧ　：　７５０　Ｉ　Ｕ）を投与する。

ＡＴ中止後、ドナーおよびレシピエンド雌ブタを、１日２回成熟雄ブタを使って、発情のサインをチェックする。ＨＣＧ投与後３６時間以内に発情を示したドナーに、発情の始まりから１２時時間表２４時間目に、（それぞれ）人工および自然受精によって妊娠させる。

ＨＣＧ投与後５９から６６時間の間に、以下の操作を使用して、妊娠したドナーから手術によって、■および２細胞卵を取り出す。

耳部末梢静脈を通じて、アセプロマシン０．５ｍｇ／体重１ｋｇおよびケタミノ１．３ｍｇ／体重１ｋｇの投与によって全身麻酔を行なう。麻酔に続いて、腹部中心開腹手術によって、生殖管を露出させる。

引き伸ばしたガラスカニユーレ（外径５ｍｍ、長さ８　ｃｍ）を卵管孔に挿入し、絹糸１本（２−０）でロート部に固定する。卵管連結部の２ｃ＋ｎ前方の卵管の内腔中に２０ｇ針を挿入することにより、卵を逆方向に流しだす。０．４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充した無菌ダルベツコリン酸緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）を卵管内に注入し、ガラスカニユーレの方に流す。内液を１７ｘｌｏｏｍｍ滅菌ポリスチレン管に集める。流出液をｌＯｘ６０ｍｍのペトリ皿に移し、ワイルド（Ｗｉｌｄ）　Ｍ３立体顕微鏡を使用して、低倍率（５０Ｘ）で探索する。

すべての１または２細胞卵を１．５ＸＢｓＡを補充したプリンスター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ）改変卵培養−３液（ＢＭＯＣ−３）で２回洗浄し、油の下のＢＭＯＣ −３の５０μｌ液滴中に移す。マイクロインジェクションを実施するまで、卵を３８℃、９０％Ｎ２．５％Ｏ７，５％ＣＯ２雰囲気下で保存する。

１または２細胞卵を、１．５％ＢＳＡを補充したＨＥＰＥＳ培養液１ｍｌを含むエッペノドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　）管中に入れ（ｌ管あたり１５卵）、１細胞卵中の前核および２細胞卵中の核を可視化するため、１４０００　ｘ　ｇで６分間遠心する。さらに、卵を陥凹スライド上の油上ＨＥＰＥＳ培地５−１Ｏμ ｌ液滴中に移す。ノマルスキ（Ｎｏｍａｒｓｋｉ）光学系およびライフ（Ｌｅｉｔｚ）ミクロマニピュレーターを備えたラボ−ルー（Ｌａｂｏｒｌｕｘ）顕微鏡を使用して、マイクロインジェクションを行なう。ＤＮＡ構築物　（トリス−ＥＤＴＡ緩衝液１μ！あたり約１ｎｇの濃度で直鎖状化）１０−１７００コピーを１細胞卵中の１つの前核または２細胞卵中の両方の核中に注入する。

マイクロインジェクションされた卵は、適当なレシピエンドに移される前に、油上のＢＭＯＣ−３培養液の微小液滴内に戻し、３８℃、９０％Ｎ２．５％ＣＯ２，５％０２雰囲気下に保持する。卵は好ましくは摘出後１０時間以内に移入される。

ドナーと同日または２４時間後に発情を示すレシピエンドのみを胚の移入に使用することが望ましい。レシピエンドを、前述したように麻酔する。１つの卵管を外に出した後、注入を受けた１および／または２細胞卵を少なくとも３０個と対照卵４−６個を、以下の方法によって移入する。２１ｇｘ３／４のバタフライ注入セ・ントから管をＩＣＣの注射器に接続する。卵と１−２ｍ１のＢＭＯＣ−３培養液とを管中に吸引する。さらにその管を卵管孔に通し、先端が卵管の下方３分の１または狭窄部に達するように入れる。管をゆっくり引抜くとともに、卵が発射される。

生殖管の露出部分を、無菌の１０％グリセロール−０，９％生理食塩水に浸し、体腔中に戻す。白線（Ｉｉｎｅａ　ａｌｂａ）を取り囲む結合組織、脂肪および皮膚を３つの層に分けて縫合する。白線を閉じるのに、連続したハルステッド（Ｈａｌｓｔｅａｄ）縫合法を使用することができる。脂肪および皮膚はそれぞれ単純な連続マツトレス縫合によって閉しる。そして切開部位に、局所抗菌剤（例えばフラジリドン（Ｆｕｒａｚｏｌｉｄｏｎｅ））を投与する。

レシピエンドはおよそ４つのグループに分け、標準１６％粗タンパク質のコーン −大豆ペレット飼料１．８ｋｇを与える。１８日目（０日月−発情の開始）から、成熟雄ブタを使って、すべてのレシピエンドの発情のサインを毎日チェックする。３５日目に、超音波を使用して妊娠の検査を実施する。妊娠１０７０７日目レシピエンドを分娩施設に移動させる。分娩時に確実に立ち合うため、妊娠１１２１２日目時および１４時にプロスタグランジンＦ２＝（１回の注射あたりｌＯｍｇ）を投与して、分娩を促進する。レシピエンドのすべての場合において、Ｐ　Ｇ　Ｆ　２ａの投与後３４時間以内に分娩がおこると予想される。

出生後２４時間目に、すべての子ブタは次の処置、すなわち耳に切り込みを入れる、とがった歯を切る、ｌＣＣのデキストラン鉄を投与する、その他の処置を受ける。尾部の生検および血液も各ブタから採取する。

この方法によって作製したブタは下記第６節の実施例に述べられ、そして図２に示される。これらのブタは健康であり、貧血ではなく、そして同腹の非トランスジェニックブタと同程度の成長をしている。これらのブタはそのトランスジーンをその子孫に遺伝させるものと考えられる。

ある特定の性質を有するブタはヒトヘモグロビンの製造に特に有用である；こうしたブタの例として本発明の特定の好ましい、しかしこれに限定するわけではない態様を以下に示す。

本発明の好ましい具体例の１つによれば、トランスジェニックブタはすくなくとも２０コピーのグロビントランスジーンを含む。

２番目の具体例によれば、高度（ａｌｔｉｔｕｄｅ）　、酸素濃度、妊娠、ヘモグロビンの変異型の存在その他の要因を考慮して、本発明のトランスジェニックブタの全血のＰ　ｓｏは、同様の非トランスジェニックブタのＰｓｏよりも少なくとも１０％増大している。こうして、本発明はヒトグロビントランスジーンを保有および発現し、そのトランスジェニックブタの全血のＰ、。は、同高度において、同様の妊娠していない非トランスジェニックブタのＰｓｏよりも少なくとも１０％大きい、非妊娠トランスジェニックブタを提供する。

他の好ましい特定の態様において、本発明は産生されるヒトグロビン量が総ヘモグロビンに対して、少なくとも２％、より好ましくは少な（とも５％、最も好ましくは少なくとも１０％であるトランスジェニックブタを提供する。

下記第６節に、本発明の好ましい、しかし限定しない具体例として、トランスジェニックブタについて記載する。

（本頁以下余白）５．３．ヒトヘモグロビンの調製とそのブタヘモグロビンからの分離本発明は、少なくとも一部の血液細胞内でヒトヘモグロビンを発現するトランスジェニックブタをつくりだすために、適切な１以上のプロモーターの制御下で、ヒトアルファグロビンやヒトベータグロビン遺伝子のようなヒトヘモグロビンをコードする１つまたは複数のトランスジーンをブタの遺伝物質内に導入することからなるヒトヘモグロビンの産生方法を提供する。

本発明はまた（１）少なくとも一部の赤血球内でヒトヘモグロビンを発現するトランスジェニックブタをつくり出すために、適切な１以上のプロモーターの制御下で、ヒトアルファグロビンならびにヒトベータグロビン遺伝子をブタの遺伝物質へ導入すること；　（ｉｉ）　トランスジェニックブタから赤血球を収集すること；　（ｉｉｉ）溶解物を形成するために収集した赤血球の内容物を放出させること：　（ｉｖ）赤血球溶解物をヒトヘモグロビンをブタヘモグロビンから実質的に分離する精製工程にかけること；および（Ｖ）精製したヒトヘモグロビンを含有する画分を回収することからなるヒトヘモグロビンの産生方法を提供する。こうした画分は適切な標準方法と平行して等電点電気泳動法により同定することができる。

本発明の好ましい実施態様では、ヒトヘモグロビンがＤＥＡＥアニオン交換カラムクロマトグラフィーによってブタヘモグロビンから分離される。

上記のトランスジェニックブタからヒトヘモグロビンを調製するために、赤血球がなんらかの当業界の技術によってブタから得られる。赤血球はその後、蒸留水のような低張液での溶血を含む任意の方法、または１９８１年にＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ　７６に記述された技術および／もしくは接線流動濾過法を用いて溶解される。

ヒトヘモグロビンが特定のトランスジェニックブタから産生されているかどうかを確認するためには、例えば、標準技術を用いる焦点電気泳動といった小規模な溶血物の電気泳動法による分析を行なうことが有用であろう。

これとは別に、または大規模な精製用に、ヒトヘモグロブリンはイオン交換クロマトグラフィーによってブタヘモグロブリンから分離することができる。意外なことには、第７節で考察するように（下記参照）、ヒトヘモグロビンはイオン交換クロマトグラフィーを用いるとブタヘモグロビンから容易に分離することが観察されたが、一方、マウスヘモグロビンとヒトヘモグロビンとはこのような方法によって分離することができなかった。ＤＥＡＥ樹脂により達成された分離に匹敵し得るヒトおよびブタのヘモグロビン分離が得られることを条件として、ジエチルアミノエチルを含む樹脂、Ｑ−セファ０−ス、ＱＣＰＩ（１，Ｂ、　Ｆ、　）、セファ−（Ｚｅｐｈｙｒ）、スフエロデックス（Ｓｐｈｅｒｏｄｅｘ）、エクチオラ、カルボキシメチルセルロース等を含むがしかしそれらに限定されない当業界において知られ、あるいは開発されるいかなるイオン交換樹脂でも利用することができる。

本発明の特定の、しかし限定されない実施態様によれば、実質的に純粋なヒトへモグロビンを産生ずるためにブタヘモグロビン（ヒト／ブタへモグロビンハイブリッドを含む）からヒトヘモグロビンを分離するには、上記のように調製されたトランスジェニックブタの赤血球溶血物を、ｐＨ７，８の０．２Ｍグリシン緩衝液で平衡化したＤＥＡＥアニオン交換カラムにかけ、０．２Ｍグリシンｐ８７．８１５＋ｎＭ　ＮａＣ１て洗浄したのち５−３０　ｍＭ　ＮａＣ１勾配またはその同等物で溶出させる（例えば、下記第９節参照）。意外にも、ヒトおよびブタのグロビン鏡開の相同性がほぼ８５パーセントであるにも拘らず、こうした処理を行なうとヒトとブタのヘモグロビンは難なく分離し、ヒトヘモグロビンはブタヘモグロビンよりも早く溶出する。溶出は、連続画分から分取したアリコートの４０５　ｎｍでの光学密度および／もしくは電気泳動処理によってモニターすることができる。ブタとヒトのグロビン鏡開に形成されたヘテロダイマーからなる四量体のヘモグロビンは、ブタヘモグロビンと同様に、この方法によってヒトヘモグロビンから分離することができる。トランスジェニックブタにおいて産生され、この方法によってブタヘモグロビンから分離されたヒトヘモグロビンは、ヒトの天然ヘモグロビンに類似した酸素結合能力を有している。

本発明の、もう１つの限定されない実施態様によれば、ヒトヘモグロビンは、下記のようにＱＣＰ　ｌイオン交換樹脂を用いるとブタヘモグロビン（ヒト／ブタヘモグロビンハイブリッドを含む）から分離できる。

トランスジェニックブタの赤血球から調製されたヘモグロビン約１０　ｍｇを緩衝液Ａ（緩衝液　Ａ＝１０ｍＭ　トリス、２００１Ｍグリシン、ｐＨ７，５）　２０　ｍｌ中に希釈する。このサンプル２０ｍ１をそのあと毎分約５ｍｌの流速で、緩衝液Ａで平衡化されたＱＣＰＩカラム（１０ｍｌ）に負荷する。その後、カラムを２倍容量の緩衝液入で、さらにそのあと２０カラム容量の０−５０　ｍＭ　ＮａＣ１勾配（１０カラム容量の緩衝液Ａ　＋　１０カラム容量の１０ｍＭトリス、２０　ｍＭグリシン、５０　ｍＭ　ＮａＣ１、ｐＨ７，５）　、もしくは代替的に、６カラム容量の１０ｍＭトリス、２０　ｍＭグリンジン１５　ｍＭ　ＮａＣ１，ｐＨ７，５で洗浄し、分離されたヘモグロビンを得るために画分０．Ｄ、２．、吸収物質を収集し、ヒトヘモグロビンを適切な標準方法、例えば等電点電気泳動法によって同定する。ＱＣＰ　ｌカラムは２カラム容量のｌＯｍＭ）リス、２０　ｍＭグリシン、ｌ　Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ７，５による溶出で清浄化する本発明は、また本質的に精製し分離されたヒト／ブタノ１イブリントヘモグロビン、特にヒト／ブタノ１イブリントヘモグロビンを提供する。ブタα／ヒトβハイブリッドは、再結合実験においてｉｎ　ｖｉｔｒｏでも、トランスジェニックブタにおいてｉｎ　ｖｉｖｏでも、その形成が観察されていない。

本発明は、ハイブリッドヘモグロビンとその血液代替品としての利用、ならびに適切な薬理学的担体中に本質的に精製され、分離されたヒト／ブタハイブリッドヘモグロビンを含む医薬組成物を提供する。

ハイブリッドヘモグロビンは、本文中に記述されているようにトランスジェニックブタから調製されたのち、クロマトグラフィー、免疫沈降あるいは当業者に知られている他の任意の方法によ゛って精製される。ハイブリッドヘモグロビンを分離する等電点電気泳動法の使用は図３および図５に示しである。

また、ハイブリッドヘモグロビンはその後に適切な微生物や細胞またはトランスジェニック動物おいて発現されるヒトおよびブタ双方のグロビン配列を含む核酸構築物を用いて調製することができる。例えば、適切なプロモーターの制御下で、ヒトαおよびブタβグロビン遺伝子を含む核酸構築物を発現させると、結果的にハイブリッドヘモグロビンが得られる。特定の例として、サイトメガロウィルスプロモーターの制御下にあるヒトαおよびブタβグロビン遺伝子をＣＯ８細胞のような哺乳動物の細胞内にトランスフェクトすることが可能であり、ハイブリッドヘモグロビンはこうした細胞から回収することができる。また、このような構築物は酵母または細菌において発現させることができる。

ハイブリッドヘモグロビンは、例えば、ポリエチレングリコールと連結したり、あるいは膜内に、例えばリポソーム内にヘモグロビンをカプセル化することによって修飾して、非免疫原性とすることが望ましいかもしれない。

トランスジェニックブタを作製するため、下記のように構築物１１６（ααβ構築物）　、１８５　（αｐβ構築物）もしくは２６３（αｐδ構築物）をブタの卵内にマイクロインジェクションした。

６．１．２．トランスジェニックブタの作製経口的に活性なプロゲストゲン（アリルトレンボロン、ＡＴ：　１５ｍｇ／雌ブタ７日）を性的に成熟した雌ブタ（〉月令７ケ月）に１２日から１４日間投与し、発情期を同時性とした。ＡＴ投与の最終日、８時および１６時に雌ブタはすべてプロスタグランジンＦｔ−（ルタジーゼ、Ｌｕｔａｌｙｓｅ：　１０　ｍｇ／注射）の筋向注射（ＩＭ）を受けた。ＡＴ摂取最終日の２４時間後、雌ブタのドナーはすべて、妊娠した雌ウマ血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ：　１５００１１Ｊ　）の１回ＩＭ注射を受けた。ヒトの絨毛膜ゴナドトロピン（ＨＣＧ：　７５０１Ｕ）をＰＭＳＧ投与の８０時間後すべてのドナーに投与した。

ＡＴ中止後、ドナーとレシピエンドの雌ブタは、成熟雄ブタを使って１日に２回発情徴候の有無を調べた。ＨＣＧ投与３６時間以内に発情を示したドナーは、発情の始まりから１２時間と２４時間後に（それぞれ）人工受精と自然受精により妊娠させた。

ＨＣＧ投与５９時間および６６時間後の中間に、下記の処理を行なって、妊娠したドナーより１および２細胞卵を外科的に回収した。

末梢耳静脈より体重１ｋｇ当たりアセプロマシン０．５ｍｇとケタミン１．３ｍｇを投与して全身麻酔を行なった。麻酔後、中腹部の開腹術により生殖管を体外に取り出した。延伸したガラスカニユーレ（外径５　ｍｍ、長さ８　ｃｍ　）を卵管の小孔に挿入し、１本の縫合絹糸（２−０）を用いロート部に固定した。卵は、子宮卵管連結部から２　ｃｍ前方の卵管内腔に２０　ｇ針を挿入して逆行的な方法で流し出した。０．４Ｘウシ血清アルブミン（ＢＳＡ　）を添加したダルベツコの無菌リン酸緩衝生理食塩水を卵管に注入し、ガラスカニユーレの方向に流した。内液を１７　ｘ　１００　ｍｍの無菌ポリスチレン管に収集した。流出液を１０　ｘ　６０　ｍｍのベトリ皿に移し、ワイルドＭ３立体顕微鏡を用い低倍率（５０ｘ）で検査した。■および２細胞卵はいずれも１．５Ｘ　ＢＳＡを補充したプリンスターの改変卵培養−３液（ＢＭＯＣ−３）で２回洗浄し、油の下のＢＭＯＣ−３培養液の５０μｌ液滴に移した。卵は、マイクロインジェクションを行うまで９０％Ｎ２．５ｘＯ□、５％Ｃ０２ノ大気中、３８°Ｃで保存した。

１および２細胞卵は、１．５％ＢＳＡを補充したＨＥＰＥＳ培養液１ｍｌを含むエツベノドルフ管（ｌ管当たり卵１５個）に入れ、１細胞卵では前核を、２細胞卵では核を可視化するため１４０００　ｘ　ｇで６分間遠心分離した。卵はその後陥凹スライド上の油上のＨＥＰＥＳ培養液の５−１Ｏμｍ液滴に移した。ノマルスキーの光学部品とライフのマイクロマニピュレーター２個を装備したＬａｂｏｒｌｕｘ顕微鏡を用いてマイクロインジェクションを行なった。ＤＮＡ構築物（ｌｎｇ／ｌμｌ　トリス−ＥＤＴＡ緩衝液）の１０−１７００コピーを、ｌ細胞卵では１個の前核に、２細胞卵では両方の核に注入した。

マイクロインジェクションを施した卵は、適切なレシピエンドへの移入に先立って、油上のＢＭＯＣ−３培養液の微小液滴に戻し、９０％Ｎ７．５％Ｃ０２，５九〇□の大気中、３８℃で保存した。卵は回収後１０時間以内に移入した。

ドナーと同じ日もしくはドナーより２４時間遅れて発情を示したレシピエンドだけを胚の移入に利用した。レシピエンドには前記のように麻酔を施した。１つの卵管を体外に取り出したのち、少なくとも３０個の注入したｌおよび／もしくは２細胞卵と４−６個の対照卵とを下記の方法で移入した。２１　ｇ　ｘ　３／４バタフライ注入セツトのチューブを、１　ｃｃの注射器に連結した。卵とＢＭＯＣ−３培養液１２　ｍｌをチューブ内に吸引した。そのあとチューブは、先端が卵管の下方１／３もしくは卵管狭窄部に達するまで、卵管の小孔を通して送り込んだ。引き続いて、チューブをゆっくりと引き抜くとともに卵を排出させた。

生殖管の露出した部分は、無菌の１０％グリセロール−０，９％生理食塩水に浸してから体腔に戻した。白線を取り囲む結合組織、脂肪および皮膚を３つの個別な層として縫合した。ハルステッドの連続縫合により白線を閉鎖した。脂肪と皮膚とは、それぞれ単純な連続マツトレス縫合によって閉じた。そのあと局所抗菌剤フラジリドン（Ｆｕｒａｚｏｌｉｄｏｎｅ）を切開部に投与した。

レシピエンドを４群に分は標準的な１６％粗タンパク質コーン−大豆ペレット飼料１．８ｋｇを与えた。１８日目（Ｏ日間−発情の開始日）から、成熟した雄ブタを使って、レシピエンドについて発情徴候の有無を毎日チェックした。３５日目に超音波を用い妊娠の検出を行なった。妊娠１０７０７日目レシピエンドを分娩設備に移した。分娩時に間違いなく立ち合うため、妊娠１１２１２日目時と１４時にプロスタグランジンＦ２−　（１０ｍｇ／注射）を投与して分娩を誘発した。いずれの場合も、レシピエンドはＰＧＦ、、投与後２４時間以内に分娩した。

出生２４時間後にすべての子ブタを処理し、すなわち、耳に刻み目をつけ、とがった歯を切り、デキストラン鉄１　ｃｃを投与するなどした。それぞれのブタから、尾部の生検と血液採取をも行注入した卵３５６６個のうち、ヒトヘモグロビンを発現した１３匹のトランスジェニックブタが出生したが、このうちの２匹は、それらがトランスジェニックブタであった事実とは全く無関係な通常の飼育に関連した事故によって、出生後間もなく死亡した（表１）。残りの１１匹は健常なようであった。トランスジェニック１２１匹の写真を図２に提示しである。ブタのプロフィールおよび産生されたその「真正」と「ハイブリッドｊヒトヘモグロビン（ＨＢ）の百分率に関するプロフィールは表ＩＩに掲げである（下記参照）。ヘモグロビンの総量は、ヒトαβに、ヒトαブタβハイブリッドの１７２を加えた合計として算出した。図３は、これらのブタのうち３匹（Ｎｏ、１２−１．９−３ならびに６−３）によって産生されたヘモグロビンの等電点電気泳動法とトリトン酸尿素ゲルの結果を示しており、これらの動物におけるヒトアルファおよびベータグロビンの発現を実証している。

表１トランスジェニックブタ作製の効率ヒトヘモグロビン遺伝子構築物パラメーター　２２の治験後の合計収集した卵の合計　８２７６受精した卵の合計　７１５６注入した卵の合計　３５６６移入した注入卵　３５６６移入した対照卵　２７９使用したレシピエンド　１０４生まれたブタ（雄、雌）　２０８．３３２トランスジエニツク（雄、雌）　８．５（０，３６）“発現件数　１３ ”　トランスジェニックブタへ発生した注入卵の比率（トランスジェニック１３個／注入卵３５６６個）表ＩＩＩは、Ｆ１世代のトランスジェニックブタカ（ヘモグロビンを発現し得ることを示すブタＮｏ、９−３の子孫↓こ関するプロフィールを表す。注目すべき点は、ブタＮｏ、　６−３のどの子孫もトランスジェニックでなく、動物の生殖組織中にトランスジーン力く存在しなかった可能性が明らかになったことである。

表■　ブタ９−３のＦｌ（子） ’　９−３−２は出生後のその日に死亡した。

トランスジェニックブタの出土時体重は、非トランスジェニックな同腹の子の体重にほぼ等しかった。トランスジェニックブタが成熟しても、その体重は依然として対照動物の体重に匹敵し得るものであった。

精Ｖには、エッペノドルフの微量遠心機を用い、５０００　ｒｐｍテ３分間遠心分離を行い赤血球を収集し、等量（もとの血液）の０．９％ＮａＣｌで３回洗浄した。赤血球は１．５容量の脱イオン化したＨ２Ｏで溶解し、１５．００ｏ　ｒｐｍで遠心したのち、上澄液をアニオン交換り０７トグラフイーで分画した。Ｗ、　Ａ、　５ｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＴ、　Ｈ，Ｊ。

Ｈｕｉｓｍａｎの「ヘモグロビンのクロマトグラフィーＪ　Ｄｅｋｋｅｒ、　ＮｅｗＹｏｒｋ、　ｐｐ、　７４−７７に従って、ＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィー（Ｗｈａｔｍａｎ、　ｌ、ｔｃｌ、製造のＤＥ−３Ｅ）を行なった。上記の赤血球溶血物０．２５ｍ１を、予め０．２ＭグリシンｐＨ７，８で平衡化した１　ｃｍｘ　７　ｃｍ　ＤＥ−５２カラムにかけ、５カラム容量の０．２ＭグリシンｐＨ７゜８　／　５　ｍＭ　ＮａＣ１で洗浄した。ヘモグロビンは２００ｍ１の５−３０　ｍＭ　ＮａＣ＋／　０．２　Ｍグリシン、ｐ）１７．８の勾配で溶出させた。ブタヘモグロビンノ溶出を完了するために、５０５０−１Ｏ０の３０　ｍＭ　ＣａＣｌ／グリシンｐＨ７，８をカラムに追加した。ヘモグロビンの溶出は、４１５　［１１Ｍの吸収とカラム分画のＩＥＦ分析とによってモニターした。

７、１．２．　グロビン鎖の再結合グロビン鎖の再結合を、本質的に、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　７６＋１２６−１３３に記述されたように行なった。２５ラムダのブタ血液、２５ラムダのヒト血液もしくは１２．５ラムダのヒト血液と１２．５ラムダのブタ血液の２５ラムダ混合液を下記のように処理した。

血液は、微量遠心機の設定５で２分間遠心して、ベレットにしたのち、１００ラムダの０．９Ｘ　ＮａＣ１で３回洗浄した。細胞を５０ラムダのＨ２Ｏで溶解したのち、溶血を確実するため高速で回転させた。

５０ラムダの溶解細胞を５０ラムダの０．２Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４゜５と混合してから氷上に置き、低温の室内で一夜インキユベートした。■。９ｍｌの０．　ｌ　Ｍ　ＮａＨｔＰＯ＜　、ｐＨ７，４を加え、それぞれのサンプルを、残りが約０．５ｍｌになるまで４℃、５にでセントリコン管内で回転させた。そのあと、１ｍｌの０．Ｉ　Ｍ　ＮａＨｚＰＯｌ、ｐＨ７，４を加えたのち、残りが約０．２ｍｌになるまで約５にで回転させた。その後、ヘモグロビンをセントリコン管の壁から洗い、エッペノドルフアダプターを取り付け、卓上用の微量遠心機を用いてセントリコン管から各サンプルを取り出した。サンプルはそのあと等電点電気泳動法で分析した。

ヒトおよびブタの血液を等しい比率で混合し、溶解したのち、得られた溶血物を上記のようなりＥＡＥクロマトグラフィーにかけた。

図４Ａに示すように、ブタヘモグロビンは事実上、完全にヒトヘモグロビンから分離された。この完全な分離は、ヒトとブタのヘモグロビン間にみられる構造的な類似性に照らして意外である。

ブタとヒトのアルファグロビン鎖は８４．４％相同性であり、ブタとヒトのベータグロビン鎖は８４．９％相同性である。また更に、図４０に示されているように、ヒトとマウスの血液を混合し、溶血し、第７．１．１．節（上記参照）に述べられている方法に従い、ＤＥＡＥカラムにかけ、そして溶出した場合、マウスとヒトのアルファグロビン鎖が約８５．８％相同性であり、マウスとヒトのベータグロビン鎖が８０．１％相同性である事実にも拘らず、ヒトとマウスのヘモグロビンの分離が観察されなかったのは意外である。ＤＥＡＥ樹脂でのヒトとブタのヘモグロビンの分離が容易なのは効率的かつ経済的であるように思われる。

興味深いことに、アニオン交換カラムからタンパク質が溶出する順位は、予想した通りではなかった。ＩＥＦゲルから推定したタンパク質の相対的なｐｉに基づくと、予想された溶出順位は、最初がハイブリッド（ヒトα／ブタβ）で、真正のヒトα／ヒトβがそれに続くであろう。従って、アニオン交換カラムから最後に溶出するのは、内因性のブタα／ブタβタンパク質であろう。しかしながら、今回試みたあらゆる条件下で、溶出の順位はヒトヘモグロビンが最初に溶出するように変更された。二番目のピークはハイブリッドの濃縮画分であり、その後非常に接近してブタヘモグロビンがこれに続いた。

（上記の第６節に記載されるように）トランスジェニックブタ６−３から採取した血液を、低張膨潤によって溶解し、その結果得られた溶血産物を上述のようにＤＥＡＥクロマトグラフィーにかけた。図４Ｂに示されているように、ヒトヘモグロビンをブタヘモグロビンから、またヒトαグロビン／ブタβグロビン異種ヘモグロビンから分離した。図４Ｄで示しているように、ヒトヘモグロビンはこの方法によって実質的に精製された。

ブタアルファグロビンとヒトベータグロビン鏡開の異種結合は、ヒトのヘモグロビンを発現するトランスジェニックブタから得られた溶血産物中に検出されなかった。しかし、このような観察は、比較的低いレベルのヒトベータグロビンの発現によって説明できる可能性があった。また、ブタアルファグロビンとヒトベータグロビンとの間の結合は、化学的に好ましくないようである。この可能性を探求するために、ブタとヒトのヘモグロビンを混合し、解離したのち、グロビン鎖を再び結合させる再結合実験が行なわれた。図５に示しである等電点電気泳動ゲルにおいて明らかなように、ブタα／ブタβ、ヒトα／ヒトβならびにヒトα／ブタβの結合が観察されたのに、ブタαグロビンとヒトβグロビンとの間には結合が起こらなかったよってある。従って、ブタα／ヒトβ異種ヘモグロビンが、トランスジェニックブタからのヒトヘモグロビンの精製を複雑化すると予想すべきではない。

トランスジェニックブタ６−３から澄明化された溶血物１３　ｍｇ／ｍｌ：緩衝液Ａ：　ｔｏ　ｍＭ　トリス、２０　ｍＭグリシンｐＨ７，５；緩衝液Ｂ・ＩＯｍＭ）リス、２０　ｍＭグリシン、１５　ｍＭ　ＮａＣ１ｐＨ７，５；緩衝液Ｃ：１０ｍＭトリス、２０　ｍＭグリシン、Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１ｐＨ７，５；緩衝液Ｄ＝１０ｍｌｌリス、２０　ｍＭグリシン、５０　ｍＭ　ＮａＣ１ｐＨ７，５；緩衝液Ａ中で平衡化したＱＣＰ　Ｉカラムｌｏｍｉ；トリス精製系。トランスジェニックブタ６−３から調製したヘモグロビン１０　ｍｇを、緩衝液Ａ　２０ｍ１で希釈した。サンプル２０　ｍｌを流速５　ｍｌ／ｍｉｎでＱＣＰ　Ｉカラムに負荷し、２カラム容量の緩衝液Ａで洗浄した。そのあとカラムは２０カラム容量の０−５０　ｍＭ　ＮａＣ１勾配で洗浄した。（１０カラム容量の緩衝液Ａ　＋　１０カラム容量の緩衝液Ｄ）ならびにＯ，Ｄ、　２　ｓ。吸収物質を収集した。そのあとカラムは２カラム容量の緩衝液Ｃて清浄化したのち、２カラム容量の緩衝液Ａで再平衡化した。

８．２．　結果Ｕ■トレース（ピーク対勾配量）（図６）の分析は、ヒトヘモグロビンが１５　ｍＭ　ＮａＣ１て溶出されたことを明らかにした。ヒトヘモグロビンを溶出するため、勾配ではなく６カラム容量の緩衝液Ｂ　（１５ｍＭ　ＮａＣ１）のみを用いる、上記と同じプロトコールを使用して、引き続いて精製を行なった。更に、この方法でクロマトグラフィーを行なった非トランスジェニックブタは、緩衝液ＢによりＱＣＰ　［から溶出しないが、天然のヒトヘモグロビンは溶出する。

１５　ｍＭ　ＮａＣｌで溶出したタンパク質を分解等電点電気泳動装置で分析したところ、このタンパク質はブタヘモグロビンまたは）＼イブリッドヘモグロビンの混入していない本質的に純粋なものであることが分かった。

９、実施例：ヒトアルファ／ブタベータグロビンハイブリノドヘモグロビンは増大したＰｓｏを示す表ＩｌとＩＩＩに示しであるように（上記参照）、本発明のトランスジェニックブタはいずれも有意な量のヒトα／ブタβグロビンハイブリッドヘモグロビンを産生ずることが分かった（ブタα／ヒトβハイブリッドは観察されなかった）。

より高い百分率でハイブリッドを発現したブタもまたその全血に関して、上昇したＰ　ｓｏ値を示すよってあった（図７）。

各種の出版物を本文中に引用したが、その明細はすべて参照によってここに完全に組み込まれるものとする。

□ コ□ ：：Ｘｌ−１− ＋：１１１ＦＩＧ、　２ＦＩＧ、　３ＡＦＩＧ、　３８ −　−−ユ、−−−１−■−一−１）ＦＩＧ、　４Ｂ工」＋ｐＦＩＧ、　５０２　（ｍｍ　ｏｆ　Ｈｇ）Ｆｆ’６．７Ｂフロントページの続き（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ）、ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ。

ＫＲ，ＬＫ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　Ｉ￥Ｏ，ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ、５Ｄ（７２）発明者　ホルッマン、ステイーブンアメリカ合衆国　０８５５０　ニューシャーシー州　プリンストン　ジャンクション、シェアプルツク　ドライブ　１５（７２）発明者　オードネル、ジェイ、ケヴインアメリカ合衆国　１９８０１　ペンシルバニア州　ドイルスタウン、ハース　ブレイス（７２）発明者　ビルダー、ステファン　エイチ。

アメリカ合衆国　０８５３６　ニューシャーシー州　プレインズポロー、ラヴエンズ　フレスト　ドライブ　６３−１０（７２）発明者　ピンカート、カール　エイ。

アメリカ合衆国　３５０２３　アラバマ州　バッセマー、レイクモント　ドライブ　１９９８（７２）発明者　スワンソン、マーク　イー。

アメリカ合衆国　０７０３４　ニューシャーシー州　レイク　ヒアワーサ、レイク　ショア　ドライブ　１４（７２）発明者　ケラ−、ヒラジーアメリカ合衆国　０８５３６　ニューシャーシー州　プレインズポロー、クワイル　リッジ　ドライブ　３６１３

Claims

【特許請求の範囲】１．（ｉ）ヒトαグロビンをコードする核酸構築物を含み、かつ（ｉｉ）少なくとも一部の赤血球においてヒトαグロビンを発現するトランスジェニックブタ。２．（ｉ）ヒトαグロビンをコードする核酸構築物およびヒトβグロビンをコードする核酸構築物を含み、かつ（ｉｉ）少なくとも一部の赤血球においてヒトα グロビンとヒトβグロビンを発現するトランスジェニックブタ。３．（ｉ）ヒトαグロビンとヒトβグロビンをコードする核酸構築物を含み、かつ（ｉｉ）少なくとも一部の赤血球においてヒトαグロビンとヒトβグロビンを発現するトランスジェニックブタ。４．核酸構築物がＬＣＲα構築物である、請求項１記載のトランスジェニックブタ。５．核酸構築物がＬＣＲαおよびＬＣＲεβ構築物である、請求項２記載のトランスジェニックブタ。６．核酸構築物が図１Ａに示した１１６梼築物である、請求項３記載のトランスジェニックブタ。７．核酸構築物が図１Ｂに示した１８５構築物である、請求項３記載のトランスジェニックブタ。８．核酸構築物が図１Ｃに示したβｐα構築物である、請求項３記載のトランスジェニックブタ。９．核酸構築物が図１Ｆに示したヘモグロビン・ヨシズカ（Ｙｏｓｈｉｚｕｋａ）構築物である、請求項３記載のトランスジェニックブタ。１０．核酸構築物が図１Ｇに示したヘモグロビン・プレスビテリアン（Ｐｒｅｓｂｙｔｅｒｉａｎ）構築物である、請求項３記載のトランスジェニックブタ。１１．核酸構築物が図１Ｈに示したαｐβ（Δα）構築物である、請求項３記載のトランスジェニックブタ。１２．核酸構築物が図１Ｉに示した２２７構築物である、請求項３記載のトランスジェニックブタ。１３．核酸構築物が図１Ｊに示した２２８構築物である、請求項３記載のトランスジェニックブタ。１４．ヘモグロビン・ボログナ（Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　Ｂｏｌｏｇｎａ）構築物が図１Ｎに示した２２８構築物である、請求項３記載のトランスジェニックブタ。１５．核酸構築物が図１Ｏに示した３１８構築物である、請求項３記載のトランスジェニックブタ。１６．核酸構築物が図１Ｐに示した３１９構築物である、請求項３記載のトランスジェニックブタ。１７．核酸構築物が図１Ｑに示した３２９構築物である、請求項３記載のトランスジェニックブタ。１８．核酸構築物が図１Ｒに示した３３９構築物である、請求項３記載のトランスジェニックブタ。１９．核酸構築物が図１Ｓに示した３４０構築物である、請求項３記載のトランスジェニックブタ。２０．核酸構築物が図１Ｔに示した３４１構築物である、請求項３記載のトランスジェニックブタ。２１．核酸構築物が図１Ｕに示した３４３構築物である、請求項３記載のトランスジェニックブタ。２２．核酸構築物が図１Ｖに示した３４７構築物である、請求項３記載のトランスジェニックブタ。２３．核酸構築物が図１Ｗに示した通りである、請求項３記載のトランスジェニックブタ。２４．核酸構築物が図１Ｘに示した通りである、請求項３記載のトランスジェニックブタ。２５．核酸構築物が図１Ｙ６に示した通りである、請求項３記載のトランスジェニックブタ。２６．（ｉ）ヒトδグロビンをコードする核酸構築物を含み、かつ（ｉｉ）少なくとも一部の赤血球においてヒトδグロビンを発現するトランスジェニックブタ。２７．核酸構築物が図１Ｋに示した２６３構築物である、請求項３記載のトランスジェニックブタ。２８．核酸構築物が図１Ｌに示した２７４構築物である、請求項３記載のトランスジェニックブタ。２９．１個の細胞の中に少なくとも２０コピーのグロビントランスジーンを含む、請求項１、２または３記載のトランスジェニックブタ。３０．妊娠していないとき、トランスジェニックブタの全血のＰ５０が同一高度において妊娠していない非トランスジェニックブタの全血のＰ５０より少なくとも１０％大きい、請求項１、２または３記載のトランスジェニックブタ。３１．総ヘモグロビンに対する生産されたヒトグロビンの量が少なくとも２％である、請求項１、２または３記載のトランスジェニックブタ。３２．総ヘモグロビンに対する生産されたヒトグロビンの量が少なくとも５％である、請求項１、２または３記載のトランスジェニックブタ。３３．総ヘモグロビンに対する生産されたヒトグロビンの量が少なくとも１０％である、請求項１、２または３記載のトランスジェニックブタ。３４．ヒトヘモグロビン、ブタヘモグロビン、およびヒト／ブタハイブリッドヘモグロビンの混合物からヒトヘモグロビンを精製する方法であって、（ｉ）請求項２、３、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５記載のトランスジェニックブタから赤血球を集め；（ｉｉ）集めた赤血球の内容物を放出させて溶解物をつくり；（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）の溶解物を、ｐＨ７．８で０．２Ｍグリシンにより平衡化したＤＥＡＥアニオン交換カラムにかけ；（ｉｖ）該カラムを５−３０ｍＭＮａＣｌ勾配で溶出し；そして（ｖ）精製されたヒトヘモグロビンを含む画分を回収する；ことから成る方法。３５．ヒトヘモグロビン、ブタヘモグロビン、およびヒト／ブタハイブリッドヘモグロビンの混合物からヒトヘモグロビンを精製する方法であって、（ｉ）請求項２、３、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５記載のトランスジェニックブタから赤血球を集め；（ｉｉ）集めた赤血球の内容物を放出させて溶解物をつくり；（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）の溶解物を、１０ｍＭトリス、２０ｍＭグリシンｐＨ５．０により平衡化したＱＣＩＰカラムにかけ；（ｉｖ）該カラムを６倍カラム容量の１０ｍＭトリス、２０ｍＭグリシン、１５ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５で溶出し；そして（ｖ）精製されたヘモグロビンを含む画分を回収する；ことから成る方法。３６．ヒトαグロビンおよびブタβグロビンを含む、本質的に精製されかつ単離されたヒト／ブタヘモグロビンハイブリッド。３７．適当なプロモーター配列の制御下にヒトαグロビン遺伝子とブタβグロビン遺伝子を含む核酸構築物。３８．適当な薬理学上の担体中に請求項３６の本質的に精製されかつ単離されたヒト／ブタヘモグロビンハイブリッドを含有する医薬組成物。