JPH09509839A

JPH09509839A - トランスジェニック動物内でのフィブリノーゲンの製造

Info

Publication number: JPH09509839A
Application number: JP7523049A
Authority: JP
Inventors: ガーナー，イアン; エー．ダルリンプル，マイケル; イー．プランカード，ドンナ; シー．フォスター，ドナルド
Original assignee: ザイモジェネティクス，インコーポレイティド; ファーマシューティカルプロテインズ，リミティド
Priority date: 1994-03-03
Filing date: 1995-03-01
Publication date: 1997-10-07
Also published as: PL316115A1; PL186074B1; FI963419A0; EP0748386B9; US5639940A; DE69534295D1; CN1144539A; EP0748386B1; CA2184004A1; AU1977095A; DE69534295T2; HU9602404D0; FI963419A; ES2245453T5; EP0748386B2; NZ282601A; DK0748386T3; DK0748386T4; DE69534295T3; AU685250B2

Abstract

(57)【要約】トランスジェニック非−ヒト哺乳類内でフィブリノーゲンを製造するための材料及び方法を開示する。フィブリノーゲンのＡα，Ｂβ及びγ鎖をコードするDNAセグメントが、非ヒト哺乳類の生殖細胞系内に導入され、そしてその哺乳類又はその子供が、その導入されたDNAセグメントから発現されたフィブリノーゲンを含む乳を産出する。異種フィブリノーゲン・ポリペプチド鎖をコードするDNAセグメントを担持する非ヒト哺乳類胚及びトランスジェニック非ヒト哺乳類をもつ開示する。

Description

【発明の詳細な説明】トランスジェニック動物内でのフィブリノーゲンの製造発明の背景血液凝固カスケードにおける最終段階は、可溶性血漿タンパク質から不溶性フィブリンへのトロンビン触媒変換である。トロンビンは、フィブリノーゲンの３成分鎖の中の１（Ａα−鎖）から小さなペプチド（フィブリノペプチドＡ）を解裂する。フィブリン・モノマーはその後に、重合し、そして活性化された第ＸII I因子により架橋されて安定な血塊を形成する。フィブリノーゲンは、恒常性を促進し、そして損傷組織を修復するための天然の血塊の形成を真似る生物学的組織糊のキー成分である（例えば、米国特許第4, 377,572号及び第4,442,655号参照）。組織糊は、縫合、ステープル及び外傷を閉じるための他の機械的手段に補助又は代替物を提供する。しかしながら、これらの製品（フィブリノーゲン、第ＸIII因子及びトロンビン）の基本成分は、冷温沈降（例えば、米国特許第4,377,572号；第4,362,567号；第4,909,251号）により又はエタノール沈降（例えば、米国特許第4,442,655号）によりプールされたヒト血漿から又は、単一ドナー血漿(例えば、米国特許第4,627,879号；Spotnitz et al., Am．Surg．55 ：166-168，1989)から調製される。得られたブィブリノーゲン／第ＸIII因子調製物は、使用直前にウシ・トロンビンと混合されて、フィブリノーゲンをフィブリンに変換し、そして第ＸIII因子を活性化し、これ故上記接着剤の凝固を開始させる。商業的に入手可能な接着剤は、プールされた血漿起源をもつ。血液由来の製品は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、肝炎ウイルス及び他の疫学的剤の伝達に関係してきたので、このような接着剤の許容性及び利用可能性は、限定される。現在、それらは、米国における使用について許可されていない。自原性血漿の使用は疾患伝達のリスクを減少させるけれども、自原性接着剤は、その患者がその後に必要な血液を提供することができるとき選択的外科手段においてのみ使用されることができる。上述のように、フィブリノーゲンは、３つのポリペプチド鎖から成り、その各々は、そのアセンブルされた分子内に２つのコピーにおいて存在する。Ａα，Ａ β及びγ−鎖といわれるこれらの鎖は、協調して発現され、アセンブルされ、そして肝臓により分泌される。組換えDNA技術が、血漿からのフィブリノーゲンの単離に対する代替を提供することができるであろうことが期待されることができるであろうが、このゴールは、つかみどころがないことが判明している。この３つのフィブリノーゲン鎖は、大腸菌(E．coli)内で別個に発現されたが（Lord，D NA 4 ：33-38，1985；Bolyard and Lord，Gene 66 ：183-192，1988；Bolyard a nd Lord，Blood 73：1202-1206）、機械的なフィブリノーゲンは、原核系内で製造されていない。酵母内での生物学的にコンピテントなフィブリノーゲンの発現は、報告されていない。培養されたトランスフェクトされた哺乳類細胞が、生物学的に活性なフィブリノーゲンを発現させるために使用されてきたが（Farrell et al.，Blood 74：55a，1989；Hartwig and Danishefsky，J．Biol．Chem. 266 ：6578-6585，1991；Farrell et al., Biochemistry 30：9414-9420，1991）、発現レベルは、商業的量における組換えフィブリノーゲンの製造が実行可能でない程低いものである。実験的証拠は、肝臓に比較して培養細胞内での低い転写速度が、今日まで達成された低い発現速度における要因であることができるが、トランスフェクトされたBHK細胞内のフィブリノーゲン鎖mRNAの量の増加は、フィブリノーゲン・タンパク質分泌における対応の増加を作り出さなかったことを示唆する（Prunkard and Foster ，XIV Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasi s，1993）。これらの後者の結果は、フィブリノーゲンの適当なアセンブリー及びプロセッシングが、一般的な実験室のセルライン中に存在しない組織特異的メカニズムに関連することを示唆している。ここに、組織接着剤及び他の用途における使用のための多量の高品質フィブリノーゲンの製造方法についての本分野における必要性が在る。さらに、血液担持病原体を含まないフィブリノーゲンについての必要性が在る。本発明は、これらの必要性を満たし、そして他の、関連する利点を提供する。発明の要約本発明の目的は、商業的に有用な量の組換えフィブリノーゲン、特に組換えヒト・フィブリノーゲンを提供することである。本発明のさらなる目的は、トランスジェニック動物、特に家畜動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ及びヤギの乳房組織内でのフィブリノーゲンの発現のための材料及び方法を提供することである。１の態様においては、本発明は、フィブリノーゲンの製造方法であって、（ａ）フィブリノーゲンＡα鎖に作用可能な状態で連結された分泌シグナルをコードする第１DNAセグメノト、フィブリノーゲンＢβ鎖に作用可能な状態で連結された分泌シグナルをコードする第２DNAセグメント、及びフィブリノーゲンγ鎖に作用可能な状態で連結された分泌シグナルをコードする第３DNAセグメントを提供し、ここで、この第１、第２及び第３セグメントの各々が、宿主雌哺乳動物の乳腺内でのその発現に要求される追加のDNAセグメントに作用可能な状態で連結されており；（ｂ）非−ヒト哺乳動物種の受精卵中に上記DNAセグメントを導入し；（ｃ）上記DNA構築物を担持する子孫を得るために上記種の雌の卵管又は子宮内にその卵を挿入し；（ｄ）上記第１、第２及び第３ DNAセグメントを発現し、そしてこれらのセグメントによりコードされたバイオコンピテント（biocompetent）フィブリノーゲンを含む乳を製造する雌子供(pro geny)を生産する子孫を育種し；（ｅ）その雌子供から乳を集め；そして（ｆ）その乳から上記フィブリノーゲンを回収する、ことを含んで成る方法を提供する。１の態様においては、上記の導入されたセグメントを含む卵を、挿入前の一定期間の時間にわたり培養する。他の態様においては、本発明は、フィブリノーゲンの製造方法であって、以下の、（ａ）β−ラクトグロブリン遺伝子内に、フィブリノーゲンのＡα鎖に作用可能な状態で連結された分泌シグナルをコードする第１DNAセグメントを取り込ませて第１遺伝子融合物を作り出し；（ｂ）β−ラクトグロブリン遺伝子内に、フィブリノーゲンのＢβ鎖に作用可能な状態で連結された分泌シグナルをコードする第２DNAセグメントを取り込ませて第２遺伝子融合物を作り出し；（ｃ）β −ラクトグロブリン遺伝子内にフィブリノーゲンのγ鎖に作用可能な状態で連結された分泌シグナルをコードする第３DNAセグメントを取り込ませて第３遺伝子融合物を作り出し，（ｄ）上記DNAセグメントが、上記哺乳動物又はその雌子供の乳腺内で発現されそしてバイオコンピテント・フィブリノーゲンがその哺乳動物又はその雌子供の乳中に分泌されるように、非−ヒト哺乳類の生殖細胞内に上記第１、第２及び第３遺伝子融合物を導入し；（ｅ）その哺乳類又はその雌子供から乳を得て；そして（ｆ）その乳から上記フィブリノーゲンを回収する、段階を含んで成るような方法を提供する。他の態様においては、本発明は、フィブリノーゲンの製造方法であって、以下の、（ａ）フィブリノーゲンのＡα，Ｂβ及びγ鎖をコードする異種DNAセグメントをその生殖細胞系内に担持するトランスジェニック雌非ヒト哺乳類を提供し、ここで、これらのDNAセグメントが、その哺乳類の乳腺中で発現され、そしてそのDNAセグメントによりコードされたフィブリノーゲンが、その哺乳類の乳中に分泌され；（ｂ）その哺乳類から乳を集め；そして（ｃ）その乳から上記フィブリノーゲンを回収する、段階を含んで成るような方法を提供する。他の態様においては、本発明は、フィブリノーゲンのＡα，Ｂβ及びγ鎖をコードする異種DNAセグメントをその核内に含む非ヒト哺乳類胚を提供する。関連態様においては、本発明は、その乳中に回収可能な量のヒト・フィブリノーゲンを作り出すトランスジェニック非ヒト雌哺乳類を提供する。他の態様においては、本発明は、哺乳類のトランスジェニック子孫の生産方法であって、以下の段階、（ａ）フィブリノーゲンＡα鎖をコードする第１DNAセグメント、フィブリノーゲンＢβ鎖をコードする第２DNAセグメント、及びフィブリノーゲンγ鎖をコードする第３DNAセグメントを提供し、ここで、この第１、第２及び第３セグメントの各々が、宿主雌哺乳類の乳腺中でのその発現及びその宿主雌哺乳類の乳中への分泌のために必要な追加のDNAセグメントに作用可能な状態で連結されており；（ｂ）非ヒト種の哺乳類の受精卵内にこれらのDNAセグメントを導入し；（ｃ）上記第１、第２及び第３DNAセグメントを担持する子孫を得るためにその非ヒト種の雌の卵管又は子宮内に上記卵を挿入する、段階を含んで成るような方法を提供する。関連態様においては、本発明は、本発明により作出された非ヒト哺乳類を提供する。追加の態様においては、本発明は、フィブリノーゲンの異種Ａα，Ｂβ及びγ 鎖をコードするDNAセグメントをその生殖細胞系内に担持する非ヒト哺乳類であって、その哺乳類の雌子供が、乳腺内でそのDNAセグメントを発現してバイオコンピテント・フィブリノーゲンを作り出すような哺乳類を提供する。本発明の上記及び他の態様は、以下の詳細な説明及び添付図面を参照する間に当業者に自明なものとなるであろう。図面の簡単な説明図１は、ヒト・フィブリノーゲンＡα鎖DNA配列のサブクローニングを図示する。図２は、ベクターZem 228の部分的制限酵素地図である。使用した記号は、MT −1p、マウス・メタロチオネイン・プロモーター；SV40ｔ，SV40ターミネーター；及びSV40ｐ，SV40プロモーターである。図３は、ヒト・フィブリノーゲンＢβ鎖DNA配列のサブクローニングを図示する。図４は、ヒト・フィブリノーゲンγ鎖DNA配列のサブクローニングを図示する。図５は、ベクターZem 2196の部分的制限酵素地図である。使用した記号は、MT −1p、マウス・メタロチオネイン・プロモーター；hGHt、ヒト成長ホルモン・ターミネーター；SV40ｐ，SV40プロモーター；DHFR、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子；及びSV40ｔ，SV40ターミネーターである。発明の詳細な説明本発明を詳細に説明する前に、本明細書中に使用する特定の用語を定義することが手助けとなるであろう。本明細書中に使用するとき、用語“バイオコンピテント・フィブリノーゲン(b iocompetent fibrinogen)”は、トロンビンにより処理されたときに重合して不溶性のトロンビンを形成するフィブリノーゲンを指すために使用される。用語“卵(egg)”は、非受精卵、前核の融合前の受精卵又は初期段階の胚（融合前核により受精された卵子）を指すために使用される。 “バイオコンピテント・フィブリノーゲンを含む乳を作り出す雌哺乳類”は、妊娠及び出産後に、泌乳期間の間に、回収可能量のバイオコンピテントなフィブリノーゲンを含む乳を作り出すものである。当業者は、このような動物が乳を、そしてそれ故、不連続的に上記フィブリノーゲンを作り出すであろうことを理解するであろう。用語“子供(progeny)”は、子供及び子孫を含むようにその普通の意味で使用される。用語“異種（heterologous）”は、その中にそれが導入されたものと異なる種に由来する遺伝子材料、又はそのような遺伝子材料から作られたタンパク質を示すために使用される。本発明においては、トランスジェニック動物技術を、宿主雌哺乳類の乳腺中でフィブリノーゲンを作り出すために使用する。乳腺中での発現及び乳中への着目のタンパク質のその後の分泌は、他の源からのタンパク質の単離において遭遇する多くの困難を克服する。乳は、容易に集められ、多量に入手可能であり、そして生物化学的によく特徴付けられている。さらに、主要な乳タンパク質は、（約１から15ｇ／ｌまでの）高い濃度において乳中に存在する。商業的な観点からは、高い乳収量をもつ種を宿主として使用することが明らかに好ましい。より小さな動物、例えば、マウス及びラットを使用することができる（そしてコンセプトの評価の（proof-of-concept）段階においては好ましい）けれども、本発明においては、非限定的に、ブタ、ヤギ、ヒツジ及びウシを含む家畜哺乳動物を使用することが好ましい。ヒツジは、この種におけるトランスジェネシスの先のヒストリー、乳収量、ヒツジ乳を集めるための設備の費用及び容易な入手可能性の如き要因により、特に好ましい。宿主種の選択に影響を及ぼす要因の比較については、WO88/00239を参照のこと。乳製品用途のために改良された宿主動物の品質を選択すること、又は後日そのトランスジェニック系の飼育により乳用株を導入することが一般的に望ましい。いずれの事案においても、公知の良好な健康状態をもつ動物を使用すべきである。本発明に従って製造されたフィブリノーゲンは、ヒト・フィブリノーゲン又は非ヒト動物のフィブリノーゲンであることができる。医療用途のためには、その患者に生来のタンパク質を使用することが好ましい。従って、本発明は、ヒト及び獣医薬の両方における使用のためにフィブリノーゲンを提供する。ヒト・フィブリノーゲンの構成成分鎖をコードするクローン化されたDNA分子が、Rixon et al．(Biochem．22 ：3237，1983)，Chung et al．(Biochem．22：3244，1983)， Chung et al．(Biochem．22 ：3250，1983)，Chung et al．（Adv．Exp．Med．B iol．281 ：39-48，1990)及びChung et al．（Ann．NY Acad．Sci．408：449-45 6，1983）により開示されている。ウシ・フィブリノーゲン・クローンは、Brown et al．(Nuc．Acids Res．17：6397，1989)及びChung et al．(Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA 78 ：1466-1470，1981)により開示されている。他の哺乳類フィブリノーゲン・クローンは、Murakawa et al．（Throm b．Haemost．69 ：351-360，1993）により開示されている。ヒトＡα，Ｂβ及び γ鎖遺伝子の代表的な配列を、それぞれ、配列番号：１，３及び５に示す。当業者は、これらの配列の対立遺伝子変異体が存在するであろうこと；追加の変異体が、アミノ酸置換、欠失、又は挿入により作り出されることができること；及びこのような変異体が、本発明において有用であることを、理解するであろう。一般的に、遺伝子操作された変異体のいずれを、限定された数のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含んで成ること、そしていずれの置換も保存的なものであることが好ましい。従って、対応の生来の鎖に対して配列において、少なくとも90％、好ましくは、少なくとも95％、そしてより好ましくは、99％以上の同一性をもつフィブリノーゲン鎖ポリペプチドを作り出すことが好ましい。用語“γ鎖”は、フィブリノーゲンの、他の方法でスプライスされたγ′鎖を含むことを意味する (Chung et al.，Biochem．23 ：4232-4236，1984)。ヒトγ′鎖アミノ酸配列を、配列番号：６に示す。このより短いγ鎖は、配列番号：５のヌクレオチド9511 と10054において別のスプライシングにより作り出され、これは、配列番号：５の10065ヌクレオチド後に終結する翻訳をもたらす。乳腺中での発現を得るために、乳タンパク質遺伝子からの転写プロモーターを使用する。乳タンパク質遺伝子は、カゼイン、ベーターラクトグロブリン(BLG) 、α−ラクトアルブミン、及びホエー酸性タンパク質をコードするような遺伝子を含む。ベーターラクトグロブリン・プロモーターが好ましい。ヒツジのベーターラクトグロブリン遺伝子の場合においては、少なくとも、（配列番号：７のヌクレオチド3844〜4257内に含まれる）ヒツジのBLG遺伝子の５′フランキング配列の近位406塩基対の領域が、一般的に使用される。約５キロ塩基対までの、上記５′フランキング配列のより大きな部分が、好ましい。（配列番号：７のヌクレオチド１〜4257内に含まれる）ベーターラクトグロブリン遺伝子の、５′フランキング・プロモーター領域及び５′非コーディング部分をコーディングする領域を包含するより大きなDNAセグメントが、特に好ましい。Whitelaw et al., Biochem．J．286：31-39，1992を参照のこと。他の種からのプロモーターDNAの類似の断片も、好適である。遺伝子のゲノム領域が発現されることができるように、ベーターラクトグロブリン遺伝子の他の領域も、構築物内に取り込まれることができる。イントロンを欠く構築物が、例えば、このようなDNA配列を含むものと比較して僅かに発現されるということが本分野において一般的に受け入れられている（Brinster et al ., Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88：478-482，1991；Whitelaw et al.，Transg enic Res．1 ：3-13，1991；WO89/01343；WO91/02318参照）。これに関して、可能である場合、着目のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の生来のイントロンの全て又はいくつかを含むゲノム配列を使用することが、一般的に好ましい。本発明の特定の態様においては、ベーターラクトグロブリン遺伝子からの少なくともいくつかのイントロンをさらに含むことが好ましい。１のこのような領域は、ヒツジのベーターラクトグロブリン遺伝子のイントロン・スプライシング及び３′非コーディング領域からのRNAポリアデニレーションを提供するDNA セグメントである。遺伝子の天然の３′非コーディング配列について置換されたとき、このヒツジ・ベーターラクトグロブリン・セグメントは、着目のタンパク質又はポリペプチドの発現レベルを強化し、かつ、安定化させることができる。他の態様においては、１以上のフィブリノーゲン配列の開始ATGの周囲の領域が、乳特異的タンパク質遺伝子からの対応配列により置換されている。このような置換は、発現を強化するために、推定組織特異的開始環境を提供する。フィブリノーゲン鎖プレープロ全体及び５ ′非コーディング配列を、例えば、上記BLG遺伝子により置換することが便利である。但し、より小さな領域が、置換されることもできる。フィブリノーゲンの発現のために、フィブリノーゲンの上記３成分ポリペプチド鎖の各々をコードしているDNAセグメントを、発現ユニットを作り出すためにそれらの発現のために必要とされる追加のDNAセグメントに作用可能な状態で連結する。このような追加のセグメントは、上述の乳タンパク質遺伝子プロモーター、並びに転写の終結及びmRNAのポリアデニル化を提供する配列を含む。この発現ユニットは、さらに、フィブリノーゲン・ポリペプチド鎖をコードするセグメントに作用可能な状態で連結された分泌シグナルをコードするDNAセグメントを含む。この分泌シグナルは、生来のフィブリノーゲン分泌シグナルであることができ又は、他のタンパク質、例えば、乳タンパク質のものであることもできる。用語“分泌シグナル”は、本明細書中、細胞からその外側への分泌経路を通してそれを向かわせるタンパク質の部分を示すために使用される。分泌シグナルは、最も一般的には、タンパク質のアミノ末端に見つけられる。例えば、von Heinje ，Nuc．Acids Res．14：4683-4690，1986；及びMeade et al.，米国特許第4,873 ,316号（これを引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。発現ユニットの構築は、便利には、追加のDNAセグメントを含むプラスミド又はファージ・ベクター内にフィブリノーゲン鎖配列を挿入することにより行われる。但し、この発現ユニットは、本質的にいずれのライゲーションの配列によっても構築されることができる。乳タンパク質をコードするDNAセグメントを含むベクターを提供し、そしてその乳タンパク質のためのコーディング配列を（分泌シグナルを含む）フィブリノーゲン鎖のものと置換し、それによりその乳タンパク質遺伝子の発現制御配列を含む遺伝子融合物を創製することが特に便利である。いずれの事案においても、プラスミド又は他のベクター内での発現ユニットのクローニングは、そのフィブリノーゲン配列の増幅を容易にする。増幅は、便利には、バクテリア（例えば、大腸菌(E．coli)宿主細胞内で行われ、これ故、これらのベクターは典型的には、バクテリア宿主細胞内で機能することができる複製起点及び選択マーカーを含む。上記フィブリノーゲン鎖遺伝子のサイズの点で、３つの別々の発現ユニットを調製し、それらを混合し、そしてその混合物を宿主内に導入することが最も実際的である。しかしながら、当業者は、他のプロトコールに従うことができることを理解するであろう。例えば、上記３つの鎖のための発現ユニットが、育種によりその後に組み合されるべき異なる胚内に別々に導入されることができる。第３のアプローチにおいては、この３つの発現ユニットは、単一の好適なベクター、例えば、酵母の人工染色体又はファージP1クローン内に連結されることができる。２つ又は３つの鎖のためのコーディング配列が、ポリシストロン性発現ユニット内で組み合されることができる（例えば、Levinson et al.,米国特許第4,713, 339号参照）。上記発現ユニット（単複）は、次に選択された宿主種（初期段階胚を含む）受精卵内に導入される。異種DNAの導入は、マイクロインジェクション（例えば、米国特許第4,873,191号）、レトロウイルス感染(Jaenisch，Science 240 ：1468 -1474，1988)又は胚性幹(embryonic stem(ES))細胞を使用した部位指定組み込み（Bradley et al.，Bio/Technology 10 ：534-539，1992によりレビーされたもの）を含むいくつかのルートの中の１により達成されることができる。次にこれらの卵は、偽妊娠雌の卵管又は子宮内に移植され、そして予定日まで発達せしめられる。それらの生殖細胞系内に導入されたDNAを担持する子孫は、正常なメンデルの法則に従ってそれらの子供にDNAを承継し、トランスジェニック集団(herds)の顕出を許容する。トランスジェニック動物の作出のための一般的手順は、本分野において知られている。例えば、Hogan et al.，Manipu lating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborat ory，1986；Simons et al.，Bio/Technology 6：179-183，1988；Wall et al.，Biol．Reprod．32 ：645-651，1985；Buhler et al.，Bio/Technology 8：140-14 3，1990；Ebert et al., Bio/Technology 9 ：835-838，1991；Krimpenfort et al.，Bio/Technology 9：844-847，1991；Wall et al.，J．Cell．Biochem．49 ：113-120，1992；及び国際公開WO88/00239，WO90/05188，WO92/11757；及びGB8 7/00458、（これらを引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。哺乳類及びこれらの生殖細胞内への外来DNA配列の導入のための技術は、元々、マウスにおいて開発された。例えば、Gordon et al., Proc．Natl．Acad．Sci．USA 77 ：7380-7384，1980；Gordon and Ruddle，Science 214 ：1244-1246，1981；P almiter and Brinster, Cell 41：343-345，1985；Brinster et al.，Proc．Nat l．Acad．Sci．USA 82 ：4438-4442，1985；及びHogan et al．（同書）を参照のこと。これらの技術は、その後、家畜種を含むより大きな動物を用いての使用のために改良された（例えば、国際公開WO88/00239，WO90/05188、及びWO92/117 57；及びSimons et al., Bio/Technology 6 ；179-183，1988参照）。要約すれば、トランスジェニック・マウス又は家畜の作出において今日まで使用されてきた最も有効な経路において、数百の着のDNAの線状分子が、受精卵の前核の中の１内にインジェクトされる。接合体の細胞質内へのDNAのインジェクションも使用されることができる。成熟タンパク質の効率的な形成を許容するために各フィブリノーゲン鎖のバランスのとれた発現を得ることが好ましい。理想的には、この３つの発現ユニットは、卵内への導入のために同一のDNA分子上になければならない。しかしながら、このアプローチは、例えば、そのインジェクション及び操作段階において、技術的な問題を作り出すことができる。例えば、フィブリノーゲン発現ユニットのサイズは、インジェクション前にそのDNAを増幅し、そして操作するために酵母人工染色体（YACs）又はファージP1の使用を必要不可欠なものとすることができる。このアプローチに従う場合、３つの発現ユニットの全てを含むインジェクトされるべきDNAのセグメントは、ひじょうに大きなものであろうし、これ故、例えば、より大きな孔の針を使用する注射（インジェクション）手順の修正を必要とする。より簡単なアプローチにおいては、各々別個の発現ユニットの混合物を使用する。上記３つの発現ユニットの等モル量を併合することが好ましい。但し、当業者は、この比が、所定の発現ユニットの特徴を補償するために変更されることができることを理解するであろう。より少ない量の１又は２の鎖が使用されるとき、いくつかの発現、一般的に減少されたレベルが得られるであろうし、そして発現効率は、一般的に、好ましい等モル比からの逸脱に凡そ比例して低下することを予想することができる。いずれの事案においても、0.5−１：0.5−１： 0.5−１のレンジ内のＡα：Ｂβ：γ発現ユニットの比をもつ混合物を使用することが好ましい。この比が等モルから変化するとき、比較的多くのＢβ発現ユニットを使用することが好ましい。あるいは、１の又は２の発現ユニットの混合物が、個々の卵内に導入される。しかしながら、このアプローチにより得られた動物は、１又は２のフィブリノーゲン鎖だけを発現するであろう。このアプローチにより無傷のフィブリノーゲン分子を作り出すことは、１群の動物の個体において３つの発現ユニットの全てを組み合せるようにデザインされたその後の育種を要求する。一般的に、雌動物は、卵胞刺激ホルモンによる処理により過剰排卵され、その後、支配される。受精卵が集められ、そして異種DNAが、公知の方法を使用してその卵内にインジェクトされる。例えば、米国特許第4,873,191号；Gordon et a l., Proc．Natl．Acad．Sci．USA 77：7380-7384，1980；Gordon and Ruddle，S cience 214 ：1244-1246，1981；Palmiter and Brinster, Cell 41：343-345，1 985；Brinster et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82 ：4438-4442，1985；H ogan et al.，Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual, Cold Sp ring Harbor Laboratory，1986；Simons et al.，Bio/Technology 6：179-183， 1988；Wall et al.，Biol．Reprod．32：645-651，1985；Buhler et al.，Bio/T echnology 8 ：140-143，1990；Ebert et al., Bio/Technology 9 ：835-838，19 91；Krimpenfort et al.，Bio/Technology 9：844-847，1991；Wall et al.，J ．Cell．Biochem．49 ：113-120，1992；国際公開WO88/00239，WO90/05118、及び WO92/11757；及びGB87/00458（これらを引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。受精卵への注射のために、上記発現ユニットは、適当な制限酵素による消化によりそれらの対応ベクターから取り出される。便利には、上記発現ユニットが、その発現ユニット内又はそのベクター内のどこかのいずれかにおいて切断しない酵素による解裂により取り出されるように、そのベクターを設計することが好ましい。これらの発現ユニットは、常法、例えば、電気溶出その後のフェノール抽出及びエタノール沈降、スクロース密度勾配遠心分離、又はこれらのアプローチの組合せにより回収される。 DNAは、Hogan et al.，同書中に本質的に記載されたように卵内に注射される。典型的な注射においては、胚培養基の皿内の卵が、立体ズーム顕微鏡（50倍又は63倍の倍率が好ましい）を使用して、配置される。好適な培地は、Hepes（Ｎ −２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸）又は重炭酸塩緩衝液化培地、例えば、M2又はＭ16（Sigma Chemical Co.，St．Loais，USAから入手可能なもの）又は合成卵管培地（以下に開示）を含む。これらの卵を固定し、そして、例えば、キャピラリー管を完備したdrummondピペットを使用して注射リグ上のガラス・スライドの中心に移す。低倍率（例えば、４倍）における観察を、この段階において使用する。上記注射リグのホールディング・ピペットを使用して、これらの卵をそのスライドの中心に置く。個々の卵を、順番に、注射のために上記ホールディング・ピペットに固定する。各注射工程のために、上記ホールディング・ピペット／卵を、その視野の中心に置く。次に注射針を、その卵の直下に置く。好ましくは、40倍のNomarski対物レンズを使用して、両マニピュレーター高を、その卵を針の両方に焦点を合せるように調整する。前核を、その卵を回転させ、そして適宜、そのホールディング・ピペット・アセンブリーを調節することにより、位置決めする。一旦、前核が位置決めされれば、そのマニピュレーターの高さが、その前核膜に焦点を合せるように変更される。注射針を、その針の先端が、その前核の中心の下の位置にあるように、その卵の下に置く。この針の位置を、次に、その針と前核を同一焦点平面内にもっていくように上記注射マニピュレーター・アセンブリーを使用して変更する。この針を、卵の右側の位置に、その注射マニピュレーター・アセンブリー上の操縦桿を介して動かす。短い、連続的なジャンビング動きを用いて、前核膜が突き刺されてその針の先端をその前核の内側に残す。その前核がその容量の約２倍に膨れるまでそのガラス・シリンジを介して圧力をその注射針に加える。この点で、この針をゆっくりと除去する。低倍率（約４倍）に戻し、注射された卵を、スライドの異なる領域に動かし、そしてこの工程を、他の卵を用いて繰り返す。 DNAが注射された後に、その前核が融合して１つの細胞又は後期段階の胚を作り出すことを許容するように、それらの卵を培養することができる。一般的に、これらの卵は、バランスされた塩及び血清を含む緩衝液化培地中で使用される種の凡そ体温において培養される。次に、生き残った胚を、典型的には、それらをその卵管又は子宮内に挿入することにより偽妊娠受容体雌に移し、そして予定日まで発達せしめる。胚形成の間、注射されたDNAは、少数の発達胚のゲノム内にランダムに組み込まれる。可能性のあるトランスジェニック子孫を、血液サンプル及び／又は組織生検を介してスクリーニングする。DNAを、これらのサンプルから調製し、そして技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR；Mullis、米国特許第4,683,202号参照）及びサザン・ブロッティング（Southern，J．Mol．Biol．98：503，1975；Mania tis et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor L aboratory，1982）により、その注射構築物の存在について調べられる。創始者トランスジェニック動物、又はG0sは、それらの細胞の全てにおいてトランスジェニックをもつ全トランスジェニック、又は細胞のサブセットだけにおいてトランスジーンをもつモザイクであることができる例えば、Wilkie et al., Devolop ．Biol．118 ：9-18，1986）。後者の場合、生殖細胞群は、全体的に又は部分的にトランスジェニックであることができる。後者の場合、創始者(founder)動物からのトランスジェニック子孫の数は、メンデルの原理から予測される期待された50％未満であろう。創始者G0動物は、性的成熟まで育てられ、そして子孫、又はG1sを得るために支配される。このG1sも、創始者G0動物から継承を立証するためにそのトランスジーンの存在について調べられる。雄G0sの場合においては、これらは、多くの子孫を作り出すためにいくつかの非トランスジェニック雌と支配されることができる。これは、トランスジーン伝達を観察する機会を増加させる。雌G0創始者は、自然に、人工的に精液を注入され又は過剰排卵されて、代理母に移される多くの卵を得る。後者のコースは、限定された数の子をもつ動物における伝達を観察する最良の機会を与える。上記の育種手順は、正常なメンデルの法則に従って次の世代の子孫にDNAを伝えることができる動物を得るために使用されて、例えば、トランスジェニック動物のコロニー（マウス）、群（ヒツジ）、又は獣群（ブタ、ヤギ及びウシ）の開発を許容する。泌乳G0及びG1雌からの乳を、免疫学的技術、例えば、ELISA（Harlow and Lane ，Antibodies，A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory，1988）及びウェスタン・ブロッティング（Towbin et al., Proc．Natl．Acad．Sci．US A 76 ：4350-4354，1979）を使用して異種タンパク質の発現について調べる。本分野において知られたさまざまな理由のために、異種タンパク質の発現レベルは、個体間で相違することが予想されるであろう。満足できる動物のファミリーは、３つの基準を満足しなければならない：それらは、同一の創始者G0動物に由来しなければならず；それらは、トランスジーンの安定した伝達を示さなければならず；そしてそれらは、個々の動物の年齢から年齢まで、そして泌乳から泌乳まで、安定した発現レベルを示さなければならない。これらの原理は、立証され、そして討議されている（Carver et al., Bio/Technology 11 ：1263-1270，1993）。このような好適なファミリーからの動物を“系列（line ）”という。最初に、雄動物、G0又はG1が、自然又は人工精液注入により産生動物の群又は獣群を誘導するために使用される。この方法で、同一のトランスジーン組み込み事件を含む多くの雌動物が、速く作出されることができ、それから乳の供給を得ることができる。フィブリノーゲンは、標準的な手順、例えば、スキミング、沈澱、濾過及びタンパク質クロマトグラフィー技術を使用して乳から回収される。本発明によって作られたフィブリノーゲンは、ヒト及び獣医薬において、例えば、外科手術用接着剤の配合において有用である。例えば、米国特許第4,377,57 2号；第4,442,655号；第4,462,567号；及び第4,627,879号（これらを引用により本明細書中に取り込む）を参照のこと。一般的に、フィブリノーゲンと第ＸIII 因子は、併合されて、トロンビンを含む第２成分と共に使用される直前に混合される第１成分を形成する。トロンビンは、フィブリノーゲンをフィブリンに変換し、その混合物をゲルにし、そして第ＸIII因子を活性化する。この活性化された第ＸIII因子はフィブリンを架橋させて、その接着剤マトリックスを強化し、そして安定化させる。このような接着剤は、典型的には、約30mg／ml〜約100mg ／mlのフィブリノーゲンを、そして約50μｇ／ml〜約500μｇ／mlの第ＸIII因子を含む。それらは、追加の成分、例えば、アプロチニン、アルブミン、フィブロネクチン、バルキング剤、及び可溶化剤を含むこともできる。第ＸIII因子の製造方法は、本分野において公知である。例えば、米国特許第5,204,447号を参照のこと。フィブリノーゲンは、米国特許第5,272,074号（引用により本明細書中に取り込む）中に開示されるように、ポリマー物品、例えば、合成血管移植片のコーディング表面のためにも有用である。本発明を、以下の非限定的な実施例によりさらに説明する。実施例実施例ＩベクターpUC18(Yanisch-Perron et al.，Gene 33：103-119，1985)の多クローニング部位を、除去し、そして制限酵素部位PvuＩ/MluＩ／EcoRＶ/XbaＩ/PvuＩ/ MluＩを含む合成２本鎖オリゴヌクレオチド（このストランドを配列番号：８と配列番号：２７に示す。）で置換し、そして制限酵素部位EcoRＩとHindIIIと互換性の５′突出にフランクさせた。pUC18を、EcoRＩとHindIIIの両方により解裂させて、その５′末端リン酸基を子ウシ腸ホスファターゼにより除去し、そして上記オリゴヌクレオチドを、そのベクター・バックボーン内にライゲートした。この接点を横切るDNA配列を、配列決定により確認し、そして新たなプラスミドを、pUCPMと呼んだ。（国際公開第WO88/00239号中に開示された）pSS1TgXSからのβ−ラクトグロブリン(BLG)遺伝子配列を、SalＩ−XbaＩ断片として切除し、そしてSalＩとXbaＩにより切断されたベクターpUCPM内に再クローン化して、ベクターpUCXSを構築した。従って、pUCXSは、ファージSS１（Ali and Clark, J． Mol．Biol．199 ：415-426，1988）のSalＩ部位からXbaＩ部位までにBLG遺伝子全体を含むpUC18誘導体である。（国際公開第WO88/00239号中に開示された）プラスミドpSS1tgSEは、SphＩとE coRＩ制限酵素部位にフランクされた1290塩基対のBLG断片、すなわち、ユニーク NotＩ部位と、そのBLG mRNAの５′非翻訳リーダー内に横たわる単一PvuII部位にわたる領域を含む。このPvuII部位内に、酵素EcoRＶのための認識部位をコードする、２本鎖、８塩基対のDNAリンカー（５′−GGATATCC−３′）をライゲートする。このプラスミドを、pSS1tgSE／RVと呼んだ。pSS1tgSE／RV内のSphＩとNotＩ制限酵素部位により結合されたDNA配列を、酵素的消化により切除し、そしてpUCXS内の等価な断片を置換するために使用した。得られたプラスミドを、pUCXSRVと呼んだ。pUCSXRV内のBLG挿入物の配列を、配列番号：７に示す。ここで、BLG遺伝子の５′非翻訳リーダー領域内のヌクレオチド4245にユニークEcoRＩ部位がある。この部位は、転写開始部位に対し３′側のBLGプロモーターの制御下でのいずれかの追加のDNA配列の挿入を許容する。プライマーBLGAMP３（５′−TGG ATC CCC TGC CGG TGC CTC TGG−３′；配列番号：９）及びBLGAMP４（５′−AAC GCG TCA TCC TCT GTG AGC CAG−３′；配列番号：10）を使用して、約650塩基対のPCR断片を、pUCXSRV内のBLG遺伝子の終結コドンに対し３′側直近配列から作り出した。このPCR断片を、その５′末端にBamHＩ部位を、そしてその３′末端にMluＩ部位をもつように遺伝子操作し、そしてBamHＩ及びMluＩ切断pGEM7zf(＋)(Promega)内にそのままクローン化して、pDAM200(＋)を得た。 pUCXSRVを、KpnＩで消化し、そして最大の、ベクター含有バンドを、ゲル精製した。このバンドは、pUCプラスミド配列の全体及びBLG遺伝子からのいくつかの３′非コーディング配列を含んでいた。このバックボーン内に、BLG３′フランキング領域の2.6Ｋ塩基対の５′末端直近におけるBamHＩ部位を、正しい方向において、有効に遺伝子操作された、pDAM200(＋)からの小さなKpnＩ断片をライゲートした。このプラスミドを、pBLAC200と呼んだ。pBLAC200からの2.6Ｋ塩基対のClaＩ−XbaＩ断片を、ClaＩ−XbaＩ切断pSP72ベクター(Promega)内にライゲートし、このように、BLG配列の上流直近にEcoRＶ部位を配置した。このプラスミドを、pBLAC210と呼んだ。 pBLAC210からの2.6Ｋ塩基対のEcoRＶ−XbaＩ断片を、EcoRＶ−XbaＩ切断pUCXS RV内にライゲートして、pMAD６を作った。これは、実際に、pUCXSRVからのコーディング及びイントロン配列の全てを切除し、4.3Ｋ塩基対の５′プロモーター及びユニークEcoRＶ部位に隣接する2.6Ｋ塩基対の３′下流配列から成るBLGミニ遺伝子を形成した。オリゴヌクレオチド・リンカー（ZC6839：ACTACGTAGT；配列番号：11）を、pMAD６のEcoRＶ部位内に挿入した。この修飾は、そのEcoRＶ部位を破壊し、そして、クローニング目的のために使用されるべきSnaBＩ部位を創出した。このベクターを、pMAD６−Snaと命名した。メッセンジャーRNAは、このSn aBＩ部位の上流で開始され、そしてこのSnaBＩ部位の下流で終結する。この前駆体転写物は、単一のBLG−由来イントロン、イントロン６であって、全て、その遺伝子の３′非翻訳領域内にあるものをコードするであろう。実施例II 個々のフィブリノーゲン鎖をコードするクローンを、Dr．Earl W．Davie，Uni versity of Washington，Seattleの実験室から得た。ゲノム・フィブリノーゲンＡα−鎖クローン（Chung et al.，1990、同書）を、プラスミドBS４から得た。このプラスミドは、ベクターpUC18のSalＩとBamHＩ部位内に挿入されたＡαクローンを含むが、Ａα鎖の最初の４アミノ酸のためのコーディング配列を欠いている。ゲノムＢβ−鎖DNA（Chung et al.、同書）を、各々約5.6Ｋ塩基対の２つの EcoRＩ断片としてラムダCharon 4Aファージ・クローン（βλ４と命名）から単離した。この２つの断片を、EcoRＩにより消化され、そして子ウシ腸ホスファターゼにより処理された pUC19内に別々にクローン化した。得られたクローンを、制限酵素PvuIIによる消化によりスクリーニングして、（それぞれ、ベータ５′RI／pucとベータ３′RI ／pucと命名した）５′と３′Ｂβ挿入物をもつプラスミドを圧別した。ゲノム γ−鎖クローンを、Rixon et al．(Biochemistry 24 ：2077-2086，1985)により記載されたように単離した。クローンｐγ12A9は、５′非コーディング配列と約 4535塩基対のγ−鎖コーディング配列を含んで成る。クローンｐγ12F3は、残りのコーディング配列と３′非コーディング・ヌクレオチドを含んで成る。両者が、そのEcoRＩ部位において挿入されたフィブリノーゲン配列をもつpBR322−ベースのプラスミドである。これらのプラスミドを、対応のPCR反応のための鋳型として使用した。上記フィブリノーゲン鎖コーディング配列を、Mullis（米国特許第4,683,202 号）により一般的に記載されるようなポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して発現ベクター内への挿入のためにあつらえた。この手順は、生来の５′及び３′非翻訳配列を除去し、各コーディング配列の最初のATGの上流に９塩基対の配列（C CT GCA GCC）を付加し、そのＡα−鎖配列のための最初の４つのコドンを提供し、そのＡα配列内の内部MluＩ部位を除去し、そしてその後のクローニング段階を容易にする制限酵素部位を付加する。図１を参照して、Ａαコーディング配列の５′末端を、プライマーZC6632（配列番号：12）とZC6627（配列番号：13）の各々について20ｐモル、約10ngのプラスミドBS４鋳型DNA，2.5mMの各dNTPを含む混合物10μｌ，7.５μｌの10倍ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）（Pfu）DNAポリメラーゼバッファー＃１（200mM Tris−HCl，pH8.2，100mM KCl，60mM(NH₄)₂SO₄，20mM MgCl₂,１％Triton Ｘ−100，100μｇ／mlヌクレアーゼ不含ウシ血清アルブミン）（Stratagene，La Jolla，CA）、及び75μｌまでの水を含むPCR反応において、あつらえた。この混合物を、DNA熱サイクラー（Perkin−Elmer Corp.，Norw alk，CT）内で94℃に加熱した。この加熱混合物に、2.5μｌ 10倍Pfuバッファー＃１，22μｌ H₂O及び１μｌ 2.5ユニット／μｌ Pfu DNAポリメラーゼ（Stra tagene）を含む混合物25μｌを添加した。この反応を、DNA熱サイクラー(Perkin −Elmer)内で、94°，45秒間；40°，90秒間；72°,120秒間の５サイクル；94° ，45秒間；45°，90秒間；72°,120秒間の20サイクルにわたり走らせ；その後７分間72°においてインキュベートした。この５′PCR−生成断片を、BamHＩとHin dIIIにより消化し、そして次にBamHＩ−HindIII断片を、内部2.91Ｋ塩基対HindI II−XbaＩ断片とBamHＩ，XbaＩ−消化pUC18にライゲートした。PCR−生成エクソン配列について、配列決定した。再び図１を参照して、Ａαコーディング配列の３′末端を、一連の段階においてあつらえた。ここで、Ａα配列の終結コドンから563塩基上流のMluＩ部位を重複伸長PCR反応（Ho et al., Gene 77：51-59，1989）を使用して突然変異された。第１反応において、プライマーZC6521（配列番号：14）とZC6520（配列番号： 15）の各々40ｐモルを、上記のような反応混合物中で約10ngのプラスミドBS４鋳型DNAと組み合せた。この反応を、94°，45秒間；40°，60秒間；72°,120秒間の５サイクル；94°，45秒間；45°，60秒間；72°,120秒間の15サイクルにわたり走らせ；次に７分間72°においてインキュベートした。第２反応を、プライマーZC6519（配列番号：16）とZC6518（配列番号：17）の各々40ｐモル、そして鋳型としてBS４を使用して同一のやり方で行った。上記第１と第２反応からのPCR −生成DNA断片を、ゲル電気泳動及びそのゲルからの溶出により単離した。各回収された反応生成物の約１／10を、PCR反応においてプライマーZC6521（配列番号：14）とZC6518（配列番号：17）の各々40ｐモルと組み合せ、この反応において、（単一の塩基変更を含む）各断片の相補的３ ′末端がアニーリングされ、そしてその相補的ストランドの３′伸長のためのプライマーとして役立つ。PCRを、上記第１と第２の３′PCR段階におけるものと同一の反応条件を使用して行った。次に、この反応生成物を、XbaＩとBamHＩで消化し、そしてそのXbaＩ−BamHＩ断片を、XbaＩ，BamHＩ−消化pUC18内にクローン化した。PCR−生成エクソンについて、配列決定した。図１に示すように、５′BamHＩ−XbaＩ断片(3.9Ｋ塩基対)と３断片XbaＩ−Bam HＩ断片(1.3Ｋ塩基対)を、ベクターZem 228のBamHＩ部位内に挿入した。Zem 228 は、マウスMT−１プロモーターとSV40ターミネーターとの間のBamHＩクローニング部位、並びにSV40プロモーター及びターミネーター配列に隣接したネオマイシン耐性遺伝子を含んで成るpUC18誘導体である。欧州特許庁公開EP 319,944及び図２を参照のこと。Ａαコーディング配列の全体を、SnaBＩ断片としてZem 228 ベクターから単離し、これを、プラスミドpMAD６−SnaのSnaBＩ部位内に挿入した。図３を参照して、Ｂβ−鎖の５′末端を、オリゴヌクレオチドZC6629（配列番号：18），ZC6630（配列番号：19）及びZC6625（配列番号：20）を使用してPCR によりあつらえた。これらのプライマーを、対の組合せ（ZC6629＋ZC6625又はZC 6630＋ZC6625）において使用して、第１ATGコドン（配列番号：３中の470位）（ N1−ベータと命名）又は第３ATGコドン（配列番号：３中512位）（N3−ベータと命名）において開始する、Ｂβコーディング配列を創出した。約５ngのベータ５ ′RI／puc鋳型DNAを、上記のような反応混合物中でプライマー（N1−ベータ：ZC 6629、配列番号：18＋ZC6625、（配列番号：20；又はN3−ベータ：ZC6630、配列番号：19＋ZC6625、配列番号：20 ）の各々20ｐモルと併合した。これらの混合物を、94°，45秒間：40°,120秒間；（N1−ベータ）又は90秒間（N3−ベータ）；72°,120秒間の５サイクル；94° ，45秒間；45°,120秒間；（N1−ベータ）又は90秒間（N3−ベータ）；72°，12 秒間の20サイクルにわたりインキュベートし；次に72°で７分間インキュベートした。この２つの反応生成物(N1，555塩基対又はN3，510塩基対)を各々、EcoRＩとBglIIにより消化し、そしてそれらの断片を、内部BglII−XbaＩ断片とEcoRＩ＋XbaＩ−消化pUC19にライゲートした。Ｂβ配列の３′末端を、オリゴヌクレオチド・プライマーZC6626（配列番号：21）とZC6624（配列番号：22）及び約５μ ｇのベータ３′RI／puc鋳型を使用して上記のように反応混合物中であつらえた。これらの混合物は、94°，45秒間；40°，90秒間；72°,120秒間の５サイクル；94°，45秒間；45°，90秒間；72°,120秒間の15サイクルにわたりインキュベートし；次に72℃で７分間インキュベートした。990塩基対のBglII−EcoRＩ断片を単離した。この３′断片を、その隣接コーディング断片(340塩基対、SphＩ−B glII)とSphＩ＋EcoRＩ−消化pUC19にライゲートした。この３′と５′PCR−生成エクソンについて配列決定した。第３の中間ベクターを、XbaＩ−SphＩ−消化pU C19内で２つの内部断片（4285塩基対のXbaＩ−EcoRＩ及び383kbのEcoRＩ−SphＩ）を組み合せることにより構築した。Ｂβコーディング配列の全体（２つの形態）を次に、５′EcoRＩ−XbaＩ断片、内部XbaＩ−SphＩ断片、３′SphＩ−EcoRＩ断片及びEcoRＩ−消化ベクターpUC19の中の１をライゲートすることによりアセンブルした。次にＢβ配列を、7.6Ｋ塩基対のSnaBＩ断片として単離し、そしてp MAD６−SnaのSnaBＩ部位内に挿入した。図４を参照して、ガンマ鎖配列の５′末端を、オリゴヌクレオチド・プライマーZC6514（配列番号：23）とZC6517（配列番号：24）及び鋳型として約50ngのｐ γ12A9を使用して、PCRによりあつらえた。このPCR反応を、40pMの各プライマーを使用して上記のように走らせた。この反応を、94°，45秒間；40°，60秒間： 72°,120秒間の５サイクル、その後の、94°，45秒間；45°，60秒間；72°,120 秒間の15サイクルにわたり走らせた。得られた213塩基対断片を、BamHＩ及びSpe Ｉにより消化し、そして得られた制限酵素断片を、隣接下流4.4kb SpeＩ−EcoR Ｉ断片とBamHＩ＋EcoRＩ消化pUC19とライゲートした。ガンマ鎖配列の３′末端を、40pMの各プライマーを用いたオリゴヌクレオチド・プライマーZC6516（配列番号：25）及びZC6515（配列番号：26）、約50ngのｐγ12F3鋳型及び５′断片のために使用されたものと同じ熱サイクリング・スケジュールを使用してあつらえた。得られた500塩基対断片を、SpeＩ及びBamHＩで消化し、そして得られた制限酵素断片を、上流2.77kb EcoRＩ−SpeＩ断片及びEcoRＩ＋BamHＩ−消化pUC19とライゲートした。全てのPCR−生成エクソンについて配列決定した。次に、γ′ −鎖コーディング配列の全てを、4.5Ｋ塩基対のBamHＩ−EcoRＩ５′断片、1.1 Ｋ塩基対のEcoRＩ−PstＩ内部断片及びBamHＩ＋XbaＩ−消化Zem 219b内の2.14Ｋ塩基対のPstＩ−XbaＩ３′断片をライゲートすることによりアセンブルした。 Zem 219bは、マウス・メタロチオネイン・プロモーター及びSV40プロモーターに作用可能な状態で連絡されたDHFR選択マーカーを含むpUC18−由来ベクターである（図５）。プラスミドZem 219bは、受託番号第68979号の下、大腸菌（E．coli ） XL１−ブルー形質転換体としてAmerican Type Culture Collectionに寄託されている。次にγ′−鎖コーディング配列の全体を、7.8Ｋ塩基対のSnaBＩ断片として単離し、そしてpM AD６−SnaのSnaBＩ部位内に挿入した。実施例III 開始育種株のためのマウス（C57BL6J，CBACA）を、Harlan Olac Ltd．（Bices ter，UK）から得た。これらを、受容体雌、排卵過剰雌、種雄及び精管切除雄のためのF1ハイブリッド雑種(B6CBAF1)を作り出すために対において交配させた。全ての動物を14時間の明／10時間の暗サイクル上で維持し、そして水と食物を適宜与えた（Specicl Diet Services RM3，Edinburgh，Scotland）。トランスジェニック・マウスは、本質的に、Hogan et al.，Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory，1986 （これを、全体として引用により本明細書中に取り込む。）中に記載されたように作出された。雌B6CBAF1動物は、妊娠した雌馬の血清性腺刺激ホルモン(FOLLIG ON，Vet−Drug，Falkirk，Scotland)の腹腔内注射（５in）により、その後の、4 5時間後のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(CHORULON，Vet−Drug，Falkirk，Scotla nd)の腹腔内注射（５in）により４〜５週齢において過剰排卵された。次にそれらは、一夜、種雄と交配された。支配したものを殺し、そしてそれらの卵を、マイクロインジェクションのために集めた。 DNAを、Hogan et al．（同書）中に記載したように受精卵中に注射した。簡単に言えば、Ａα，Ｂβ及びγ発現ユニットを含むベクターの各々を、MluＩで消化し、そしてそれらの発現ユニットを、スクロース勾配遠心分離により単離した。使用した全ての化学物質は、試薬グレードであり(Sigma Chemical Co.，St−L oais，MO，U．S．A.)、そして全ての溶液は、滅菌され、そしてヌクレアーゼ不含であった。１Ｍ NaCl，20mM Tris pH8.0，５mM EDTA中の20％及び40％スクロースの溶液を、UHP水を使用して調製し、そして濾過滅菌した。30％スクロース溶液を、等容量の上記20％及び40％溶液を混合することにより調製した。勾配を、２mlポリアロマー管内に0.5ml段階の40％，30％及び20％スクロース溶液を重層することにより調製し、そして１時間放置した。10 0μｌのDNA溶液（最大８μｇ DNA）を、その勾配の上にロードし、そしてその勾配を、TLS−55ローターを用いたBeckman TL100超遠心分離装置(Beckman Instnum ents，Fullerton，CA，USA)内で26,000rpm，15℃において17〜20時間遠心分離した。勾配を、20ga、針を用いてその管の底を穿刺し、そして96ウェルのマイクロタイター・プレート内に滴を集めることにより分画した。３μｌアリコートを、１％アガロース・ミニーゲル上で分析した。所望のDNA断片を含む画分を、プールし、そして0.3Ｍ酢酸ナトリウム中−20℃において一夜、エタノール沈降させた。DNAペレットを、50〜100μｌ UHP水中に再懸濁させ、そして蛍光計により定量した。これらの発現ユニットを、（１リッター当り0.2g KCl，0.2g KH₂PO₄ ，8.0ｇ NaCl，1.15ｇ Na₂HPO₄を含む）カルシウム及びマグネシウムを含まない Dulbecco'Sリン酸塩緩衝液化生理食塩水中で希釈し、１：１：１のモル比において（上記N1−ベータ又はN3−ベータ発現ユニットのいずれかを使用して）混合し、そして卵内に注射した（卵当り〜２μｌの全DNA溶液）。６〜８週齢の受容体雌を、精管切除雄と自然発情期におけるB6CBAF1雌との交配により調製した。性交栓をもつ雌を次に、マイクロインジェクトされた卵を移すために維持した。可能性のあるトランスジェニック動物の出生の後に、尾生検を、４週齢において麻酔下で採った。組織サンプルを、200μｇ／mlプロティナーゼＫ（Boehringe r Mannheim，Mannheim，Germany）を含む２mlの尾バッファー(0.3Ｍ酢酸Na，50m M HCl，1.5mM MgCl₂，10m M Tris−HCl，pH8.5，0.5％ NP40，0.5％ Tween 20)中に入れ、そして攪乱した。これらのサンプルを、３時間〜一夜、55°〜60°において振とうした（250rpm ）。生検サンプルから調製されたDNAを、PCR及びサザン・ブロッティングによりその注射された構築物の存在について調べる。消化された組織を、激しく攪乱し、そして５μｌのアリコートを、0.5mlマイクロ遠心分離管内に入れた。陽性及び陰性尾サンプルが、対照として含まれる。40μｌのシリコーン油（BDH，Poole ，UK）を、各管に添加し、そしてこれらの管を短時間遠心分離した。これらの管を、10分間95℃まで熱サイクラー（例えば、Omnigene，Hybaid，Teddington，UK ）の加熱ブロック内でインキュベートする。この後、各管は、各反応ミックスの最終的な組成が：50mM KCl；２mM MgCl₂；10mM Tris-HCl（pH8.3）；0.01％ゼラチン；0.1％ NP40，10％ DMSO；500nM各プライマー、200μＭ dNTPs；0.02Ｕ／ μｌ Taqポリメラーゼ（Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany）であるように、45μｌアリコートのPCRミックスを添加された。次に、これらの管を、使用される特定のプライマーにより要求されるとき30の反復温度変化を通してサイクルにかけた。上記プライマーは、変更されることができるが、全てのケースにおいてBLGプロモーター領域を標的としなければならない。これは、注射されたD NA断片に特異的である。なぜなら、このマウスは、BLG遺伝子をもたないからである。次に、オレンジＧマーカー染料（0.25％オレンジＧ〔Sigma〕15％ Ficoll 型400〔Pharmacia Biosystems Ltd.，Milton Keynes，UK〕）を含む12μｌの５倍ローディング・バッファーを、各管に添加し、そしてそれらの反応混合物を、そのマーカー染料がそのゲルの長さの２／３に移動するまで、臭化エチジウム(S igma)を含む1.6％アガロース・ゲル上で電気泳動にかけた。このゲルを、254nm の波長を放射するUV光源を用いて可視化する。１以上の注射されたDNA断片をもつトランスジェニック・マウスを、このアプローチにより同定した。陽性尾サンプルを、純粋なDNAを得るためにプロセスした。これらのDNAサンプルを、BLGプロモーター・ブローブ（配列番号：７のヌクレオチド2523−4253）を用いたサザン・ブロッティングによりスクリーニングした。適当な制限酵素（例えば、EcoRＩ）による特異的な解裂は、Ａα，Ｂβ及びγ配列を含む３つの構築物の区別を可能にする。本質的に上記のように調製されたトランスジェニック・マウスのサザン・ブロット分析は、子供の50％以上が３つのフィブリノーゲン配列の全てを含んでいたことを立証した。還元的SDSポリアクリルアミド・ゲル電気泳動による陽性動物からの乳の検査は、１mg／mlまでの濃度における３つのタンパク質鎖の全ての存在を立証した。完全にアセンブルされたフィブリノーゲンの量は、その乳中に存在する個々のサブユニットの比に関係付けられた。見かけの表現型は、マウス乳中の高濃度のヒト・フィブリノーゲンと全く関係しなかった。実施例IV ドナー雌ヒツジを、０日目に、膣内プロゲステロン−含浸スポンジ(CHRONOGES T Goat Sponge，Intervet，Cambridge，UK)により処置した。スポンジを、その場に、10又は20日間にわたり残した。排卵過剰を、−４日目の午後5:00から出発しで、そして０日目の午前８:00に終了する注射当り0.125ユニットの８つの筋中注射において投与された全部で１ユニットのヒツジ卵胞刺激ホルモン（OFSH）(OVAGEN，Horizon Animal Reproduc tion Technology Pty．Ltd.，New Zealand)によりドナー雌ヒツジを処置することにより誘発した。ドナーに、−４日目に0.5mlの黄体融解剤(ESTRUMAE，Vet−D r ug)を筋中注射して黄体の退行を生じさせ、発情期及び排卵に復帰せしめる。排卵を同調させるために、ドナー動物に、０日目の午後5:00において２mlの合成放出ホルモン・アナログ(RECEPTAL，Vet−Drug)を筋中注射した。ドナーを、人工的精液注入(avtificial insemination CA．I.))前少なくとも1 2時間にわたり食物及び水から飢餓状態にする。これらの動物を、１日目に鎮静及び局所麻酔下、子宮内ラパロスコピーにより人工的に精液注入させた。体重10 kg当り0.05〜0.1mlの投与量におけるキシラジン(ROMPUN，Vet−Drug)又は体重10 kg当り0.1mlの投与量におけるACP注射10mg／ml(Vet−Drug)のいずれかを、鎮静を提供するためにＡ．Ｉ．の約15分前に筋中注射した。Ａ．Ｉ．を、Poll Dorse tラムから新たに集めた精子を使用して行う。精子を、等部の濾過リン酸塩緩衝液化生理食塩水で希釈し、そして0.2mlの上記希釈精子を、子宮角毎に注射する。Ａ．Ｉ．−直前又は直後に、ドナーに、AMOXYPEN(Vet−Drug)の筋中注射を与える。受精卵を、１日目の午後5:00から食物及び水からのドナーの飢餓後２日目に回収する。回収を、体重10kg当り３mlの投与量における５％チオペントン・ナトリウム（INTRAVAL SODIUM，Vet−Drug）の静脈内注射により誘導される一般的な麻酔下で行う。麻酔を、挿管後１−２％ハロタン／Ｏ₂／N₂Oの吸入により維持する。この受精卵を回収するために、腹腔鏡切開を行い、そしてその子宮を、体外に出す。これらの卵を、ニュー・ジーランド起源のウシ血清アルブミンを補完した Ovum Culture Medium(Advanced Protein Products，Brierly Hill，West Midlan ds，UK)によるその卵管の逆方向フラッシングにより回収する。フラッシング後、その子宮を、その腹に戻し、そしてその切開を閉じる。ドナーを、術後回復せしめ、又は安楽死させる。回復に供されたドナーに、手術の直前又は直後に、製造者の推奨投与量においてAmoxypen L．A.の筋中注射を与えた。上記３つのフィブリノーゲン鎖発現ユニットを含むプラスミドを、MluＩで消化し、そしてそれらの発現ユニット断片を、回収し、そしてスクロース密度勾配上で精製する。この断片濃度を、蛍光計により測定し、そして上記のようなカルシウム及びマグネシウムを含まないDulbecco'Sリン酸塩緩衝液化生理食塩水中で希釈する。この濃度を、６μｇ／mlに調整し、そして約２plの上記混合物を、肉眼で観察できる前核をもつ各受精卵の中の１の前核内にマイクロインジェクトした。前核マイクロインジェクションを生き延びた全ての受精卵を、20ｖ／ｖ％精管切断ラム血清を補完した重炭酸塩緩衝液化合成卵管培地（表参照）中で、５％ C O₂：５％Ｏ₂：90％Ｎ₂及び約〜100 ％湿度の雰囲気中38.5℃においてインビトロにおいて培養した。この血清は、30分間56℃において加熱失活され、そして使用前−20℃において凍結保存されることができる。この受精卵は、（上記マニピュレーション技術により引き起こされる）初期胚死亡率を生ぜしめるのに好適な時間期間にわたり培養される。５又は６細胞分裂まで発達した胚を、同調受容体雌ヒツジに移す。受容体雌ヒツジを、10又は12日目にその場に残された膣内プロゲステロン−含浸スポンジ（Chronogest Ewe Sponge or Chronogest Ewe−Lamb Sponge，Interr est）により処置した。これらの雌ヒツジに、−１日目のスポンジ除去において、1.5ml（300iu）の卵胞刺激ホルモン代替物(P．M．S．G.，Intervet)を、そして0.5mlの黄体融解剤(Estrumate，Coopers Pitman−Moore)を、筋中注射する。これらの雌ヒツジを、０と１日目において午前8:00と午後5:00の間、精管切除ラムを用いて発情期についてテストする。インビトロにおける培養を生き延びた胚を、６又は７日目に（５又は６日目の午前5:00から断食させた）受容体に戻す。胚転移を、上記のような一般的な麻酔下で行う。その子宮を、腹腔鏡を用いた又は用いない腹腔鏡切開を介して体外に出した。胚を、少なくとも１の好適な黄体をもつ雌ヒツジにおいてのみ、１又は両方の子宮角に戻す。子宮を戻した後、その腹を閉じ、そして受容体を回復せしめる。これらの動物に、手術直前又は直後に製造者推奨投与量においてAmoxypen L．A.の筋中注射を与える。ラムを、耳タブにより同定し、そして飼養のために、それらの母と共に放置する。雌ヒツジとラムを、屋内に閉じこめ、そして完全食餌濃縮物又は他の補充成分を及び又は任意に飼養し、又は牧草に放牧するかのいずれかとする。生後第１週以内（又は健康を害せずにその後可能な限り早く）、各ラムを、２つのサンプリング手順により異種DNAの存在についてテストする。10mlの血液サンプルを、頸静脈からEDTA真空容器内に採取する。健康状態が十分に良い場合には、ラムは、上記第１週以内に採取される、第２の10ml血液サンプルをももつ。（通常“テイリング”後200分以内の）その近位１／３へのゴム・エラストレーター（elastrator）リングの適用後に尾が痛感脱失されるようになった後できるだけ速く、組織サンプルを尾生検により採取する。この組織を、尾緩衝液の溶液中に直ちに入れる。尾サンプルを、室温において維持し、そして採取の日に分析する。全てのラムに、生検直後に製造者の推奨投与量においてAmox ypen L．A.の筋中注射を与え、そしてその尾の切断端を、抗生物質スプレーを用いてスプレーする。 DNAを、白血球を最初に分離することによりヒツジ血液から抽出する。10mlの血液サンプルを、20mlのHank's緩衝液化生理食塩水中で希釈する（HBS；Sigma C hemical Co.から得られたもの）。10mlの希釈血液を、２つの15mlスクリュー− キャップ管の各々の内の５mlのHistopaque(Sigma)上に重層する。これらの管を、3000rpm（2000×ｇ最大）において遠心分離し、室温において15分間ロー・ブレーキをかけた。白血球界面を、きれいな15ml管に取り出し、そしてHBS中で15m lに希釈する。希釈された細胞を、室温において10分間3000rpmにおいて回転させ、そしてその細胞ペレットを、回収し、そして２−５mlの尾バッファー中に再懸濁させる。上記白血球からDNAを抽出するために、10％ SDSを、１％の最終濃度まで上記再懸濁細胞に添加し、そしてその管を、逆さにしてその溶液を混合する。１mgの新たなプロティナーゼＫ溶液を添加し、そしてその混合物を45℃において一夜インキュベートする。DNAを、等容量のフェノール／クロロホルム（３倍）及びクロロホルム／イソアミル・アルコール（１倍）を使用して抽出する。次にこのDN Aを、0.1容量の３Ｍ NaOAc及び２容量のエタノールの添加により沈降させ、そしてその管を逆さにして混合する。この沈澱DNAを、密閉端をもつきれいなガラス棒を使用して糸巻状に取り出す(Spooled out)。このスプールを、70％エタノール中で洗浄し、そしてそのDNAを部分的に乾燥せしめ、次にTE(10mM Tris−HCl， 1mM EDTA， pH7.4)中に再溶解する。血液及び尾からのDNAサンプルを、BLGプロモーター領域及びフィブリノーゲン鎖コーディング領域のためのプローブを使用してサザン・ブロッティングにより分析する。これまで、本発明の特定の態様を説明の目的をもって本明細書中に説明してきたが、さまざまな修正を、本発明の本質及び範囲から逸脱せずに行うことができることが、理解されるであろう。従って、本発明は、添付クレームによる場合を除き、限定されない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ガーナー，イアンイギリス国，エジンバライーエイチ８７ディーダブリュ，リスモアアベニュ 13 (72)発明者ダルリンプル，マイケルエー. イギリス国，エジンバライーエイチ６４エイチビー，ノースフォートストリート 21 (72)発明者プランカード，ドンナイー. アメリカ合衆国，ワシントン 98117，シアトル，シックスティーフィフスストリート＃201，ノースウエスト 3200 (72)発明者フォスター，ドナルドシー. アメリカ合衆国，ワシントン 98155，シアトル，ワンハンドレッドエイティファーストストリートノースイースト 3002

Claims

【特許請求の範囲】１．フィブリノーゲンの製造方法であって、フィブリノーゲンＡα鎖に作用可能な状態で連結された分泌シグナルをコートする第１DNAセグメント、フィブリノーゲンＢβ鎖に作用可能な状態で連結された分泌シグナルをコードする第２DNAセグメント、及びフィブリノーゲンγ鎖に作用可能な状態で連結された分泌シグナルをコードする第３DNAセグメントを提供し、ここで、この第１、第２及び第３セグメントの各々が、宿主雌哺乳動物の乳腺内でのその発現に要求される追加のDNAセグメントに作用可能な状態で連結されており；非−ヒト哺乳類種の受精卵内に上記のDNAセグメントを導入し；上記のDNA構築物を担持する子孫を得るために上記種の雌の卵管又は子宮内に上記の卵を挿入し；上記第１、第２及び第３DNAセグメントを発現し、そしてこれらのセグメントによりコードされたバイオコンピテント・フィブリノーゲンを含む乳を産生する雌子供(progeny)を作出するようにその子孫を育種し；その雌子供から乳を集め；そしてその乳から上記フィブリノーゲンを回収する、ことを含んで成る方法。２．種が、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウシから成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。３．第１、第２及び第３DNAセグメントの各々が、イントロンを含んで成る、請求項１に記載の方法。４．第１、第２及び第３DNAセグメントのモル比が、0.5−１：0.5−１：0.5− １のレンジ内にある、請求項１に記載の方法。５．第１、第２及び第３DNAセグメントの各々が、カゼイン、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン及びホエー酸性タンパク質遺伝子プロモーターから成る群から選ばれた転写プロモーターに作用可能な状態で連結されている、請求項１に記載の方法。６．第１、第２及び第３DNAセグメントが、β−ラクトグロブリン・プロモーターの制御下で発現される、請求項１に記載の方法。７．導入段階が、受精卵の前核内に第１、第２及び第３DNAセグメントを注射することを含んで成る、請求項１に記載の方法。８．フィブリノーゲンが、ヒト・フィブリノーゲンである、請求項１に記載の方法。９．第２DNAセグメントが、ヌクレオチド470からヌクレオチド8100までの配列番号：３中に示すようなヌクレオチドの配列を含んで成る、請求項１に記載の方法。 10．第２DNAセグメントが、ヌクレオチド512からヌクレオチド8100までの配列番号：３中に示すようなヌクレオチドの配列を含んで成る、請求項１に記載の方法。 11．フィブリノーゲンの製造方法であって： β−ラクトグロブリン遺伝子内にフィブリノーゲンのＡα鎖に作用可能な状態で連結された分泌シグナルをコードする第１DNAセグメントを取り込ませて第１遺伝子融合物を作り出し； β−ラクトグロブリン遺伝子内にフィブリノーゲンのＢβ鎖に作用可能な状態で連結された分泌シグナルをコードする第２DNAセグメントを取り込ませて第２遺伝子融合物を作り出し； β−ラクトグロブリン遺伝子内にフィブリノーゲンのγ鎖に作用可能な状態で連結された分泌シグナルをコードする第３DNAセグメントを取り込ませて第３遺伝子融合物を作り出し；上記のDNAセグメントが、その哺乳類又はその雌子供の乳腺内で発現されそしてバイオコンピテント・フィブリノーゲンがその哺乳動物又はその雌子供の乳中に分泌されるように、非−ヒト哺乳類の生殖細胞系内に上記第１、第２及び第３遺伝子融合物を導入し；その哺乳類又はその雌子供から乳を得て；そしてその乳から上記フィブリノーゲンを回収する、ことを含んで成る方法。 12．哺乳類が、ヒツジ、ブタ、ヤギ又はウシである、請求項11に記載の方法。 13．第１、第２及び第３遺伝子融合物の各々が、イントロンを含んで成る、請求項11に記載の方法。 14．導入された第１、第２及び第３遺伝子融合物のモル比が、0.5−１：0.5− １：0.5−１のレンジ内にある、請求項11に記載の方法。 15．導入段階が、第１、第２及び第３遺伝子融合物を受精卵の前核内に導入し、そして妊娠雌の卵管内にその卵を挿入して、その生殖細胞系内にその遺伝子融合物を担持する雌子孫を作出することを含んで成る、請求項11に記載の方法。 16．フィブリノーゲンの製造方法であって：フィブリノーゲンのＡα，Ｂβ及びγ鎖をコードする異種DNAセグメントをその生殖細胞系内に担持するトランスジェニック雌非ヒト哺乳類を提供し、ここで、これらのDNAセグメントが、その哺乳類の乳腺中で発現され、そしてそれらのセグメノトによりコードされたフィブリノーゲンが、その哺乳類の乳中に分泌され；その哺乳類から乳を集め；そしてその乳から上記フィブリノーゲンを回収する、ことを含んで成るような方法。 17．哺乳類が、ヒツジ、ブタ、ヤギ又はウシである、請求項16に記載の方法。 18．フィブリノーゲンのＡα，Ｂβ及びγ鎖をコードする異種DNAセグメントをその核内に含む非−ヒト哺乳類胚。 19．その乳中に回収可能な量のヒト・フィブリノーゲンを産出するトランスジェニック非−ヒト雌哺乳類。 20．哺乳類のトランスジェニック子孫の生産方法であって：フィブリノーゲンＡα鎖をコードする第１DNAセグメント、フィブリノーゲンＢβ鎖をコードする第２DNAセグメント、及びフィブリノーゲンγ鎖をコードする第３DNAセグメントを提供し、ここで、この第１、第２及び第３セグメントの各々が、宿主雌哺乳類の乳腺中でのその発現及びその宿主雌哺乳類の乳中への分泌のために必要な追加のDNAセグメントに作用可能な状態で連結されており；非ヒト種の哺乳類の受精卵内にこれらのDNAセグメントを導入し；上記第１、第２及び第３DNAセグメントを担持する子孫を得るために、その非ヒト種の雌の卵管又は子宮内に上記卵を挿入する、ことを含んで成るような方法。 21．子孫が、雌である、請求項20に記載の方法。 22．子孫が、雄である、請求項20に記載の方法。 23．請求項20に記載の方法により作出された非−ヒト哺乳類。 24．哺乳類が、雌である、請求項23に記載の非ヒト哺乳類。 25．DNAセグメントによりコードされたバイオコンピテント・フィブリノーゲンを含む乳を産出する、請求項24に記載の雌哺乳類。 26．哺乳類が、雄である、請求項23に記載の非ヒト哺乳類。 27．フィブリノーゲンの異種Ａα，Ｂβ及びγ鎖をコードするDNAセグメントをその生殖細胞系内に担持する非ヒト哺乳類であって、その哺乳類の雌子供が、乳腺中にそのDNAセグメントを発現してバイオコンピテント・フィブリノーゲンを作り出すような哺乳類。 28．子孫が、雌である、請求項27に記載の哺乳類。 29．子孫が、雄である、請求項27に記載の哺乳類。