CN103995077B - 一种测定奶粉中β-乳球蛋白含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定奶粉中β-乳球蛋白含量的方法，包括如下步骤：(1)选择TK-11为特异性肽段进行β-乳球蛋白定量；(2)合成上述肽段，同位素标记肽段；(3)采用同位素稀释质谱法对合成的标准肽段进行准确定量；(4)样品处理及酶切；(5)液质分析：酶切处理后的溶液滤膜过滤后，滤液采用质谱进行选择性离子扫描分析；(6)根据公式计算完成奶粉中β-乳球蛋白含量的测定。本发明所述方法测定结果准确、合理。

Description

一种测定奶粉中β-乳球蛋白含量的方法

技术领域

本发明涉及一种蛋白含量的测定方法，特别是涉及一种用于测定奶粉中β-乳球蛋白含量的方法。

背景技术

β-乳球蛋白(β-lactoglobulin)是鲜奶当中蛋白质的一种，约占鲜奶蛋白质的7～12％。β-乳球蛋白单体由162个氨基酸残基组成。该蛋白具有稳定的分子结构，不易被胃蛋白酶消化酶解，因此极易通过胃肠道的途径加入到人体血液循环当中，容易刺激免疫系统发生超敏反应，对于婴儿来说是主要的过敏原，容易造成婴儿的过敏(婴儿的消化系统尚未发育完全，β-乳球蛋白较容易“整颗”被吸收，而被免疫系统判断为病原)。β-乳球蛋白有A，B，C3种不同变型。主要是A和B，pI在5.1-5.3之间。结构和性质随pH值变化很大。

目前蛋白含量的方法有很多种，但大致可以归为几类：一是需要借助抗体，如酶联免疫法、放射免疫扩散法和免疫印记；二是根据不同分子结构的物质对电磁辐射选择性吸收，如紫外分光光度法；三是根据离子迁移速度，如毛细管电泳技术；四是阳离子交换色谱柱进行高效液相色谱测定含量。其中，酶联免疫吸附测定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，简称ELISA)采用ELISA测定蛋白含量具有灵敏度高、最小检测限低、样品无需纯化等特点但该法受环境和操作人员的影响较大，对于定量重复差；放射免疫扩散法的检测范围有限；准确度不高并且存在一定的放射危害；紫外分光光度法具有快速简便的特点，但误差大；而凝胶色谱法适用于高纯度的样品测定；而用阳离子交换色谱柱进行高效液相色谱测定方法，提高了定量的准确性，但此方法的流动相中使用了大量的NaCl，对高压液相色谱仪来讲是最忌讳的，对仪器损害非常大。因而，探寻一种成本低廉、检测快速、准确、适用于测定奶粉中β-乳球蛋白含量的方法是十分必要的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种测定结果准确、合理的测定奶粉中β-乳球蛋白含量的方法。

一种测定奶粉中β-乳球蛋白含量的方法，包括如下步骤：

(1)选择TPEVDDEALEK，即TK-11为特异性肽段进行β-乳球蛋白定量；

(2)合成上述肽段，同时使用同位素标记氨基酸合成对应的同位素标记肽段；

(3)以国家缬氨酸、脯氨酸和亮氨酸有证标准物质为标准，以同位素标记缬氨酸、脯氨酸和亮氨酸为内标，采用同位素稀释质谱法对合成的标准肽段进行准确定量；

(4)样品处理及酶切：称取0.1g奶粉样品溶于0.8g的PBS-T磷酸缓冲盐溶液中，在60℃下水浴加热15min，每2min摇晃一次样品溶液；水浴结束后，加入15.2g50mM的NH4HCO3溶液，混匀；将样品溶液在8437g离心力下离心20分钟，取出3g上清液，加入6g50mM的NH₄HCO₃溶液稀释三倍，取2.7g溶液进行超滤，超滤管截留分子量为3kDa，离心力为6500g，离心15分钟，加入1mL50mM的NH₄HCO₃溶液进行淋洗，离心力为6500g，离心15分钟，共淋洗5次，然后加入100μL浓度为0.095mg/g的同位素标记TK-11溶液并称重，加入35μL0.1M的二硫苏糖醇溶液，在60℃水浴中加热15min，然后加入35μL0.1M的碘乙酰胺，在封闭抽屉里反应40min，加入105μL0.1M的DTT还原多余的IAA，加入5μL0.5mg/mL的Trypsin溶液在37℃进行酶切，酶切16小时后加入200μL0.1MHCl溶液终止酶切反应；

(5)液质分析：酶切处理后的溶液用0.22μm滤膜过滤后，滤液采用液相色谱进行分离、采用质谱进行选择性离子扫描分析；

(6)奶粉中β-乳球蛋白含量的测定：根据质谱测定的TK-11与同位素标记TK-11的峰面积比及强度，配制相应比例非标记TK-11与同位素标记TK-11的混合标准液。根据单点法或括弧法计算酶解液中肽段TK-11含量，根据公式四计算奶粉溶液中已被酶解的β-乳球蛋白的含量，g/g，表示为c₃：

公式四： $c_3=\frac{{m_{\mathrm{TK}-11}}^{\′}\·{\mathrm{MW}}_{\mathrm{Pro}}}{{m_S}^{\′}\·{\mathrm{MW}}_{\mathrm{TK}-11}}$

式中，m_TK-11'为根据单点法或括弧法计算出的奶粉酶解液中TK-11的质量，g；MW_TK-11为TK-11的分子量；MW_Pro为β-乳球蛋白的分子量；m_S'为奶粉溶液的质量，g；

根据公式五计算出奶粉中β-乳球蛋白的含量：

公式五： $c=\frac{c_3\·{m_S}^{\′}}{m\·E}$

式中，c₃为根据公式四计算出的奶粉溶液中已被酶解的β-乳球蛋白的含量，g/g；m_s'为奶粉溶液的质量，g；m为称取奶粉的质量g，E为酶切效率。

本发明所述的测定奶粉中β-乳球蛋白含量的方法，其中，步骤(5)中所述液质分析条件为：

色谱柱：ZORBAXSB-Aq，3.5μm，2.1×150mm；柱温：40℃；进样量为10μL；流速为0.2mL/min；流动相包括A相和B相，其中，所述A相为含体积百分比0.1％甲酸的水，所述B相为含0.1％甲酸的乙腈，梯度洗脱条件见表1；

质谱采用ESI电离源，在正电荷条件下，采用选择性离子扫描的模式进行目标离子捕获，监测离子为TK-11，m/z＝623，以及同位素标记的TK-11，m/z＝625；壳气流速为30au，辅助气流速为10au；毛细管温度设为270℃，喷涂电压为3000V。

表1HPLC-IDMS分析酶解肽段的液相梯度条件

本发明所述的测定奶粉中β-乳球蛋白含量的方法，其中所述酶切效率E的计算过程包括如下步骤：

称取10mgβ-乳球蛋白纯品国家有证标准物质，按步骤(4)中所述方法进行样品处理与酶切，按步骤(5)中所述液质条件进行分析；根据质谱测定的TK-11与同位素标记TK-11的峰面积比及强度，配制相应比例非标记TK-11与同位素标记TK-11的混合标准液。根据单点法或括弧法计算酶解液中肽段TK-11含量，根据公式一计算β-乳球蛋白纯品国家有证标准物质溶液中已被酶解的β-乳球蛋白的含量；

公式一： $c_1=\frac{m_{\mathrm{TK}-11}\·{\mathrm{MW}}_{\mathrm{Pro}}}{m_S\·{\mathrm{MW}}_{\mathrm{TK}-11}}$

式中，c₁为β-乳球蛋白纯品国家有证标准物质溶液中已被酶解的β-乳球蛋白的含量，g/g；m_TK-11为根据单点法或括弧法计算出的β-乳球蛋白纯品国家有证标准物质酶解液中TK-11的质量，g；MW_TK-11为TK-11的分子量；MW_Pro为β-乳球蛋白的分子量；m_S为β-乳球蛋白纯品国家有证标准物质溶液的质量，g；

β-乳球蛋白国家有证标准物质的配制值按公式二计算：

公式二： $c_2=\frac{m_0}{m_S}\·P$

式中，m₀为加入的β-乳球蛋白国家有证标准物质的质量，g；P为β-乳球蛋白国家有证标准物质的含量，g/g；m_s为β-乳球蛋白纯品国家有证标准物质溶液的质量，g；c₂为β-乳球蛋白国家有证标准物质的配制值，g/g；

根据公式三计算β-乳球蛋白的酶切效率：

公式三： $E=\frac{c_1}{c_2}\×100\%$

式中，c₁为根据公式一计算出的β-乳球蛋白纯品国家有证标准物质溶液中已被酶解的β-乳球蛋白的含量，g/g；c₂为根据公式二计算出的β-乳球蛋白国家有证标准物质的配制值，g/g；E为酶切效率。

本发明所述的测定奶粉中β-乳球蛋白含量的方法，其中在步骤(6)之后还包括测定结果的不确定度评定方法，包括如下步骤：建立包括各次天平称量、测量结果重复性、酶解效率、TK-11含量测定结果、β-乳球蛋白标准物质定值结果及称量相关性在内的不确定度模型，计算以上各个不确定度分量的灵敏系数，按照公式六计算测定结果的合成标准不确定度：

公式六： $u_c=\sqrt{c_1^2{u}_1^2+c_2^2{u}_2^2+c_3^2{u}_3^2+c_4^2{u}_4^2+c_5^2{u}_5^2+c_6^2{u}_6^2}$

式中，u_c为测定结果的标准扩展不确定度；u₁和c₁为各次天平称量结果不确定度及对应的灵敏系数；u₂和c₂为测量结果重复性的不确定度及对应的灵敏系数；u₃和c₃为酶解效率的不确定度及对应的灵敏系数；u₄和c₄为TK-11含量测定结果的不确定度及对应的灵敏系数；u₅和c₅为β-乳球蛋白标准物质定值结果的不确定度及对应的灵敏系数；u₆和c₆为称量相关性的不确定度及对应的灵敏系数。

本发明所述的测定奶粉中β-乳球蛋白含量的方法，其中在步骤(1)之前还包括含油β-乳球蛋白的奶粉样品的制备方法，包括如下步骤：将含有β-乳球蛋白的奶粉分装至7mL棕色西林瓶中，每瓶分装2.5g，分装好的奶粉样品在4℃冰箱中保存。

本发明测定奶粉中β-乳球蛋白含量的方法与现有技术不同之处在于：

(1)采用同位素稀释质谱基准方法对标准肽段含量进行测定，在定量时选用了多个氨基酸标准物质测定结果的平均值计算标准肽段含量，保证了定值测定结果的准确性与溯源性；

(2)采用同位素稀释质谱方法对奶粉中的β-乳球蛋白含量进行测定，同时采用β-乳球蛋白纯品国家有证标准物质对酶解效率进行测定和修正，保证了奶粉中的β-乳球蛋白含量测定结果测准确性与溯源性；

(3)完全按照《ISO/IECGuide98-3:2008Uncertaintyofmeasurement--Part3:Guidetotheexpressionofuncertaintyinmeasurement(GUM:1995)》的要求，在不做简化的条件下对测量过程中的各项不确定度进行评定，保证了评定结果的合理准确。

本发明建立的方法拥有着很好的重现性与稳定性，本方法能够准确测定奶粉中β-乳球蛋白含量，并通过β-乳球蛋白和脯氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸等国家有证标准物质可以溯源到SI单位，这对研制含β-乳球蛋白奶粉标准物质有着重要意义，同时可以提高不同实验室不同定值结果的可比性。

下面结合附图对本发明的测定奶粉中β-乳球蛋白含量的方法作进一步说明。

附图说明

图1为同位素稀释质谱法检测奶粉样品酶解液的总离子色谱图和提取离子色谱图；

图2为奶粉中β-乳球蛋白含量溯源途径。

具体实施方式

实施例1

1、使用的仪器：

分析天平：(METTLERTOLEDOXS205型，最大称量为81g，精度为0.01mg，美国)；(METTLERTOLEDOXP56型，最大称量为52g，精度为0.001mg，美国)；

恒温摇床(S16R-2型，SHELLAB，美国)；

烘箱(UFE500型，MEMMERT，美国)；

液相色谱-质谱联用仪(TSQVantageTripleQuardLC/MS，Thermo，美国)；

高速离心机(3K15型，Sigma，德国)；

超纯水系统(Milli-Q型，MILLIPORE，美国)；

离心超滤管(Amiconultra-4型，Millipore，美国)。

如图1和图2所示，一种测定奶粉中β-乳球蛋白含量的方法，包括如下步骤：

1、奶粉中β-乳球蛋白含量标准物质样品制备过程：将含有β-乳球蛋白的奶粉分装至7mL棕色西林瓶中，每瓶分装2.5g，分装好的奶粉样品在4℃冰箱中保存。

2、奶粉中β-乳球蛋白含量标准物质定值：

(1)选择TPEVDDEALEK(TK-11)为特异性肽段进行β-乳球蛋白定量。

(2)合成上述肽段，同时使用同位素标记氨基酸合成对应的同位素标记肽段。

(3)以国家缬氨酸、脯氨酸和亮氨酸有证标准物质为标准，以同位素标记缬氨酸、脯氨酸和亮氨酸为内标，采用同位素稀释质谱法对合成的标准肽段进行准确定量。

(4)样品处理及酶切：分别称取0.1g奶粉样品和10mgβ-乳球蛋白纯品国家有证标准物质溶于0.8g的PBS-T磷酸缓冲盐溶液中，进行如下处理：在60℃下水浴加热15min，并且每2min摇晃一次样品溶液。水浴结束后，加入15.2g50mM的NH₄HCO₃溶液，混匀。将样品溶液在大约8000g离心力下离心20分钟。取出3g上清液，加入6g50mM的NH₄HCO₃溶液稀释三倍。取2.7g溶液进行超滤，超滤管截留分子量为3kDa，离心力为6500g，离心15分钟。加入1mL50mM的NH₄HCO₃溶液进行淋洗，离心力为6500g，离心15分钟。共淋洗5次。然后加入100μL浓度约为0.095mg/g的同位素标记TK-11溶液并称重。加入35μL0.1M的二硫苏糖醇(DTT)溶液在60℃水浴中加热15min。然后加入35μL0.1M的碘乙酰胺(IAA)，在封闭抽屉里反应40min。加入105μL0.1M的DTT还原多余的IAA。加入5μL0.5mg/mL的Trypsin溶液在37℃进行酶切，酶切16小时后加入200μL0.1MHCl溶液终止酶切反应。用0.22μm滤膜过滤后采用质谱进行选择性离子扫描分析。

(5)液质分析条件：色谱柱：ZORBAXSB-Aq(3.5μm,2.1×150mm；安捷伦，美国)；柱温：40℃；进样量为10μL；流速为0.2mL/min。流动相中A相为含0.1％甲酸的水，B相为含0.1％甲酸的乙腈。梯度条件见表1。质谱采用ESI电离源，在正电荷条件下，采用选择性离子扫描的模式(SIM)进行目标离子捕获。监测离子为TK-11(m/z＝623)以及同位素标记的TK-11(m/z＝625)。壳气流速为30au，辅助气流速为10au。毛细管温度设为270℃，喷涂电压为3000V。

表1HPLC-IDMS分析酶解肽段的液相梯度条件

(6)样品溶液中已被酶解的β-乳球蛋白的含量：酶解液经过液相色谱——同位素稀释质谱分离分析后的得到的总离子流色谱图如图1上图所示，按照母离子—>子离子对提取以后，得到TK-11(图1，中图)和同位素标记TK-11的色谱图(图1，下图)。由于可见，不论标记还是非标记TK-11，都具有足够的信号强度并且不受酶解液中其它肽段及杂质的干扰。根据质谱测定的TK-11与同位素标记TK-11的峰面积比及强度，配制相应比例非标记TK-11与同位素标记TK-11的混合标准液。根据单点法或括弧法计算酶解液中肽段TK-11含量，根据公式一计算β-乳球蛋白纯品国家有证标准物质溶液中已被酶解的β-乳球蛋白的含量。

公式一： $c_3=\frac{{m_{\mathrm{TK}-11}}^{\′}\·{\mathrm{MW}}_{\mathrm{Pro}}}{{m_S}^{\′}\·{\mathrm{MW}}_{\mathrm{TK}-11}}$

式中，c₁为β-乳球蛋白纯品国家有证标准物质溶液中已被酶解的β-乳球蛋白的含量(g/g)；m_TK-11为质谱测得的β-乳球蛋白纯品国家有证标准物质酶解液中TK-11的质量(g)；MW_TK-11为TK-11的分子量；MW_Pro为β-乳球蛋白的分子量；m_S为β-乳球蛋白纯品国家有证标准物质溶液的质量(g)。

根据公式一算出c₁为8.7×10^-6g/g。

(7)酶解效率计算：

(8)β-乳球蛋白国家有证标准物质的配制值按公式二计算：

公式二： $c_2=\frac{m_0}{m_S}\·P$

式中，m₀为加入的β-乳球蛋白国家有证标准物质的质量(g)；P为β-乳球蛋白国家有证标准物质的含量(g/g)；m_s为β-乳球蛋白纯品国家有证标准物质溶液的质量(g)；c₂为β-乳球蛋白国家有证标准物质的配制值(g/g)。

根据公式二算出c₂为9×10^-5g/g。

根据公式三计算β-乳球蛋白的酶切效率：

公式三： $E=\frac{c_1}{c_2}\×100\%$

式中，c₁为根据公式一计算出的β-乳球蛋白纯品国家有证标准物质溶液中已被酶解的β-乳球蛋白的含量(g/g)；c₂为根据公式②计算出的β-乳球蛋白国家有证标准物质的配制值(g/g)；E为酶切效率。

根据公式一算出E为9.7％。

(9)奶粉中β-乳球蛋白含量的计算：

公式四： $c_3=\frac{{m_{\mathrm{TK}-11}}^{\′}\·{\mathrm{MW}}_{\mathrm{Pro}}}{{m_S}^{\′}\·{\mathrm{MW}}_{\mathrm{TK}-11}}$

式中，c₃为奶粉溶液中已被酶解的β-乳球蛋白的含量(g/g)；m_TK-11'为质谱测得的奶粉酶解液中TK-11的质量(g)；MW_TK-11为TK-11的分子量；MW_Pro为β-乳球蛋白的分子量；m_S'为奶粉溶液的质量(g)。

根据公式四算出c₃为3.3×10^-6g/g。

根据公式五计算出奶粉中β-乳球蛋白的含量c：

公式五： $c=\frac{c_3\·{m_S}^{\′}}{m\·E}$

式中，c₃为根据公式四计算出奶粉溶液中已被酶解的β-乳球蛋白的含量(g/g)；m_s'为奶粉溶液的质量(g)；m为称取奶粉的质量(g)；E为酶切效率。

根据公式五算出c为0.02g/g。

根据分析步骤，β-乳球蛋白含量采用基于肽段的同位素稀释质谱方法进行测定，测量结果可直接溯源到TK-11肽段上(图2)，TK-11的含量采用基于氨基酸分析的同位素稀释质谱方法测定，其结果可直接溯源到国家氨基酸有证标准物质上，而国家氨基酸有证标准物质的量值可最终溯源到SI单位，所以采用本方法测定的奶粉中β-乳球蛋白含量结果可最终溯源到SI单位。

(9)测定结果的不确定度评定：根据《ISO/IECGuide98-3:2008Uncertaintyofmeasurement--Part3:Guidetotheexpressionofuncertaintyinmeasurement(GUM:1995)》的要求，建立包括各次天平称量、测量结果重复性、酶解效率、TK-11含量测定结果、β-乳球蛋白标准物质定值结果及称量相关性在内的不确定度模型，计算以上各个不确定度分量的灵敏系数，按照公式六计算测定结果的合成标准不确定度：

公式六： $u_c=\sqrt{c_1^2{u}_1^2+c_2^2{u}_2^2+c_3^2{u}_3^2+c_4^2{u}_4^2+c_5^2{u}_5^2+c_6^2{u}_6^2}$

式中，u_c为测定结果的标准扩展不确定度；u₁和c₁为各次天平称量结果不确定度及对应的灵敏系数；u₂和c₂为测量结果重复性的不确定度及对应的灵敏系数；u₃和c₃为酶解效率的不确定度及对应的灵敏系数；u₄和c₄为TK-11含量测定结果的不确定度及对应的灵敏系数；u₅和c₅为β-乳球蛋白标准物质定值结果的不确定度及对应的灵敏系数；u₆和c₆为称量相关性的不确定度及对应的灵敏系数。

根据公式六算出u_c为5.9％。

最终结论：本实施例中奶粉中β-乳球蛋白的含量为0.019～0.021g/g。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (2)

1.一种测定奶粉中β-乳球蛋白含量的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)选择TPEVDDEALEK，即TK-11为特异性肽段进行β-乳球蛋白定量；

(2)合成上述肽段，同时使用同位素标记氨基酸合成对应的同位素标记肽段；

(3)以国家缬氨酸、脯氨酸和亮氨酸有证标准物质为标准，以同位素标记缬氨酸、脯氨酸和亮氨酸为内标，采用同位素稀释质谱法对合成的标准肽段进行准确定量；

(4)样品处理及酶切：称取0.1g奶粉样品溶于0.8g的PBS-T磷酸缓冲盐溶液中，在60℃下水浴加热15min，每2min摇晃一次样品溶液；水浴结束后，加入15.2g50mM的NH4HCO3溶液，混匀；将样品溶液在8437g离心力下离心20分钟，取出3g上清液，加入6g50mM的NH₄HCO₃溶液稀释三倍，取2.7g溶液进行超滤，超滤管截留分子量为3kDa，离心力为6500g，离心15分钟，加入1mL50mM的NH₄HCO₃溶液进行淋洗，离心力为6500g，离心15分钟，共淋洗5次，然后加入100μL浓度为0.095mg/g的同位素标记TK-11溶液并称重，加入35μL0.1M的二硫苏糖醇溶液，在60℃水浴中加热15min，然后加入35μL0.1M的碘乙酰胺，在封闭抽屉里反应40min，加入105μL0.1M的二硫苏糖醇还原多余的碘乙酰胺，加入5μL0.5mg/mL的Trypsin溶液在37℃进行酶切，酶切16小时后加入200μL0.1MHCl溶液终止酶切反应；

(5)液质分析：酶切处理后的溶液用0.22μm滤膜过滤后，滤液采用液相色谱进行分离、采用质谱进行选择性离子扫描分析；

(6)奶粉中β-乳球蛋白含量的测定：根据质谱测定的TK-11与同位素标记TK-11的峰面积比及强度，配制相应比例非标记TK-11与同位素标记TK-11的混合标准液；根据单点法或括弧法计算酶解液中肽段TK-11含量，根据公式四计算奶粉溶液中已被酶解的β-乳球蛋白的含量，g/g，表示为c₃：

公式四： $c_3=\frac{{m_{TK-11}}^{\′}\·{\mathrm{MW}}_{\mathrm{Pr}o}}{{m_S}^{\′}\·{\mathrm{MW}}_{TK-11}}$

式中，m_TK-11'为根据单点法或括弧法计算出的奶粉酶解液中TK-11的质量，g；MW_TK-11为TK-11的分子量；MW_Pro为β-乳球蛋白的分子量；m_S'为奶粉溶液的质量，g；

根据公式五计算出奶粉中β-乳球蛋白的含量：

公式五： $c=\frac{c_3\·{m_S}^{\′}}{m\·E}$

式中，c₃为根据公式四计算出的奶粉溶液中已被酶解的β-乳球蛋白的含量，g/g；m_s'为奶粉溶液的质量，g；m为称取奶粉的质量g，E为酶切效率；

步骤(5)中所述液质分析条件为：

色谱柱：ZORBAXSB-Aq，3.5μm，2.1×150mm；柱温：40℃；进样量为10μL；流速为0.2mL/min；流动相包括A相和B相，其中，所述A相为含体积百分比0.1％甲酸的水，所述B相为含0.1％甲酸的乙腈，梯度洗脱条件如下：

在0、2、20、25、30、35、45min时，流动相A相的比例分别为：97％、97％、70％、3％、3％、97％、97％，流动相B相的比例分别为：3％、3％、30％、97％、97％、3％、3％，流动相流速为0.2mL/min；

质谱采用ESI电离源，在正电荷条件下，采用选择性离子扫描的模式进行目标离子捕获，监测离子为TK-11，m/z＝623，以及同位素标记的TK-11，m/z＝625；壳气流速为30au，辅助气流速为10au；毛细管温度设为270℃，喷涂电压为3000V；

所述酶切效率E的计算过程包括如下步骤：

称取10mgβ-乳球蛋白纯品国家有证标准物质，按步骤(4)中所述方法进行样品处理与酶切，按步骤(5)中所述液质条件进行分析；根据质谱测定的TK-11与同位素标记TK-11的峰面积比及强度，配制相应比例非标记TK-11与同位素标记TK-11的混合标准液；根据单点法或括弧法计算酶解液中肽段TK-11含量，根据公式一计算β-乳球蛋白纯品国家有证标准物质溶液中已被酶解的β-乳球蛋白的含量；

公式一： $c_1=\frac{m_{TK-11}\·{\mathrm{MW}}_{\mathrm{Pr}o}}{m_S\·{\mathrm{MW}}_{TK-11}}$

式中，c₁为β-乳球蛋白纯品国家有证标准物质溶液中已被酶解的β-乳球蛋白的含量，g/g；m_TK-11为根据单点法或括弧法计算出的β-乳球蛋白纯品国家有证标准物质酶解液中TK-11的质量，g；MW_TK-11为TK-11的分子量；MW_Pro为β-乳球蛋白的分子量；m_S为β-乳球蛋白纯品国家有证标准物质溶液的质量，g；

β-乳球蛋白国家有证标准物质的配制值按公式二计算：

公式二： $c_2=\frac{m_0}{m_S}\·P$

式中，m₀为加入的β-乳球蛋白国家有证标准物质的质量，g；P为β-乳球蛋白国家有证标准物质的含量，g/g；m_s为β-乳球蛋白纯品国家有证标准物质溶液的质量，g；c₂为β-乳球蛋白国家有证标准物质的配制值，g/g；

根据公式三计算β-乳球蛋白的酶切效率：

公式三： $E=\frac{c_1}{c_2}\×100\%$

式中，c₁为根据公式一计算出的β-乳球蛋白纯品国家有证标准物质溶液中已被酶解的β-乳球蛋白的含量，g/g；c₂为根据公式二计算出的β-乳球蛋白国家有证标准物质的配制值，g/g；E为酶切效率；

在步骤(6)之后还包括测定结果的不确定度评定方法，包括如下步骤：建立包括各次天平称量、测量结果重复性、酶解效率、TK-11含量测定结果、β-乳球蛋白标准物质定值结果及称量相关性在内的不确定度模型，计算以上各个不确定度分量的灵敏系数，按照公式六计算测定结果的合成标准不确定度：

公式六： $u_c=\sqrt{c_1^2{u}_1^2+c_2^2{u}_2^2+c_3^2{u}_3^2+c_4^2{u}_4^2+c_5^2{u}_5^2+c_6^2{u}_6^2}$

式中，u_c为测定结果的标准扩展不确定度；u₁和c₁为各次天平称量结果不确定度及对应的灵敏系数；u₂和c₂为测量结果重复性的不确定度及对应的灵敏系数；u₃和c₃为酶解效率的不确定度及对应的灵敏系数；u₄和c₄为TK-11含量测定结果的不确定度及对应的灵敏系数；u₅和c₅为β-乳球蛋白标准物质定值结果的不确定度及对应的灵敏系数；u₆和c₆为称量相关性的不确定度及对应的灵敏系数。

2.根据权利要求1所述的测定奶粉中β-乳球蛋白含量的方法，其特征在于：在步骤(1)之前还包括含有β-乳球蛋白的奶粉样品的制备方法，包括如下步骤：将含有β-乳球蛋白的奶粉分装至7mL棕色西林瓶中，每瓶分装2.5g，分装好的奶粉样品在4℃冰箱中保存。