CN105241973A - 蛋白制剂的高效液相色谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了蛋白制剂的高效液相色谱检测方法，包括以下步骤：a、取蛋白制剂，用水溶解后，流动相稀释，制成供试品溶液；b、取对照品，用水溶解，制成对照品溶液；c、采用高效液相色谱分别对供试品溶液、对照品溶液进行检测，检测条件为：色谱柱为氨基柱；流动相为乙腈-水溶液，乙腈与水的体积比为(65：35)～(80：20)。本发明蛋白制剂的检测方法，无需采用梯度洗脱程序，就能实现对蛋白制剂中蔗糖、甘露醇等组分的有效分离，蔗糖和甘露醇之间的分离度高；同时，本发明检测方法，操作简便、快速，检测结果的准确性高，非常适合用于对蛋白制剂中甘露醇、蔗糖等组分的定性和定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白制剂的高效液相色谱检测方法。
背景技术
蛋白制剂中，通常需要加入一些辅料，例如：甘露醇作为赋型剂，蔗糖作为稳定剂，三羟甲基氨基甲烷作为缓冲剂体系。为了控制蛋白制剂的成品质量，通常需要对其组分含量进行检测；但由于其中含有甘露醇、蔗糖等辅料，检测时各组分之间存在干扰，导致其检测方法往往比较繁琐、复杂。
目前，蛋白制剂的检测方法均需要采用两种不同的流动相进行梯度洗脱，实现对蛋白制剂中各个组分的分离，以避免各组分之间的干扰。例如，柏兆方等采用超高效纳升液相色谱-电喷雾串联质谱对重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白进行了分析，它采用特殊的富集柱和分离柱，并采用两种不同的流动相(流动相A：含0.1％甲酸的水溶液；流动相B：含0.1％甲酸的乙氰)进行梯度洗脱，实现重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白中各个组分的有效分离，避免各组分之间的干扰(柏兆方，林碧蓉，李萍，李卫华，刘炳玉，王红霞.《超高效纳升液相色谱-电喷雾串联质谱鉴定重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白》.分析化学研究简报，2009年7月，第37卷，第7期：1025～1028.)。
姚雪静等建立了一种测定注射用重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白含量的方法，也是采用特殊的色谱柱，并采用两种不同的流动相(流动相A液：含0.1％三氟乙酸的水溶液，流动相B液：含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液)进行梯度洗脱(A液从75％渐变至60％，同时B液从25％渐变至40％，洗脱时间：15min)(姚雪静，李壮林.《RP-HPLC法测定注射用重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白的含量》.中国药房，2012年，第23卷，第33期.)。
高凯等建立了一种重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白的质控方法，它使用AgilentZorbax300SBC18(5μm，4.6mm×250mm)色谱柱，采用两种不同的流动相(流动相A液：含0.1％三氟醋酸的水溶液；流动相B液：含0.1％三氟醋酸的乙腈溶液)进行梯度洗脱(洗脱梯度为：0～15min，B液：30％～45％；16～20min，B液：45％～30％)(高凯，陶磊，史新昌，裴德宁，王兰，李响，饶春明，王军志.《重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白质控方法和质量标准的建立》.中国生物制品学杂志，2012年3月，第25卷，第3期.)。
可见，现有技术检测蛋白制剂的方法都比较繁琐、复杂，均需要采用两种不同的流动相进行梯度洗脱，才能实现对蛋白制剂中各个组分的分离。
因此，对于蛋白制剂而言，需要发明一种简便并能有效避免各组分之间相互干扰、实现对各组分有效检测的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供蛋白制剂的一种高效液相色谱检测方法。
本发明提供的蛋白制剂的高效液相色谱检测方法，包括以下步骤：
a、取蛋白制剂，用水溶解后，流动相稀释，制成供试品溶液；
b、取对照品，用水溶解，制成对照品溶液；
c、采用高效液相色谱分别对供试品溶液、对照品溶液进行检测，检测条件为：
色谱柱为氨基柱；流动相为乙腈-水溶液，乙腈与水的体积比为(65：35)～(80：20)。
进一步的，步骤a中，蛋白制剂为注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白。
进一步的，注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白包括以下组分：重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白、甘露醇、蔗糖和三羟甲基氨基甲烷。
进一步的，注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白包括以下重量份配比的组分：重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白25份、甘露醇40份、蔗糖10份和三羟甲基氨基甲烷1.2份。
进一步的，步骤a中，供试品溶液的浓度为2.5mg/ml。
进一步的，步骤b中，对照品为甘露醇、蔗糖、重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白、三羟甲基氨基甲烷中的任意一种或两种以上。
进一步的，步骤c中，色谱柱为AgilentZORBAXCarbohydrate，规格为4.6mm×250mm，填充剂粒径为5μm。
进一步的，步骤c中，乙腈与水的体积比为(75：25)～(80：20)。
进一步的，步骤c中，流动相的流速为1～1.5ml/min；优选的，流动相的流速为1.5ml/min。
进一步的，步骤c中，色谱柱的柱温为30℃；检测器为示差折光检测器，检测器池温度为35℃；上样体积为10μl～20μl。
进一步的，步骤c中，按外标法以峰面积计算供试品中甘露醇、蔗糖、重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白和/或三羟甲基氨基甲烷的含量。
本发明蛋白制剂的检测方法，无需采用梯度洗脱程序，就能实现对蛋白制剂中蔗糖、甘露醇等组分的有效分离，蔗糖和甘露醇之间的分离度高，符合《中国药品检验标准操作规范2010年版》及《中国药典2010年版》的规定(规定要求大于1.5)，避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测方法，操作简便、快速，检测结果的准确性高，非常适合用于对蛋白制剂中甘露醇、蔗糖等组分的定性和定量检测。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1、试验例1条件下对融合蛋白制剂的检测结果：(a)供试品溶液；(b)蔗糖对照品；(c)甘露醇对照品。
图2、试验例2条件下对融合蛋白制剂的检测结果：(a)供试品溶液；(b)融合蛋白原液对照品。
图3、试验例3条件下对融合蛋白制剂的检测结果。
图4、试验例4条件下对融合蛋白制剂的检测结果。
图5、试验例5条件下对融合蛋白制剂的检测结果：曲线1：供试品溶液，曲线2：融合蛋白原液对照品。
图6、试验例6条件下对融合蛋白制剂的检测结果：曲线1：供试品溶液，曲线2：融合蛋白原液对照品。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白：含有重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR：Fc)、甘露醇、蔗糖和三羟甲基氨基甲烷；目前已经上市的产品有美国辉瑞公司生产的恩利-依那西普、上海中信国健药业生产的益赛普和上海赛金生物医药生产的强克等。
融合蛋白原液：重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白。
实施例1
(1)制备供试品溶液
取注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，用1.0ml超净水复溶后，流动相稀释10倍，制成供试品溶液，终浓度为2.5mg/ml；
(2)高效液相色谱检测
采用高效液相色谱对供试品溶液进行检测，供试品溶液的上样体积为10μl，色谱条件为：色谱柱：AgilentZORBAXCarbohydrate，固定相为氨基柱；色谱柱的填充剂粒径为5μm，规格为4.6mm×250mm；流动相：乙腈水溶液，乙腈与水的体积比为65：35；流动相的流速：1ml/min；色谱柱温：30℃；检测器为示差折光检测器，检测器池温度为35℃。
实施例2
(1)制备供试品溶液
取注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，用1.0ml超净水复溶后，流动相稀释10倍，制成供试品溶液，终浓度为2.5mg/ml；
(2)高效液相色谱检测
采用高效液相色谱对供试品溶液进行检测，供试品溶液的上样体积为10μl，色谱条件为：色谱柱：AgilentZORBAXCarbohydrate，固定相为氨基柱；色谱柱的填充剂粒径为5μm，规格为4.6mm×250mm；流动相：乙腈水溶液，乙腈与水的体积比为75：25；流动相的流速：1ml/min；色谱柱温：30℃；检测器为示差折光检测器，检测器池温度为35℃。
实施例3
(1)制备供试品溶液
取注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，用1.0ml超净水复溶后，流动相稀释10倍，制成供试品溶液，终浓度为2.5mg/ml；
(2)高效液相色谱检测
采用高效液相色谱对供试品溶液进行检测，供试品溶液的上样体积为10μl，色谱条件为：色谱柱：AgilentZORBAXCarbohydrate，固定相为氨基柱；色谱柱的填充剂粒径为5μm，规格为4.6mm×250mm；流动相：乙腈水溶液，乙腈与水的体积比为80：20；流动相的流速：1ml/min；色谱柱温：30℃；检测器为示差折光检测器，检测器池温度为35℃。
实施例4
(1)制备供试品溶液
取注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，用1.0ml超净水复溶后，流动相稀释10倍，制成供试品溶液，终浓度为2.5mg/ml；
(2)高效液相色谱检测
采用高效液相色谱对供试品溶液进行检测，供试品溶液的上样体积为20μl，色谱条件为：色谱柱：AgilentZORBAXCarbohydrate，固定相为氨基柱；色谱柱的填充剂粒径为5μm，规格为4.6mm×250mm；流动相：乙腈水溶液，乙腈与水的体积比为80：20；流动相的流速：1ml/min；色谱柱温：30℃；检测器为示差折光检测器，检测器池温度为35℃。
实施例5
(1)制备供试品溶液
取注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，用1.0ml超净水复溶后，流动相稀释10倍，制成供试品溶液，终浓度为2.5mg/ml；
(2)高效液相色谱检测
采用高效液相色谱对供试品溶液进行检测，供试品溶液的上样体积为20μl，色谱条件为：色谱柱：AgilentZORBAXCarbohydrate，固定相为氨基柱；色谱柱的填充剂粒径为5μm，规格为4.6mm×250mm；流动相：乙腈水溶液，乙腈与水的体积比为80：20；流动相的流速：1.5ml/min；色谱柱温：30℃；检测器为示差折光检测器，检测器池温度为35℃。
实施例6
(1)制备供试品溶液
取注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，用1.0ml超净水复溶后，流动相稀释10倍，制成供试品溶液，终浓度为2.5mg/ml；
(2)高效液相色谱检测
采用高效液相色谱对供试品溶液进行检测，供试品溶液的上样体积为10μl，色谱条件为：色谱柱：AgilentZORBAXCarbohydrate，固定相为氨基柱；色谱柱的填充剂粒径为5μm，规格为4.6mm×250mm；流动相：乙腈水溶液，乙腈与水的体积比为80：20；流动相的流速：1.5ml/min；色谱柱温：30℃；检测器为示差折光检测器，检测器池温度为35℃。
为了说明本发明的有益效果，本发明提供以下试验例：
试验例1
(1)制备供试品溶液
取注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，用1.0ml超净水复溶后，流动相稀释10倍，制成供试品溶液，终浓度为2.5mg/ml；
流动相的制备方法：量取650ml乙腈，加入用0.22μm滤膜过滤后的超纯水，定容至1000ml，混匀后，即得。
以蔗糖标准品、甘露醇标准品和自制融合蛋白原液作为对照。
蔗糖对照品溶液的制备方法：准确称取蔗糖0.5g，用超纯水溶解并定容至500ml，用0.22μm滤膜过滤，超声后，备用。
甘露醇对照品溶液的制备方法：准确称取甘露醇2.0g，用超纯水溶解并定容至500ml，用0.22μm滤膜过滤，超声后，备用。
融合蛋白原液的制备方法如下：
1、rhTNFRII-Fc融合蛋白表达载体的构建
采用PCR技术和DNA重组技术将pSV2-dhfr载体(ATCC产品)中的dhfr(二氢叶酸还原酶)表达单元克隆到pCDNA3.1(+)载体(Invitrogen公司产品)中，构建可表达DHFR的哺乳动物细胞表达载体pBF01。
根据hTNFRII的基因序列(Genebank登记号AH006638)和人IgG1Fc片段基因序列(WO9411026)分别设计引物进行PCR扩增，并克隆至PUC18质粒中。
重新设计引物，对上述获得的hTNFRII和人IgG1Fc的cDNA片段进行重叠(overlap)PCR扩增，以得到rhTNFRII-Fc融合蛋白全长cDNA片段，并采用DNA重组技术将其克隆到pBF01载体中，构建可表达rhTNFRII-Fc融合蛋白的重组表达载体pBF01-rhTNFRII-Fc。
2、rhTNFRII-Fc融合蛋白工程细胞的构建
采用脂质体转染法，将构建的重组表达载体pBF01-rhTNFRII-Fc转染Invitrogen公司的CHO-DG44细胞，然后经G418抗性筛选阳性克隆，然后再通过ELISA法筛选高表达抗体的克隆，然后再用MTX(甲氨蝶呤)逐步加压、筛选、克隆，最终获得一株高表达rhTNFRII-Fc融合蛋白的CHO细胞株CHO-BF02。
3、rhTNFRII-Fc融合蛋白的分离纯化
采用批次流加培养方法，得到细胞培养液，并通过Millipore公司的D0HC和B1HC深层滤器按顺序过滤所得到的细胞培养液，收集滤过液后用ProteinA亲和层析法进行纯化。
将MabselectSuRe(GE公司)层析柱以PBS缓冲液冲洗平衡后，以50～300cm/h的速度将细胞培养液上清上样，用PBS缓冲液冲洗直至未结合的蛋白全被洗脱(以A280进行监测)，然后用20mmol/L柠檬酸(pH3.5)洗脱融合蛋白，融合蛋白原液收集后用Tris调节pH值至7.2。
自制融合蛋白原液对照品溶液的制备方法：流动相稀释融合蛋白原液10倍，备用。
(2)高效液相色谱检测
采用高效液相色谱对供试品溶液、对照品溶液进行检测，上样体积为10μl，色谱条件为：色谱柱：AgilentZORBAXCarbohydrate，固定相为氨基柱；色谱柱的填充剂粒径为5μm，规格为4.6mm×250mm；流动相：乙腈水溶液，乙腈与水的体积比为65：35；流动相的流速：1ml/min；色谱柱温：30℃；检测器为示差折光检测器，检测器池温度为35℃。
供试品溶液的检测结果见表1和图1。
表1、试验例1条件下对融合蛋白制剂的检测结果
| 样品 | 供试品1 | 供试品2 | 供试品3 |
| 蔗糖峰面积 | 98016.7 | 100736 | 105419 |
| 计算蔗糖上样量(μg) | 10.99 | 11.30 | 11.82 |
| 蔗糖理论上样量(μg) | 10 | 10 | 10 |
| 蔗糖回收率 | 109.93％ | 112.98％ | 118.24％ |
| 甘露醇峰面积 | 378878 | 391292 | 406908 |
| 计算得甘露醇上样量(μg) | 43.81 | 45.24 | 47.05 |
| 甘露醇理论上样量(μg) | 40 | 40 | 40 |
| 甘露醇回收率 | 109.52％ | 113.11％ | 117.63％ |
| 甘露醇与蔗糖之间的分离度 | 2.66 | 2.64 | 2.63 |
说明：
计算蔗糖上样量：根据供试品的蔗糖峰面积与蔗糖对照品的峰面积比值，以及蔗糖对照品的上样量，通过以下公式计算得到：蔗糖上样量＝蔗糖对照品上样量*供试品蔗糖峰面积/蔗糖对照品峰面积。
蔗糖理论上样量：是指供试品中蔗糖理论上的上样量。
蔗糖回收率＝计算蔗糖上样量/蔗糖理论上样量×100％。
类似地，
计算甘露醇上样量：根据供试品的甘露醇峰面积与甘露醇对照品的峰面积比值，以及甘露醇对照品的上样量，通过以下公式计算得到：甘露醇上样量＝甘露醇对照品上样量*供试品甘露醇峰面积/甘露醇对照品峰面积。
甘露醇理论上样量：是指供试品中甘露醇理论上的上样量。
试验结果表明，本发明在试验例1条件下对融合蛋白制剂进行检测，可以实现对融合蛋白制剂中蔗糖和甘露醇的有效分离，蔗糖和甘露醇之间的分离度均在2.60以上，符合《中国药品检验标准操作规范2010年版》及《中国药典2010年版》的规定(规定要求大于1.5)，避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性。
试验例2
(1)制备供试品溶液
取注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，用1.0ml超净水复溶后，流动相稀释10倍，制成供试品溶液，终浓度为2.5mg/ml；
流动相的制备方法：量取750ml乙腈，加入用0.22μm滤膜过滤后的超纯水，定容至1000ml，混匀后，即得。
以蔗糖标准品、甘露醇标准品和自制融合蛋白原液作为对照。
蔗糖对照品溶液的制备方法：准确称取蔗糖0.5g，用超纯水溶解并定容至500ml，用0.22μm滤膜过滤，超声后，备用。
甘露醇对照品溶液的制备方法：准确称取甘露醇2.0g，用超纯水溶解并定容至500ml，用0.22μm滤膜过滤，超声后，备用。
融合蛋白原液的制备方法：同试验例1；
自制融合蛋白原液对照品溶液的制备方法：流动相稀释10倍，备用。
(2)高效液相色谱检测
采用高效液相色谱对供试品溶液、蔗糖/甘露醇混合溶液、对照品溶液进行检测，上样体积为10μl，色谱条件为：色谱柱：AgilentZORBAXCarbohydrate，固定相为氨基柱；色谱柱的填充剂粒径为5μm，规格为4.6mm×250mm；流动相：乙腈水溶液，乙腈与水的体积比为75：25；流动相的流速：1ml/min；色谱柱温：30℃；检测器为示差折光检测器，检测器池温度为35℃。
蔗糖对照品和甘露醇对照品的检测结果见表2：
表2、试验例2条件下对蔗糖对照品和甘露醇对照品的检测结果
自制融合蛋白原液对照品的检测结果见表3：
表3、试验例2条件下对融合蛋白原液对照品的检测结果
| 自制融合蛋白 | 自制融合蛋白特有位置峰峰面积 | 甘露醇处峰面积 | 蔗糖处峰面积 |
| 样品1 | 6431.9 | 3438.4 | 无 |
| 样品2 | 8274.4 | 3022.0 | 无 |
| 样品3 | 6684.1 | 无 | 无 |
| 样品4 | 9656.0 | 1839.5 | 无 |
| 平均值 | 7761.6 | 2766.6 | 无 |
供试品溶液的检测结果见表4和图2。
表4、试验例2条件下对融合蛋白制剂的检测结果
| 样品 | 供试品4 | 供试品5 |
| 蔗糖峰面积 | 84326.5 | 86216.1 |
| 计算蔗糖上样量(μg) | 9.71 | 9.93 |
| 蔗糖理论上样量(μg) | 10 | 10 |
| 蔗糖回收率 | 97.11％ | 99.28％ |
| 甘露醇峰面积 | 341787 | 346793 |
| 计算得甘露醇上样量(μg) | 39.60 | 40.18 |
| 甘露醇理论上样量(μg) | 40 | 40 |
| 甘露醇回收率 | 99.00％ | 100.45％ |
| 甘露醇与蔗糖之间的分离度 | 6.14 | 6.30 |
| 融合蛋白特有位置峰面积 | 6351.2 | 8041.9 |
试验结果表明，本发明在试验例2条件下对融合蛋白制剂进行检测，可以实现对融合蛋白制剂中蔗糖、甘露醇、重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的分离，甘露醇与蔗糖之间的分离度均在6.10以上，符合《中国药品检验标准操作规范2010年版》及《中国药典2010年版》的规定(规定要求大于1.5)，避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性。
试验例3
(1)制备供试品溶液
取注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，用1.0ml超净水复溶后，流动相稀释10倍，制成供试品溶液，终浓度为2.5mg/ml；
流动相的制备方法：量取800ml乙腈，加入用0.22μm滤膜过滤后的超纯水，定容至1000ml，混匀后，即得。
以蔗糖标准品、甘露醇标准品和自制融合蛋白原液作为对照。
蔗糖对照品溶液的制备方法：准确称取蔗糖0.5g，用超纯水溶解并定容至500ml，用0.22μm滤膜过滤，超声后，备用。
甘露醇对照品溶液的制备方法：准确称取甘露醇2.0g，用超纯水溶解并定容至500ml，用0.22μm滤膜过滤，超声后，备用。
融合蛋白原液的制备方法：同试验例1；
自制融合蛋白原液对照品溶液的制备方法：流动相稀释10倍，备用。
(2)高效液相色谱检测
采用高效液相色谱对供试品溶液、对照品溶液进行检测，上样体积为10μl，色谱条件为：色谱柱：AgilentZORBAXCarbohydrate，固定相为氨基柱；色谱柱的填充剂粒径为5μm，规格为4.6mm×250mm；流动相：乙腈水溶液，乙腈与水的体积比为80：20；流动相的流速：1ml/min；色谱柱温：30℃；检测器为示差折光检测器，检测器池温度为35℃。
蔗糖对照品和甘露醇对照品的检测结果见表5：
表5、试验例3条件下对蔗糖对照品和甘露醇对照品的检测结果
| 上样量 | 峰面积 |
| 蔗糖上样量(μg) | 蔗糖峰面积 |
| 10 | 138617 |
| 甘露醇上样量(μg) | 甘露醇峰面积 |
| 40 | 487629 |
供试品溶液的检测结果见表6和图3。
表6、试验例3条件下对融合蛋白制剂的检测结果
| 样品 | 供试品6 |
| 蔗糖峰面积 | 130107 |
| 计算蔗糖上样量(μg) | 9.39 |
| 蔗糖理论上样量(μg) | 10 |
| 蔗糖回收率 | 93.86％ |
| 甘露醇峰面积 | 480624 |
| 计算得甘露醇上样量(μg) | 39.43 |
| 甘露醇理论上样量(μg) | 40 |
| 甘露醇回收率 | 98.56％ |
| 甘露醇与蔗糖之间的分离度 | 8.21 |
试验结果表明，本发明在试验例3条件下对融合蛋白制剂进行检测，可以实现对融合蛋白制剂中蔗糖、甘露醇、重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的完全、有效分离，蔗糖与甘露醇的分离度为8.21，符合《中国药品检验标准操作规范2010年版》及《中国药典2010年版》的规定(规定要求大于1.5)，避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性。
试验例4
(1)制备供试品溶液
取注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，用1.0ml超净水复溶后，流动相稀释10倍，制成供试品溶液，终浓度为2.5mg/ml；
流动相的制备方法：量取800ml乙腈，加入用0.22μm滤膜过滤后的超纯水，定容至1000ml，混匀后，即得。
以蔗糖标准品、甘露醇标准品和自制融合蛋白原液作为对照。
蔗糖对照品溶液的制备方法：准确称取蔗糖0.5g，用超纯水溶解并定容至500ml，用0.22μm滤膜过滤，超声后，备用。
甘露醇对照品溶液的制备方法：准确称取甘露醇2.0g，用超纯水溶解并定容至500ml，用0.22μm滤膜过滤，超声后，备用。
融合蛋白原液的制备方法：同试验例1；
自制融合蛋白原液对照品溶液的制备方法：流动相稀释10倍，备用。
(2)高效液相色谱检测
采用高效液相色谱对供试品溶液、对照品溶液进行检测，上样体积为20μl，色谱条件为：色谱柱：AgilentZORBAXCarbohydrate，固定相为氨基柱；色谱柱的填充剂粒径为5μm，规格为4.6mm×250mm；流动相：乙腈水溶液，乙腈与水的体积比为80：20；流动相的流速：1ml/min；色谱柱温：30℃；检测器为示差折光检测器，检测器池温度为35℃。
蔗糖对照品和甘露醇对照品的检测结果见表7。
表7、试验例4条件下对蔗糖对照品和甘露醇对照品的检测结果
| 上样量 | 峰面积 |
| 蔗糖上样量(μg) | 蔗糖峰面积 |
| 20 | 254268 |
| 甘露醇上样量(μg) | 甘露醇峰面积 |
| 80 | 988079 |
供试品溶液的检测结果见表8和图4。
表8、试验例4条件下对融合蛋白制剂的检测结果
| 样品 | 供试品7 |
| 蔗糖峰面积 | 249825 |
| 计算蔗糖上样量(μg) | 19.65 |
| 蔗糖理论上样量(μg) | 20 |
| 蔗糖回收率 | 98.25％ |
| 甘露醇峰面积 | 1022671 |
| 计算得甘露醇上样量(μg) | 82.80 |
| 甘露醇理论上样量(μg) | 80 |
| 甘露醇回收率 | 103.50％ |
| 甘露醇与蔗糖之间的分离度 | 8.21 |
试验结果表明，本发明在试验例4条件下对融合蛋白制剂进行检测，可以实现对融合蛋白制剂中蔗糖、甘露醇、重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的完全、有效分离，蔗糖与甘露醇的分离度为8.21，符合《中国药品检验标准操作规范2010年版》及《中国药典2010年版》的规定(规定要求大于1.5)，避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性。
试验例5
(1)制备供试品溶液
取注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，用1.0ml超净水复溶后，流动相稀释10倍，制成供试品溶液，终浓度为2.5mg/ml；
流动相的制备方法：量取800ml乙腈，加入用0.22μm滤膜过滤后的超纯水，定容至1000ml，混匀后，即得。
以蔗糖标准品、甘露醇标准品和自制融合蛋白原液作为对照。
蔗糖对照品溶液的制备方法：准确称取蔗糖0.5g，用超纯水溶解并定容至500ml，用0.22μm滤膜过滤，超声后，备用。
甘露醇对照品溶液的制备方法：准确称取甘露醇2.0g，用超纯水溶解并定容至500ml，用0.22μm滤膜过滤，超声后，备用。
融合蛋白原液的制备方法：同试验例1；
自制融合蛋白原液对照品溶液的制备方法：流动相稀释10倍，备用。
(2)高效液相色谱检测
采用高效液相色谱对供试品溶液、对照品溶液进行检测，上样体积为20μl，色谱条件为：色谱柱：AgilentZORBAXCarbohydrate，固定相为氨基柱；色谱柱的填充剂粒径为5μm，规格为4.6mm×250mm；流动相：乙腈水溶液，乙腈与水的体积比为80：20；流动相的流速：1.5ml/min；色谱柱温：30℃；检测器为示差折光检测器，检测器池温度为35℃。
蔗糖对照品和甘露醇对照品的检测结果见表9。
表9、试验例5条件下对蔗糖对照品和甘露醇对照品的检测结果
| 上样量 | 峰面积 |
| 蔗糖上样量(μg) | 蔗糖峰面积 |
| 20 | 179104 |
| 甘露醇上样量(μg) | 甘露醇峰面积 |
| 80 | 696045 |
自制融合蛋白原液对照品的检测结果见表10：
表10、试验例5条件下对融合蛋白原液对照品的检测结果
| 自制融合蛋白 | 自制融合蛋白特有位置峰峰面积 | 甘露醇处峰面积 | 蔗糖处峰面积 |
| 样品1 | 21034.5 | 无 | 无 |
| 样品2 | 27197.9 | 无 | 无 |
| 平均值 | 24116.2 | 无 | 无 |
供试品溶液的检测结果见表11和图5。
表11、试验例5条件下对融合蛋白制剂的检测结果
| 样品 | 供试品8 |
| 蔗糖峰面积 | 170922 |
| 计算蔗糖上样量(μg) | 19.09 |
| 蔗糖理论上样量(μg) | 20 |
| 蔗糖回收率 | 95.43％ |
| 甘露醇峰面积 | 678105 |
| 计算得甘露醇上样量(μg) | 77.94 |
| 甘露醇理论上样量(μg) | 80 |
| 甘露醇回收率 | 97.42％ |
| 融合蛋白特有位置峰面积 | 25254.8 |
| 甘露醇与蔗糖之间的分离度 | 5.57 |
试验结果表明，本发明在试验例5条件下对融合蛋白制剂进行检测，可以实现对融合蛋白制剂中蔗糖、甘露醇、重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的完全、有效分离，甘露醇与蔗糖之间的分离度为5.57，符合《中国药品检验标准操作规范2010年版》及《中国药典2010年版》的规定(规定要求大于1.5)，避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性。
试验例6
(1)制备供试品溶液
取注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，用1.0ml超净水复溶后，流动相稀释10倍，制成供试品溶液，终浓度为2.5mg/ml；
流动相的制备方法：量取800ml乙腈，加入用0.22μm滤膜过滤后的超纯水，定容至1000ml，混匀后，即得。
以蔗糖标准品、甘露醇标准品和自制融合蛋白原液作为对照。
蔗糖对照品溶液的制备方法：准确称取蔗糖0.5g，用超纯水溶解并定容至500ml，用0.22μm滤膜过滤，超声后，备用。
甘露醇对照品溶液的制备方法：准确称取甘露醇2.0g，用超纯水溶解并定容至500ml，用0.22μm滤膜过滤，超声后，备用。
融合蛋白原液的制备方法：同试验例1；
自制融合蛋白原液对照品溶液的制备方法：流动相稀释10倍，备用。
(2)高效液相色谱检测
采用高效液相色谱对供试品溶液、对照品溶液进行检测，上样体积为10μl，色谱条件为：色谱柱：AgilentZORBAXCarbohydrate，固定相为氨基柱；色谱柱的填充剂粒径为5μm，规格为4.6mm×250mm；流动相：乙腈水溶液，乙腈与水的体积比为80：20；流动相的流速：1.5ml/min；色谱柱温：30℃；检测器为示差折光检测器，检测器池温度为35℃。
蔗糖对照品和甘露醇对照品的检测结果见表12。
表12、试验例6条件下对蔗糖对照品和甘露醇对照品的检测结果
| 上样量 | 峰面积 |
| 蔗糖上样量(μg) | 蔗糖峰面积 |
| 10 | 93750 |
| 甘露醇上样量(μg) | 甘露醇峰面积 |
| 40 | 349388 |
供试品溶液的检测结果见表13和图6。
表13、试验例6条件下对融合蛋白制剂的检测结果
| 样品 | 供试品9 |
| 蔗糖峰面积 | 91504 |
| 计算蔗糖上样量(μg) | 9.76 |
| 蔗糖理论上样量(μg) | 10 |
| 蔗糖回收率 | 97.60％ |
| 甘露醇峰面积 | 345641 |
| 计算得甘露醇上样量(μg) | 39.57 |
| 甘露醇理论上样量(μg) | 40 |
| 甘露醇回收率 | 98.93％ |
| 甘露醇与蔗糖之间的分离度 | 5.57 |
试验结果表明，本发明在试验例6条件下对融合蛋白制剂进行检测，可以实现对融合蛋白制剂中蔗糖、甘露醇、重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的完全、有效分离，甘露醇和蔗糖的分离度为5.57，符合《中国药品检验标准操作规范2010年版》及《中国药典2010年版》的规定(规定要求大于1.5)，避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性。
试验例7、线性关系实验
在本发明试验例3的高效液相色谱条件下，分别配制不同浓度的甘露醇对照品溶液、蔗糖对照品溶液，进行线性范围实验，实验结果见表14和表15。
表14、甘露醇对照品溶液的线性实验结果
| 甘露醇对照品 | 上样量(μg) | 平均峰面积(nRIU*S) |
| 对照品1 | 10 | 78497.2 |
| 对照品2 | 20 | 154594 |
| 对照品3 | 40 | 323770 |
| 对照品4 | 80 | 608781.5 |
| 对照品5 | 100 | 740207 |
| 对照品6 | 120 | 883602.5 |
| 对照品7 | 160 | 1177605 |
| 对照品8 | 200 | 1492445 |
表15、蔗糖对照品溶液的线性实验结果
| 蔗糖对照品 | 上样量(μg) | 平均峰面积(nRIU*S) |
| 对照品1 | 10 | 79988 |
| 对照品2 | 20 | 158284 |
| 对照品3 | 40 | 299754 |
| 对照品4 | 50 | 388242 |
| 对照品5 | 60 | 460291 |
| 对照品6 | 80 | 609413 |
| 对照品7 | 100 | 752047 |
对于甘露醇对照品，线性方程：y＝7348x+11933，R2＝0.9995，R2>0.99，对于蔗糖对照品，线性方程：y＝7495.6x+7084，R2＝0.9996，R2>0.99，非常适合用于高效液相色谱的定量检测。
试验例8、重复性实验
在本发明试验例3的高效液相色谱条件下，选取6份融合蛋白制剂样品(BF0220150801)进行重复性实验，实验结果见表16和表17。
表16、甘露醇含量检测的重复性实验结果
表17、蔗糖含量检测的重复性实验结果
结果表明，本发明检测方法的重复性好。
试验例9、回收率实验
在本发明试验例3的高效液相色谱条件下，配制蔗糖溶液浓度分别为0.8mg/ml、1.2mg/ml，甘露醇溶液浓度分别为3.2mg/ml，4.8mg/ml，进样检测，使用之前配制的蔗糖标准溶液和甘露醇标准溶液分别测定回收率，实验结果见表18。
表18、回收率实验结果
结果表明，本发明检测方法的回收率结果均在98％～102％之间，检测结果的准确性高。
综上所述，本发明蛋白制剂的检测方法，无需采用梯度洗脱程序，就能实现对蛋白制剂中蔗糖、甘露醇等组分的有效分离，蔗糖和甘露醇之间的分离度高，符合《中国药品检验标准操作规范2010年版》及《中国药典2010年版》的规定(规定要求大于1.5)，避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测方法，操作简便、快速，检测结果的准确性高，非常适合用于对蛋白制剂中甘露醇、蔗糖等组分的定性和定量检测。
Claims (10)
1.蛋白制剂的高效液相色谱检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、取蛋白制剂，用水溶解后，流动相稀释，制成供试品溶液；
b、取对照品，用水溶解，制成对照品溶液；
c、采用高效液相色谱分别对供试品溶液、对照品溶液进行检测，检测条件为：
色谱柱为氨基柱；流动相为乙腈-水溶液，乙腈与水的体积比为(65：35)～(80：20)。
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱检测方法，其特征在于：步骤a中，蛋白制剂为注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的高效液相色谱检测方法，其特征在于：注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白包括以下组分：重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白、甘露醇、蔗糖和三羟甲基氨基甲烷。
4.根据权利要求1所述的高效液相色谱检测方法，其特征在于：步骤a中，供试品溶液的浓度为2.5mg/ml。
5.根据权利要求1所述的高效液相色谱检测方法，其特征在于：步骤b中，对照品为甘露醇、蔗糖、重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白、三羟甲基氨基甲烷中的任意一种或两种以上。
6.根据权利要求1所述的高效液相色谱检测方法，其特征在于：步骤c中，色谱柱为AgilentZORBAXCarbohydrate，规格为4.6mm×250mm，填充剂粒径为5μm。
7.根据权利要求1所述的高效液相色谱检测方法，其特征在于：步骤c中，乙腈与水的体积比为(75：25)～(80：20)。
8.根据权利要求1所述的高效液相色谱检测方法，其特征在于：步骤c中，流动相的流速为1～1.5ml/min；优选的，流动相的流速为1.5ml/min。
9.根据权利要求1所述的高效液相色谱检测方法，其特征在于：步骤c中，色谱柱的柱温为30℃；检测器为示差折光检测器，检测器池温度为35℃；上样体积为10μl～20μl。
10.根据权利要求1所述的高效液相色谱检测方法，其特征在于：步骤c中，按外标法以峰面积计算供试品中甘露醇、蔗糖、重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白和/或三羟甲基氨基甲烷的含量。
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