CN110261530A - 一种果汁饮料中20种有机胺、生物胺和阳离子同时测定的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种果汁饮料中20种有机胺、生物胺和阳离子同时测定的方法属于分析化学领域,本发明采用电导抑制‑离子色谱法，在多级梯度淋洗条件下，通过研究多种实验影响因素，优化实验测定条件，建立了果汁饮料中20种有机胺、生物胺和阳离子（甲胺、二甲胺、三甲胺、二乙醇胺、丁胺、组胺、尸胺、腐胺、胍丁胺、庚二胺、亚精胺、精胺、Li⁺、Na⁺、NH₄ ⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺）同时测定的方法，此方法快速、简便、灵敏度高、稳定性好，实现了快速分析、绿色分析、多组分同时分析的目标。

Description

一种果汁饮料中20种有机胺、生物胺和阳离子同时测定的 方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种果汁饮料中20种有机胺、生物胺和阳离子同时测定的方法。

背景技术

生物胺，是一类含氮的脂肪族或杂环类中低分子量的有机化合物，在水产品、蔬菜、啤酒、葡萄酒等多种食品中广泛存在。生物胺不仅是生成荷尔蒙、核酸、蛋白质的前体物质，也是生成致癌物质亚硝基化合物的前体物质，适量摄入生物胺能够有效调节机体内的生理活动，例如适量摄入亚精胺，可延缓记忆力减退，阻止老年痴呆病发病；但某些生物胺摄入过量会使人体产生头疼、腹部痉挛等不良生理反应，严重时可能危及生命。有机胺是易溶于水的一类有毒有害的有机化合物，目前随着有机胺的广泛应用，其污染状况不断增加，科学准确监测食品中有机胺的含量，显得格外重要。阳离子对调节人体电解质平衡、改善造血、促进骨骼生长等起到重要作用，但食品中某些阳离子超过限量会对人体产生严重危害。显而易见，同时测定食品中多种有机胺、生物胺和阳离子具有重要的现实意义。

果汁饮料是人们日常生活中常见的饮品，某些果汁在生产或后期保存、储运过程中易生成生物胺，从而影响产品质量、危害人体健康；果汁生产时所用的水质质量监控不到位或使用的添加剂质量不高，同样会引入某些有毒有害的有机胺和阳离子。建立果汁中多种有机胺、生物胺和阳离子快速测定的方法，可为果汁的生产加工、质量监控、掺假辨别等提供强有力的技术支持。

目前，有机胺和生物胺常用检测方法有气相色谱法、液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、安培检测-离子色谱法等。当前主要采用液相色谱法，但多数生物胺缺少荧光基团，需柱前或柱后衍生才能检测，衍生步骤会耗时、耗力、耗材，同时易引入副产物产生干扰，存在定量不准确的不足。而目前食品中常见阳离子的测定方法主要有离子色谱法、电感耦合等离子体法(ICP)、电泳法等。但是ICP法和电泳法存在干扰较大，稳定性和灵敏度较差等问题，且存在前处理及操作步骤复杂等不足。因此，为提高检测工作质量和效率，迫切需要研究并创建一种快速、灵敏、准确的食品中多种有机胺、生物胺和阳离子同时测定的技术方法。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供了一种果汁饮料中20种有机胺、生物胺和阳离子同时测定的方法，本发明采用电导抑制-离子色谱法，在多级梯度淋洗条件下，通过研究多种实验影响因素，优化实验测定条件，建立了果汁、饮料中20种有机胺、生物胺和阳离子（甲胺、二甲胺、三甲胺、二乙醇胺、丁胺、组胺、尸胺、腐胺、胍丁胺、庚二胺、亚精胺、精胺、Li⁺、Na⁺、NH₄ ⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺）同时测定的方法，此方法快速、简便、灵敏度高、稳定性好，实现了快速分析、绿色分析、多组分同时分析的目标。

为达到上述目的，本发明公开了一种果汁饮料中20种有机胺、生物胺和阳离子同时测定的方法，其测定步骤如下；

步骤一、配制标准混合工作液：

准备离子浓度均为1000 mg/L的Li⁺、Na⁺、NH₄ ⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺标准溶液，浓度均为1000 mg/L的甲胺、二甲胺标准溶液，浓度为2000 mg/L的三甲胺标准溶液和纯度≥97%的二乙醇胺、丁胺、组胺、尸胺、腐胺、胍丁胺、庚二胺、亚精胺、精胺的标准物质；依次将有机胺、生物胺的标准物质或者溶液全部配置成质量浓度为1000 mg/L的标准溶液，使用时移取一定量有机胺、生物胺和阳离子标准溶液用去离子水配成标准混合储备液，根据需要用去离子水稀释成一定浓度的标准混合工作液，在4℃避光冷藏保存，现配现用；

步骤二、样品前处理：

准确取果汁饮料待检样品2.00 g，加入去离子水约80 mL，摇匀静置15 min，调节稀释液pH值至弱酸性，全部转移至100 mL容量瓶中，采用去离子水定容至刻度，摇匀、静置15min，取10.0 mL溶液，先过0.22 μm水相滤膜，再过已预活化的RP柱，弃去前3 mL，收集清液，待上机检测；

其中RP柱的预活化过程为依次过10 mL甲醇、15mL去离子水，静置30 min；

步骤三、离子色谱条件：

离子色谱仪：Dionex ICS5000+型离子色谱仪；

色谱分离柱：DionexIonPac^TMCS18（2×250 mm）；

保护柱：DionexIonPac^TMCG18（2×50 mm）；

电导抑制器：CERS 500e_2mm；

流动相：甲磺酸（MSA）-去离子水多级梯度淋洗液；

流速：0.25mL/min；

色谱柱温度：40℃；

进样量：25μL；

Milli-Q超纯水仪；

超纯水（电阻率18.2MΩ.cm）；

步骤四、多级梯度淋洗条件：

多级梯度淋洗程序为：0.0-5.0 min时，淋洗液甲磺酸浓度为1.75 mmol/L；5.0-13.0min，淋洗液甲磺酸浓度为1.75-2.25mmol/L；13.0-27.0 min，淋洗液甲磺酸浓度为2.25-12.0mmol/L；27.0-40.0 min，淋洗液甲磺酸浓度为12.0mmol/L；40.0-45.0 min，淋洗液甲磺酸浓度为12.0-40.0 mmol/L；45.0-52.0 min，淋洗液甲磺酸浓度为40.0 mmol/L；52.0-55.0 min，淋洗液甲磺酸浓度为40.0-1.75 mmol/L；55.0-60.0 min，淋洗液甲磺酸浓度为1.75 mmol/L。

步骤五、校准曲线绘制：

将步骤一中配置的标准混合工作溶液，按照步骤三、步骤四给出的色谱分析条件进行上机检测，以待测组分质量浓度为横坐标，以待测组分峰面积为纵坐标，来绘制校准曲线，外标法定量；

步骤六、样品溶液的检测：

将步骤二中所得清液按照步骤三、步骤四给出的色谱分析条件进行上机检测，并计算结果；

步骤七、结果计算：

通过步骤五标准混合工作溶液所测得的结果来校正步骤六所得计算结果，从而计算出所测果汁中各组分含量。

作为优选，所述步骤二中用盐酸和氢氧化钠溶液调节样品溶液的pH值至3.4～4.5。

上述测定方法步骤三中的色谱柱温度为40℃，柱温的改变，直接引起组分的保留时间和色谱峰高发生改变。柱温的升高，会一定程度地提高色谱柱内离子交换速率，有利于提高柱效，缩短分析时间，保留时间变小，但降低了分离选择性，不利于组分间的分离。从提高分析速率角度考虑，一般会选择较高的柱温，而从提高分离效果角度上考虑，应该选用较低的柱温，因此，综合考虑分离度、灵敏度、选择性等多种影响因素，选择在40℃柱温下进行测定分析。

上述测定方法步骤四中的淋洗液的流速为0.25 mL/min，在这个流速下的初始压力为12.0 MPa ，压力适中不仅可以保证系统的安全性，还能避免某些连接处出现漏液等情况，从而可以提高分离度、缩短检测时间、保持色谱系统稳定性。

将20种有机胺、生物胺和阳离子组分同时分离，本身就是一项技术难度高的分析实验，经过实验证实，在等度梯度条件下不能实现20种组分的有效分离，为提高检测灵敏度和色谱峰分离度，先后根据不同淋洗时间段、不同淋洗浓度进行60多次多级梯度淋洗实验研究分析，最终通过对比总体分离效果选取了表1中多级梯度淋洗条件，从表1中可以看出，色谱分离梯度淋洗时间分为6段（0.0-5.0 min、5.0-13.0 min、13.0-27.0 min、27.0-40.0min、40.0-45.0 min、45.0-52.0 min），初始淋洗浓度是整个梯度淋洗程序的基础，对于20种组分整理分离效果来说至关重要，先后实验分析对比了1.00、1.50、1.75、2.00、2.50mmol/L五个初始浓度，最终根据综合分离效果（详见实施例三），选择了1.75 mmol/L的初始浓度。因此在0.0-5.0 min采用的是1.75 mmol/L甲磺酸淋洗液，此时前3种弱保留组分分离效果较好。5.0-13.0 min时，选用浓度为1.75-2.25mmol/L的甲磺酸梯度淋洗液，此时组分4至组分7的基本分离，只是组分5（二乙醇胺）和组分6（K⁺）分离度不高，这主要是因为二者在色谱柱上的作用性质和作用力相近，出峰时间临近，当柱温高于42℃时几乎重叠；13.0-27.0 min时，采用了浓度为2.25-12.0mmol/L的甲磺酸梯度淋洗液，实现了中强保留组分8至组分12良好的洗脱和分离。27.0-40.0 min时，选取12 mmol/L的等度淋洗溶液进行洗脱，恰好能确保组分14、15、16的有效分离，但组分17（胍丁胺）和组分18（庚二胺）分离度不高，主要是因为二者分子量相近，离子半径相差不大，导致出峰时间相近。40.0-45.0 min时，为使强保留组分亚精胺和精胺的快速洗脱，将淋洗液浓度提高至40 mmol/L。在53 min内20种有机胺、生物胺和阳离子实现了分离。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明将三大类20种组分进行同时检测，实现了20种有机胺、生物胺和阳离子组分一次性快速检测的技术创新，有效提高了检测工作效率。

2、梯度淋洗程序的分析条件在多组分分析实验中是极其重要的，单就梯度淋洗程序来讲，待分析待检测的成分越多，则对梯度淋洗程序的要求越高，需要在一个合理的分析时间内将某些保留特性非常相近的组分准确分离；实验证实在等度淋洗梯度条件不能实现多组分的有效分离，为提高检测灵敏度和色谱峰分离度，先后根据不同流速、不同淋洗时间段、不同淋洗浓度，进行了60多次梯度淋洗实验研究分析，最终通过对比总体分离效果选取了本发明中的多级梯度淋洗条件，而本发明的梯度淋洗实验条件的选取，可以实现20种有机胺、生物胺和阳离子组分的有效分离，有效地提高检测灵敏度和准确性。

3、经研究发现溶液pH值对本发明检测结果的重要影响，本发明找到了适于20种组分测定的pH值范围，通过调节检测溶液的pH值，大大提高了检测准确性，通过调节pH值提高20种有机胺、生物胺和阳离子同时检测的灵敏度，是本发明方法的又一重要创新。

4、多因素多基质考察分析，本发明先后分析了多级梯度淋洗条件、初始淋洗浓度、色谱柱温度、pH值等实验影响因素，最大程度地提高了多种组分同时检测时方法的准确性和适用性。

5、操作简便快速、检测灵敏度高，经过简单前处理操作，即可上机检测。

6、检测时间短，20种组分在53min内即可全部出峰，因此，该方法简便、快速、准确、灵敏度高，完全适于果汁、饮料等基质中20种有机胺、生物胺和阳离子的快速分析。

7、检测准确度高，通过3天间9平行实验数据分析证实，20种生物胺和阳离子组分的9次平行实验结果与理论真值的相对偏差在-11.95%～10.48%范围内，完全满足食品理化检测的准确度要求。

8、在本发明检测方法中除了作为淋洗液的稀浓度甲磺酸溶液，并没有使用或产生对人类健康、生态环境有害的溶剂、试剂、副产物，符合绿色分析的理念。

附图说明

图1为20种有机胺、生物胺和阳离子混合标准溶液的离子色谱图。

图2为不同初始淋洗液浓度下混合标准溶液的离子色谱图。

图3为不同柱温下混合标准溶液的离子色谱图。

图4为在不同pH值下混合标准溶液的离子色谱图。

图5为5种果汁样品的离子色谱图。

具体实施例

实施例一、一种果汁饮料中20种有机胺、生物胺和阳离子同时测定的方法，包括以下步骤：

步骤一、配制标准混合工作液：

无机阳离子均为购自国家有色金属及分析材料测试中心的标准溶液Li⁺、Na⁺、NH₄ ⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺，离子浓度均为1000 mg/L，甲胺、二甲胺标准溶液浓度均为1000 mg/L，三甲胺标准溶液浓度为2000 mg/L，二乙醇胺、丁胺、组胺、尸胺、腐胺、胍丁胺、庚二胺、亚精胺、精胺为纯度≥97%的标准物质；依次将有机胺、生物胺的标准物质或者溶液全部配置成质量浓度为1000mg/L的标准溶液，使用时移取一定量有机胺、生物胺和阳离子标准溶液用去离子水配成标准混合储备液，根据需要用去离子水稀释成一定浓度的标准混合工作液，在4℃避光冷藏保存，现配现用；

步骤二、样品前处理：

准确取果汁饮料待测样品2.00 g，加入去离子水约80 mL，摇匀静置15 min，调节稀释液pH值至3.5～4.5，全部转移至100 mL容量瓶中，采用去离子水定容至刻度，摇匀、静置15min，取10.0 mL溶液，先过0.22 μm水相滤膜，再过已预活化的RP柱（活化过程为依次过10mL甲醇、15mL去离子水，静置30 min），弃去前3 mL，收集清液，待上机检测；

步骤三、离子色谱条件：

离子色谱仪：Dionex ICS5000+型离子色谱仪

色谱分离柱：DionexIonPac^TMCS18（2×250 mm）；

保护柱：DionexIonPac^TMCG18（2×50 mm）；

电导抑制器：CERS500e_2mm；

流动相：甲磺酸（MSA）-去离子水多级梯度淋洗液；

流速：0.25mL/min；

色谱柱温度：40℃；

进样量：25μL；

Milli-Q超纯水仪：(美国Millipore公司)；

超纯水（电阻率18.2MΩ.cm）；

步骤四、多级梯度淋洗条件：

多级梯度淋洗程序为：0.0-5.0 min时，淋洗液甲磺酸浓度为1.75 mmol/L；5.0-13.0min，淋洗液甲磺酸浓度为1.75-2.25mmol/L；13.0-27.0 min，淋洗液甲磺酸浓度为2.25-12.0mmol/L；27.0-40.0 min，淋洗液甲磺酸浓度为12.0mmol/L；40.0-45.0 min，淋洗液甲磺酸浓度为12.0-40.0mmol/L；45.0-52.0 min，淋洗液甲磺酸浓度为40.0 mmol/L；52.0-55.0 min，淋洗液甲磺酸浓度为40.0-1.75 mmol/L；55.0-60.0 min，淋洗液甲磺酸浓度为1.75 mmol/L。

步骤五、校准曲线绘制：

将步骤一中配置的标准混合工作溶液，按照步骤三、步骤四给出的色谱分析条件进行上机检测，以待测组分质量浓度为横坐标，以待测组分峰面积为纵坐标，来绘制校准曲线，外标法定量；

步骤六、样品溶液的检测：

将步骤二中所得清液按照步骤三、步骤四给出的色谱分析条件进行上机检测，并计算结果；

步骤七、结果计算：

通过步骤五标准混合工作溶液所测得的结果来校正步骤六所得计算结果，从而计算出所测果汁中各组分含量。

20种组分混合标准溶液的离子色谱图如图1所示，其中各组分与峰的对应关系如下所示，1.Li⁺；2.Na⁺；3.NH₄ ⁺；4.甲胺；5.二乙醇胺；6.K⁺；7.二甲胺；8.三甲胺；9.丁胺；10.Mg²⁺；11.Ca²⁺；12. Sr²⁺；13.Ba²⁺；14.腐胺；15.尸胺；16.组胺；17.胍丁胺；18.庚二胺；19.亚精胺；20.精胺。

实施例二、按照实施例一中的实验分析方法，分别在0.20 mL/min、0.25 mL/min、0.30 mL/min的流速条件下，进行标准混合工作溶液测定。

由于梯度条件中初始甲磺酸浓度较小，此时的压力是整个梯度淋洗环节中最高的，此后随着流动相中甲磺酸浓度的增大，压力逐步降低。当流速为0.20 mL/min时，初始压力为9.9 MPa，此时压力较小，峰宽增大，峰灵敏度下降，整体分离度不高。0.25 mL/min流速时，总体来说组分分离效果不错，而且0.25 mL/min流速时初始压力为12.0 MPa，压力适中。0.30 mL/min流速时初始压力15.1 MPa，此时压力相对较大，易造成造成系统的某些连接处漏液等情况，为了提高分离度、缩短检测时间、保持色谱系统稳定性，作为优选实施例一，选用流速在0.25 mL/min的流速下进行实验。

实施例三、按照实施例一中的实验分析方法，在甲磺酸淋洗液初始浓度分别为1.0mmol/L、1.5 mmol/L、1.75 mmol/L、2.0 mmol/L、2.5 mmol/L的条件下，测定标准混合工作溶液。不同初始浓度下标准混合工作溶液的离子色谱图如图2所示；

从图2中可以看出，初始浓度越小，组分出峰时间越长，特别是前8种组分变化最为明显；此时总体分离度增大，但色谱峰的响应值变小，峰灵敏度降低。初始浓度越大，各种组分出峰时间缩短，总体分离度降低，但是色谱峰的响应值变大，色谱峰灵敏度增大。在初始浓度为1.0和1.5 mmol/L时，组分9（丁胺）和组分10（Mg²⁺）重叠，没有实现分离；初始浓度为2.0和2.5 mmol/L时，前8种组分出峰时间大幅缩短，而且前3种组分的灵敏度明显增大，但组分4至组分7这4种组分的总体分离度却有明显的降低；另外，初始浓度对中强保留组分11至组分18影响相对较小。因此，综合考虑20种组分的灵敏度和整体分离度，作为优选实施例一，选取初始浓度为1.75mmol/L进行实验分析。

实施例四、按照实施例一中的实验分析方法，分别在35℃、37.5℃、40℃、42.5℃、45℃色谱柱温度下，测定标准混合工作溶液。不同柱温下标准混合工作溶液的离子色谱图结果如图3所示。

色谱柱温度是影响柱效、选择性、灵敏度和稳定性的重要因素。柱温改变，直接引起组分的保留时间和色谱峰高发生改变。在图3中可以看出，在35℃到45℃温度范围内，随着温度的升高，组分5（二乙醇胺）和组分6（K⁺）分离度逐渐降低，42.5℃时二者几乎重叠，45℃时二者完全重叠；随着温度的升高，组分9（丁胺）和组分10（Mg²⁺）分离度逐渐增大，在35℃时二者完全重叠，在37.5℃时二者分离度不高，但是在40℃至45℃时二者分离良好；随着温度的升高，组分17（胍丁胺）和组分18（庚二胺）分离度逐渐增大，在35℃时完全重叠，而在45℃时二者分离良好；其他组分分离度受柱温影响较小。另外，从图中可以看出，温度越高组分的峰型越尖锐，灵敏度越高，会一定程度的提高色谱柱内离子交换速率，有利于提高柱效，缩短分析时间，保留时间变小，但降低了分离选择性，不利于组分间的分离。从提高分析速率角度考虑，一般会选择较高的柱温，而从提高分离效果角度上考虑，应该选用较低的柱温，因此，综合考虑分离度、灵敏度、选择性等多种影响因素，作为优选实施例一，选取在40℃柱温条件下，进行实验分析。

实施例五、按照实施例一中的实验分析方法，分别在标准工作溶液pH值为2.0、3.2、4.5、6.0时，进行实验测定，标准工作溶液的离子色谱图如图4所示。

从图4中可以看出，当样品溶液pH值在2.0的强酸性条件下，前6种组分出现了显著的峰型不对称的问题，这是因为CS18色谱柱树脂填料是弱羟酸交换基团，交换基团的离子化程度与淋洗液以及样品溶液的pH值有直接关联，另外，由于交换基是亲水性的，样品pH值会对样品溶液中阳离子从交换基上的洗脱产生较大影响；基于色谱柱交换基的特性，当pH值较低时，色谱柱的分离效能下降，使色谱峰对称性变差。当pH值在6.0的弱酸条件下，组分19（亚精胺）和组分20（精胺）的含量大幅下降，其中精胺色谱峰几乎消失，主要是因为亚精胺和精胺是多胺，携带多个带正电的氨基，因此，当它们遇到带负电的物质时会发生反应，导致组分含量显著降低，而本实验正是采用了NaOH溶液来调节pH值为6.0的混合标准溶液，所以亚精胺和精胺含量有明显的降低。

综合考虑色谱柱的交换基性质、20种组分自身的特性以及其受pH值影响的程度，作为优选我们在实施例一，选择pH值在3.5～4.5条件下，进行实验分析。

实施例六、线性范围、线性方程、相关系数及检出限的测定

根据实施例一中步骤一配置20种有机胺、生物胺和阳离子的混合标准溶液，进行校准曲线拟合。通过色谱峰信噪比来计算待测组分的检出限（S/N=3），在0.05 mg/L～2.0 mg/L浓度范围内，进行了6个不同浓度水平（0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mg/L）标准工作液的测定和线性拟合。结果（见表2）表明，20种组分线性相关系数均大于0.99，其中有18种组分相关系数大于0.995，这说明在该实验条件下，20种组分同时测定时线性相关性良好。20种组分检出限在0.0006～0.0503 mg/L之间，其中8种阳离子检出限均小于0.008 mg/L。

Y：峰面积（µS．min），X：质量浓度（mg/L）。

实施例七、回收率及精密度的测定

分别选取葡萄汁、苹果汁、橙汁3种果汁饮料样品，依次向3个样品中添加浓度级别水平分别为0.10 mg/L、0.20 mg/L、1.00 mg/L的标准溶液，每个浓度水平进行6次平行测定实验，来验证不同果汁基质测定时方法的回收率和精密度，根据基质浓度、添加浓度和添加后测定浓度计算回收率。表3列出三浓度水平、六次平行测定的回收率和RSD数据。

从表3中可以看出，在0.10 mg/L添加浓度水平下，仅有二乙醇胺回收率为79.53%，在0.20 mg/L添加浓度水平下，组胺的回收率为78.36%，但依然满足食品理化检验技术要求；其他组分回收率在80.64%～108.89%之间，这说明20种组分回收率良好。三种添加浓度水平下，20种组分测定RSD在2.12%～7.29%范围内。从总体上来看，三种基质，六次平行测定回收率数据结果符合食品理化检测要求，表明方法准确性高、精密度好。

实施例八、方法重复性的测定

向一份苹果汁中添加0.50 mg/L浓度水平的20种有机胺、生物胺和阳离子混合标准溶液，进行9次平行测定实验，每天进行3次平行样品测定，连续测定3天，通过基质浓度、添加浓度和测定浓度，来计算回收率，进而计算出测定值和真值的相对偏差。3天间9平行重复性实验数据分析证实，20种组分的9次平行实验结果与理论真值的相对偏差在-11.95%～10.48%范围内，完全满足食品理化检测的准确度要求。

实施例九、实际样品的测定

抽取5种常见果汁饮料（苹果汁、橙汁、葡萄汁、椰子汁、芒果汁），按照实施例一中的离子色谱条件和前处理步骤，进行了实际样品中有机胺、生物胺和阳离子含量的测定分析，图5是实际样品测定离子色谱图，表4是测定组分数据结果。

“－”：未检出。

从测定结果来看，橙汁和椰子汁中检出的有机胺、生物胺和阳离子组分最多，分别检出12和11种，其中检出阳离子含量高的依次是K⁺、Na⁺、Mg²⁺，检出生物胺含量高的依次是腐胺、精胺、亚精胺。数据分析发现，在果汁生产或储存过程中易出现腐烂变质的问题，从而产生腐胺、尸胺、组胺等有害的生物胺，饮用后会对人体造成危害，因此果汁企业及监管部门应该加强监测果汁中生物胺含量。

从图5的实际样品离子色谱图中可以看出，基线稳定，峰形尖锐，受其他物质干扰较小，这充分说明该测定方法稳定性良好、准确性高。从实际样品测定结果看，该测定方法操作简便、快速准确、实用性强。

本实施例通过对流速、初始梯度浓度、柱温、溶液pH值等多种实验影响因素的分析讨论，探索出了20种有机胺、生物胺和阳离子分析的梯度淋洗条件，建立了多级梯度淋洗-离子色谱法同时测定果汁中20种有机胺、生物胺和阳离子的分析方法。通过上述实施例可以得出，流速为0.25 mL/min，柱温为40℃时，初始淋洗液浓度为1.75 mmol/L，pH值在3.5～4.5之间，20种组分的测定结果准确可靠、灵敏度高。因此，本发明方法完全适于果汁饮料基质中20种有机胺、生物胺和阳离子的快速分析。

本发明的保护内容不局限于以上实施例，在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims (2)

1.一种果汁饮料中20种有机胺、生物胺和阳离子同时测定的方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一、配制标准混合工作液：

准备离子浓度均为1000 mg/L的Li⁺、Na⁺、NH₄ ⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺标准溶液，浓度均为1000 mg/L的甲胺、二甲胺标准溶液，浓度为2000 mg/L的三甲胺标准溶液和纯度≥97%的二乙醇胺、丁胺、组胺、尸胺、腐胺、胍丁胺、庚二胺、亚精胺、精胺的标准物质；依次将有机胺、生物胺的标准物质或者溶液全部配置成质量浓度为1000 mg/L的标准溶液，使用时移取一定量有机胺、生物胺和阳离子标准溶液用去离子水配成标准混合储备液，根据需要用去离子水稀释成一定浓度的标准混合工作液，在4 ℃避光冷藏保存，现配现用；

步骤二、样品前处理：

准确取果汁饮料待测样品2.00 g，加入去离子水约80 mL，摇匀静置15 min，调节稀释液pH值至弱酸性，全部转移至100 mL容量瓶中，采用去离子水定容至刻度，摇匀、静置15min，取10.0 mL溶液，先过0.22 μm水相滤膜，再过已预活化的RP柱，弃去前3 mL，收集清液，待上机检测；

其中RP柱的预活化过程为依次过10 mL甲醇、15mL去离子水，静置30 min；

步骤三、离子色谱条件：

离子色谱仪：Dionex ICS5000+型离子色谱仪；

色谱分离柱：DionexIonPac^TMCS18（2×250 mm）；

保护柱：DionexIonPac^TMCG18（2×50 mm）；

电导抑制器：CERS 500e_2mm；

流动相：甲磺酸（MSA）-去离子水多级梯度淋洗液；

流速：0.25mL/min；

色谱柱温度：40℃；

进样量：25μL；

Milli-Q超纯水仪；

超纯水（电阻率18.2MΩ.cm）；

步骤四、多级梯度淋洗条件：

多级梯度淋洗程序为：0.0-5.0 min时，淋洗液甲磺酸浓度为1.75 mmol/L；5.0-13.0min，淋洗液甲磺酸浓度为1.75-2.25mmol/L；13.0-27.0 min，淋洗液甲磺酸浓度为2.25-12.0mmol/L；27.0-40.0 min，淋洗液甲磺酸浓度为12.0mmol/L；40.0-45.0 min，淋洗液甲磺酸浓度为12.0-40.0 mmol/L；45.0-52.0 min，淋洗液甲磺酸浓度为40.0 mmol/L；52.0-55.0 min，淋洗液甲磺酸浓度为40.0-1.75 mmol/L；55.0-60.0 min，淋洗液甲磺酸浓度为1.75 mmol/L；

步骤五、校准曲线绘制：

将步骤一中配置的标准混合工作溶液，按照步骤三、步骤四给出的色谱分析条件进行上机检测，以待测组分质量浓度为横坐标，以待测组分峰面积为纵坐标，来绘制校准曲线，外标法定量；

步骤六、样品溶液的检测：

将步骤二中所得清液按照步骤三、步骤四给出的色谱分析条件进行上机检测，并计算结果；

步骤七、结果计算：

通过步骤五标准混合工作溶液所测得的结果来校正步骤六所得计算结果，从而计算出所测果汁中各组分含量。

2.根据权利要求1所述的果汁饮料中20种有机胺、生物胺和阳离子同时测定的方法，其特征在于，所述步骤二中调节pH值至3.4～4.5。