CN111077240A - 一种高效液相色谱-质谱联用检测三甲胺的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高效液相色谱‑质谱联用检测三甲胺的方法，包括以下步骤：S01.在待测样品中加入提取剂，在冰浴条件下超声提取；S02.离心，分离上清液和沉淀；S03.在沉淀中加入提取剂，重复离心；S04.合并每次离心后得到的上清液，纯化后经过高效液相色谱‑质谱联用检测。利用建立的方法检测三甲胺，通过食品中三甲胺的基质抑制率折算实际样品中三甲胺的含量，该方法操作简单，经济实用，三甲胺在0～200ng/mL范围内得到的标准曲线，线性相关性R＝0.9994，检出限为11.2μg/kg，检出限低(达到ppb级)，灵敏度高，可用于准确检测食品中的三甲胺。

Description

一种高效液相色谱-质谱联用检测三甲胺的方法
技术领域
本发明涉及分析检测领域，具体涉及一种高效液相色谱-质谱联用检测三甲胺的方法。
技术背景
三甲胺(TMA)即trimethylamine，分子式为C3H9N，是最简单的叔胺，无色有鱼油臭味的气体，溶于水，乙醇，乙醚，易燃，有毒。液体或气体状态的三甲胺有刺激性和腐蚀性，可导致皮肤灼伤、眼部不适、呼吸道刺激等，严重者可导致死亡。此外，我国未对食品中的三甲胺含量有明确规定，但已经有三甲基胺尿症(臭鱼症)患者出现，他们无法代谢体内的三甲胺。三甲胺主要存在于禽蛋、牛奶、豆类、鱼类、内脏等食品中，三甲胺的测定值常用作鱼类等水产品腐败情况的重要质量控制参数。但人们对于其他食品中三甲胺的含量并未引起关注。
我国蛋鸭年存栏1.89亿只，年产鸭蛋360万吨左右，人均约25公斤。鸭蛋是南方消费的主要禽蛋之一，由于南方常年潮湿高温，鸭蛋容易变质。而且，当前我国鸭蛋生产面临着总体品质不高、腥味重、鲜蛋口感差等问题。三甲胺是引起鸭蛋发生腥味的主要物质，据国内外相关研究报道，三甲胺在肠道中可被进一步氧化形成氧化三甲胺，进而成为诱导动脉粥样化等人类心血管疾病发生的协同因子，人类食用存在一定的安全风险。
目前样品中三甲胺的提取方法对三甲胺的提取不完全，从而影响检测的准确性，另外测定三甲胺含量的检测方法有很多，包括分光光度法、离子色谱法、顶空气相色谱法和顶空气相色谱-质谱联用法。现有的检测方法由于检测限高，基本达到ppm级，检测周期长，灵敏度低，稳定性差等局限，不利于开展对于鸭蛋中三甲胺含量的快速批量测定。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中食品中三甲胺检测方法的检测限高，检测周期长，以及检测灵敏度低、稳定性差的缺陷，提供一种高效液相色谱-质谱联用检测三甲胺的方法。
本发明的第一个目的是提供一种用于检测食品中三甲胺的样品前处理方法。
本发明的第二个目的是提供一种用于检测食品中三甲胺的方法。
本发明的第三个目的提供上述检测方法的应用。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
一种用于检测食品中三甲胺的样品前处理方法，包括以下步骤：
S01.将待测食品匀质，加入提取剂，并在冰浴条件下超声；
S02.首次离心，获得上清液和沉淀；
S03.向沉淀中加入提取剂，并在冰浴条件下超声；
S04.再次离心，获得再次离心后的上清液和沉淀；
S05.沉淀采用步骤S03和S04进行再提取，重复1～3次；
S06.合并每次离心后的上清液，经纯化后获得目标样品。
传统食品中检测三甲胺时，一般是将样品与提取剂进行混合后，直接离心，并合并上清液，例如，当用顶空法测定食品中三甲胺时，其操作是在合并了上清液后，将上清液置于顶空瓶中，然后连同顶空瓶一起放入冰水浴中，再在顶空瓶中加入NaOH，这里的冰浴和加入NaOH是为了将铵盐转化为挥发性的胺，使三甲胺在气液两相达到动态平衡，而其他酸类物质留在溶液中，进入色谱柱的干扰较少。而本发明并非采用顶空法，是采用普通的液相色谱法检测，因此在样品的前处理上有不同，例如，本发明在在获取上清液前，即三甲胺的提取过程中，需要在冰浴条件下超声，超声提取可提高三甲胺的提取效率，冰水浴使易挥发的胺类减少挥发损耗。具有提取高效，且减少待检测目标物损耗的好处。
优选的，上述样品前处理方法中，步骤S01所用的提取剂为质量分数为3～7％的三氯乙酸。
优选的，步骤S02中离心采用5000～8000r/min的转速，每次离心10～20min。
优选的，待测食品与提取剂的混合比为1：(1～4)，更优选的，待测食品与提取剂的混合比为1：2。
优选的，步骤S01中，冰浴条件下超声提取10～20min。
优选的，步骤S06中，纯化包括依次进行的离心、柱纯化和过滤，具体是合并每次离心后的上清液，先经过离心，取离心后的上清液，经固相萃取柱后，再取过柱后的滤液过滤。
更优选的，步骤S06中，离心的条件为5000～8000r/min，10～20min，柱纯化采用的是PRIME HLB小柱(无需活化)纯化；纯化后的滤液过0.22μm的膜，备用。
本发明还提供一种用于检测食品中三甲胺的方法，包括以下步骤：
S1.根据上述方法处理得到目标样品；
S2.配制三甲胺的标准溶液；
S3.将S1得到的目标样品和S2的标准溶液分别通过高效液相色谱-质谱仪检测；
S4.根据标准溶液的高效液相色谱-质谱仪检测结果绘制标准曲线，再根据标准曲线和高效液相色谱-质谱仪检测的峰面积计算目标样品中三甲胺的含量。
优选的，步骤S3的检测条件为：
(1)色谱条件
色谱柱：ACQUITY UPLC C18，规格：1.7μm，3.0×100mm；进样量：3μL；柱温：40℃；流速：0.3mL/min；流动相：流动相A为0.1％的甲酸水溶液，流动相B为甲醇；
其中，高效液相色谱采用梯度洗脱，梯度洗脱条件如下：0～1.2min时，流动相为95％A+5％B；1.2～3min时，流动相为95％A变化为50％A；3～6min时，保持流动相为50％A+50％B；6～6.1min时，流动相为50％A变化为95％A；6.1～8.00min时，保持流动相为95％A+5％B；
(2)质谱条件
离子源：电喷雾电离源ESI；扫描模式：多反应监控MRM；温度：550℃；时间：8min，延迟0，循环1s；以60.10/45.00为定性离子对；60.10/44.00为定量离子对；DP电压：50V；CE电压：子离子44.00为18v，子离子45.00为26v。
优选的，步骤S4还包括待测食品中三甲胺基质效应的检测，由于新鲜的食品中通常也含有三甲胺，因此，为了降低检测误差，提高检测精准率，本发明在检测食品中三甲胺的时候，还增加了校准食品中三甲胺含量的步骤；具体在检测的过程中，会通过扣除新鲜食品中固有的三甲胺含量，来确定食品中实际增加的三甲胺含量。
具体地，是采用相对响应值法计算三甲胺的基质效应，基质效应＝(B-B0)/A*100％，其中，A为在纯溶剂中被检测物(本发明中，该被检测物为三甲胺)的响应值，B为样品基质中添加的相同含量的被检测物得到响应值；B0为样品基质未添加被检测物(三甲胺)的本底值；通过公式X＝V×C/(基质效应×m)，其中X为鸭蛋中三甲胺含量，μg/kg；V为提取剂体积，mL；C为仪器读取提取剂中三甲胺的含量，ng/mL；m为样品称样量，g，计算获得待测食品中实际三甲胺的含量。
优选的，上述检测方法中，质谱条件还包括：CXP电压：13v；离子化电压(IS)：2500v，其中质谱检测中所用的雾化气、气帘气、辅助气、碰撞气均为高纯氮气。气帘气(CUR)：30psi；碰撞气(CAD)：9；喷雾气(GS1)：55psi；辅助加热气(GS2)：55psi。
本发明还提供上述检测方法在检测食品中三甲胺含量的应用。
优选的，上述应用中，所述食品包括但不限于水产品、蛋类、豆类、奶类食品。
具体的，本发明提供上述检测方法在检测鸭蛋中三甲胺含量的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
本发明建立了一种高效液相色谱-质谱联用检测食品中三甲胺含量的方法，该方法在样品前处理中采用了冰浴超声提取样品中的目标物质，具有提取高效，且减少待检测目标物损耗的好处，另外，利用建立的方法检测三甲胺，通过食品中三甲胺的基质抑制率折算实际样品中三甲胺的含量，该方法操作简单，经济实用，三甲胺在0～200ng/mL范围内得到的标准曲线，线性相关性R＝0.9994，检出限为11.2μg/kg，检出限低(检出限达到ppb级)，灵敏度高，其可用于准确检测食品中的三甲胺。
附图说明
图1以5％三氯乙酸为溶剂配制的标准溶液绘制的标准曲线；
图2以80％乙腈为溶剂配制的标准溶液绘制的标准曲线；
图3以10％甲醇为溶剂配制的标准溶液绘制的标准曲线；
图4以5％三氯乙酸为溶剂配置的100ng/mL的三甲胺标准溶液的色谱图(A为定量特征离子色谱图；B为定性特征离子色谱图)；
图5以80％乙腈为溶剂配置的100ng/mL的三甲胺标准溶液的色谱图(A为定量特征离子色谱图；B为定性特征离子色谱图)；
图6以10％甲醇为溶剂配置的100ng/mL的三甲胺标准溶液的色谱图(A为定量特征离子色谱图；B为定性特征离子色谱图)。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例、对比例和说明书附图将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
除特殊说明，本实施例、对比例以及实验例中所用的设备均为常规实验设备，所用的材料、试剂无特殊说明均为市售得到。实施例中的“溶液”无特殊说明为水溶液。
实施例1
一、提取剂的选择
(1)分别用5％三氯乙酸、80％乙腈以及10％甲醇配制成10、20、50、100、200ng/mL的三甲胺标准溶液。进行高效液相色谱-质谱检测(检测条件一致)并绘制标准曲线。5％三氯乙酸配制的标准溶液的检测结果标准曲线如表1，图1；80％乙腈配制的标准溶液的检测结果和标准曲线如表2、图2；10％甲醇配制的标准溶液的检测结果和标准曲线如表3、图3。
表1 5％三氯乙酸配制的标准溶液的检测结果
Figure BDA0002294420280000041
Figure BDA0002294420280000051
表2 80％乙腈配制的标准溶液的检测结果
Figure BDA0002294420280000052
表3 10％甲醇配制的标准溶液的检测结果
Figure BDA0002294420280000053
如表1至3和图1至3所示，以5％三氯乙酸为溶剂得到的标准曲线的线性相关系数R为0.99940；以80％乙腈为溶剂得到的标准曲线的线性相关系数R为0.99504；以10％甲醇为溶剂得到的标准曲线的线性相关系数R为0.99681。说明三甲胺以5％三氯乙酸作为提取剂的标准曲线线性最好，更有利于提高检测的准确性。
(2)分别以5％三氯乙酸、80％乙腈以及10％甲醇为溶剂配置100ng/mL的三甲胺标准溶液。用高效液相色谱-质谱进行测试得到的色谱图分别如图4，图5和图6所示。
图4A为用5％三氯乙酸作为溶剂的三甲胺定量离子的色谱图，图4B为用5％三氯乙酸作为溶剂的三甲胺定性离子的色谱图；图5A为用80％乙腈作为溶剂的三甲胺定量离子的色谱图，图5B为用80％乙腈作为溶剂的三甲胺定性离子的色谱图；图6A为用10％甲醇作为溶剂的三甲胺定量离子的色谱图，图6B为用10％甲醇作为溶剂的三甲胺定性离子的色谱图。由图4至图6可以看出，不论是定性离子还是定量离子，5％三氯乙酸作为溶剂得到的色谱图的基线低，峰形好，拖尾峰影响最小，所以应采用5％三氯乙酸作为三甲胺的提取剂。
二、基质效应的测定
采用相对响应值法计算基质效应，基质效应Matrix Effcet(％)＝(B-B0)/A×100％，A：在纯溶剂中被检测物(三甲胺)的响应值；B：样品基质中添加的相同含量被检测物(三甲胺)响应值；B0：样品基质未添加被检测物(三甲胺)的本底值。
本实验通过对新鲜的鸭蛋样品进行基质加标，样品经过实施例中的前处理后，通过高效液相色谱-质谱联用检测，加标浓度相当于提取剂中所含浓度分别为50ng/mL和100ng/mL，加标样品6个平行项，测试结果如表4和表5所示。
表4 鸭蛋中加标50ng/mL的三甲胺测定浓度
Figure BDA0002294420280000061
表5 鸭蛋中加标100ng/mL的三甲胺测定浓度
Figure BDA0002294420280000062
同批次标准曲线中50ng/mL三甲胺标准溶液的测定值为51.22ng/mL，加标样平均测定浓度为9.48ng/mL(表4)，故基质效应为16.0％。同批次标准曲线中100ng/mL三甲胺标准溶液的测定值为107.51ng/mL，加标样平均测定浓度为16.24ng/mL(表5)，故基质效应为14.8％。
综合两组加标量的基质效应，得到鸭蛋中平均基质效应为15.4％。
实施例2一种用于检测食品中三甲胺的样品前处理方法
(1)前处理：
称取3g样品于50mL离心管中，加入6mL5％三氯乙酸沉淀蛋白质，用混合仪混匀10min，冰浴超声萃取15min，高速离心(6000r/min)10min，采用胶头滴管转移上清液至15mL离心管中，沉淀再用6mL5％三氯乙酸重复上述操作提取一次，合并两次提取液，定容到15mL，高速离心(6000r/min)10min，取上清液5mL经PRIME HLB小柱净化(无需活化)，取过柱后的滤液1mL过0.22μm的膜，待上机使用。
(2)液相色谱和质谱条件
色谱条件
ACQUITY UPLC C18 1.7μm 3.0×100mm色谱柱；柱温40℃；进样体积3μL；流动相A为0.1％的甲酸水溶液，流动相B为甲醇；流速为：0.3mL/min，梯度洗脱条件如下所示：
时间(min) A(％) B(％)
0.00 95 5
1.20 95 5
3.00 50 50
6.00 50 50
6.10 95 5
8.00 95 5
质谱条件
离子源：电喷雾电离源(ESI)；持续时间：8min，延迟0，循环1s；三甲胺母离子质荷比：60.10；子离子质荷比：44.00、45.00；以60.1/45.00为定性离子对；60.10/44.00为定量离子对；扫描模式：多反应监控(MRM)；正负离子模式：正离子模式；DP(去族)电压：50v；EP电压：10v；CE电压：子离子44.00为18v，子离子45.00为26v；CXP电压：13v气帘气(CUR)：30psi；碰撞气(CAD)：9；离子化电压(IS)：2500v；温度(TEM)：550℃喷雾气(GS1)：55psi；辅助加热气(GS2)：55psi
监测离子对列表如下(表6)：
表6 检测离子情况表
Figure BDA0002294420280000071
将新鲜的鸭蛋按照上述检测方法，再加标测定，加标量分别为50ng/mL、100ng/mL和20ng/mL。并同时计算各组的精密度(RSD％)和回收率(％)。结果如表7至9所示。
表7 样品加标50ng/mL测定浓度、精密度和回收率情况表
Figure BDA0002294420280000081
表8 样品加标100ng/mL测定浓度、精密度和回收率情况表
Figure BDA0002294420280000082
表9 样品加标20ng/mL测定浓度的测定浓度、精密度和回收率
Figure BDA0002294420280000083
从表7至表9可以看出对不同浓度的检测，检测的精密度小于3.74％，回收率91～116％。说明本发明的检测方法具有较高的精密度及回收率。
以空白鸭蛋为基质，做14个平行添加实验，三甲胺的添加浓度均为100μg/kg(本实验中相当于上机浓度20ng/mL)，按照上述方法进行前处理，上机测得三甲胺浓度X：110μg/kg、104μg/kg、108μg/kg、105μg/kg、116μg/kg、117μg/kg、114μg/kg、116μg/kg、106μg/kg、113μg/kg、114μg/kg、111μg/kg、110μg/kg、111μg/kg，可计算三甲胺的检出限为：11.2μg/kg。
计算公式如下：
检出限
Figure BDA0002294420280000084
式中：K为置信因子，取3；Sb-平行测试样含量的标准偏差；C-加标浓度；
Figure BDA0002294420280000085
-平行试样含量的平均值。
实施例3
采用实施例2实验方法对深圳农贸市场随机购入的32份鸭蛋样品进行双平行测定，取平均浓度为该样品三甲胺的含量。其中超线性范围的测定值经过稀释后上机测定。结果如表10所示。
表10 鸭蛋样品中三甲胺含量的测定值
样品编号 YD-1 YD-2 YD-3 YD-4 YD-5 YD-6 YD-7 YD-8
浓度μg/kg 1.21×10<sup>5</sup> 16.2 20.9 21.8 23.6 31.3 48.0 35.3
样品编号 YD-9 YD-10 YD-11 YD-12 YD-13 YD-14 YD-15 YD-16
浓度μg/kg 22.3 17.9 28.1 23.2 17.4 17.6 22.5 46.3
样品编号 YD-17 YD-18 YD-19 YD-20 YD-21 YD-22 YD-23 YD-24
浓度μg/kg 31.9 37.4 17.0 27.9 28.0 29.7 21.6 30.3
样品编号 YD-25 YD-26 YD-27 YD-28 YD-29 YD-30 YD-31 YD-32
浓度μg/kg 31.2 23.8 41.4 28.1 33.0 25.2 38.6 651
32份样品，在制样过程中发现：YD-1为臭鸭蛋，样品状态流水状，气味恶臭；YD-7、YD-16为轻度散黄蛋，淡淡的腥味；YD-32为散黄蛋，较浓的臭味。
经实验测定，除制样过程中发现的四份样品状态异常，检测值：YD-1为1.21×105μg/kg，YD-7为48.0μg/kg，YD-16为46.3μg/kg，YD-32为651μg/kg。其它样品状态正常，测定值均小于36μg/kg。通过实验结果与样品状态观察结果基本吻合的情况，我们可以初步判定，鸭蛋中的三甲胺含量是鸭蛋新鲜度的一项重要指标，其中当三甲胺含量低于36μg/kg时，鸭蛋为新鲜可食用状态，当三甲胺含量高于36μg/kg时，鸭蛋已经变质。说明，本发明的检测方式可以适用于实际鸭蛋样品中的检测，为判断鸭蛋的新鲜程度提供更为科学的依据。
综上所述，本发明通过5％三氯乙酸作为提取剂结合冰浴超声，充分提取鸭蛋中的三甲胺后，用高效液相色谱-质谱联用法测定鸭蛋中三甲胺的含量。由于鸭蛋中本身含有三甲胺基底，而且基质效应明显，故采用相对响应值法计算鸭蛋基质效应为15.4％，再通过试剂配制的标准工作曲线，上机测定检测值，通过基质抑制率折算出实际样品中的三甲胺的含量。建立的方法操作简单、经济实用、灵敏度高，样品提取稳定性好，可用于准确测定鸭蛋中的三甲胺含量，同时可以推广到其它诸如水产品、豆类、牛奶中三甲胺的检测。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种用于检测食品中三甲胺的样品前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
S01.将待测食品匀质，加入提取剂，并在冰浴条件下超声；
S02.首次离心，获得上清液和沉淀；
S03.向沉淀中加入提取剂，并在冰浴条件下超声；
S04.再次离心，获得再次离心后的上清液和沉淀；
S05.沉淀采用步骤S03和S04进行再提取，重复1～3次；
S06.合并每次离心后的上清液，经纯化后获得目标样品。
2.根据权利要求1所述的用于检测食品中三甲胺的样品前处理方法，其特征在于，步骤S01中，冰浴条件下超声提取10～20min。
3.根据权利要求1所述的用于检测食品中三甲胺的样品前处理方法，其特征在于，步骤S06中，纯化包括依次进行的离心、柱纯化和过滤。
4.一种用于检测食品中三甲胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.根据权利要求1至3任一项所述的方法处理得到目标样品；
S2.配制三甲胺的标准溶液；
S3.将S1得到的目标样品和S2的标准溶液分别通过高效液相色谱-质谱仪检测；
S4.根据标准溶液的高效液相色谱-质谱仪检测结果绘制标准曲线，再根据标准曲线和高效液相色谱-质谱仪检测的峰面积计算目标样品中三甲胺的含量。
5.根据权利要求4所述的用于检测食品中三甲胺的方法，其特征在于，步骤S3的检测条件为：
(1)色谱条件
色谱柱：ACQUITY UPLC C18，规格：1.7μm，3.0×100mm；进样量：3μL；柱温：40℃；流速：0.3mL/min；流动相：流动相A为0.1％的甲酸水溶液，流动相B为甲醇；
其中，高效液相色谱采用梯度洗脱，梯度洗脱条件如下：0～1.2min时，流动相为95％A+5％B；1.2～3min时，流动相为95％A变化为50％A；3～6min时，保持流动相为50％A+50％B；6～6.1min时，流动相为50％A变化为95％A；6.1～8.00min时，保持流动相为95％A+5％B；
(2)质谱条件
离子源：电喷雾电离源ESI；扫描模式：多反应监控MRM；温度：550℃；时间：8min，延迟0，循环1s；以60.10/45.00为定性离子对；60.10/44.00为定量离子对；DP电压：50V；CE电压：子离子44.00为18v，子离子45.00为26v。
6.根据权利要求5所述的用于检测食品中三甲胺的方法，其特征在于，步骤S4还包括待测食品中三甲胺基质效应的检测。
7.权利要求6所述方法在检测食品中三甲胺的含量的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述食品包括但不限于水产品、蛋类、豆类、奶类食品。
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