CN114137097A - 液相色谱-串联质谱检测奶中褪黑素的方法及其性能评价 - Google Patents

Abstract

本发明公开了使用液相色谱‑串联质谱(LC‑MS/MS)法检测奶中褪黑素浓度的方法及检测性能评价，该方法可以排除干扰，更准确的检测奶中褪黑素浓度。本发明还包括对奶的前处理方法，采用甲醇提取样品后，使用C18固相萃取柱净化，可有效降低检测时产生的基质效应，使得检测更加准确，为奶中褪黑素的研究提供了有益的参考。

Description

液相色谱-串联质谱检测奶中褪黑素的方法及其性能评价

技术领域

本发明属于褪黑素检测技术领域，具体地涉及使用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法测定奶中褪黑素浓度的方法及检测性能评价。

背景技术

褪黑素(Melatonin，MT)是一种吲哚类激素，化学名称为N-乙酰-5-甲氧基色胺，是一种古老的抗氧化剂，同时也是一种重要的生殖激素。褪黑素主要来自于哺乳动物的松果体，其功能包括清除自由基、增强免疫力、抑制衰老、改善睡眠质量等作用。褪黑素的生理与药理功能的多样性得到了国内外学者的普遍重视，美国食品与药品管理局认可褪黑素作为普通膳食补充剂，中国卫生部先后批准20余种含褪黑素产品作为改善睡眠的保健食品，全世界至今已经有数百万人长期服用。通过对牛奶中MT含量的提取与检测，可以评估相关食品的合理饮用量，为人们的健康饮食、功能保健食品的开发利用提供科学依据。

现有技术已知一些对奶和血清及其相关制品中褪黑素含量进行检测的方法。目前，国内外褪黑素的检测方法主要有以下四种：高效液相色谱法(HPLC)、紫外分光光度法(CV)、酶联免疫检测法(ELISA)和液相色谱-质谱仪联用法(LC-MS)。不同方法也有各自使用范围和局限性。

(1)高效液相色谱法(HPLC)：优点是高压、高速、高效、高灵敏度和应用范围广，但对分子量相近的物质，或成分过于复杂的样品，会造成无法分辨待测物质的出峰时间，从而造成检测结果的不准确。

(2)紫外分光光度法(CV)：优点是对于成分简单的物质或生物制剂检测结果准确可靠，但不能测得成分复杂的样品。

(3)酶联免疫检测法(ELISA)：优点是检测灵敏度高，而缺点是由于褪黑素ELISA检测法中褪黑素纯化抗体不纯，导致抗原抗体结合不完全，检测范围受限，并且酶联免疫检测法中褪黑素损耗较大，准确性相对来说较低。

(4)液相色谱-质谱仪联用法(LC-MS)：优点是将液相色谱和质谱连接，增加更充分的分析能力，能够准确定性和定量细胞和组织裂解液、血液、血浆、尿液和口腔液等复杂样品基质中的微量化合物。其中，液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)能够有效地将有机物样品中的待测成分分离，串联质谱能够对分开的有机物逐个的分析，具有高灵敏度、高通量、定量的高精密度和重现性、高稳定性、质谱图简洁、后期数据处理简单，但对样品处理要求高，如果样品不符合要求，很难达到理想的效果。

目前，在检测奶中的褪黑素的方面，尚未见报道对奶样进行优化的前处理方法。

因此，有必要对样品前处理方法进行优化，并建立一套完整、可靠的LC-MS/MS方法来检测奶中褪黑素的含量。

发明内容

本发明的目的是提供使用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法检测奶及奶中褪黑素浓度的方法及检测性能评价。

第一方面，本发明提供液相色谱-串联质谱检测奶中褪黑素的前处理方法，所述前处理方法包括以下步骤：采用甲醇提取样品中的褪黑素后，浓缩，使用C18固相萃取柱净化。

具体地，将甲醇与奶混合，离心，取上清液，氮吹至近干，用甲醇水溶液复溶，过C18固相萃取柱净化，用甲醇洗脱，得到净化后的样品溶液。

在一些实施方案中，本发明的前处理方法中，所述甲醇为色谱级甲醇。

在一些实施方案中，本发明的前处理方法中，所述甲醇水溶液的质量浓度为3％～10％；优选地，所述甲醇水溶液的质量浓度为5％～8％；更优选地，所述甲醇水溶液的质量浓度为5％。

在一些实施方案中，本发明的前处理方法中，在离心前进行降温，所述降温为降低温度至-25℃～-15℃；优选地，降温至-20℃～-18℃；更优选地，降温至-18℃。降温时，可静置20min～60min，优选静置30min。降温的目的是去除蛋白及部分脂肪，优选在-18℃以下降温去除蛋白及部分脂肪更加彻底。

在一些实施方案中，本发明的前处理方法中，所述离心为以10000g～20000g、4℃离心3min～10min；优选地，所述离心为以10000g、4℃离心5min。离心采用的是高速离心，离心的目的是去除沉淀，高速离心可使去除沉淀更加彻底。

在一些实施方案中，在本发明的前处理方法中，使用C18固相萃取柱净化的目的是去除极性较大的干扰检测物质，降低基质效应，使得检测更加准确。在上液相柱进行检测前，将奶先过C18固相萃取柱，可以使奶中包括褪黑素在内的非极性小分子保留在C18固相萃取柱上，然后经过甲醇洗脱，得到净化后的样品溶液。

第二方面，本发明提供液相色谱-串联质谱检测奶中褪黑素的方法，所述方法包括：采用液相色谱-串联质谱对奶样品进行检测，其中液相色谱的流动相为0.1％的甲酸水溶液和甲醇溶液，梯度洗脱；质谱的多反应监测条件：定性离子对为233.1＞174.2和233.1＞159.1，碰撞能量分别为10eV和25eV，以233.1＞174.2离子对进行定量，锥孔电压75V。

在一些实施方案中，0.1％的甲酸水溶液的梯度浓度为90％～10％，甲醇溶液的梯度浓度为10％～90％。

在一些实施方案中，所述样品是经过上述的前处理方法得到的。

本发明的方法适用于哺乳动物乳汁或奶中褪黑素的含量检测，所述奶包括但不限于人乳、牛奶、羊奶、马奶、骆驼奶和鹿奶等，优选为人乳、牛奶、羊奶、马奶，更优选为人乳或牛奶。

本发明的检测方法性能评价主要依据美国食品与药品监督管理局(U.S.FDA)发布的《生物分析方法验证指南》中实验项目进行评价，主要包括：线性、携带污染及残留、基质效应、回收率、精密度。

本发明提供了使用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法测定奶中褪黑素浓度的方法及检测性能评价，该方法可以排除干扰，更准确的检测奶中褪黑素浓度。本发明还包括对奶的前处理方法，采用甲醇提取样品后，浓缩，使用C18固相萃取柱净化，去除极性大分子等干扰检测物质后，能够有效降低检测时产生的基质效应，并减少褪黑素的损失，使得检测更加准确，为奶中褪黑素的研究提供了有益的参考。

本发明的优点在于：

(1)样本的前处理方法中，通过甲醇提取后，在-18℃以下降温去除蛋白及部分脂肪更加彻底；

(2)样本的前处理方法中，通过甲醇提取后，离心得到的上清液经过C18固相萃取柱净化，去除极性物质，降低基质效应，使得检测更加准确；

(3)样本的前处理方法中，氮吹、复溶步骤，起到浓缩的作用，可以减少稀释倍数，增加浓度，例如可由开始的稀释5倍浓缩为稀释2倍，因此，也更有利于浓度较低样本的检测；

(4)本发明的液相色谱-串联质谱方法检测奶中褪黑素的含量，通过检测性能评价，该检测方法精确度高，灵敏度高，可靠性高。

附图说明

图1示出低浓度褪黑素标准品标准曲线。

图2示出高浓度褪黑素标准品标准曲线。

图3示出0.1ng/mL标准品定量离子色谱图。

图4示出10ng/mL标准品定量离子色谱图。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。

以下实施例中使用的试剂和材料均为市售商品。

实施例：

1.实验样品

采集的牛奶放置于50mL离心管中，低温运输，-20℃保存。

2.褪黑素标准品制备

精确称取褪黑素标准品100mg，用甲醇定容至100mL，配制成浓度为1mg/mL的标准储备溶液，置于-18℃冰箱保存；准确移取0.10mL标准储备液于10mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，配制成浓度为10μg/mL的标准中间液；准确移取0.10mL标准储备液于10mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，配制成浓度为100ng/mL的标准使用液，-18℃冰箱保存。

3.样品前处理

样品(冷冻试样常温解冻后)，置于超声波清洗机37℃超声30min使样品均质化；如是液态样品，可直接置于超声波清洗机37℃超声30min使牛奶均质化。量取1mL试样置于15mL离心管中，准确加入4mL甲醇，使用旋涡混合仪振荡提取10min。将混合液全部置于-18℃冰箱静置30min。静置后使用低温高速离心机以10000g，4℃离心5min。取上清液至10mL离心管中使用氮吹仪在40℃吹干，使用2mL 5％甲醇水溶液复溶。

C18固相萃取柱(3mL，500mg)使用前先用2mL甲醇和2mL水活化，活化后将2mL样品复溶液加入固相萃取柱，以约1滴/秒的速度过柱，弃去第一次滤液，再用2mL甲醇过柱，以约1滴/秒的速度过柱，收集滤液。用注射器吸取滤液，过0.22μm有机相微孔滤器，供液相色谱-串联质谱测定。

4.液相色谱-串联质谱检测(LC-MS/MS)

本专利检测设备采用安捷伦(Agilent)6470三重四极杆液相色谱-串联质谱检测仪。

4.1色谱条件

a)色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18，50mm×2.1mm，粒径1.8μm。

b)柱温：40℃。

c)流速：0.4mL/min。

d)进样量：2μL。

e)流动相：A液为0.1％的甲酸水溶液，B液为甲醇溶液，梯度洗脱(梯度洗脱条件见表1)。

表1液相色谱梯度洗脱条件

4.2质谱条件

a)离子源：电喷雾离子源(ESI)。

b)扫描方式：正离子扫描。

c)检测方式：多反应监测(MRM)，条件见表2。

d)监测离子对：母离子233.1(m/z)，定性离子对为233.1＞174.2(碰撞能量10eV)和233.1＞159.1(碰撞能量25eV)，以233.1＞174.2离子对进行定量，锥孔电压75V。

e)干燥气温度：350℃。

f)干燥气流量：6L/min。

g)雾化气压力：50psi。

h)毛细管电压：3500V。

表2MRM条件

注：CE：碰撞能量；Frag：锥孔电压；^*离子用来定量

5.实验结果

5.1线性

对于低浓度褪黑素标准品(0.01ng/mL-0.2ng/mL)和高浓度褪黑素标准品(0.5ng/mL-20ng/mL)检测结果分别见表3和图1以及表4和图2。另外，0.1ng/mL标准品定量离子色谱图见图3，10ng/mL标准品定量离子色谱图见图4。

表3低浓度褪黑素标准品标准曲线

理论浓度(ng/mL)	响应值	实际浓度(ng/mL)
			0.01	784	0.01
0.02	1053	0.02
			0.05	3612	0.05
0.1	7832	0.11
			0.2	14345	0.2

表4高浓度褪黑素标准品标准曲线

理论浓度(ng/mL)	响应值	实际浓度(ng/mL)
			0.5	5885.063	0.55
1	9821.037	0.97
			3	27224.98	2.81
5	46818.66	4.88
			10	99494.7	10.46
20	188026.5	19.83

从表3和图1以及表4和图2中可以看出，对于低浓度褪黑素标准品(0.01ng/mL-0.2ng/mL)和高浓度褪黑素标准品(0.5ng/mL-20ng/mL)线性检测结果，R²均大于0.99，表明该方法线性良好。

5.2携带污染及残留

本实验对0.5ng/mL浓度样本和5ng/mL浓度样本连续交替进样，结果如表5所示。

表5

通过第一次进样低浓度样本的低浓度检测结果与随后进样的低浓度样本的差异为2.52％，低于预定标准(20％)，认为本方法不存在携带污染。

5.3基质效应

样品测定的基质干扰可以认为是样品中的整个化学组成成分与被分析物分子之间的关系，由于基质常常对目标分析物的分析过程有显著的干扰，并影响分析结果的准确性，这些影响和干扰被称为基质效应(Matrix effect,ME)，在实际应用中，在进行分析测试时，色谱质谱联用技术的准确性、精密度和重复性都非常容易受到基质干扰影响。

本方法中，配制标准工作溶液，使用甲醇配制浓度分别为0.01、0.02、0.05、0.1和0.2ng/mL的溶剂标准工作液。将溶剂标准工作溶液和基质匹配标准工作溶液分别进行LC-MS/MS测定，按照浓度和相应的峰面积绘制线性方程，计算基质效应(ME)。基质效应的计算公式为：

其中，Sm和Ss分别表示基质匹配标准曲线和溶剂标准曲线的斜率。负的结果表示基质抑制效应，正的结果表示基质增强效应。当ME＝–20％～20％时为弱基质效应；当ME＝–50％～–20％或20％～50％时为中等基质效应；当ME＝<–50％或>50％时为强基质效应。

实验结果显示，在使用LC-MS/MS测定褪黑素时，检测结果见表6，牛奶基质效应均在30％-60％之间，表现出了中等基质抑制效应。

表6牛奶基质效应影响

浓度(ng/mL)	0.01	0.02	0.05	0.1	0.2
						甲醇溶剂响应	784	1053	3612	7832	14345
生乳基质响应	297	596	1098	4716	8883
						灭菌乳基质响应	376	715	1820	3631	8391
巴氏杀菌乳基质响应	353	807	2117	4493	9506
						平均基质效应	-56.38	-32.95	-53.54	-45.35	-37.77

5.4回收率

本实验中对空白牛奶基质添加高浓度外源褪黑素标准品5ng/mL和10ng/mL，添加后处理，检测浓度，计算回收率，结果见表7。

表7空白牛奶基质添加高浓度外源褪黑素回收率(n＝15)

该方法检测外源添加高浓度褪黑素牛奶基质平均回收率为84.32％。

本实验中对不同牛奶添加低浓度外源褪黑素标准品0.1ng/m、0.2ng/mL和0.3ng/mL，添加后处理，检测浓度，计算回收率，结果见表8。

表8不同牛奶添加低浓度外源褪黑素回收率(n＝3)

从表7和表8中的结果可知，该方法检测牛奶中外源添加高、低浓度褪黑素均具有良好的回收率(70-120％)。

5.5褪黑素提取净化方法优化

前期基质效应结果表明，用甲醇直接提取会有明显基质效应，因此本发明的前处理方法采用在甲醇直接提取后使用固相萃取柱净化样品。本试验比较了甲醇直接提取法、甲醇提取-C18固相萃取柱和甲醇提取-HLB固相萃取柱三种净化方式。从表9中可以看出，经过不同类型的固相萃取柱净化后，褪黑素相对于甲醇直接提取法均有不同程度的损失。由表9的结果可知，对于样品1，经过HLB固相萃取柱后相对于甲醇直接提取上机褪黑素损失为34.65％；对于样品2，经过C18固相萃取柱后褪黑素损失为8.75％，经过HLB固相萃取柱后褪黑素损失为32.92％；对于样品3(高乳脂样品)，经过C18固相萃取柱后褪黑素损失为46.67％，经过HLB固相萃取柱后褪黑素损失为52.55％，甲醇直接提取法基质抑制效应为-63.73％，经过C18固相萃取柱后基质抑制效应降低为-28.29％，经过HLB固相萃取柱后基质抑制效应降低为-32.97％。

牛奶样本为非高乳脂样本，如果直接用甲醇提取，会产生很强的基质效应。当采用HLB固相萃取柱时，会造成较多的褪黑素损失。相对于常规的HLB固相萃取柱，本发明人意外地发现，当采用C18固相萃取柱后，不仅可以降低基质效应，而且可以降低褪黑素的损失。

因此，通过优化，本发明在液质联用检测奶中褪黑素时，对样品进行前处理，采用甲醇提取后，C18固相萃取柱净化的前处理方法，这样不仅能有效地降低基质效应，而且还可以使褪黑素损失较少，尤其是可以对低浓度样品进行检测。

表9甲醇提取、甲醇提取-C18固相萃取柱和甲醇提取-HLB固相萃取柱的稳定性

5.6精密度

对某公司提供的天然高褪黑素灭菌奶(试饮品)进行检测，每个样品做4个重复，RSD小于20％，详细结果见表10。

表10天然高褪黑素灭菌奶检测

不同实验人员使用本发明的方法分别对两份生乳样品进行前处理，每份样品3次重复，并上机检测，检测结果见表11，RSD小于20％。

表11不同人员检测样品差异对比

由三家独立不同机构对牛场大罐奶样品进行检测，每份样品检测2次，对比结果见表12和表13，经过不同人员，不同机器上机检测，不同实验室、不同操作人员、不同仪器对实际样品检测结果相对标准偏差不大于20％。

表12不同机构对同一样品检测稳定性

表13不同检测人员对同一样品检测稳定性

6.实验结论

6.1利用上述液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的洗脱程序和质谱条件检测褪黑素，具有检测线性良好、峰形单一对称、不存在携带污染、重复性良好的优点。

6.2利用本发明的前处理方法，超声均质化、甲醇处理、漩涡混合提取、低温沉淀、低温高速离心步骤、C18固相萃取柱净化牛奶样本，具有损失较少，检测准确的优点，且该处理方法回收率良好、保留时间稳定、方法整体精密度良好。

6.3本实验的研究对象实例为牛奶，但本发明的方法不仅适用牛奶中褪黑素含量检测，也适用于其他哺乳动物的乳汁及其奶中褪黑素含量检测，包括但不限于人乳、羊奶、马奶、骆驼奶和鹿奶。

以上所述，仅是对本发明的一般性说明及具体实施方案的描述而已，并非是对本发明作其它形式的限制。任何熟悉本领域的技术人员均可以基于本申请公开的技术内容加以更改或变型为其等同实施例。在不背离本发明的构思和精神的前提下，对本发明进行的任何修改或变型均属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.液相色谱-串联质谱检测奶中褪黑素的前处理方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

将甲醇与奶混合，离心，取上清液，氮吹至近干，用甲醇水溶液复溶，过C18固相萃取柱净化，用甲醇洗脱，得到净化后的样品溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲醇为色谱级甲醇。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲醇水溶液的质量浓度为3％～10％；优选地，所述甲醇水溶液的质量浓度为5％～8％。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在离心前进行降温，所述降温为降低温度至-25℃～-15℃；优选地，所述降温为降低温度至-20℃～-18℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离心为以10000g～20000g、4℃离心3min～10min；优选地，所述离心为以10000g、4℃离心5min。

6.液相色谱-串联质谱检测奶中褪黑素的方法，其特征在于，采用液相色谱-串联质谱对奶样品进行检测，其中液相色谱的流动相为0.1％的甲酸水溶液和甲醇溶液，梯度洗脱；质谱的多反应监测条件：定性离子对为233.1＞174.2和233.1＞159.1，碰撞能量分别为10eV和25eV，以233.1＞174.2离子对进行定量，锥孔电压75V。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，0.1％的甲酸水溶液的梯度浓度为90％～10％，甲醇溶液的梯度浓度为10％～90％。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述样品是经过权利要求1-5任一项所述的前处理方法得到的。

9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述奶包括人乳、牛奶、羊奶、马奶、骆驼奶和鹿奶。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述奶为人乳或牛奶。

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