CN112505179B - 一种测定同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法 - Google Patents

一种测定同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种测定同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法，步骤如下：1)选取三种目标化合物：吡哆醛；5‑甲基四氢叶酸；甲钴胺；2)以目标化合物与其同位素内标的浓度比为X轴，目标化合物与其同位素内标的峰面积比为Y轴，建立校正曲线，计算上述三种水溶性维生素的含量；3)蛋白沉淀剂配制；4)血清样本的前处理；5)标准曲线的配制与处理。运用蛋白沉淀与液液萃取相结合的前处理方式对血清样本处理，一方面使样本中蛋白质变性沉降得以去除，另一方面脂类杂质得到去除，使处理后的样本在检测过程中受较少基质的干扰；运用相对简便的前处理方式，及快速的检测方法，建立一种能同时检测多种水溶性维生素代谢产物。

Description

一种测定同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法
技术领域
本发明涉及一种测定血清中多种水溶性维生素代谢产物的同位素的液相色谱质谱联用方法，尤其涉及一种测定血清中多种水溶性维生素代谢产物的同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法。
背景技术
水溶性维生素(water-soluble vitamins)是能在水中溶解的一组维生素，是辅酶或辅基的组成部分。主要包括在酶的催化中起着重要作用的B族维生素，其代谢产物含量是判断人体健康水平的重要依据。如维生素B6又叫吡哆素，在蛋白质的代谢过程中起调控作用，它有助于能量的产生，让人感觉精力充沛，被称为提神营养素，吡哆醛是维生素B6的主要代谢产物，是在肝脏醛氧化酶的作用下产生的。5-甲基四氢叶酸是叶酸最具生物活性和功能的形式，是叶酸参与生理代谢的唯一途径，也是出现在动物血浆和细胞游离叶酸存在的唯一形式，主要用于药物活性成分和食品添加剂，有预防胎儿神经管缺陷、动脉硬化，治疗巨幼红细胞性贫血，增强氟化嘧啶的治疗效果，治疗例如牛皮癣和风湿性关节炎的自身免疫疾病。甲钴胺为维生素B12衍生物，通过化学结构命名，应该叫“甲基维生素B12”，其甲基化的官能基团可参与机体生化过程中的甲基转移活动，对神经组织的核酸、蛋白质和脂肪代谢有促进作用，可刺激雪旺氏细胞卵磷脂合成，修复损伤髓鞘，改善神经传导速度，可直接进入神经细胞，并刺激轴突受损区再生，刺激神经细胞的蛋白质合成，加强轴突的合成代谢，防止轴突变性，参与核酸合成，促进造血机能。
目前，有关水溶性维生素代谢产物的检测方法有很多种，如微生物检测法、ELISA、放射免疫分析，蛋白质结合或生物传感器等方法。微生物检测方法适用于检测多种衍生物的总和(如总叶酸)，其它方法在代谢物的区分上存在相同的缺点。而液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)能够区分开天然维生素及其代谢产物，灵敏度高，特异性强，非常适用于血清或血浆中多种水溶性维生素代谢产物的检测。但是，目前的LC-MS/MS技术检测水溶性维生素时仍然存在诸多问题，如灵敏度不够、前处理复杂和样本用量大等。
CN201910387449.0阐明了“一种多种水溶性维生素含量的测定方法”，采用LC-MS法对血样中5种水溶性维生素进行了检测，缺乏对指标的明确化说明，且对方法中的验证数据相对较少，仅进行了线性说明。
CN 201910837920.1发明名称“一种检测血液中水溶性维生素的方法”，采用LC-MS法对血样中11种水溶性维生素进行了检测，该专利虽然所分析的维生素较多，但仅使用的蛋白沉淀去除蛋白和基质能力较差，且一针分析时间为 15min，在临床检测中难以应用。
发明内容
水溶性维生素的代谢物是一类庞大而复杂的家族，不同代谢产物的化学性质和极性差异较大。因此，将几类样品前处理技术联用，如蛋白沉淀与液液萃取相结合，既能提高待测物的纯化效果，又能提高检测的灵敏度和重现性，非常适合临床复杂样本的分析，本发明的目的正是在于提供这样一种准确性好、灵敏度高的测定同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：
一种测定同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法，该方法包括如下步骤：
1)选取三种目标化合物
三种目标化合物分别为：吡哆醛(PL，吡哆醛)；5-甲基四氢叶酸(5-甲基四氢叶酸)；甲钴胺(MeB12，甲钴胺)；
2)利用同位素内标法进行定量，以目标化合物与其同位素内标的浓度比为 X轴，目标化合物与其同位素内标的峰面积比为Y轴，建立校正曲线，计算上述三种水溶性维生素的含量；
3)蛋白沉淀剂按照如下方法配制得到：分别移取10μL 100μg/mL吡哆醛-d3、10μL100μg/mL 5-甲基四氢叶酸-d5、20μL 10μg/mL甲钴胺-d3，加甲醇定容至1mL，配制成混合内标液，再准确移取100μL混合内标液，用 50％甲醇乙腈定容至10mL，配制成内标浓度分别为10.0ng/mL吡哆醛-d3、10.0 ng/mL 5-甲基四氢叶酸-d5、2.0ng/mL甲钴胺-d3蛋白沉淀剂；
4)血清样本的前处理：
4.1)准确移取200μL血清样本，加入含有四种内标的蛋白沉淀剂500μ L，涡旋混匀3min，再加入600μL B液，涡旋混匀3min，于4℃，15000rpm 离心10min；
4.2)取中间层500μL置于新的1.5mL EP管中，避光氮吹30min至近干，再加入120μLC液，涡旋混匀3min，于4℃，15000rpm离心2min；取100 μL于96孔样品板中，上机检测；
5)标准曲线的配制与处理
5.1)分别准确称取10.0mg吡哆醛、10.0mg 5-甲基四氢叶酸、10.0mg 氰钴胺、10.0mg甲钴胺，分别加入10mL甲醇、10mL含1％(v/v)VC甲醇、 10mL甲醇、10mL甲醇，配制成浓度分别为1.0mg/mL吡哆醛母液、1.0mg/mL5- 甲基四氢叶酸母液、1.0mg/mL氰钴胺母液、1.0mg/mL甲钴胺母液；
5.2)分别移取100μL 1.0mg/mL吡哆醛，用50％甲醇水定容至1mL得到 100.0μg/mL吡哆醛中间液；移取100μL 1.0mg/mL 5-甲基四氢叶酸，用甲醇定容至1mL得到100.0μg/mL5-甲基四氢叶酸中间液；移取10μL 1.0 mg/mL甲钴胺，用甲醇定容至1mL得到10.0μg/mL甲钴胺中间液；
5.3)分别从上述吡哆醛中间液、5-甲基四氢叶酸中间液、氰钴胺中间液、甲钴胺中间液10μL、10μL、10μL、10μL，用甲醇定容至1mL，得到混合标准液A；
5.4)混合标准液A用50％甲醇稀释得到吡哆醛/5-甲基四氢叶酸/甲钴胺浓度分别为5/10/25/50/100/250/500/1000、5/10/25/50/100/250/500/1000、 1/2/5/10/20/50/100/200ng/mL的标准曲线中间液；
5.5)吸取标准曲线中各个浓度标准曲线中间液用5％(v/v)BSA/PBS稀释10倍，得到吡哆醛/5-甲基四氢叶酸/甲钴胺浓度分别为 0.5/1/2.5/5/10/25/50/100、0.5/1/2.5/5/10/25/50/100、 0.1/0.2/0.5/1/2/5/10/20ng/mL的标准曲线；
5.6)准确移取200μL标准曲线各浓度点，加入含有3种内标的蛋白沉淀剂500μL，再加入600μL 80％(v/v)正己烷/乙酸乙酯，涡旋混匀3min，于4℃，15000rpm离心10min；
5.7)取中间层500μL置于新的1.5mL EP管中，避光氮吹30min至近干，再加入120μLC液，涡旋混匀3min，于4℃，15000rpm离心2min；取100 μL于96孔样品板中，上机检测。
作为本发明的一种优选方案，步骤2)中使用的仪器条件为：
高效液相色谱条件：
流动相A：0.1％甲酸+纯水；
流动相B：0.1％50％乙腈甲醇；
色谱柱型号：Waters UPLC HSS PFP(2.1mm*50mm,1.7μm)+在线过滤器；
柱温：40℃±5℃；进样量：15μL；进样盘温度：10℃±5℃；流速为0.3 mL/min。
作为本发明的一种优选方案，步骤2)中使用的仪器条件为：
质谱条件：
离子化模式：电喷雾正负离子切换；采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压：3.0kV；去溶剂气温度：350℃；去溶剂气流速：650L/Hr。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、运用蛋白沉淀与液液萃取相结合的前处理方式对血清样本处理，一方面使样本中蛋白质变性沉降得以去除，另一方面对脂类杂质得到去除，使处理后的样本在检测过程中受较少基质的干扰。
2、运用相对简便的前处理方式，及快速的检测方法，建立一种能同时检测多种水溶性维生素代谢产物：吡哆醛、5-甲基四氢叶酸、甲钴胺的同位素稀释超高效液相色谱串联质谱联用方法。
附图说明
图1为吡哆醛、5-甲基四氢叶酸和甲钴胺及其三种内标标准品的总离子流图；
图2为吡哆醛标准曲线图；
图3为5-甲基四氢叶酸标准曲线图；
图4为甲钴胺标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细地描述。
一种测定同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法，该方法包括如下步骤：
1)选取三种目标化合物
三种目标化合物分别为：吡哆醛(PL，吡哆醛)；5-甲基四氢叶酸(5-甲基四氢叶酸)；甲钴胺(MeB12，甲钴胺)。
2)利用同位素内标法进行定量，以目标化合物与其同位素内标的浓度比为 X轴，目标化合物与其同位素内标的峰面积比为Y轴，建立校正曲线，计算上述三种水溶性维生素的含量，具体仪器条件为：
a)高效液相色谱条件：
流动相A：0.1％甲酸+纯水；
流动相B：0.1％50％乙腈甲醇；
色谱柱型号：Waters UPLC HSS PFP(2.1mm*50mm,1.7μm)+在线过滤器；
柱温：40℃±5℃；进样量：15μL；进样盘温度：10℃±5℃；流速为0.3 mL/min；
采用梯度洗脱方式，见表1
表1梯度洗脱程序
Figure BDA0002797807290000051
Figure BDA0002797807290000061
b)质谱条件：
离子化模式：电喷雾正负离子切换；采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压：3.0kV；去溶剂气温度：350℃；去溶剂气流速：650L/Hr。
表2吡哆醛、5-甲基四氢叶酸和甲钴胺质谱参数
Figure 2
3)蛋白沉淀剂按照如下方法配制得到：分别移取10μL 100μg/mL吡哆醛-d3、10μL100μg/mL 5-甲基四氢叶酸-d5、20μL 10μg/mL甲钴胺-d3，加甲醇定容至1mL，配制成混合内标液，再准确移取100μL混合内标液，用 50％甲醇乙腈定容至10mL，配制成内标浓度分别为10.0ng/mL吡哆醛-d3、10.0 ng/mL 5-甲基四氢叶酸-d5、2.0ng/mL甲钴胺-d3蛋白沉淀剂。
4)血清样本的前处理：
4.1)准确移取200μL血清样本，加入含有四种内标的蛋白沉淀剂500μL，涡旋混匀3min，再加入600μL B液，涡旋混匀3min，于4℃，15000rpm 离心10min；
4.2)取中间层500μL置于新的1.5mL EP管中，避光氮吹30min至近干，再加入120μLC液，涡旋混匀3min，于4℃，15000rpm离心2min；取100 μL于96孔样品板中，上机检测。
5)标准曲线的配制与处理
5.1)分别准确称取10.0mg吡哆醛、10.0mg 5-甲基四氢叶酸、10.0mg 氰钴胺、10.0mg甲钴胺，分别加入10mL甲醇、10mL含1％(v/v)VC甲醇、 10mL甲醇、10mL甲醇，配制成浓度分别为1.0mg/mL吡哆醛母液、1.0mg/mL5- 甲基四氢叶酸母液、1.0mg/mL氰钴胺母液、1.0mg/mL甲钴胺母液；
5.2)分别移取100μL 1.0mg/mL吡哆醛，用50％甲醇水定容至1mL得到 100.0μg/mL吡哆醛中间液；移取100μL 1.0mg/mL 5-甲基四氢叶酸，用甲醇定容至1mL得到100.0μg/mL5-甲基四氢叶酸中间液；移取10μL 1.0 mg/mL甲钴胺，用甲醇定容至1mL得到10.0μg/mL甲钴胺中间液；
5.3)分别从上述吡哆醛中间液、5-甲基四氢叶酸中间液、氰钴胺中间液、甲钴胺中间液10μL、10μL、10μL、10μL，用甲醇定容至1mL，得到混合标准液A；
5.4)混合标准液A用50％甲醇稀释得到吡哆醛/5-甲基四氢叶酸/甲钴胺浓度分别为5/10/25/50/100/250/500/1000、5/10/25/50/100/250/500/1000、 1/2/5/10/20/50/100/200ng/mL的标准曲线中间液；
5.5)吸取标准曲线中各个浓度标准曲线中间液用5％(v/v)BSA/PBS稀释 10倍，得到吡哆醛/5-甲基四氢叶酸/甲钴胺浓度分别为 0.5/1/2.5/5/10/25/50/100、0.5/1/2.5/5/10/25/50/100、 0.1/0.2/0.5/1/2/5/10/20ng/mL的标准曲线；
5.6)准确移取200μL标准曲线各浓度点，加入含有3种内标的蛋白沉淀剂500μL，再加入600μL 80％(v/v)正己烷/乙酸乙酯，涡旋混匀3min，于4℃，15000rpm离心10min；
5.7)取中间层500μL置于新的1.5mL EP管中，避光氮吹30min至近干，再加入120μLC液，涡旋混匀3min，于4℃，15000rpm离心2min；取100 μL于96孔样品板中，上机检测。
实施例
1.样本
研究的样本来自于重庆大学附属肿瘤医院于2020年9月体检的血清样本。
(1)仪器：Waters ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQD(美国，Waters)； ST16R台式高速冷冻离心机(美国，ThermoFisher Scientific)；G560E涡旋混合器(美国，ScientificIndustries公司)；BT125D电子天平(德国，赛多利斯股份公司)；MTN-2800W氮吹浓缩装置(德国，赛多利斯股份公司)；量筒、离心管等。
(2)试剂耗材：色谱纯甲醇(美国，默克)；色谱纯乙腈(美国，默克)；色谱纯甲酸(美国，阿拉丁)；色谱纯乙酸铵(美国，阿拉丁)；纯化水(中国，屈臣氏)；HSS PFP(2.1mm*50mm,1.7μm)配在线过滤器(美国，Waters)。
(3)标准品：吡哆醛盐酸盐、吡哆醛盐酸盐-d3、5-甲基四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸-d5、甲钴胺、甲钴胺-d3购自Sigma-Aldrich，纯度≥98％。
(4)质控品：含有吡哆醛、5-甲基四氢叶酸、甲钴胺、血清，分高、中、低三个浓度分别为QCL、QCM、QCH，见表3。
表3各目标物质控品对应浓度(单位：ng/mL)
编号 中文名 QCL QCM QCH
1 吡哆醛 5.0 10.0 20.0
2 5-甲基四氢叶酸 5.0 10.0 20.0
4 甲钴胺 0.5 2.0 10.0
2.方法
(1)色谱条件(高效液相色谱条件)：流动相A：0.1％甲酸+纯水；流动相B：50％甲醇乙腈；色谱柱型号：Waters UPLC HSS PFP(2.1mm*50mm,1.7μ m)+在线过滤器；柱温：40℃±5℃；进样量：15μL；进样盘温度：10℃±5℃；流速为0.3mL/min；采用梯度洗脱方式，见表1。
(2)质谱条件：在电喷雾(ES，Electrospray ionization)正负离子切换模式下；采用多反应监测(MRM，multiple reaction monitoring)的质谱扫描模式，毛细管电压(Capillary)：3.0kV；去溶剂气温度(Desolvation Temp)： 350℃；去溶剂气流速(Desolvation)：650L/Hr；同时监测目标物以及同位素内标，再分别对各目标物的锥孔电压和碰撞电压进行了优化，以便达到更高的稳定性和灵敏度。
(3)标准品配制：
分别准确称取10.0mg吡哆醛、10.0mg 5-甲基四氢叶酸、10.0mg氰钴胺、10.0mg甲钴胺，分别加入10mL甲醇、10mL含1％(v/v)VC甲醇、10mL 甲醇、10mL甲醇，配制成浓度分别为1.0mg/mL吡哆醛母液、1.0mg/mL5-甲基四氢叶酸母液、1.0mg/mL氰钴胺母液、1.0mg/mL甲钴胺母液；
分别移取100μL 1.0mg/mL吡哆醛，用50％甲醇水定容至1mL得到100.0 μg/mL吡哆醛中间液；移取100μL 1.0mg/mL 5-甲基四氢叶酸，用甲醇定容至1mL得到100.0μg/mL 5-甲基四氢叶酸中间液；移取10μL 1.0mg/mL 甲钴胺，用甲醇定容至1mL得到10.0μg/mL甲钴胺中间液。
(4)分别从上述吡哆醛中间液、5-甲基四氢叶酸中间液、甲钴胺中间液 10μL、10μL、10μL、10μL，用甲醇定容至1mL，得到混合标准液A；混合标准液A用50％甲醇稀释得到吡哆醛/5-甲基四氢叶酸/甲钴胺浓度分别为 5/10/25/50/100/250/500/1000、5/10/25/50/100/250/500/1000、 1/2/5/10/20/50/100/200、1/2/5/10/20/50/100/200ng/mL的标准曲线中间液；
吸取标准曲线中各个浓度标准曲线中间液用5％(v/v)BSA/PBS稀释10倍，得到吡哆醛/5-甲基四氢叶酸/甲钴胺浓度分别为0.5/1/2.5/5/10/25/50/100、 0.5/1/2.5/5/10/25/50/100、0.1/0.2/0.5/1/2/5/10/20、 0.1/0.2/0.5/1/2/5/10/20ng/mL的标准曲线。
(5)样本处理：
5.1)校准曲线的处理：准确移取200μL标准曲线各浓度点，加入含有四种内标的蛋白沉淀剂500μL，再加入600μL B液，涡旋混匀3min，于4℃， 15000rpm离心10min；
取中间层500μL置于新的1.5mL EP管中，避光氮吹30min至近干，再加入120μL C液，涡旋混匀3min，于4℃，15000rpm离心2min；
取100μL于96孔样品板中，上机检测。
5.2)血清样本的前处理：取血清200μL于1.5mL离心管中，然后跟标准曲线前处理方法一致，此处不再赘述。
5.3)质控品的前处理：分别取质控品QCL、QCM、QCH各200μL于1.5mL 离心管中，然后跟标准曲线前处理方法一致，此处不再赘述。
(6)样本测试结果：
序号 吡哆醛 5-甲基四氢叶酸 甲钴胺
1 14.20 4.00 0.438
2 13.61 9.19 0.092
3 7.16 6.09 0.229
4 9.69 4.02 0.146
5 1.75 32.57 0.239
6 13.83 10.63 0.362
7 8.57 35.10 0.420
8 5.00 32.71 0.200
9 11.54 11.30 0.159
10 13.87 16.14 0.410
产品性能测试数据
1.总离子流图：三种目标物的标准品和血清样本的峰型比较对称，在浓度不大于100ng/mL时基本没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为三种目标物总离子流图，各物质分离度良好，满足定量要求。
2.校准曲线：采用同位素内标定量法，利用MasstLynx软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算血清中待测物的浓度。3种目标化合物在对应浓度范围内线性拟合方程线性良好，相关系数在0.995以上，满足定量要求，见图2～图4。
3.精密度实验：购买经活性炭处理后空白血清，分别加入低、中、高三个浓度的标准品，以同位素内标法定量测三种目标物的浓度，日内精密度范围为 7.34％～11.52％；三天内分析10批，计算日间精密度范围为8.42～12.68％，表明本实施例所见方法稳定良好。
表5各目标物批内、批间精密度
Figure BDA0002797807290000111
4.回收率实验：
(1)购买有证参考物质，以相同步骤重复处理，平行3份，结果计算如表6 所示，结果：回收率范围：90.20％～98.75％。
表6目标化合物的回收率
目标化合物 靶值，ng/mL 测定值，ng/mL 平均回收率，％ RSD,％
吡哆醛 13.3 13.14 98.75 5.47
5-甲基四氢叶酸 9.75 10.32 105.85 4.15
甲钴胺 0.48 0.433 90.2 10.33
(2)制备低浓度、中浓度和高浓度加标样本，分别标记为RL、RM、RH，每个浓度平行6份，结果计算如表7所示，结果：不同浓度加标回收率样品的平均回收率在91.54％～108.60％，RSD均小于13.85％，表明本实例所建方法准确度良好。
表7各目标物的加标回收率结果(单位：ng/mL)
Figure BDA0002797807290000121
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (1)

1.一种测定同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
1)选取三种目标化合物
三种目标化合物分别为：吡哆醛；5-甲基四氢叶酸；甲钴胺；
2)利用同位素内标法进行定量，以目标化合物与其同位素内标的浓度比为X轴，目标化合物与其同位素内标的峰面积比为Y轴，建立校正曲线，计算上述三种水溶性维生素的含量；
3)蛋白沉淀剂按照如下方法配制得到：分别移取10μL 100μg/mL吡哆醛-d3、10μL 100μg/mL 5-甲基四氢叶酸-d5、20μL 10μg/mL甲钴胺-d3，加甲醇定容至1mL，配制成混合内标液，再准确移取100μL混合内标液，用50％甲醇乙腈定容至10mL，配制成内标浓度分别为10.0ng/mL吡哆醛-d3、10.0ng/mL 5-甲基四氢叶酸-d5、2.0ng/mL甲钴胺-d3蛋白沉淀剂；
4)血清样本的前处理：
4.1)准确移取200μL血清样本，加入含有三种内标的蛋白沉淀剂500μL，涡旋混匀3min，再加入600μL 80％正己烷/乙酸乙酯，v/v，涡旋混匀3min，于4℃，15000rpm离心10min；
4.2)取中间层500μL置于新的1.5mL EP管中，避光氮吹30min至近干，再加入溶剂溶解，涡旋混匀3min，于4℃，15000rpm离心2min；取100μL于96孔样品板中，上机检测；
5)标准曲线的配制与处理
5.1)分别准确称取10.0mg吡哆醛、10.0mg 5-甲基四氢叶酸、10.0mg氰钴胺、10.0mg甲钴胺，分别加入10mL甲醇、10mL含1％VC甲醇，v/v、10mL甲醇、10mL甲醇，配制成浓度分别为1.0mg/mL吡哆醛母液、1.0mg/mL5-甲基四氢叶酸母液、1.0mg/mL氰钴胺母液、1.0mg/mL甲钴胺母液；
5.2)分别移取100μL 1.0mg/mL吡哆醛，用50％甲醇水定容至1mL得到100.0μg/mL吡哆醛中间液；移取100μL 1.0mg/mL 5-甲基四氢叶酸，用甲醇定容至1mL得到100.0μg/mL 5-甲基四氢叶酸中间液；移取10μL 1.0mg/mL甲钴胺，用甲醇定容至1mL得到10.0μg/mL甲钴胺中间液；
5.3)分别从上述吡哆醛中间液、5-甲基四氢叶酸中间液、氰钴胺中间液、甲钴胺中间液10μL、10μL、10μL、10μL，用甲醇定容至1mL，得到混合标准液A；
5.4)混合标准液A用50％甲醇稀释得到吡哆醛/5-甲基四氢叶酸/甲钴胺浓度分别为5/10/25/50/100/250/500/1000、5/10/25/50/100/250/500/1000、1/2/5/10/20/50/100/200ng/mL的标准曲线中间液；
5.5)吸取标准曲线中各个浓度标准曲线中间液用5％BSA/PBS，v/v，稀释10倍，得到吡哆醛/5-甲基四氢叶酸/甲钴胺浓度分别为0.5/1/2.5/5/10/25/50/100、0.5/1/2.5/5/10/25/50/100、0.1/0.2/0.5/1/2/5/10/20ng/mL的标准曲线；
5.6)准确移取200μL标准曲线各浓度点，加入含有3种内标的蛋白沉淀剂500μL，再加入600μL 80％正己烷/乙酸乙酯，v/v，涡旋混匀3min，于4℃，15000rpm离心10min；
5.7)取中间层500μL置于新的1.5mL EP管中，避光氮吹30min至近干，再加入溶剂溶解，涡旋混匀3min，于4℃，15000rpm离心2min；取100μL于96孔样品板中，上机检测；
步骤2)中使用的仪器条件为：
高效液相色谱条件：
流动相A：0.1％甲酸+纯水；
流动相B：0.1％甲酸+50％乙腈甲醇；
色谱柱型号：Waters UPLC HSS PFP，2.1mm*50mm,1.7μm+在线过滤器；
柱温：40℃±5℃；进样量：15μL；进样盘温度：10℃±5℃；流速为0.3mL/min；
梯度洗脱程序如下：
时间，min 流速，mL/min A％ B％ Curve Initial 0.300 99.0 1.0 Initial 1.0 0.300 99.0 1.0 6 1.2 0.300 85.0 15.0 6 4.0 0.300 30.0 70.0 6 4.9 0.300 2.0 98.0 6 4.95 0.300 99.0 1.0 6 5.5 0300 99.0 1.0 6
质谱条件：
离子化模式：电喷雾正负离子切换；采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压：3.0kV；去溶剂气温度：350℃；去溶剂气流速：650L/Hr。
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