CN111323499A - 测定滤纸干血片中核苷酸代谢物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种测定滤纸干血片中核苷酸代谢物的方法，所述核苷酸代谢物包括腺苷、2'‑脱氧腺苷、鸟苷、2'‑脱氧鸟苷、肌苷和2'‑脱氧肌苷。该方法包括：1)将待测滤纸干血片在提取工作液中进行萃取处理，以便获得含有所述核苷酸代谢物的萃取液；2)将所述萃取液进行液相色谱‑质谱检测；3)基于液相色谱分离‑质谱检测结果，确定所述滤纸干血片中核苷酸代谢物的产量。根据本发明实施例的检测方法能够同时检测滤纸干血片中的6种核苷酸代谢物，用于科学研究或用于ADA和PNP两种疾病的同步筛查和诊断，使得检测成本降低，效率提高。该方法灵敏度高、特异性强和准确性高。

Description

测定滤纸干血片中核苷酸代谢物的方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体地，本发明涉及测定滤纸干血片中核苷酸代谢物的方法以及测定滤纸干血片中核苷酸代谢物的试剂盒。

背景技术

核苷是一类十分重要的生物大分子，在细胞的结构、代谢、能量和功能的调节等方面起着关键作用。作为核酸的基本构成单元，核苷参与生物体基因信息的保留、复制和转录的分子机制。此外，核苷类物质具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、抗炎、抗心肌缺血、改善心脑血管循环等多种生物功能。通过测定人体血液中核苷类代谢物的含量可用来评价人体的核苷代谢状况。

腺苷脱氨酶和嘌呤核苷磷酸化酶是人体中两个关键的蛋白酶，腺苷脱氨酶是一种嘌呤代谢补救通路酶，催化腺苷和2'-脱氧腺苷脱氨分别生成肌苷和2'-脱氧肌苷，而嘌呤核苷磷酸化酶用于催化嘌呤核苷和脱氧核苷的磷酸分解，从而形成黄嘌呤、次黄嘌呤、尿酸等人体重要代谢物。当其中任何一种酶缺乏时，会导致其前体物质的积累，再通过其他途径产生毒性代谢物，最终导致组织和系统的永久损伤。因此，可通过检测前体物质，即相关的核苷类代谢物(腺苷、2'-脱氧腺苷、鸟苷、2'-脱氧鸟苷、肌苷和2'-脱氧肌苷等)的含量用于反映两种酶的缺乏状况，从而进行重症联合免疫缺陷综合症ADA和PNP两种遗传代谢疾病的筛查和诊断。

目前核苷类代谢物的常规检测方法为适配体传感器法和高效液相色谱法。适配体传感器法是一种基于微流控芯片和核酸适配体识别技术的单一核苷检测方法，可实现血清样本中某种核苷的定量检测(相关专利申请号：201310702881.7)。高效液相色谱法采用紫外检测器对前处理后的样品进行定量检测分析，其检测样本类型有尿液或中草药等。

当前已有国外课题组报道了采用液相串联质谱技术检测嘌呤核苷的方法，从而进行ADA或PNP其中一种疾病的筛查。该方法将干血片样本进行前处理后上机检测，从而实现目标物的检测。

然而，核苷类代谢物的检测方法仍需要进一步开发和改进。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

现有的适配体传感器法检测核苷类代谢物，操作较为复杂，而且不能够同时检测多种核苷，且不适用于高通量筛查。高效液相色谱法，使用的紫外检测器灵敏度较低，不适用于待测物丰度低的血液样本。液相串联质谱技术虽然可以检测干血片样本中的嘌呤核苷，但现有技术方法较简单，并不能实现同时检测6种核苷类代谢物，只能针对ADA(腺苷脱氨酶缺乏症)或PNP(嘌呤核苷磷酸化酶缺乏症)中的一种疾病进行筛查，因此若筛查两种疾病将会增加时间和人工成本等。

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种测定滤纸干血片中核苷酸代谢物的方法，所述核苷酸代谢物包括腺苷、2'-脱氧腺苷、鸟苷、2'-脱氧鸟苷、肌苷和2'-脱氧肌苷。根据本发明的实施例，所述方法包括：1)将待测滤纸干血片在提取工作液中进行萃取处理，以便获得含有所述核苷酸代谢物的萃取液；2)将所述萃取液进行液相色谱分离-质谱检测；3)基于液相色谱分离-质谱检测结果，确定所述滤纸干血片中核苷酸代谢物的产量。根据本发明实施例的检测方法能够同时检测滤纸干血片中的6种核苷酸代谢物，基于滤纸干血片中的6种核苷酸代谢物含量的检测结果，可进一步用于科学研究，如若核苷酸代谢物来源于被给药动物，则可根据检测结果判定，动物在给药前后，体内核苷酸代谢物的含量变化，从而筛选出具有调节体内核苷酸代谢物含量功能的药物；也可进一步用于ADA和PNP两种疾病的同步筛查和诊断，使得检测成本降低，效率提高。并且根据本发明实施例的检测方法灵敏度高、特异性强和准确性高，可以有效克服核苷酸代谢物来源样本复杂、核苷酸代谢物丰度低等缺点。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步具有如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述核苷酸代谢物来源于血液样本。根据本发明实施例的检测方法，可实现核苷酸代谢物丰度较低的血液样本中核苷酸代谢物含量的检测。

根据本发明的实施例，所述提取工作液包括所述核苷酸代谢物同位素内标准品和浓度不低于50％的甲醇，优选70％～100％甲醇，优选75％～100％甲醇，更优选75％的甲醇或100％的甲醇。发明人发现，提取工作液的成分对于同位素内标的稳定性具有显著影响。当甲醇比例小于50％时，虽然目标物均能检出，但是内标会有不同程度的降解；当甲醇浓度大于75％时，各目标分析物的响应情况满足检测要求，以75％甲醇综合响应最佳，而采用纯甲醇，可减少萃取液氮吹的时间，提高样品前处理效率。根据本发明实施例的上述提取工作液，既能实现6种目标物的提取，又不影响同位素内标的稳定性，且能保证后续上机检测过程中的稳定性，实现可靠准确的检测结果。

根据本发明的实施例，所述核苷酸代谢物同位素内标准品包括核糖2-13C-腺苷、15N4-肌苷和15N5-鸟苷。上述同位素内标准品与分析物对应关系可参见下表1。

表1：

根据本发明的实施例，所述核糖2-13C-腺苷、所述15N4-肌苷和所述15N5-鸟苷在所述提取工作液中的浓度为10ppb。发明人发现，所述核苷酸代谢物同位素内标准品在上述工作浓度下，内标信号响应较高且稳定，且能在尽可能浓度低(经济节约)的情况下，充分保证检测结果的稳定性。

根据本发明的实施例，所述萃取处理是在如下条件下进行的：将所述待测滤纸干血片置于100μL的所述提取工作液中，并在25℃、750rpm、避光的条件下进行孵育30min。发明人发现，所述萃取处理在上述条件下进行，可保证滤纸干血片中的核苷酸代谢物充分进入萃取液中，而核苷酸代谢物不会发生降解，为后续萃取液的液相色谱分离-质谱检测奠定了基础。

根据本发明的实施例，萃取处理后、液相色谱-质谱检测前，进一步将所述萃取液进行氮吹干、复溶处理和离心处理，以便获得待上样液。进而可进一步将萃取液中的干扰物去除，提高液相色谱分离-质谱检测的准确性。

根据本发明的实施例，所述复溶处理是在纯水中进行的。采用纯水对氮吹干后产物进行复溶，可最大限度的避免干扰离子的引入，同时核苷酸代谢物在纯水中溶解度高，进而可进一步提高液相色谱分离-质谱检测的准确性和稳定性。

根据本发明的实施例，所述液相色谱分离是在如下条件下进行的：

进样体积为5uL，色谱柱为HSST3(50*2.1mm，1.7um)或HILIC，柱温为45℃，流动相A为含有0.1％甲酸的水溶液，流动相B为含有0.1％甲酸的乙腈溶液，每个样品检测时间2.0min，洗脱梯度为：

时间点min	流速ml/min	％A
			0	0.5	99
0.75	0.5	99
			1.0	0.5	5
1.5	0.5	5
			2.0	0.5	99

发明人发现，将待上样液在上述液相色谱检测条件下进行分离和检测，对腺苷、2'-脱氧腺苷、鸟苷、2'-脱氧鸟苷、肌苷和2'-脱氧肌苷的特异性分离和检测效果佳，各目标分析物检测信号强(峰高)，与其他非目标分析物检测信号的分离度高、差别大。

根据本发明的实施例，所述质谱检测是在如下条件下进行的：串联质谱仪电喷雾阳离子方式(ESI+)，多反应监测模式(MRM)，离子源温度135℃，毛细管电压为3kV，锥孔气速为150L/Hr，脱溶剂温为450℃，脱溶剂气速为900L/Hr，

发明人发现，将待上样液在上述质谱检测条件下进行进一步分离和检测确认，可进一步提高检测的专属性、准确性和特异性。

根据本发明的实施例，基于液相色谱分离-质谱检测出的确定核苷酸代谢物的色谱峰面积，确定所述确定核苷酸代谢物的含量。

根据本发明的实施例，进一步包括同时将质控品进行核苷酸代谢物含量检测，所述质控品为含有已知浓度核苷酸代谢物的滤纸干血片。进而可对检测结果进行质控，确保检测结果的真实性。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种测定滤纸干血片中核苷酸代谢物的试剂盒，所述核苷酸代谢物包括腺苷、2'-脱氧腺苷、鸟苷、2'-脱氧鸟苷、肌苷和2'-脱氧肌苷。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：(A)核苷酸代谢物同位素内标准品：由核糖2-13C-腺苷，15N5-鸟苷和15N4-肌苷组成；(B)质控品：质控品为含已知浓度核苷类代谢物的牛血清滤纸干血片，质控品包括低浓度质控品、中浓度质控品以及高浓度质控品；以及(C)使用说明书，所述说明书记载前面所述的定滤纸干血片中核苷酸代谢物的方法。根据本发明实施例的试剂盒操作简单快速，特异性高、稳定性好、便于标准化操作，大大增加了检测结果的可靠性和稳定性，同时也适用于高通量筛查，可使得检测成本降低，效率提高。此外，本发明试剂盒采用干血片样本，其便于取样、存储和运输，适用于新生儿筛查项目。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种测定滤纸干血片中核苷酸代谢物的方法，所述核苷酸代谢物包括腺苷、2'-脱氧腺苷、鸟苷、2'-脱氧鸟苷、肌苷和2'-脱氧肌苷。根据本发明的实施例，所述核苷酸代谢物来源于血液样本，所述方法包括：1)将待测滤纸干血片置于100μL的提取工作液中，在25℃、750rpm、避光的条件下进行30min的萃取处理，以便获得含有所述核苷酸代谢物的萃取液，所述提取工作液包括所述核苷酸代谢物同位素内标准品和100％的甲醇，所述核苷酸代谢物同位素内标准品包括核糖2-13C-腺苷、15N4-肌苷和15N5-鸟苷，所述核糖2-13C-腺苷、所述15N4-肌苷和所述15N5-鸟苷在所述提取工作液中的浓度分别为10ppb；2)将所述萃取液在室温、气流为15L/hr、避光的条件下进行氮吹干处理，将氮吹干处理产物在50μL的纯水中进行复溶处理，并将复溶产物在室温、1500g的条件下离心3min，以便获得待上样液；3)将所述待上样液进行液相色谱分离-质谱检测，其中，所述液相色谱分离是在如下条件下进行的：进样体积为5uL，色谱柱为HSST3(50*2.1mm，1.7um)或HILIC，柱温为45℃，流动相A为含有0.1％甲酸的水溶液，流动相B为含有0.1％甲酸的乙腈溶液，每个样品检测时间2.0min，洗脱梯度为：

时间点min	流速ml/min	％A
			0	0.5	99
0.75	0.5	99
			1.0	0.5	5
1.5	0.5	5
			2.0	0.5	99

所述质谱检测是在如下条件下进行的：

串联质谱仪电喷雾阳离子方式(ESI+)，多反应监测模式(MRM)，离子源温度135℃，毛细管电压为3kV，锥孔气速为150L/Hr，脱溶剂温为450℃，脱溶剂气速为900L/Hr，

4)基于液相色谱分离-质谱检测出的确定核苷酸代谢物的色谱峰面积，确定所述确定核苷酸代谢物的含量；其中，进一步包括同时将质控品进行核苷酸代谢物含量检测，所述质控品为含有已知浓度核苷酸代谢物的滤纸干血片。

任选地，所述提取工作液是通过如下方式获得的：将0.1mg的所述核糖2-13C-腺苷、0.1mg的所述15N4-肌苷和0.1mg的所述15N5-鸟苷溶于970μL的50％甘油/水中，以便获得核苷酸代谢物同位素内标准品储液；利用100％甲醇将所述同位素内标准品储液进行100倍稀释，以便获得所述提取工作液。

根据本发明实施例的检测方法能够同时检测滤纸干血片中的6种核苷酸代谢物，基于滤纸干血片中的6种核苷酸代谢物含量的检测结果，可进一步用于科学研究，也可进一步用于ADA和PNP两种疾病的同步筛查和诊断，使得检测成本降低，效率提高。并且根据本发明实施例的检测方法灵敏度高、特异性强和准确性高，可以有效克服核苷酸代谢物来源样本复杂、核苷酸代谢物丰度低等缺点。

附图说明

图1～图3是根据本发明实施例的不同萃取液抽提条件下，得到各目标分析物的检测响应结果；

图4是根据本发明实施例6的正常人色谱分析图谱；

图5是根据本发明实施例6的ADA患儿色谱分析图谱；

图6是根据本发明实施例6的正常人色谱分析图谱；以及

图7是根据本发明实施例6的PNP患儿色谱分析图谱。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明目的在于提供一种同时检测滤纸干血片中6种核苷类代谢物检测的方法和试剂盒。因其高灵敏度、高特异性和高准确性，可以克服血液样本复杂，待测物丰度低等缺点。发明提供的检测方法中，样本类型选择为干血片，该类型样本稳定性好，避免微生物的污染，且方便血样采集、存储运输等。同时，本发明将对该技术方法优化并包装成试剂盒，这样会便于标准化操作，增加方法的可靠性和稳定性，同时也适用于高通量筛查。本发明可实现同时检测6种核苷类代谢物，从而实现ADA和PNP两种遗传代谢病的同步筛查和诊断，可使得检测成本降低，效率提高。

为了实现本发明的上述目的，本发明提出了一种快速检测滤纸干血片中6种核苷类代谢物的串联质谱检测方法，该方法包括以下主要步骤：

(1)采用制备的提取工作液(提取工作液为含内标的70～100％甲醇水溶)将待测干血片样本进行孵育；

(2)对步骤(1)孵育后的产物取上清液，氮气吹干，复溶，过滤得到待测样品；

(3)采用液相色谱分离串联质谱技术对待测样品中6种核苷类代谢物进行定量检测。

其中，步骤(1)中所述提取工作液，是包括核苷类代谢物同位素内标准品的有机溶剂。即用有机溶剂(70～100％甲醇水溶液均可)将同位素内标准品工作液进行稀释得到。发明人发现，对于液相串联质谱检测技术，提取工作液的成分尤为重要，并且对于不同的样本类型萃取效果有很大不同。尤其是复杂的血液样本(本发明样本类型为干血片)，对提取工作液(即萃取液)的成分要求更高，既要实现6种目标物的提取又不影响同位素内标的稳定性，且能保证后续上机检测过程中的稳定性，从而实现可靠准确的检测。

本发明对萃取液成分经过优化，由数据可看出当甲醇比例小于50％时，虽然目标物均能检出，但是内标会有不同程度的降解。当甲醇浓度大于75％时，各目标分析物的响应情况满足检测要求(75％甲醇综合响应最佳)。本发明最终选用的萃取液成分(即提取工作液主要成分)为70％-100％甲醇水溶液。建议选用纯甲醇，这样可减少萃取液氮吹的时间，提高样品前处理效率。

其中，发明人发现，采用液流法(即将样本直接经液相进入质谱检测，不接色谱柱)的进样检测方式只能实现ADA或PNP其中一种疾病的检测。如本申请实施例2所验证的，采用液流法串联质谱检测将ADA和PNP相关的6种核苷合并检测，检测目标物之间存在互相干扰，无法实现同时检测(即检测不满足特异性)。为了避免以上干扰现象，本发明改用色谱分离技术，并优化液相方法，最终选用色谱柱为HSS T3，结果显示，本发明优化的液相方法特异性高，不存在干扰，满足检测要求，最终可实现6种目标分析物的同时检测。

其中，本发明首次提供了一种同时测定滤纸干血片中6种核苷类代谢物的快速、可靠、稳定、高通量的试剂盒。采用本发明试剂盒及检测方法，进一步测试基质效应、回收率、线性和最低检测限，以及临床样本检测(阳性样本均检出)，结果表明均满足检测技术要求，这些充分证明了本发明试剂盒的稳定性和可靠性。

需要说明的是，本申请的试剂盒不仅可应用于重症联合免疫缺陷综合症ADA和PNP两种疾病的筛查和诊断，还可以用于人体核苷代谢状况的评估。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例1

本例的试剂盒包括独立包装的以下组分：

(A)同位素内标准品，1瓶；由等量的核糖2-13C-腺苷，15N5-鸟苷和15N4-肌苷等三种组成；以上各内标准品质量均为0.1mg；

(B)质控品，3套；质控品为含6种核苷类代谢物的牛血清滤纸干血片，3套质控品总计包括牛血清滤纸干血片6张，其中低浓度质控品2张，中浓度质控品2张，高浓度质控品2张；

(C)V型底96孔板，10块；

(D)亲水性PVDF过滤板，5块；

(E)铝箔封口膜，10张；

(F)使用说明书，1份

试剂盒于2-8℃保存。

试剂盒的使用方法包括如下步骤：

(1)日常工作液的配制

使用970uL的50％甘油/水对同位素内标准品的小瓶进行复溶，彻底混匀，直到完全溶解，作为核苷类代谢物的同位素内标准品工作液储液(保存于-20℃)。

(2)提取工作液配制

同位素内标准品工作液的稀释倍数为1:100，稀释溶剂70～100％甲醇水溶液。

以配制12mL提取工作液为例，将内标准品工溶液充分混合后，用移液枪吸取120μL，加入到已装有12mL100％甲醇的离心管中，反复吹打5～10次，然后充分混合即为提取工作液。

(3)打孔并加样

使用自动或手动打孔器在干血片上将滤纸血片打孔，并将滤纸血片移入提供的V型底96孔板内，1个孔对应1个样本的3.2mm直径血点。试验时，每板设置一个孔添加低浓度质控品(3.2mm滤纸干血片)，一个孔添加中浓度质控品(3.2mm滤纸干血片)，一个孔添加高浓度质控品(3.2mm滤纸干血片)。

(4)提取工作液的加入

使用多道移液器以反向加样法给每个含有滤纸血片的板孔内添加100μL的提取工作液，注意该环节操作时间尽量短，移液完成后迅速用96孔板铝箔封口膜均匀密封，防止溶剂挥发。

(5)孵育抽提

将上述密封好的96孔板放置于恒温孵育仪中，在25℃，750rpm条件下震荡孵育30min。

(6)抽提液吹干

将上述孵育完的96孔板取出后撕去封口膜，用多道移液枪贴壁移取50μL/孔的抽提液于一块新的96孔板对应孔中，并将该96孔板置于氮吹仪下，在室温条件下吹干20min，气流15L/hr，氮吹过程避光。

(7)复溶

使用多道移液器将吹干后的96孔板每孔内加入50μL纯水，封膜后放置于恒温孵育仪中，25℃，750rpm，震荡5min。

(8)离心过滤

取出复溶后的96孔板，撕去封口膜，用排枪将复溶液全部吸出并转移至过滤板中，过滤板下面用一块新96孔板收集，离心过滤(室温，1500g，3min)，收集完成后用铝箔封口膜均匀密封，等待上机。

(9)质谱上机检测

将上述待测96孔板样品放置质谱自动进样器进行上机检测。进样体积为5μL，色谱柱为HSST3(50*2.1mm，1.7um)，柱温45℃，流动相A为水(含0.1％甲酸)，流动相B为乙腈(含0.1％甲酸)，每个样品检测时间2.0min。采用串联质谱仪电喷雾阳离子方式(ESI+)，多反应监测模式(MRM)，离子源温度135℃，毛细管电压3kV，锥孔气速150L/Hr，脱溶剂温450℃，脱溶剂气速900L/Hr。具体的液相方法及质谱方法参数分别见表2和表3。

表2：液相方法参数

时间点min	流速ml/min	％A
			0	0.5	99
0.75	0.5	99
			1.0	0.5	5
1.5	0.5	5
			2.0	0.5	99

表3：质谱方法参数(MRM)

(10)定量结果报告

根据仪器设定程序自动得到各个分析物的浓度。

本例的试剂盒可以同时定量检测6种核苷类代谢物，其中同位素内标准品与6种核苷类代谢物的对应检测关系如表1所示。

根据以上6种核苷类代谢物的定量检测情况可实现筛查和诊断两种重症联合免疫缺陷病，其中包括：ADA(腺苷脱氨酶缺乏症)和PNP(嘌呤核苷磷酸化酶缺乏症)。

实施例2液相方法的优化

对比案例中采用液流法的进样检测方式(即将样本直接经液相进入质谱检测，不接色谱柱)只能实现ADA或PNP其中一种疾病的检测。本实施例采用液流法串联质谱将ADA和PNP相关的6种核苷合并检测，发现检测目标物之间存在互相干扰所以无法实现同时检测(即检测不满足特异性)。即分别配制6种核苷类代谢物的单一标准品溶液和内标准品溶液(均为1ppm)，并进样检测。各目标分析物检测信号强度(峰高)详见表4。

表4：单一标准品和内标准品样品的检测信号(液流法)

其中，IS表示：同位素标记。

各个指标通道在专属单一加标的通道真实响应应显著高于其它指标通道(至少1个数量级)，而且相同指标通道的加标响应均应显著高于非加标响应(至少1个数量级)，则说明液相-质谱方法的专属性和特异性良好。本试验发现个别指标由于质量数接近，在质谱信号响应方面存在跨通道干扰的情况，如Ado和Ino，Ado和dAdo，以及dAdo和dIno等之间存在明显的相互干扰。如表5数据所示，单一加标样品1-Ado溶液检测得到的Ino(非加标)和dAdo(非加标)的信号强度很高，且接近于目标分析物Ado(加标)的信号强度，可见Ino和dAdo对Ado的检测存在干扰，即Ado的检测响应并非特异。其他单一加标溶液测试也有类似的现象。

为了避免以上干扰现象，本实验改用色谱分离技术，并优化液相方法，最终选用色谱柱为HSS T3(50*2.1mm，1.7um)，优化后的前处理实验流程，液相方法和质谱方法等具体参数详见实施例1。

本实验采用优化后的方法验证检测的专属性和特异性，分别配制6种核苷类代谢物的单一标准品溶液和内标准品溶液(均为100ppb)，并进样检测，各目标分析物检测结果(峰高响应)详见表5。

表5：单一标准品和内标准品样品的检测信号(液相色谱分离法)

如表5所示，各个指标通道在专属加标的通道真实响均显著高于其它指标通道(至少2个数量级)，而且相同指标通道的加标响应均显著高于非加标响应(至少2个数量级)，说明通过色谱分离可避免目标分析物之间的干扰现象，表明当前方法满足检测的特异性要求。此外优化后的液相方法进样时间较短(2min)，样品检测效率较高。

实施例3萃取液的优化

取同一例干血片样本，分别采用不同的萃取液成分进行萃取，萃取液成分包括纯水，25％甲醇，50％甲醇，75％甲醇和100％甲醇(萃取液中含3种内标准品，浓度为10ppb)。经过样本前处理后，上机检测评估(前处理步骤及上机检测方法参见实施例1)。

不同萃取液抽提条件下，得到各目标分析物的检测响应结果如附图1～图3，由数据可看出当甲醇比例小于50％时，内标会有不同程度的降解，当甲醇浓度大于75％时，各目标分析物的响应情况满足检测要求(75％甲醇综合响应最佳)。但为了减少萃取液氮吹的时间，提高样品前处理效率，最终选用的萃取液成分(即工作液主要成分)为纯甲醇。

实施例4基质效应和回收率的测定

首先准备如下样品：

样品1：分别配制含6种核苷类代谢物的5ppb，50ppb，250ppb的低、中、高三个浓度溶液；

样品2：一例正常人全血样本制备成干血片样本；

样品3：与样品2为同一例正常人全血样本，然后添加对应浓度的标准品后制备成干血片样本(标准品浓度与样品1的低中高三个浓度一致)。

基质效应的测定

将上述制备的样品进行前处理，样品1无需进行前处理直接上机；样品2分两种情况处理：(1)正常前处理；(2)前处理后上机前在复溶液中添加对应浓度标准品(与样品1三个浓度一致)。前处理步骤和上机方法参见实施例1。重复试验6次，最终基质效应的数据结果如表6。由数据可见基质效应计算结果均高于50％，且CV均小于20％，满足检测要求。

表6：基质效应的计算结果

回收率的测定

将上述制备的样品进行前处理，将样品1无需前处理直接上机检测；样品2和样品3进行前处理过程(步骤方法参见实施例1)。重复试验6次，回收率的计算结果如表7。数据显示回收率计算结果均高于50％，且CV均小于20％，满足检测要求。

表7：回收率的计算结果

实施例5线性和最低检测限

首先配制6种核苷类代谢物的标准曲线溶液，用纯水稀释到如下浓度点，(如表8)，即与实施例1中的校准品溶液CAL1-CAL7浓度设置一致。

表8：标准曲线溶液浓度表

	CAL1	CAL2	CAL3	CAL4	CAL5	CAL6	CAL7
								A	10	25	50	100	250	500	1000
dA	10	25	50	100	250	500	1000
								I	10	25	50	100	250	500	1000
dI	100	250	500	1000	2500	5000	10000
								G	10	25	50	100	250	500	1000
dG	10	25	50	100	250	500	1000

每个浓度取3.2ul作为样品加入到96孔板中，其它操作按照实施例1所述。重复试验3次，线性结果及最低检测限如表9。最低检测限要求满足：S/N>3条件下，与理论标曲浓度偏差≤20％的最低浓度点。

表9：线性及最低检测限的结果

分析物	R2	线性范围(ppb)	最低检测限(ppb)
				Ado	0.999～1.000	55～100	1～2.5
dAdo	0.999～1.000	1～100	0.1～0.25
				Ino	0.997～0.999	5～100	0.5～2.5
dIno	0.991～0.995	25～1000	10～25
				Guo	0.998～0.999	1～100	0.1～0.25
dGuo	0.998～0.999	1～100	0.1～0.25

实施例6临床样本的测定及稳定性评估

应用实施例1试剂盒对255例新生儿干血片样本进行检测(所有血液样本由天津华大医学检验所提供和保存，255例血液样本收集自全国范围内的新生儿)。

按照本例提供的试剂盒使用方法，对质控品进行了定量检测分析，以评估检测方法的稳定性和重现性。本例在一天内对质控品进行了4次检测，每次3个质控品重复样，连续8天测试，计算各分析物浓度的CV值结果如表10所示。

表10：检测质控品各分析物CV

试验批次

Ado

dAdo

Ino

dIno

Guo

dGuo

Day1

13.90％

14.96％

16.21％

11.59％

18.20％

15.80％

Day2

20.03％

12.37％

19.75％

12.30％

14.64％

15.99％

Day3

17.41％

14.19％

11.70％

8.94％

17.22％

13.65％

Day4

15.69％

14.54％

18.99％

10.15％

20.86％

12.78％

Day5

8.34％

6.38％

5.89％

7.66％

6.36％

7.71％

Day6

6.83％

3.22％

5.22％

10.06％

6.35％

10.16％

Day7

8.67％

5.80％

7.07％

9.57％

1.88％

6.80％

Day8

6.65％

3.24％

8.09％

15.69％

1.80％

8.28％

Day1～Day8

15.12％

11.11％

18.98％

13.55％

13.62％

13.10％

由表10数据结果显示，质控品检测值的相对标准偏差CV≤20％，表明仪器状态良好，检测方法稳定性和重现性良好。

按照本例提供的试剂盒使用方法，对255例血液样本的干血片样品进行检测，结果显示，筛选出腺苷脱氨酶缺乏症(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶缺乏症(PNP)各1例，结果与预期相符。正常人和ADA患儿的色谱峰分别如图4-5所示。正常人和PNP患儿的色谱分析图谱分别如图6-7所示。通过比较图4(正常人)和图5(ADA患儿)中的腺苷(A)和2'-脱氧腺苷(dA)的峰面积，可以看见，ADA患儿的这2个指标的峰面积明显高于正常人，超出了正常参考范围。通过比较图6(正常人)和图7(PNP患儿)中的鸟苷(G)，2'-脱氧鸟苷(dG)，肌苷(I)和2'-脱氧肌苷(dI)的峰面积，可以看见，PNP患儿的这4个指标的峰面积明显高于正常人，超出了正常参考范围。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种测定滤纸干血片中核苷酸代谢物的方法，所述核苷酸代谢物包括腺苷、2'-脱氧腺苷、鸟苷、2'-脱氧鸟苷、肌苷和2'-脱氧肌苷，其特征在于，包括：

1)将待测滤纸干血片在提取工作液中进行萃取处理，以便获得含有所述核苷酸代谢物的萃取液；

2)将所述萃取液进行液相色谱分离-质谱检测；

3)基于液相色谱分离-质谱检测结果，确定所述滤纸干血片中核苷酸代谢物的产量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核苷酸代谢物来源于血液样本。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取工作液包括所述核苷酸代谢物同位素内标准品和浓度不低于50％的甲醇，优选70％～100％甲醇，优选75％～100％甲醇，更优选75％的甲醇或100％的甲醇；

任选地，所述核苷酸代谢物同位素内标准品包括核糖2-13C-腺苷、15N4-肌苷和15N5-鸟苷；

任选地，所述核糖2-13C-腺苷、所述15N4-肌苷和所述15N5-鸟苷在所述提取工作液中的浓度为10ppb。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述萃取处理是在如下条件下进行的：

将所述待测滤纸干血片置于100μL的所述提取工作液中，并在25℃、750rpm、避光的条件下进行孵育30min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，萃取处理后、液相色谱分离-质谱检测前，进一步将所述萃取液进行氮吹干、复溶处理和离心处理，以便获得待上样液；

任选地，所述复溶处理是在纯水中进行的。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱分离是在如下条件下进行的：

进样体积为5uL，色谱柱为HSST3(50*2.1mm，1.7um)或HILIC，柱温为45℃，流动相A为含有0.1％甲酸的水溶液，流动相B为含有0.1％甲酸的乙腈溶液，每个样品检测时间2.0min，洗脱梯度为：

时间点min 流速ml/min ％A 0 0.5 99 0.75 0.5 99 1.0 0.5 5 1.5 0.5 5 2.0 0.5 99

。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱检测是在如下条件下进行的：串联质谱仪电喷雾阳离子方式(ESI+)，多反应监测模式(MRM)，离子源温度135℃，毛细管电压为3kV，锥孔气速为150L/Hr，脱溶剂温为450℃，脱溶剂气速为900L/Hr，

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基于液相色谱分离-质谱检测出的确定核苷酸代谢物的色谱峰面积，确定所述确定核苷酸代谢物的含量；

任选地，进一步包括同时将质控品进行核苷酸代谢物含量检测，所述质控品为含有已知浓度核苷酸代谢物的滤纸干血片。

9.一种测定滤纸干血片中核苷酸代谢物的试剂盒，所述核苷酸代谢物包括腺苷、2'-脱氧腺苷、鸟苷、2'-脱氧鸟苷、肌苷和2'-脱氧肌苷，其特征在于，包括：

(A)核苷酸代谢物同位素内标准品：由核糖2-13C-腺苷，15N5-鸟苷和15N4-肌苷组成；

(B)质控品：质控品为含已知浓度核苷类代谢物的牛血清滤纸干血片，质控品包括低浓度质控品、中浓度质控品以及高浓度质控品；

以及

(C)使用说明书，所述说明书记载权利要求1～8任一项所述的方法。

10.一种测定滤纸干血片中核苷酸代谢物的方法，所述核苷酸代谢物包括腺苷、2'-脱氧腺苷、鸟苷、2'-脱氧鸟苷、肌苷和2'-脱氧肌苷，其特征在于，所述核苷酸代谢物来源于血液样本，所述方法包括：

1)将待测滤纸干血片置于100μL的提取工作液中，在25℃、750rpm、避光的条件下进行30min的萃取处理，以便获得含有所述核苷酸代谢物的萃取液，所述提取工作液包括所述核苷酸代谢物同位素内标准品和100％的甲醇，所述核苷酸代谢物同位素内标准品包括核糖2-13C-腺苷、15N4-肌苷和15N5-鸟苷，所述核糖2-13C-腺苷、所述15N4-肌苷和所述15N5-鸟苷在所述提取工作液中的浓度分别为10ppb；

2)将所述萃取液在室温、气流为15L/hr、避光的条件下进行氮吹干处理，将氮吹干处理产物在50μL的纯水中进行复溶处理，并将复溶产物在室温、1500g的条件下离心3min，以便获得待上样液；

3)将所述待上样液进行液相色谱分离-质谱检测，

其中，所述液相色谱分离是在如下条件下进行的：

进样体积为5uL，色谱柱为HSST3(50*2.1mm，1.7um)或HILIC，柱温为45℃，流动相A为含有0.1％甲酸的水溶液，流动相B为含有0.1％甲酸的乙腈溶液，每个样品检测时间2.0min，洗脱梯度为：

时间点min 流速ml/min ％A 0 0.5 99 0.75 0.5 99 1.0 0.5 5 1.5 0.5 5 2.0 0.5 99

所述质谱检测是在如下条件下进行的：

串联质谱仪电喷雾阳离子方式(ESI+)，多反应监测模式(MRM)，离子源温度135℃，毛细管电压为3kV，锥孔气速为150L/Hr，脱溶剂温为450℃，脱溶剂气速为900L/Hr，

4)基于液相色谱-质谱检测出的确定核苷酸代谢物的色谱峰面积，确定所述确定核苷酸代谢物的含量；

其中，进一步包括同时将质控品进行核苷酸代谢物含量检测，所述质控品为含有已知浓度核苷酸代谢物的滤纸干血片；

任选地，所述提取工作液是通过如下方式获得的：

将0.1mg的所述核糖2-13C-腺苷、0.1mg的所述15N4-肌苷和0.1mg的所述15N5-鸟苷溶于970μL的50％甘油/水中，以便获得核苷酸代谢物同位素内标准品储液；

利用100％甲醇将所述同位素内标准品储液进行100倍稀释，以便获得所述提取工作液。

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