CN111830146B - 一种干血片中25-羟基维d的lc-ms/ms高通量检测方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种干血片中25‑羟基维D的LC‑MS/MS高通量检测方法及试剂盒；其样品前处理工艺主要包括取样，衍生，复溶后采用LC‑MS/MS进行检测，高效液相色谱串联质谱为三重四级杆质谱仪，通过高效液相色谱串联质谱法测定经前处理后的样品复溶；本申请提供的方法和试剂盒满足了临床大批量样品分析的需求，与现有技术相比具有操作简单、提取时间短、适合高通量样品预处理的特点。

Description

一种干血片中25-羟基维D的LC-MS/MS高通量检测方法及试 剂盒
技术领域
本发明涉及一种维生素D的检测领域，尤其涉及一种干血片中25-羟基维D的LC-MS/MS高通量检测方法及试剂盒。
背景技术
维生素主要由食物供给，是人体健康所必须的一类基本营养物质，是维持机体正常的生理功能和细胞内特异代谢反应所必须的一类小分子有机物。根据其极性大小可分为脂溶性和水溶性维生素。其中，脂溶性的维生素D在维持人体钙的动态平衡方面起着非常重要的作用，能和钙一起促进儿童骨骼的形成和维持成人骨骼强度。在儿童中，维生素D的缺乏会导致骨骼畸形，如出现佝偻病等；而在成人中，维生素D的缺乏会导致骨质疏松症。当机体摄入并蓄积过量的维生素D时，体内维生素D负反馈调节作用失调，会导致高钙血症及一系列不良反应，如恶心、呕吐、便秘、胰腺炎、急性肾脏损伤等。维生素D存在两种主要的活性形式，分别为25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3。二者是维生素D在血液循环中的主要存在形式，可作为维生素D的检测指标。因此监测血液内25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的含量，有助于评价人体维生素D的状况。
目前临床常用的25-羟基维生素D检测方法主要为酶免疫分析法、竞争蛋白结合法、高效液相色谱法等。然而，酶免疫分析法无法区分25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3，无法检测人体内25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的含量。竞争蛋白结合法存在严重基质效应，影响了定量检测结果的准确性。近年来已被广泛应用的高效液相色谱法样本前处理步骤相对繁琐，且无法实现快速高通量检测，这在一定程度上限制了该精准检测方法在25-羟基维生素D在临床检测方面的应用。
目前，新生儿疾病筛查时广泛使用的干燥生物流体样品，例如干滤纸干血片(DBS)在临床试验中变得越来越流行。DBS采样法对样本采集者的技术要求低，血样采集的过程被简化，采血量小(通常小于100μL)，干燥后的样本具有很好的生物稳定性且拥有很好的生物安全性，可在室温下储存和运输。由于干血片样本中含血量较少，通常的检测方法很难从干血片中检测维生素D的含量。然而，串联质谱(MS/MS)的原理是将两个质谱仪经一个碰撞室串联而成，能够大大提高检测的特异性和灵敏性。因此，有必要发明一种抗干扰能力强、灵敏度高、特异性强，且操作简便快速的25-羟基维生素D检测试剂盒。
发明内容
本发明目的在于提供了一种简便快速、精度高，适合大批量样品检测的干血片中25-羟基维D的LC-MS/MS高通量检测方法及试剂盒。
为了实现上述目的，本发明提供了一种干血片中25-羟基维D的LC-MS/MS高通量检测方法，包括以下步骤：
S1、样品前处理
取样：取干血斑样本，用打孔器取3.2毫米滤纸干血片3片加入到96孔U型板中，然后加入200μL甲醇溶液与10μL 10ng/mL 25(OH)D2-D6和25(OH)D3-D3的混合内标溶液涡旋振荡混匀30min，取180μL上清液至96孔V板中，35-60℃氮气直至吹干；
衍生：加入50μL衍生剂4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)衍生液，涡旋振荡30min；
终止：加入50μL超纯水溶液终止，涡旋振荡30min，将96孔板V板置于高效液相色谱串联质谱系统中进行检测；
S2、采用LC-MS/MS法检测
高效液相色谱串联质谱为三重四级杆质谱仪，通过高效液相色谱串联质谱法测定经所述步骤S1预处理后的样品复溶，采用串联四级杆质谱仪进行检测。
进一步的，所述步骤S2中的检测的目标定量离子对包括25-OHD2衍生化产物和25-OHD3衍生化产物的母离子/子离子检测对如下所示：25-羟基维生素D3 m/z558.4＞m/z298.2、25-羟基维生素D2 m/z570.4＞m/z298.2；所述步骤S2中检测的内标衍生化产物的检测离子对为25-羟基维生素D3内标衍生化产物m/z563.4＞m/z298.2和25-羟基维生素D2内标衍生化产物m/z573.4＞m/z301.2。
进一步的，所述血斑样本包括干血斑标准曲线样本、质控干血斑样本和需要检测的血斑样本。
更进一步的，所述质控干血斑样本的制备是通过取处理过的全血，分别与30μL、150μL浓度为1μg/mL的25-羟基维生素D混匀至2mL，取75μL滴于滤纸片上，分别获得15ng/mL、75ng/mL质控干血斑样本。
进一步的，所述步骤S2中采用梯度洗脱反相色谱法，进行高效液相色谱串联质谱法的测定条件如下：
I.LC条件：Waters BEH C18柱；柱长：50×2.1mm，填料粒径1.7μm；柱温：30～45℃；进样体积：20～40μL；流动相A：0.5mM乙酸铵水溶液；流动相B：0.5mM乙酸铵甲醇溶液；洗液：弱洗-70％乙腈，强洗-乙腈；流速为0.3-1mL/min；所述梯度洗脱的条件包括：
进一步的，II.MS条件：离子源：APCI离子源；扫描模式：电喷雾离子源(ESI)和MRM模式；其他检测条件包括：
还包括S3、标准曲线的绘制：配制标准液，以上述LC-MS/MS条件分别检测所述标准液，并根据检测结果绘制相应的标准曲线。
更进一步的，所述步骤S3中干血斑标准曲线的制作：取处理过的全血，分别与10μL、20μL、40μL、100μL、160μL、200μL浓度为1μg/mL的25-羟基维生素D混匀至2mL全血，取75μL滴于滤纸片上，获得5-100ng/mL干血斑标准曲线样本，以上述LC-MS/MS条件分别检测所述干血斑标准曲线样本，并根据检测结果绘制相应的干血斑标准曲线。
一种干血片中25-羟基维生素D的液相色谱串联质谱检测的试剂盒，所述试剂盒包括：
①标准品；
②质控品；
③内标品：25-羟基维生素D2-d3和25-羟基维生素D3-13C5；
④稀释液；
⑤流动相溶剂；
⑥终止液；
⑦样本处理液；
所述质控品包括高值质控品和低值质控品。
进一步的，所述流动相溶剂为乙酸铵溶液，所述终止液为水溶液，所述样本处理液是含有能提高25-羟基维生素D检测信号的乙腈溶液的样本处理液。
进一步的，所述样本处理液中还包括浓度为200μg/mL的衍生剂4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮。
进一步的，还包括96孔U型板和96孔V型板。
本发明提供了干血片中25-羟基维D的LC-MS/MS高通量检测方法及试剂盒，试剂盒中的样本处理液是含有能提高25-羟基维生素D检测信号的乙腈溶液的样本处理液，样本处理液含有PTAD的衍生液，能够衍生放大信号，可高效地完成样本的前处理工作，采用96孔板进行前处理可大幅提高自动化水平，提高分析通量，能够同时对干血片中25-羟基维生素D2和D3的主要活性形式进行检测，具有抗干扰能力强、灵敏度高、特异性强、通用性强且检测速度快，操作简便等优点。
本发明还提供了一种干血片中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，使用LC-MS/MS同时测定25(OH)D2和25(OH)D3的含量，本方法采用滤纸干血片发(Driedblood spot，DBS)样本，微创且采血量少，样本前处理步骤较为简单，操作简便。通过分析物衍生化反应增强分析物在ESI+中的离子化效率，提高检测的灵敏，降低了样本用量，使用稳定同位素内标消除基质效应的影响，实现了微小样品量的测定。
综上所述，本发明具有如下优点：
1、本发明将内标法与高效液相色谱质谱联用法相结合，采用衍生试剂使干扰因素大大减少，且特异性强、灵敏度高、检测结果准确，同时分析时间短；
2、本发明是检测滤纸干血片中的维生素含量，非常适用于婴幼儿特别是新生儿以及其他存在静脉穿刺的人群；
3、本发明以同位素标记物为内标物，使得目标化合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、准确度和灵敏度高。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。
附图说明
图1是本发明以定量离子色谱峰面积-浓度为坐标得到的标准曲线图；
图2是本发明提供的试剂盒在AB3200质谱仪上的离子扫描图；
图3是本发明提供的试剂盒在4500质谱仪上的离子扫描组图；
图4是本发明提供的试剂盒在Waters公司STQD质谱仪上的离子扫描组图；
图5是本发明提供的试剂盒在Waters公司TQS质谱仪上的离子扫描组图；
图6分别是检测25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的检测限的离子扫描组图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例
一、高通量干血片中25-羟基维生素D高效液相色谱串联质谱检测方法包含以下步骤：
1、样本预处理：
用打孔器取3.2mm血片3片加入到96孔U型板中，加入200μL甲醇，10μL 10ng/mL 25(OH)D3-13C5和25(OH)D2-D3混合内标溶液，涡旋振荡混匀30min，
氮吹：
精密移取180μL上清至96孔V板中，35-60℃氮气直至干燥；
衍生：
加入50μLPTAD衍生液至96孔V板中，涡旋振荡30min；
终止：
加入50μL的超纯水涡旋振荡30min，将96孔板V板置于LC-MS/MS中进行检测。
2、色谱条件
色谱柱：Waters BEH C18(50×2.1mm,1.7μm)
柱温：20-100℃
流动相A：0.5mM乙酸铵水溶液
流动相B：0.5mM乙酸铵甲醇溶液
洗液：弱洗-70％乙腈，强洗-乙腈(乙腈可替换为甲醇)
运行时间：3min
进样量：30μL
液相梯度见表1。
表1液相梯度
3、质谱条件
正离子模式下，MRM检测方式检测，检测离子对(m/z)分别是：25-羟基维生素D3-PTAD 558.4→298.2、25-羟基维生素D2-PTAD 570.4→298.2、内标25(OH)D3-13C5 563.4→298.2和25(OH)D2-D3 573.4→298.2，检测条件见表2。
表2质谱条件
4、检测数据分析和结果：
①校准曲线绘制：以校准品的浓度为自变量x，以对应浓度校准品和内标的峰面积比值为因变量y，计算线性回归方程y＝ax+b和相关系数r；
②质控品数据分析：当校准曲线的r≥0.980时，将低值和高值质控品的信号强度带入回归方程，获得质控品浓度；
③血清样本数据分析：当高值质控品的相对偏差≤±20％、低值质控品的相对偏差≤±20％时，将血清样本的信号强度带入回归方程，获得血清样本中的目标物浓度。
将待测样品的色谱图中，维生素的峰面积与其内标物的峰面积的比值，代入到该维生素的标准曲线方程中，并根据所添加的其内标物的浓度，计算出待检测末梢血液中该维生素的含量，从而得到待检测末梢血液中25-羟基维生素D3的含量和25-羟基维生素D2的含量；
其中，维生素的标准曲线方程为：y＝k×x+b，其中，y表征峰面积比值，x表征浓度比值，k和b均为表征系数。
在本发明中，通过生理盐水洗涤全血，保证标准品的纯度和均一性，利用BSA来稀释红细胞保证了标准曲线的线性和稳定性。结构简单、使用方便、结果更加准确而且成本大大降低了，特别适用于各级新生儿疾病筛查中心使用。
二、本发明提供的检测干血片样品中25-羟基维生素D的试剂盒包含的溶液，见表3。
表3.检测干血片样品中25-羟基维生素D的试剂盒
本试剂盒未提供，但检测需要的物品见表4。
表4.检测所需物品
名称 要求
1 纯化水 去离子水
2 甲醇 色谱纯以上
3 氮吹仪 96孔板氮吹仪
4 涡旋混合器 96孔板涡旋混合器
5 离心机 低温96孔板离心机
三、本发明提供的检测干血片样品中25-羟基维生素D的试剂盒中标准品的配制：
1、稀释液配制：精密移取10mL纯化水加到稀释液瓶中，涡旋混合均匀3min～5min；
2、流动相溶剂包配制：取38.54mg乙酸铵和1L水/甲醇溶解流动相溶剂包瓶中的固体，涡旋混合均匀3min～5min；
3、内标配制：精密移取10mL甲醇加到内标准品瓶中，涡旋混合均匀3min～5min；
4、校准品溶液及校准曲线工作溶液配制：
取校准品，编号为S0溶液，用处理过的全血将S0稀释成S1-S6，操作如下：
校准品血卡S1配制：精密移取200μL S0溶液，加入2mL处理过的全血，混匀，取75μL滴于滤纸片上；
校准品血卡S2配制：精密移取160μL S0溶液，加入2mL处理过的全血，混匀，取75μL滴于滤纸片上；
校准品血卡S3配制：精密移取100μL S0溶液，加入2mL处理过的全血，混匀，取75μL滴于滤纸片上；
校准品血卡S4配制：精密移取40μL S0溶液，加入2mL处理过的全血，混匀，取75μL滴于滤纸片上；
校准品血卡S5配制：精密移取20μL S0溶液，加入2mL处理过的全血，混匀，取75μL滴于滤纸片上；
校准品血卡S6配制：精密移取10μL S0溶液，加入2mL处理过的全血，混匀，取75μL滴于滤纸片上。
5、检测干血片样品中25-羟基维生素D的试剂盒的线性关系及检测限：
制备不同来源的血浆样本，分别加入10μL混合内标工作液，按本发明实施例中的前处理及LC-MS/MS测定条件进行测定，以定量离子色谱峰面积-浓度作图，得到标准曲线Y＝0.00377382X+-0.00823686，见表5、图1和图6。
表5.标准曲线
待测物 VD2(ng/mL) VD3(ng/mL)
标准品(10X) 1000 1000
Line-1 100 100
Line-2 80 80
Line-3 50 50
Line-4 20 20
Line-5 10 10
Line-6 5 5
结果表明25-羟基维生素D3、25-羟基维生素D2的线性范围和定量限如下：
对于25-羟基维生素D3来说，
①25-羟基维生素D3的检测限(LOD)：1.67ng/mL。
②25-羟基维生素D3的定量限(LOQ)：5ng/mL。
③25-羟基维生素D3的线性范围：25-羟基维生素D3在1.67ng/mL到100ng/mL范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.9800。
另外，对于25-羟基维生素D2而言，
①25-羟基维生素D2的检测限(LOD)：0.27ng/mL。
②25-羟基维生素D2的定量限(LOQ)：0.8ng/mL。
③25-羟基维生素D2的线性范围：25-羟基维生素D2在0.27ng/mL到100ng/mL范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.9800。
四、检测干血片样品中25羟基维生素D的试剂盒的回收率和精密度
分别取含25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2的标准工作液配制成高、低两种浓度进行加样回收率和精密度实验，按本发明提供的液相色谱-串联质谱测试方法进行测定，重复分析测定3批次，25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2的回收率和精密度见表6。25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3在低、高这两个添加水平范围内的平均回收率为97.15％～100.59％。
表6.25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2的回收率和精密度
五、试剂盒的稳定性
25-羟基维生素D测定试剂盒(液相色谱-串联质谱法)的稳定性包括：2-8℃储存条件下长期稳定性和开瓶稳定性，采用三批试剂盒研究，批号：20150611、20150612和20150613；
①长期稳定性测试：
于4～8℃储存条件下进行长期稳定性试验：将三批试剂盒，放置于4～8℃条件下储存，于第6、12以及36个月，分别抽取每批试剂盒，参照产品技术要求中的全部性能指标(外观、装量、线性、重复性、准确度，以及校准品和质控品的外观、装量、准确度、均一性)进行检测。实验结果见表7，表7中高低质控溶液的浓度分别为15ng/mL、75ng/mL，分别记录为QCL、QCH，本试剂盒在4～8℃储存条件下保存至36个月时，各指标检测结果均符合要求，因此将试剂盒4～8℃长期储存有效期定为36个月；
表7.长期稳定性测试结果
②开瓶稳定性试验：
根据实验结果，本试剂盒开瓶后，在-20±5℃储存条件下保存至20天，各指标检测结果见表8，均符合要求，试剂盒开瓶后有效期定为15天。
表8.开瓶稳定性试验结果
六、试剂盒适配机型验证
本试剂盒能够适配目前主流的质谱机型，在AB3200、4500及Waters公司STQD、TQS等质谱仪上能够通过方法学验证，结果分别见图2、图3、图4和图5。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
除非另外定义，否则本文中所用的术语具有与本发明所属领域的技术人员的通常所理解相同的含义。应进一步理解，术语应被解释为具有与其在相关技术以及本发明的上下文中的含义一致的含义，并且不应以理想化或过度形式化意义进行解释，除非本文中明确地这样定义。

Claims (5)

1.一种干血片中25-羟基维D的LC-MS/MS高通量检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、样品前处理
取样：取干血斑样本，用打孔器取3.2毫米滤纸干血片3片加入到96孔U型板中，然后加入200μL甲醇溶液与10μL 10μg/mL 25(OH)D3-13C5和25(OH)D2-D3的混合内标溶液涡旋振荡混匀30min，取180μL上清液至96孔V板中，35-60℃氮气直至吹干；
衍生：加入50μL衍生剂为4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮的衍生液至吹干后的96孔V板中，涡旋振荡30min；
终止：加入50μL超纯水溶液终止，涡旋振荡30min，将96孔板V板置于高效液相色谱串联质谱系统中进行检测；
S2、采用LC-MS/MS法检测
高效液相色谱串联质谱为三重四级杆质谱仪，通过高效液相色谱串联质谱法测定经所述步骤S1预处理后的样品检测溶液；所述步骤S2是采用梯度洗脱反相色谱法分离待测物，利用串联四级杆质谱仪进行检测的测定条件包括：
LC条件：Waters BEH C18柱；50×2.1mm，填料粒径1.7μm；柱温：30～45℃；进样体积：20～40μL；流动相A：0.5mM乙酸铵水溶液；流动相B：0.5mM乙酸铵甲醇溶液；洗液：弱洗-70％乙腈，强洗-乙腈；所述梯度洗脱的条件包括：
MS条件：离子源：APCI离子源；扫描模式：电喷雾离子源(ESI)和MRM模式；毛细管电压：3.5KV；离子源加热温度：500℃；气源流速：800L/Hr；其他检测条件包括：
化合物 母离子Q1 子离子Q3 锥孔电压 碰撞能量 25-羟基维生素D2 570.4 298.2 25 16 25-羟基维生素D2-D3 573.4 301.2 25 16 25-羟基维生素D3 558.4 298.2 25 16 25-羟基维生素D3-13C5 563.4 298.2 25 16
S3、标准曲线的绘制：配制标准液，以上述LC-MS/MS条件分别检测所述标准液，并根据检测结果绘制相应的标准曲线。
2.根据权利要求1所述的干血片中25-羟基维D的LC-MS/MS高通量检测方法，其特征在于：所述步骤S2中的检测的目标定量离子对包括25-OHD2衍生化产物和25-OHD3衍生化产物的母离子/子离子检测对如下所示：25-羟基维生素D3 m/z558.4＞m/z298.2、25-羟基维生素D2 m/z570.4＞m/z298.2；所述步骤S2中检测的内标衍生化产物的检测离子对为25-羟基维生素D3内标衍生化产物m/z563.4>m/z298.2和25-羟基维生素D2内标衍生化产物m/z573.4＞m/z301.2。
3.根据权利要求1所述的干血片中25-羟基维D的LC-MS/MS高通量检测方法，其特征在于：所述干血斑样本包括干血斑标准曲线样本、质控干血斑样本和需要检测的血斑样本。
4.根据权利要求3所述的干血片中25-羟基维D的LC-MS/MS高通量检测方法，其特征在于：所述质控干血斑样本的制备是通过取处理过的全血，分别与30μL、150μL浓度为1μg/mL的25-羟基维生素D混匀至2mL，取75μL滴于滤纸片上，分别获得15ng/mL和75ng/mL质控干血斑样本。
5.根据权利要求1所述的干血片中25-羟基维D的LC-MS/MS高通量检测方法，其特征在于，所述步骤S3中干血斑标准曲线的制作：取处理过的全血，分别与10μL、20μL、40μL、100μL、160μL、200μL浓度为1μg/mL的25-羟基维生素D混匀至2mL，取75μL滴于滤纸片上，获得5-100ng/mL干血斑标准曲线样本，以步骤S2中LC-MS/MS法的测试条件分别检测所述干血斑标准曲线样本，并根据检测结果绘制相应的干血斑标准样本曲线。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113640428A (zh) * 2021-08-24 2021-11-12 青岛惠安康生物工程有限公司 干血片中25-羟基维生素d的液相色谱串联质谱检测方法及试剂盒
CN115980211A (zh) * 2022-12-07 2023-04-18 广州凯普医药科技有限公司 一种定量检测25-羟基维生素d的试剂盒、方法及其应用
CN116399963A (zh) * 2022-12-13 2023-07-07 吉林金域医学检验所有限公司 血斑中痕量维生素d检测试剂盒及方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105527364A (zh) * 2015-08-26 2016-04-27 袁洪 超高效液相色谱串联质谱检测血清25羟基维生素d的方法
CN105651901A (zh) * 2016-04-11 2016-06-08 北京洛奇临床检验所股份有限公司 干血片样品中25羟基维生素d的液相色谱串联质谱检测方法及试剂盒
CN106908554A (zh) * 2017-03-24 2017-06-30 北京爱普益医学检验中心有限公司 一种干血斑中维生素d含量的检测方法
CN109001329A (zh) * 2018-08-21 2018-12-14 杭州凯莱谱精准医疗检测技术有限公司 干血片中25-羟基维生素d的高效液相色谱串联质谱检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105527364A (zh) * 2015-08-26 2016-04-27 袁洪 超高效液相色谱串联质谱检测血清25羟基维生素d的方法
CN105651901A (zh) * 2016-04-11 2016-06-08 北京洛奇临床检验所股份有限公司 干血片样品中25羟基维生素d的液相色谱串联质谱检测方法及试剂盒
CN106908554A (zh) * 2017-03-24 2017-06-30 北京爱普益医学检验中心有限公司 一种干血斑中维生素d含量的检测方法
CN109001329A (zh) * 2018-08-21 2018-12-14 杭州凯莱谱精准医疗检测技术有限公司 干血片中25-羟基维生素d的高效液相色谱串联质谱检测方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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液相色谱-串联质谱法检测干血点样本中25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3;韩吉春等;《分析化学》;20170331;第45卷(第3期);摘要，第2节，第3.2.1节，表1 *

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