CN116969852A - 一种季铵盐化合物在制备检测短链脂肪酸的衍生化试剂中的应用 - Google Patents

一种季铵盐化合物在制备检测短链脂肪酸的衍生化试剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种季铵盐化合物在制备检测短链脂肪酸的衍生化试剂中的应用。本发明所述季铵盐化合物不仅可以与短链脂肪酸发生衍生反应，并且在质谱仪器中发生正模式的电离，季铵盐化合物与短链脂肪酸衍生后碎裂出的子离子具有较高的特异性。

Description

一种季铵盐化合物在制备检测短链脂肪酸的衍生化试剂中的 应用
技术领域
本发明涉及脂肪酸的衍生化检测技术领域，尤其是涉及一种季铵盐化合物在制备检测短链脂肪酸的衍生化试剂中的应用，及一种短链脂肪酸的衍生化检测方法。
背景技术
脂肪酸是由碳链和羧基组成的化合物，是体内中性脂肪、磷脂和糖脂的主要成分。脂肪酸根据碳链长度可以分为短链脂肪酸，其碳链上的碳原子数小于6；中链脂肪酸，其碳链上碳原子数为6-12；以及长链脂肪酸，其碳链上的碳原子数大于12。其中短链脂肪酸在人体中，多由肠道中的细菌产生，对身体健康起着很重要的作用。因此建立能够准确检测生物体内短链脂肪酸含量的方法也十分重要。
针对短链脂肪酸的检测，常用的质谱检测手段会出现灵敏度较差的情况，我们采用衍生方法可以有效解决上述问题；常用的衍生化试剂是3-硝基苯肼，但是短链脂肪酸经3-硝基苯肼衍生后碎裂出的信号强度最高的子离子均为137Da，因此子离子的特异性不高。
CN111175426A公开了一种短链脂肪酸的定量方法，使用3-硝基苯肼作为衍生化试剂对生物排泄样本中的短链脂肪酸进行衍生化(按照预设比例采用乙腈萃取该生物排泄样本中的短链脂肪酸，从而得到萃取液；在萃取液中加入3-硝基苯肼、EDC和吡啶以使萃取液中的短链脂肪酸衍生化，从而得到短链脂肪酸衍生化产物)，以生成在紫外光区有特征吸收峰的短链脂肪酸衍生化产物，利用HPLC-UV法并基于分配色谱法原理在紫外光区下测定短链脂肪酸衍生化产物，从而实现对短链脂肪酸的定量检测。
CN111521699A公开了一种基于双衍生化技术的脂肪酸LC-MS/MS分析方法，包括以下步骤：一、制备脂肪酸混合标准品溶液；二、制备2-肼基嘧啶衍生化溶液；三、制备衍生化内标溶液；四、制备2-肼基-4,6-二甲基嘧啶衍生化溶液；五、制备各标准曲线待测溶液；六、采用LC-MS/MS法检测各标准曲线待测溶液，建立各种脂肪酸的标准曲线；七、取待测样品，加入DMP衍生化溶液混匀至脂肪酸均被衍生化，再加入衍生化内标溶液，混匀，离心后取上清液，采用LC-MS/MS法测量，得到脂肪酸的种类和含量。本发明能有效提升脂肪酸的质谱检测灵敏度和特异性，并可以实现短链、中链、长链和超长链脂肪酸的同时定量分析。
CN115872895A公开了一种用于衍生短链脂肪酸标准品作为内标的重标试剂及其制备方法、应用，涉及短链脂肪酸检测的技术领域，本发明提供的重标试剂是3-硝基苯胺-D4经重氮化反应，得到重氮盐，之后经还原反应，得到所述重标试剂，而且也解决了作为内源性物质的短链脂肪酸没有同位素内标的技术问题，同时，本发明在衍生化反应后引入的衍生终止反应有效改善了甲酸和乙酸的回收率，解决了由于甲酸和乙酸容易在色谱系统中残留而导致的回收率不达标的技术问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种季铵盐化合物在制备检测短链脂肪酸的衍生化试剂中的应用。所述季铵盐化合物不仅可以与短链脂肪酸发生衍生反应，并且与3-硝基苯肼相比，季铵盐化合物与短链脂肪酸衍生后碎裂出的子离子具有较高的特异性。
本发明的目的之二在于提供一种短链脂肪酸的衍生化检测方法。所述衍生化检测方法采用季铵盐化合物将短链脂肪酸衍生后，质谱仪器中发生正模式的电离，衍生后碎裂出的子离子特异性更强，且灵敏度高，结构鉴定精准，检测种类较多，5min之内可同时检测9中短链脂肪酸。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种季铵盐化合物在制备检测短链脂肪酸的衍生化试剂中的应用。
优选地，所述季铵盐化合物具有如下式I所示的结构：
其中，R基团选自C1-C6(例如可以是C1、C2、C3、C4、C5、C6)直链或支链的烷基，X选自卤素。
在本发明中，上述结构的季铵盐化合物具有N,N,N-三甲基结构，同时也具有氨基基团(-NH2)，在质谱中带正电生成的母离子碳-氮键容易发生断裂，在其发生衍生反应后，该碳-氮键发生断裂，N,N,N-三甲基结构掉落，从而形成59.1的子离子和另一个包含衍生反应物的子离子。其作为短链脂肪酸的衍生试剂，发现(2-氨基乙基)三甲基氯化铵不仅可以与短链脂肪酸发生衍生反应，并且与3-硝基苯肼相比，上述结构的季铵盐化合物与短链脂肪酸衍生后碎裂出的子离子具有较高的特异性。
季铵盐化合物与短链脂肪酸发生的衍生反应如下所示：
其中，R基团各自独立地选自C1-C6(例如可以是C1、C2、C3、C4、C5、C6)直链或支链的烷基，R'基团各自独立地选自C1-C5(例如可以是C1、C2、C3、C4、C5)直链或支链的烷基，X选自卤素(例如可以是F、Cl、Br、I)。
优选地，所述R基团为C1-C3直链烷基。
优选地，所述X为Cl。
优选地，所述季铵盐化合物为(2-氨基乙基)三甲基氯化铵。
优选地，所述短链脂肪酸中碳链上的碳原子数小于6，例如可以是1、2、3、4、5。
优选地，所述短链脂肪酸包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸、2-甲基丁酸、己酸、异己酸或3-甲基戊酸中的任意一种或至少两种的组合。
第二方面，本发明提供一种短链脂肪酸的衍生化检测方法，所述衍生化检测方法包括以下步骤：
将至少两种的短链脂肪酸混合，配置得到短链脂肪酸混合标准品溶液；
将内标物、如第一方面所述的季铵盐化合物、缩合剂、催化剂混合，进行衍生化反应，得到内标溶液；
将短链脂肪酸混合标准品溶液、如第一方面所述的季铵盐化合物、缩合剂、催化剂混合，进行衍生化反应，得到衍生化溶液；
将衍生化溶液稀释成不同的线性浓度后，取各浓度的衍生化溶液与内标溶液混合，进行LC-MS/MS定性检测和/定量检测。
优选地，所述混合标准品溶液中，短链脂肪酸的总浓度为0.045-900μg/mL，例如可以是0.045μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、500μg/mL、900μg/mL等，每种短链脂肪酸的浓度各自独立地为0.005-100μg/mL，例如可以是0.005μg/mL、0.05μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、80μg/mL、100μg/mL等。
优选地，所述混合标准品溶液的溶剂为甲醇。
优选地，所述内标物为乙酸-D4溶液。
优选地，所述缩合剂为EDC。
优选地，所述催化剂为吡啶。
优选地，所述衍生化反应的温度为30-50℃，例如可以是30℃、35℃、38℃、40℃、42℃、45℃、50℃等，所述衍生化反应的时间为30-50min，例如可以是30min、35min、40min、45min、50min等。
优选地，所述衍生化反应的溶剂为70-90％(v/v)(例如可以是70％(v/v)、75％(v/v)、78％(v/v)、80％(v/v)、82％(v/v)、85％(v/v)、90％(v/v)等)的甲醇水溶液。
优选地，所述内标溶液中内标物和季铵盐化合物的衍生化产物总浓度为15-25μg/mL，例如可以是15μg/mL、16μg/mL、18μg/mL、20μg/mL、22μg/mL、25μg/mL等。
作为本发明优选技术方案，所述短链脂肪酸混合标准品溶液由以下方法配置得到：
先分别配置9种短链脂肪酸的母液，再将9种短链脂肪酸的母液进行混合，配置得到短链脂肪酸混合标准品溶液；
优选地，所述短链脂肪酸的母液中短链脂肪酸的浓度为100μg/mL，母液的溶剂为甲醇。
作为本发明优选技术方案，所述内标溶液由以下方法配置得到：
取内标物溶液，采用甲醇水溶液稀释，得到内标物稀释液，离心，取上清液，向所述上清液中加入季铵盐化合物、缩合剂和催化剂，进行衍生化反应，得到内标溶液。
优选地，所述内标物溶液中内标物的浓度为20μg/mL，内标物溶液的溶剂为甲醇。
优选地，所述离心的转速为10000-12000rpm，例如可以是10000rpm、10500rpm、11000rpm、11500rpm、12000rpm等，所述离心的时间为10-15min，例如可以是10min、11min、12min、13min、14min、15min等。
优选地，所述内标物、季铵盐化合物、缩合剂和催化剂的质量比为1:(2500-3000):(2000-2500):(7500-8000)；
其中，“2500-3000”例如可以是2500、2600、2700、2800、2900、3000等；
其中，“2000-2500”例如可以是2000、2100、2200、2300、2400、2500等；
其中，“7500-8000”例如可以是7500、7600、7700、7800、7900、8000等。
优选地，所述内标物为乙酸-D4溶液，所述缩合剂为EDC，所述催化剂为吡啶。
优选地，所述甲醇水溶液的浓度为70-90％(v/v)，例如可以是70％(v/v)、75％(v/v)、78％(v/v)、80％(v/v)、82％(v/v)、85％(v/v)、90％(v/v)等。
优选地，所述衍生化反应的温度为30-50℃，例如可以是30℃、35℃、38℃、40℃、42℃、45℃、50℃等，所述衍生化反应的时间为30-50min，例如可以是30min、35min、40min、45min、50min等。
作为本发明优选技术方案，所述衍生化溶液由以下方法配置得到：
取短链脂肪酸混合标准品溶液，采用甲醇水溶液稀释，得到稀释液，离心，取上清液，向所述上清液中加入季铵盐化合物、缩合剂和催化剂，进行衍生化反应，得到衍生化溶液。
优选地，所述稀释液中短链脂肪酸的总浓度为900μg/mL。
优选地，所述离心的转速为10000-12000rpm，例如可以是10000rpm、10500rpm、11000rpm、11500rpm、12000rpm等，所述离心的时间为10-15min，例如可以是10min、11min、12min、13min、14min、15min等。
优选地，所述短链脂肪酸、季铵盐化合物、缩合剂和催化剂的质量比为1:(250-300):(200-250):(750-800)；
其中，“250-300”例如可以是250、260、270、280、290、300等；
其中，“200-250”例如可以是200、210、220、230、240、250等；
其中，“750-800”例如可以是750、760、770、780、790、800等。
优选地，所述甲醇水溶液的浓度为70-90％(v/v)，例如可以是70％(v/v)、75％(v/v)、78％(v/v)、80％(v/v)、82％(v/v)、85％(v/v)、90％(v/v)等。
优选地，所述衍生化反应的温度为30-50℃，例如可以是30℃、35℃、38℃、40℃、42℃、45℃、50℃等，所述衍生化反应的时间为30-50min，例如可以是30min、35min、40min、45min、50min等。
作为本发明优选技术方案，标准曲线由以下方法绘制得到：
将衍生化溶液稀释成不同的线性浓度后，取各浓度的衍生化溶液与内标溶液混合，选择正离子模式电喷雾电离源，采集短链脂肪酸的谱图和谱峰数据，记录对应的短链脂肪酸衍生化后的色谱图峰面积和对应浓度，绘制对应的短链脂肪酸标准曲线。
优选地，所述不同的线性浓度分别为：浓度分别为：0.005μg/mL、0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL中至少三组的组合。
优选地，所述标准曲线以各短链脂肪酸的峰面积与内标物峰面积的比值为纵坐标，以各短链脂肪酸的浓度与内标物的浓度比值为横坐标。
优选地，所述检测的质谱条件为：电喷雾电离源，采用多重反应监测进行扫描，离子源温度500-550℃(例如可以是500℃、520℃、540℃、550℃等)，离子源电压5000-5500V(例如可以是5000V、5100V、5200V、5300V、5400V、5500V等)，鞘气40-50psi(例如可以是40psi、42psi、44psi、46psi、48psi、50psi等)，辅助气45-55psi(例如可以是45psi、46psi、48psi、50psi、52psi、54psi、55psi等)，碰撞气选择Medium。
优选地，所述检测的9种标准品(短链脂肪酸)和内标(乙酸-D4)的质谱检测参数如下所示：
优选地，所述检测采用的色谱柱的填料包括亚乙基桥杂化颗粒。
优选地，所述色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm，2.1×100mm。
优选地，所述色谱柱的柱温为35-45℃。
优选地，所述检测的进样量为1-3μL，例如可以是1μL、1.5μL、2μL、2.5μL、3μL等。
优选地，所述检测中洗脱的流动相为：A相乙酸铵水溶液，B相乙腈和异丙醇的混合液。
优选地，所述乙酸铵水溶液的浓度为10-20mM，例如可以是10mM、12mM、14mM、16mM、18mM、20mM等。
优选地，所述乙腈和异丙醇的体积比为1:(0.2-0.5)，例如可以是1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5等。
优选地，所述检测中洗脱的流速为0.2-0.4mL/min，例如可以是0.2mL/min、0.22mL/min、0.24mL/min、0.26mL/min、0.28mL/min、0.3mL/min、0.32mL/min、0.34mL/min、0.36mL/min、0.38mL/min、0.4mL/min等。
优选地，所述检测中洗脱的方式为梯度洗脱，梯度洗脱程序如下所示：
第0-1min A相95-100％(v/v)，例如可以是95％(v/v)、96％(v/v)、97％(v/v)、98％(v/v)、99％(v/v)、100％(v/v)等，B相0-5％(v/v)，例如可以是0％(v/v)、1％(v/v)、2％(v/v)、3％(v/v)、4％(v/v)、5％(v/v)等。
第2min A相92-97％(v/v)，例如可以是92％(v/v)、93％(v/v)、94％(v/v)、95％(v/v)、96％(v/v)、97％(v/v)等，B相3-8％(v/v)，例如可以是3％(v/v)、4％(v/v)、5％(v/v)、6％(v/v)、7％(v/v)、8％(v/v)等；
第3min A相70-80％(v/v)，例如可以是70％(v/v)、72％(v/v)、74％(v/v)、76％(v/v)、78％(v/v)、80％(v/v)等，B相20-30％(v/v)，例如可以是20％(v/v)、22％(v/v)、24％(v/v)、26％(v/v)、28％(v/v)、30％(v/v)等。
第4min A相55-65％(v/v)，例如可以55％(v/v)、56％(v/v)、58％(v/v)、60％(v/v)、62％(v/v)、64％(v/v)、65％(v/v)等，B相35-45％(v/v)，例如可以35％(v/v)、36％(v/v)、38％(v/v)、40％(v/v)、42％(v/v)、45％(v/v)等。
第5min A相35-45％(v/v)，例如可以35％(v/v)、36％(v/v)、38％(v/v)、40％(v/v)、42％(v/v)、44％(v/v)、45％(v/v)等，B相55-65％(v/v)，例如可以55％(v/v)、56％(v/v)、58％(v/v)、60％(v/v)、62％(v/v)、64％(v/v)、65％(v/v)等。
第5.5min A相75-85％(v/v)，例如可以75％(v/v)、76％(v/v)、78％(v/v)、80％(v/v)、82％(v/v)、84％(v/v)、85％(v/v)等，B相15-25％(v/v)，例如可以15％(v/v)、16％(v/v)、18％(v/v)、20％(v/v)、22％(v/v)、24％(v/v)、25％(v/v)等。
第6-8min A相99-100％(v/v)，例如可以99％(v/v)、99.5％(v/v)、100％(v/v)等，B相0-1％(v/v)，例如可以0％(v/v)、0.5％(v/v)、1％(v/v)等。
第8.1-10min A相97-99％(v/v)，例如可以97％(v/v)、97.5％(v/v)、98％(v/v)、98.5％(v/v)、99％(v/v)，B相1-3％(v/v)，例如可以1％(v/v)、1.5％(v/v)、2％(v/v)、2.5％(v/v)、3％(v/v)等。
优选地，所述检测中洗脱的方式为梯度洗脱，梯度洗脱程序如下所示：
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明意外地发现了式I所示的季铵盐化合物可以作为一种新的短链脂肪酸衍生化试剂，与常用的3-硝基苯肼相比，式I所示的季铵盐化合物发生衍生反应后，碎裂产生的子离子特异性较高(例如(2-氨基乙基)三甲基氯化铵与短链脂肪酸发生衍生反应后的Q3)；
(2)本发明发现并使用(2-氨基乙基)三甲基氯化铵作为短链脂肪酸的衍生试剂，与短链脂肪酸的常用衍生试剂3-硝基苯肼相比，(2-氨基乙基)三甲基氯化铵与短链脂肪酸发生衍生反应后在质谱仪器中发生正模式的电离，而3-硝基苯肼衍生后发生负模式的电离；
(3)3-硝基苯肼衍生短链脂肪酸后产生的信号最高的子离子均为137Da，但(2-氨基乙基)三甲基氯化铵衍生短链脂肪酸后产生的信号最高的子离子是不同的(同分异构体除外)，因此(2-氨基乙基)三甲基氯化铵的优势在于衍生后碎裂出的子离子特异性更强；
(4)本发明提供一种短链脂肪酸的衍生化检测方法。所述衍生化检测方法采用季铵盐化合物将短链脂肪酸衍生后，质谱仪器中发生正模式的电离，衍生后碎裂出的子离子特异性更强，且灵敏度高，结构鉴定精准，检测种类较多，5min之内可同时检测9中短链脂肪酸。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为(2-氨基乙基)三甲基氯化铵碎裂生成子离子的质谱图。
图2为实施例1的中9种短链脂肪酸经衍生化后的色谱分离图。
图3为甜菜碱碎裂生成子离子的质谱图。
图4为实施例2的中9种短链脂肪酸经衍生化后的色谱分离图。
图5为实施例3的中9种短链脂肪酸经衍生化后的色谱分离图。
具体实施方式
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。
标准品和内标物溶液的配置：
①9种短链脂肪酸母液的配置：
将1000μg的乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸、2-甲基丁酸、己酸、异己酸和3-甲基戊酸分别溶解于1mL的甲醇溶剂中，配置得到1000μg/mL的对应短链脂肪酸标准品溶液；
②乙酸-D4(内标物)溶液
将20μg的乙酸-D4溶解于1mL的甲醇溶剂中，配置得到20μg/mL的乙酸-D4内标物溶液。
实施例1
本实施例提供一种短链脂肪酸的衍生化检测方法，所述衍生化检测方法包括以下步骤：
(1)待测样液的配置
混标配制：用移液器分别移取9种短链脂肪酸标准品溶液(取用量各自为0.1mL)，混匀后加入0.1mL甲醇，制得9种标准品(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸、2-甲基丁酸、己酸、异己酸、3-甲基戊酸)的混标母液(100μg/mL)；
内标配制：用移液器移取100μL乙酸-D4溶液，加入400μL 80％(v/v)甲醇水溶液，得到500μL混合液，混匀离心，取上清液50μL，分别加入50μL、160mM(2-氨基乙基)三甲基氯化铵、50μL 120mM EDC(N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺)、50μL 8％吡啶，在40℃下衍生40min，得到内标母液(1μg/mL)；
衍生化溶液配制：用移液器移取100μL混标母液，加入400μL 80％(v/v)甲醇水溶液，得到500μL混合液，混匀离心，取上清液50μL，分别加入50μL 160mM(2-氨基乙基)三甲基氯化铵、50μL 120mM EDC(N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺)、50μL 8％吡啶，在40℃下衍生40min，得到衍生化溶液。
(2)检测条件：
质谱条件：
电喷雾电离(ESI)源，离子源温度550℃，离子源电压5500V，鞘气45psi，辅助气50psi，碰撞气选择medium。采用多重反应监测(MRM)进行扫描。10种标准品和内标的质谱检测参数见下所示：
色谱条件：
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm，2.1×100mm；
流动相：A相：20mM乙酸铵水；B相：50％乙腈异丙醇；
柱温：40℃；
进样量：2μL；
所述检测中洗脱的方式为梯度洗脱，梯度洗脱程序如下所示：
(3)标准曲线配制
将上述稀释成线性后，浓度分别为：0.005μg/mL、0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、50μg/mL100μg/mL，取各点90μL分别加入10μL混合内标溶液(1μg/mL)，通过上述检测条件，采集短链脂肪酸的谱图和谱峰数据，记录对应的短链脂肪酸衍生化后的色谱图峰面积和对应浓度，绘制对应的短链脂肪酸标准曲线；
所述标准曲线以对应短链脂肪酸与内标的峰面积比值为纵坐标，以对应短链脂肪酸与内标的浓度比值为横坐标；具体的短链脂肪酸对应的标准曲线结果如下所示：
(4)待测样品的定性定量检测
将待测样品采用上述检测条件，采集短链脂肪酸的谱图和谱峰数据，记录对应的短链脂肪酸衍生化后的色谱图峰面积和对应浓度，得到如图2所示的谱图，通过面积代入上述标准曲线，计算得到待测样品(样品1是小鼠肝脏组织；样品2是小鼠血清；样品3是植物叶片)中对应短链脂肪酸的实际含量结果如下所示：
实施例2
本实施例提供一种短链脂肪酸的衍生化检测方法，与实施例1的区别仅在于，梯度洗脱程序略有不同，但是丁酸和2-甲基丁酸出峰的峰型明显比实施例1差(如图4所示)，梯度洗脱程序如下所示：
实施例3
本实施例提供一种短链脂肪酸的衍生化检测方法，与实施例1的区别仅在于，梯度洗脱程序略有不同，但是丁酸出峰的峰型以及2-甲基丁酸和异戊酸的分离度比实施例1差(如图5所示)，梯度洗脱程序如下所示：
实施例4
本实施例提供一种短链脂肪酸的衍生化检测方法，与实施例1的区别仅在于，梯度洗脱程序完全不同，梯度洗脱程序如下所示：
对比例1
本对比例提供一种短链脂肪酸的衍生化检测方法，与实施例1的区别仅在于，将(2-氨基乙基)三甲基氯化铵替换为量的3-硝基苯肼，其他检测条件与实施例1完全一致。
该对比例的衍生化试剂是3-硝基苯肼，但是短链脂肪酸经3-硝基苯肼衍生后碎裂出的信号强度最高的子离子均为137Da，因此子离子的特异性不高；且3-硝基苯肼衍生只有在负模式下才发生电离，其采用实施例1的检测条件无法进行短链脂肪酸的衍生化检测。
对比例2
本对比例提供一种短链脂肪酸的衍生化检测方法，与实施例1的区别仅在于，将(2-氨基乙基)三甲基氯化铵替换为量的甜菜碱，其他检测条件与实施例1完全一致。
如图3所示，甜菜碱(即N,N,N-三甲基甘氨酸)作为与(2-氨基乙基)三甲基氯化铵的类似结构，在质谱中带正电生成的母离子碳-氮键容易发生断裂，从而形成58和59.1两个子离子，然而不具备氨基基团，无法与脂肪酸类化合物发生衍生化反应(发生缩合形成酰胺衍生物)，因此甜菜碱无法作为衍生化试剂对短链脂肪酸进行检测。
测试例1
准确度和精确度测试
测试项目：实施例1提供的衍生化检测方法；
测试方法：根据基质标准曲线范围分别选择基质标准曲线最低浓度点、中浓度点及最高浓度点作为低浓度质控点(LQC)、中浓度质控点(MQC)、高浓度质控点(HQC)。用空白基质配制3个浓度的QC，每个浓度平行配制5份，分别取20μL测试样品，反应结束后，将测试样品于12000rpm，4℃离心10min，取100μL上机分析。计算准确度及精密度，结果如表1所示：
具体测试结果如表1所示：
表1
如表1测试数据可知，本发明优选技术方案测试9种待测短链脂肪酸的准确度在89.2～107.74％之间。精密度RSD％均在10％以内。表明该方法精密度良好。说明本发明所述检测方法脂肪酸的羧基有效被转化成酰胺键，采用特定的衍生化试剂，使得修饰后的脂肪酸在ESI中的离子化效率增加，从而显著提升了其质谱检测灵敏度，实现对短链脂肪酸的准确定量分析。
测试例2
稳定性测试
测试项目：实施例1提供的衍生化检测方法；
测试方法：根据基质标准曲线范围分别选择基质标准曲线最低浓度点、中浓度点及最高浓度点作为低浓度质控点(LQC)、中浓度质控点(MQC)、高浓度质控点(HQC)。用空白基质配制3个浓度的QC，每个浓度平行配制5份，分别取20μL测试样品，放置在样品盘中24小时持续进样检测，并计算稳定性，结果如表2所示：
具体测试结果如表2所示：
表2
如表2测试数据可知，各样品24h内稳定性RSD％均在5％以内，经过衍生化。
综上所述，所述衍生化检测方法采用季铵盐化合物将短链脂肪酸衍生后，质谱仪器中发生正模式的电离，衍生后碎裂出的子离子特异性更强，且灵敏度高，结构鉴定精准，5min之内可同时检测9种短链脂肪酸，并且峰形良好。相比于此前的分析方法，本方法对脂肪酸的分析时间得到有效缩短，并且色谱峰形也得到了良好的改善，增加了其分离效率，改善了色谱峰形，同时实现了短链脂肪酸的定量分析。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种季铵盐化合物在制备检测短链脂肪酸的衍生化试剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述季铵盐化合物具有如下式I所示的结构：
其中，R基团选自C1-C6直链或支链的烷基，X选自卤素；
优选地，所述R基团为C1-C3直链烷基；
优选地，所述X为Cl；
优选地，所述季铵盐化合物为(2-氨基乙基)三甲基氯化铵。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述短链脂肪酸中碳链上的碳原子数小于6；
优选地，所述短链脂肪酸包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸、2-甲基丁酸、己酸、异己酸或3-甲基戊酸中的任意一种或至少两种的组合。
4.一种短链脂肪酸的衍生化检测方法，其特征在于，所述衍生化检测方法包括以下步骤：
将至少两种的短链脂肪酸混合，配置得到短链脂肪酸混合标准品溶液；
将内标物、如权利要求1-3中任一项所述的季铵盐化合物、缩合剂、催化剂混合，进行衍生化反应，得到内标溶液；
将短链脂肪酸混合标准品溶液、如权利要求1-3中任一项所述的季铵盐化合物、缩合剂、催化剂混合，进行衍生化反应，得到衍生化溶液；
将衍生化溶液稀释成不同的线性浓度后，取各浓度的衍生化溶液与内标溶液混合，进行LC-MS/MS定性检测和/定量检测。
5.根据权利要求4所述短链脂肪酸的衍生化检测方法，其特征在于，所述混合标准品溶液中，短链脂肪酸的总浓度为0.045-900μg/mL，每种短链脂肪酸的浓度各自独立地为0.005-100μg/mL；
优选地，所述混合标准品溶液的溶剂为甲醇。
6.根据权利要求4所述短链脂肪酸的衍生化检测方法，其特征在于，所述内标物为乙酸-D4溶液；
优选地，所述缩合剂为EDC；
优选地，所述催化剂为吡啶；
优选地，所述衍生化反应的温度为30-50℃，所述衍生化反应的时间为30-50min；
优选地，所述衍生化反应的溶剂为70-90％(v/v)的甲醇水溶液；
优选地，所述内标溶液中内标物和季铵盐化合物的衍生化产物总浓度为15-25μg/mL。
7.根据权利要求4所述短链脂肪酸的衍生化检测方法，其特征在于，所述检测的质谱条件为：电喷雾电离源，采用多重反应监测进行扫描，离子源温度500-550℃，离子源电压5000-5500V，鞘气40-50psi，辅助气45-55psi，碰撞气选择Medium。
8.根据权利要求4所述短链脂肪酸的衍生化检测方法，其特征在于，所述检测采用的色谱柱的填料包括亚乙基桥杂化颗粒；
优选地，所述色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm，2.1×100mm；
优选地，所述色谱柱的柱温为35-45℃；
优选地，所述检测的进样量为1-3μL。
9.根据权利要求4所述短链脂肪酸的衍生化检测方法，其特征在于，所述检测中洗脱的流动相为：A相乙酸铵水溶液，B相乙腈和异丙醇的混合液；
优选地，所述乙酸铵水溶液的浓度为10-20mM；
优选地，所述乙腈和异丙醇的体积比为1:(0.2-0.5)。
10.根据权利要求4或9所述短链脂肪酸的衍生化检测方法，其特征在于，所述检测中洗脱的流速为0.2-0.4mL/min；
优选地，所述检测中洗脱的方式为梯度洗脱，梯度洗脱程序如下所示：
第0-1min A相95-100％(v/v)，B相0-5％(v/v)；
第2min A相92-97％(v/v)，B相3-8％(v/v)；
第3min A相70-80％(v/v)，B相20-30％(v/v)；
第4min A相55-65％(v/v)，B相35-45％(v/v)；
第5min A相35-45％(v/v)，B相55-65％(v/v)；
第5.5min A相75-85％(v/v)，B相15-25％(v/v)；
第6-8min A相99-100％(v/v)，B相0-1％(v/v)；
第8.1-10min A相97-99％(v/v)，B相1-3％(v/v)。
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