CN116087373B - 红细胞中叶酸和5-甲基四氢叶酸的检测方法及前处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种红细胞中叶酸和5‑甲基四氢叶酸的检测方法及前处理方法。检测方法包括：制备标准曲线方程，制备标准曲线方程所使用的标准溶液中添加有动物血清；样本前处理，检测待测样品，包括：使用高效液相色谱质谱联用仪对待测样本进行检测，将检测结果代入标准曲线方程，得到待测样本中红细胞中叶酸和5‑甲基四氢叶酸的浓度。本发明获得红细胞进行处理，直接获得实验结果，不需要检测其他指标进行换算。本发明简化了前处理的步骤，缩短整个前处理时长，降低了成本，提高了检测的准确性。

Description

红细胞中叶酸和5-甲基四氢叶酸的检测方法及前处理方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种红细胞中叶酸和5-甲基四氢叶酸的检测方法及前处理方法。

背景技术

叶酸（Folic Acid）也称蝶酰谷氨酸，是一种核酸、胸苷酸、神经递质、磷脂以及激素合成必不可少的一种重要的B族水溶性维生素，其在蛋白质合成及细胞分裂与生长过程中具有重要作用，对正常红细胞的形成有促进作用。叶酸缺乏与多种疾病的发生有关，准确检测人体内叶酸水平是评价叶酸营养状态的基础。长期以来，临床检验中一般是对人血清或血浆中叶酸含量的测定，来判断人体叶酸的缺乏与否。近年来，经研究证明红细胞中叶酸含量是血清或血浆中叶酸的含量的10 ~ 20倍，且血浆或血清叶酸代表体内循环状态的叶酸水平，但易受到膳食等因素影响，其浓度水平波动较大。而红细胞叶酸与红细胞更新过程有关，反映人体内叶酸的长期变化状态和叶酸储备情况，因此红细胞叶酸测量可以更加准确地反映组织贮存情况。红细胞叶酸浓度被视为能够最可靠地反映叶酸状态的指标。

叶酸并非是单一分子，是由一系列的衍生物组成。活性叶酸是5-甲基四氢叶酸，是稳定性的天然叶酸，无需代谢，可直接进入循环，被人体吸收利用。5-甲基四氢叶酸是血液中叶酸最主要的存在形式，约占总量的82%~93%，因此叶酸的测定重点测定非代谢型叶酸和5-甲基四氢叶酸。

文献中有两种方法估算红细胞叶酸浓度。第一种方法是根据全血叶酸浓度推算红细胞叶酸浓度。具体地，首先取出一小份全血，测量红细胞压积；再取出一小份全血，测得全血叶酸浓度。再将全血叶酸浓度除以红细胞压积以估算红细胞叶酸浓度。这种方法由于忽略了血浆叶酸的贡献及占比的差异性，会造成红细胞叶酸浓度高估和不准确。第二种方法是先测得红细胞压积和全血叶酸浓度，再将同一管血离心取得血浆，测得血浆叶酸浓度，再根据公式“红细胞叶酸＝[全血叶酸-血浆叶酸(1-红细胞压积)]/红细胞压积”估算出红细胞叶酸。这种方法的缺陷是需要分别做血浆和全血的叶酸检测，增加了检测误差和成本。

在全血叶酸提取方面，根据文献报道，样本前处理阶段需要复杂的前处理过程，包括冻融裂解（-80℃冰箱内快速冷冻至少30分钟）、加标稀释、热变失活（90℃加热15分钟）、水解孵育（37℃或常温孵育3小时）和固相萃取（包括活化、平衡、上样、淋洗、洗脱）等步骤，所处理得到的样本氮气吹干复溶后进入液相色谱-串联质谱进行检测。上述前处理技术即增加了成本，降低了效率，也有可能因步骤多而增加了检测误差。

为了进一步提高红细胞叶酸检测的效率、同时提高检测的灵敏度和准确性，特提出本发明。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种红细胞中叶酸和5-甲基四氢叶酸的检测方法及前处理方法。

本发明提供了一种红细胞中叶酸和5-甲基四氢叶酸的检测方法，至少包括以下步骤：

S1、制备标准曲线方程，制备标准曲线方程所使用的标准溶液中添加有动物血清；

S2、样本前处理，包括：

S21、将EDTA抗凝血离心，获得血细胞；

S22、在血细胞中加入混合内标工作液和红细胞裂解液，裂解一段时间后离心取上清；

S23、在S22中获得的上清中加入动物血清，混合后酶解一段时间；

S24、在S23中获得的酶解产物中加入蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀，混合后离心，取上清为待测样本；

S3、检测所述待测样品，包括：使用高效液相色谱质谱联用仪对所述待测样本进行检测，将检测结果代入所述标准曲线方程，得到所述待测样本中红细胞中叶酸和5-甲基四氢叶酸的浓度。

可选的，制备标准曲线方程时使用的标准溶液还含有红细胞裂解液和蛋白沉淀剂，经混合后离心得到标准溶液进样液；所述红细胞裂解液为：含有140 ~ 160 mmol/L的NH₄Cl、5 ~ 15 mmol/L的KHCO₃和0.05 ~ 0.15 mmol/L的Na₂EDTA的水溶液；所述蛋白沉淀剂选自质量体积百分比为3% ~ 10%的磺基水杨酸水溶液或体积百分比为3% ~ 10%高氯酸水溶液。

本发明提供了一种采用高效液相色谱串联质谱法检测红细胞中叶酸和5-甲基四氢叶酸的前处理方法，至少包括以下步骤：

S1’、将EDTA抗凝血离心，获得血细胞；

S2’、在血细胞中加入混合内标工作液和红细胞裂解液，裂解一段时间后离心取上清；红细胞裂解液为：含有140 ~ 160 mmol/L的NH₄Cl、5 ~ 15 mmol/L的KHCO₃和0.05 ~0.15 mmol/L的Na₂EDTA的水溶液；

S3’、在S2’中获得的上清中加入动物血清，混合后酶解一段时间；所述动物血清选自大鼠血清或人血清；

S4’、在S3’中获得的酶解产物中加入蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀，混合后离心，取上清为待测样本；蛋白沉淀剂选自质量体积百分比为3% ~ 10%的磺基水杨酸水溶液或体积百分比为3% ~ 10%高氯酸水溶液；

混合内标工作液先采用溶解试剂配制标准储备液，再采用稀释液稀释得到，所述溶解试剂为甲醇和0.05 ~ 0.5 mol/L氨水体积比为1：1的混合溶液；稀释剂为甲醇和水体积比为3：7的混合溶液，水中含有质量百分比为0.1% ~ 2%的2,6-二叔丁基对甲酚和/或质量百分比为0.1% ~ 1%的二硫苏糖醇。

本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：

首先，本发明获得红细胞进行处理，直接获得实验结果，不需要检测其他指标进行换算。

其次，本发明简化了前处理的步骤，缩短整个前处理时长，降低了成本。

最后，本发明通过将动物血清同时加入到标准工作液中的方式来抵消动物血清中内源性叶酸和5-甲基四氢叶酸带来的影响，无需对动物血清进行去除叶酸和5-甲基四氢叶酸的操作，简化了前处理步骤，提高了检测的准确性。同时本发明标准工作液中无需加入红细胞基质，也能实现很好的准确度，避免了对红细胞基质去除叶酸和5-甲基四氢叶酸的操作，简化了标曲前处理的步骤。

附图说明

图1为实施例1中标准溶液中叶酸的色谱图（左图为标准物质，右图为内标物质）；

图2为实施例1中标准溶液中5-甲基四氢叶酸的色谱图（左图为标准物质，右图为内标物质）；

图3为实施例1中待测样本红细胞叶酸的色谱图（左图为待测物质，右图为内标物质）；

图4为实施例1中待测样本红细胞5-甲基四氢叶酸的色谱图（左图为待测物质，右图为内标物质）；

图5为本发明实施例4中梯度洗脱条件1时，检测2 ng/mL叶酸标准溶液的色谱图（左图为标准物质，右图为内标物质）；

图6为实施例4中梯度洗脱条件1时，检测5 ng/mL 5-甲基四氢叶酸标准溶液的色谱图（左图为标准物质，右图为内标物质）；

图7为实施例4中梯度洗脱条件2时，检测2 ng/mL叶酸标准溶液的色谱图（左图为标准物质，右图为内标物质）；

图8为实施例4中梯度洗脱条件2时，检测5 ng/mL的5-甲基四氢叶酸标准溶液的色谱图（左图为标准物质，右图为内标物质）；

图9为对比例1的D1-3中大鼠血清中叶酸的色谱图（左图为待测物质，右图为内标物质）；

图10为对比例1的D1-3中大鼠血清中5-甲基四氢叶酸的色谱图（左图为待测物质，右图为内标物质）；

图11为对比例3中6%的磺基水杨酸沉淀蛋白首次离心效果；

图12为对比例3中6%的磺基水杨酸沉淀蛋白二次离心效果；

图13为对比例3中甲醇沉淀蛋白首次离心效果；

图14为对比例3中甲醇沉淀蛋白二次离心效果；

图15为对比例D6-1中B相为乙腈时，检测2 ng/mL叶酸标准溶液的色谱图（左图为标准物质，右图为内标物质）；

图16为对比例D6-1中B相为乙腈时，检测5 ng/mL 5-甲基四氢叶酸标准溶液的色谱图（左图为标准物质，右图为内标物质）；

图17为对比例D6-2中A相采用纯水、B相采用纯甲醇时，检测2 ng/mL叶酸标准溶液的色谱图（左图为标准物质，右图为内标物质）；

图18为对比例D6-2中A相采用纯水、B相采用纯甲醇时，检测5 ng/mL 5-甲基四氢叶酸标准溶液的色谱图（左图为标准物质，右图为内标物质）；

图19为对比例D6-3中初始条件为1%B相等度洗脱时，检测2 ng/mL叶酸标准溶液的色谱图（左图为标准物质，右图为内标物质）；

图20为对比例D6-3中初始条件为1%B相等度洗脱时，检测5 ng/mL 5-甲基四氢叶酸标准溶液的色谱图（左图为标准物质，右图为内标物质）；

图21为对比例D6-4中初始条件为15%B相时，检测2 ng/mL叶酸标准溶液的色谱图（左图为标准物质，右图为内标物质）；

图22为对比例D6-4中初始条件为15%B相时，检测5 ng/mL5-甲基四氢叶酸标准溶液的色谱图（左图为标准物质，右图为内标物质）；

图23为对比例D6-5中离子对选择叶酸：442.3/295.1时，实际样本中叶酸的色谱图（左图为待测物质，右图为内标物质）；

图24为对比例D6-5中离子对选择5-甲基四氢叶酸：460.4/313.1时的标准曲线方程。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

本发明实施例提出一种红细胞中叶酸和5-甲基四氢叶酸的检测方法，本发明实施例直接检测离心得到的血细胞，直接获得实验结果，不需要检测其他指标进行换算，无需血红蛋白仪配套设备，结果准确可靠。具体的，该检测方法至少包括以下步骤：

S1、制备标准曲线方程，制备标准曲线方程所使用的标准溶液中添加有动物血清；

S2、样本前处理，包括：

S21、将EDTA抗凝血离心，获得血细胞；

S22、在血细胞中加入混合内标工作液和红细胞裂解液，裂解一段时间后离心取上清；

S23、在S22中获得的上清中加入动物血清，混合后酶解一段时间；

S24、在S23中获得的酶解产物中加入蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀，混合后离心，取上清为待测样本；

S3、检测待测样品，包括：使用高效液相色谱质谱联用仪对待测样本进行检测，将检测结果代入标准曲线方程，得到待测样本中红细胞中叶酸和5-甲基四氢叶酸的浓度。本发明实施例使用动物血清作为γ-谷氨酰水解酶将红细胞中贮存的多谷氨酸叶酸形式转换成单谷氨酸叶酸形式，解决了直接使用γ-谷氨酰水解酶价格昂贵的技术缺陷。并且，γ-谷氨酰水解重组酶受不同厂家批号、不同工艺的影响可能对结果产生影响，进而影响检测的准确性。但由于动物血清中含有内源性叶酸和5-甲基四氢叶酸，将动物血清加入到全血红细胞中会影响其结果，为此，本发明实施例采用将动物血清同时加入到标准工作液中的方式来抵消动物血清中内源性叶酸和5-甲基四氢叶酸带来的影响，无需对动物血清进行去除叶酸和5-甲基四氢叶酸的操作，简化了前处理步骤，提高了检测的准确性。

本发明实施例的标准工作液中无需加入红细胞基质，也能实现很好的准确度，避免了对红细胞基质去除叶酸和5-甲基四氢叶酸的操作，简化了标曲前处理的步骤，另外，制备标准曲线方程时使用的标准溶液还含有红细胞裂解液和蛋白沉淀剂，经混合后离心得到标准溶液进样液。

本发明实施例采用对EDTA全血离心，去除血浆获取血细胞，然后用专用红细胞裂解液对红细胞进行裂解，红细胞裂解液为：140 ~ 160 mmol/L NH₄Cl、5 ~ 15 mmol/L KHCO₃和0.05 ~ 0.15mmol/L Na₂EDTA的水溶液，优选为含有150 mmol/L的NH₄Cl、10 mmol/L的KHCO₃和0.1 mmol/L的Na₂EDTA的水溶液。该红细胞裂解液可以在不损伤有核红细胞的前提下充分的裂解红细胞，再加入动物血清将红细胞中释放的多谷氨酸叶酸形式转换成单谷氨酸叶酸。因此，本申请可直接测定红细胞中叶酸的含量，无需先测得全血中红细胞叶酸的含量，以及红细胞压积，再折算红细胞中的叶酸。经实验证实，该红细胞裂解液对红细胞的裂解效果好，可对离心后的红细胞进行充分的、选择性裂解，不需要冻融等复杂操作，从而简化血细胞获取和红细胞裂解过程。

作为本发明的一种具体实施方式，蛋白沉淀剂选自质量体积百分比为3% ~ 10%的磺基水杨酸水溶液（将3 ~ 10g的磺基水杨酸溶解、定容于100 mL的水中获得）或体积百分比为3% ~ 10%高氯酸水溶液（将4.167 ~ 13.889 mL的72%的高氯酸、定容于100 mL的水中获得）。经实验证实，该蛋白沉淀剂对样本的提取回收率良好，减少样品量，可以保证检测的准确度和灵敏度。与采用固相萃取进行前处理相比，本申请前处理简单易操作，且经济适用。

作为本发明实施例的一种改进，本发明标曲的制备对混合标准工作液进行与待测样本相同的操作，从而保证了检测的准确性，具体的，S1包括：

S11、配制梯度浓度的混合标准工作液、混合内标工作液；混合标准工作液中含有叶酸标准品和5-甲基四氢叶酸标准品，混合内标工作液中含有叶酸内标标准品和5-甲基四氢叶酸内标标准品；

S12、将梯度浓度的混合标准工作液中分别加入混合内标工作液，再加入动物血清和红细胞裂解液，制备得到梯度浓度的标准溶液；

S13、将标准溶液中加入蛋白沉淀剂，混合后离心，取上清为标准溶液进样液；使用高效液相色谱质谱联用仪对标准溶液进样液进行检测，获得标准曲线方程。

作为本发明实施例的一种改进，动物血清选自大鼠血清或人血清。内标标准品优选采用同位素标准品，具体的，叶酸内标可采用叶酸-d4、5-甲基四氢叶酸内标可采用5-甲基四氢叶酸-C13,d3。

作为本发明实施例的一种改进，叶酸和5-甲基四氢叶酸不稳定，需要加入保护剂，具体可选用含甲醇和水体积比为3：7的混合溶液，水中含有质量百分比为0.1% ~ 2%的2,6-二叔丁基对甲酚和/或质量百分比为0.1% ~ 1%的二硫苏糖醇，可以避免标准溶液中叶酸和5-甲基四氢的降解，提高检测的准确性。保护剂同时可作为标准溶液和内标工作液的稀释剂。保护剂更优选为甲醇：水（含有1%的2,6-二叔丁基对甲酚和/或0.5%的二硫苏糖醇）体积比为3：7的混合溶液。

作为本发明实施例的一种改进，为了保证标曲制备和样本处理的一致性，在S1和S2的每个检测体系内（即在一个容器内进行一个标准溶液的配制或者一个待测样本的配制时），所加入的动物血清的体积相同。

进一步优选的，在S1和S2的每个检测体系内，所加入的蛋白沉淀剂的体积均相同；在S1的每个检测体系内，混合标准工作液与红细胞裂解液的体积比为V₁，在S2的每个检测体系内，血细胞与红细胞裂解液的体积比为V₂，V₁= V₂。

作为本发明实施例的一种改进，具体的，V₁= V₂=1：3 ~ 5；本发明实施例的红细胞裂解液在该比例下的裂解效果最佳。

作为本发明实施例的一种改进，在S12中，混合标准工作液与混合内标工作液的体积比为1：0.5 ~ 1；混合标准工作液与动物血清的体积比为1：1 ~ 1.5。

作为本发明实施例的一种改进，在S22中，血细胞与混合内标工作液的体积比为1：0.5 ~ 1。

作为本发明实施例的一种改进，在S23中，S22中获得的上清与动物血清的体积比为10：2 ~ 3。

作为本发明实施例的一种改进，在S24中，S22中获得的上清与红细胞裂解液的体积比为2：3 ~ 5。

作为本发明实施例的一种改进，在S1中，分别取混合标准工作液20 μL，加入内标工作液10 ~ 20 μL、动物血清20 ~ 30 μL和红细胞裂解液60 ~ 100 μL，混合制成梯度浓度的标准溶液，混合后加入蛋白沉淀剂60 ~ 100 μL，混合后离心。

作为本发明实施例的一种改进，在S2中，取血细胞50 μL加入内标工作液25 ~ 50μL，混合后加入红细胞裂解液150 ~ 250 μL，混匀裂解后离心，取100 μL上清加入动物血清20 ~ 30 μL，水解反应后加入蛋白沉淀剂60 ~ 100 μL，混合后离心。

作为本发明实施例的一种改进，在S21中，EDTA抗凝血0 ~ 5℃条件下运输或保存，并最长72小时内进行操作，离心的条件为在0 ~ 5℃条件下3000 ~ 5000 rpm下离心5 ~ 15min。具体条件可采用在4℃ 4000 rpm下离心10 min。

作为本发明实施例的一种改进，在S22中，加入混合内标工作液后混合一段时间，然后再加入红细胞裂解液混合一段时间。优选的，加入混合内标工作液后1000 ~ 2500 rpm混匀5 ~ 10 min，再加入红细胞裂解液1000 ~ 2500 rpm混匀5 ~ 30 min、优选10 ~ 20min。优选的，离心的条件为0 ~ 5℃下10000 ~ 16000 rpm离心5 ~ 10 min。具体条件可采用2500 rpm混匀5 min，加入红细胞裂解液后2500 rpm混匀裂解10 min，4℃下14000 rpm离心5 min。作为本发明实施例的一种改进，在S23中，混合的条件为1000 ~ 2500 rpm条件混合5 ~ 10 min，优选2500 rpm条件混合5 min；酶解的条件为35 ~ 38℃下孵育2 ~ 4小时，优选37℃下孵育2小时。

作为本发明实施例的一种改进，在S24中，混合的条件为1000 ~ 2500 rpm混匀5 ~10 min，优选2500 rpm混匀5 min。由于红细胞经蛋白沉淀后杂质较多，离心采用两次离心的方式，以起到进一步净化的作用。第一次离心的条件为0 ~ 5℃下10000 ~ 16000 rpm离心5 ~ 10 min，第二次离心的条件为0 ~ 5℃下3000 ~ 5000 rpm离心5 ~ 10 min。优选的，先2500 rpm混合5 min，4℃下14000 rpm离心5 min，取上清120 μL到96孔板或离心管中，再次4℃下3700 rpm离心5 min，进样分析。

作为本发明实施例的一种改进，在S12中，加入动物血清和红细胞裂解液后，1000~ 2000 rpm下涡旋混匀30s ~ 1 min；优选2000 rpm下涡旋混匀1 min。

作为本发明实施例的一种改进，在S13中，加入蛋白沉淀剂后，在转速为1000 ~2000 rpm下涡旋混匀5 ~ 10 min，0 ~ 5℃下10000 ~ 16000 rpm离心5 ~ 10 min。优选为在转速为2000 rpm下涡旋混匀5 min，4℃下14000 r/min离心5 min。

作为本发明实施例的一种改进，混合标准工作液的配制方法为：先采用溶解试剂分别配制叶酸标准品和5-甲基四氢叶酸标准品的标准储备液；再将标准储备液采用稀释剂分别稀释为标准中间液；将两种标准中间液混合，并用稀释液继续稀释，获得梯度浓度的混合标准工作液；

混合内标工作液的配制方法为：先采用溶解试剂分别配制叶酸内标标准品和5-甲基四氢叶酸内标标准品的标准储备液；再将标准内标储备液采用稀释剂分别稀释为内标中间液；将两种内标中间液混合，并用稀释液继续稀释，获得混合内标工作液；溶解试剂为甲醇和0.05 ~ 0.5 mol/L氨水（将0.417~ 4.167 mL的12 mol/L氨水、定容于100 mL的水中获得）体积比为1：1的混合溶液；稀释剂为甲醇和水体积比为3：7的混合溶液，水中含有质量百分比为0.1% ~ 2%的2,6-二叔丁基对甲酚和/或质量百分比为0.1% ~ 1%的二硫苏糖醇。

作为本发明实施例的一种改进，对待测样本和标准溶液进样液进行检测的色谱条件为：色谱分析所使用的色谱柱为硅胶反相C18柱；具体可选用Waters Atlantis-T3（2.1mm × 50 mm，3 μm）。

流动相：A相为含有体积百分比含量为0.1 ~ 0.2%甲酸的水溶液，B相为含有体积百分比含量为0.1 ~ 0.2%甲酸的甲醇溶液。

流速：0.35 ~ 0.45 mL/min，优选为0.4 mL/min。

柱温：40 ~ 50℃，优选为45℃。

进样量：1 ~ 10 µL，优选为5 µL。

分析时间：5.5 min。

梯度洗脱条件如表1所示。

表1

作为本发明实施例的一种改进，对待测样本和标准溶液进样液进行检测的质谱条件为：采用电喷雾离子源，正离子模式，多反应监测，电喷雾电压：5500 V；离子源温度：550℃；雾化气：50 psi；辅助气：60 psi；离子对如表2所示。

表2

本实施例还提出一种采用高效液相色谱串联质谱法检测红细胞中叶酸和5-甲基四氢叶酸的前处理方法，至少包括以下步骤：

S1’、将EDTA抗凝血离心，获得血细胞；

S2’、在血细胞中加入混合内标工作液和红细胞裂解液，裂解一段时间后离心取上清；红细胞裂解液为：含有140 ~ 160 mmol/L NH₄Cl、5 ~ 15 mmol/L KHCO₃和0.05 ~0.15mmol/L Na₂EDTA的水溶液；

S3’、在S2’中获得的上清中加入动物血清，混合后酶解一段时间；动物血清选自大鼠血清或人血清；

S4’、在S3’中获得的酶解产物中加入蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀，混合后离心，取上清为待测样本；蛋白沉淀剂选自质量体积百分比为3% ~ 10%的磺基水杨酸水溶液或体积百分比为3% ~ 10%高氯酸水溶液；

混合内标工作液先采用溶解试剂配制标准储备液，再采用稀释液稀释得到，溶解试剂为甲醇和0.05 ~ 0.5 mol/L氨水体积比为1：1的混合溶液；稀释剂为甲醇和水体积比为3：7的混合溶液，水中含有质量百分比为0.1% ~ 2%的2,6-二叔丁基对甲酚和/或质量百分比为0.1% ~ 1%的二硫苏糖醇。

下面通过具体实施对本发明实施例的技术方案做进一步的解释和说明，本发明的原料均为市售。

所采用的主要原料和仪器如下：

1.仪器设备：

高效液相色谱质谱联用仪，购自SCEIX，型号为AB5500；

离心机，购自湘智，型号为TG20-WS；

氮吹仪，购自杭州奥盛，型号为MD200-1A。

2.试剂与原料：

甲醇购自默克；水购自屈臣氏；叶酸、氯化铵、乙二胺四乙酸二钠盐二水合物购自Sigma；5-甲基四氢叶酸、叶酸-d4、5-甲基四氢叶酸-C13,d3购自TRC；甲酸购自DIKMA；2,6-二叔丁基对甲酚、二硫苏糖醇购自阿拉丁；碳酸氢钠购自国药集团；磺基水杨酸购自沪试；高氯酸购自飞船牌。在本发明实施例中，甲醇、甲酸的浓度均为体积百分比浓度。

3.所检测的实际样本1~5为随机的人血液样本。

实施例1

本实施例提出一种检测红细胞中叶酸及其5-甲基四氢叶酸的检测方法，包括以下步骤：

一、标准曲线的制备：

（一）标准工作液的配制：

下述溶液配制的溶解试剂采用甲醇：0.1 mol/L氨水=1：1；稀释剂采用甲醇：水(1%的2,6-二叔丁基对甲酚+0.5%二硫苏糖醇)=3：7。

1.1混合标准工作液的配制：

天平精密称量叶酸标准品1.17 mg，用2 mL溶解试剂进行溶解，配制浓度为578 μg/mL的标准储备液A。天平精密称量5-甲基四氢叶酸标准品2.12 mg，用4 mL溶解试剂进行溶解，配制浓度为504 μg/mL的标准储备液B。

取叶酸标准储备液A 100 μL，再准确吸取478 μL稀释剂得到浓度为100 μg/mL的标准中间液C。取5-甲基四氢叶酸标准储备液B 100 μL，再准确吸取404 μL稀释剂得到浓度为100 μg/mL的标准中间液D。

取叶酸标准中间液C 20 μL，5-甲基四氢叶酸标准中间液D 50 μL再准确吸取稀释剂930 μL得到混合标准溶液即标曲最高点，浓度为2000 ng/mL的叶酸和5000 ng/mL的5-甲基四氢叶酸。然后继续用稀释剂进行稀释，配制成叶酸浓度分别为2 ng/mL、4 ng/mL、20ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、200 ng/mL、800 ng/mL、2000 ng/mL的溶液，5-甲基四氢叶酸浓度分别为5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、2000 ng/mL、5000 ng/mL的混合标准工作液。上述溶液均在-20℃条件下保存。

1.2内标工作液的配制：

叶酸内标标准品（叶酸-d4，0.5 mg）全部溶于2 mL溶解试剂中，配制浓度为243 μg/mL的内标储备液E。天平精密称取5-甲基四氢叶酸内标标准品（5-甲基四氢叶酸-C13,d3，1 mg）溶于2 mL溶解试剂中。配制浓度为500 μg/mL的内标储备液F。

取叶酸内标储备液E 10 μL，再准确吸取233 μL稀释剂得到浓度为10 μg/mL的内标中间液G。取5-甲基四氢叶酸内标储备液F 10 μL，再准确吸取490 μL稀释剂得到浓度为10 μg/mL的内标中间液H。

取叶酸内标中间液G 20 μL，5-甲基四氢叶酸内标中间液H 20 μL再准确吸取960μL稀释剂得到混合内标工作液，浓度为200 ng/mL，上述溶液均在-20℃条件下保存。

（二）标准溶液的标定

首先用移液器分别移取20 μL标准工作液、20 μL内标工作液、20 μL大鼠血清或人血清，和60 μL红细胞裂解液，分别置于1.5 mL离心管中混合制成八种不同浓度的标准溶液；

将上述标准溶液分别在转速为2000 rpm下涡旋混匀1 min后，加入6%磺基水杨酸60 μL，在转速为2000 rpm下涡旋混匀5 min，4℃下14000 r/min高速离心5 min，吸取上清液120 μL；

利用高效液相色谱质谱联用仪对上述溶液进行检测，得到八种不同浓度的叶酸、5-甲基四氢叶酸和内标物的标准溶液色谱图，从上述叶酸、5-甲基四氢叶酸和内标物的标准溶液色谱图中分别得到叶酸、5-甲基四氢叶酸和内标物的峰面积，分别以上述八个不同浓度的叶酸、5-甲基四氢叶酸标准溶液的峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1，以上述叶酸、5-甲基四氢叶酸标准工作液中的浓度与内标工作液浓度的比值为作为标准曲线方程的横坐标x1，将以上检测所得的八种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1=a*x 1+ b，并且得出线性方程系数a、b；标准工作液为含有叶酸、5-甲基四氢叶酸的溶液，内标工作液为含有叶酸-d4、5-甲基-4-氢-叶酸-13C,d3的溶液。

二、待测样品处理

S21、获取血细胞：EDTA抗凝血0 ~ 5℃条件下运输或保存，72小时内进行操作，在4℃ 4000 rpm下离心10 min，分离出血浆层和血细胞层，弃其血浆层，保留血细胞层。

S22、裂解红细胞：配制红细胞专用裂解液，裂解液成分和浓度为150 mmol/LNH₄Cl + 10 mmol/L KHCO₃+ 0.1 mmol/LNa₂EDTA，移液枪准确移取50 μL血细胞，加入50 μL的内标工作液，2500 rpm混匀5 min，加入红细胞裂解液150 μL，2500 rpm混匀裂解10 min，4℃下14000 rpm离心5min。

S23、水解孵育：取100 μL上清，加入20 μL的大鼠血清或人血清，2500 rpm混匀5min，37℃下孵育2 h。

S24、沉淀：加入6%磺基水杨酸60 μL，2500 rpm混匀5 min，4℃下14000 rpm离心5min，取上清120 μL到96孔板中，4℃下3700 rpm离心5 min，上机进样分析，进样量5 μL。

三、待测样品的检测

色谱分析所使用的色谱柱为Waters Atlantis-T3，2.1 mm × 50 mm，3 μm；流动相为水（0.2%甲酸）和甲醇（0.2%甲酸），梯度洗脱如表3所示，流速为0.4 mL/min，柱温为45℃，进样量为5 µL；分析时间5.5 min。

表3

质谱检测器是SCEIX AB5500检测器，采用电喷雾离子源（ESI），正离子模式，多反应监测（MRM），电喷雾电压（IonSpray Voltage）：5500 V；离子源温度（TEM）：550℃；雾化气（Gas1）：50 psi；辅助气（Gas2）：60 psi。离子对信息如表2所示。

检测得到标准溶液中叶酸的色谱图如图1所示，标准溶液中5-甲基四氢叶酸的色谱图如图2所示；待测样本红细胞中叶酸的色谱图如图3所示；待测样本红细胞中5-甲基四氢叶酸的色谱图如图4所示。

实施例2

本实施例用于论证实施例1方法的效果：

1、该方法的线性

按照实施例1测定条件，叶酸在2 ng/mL到2000 ng/mL范围内，5-甲基四氢叶酸浓度在5 ng/mL到5000 ng/mL范围内，按浓度由低到高进行测定，以叶酸和5-甲基四氢叶酸的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值叶酸和5-甲基四氢叶酸的浓度与内标物的浓度的比值作图，得到标准曲线；结果表明叶酸在2 ng/mL到2000 ng/mL范围内，5-甲基四氢叶酸在5 ng/mL到5000 ng/mL范围内，线性良好，相关系数R²﹥0.99。

2、该方法的检出限、定量限

按照实施例1测定条件，叶酸的检出限为0.392 ng/mL，5-甲基四氢叶酸的检出限为0.264 ng/mL。

按照实施例1测定条件，叶酸的定量限为0.65 ng/mL，5-甲基四氢叶酸的定量限为0.45 ng/mL。

3、该方法的回收率和精密度

分别取叶酸和5-甲基四氢叶酸标准工作液配制成低、中、高3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按本实施例方法进行测定，重复分析测定3个平行，叶酸和5-甲基四氢叶酸回收率和精密度分别如表3所示。

叶酸在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为98.6% ~ 107.4%，相对标准偏差为1.40% ~ 2.52%，5-甲基四氢叶酸在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为93.5% ~ 96.8%，相对标准偏差为2.38% ~ 6.31%，结果见表4。

表4：加标回收率和精密度

综合上述验证试验，本实施例的回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，本实施例的方法重现性良好，加样回收率高，提高了检测结果的准确度。全血经离心，得到血细胞，再用红细胞专用裂解剂裂解后直接测定红细胞中叶酸和5-甲基四氢叶酸含量，使检测过程简便快速，实验成本降低，分析时间短，更利于大通量的样本检测。

4、该方法参加美国病理学家协会（CAP）组织的红细胞中叶酸含量测定室间质评活动，结果满意。进一步证明了方法的准确性。

实施例3

本实施例用于说明红细胞裂解液裂解时间的技术效果：

采用实施例1中的方法对样本进行检测，区别在于：样品前处理过程中红细胞裂解液裂解时间分别为5 min、10 min、15min、20 min、30 min。对实际样本进行检测，获得实验结果如表5所示。

表5

结果表明，红细胞裂解液裂解时间为5 min、10 min、15 min、20 min、30 min，均能获得预期效果。

实施例4

本实施例用于说明洗脱条件的技术效果：

采用实施例1中的方法对样本进行检测，区别在于梯度洗脱如表6所示：

表6

梯度洗脱条件1中检测2 ng/mL的叶酸标准溶液的色谱图如图5所示，检测5 ng/mL的5-甲基四氢叶酸标准溶液的色谱图如图6所示，梯度洗脱条件2中，检测2 ng/mL的叶酸标准溶液的色谱图如图7所示，检测5 ng/mL的5-甲基四氢叶酸标准溶液的色谱图如图8所示。

结果说明：采用梯度洗脱初始条件为90 ~ 100 v/v% A相，均能得到预期效果。

实施例5

本实验例用于说明制备标曲和配制混合内标工作液时所使用稀释剂的技术效果：

稀释剂1：甲醇和水体积比为3：7；

稀释剂2：甲醇和水体积比为3：7，水中含有质量百分比为1%的2,6-二叔丁基对甲酚；

稀释剂3：甲醇和水体积比为3：7，水中含有质量百分比为0.5%的二硫苏糖醇；

稀释剂4：甲醇和水体积比为3：7，水中含有质量百分比为1%的2,6-二叔丁基对甲酚 + 0.5%的二硫苏糖醇。

采用上述稀释剂配制标准品工作液，将配制得到的标准品工作液室温放置3 h，6h，12 h，24 h，36h，48 h，72 h，采用实施例1中的方法对标准品工作液进行考察，测定其稳定性，结果如表7所示：

表7

结果表明，稀释剂为甲醇和水体积比为3：7时叶酸和5-甲基四氢叶酸稳定性较差，添加了1%的2,6-二叔丁基对甲酚或0.5%的二硫苏糖醇可保证稳定性。

实施例6

本实验例用于说明人血清和大鼠血清分别作为γ-谷氨酸水解酶用于将红细胞中贮存的多谷氨酸叶酸形式转换成单谷氨酸叶酸形式的技术效果：

采用实施例1中的方法对质控样本进行检测，区别在于将人血清和大鼠血清作为γ-谷氨酸水解酶，作为γ-谷氨酸水解酶。结果如表8所示：

表8

结果说明：人血清和大鼠血清作为γ-谷氨酸水解酶，均能得到预期效果。

对比例1

本对比例用于说明不同样品前处理步骤的技术效果。

D1-1：采用已有专利1“一种叶酸及其代谢物的样本前处理方法以及检测方法和试剂盒（CN114646713A）”中实施例1的方法对实际样本进行前处理和上机检测；

D1-2：采用实施例1中的方法，区别在于：采用1%抗坏血酸进行前处理，对实际样本进行前处理和上机检测；

D1-3、采用实施例1中的方法，区别在于：制备标准曲线方程所使用的标准溶液中不添加动物血清，只在样本前处理过程中添加动物血清；

对实际样本进行前处理和上机检测。实验结果如表9所示：

表9

由实验结果可知，D1-1的检测结果较本发明实施例1的结果偏高，原因是用大鼠血清替代酶加入到样本，未考虑大鼠血清中叶酸带来的影响，另外忽略了人血浆叶酸的贡献，使测定结果偏高。

D1-1的前处理步骤复杂，需要折算红细胞中叶酸含量，因此准确度差。

D1-2中，1%抗坏血酸不能选择性的裂解红细胞，因此测定结果偏高。

D1-3中，动物血清中本身含有叶酸和5-甲基四氢叶酸，大鼠血清中叶酸色谱图如图9所示，5-甲基四氢叶酸色谱图如图10所示，故只在样本前处理中添加动物血清而不在标准溶液中添加，会使测定结果偏高。

对比例2

以下对比例说明加入大鼠血清、水解孵育时间的技术效果。

采用实施例1中的方法对实际样本进行检测，区别在于：样品前处理过程中加入大鼠血清，37℃水解孵育时间分别为0 h、1h、2 h、3 h、4 h、5h。对实际样本进行检测，获得实验结果如表10所示。

表10

结果表明，加入大鼠血清，37℃水解孵育时间分别为0 h、1 h对叶酸的含量测定有影响，0 h、5 h对5-甲基四氢叶酸的含量测定有影响，确定37℃水解孵育时间为2 ~ 4 h。

对比例3

本对比例用于说明蛋白沉淀剂的技术效果：

采用实施例1中的方法对样本进行检测，区别在于，蛋白沉淀剂采用如表11所示的试剂，计算检测结果的回收率和精密度，实验结果如表11所示。

表11

其中，磺基水杨酸水溶液的浓度为质量体积百分比，高氯酸水溶液的浓度为体积百分比。

结果表明，磺基水杨酸的提取回收率效果最好，3% ~ 10%的磺基水杨酸无明显差异；6%的磺基水杨酸沉淀蛋白第一次离心效果如图11所示，第二次离心效果如图12所示；高氯酸提取回收率稍低；氯仿和甲醇混合液回收率偏高，精密度差；1%的磺基水杨酸、1%的高氯酸、甲醇、乙腈、硫酸锌无法彻底去除红细胞中蛋白，甲醇沉淀蛋白第一次离心效果如图13所示，第二次离心效果如图14所示，无法满足上机需求，若加大甲醇或乙腈的用量，会导致响应降低，并产生严重的溶剂效应，无法满足叶酸检测需求。

对比例4

本对比例用于说明溶解试剂的技术效果：

采用如下溶剂作为溶解试剂制备标准品溶液，实验结果如表12所示：

表12

结果表明：溶解试剂使用50%甲醇、100%甲醇、纯水均不能有效溶解叶酸和5-甲基四氢叶酸标准品。

对比例5

按照实施例1的方法进行检测，区别在于：

D5：将S22和S23合并，在血细胞中同时加入混合内标工作液和红细胞裂解液和动物血清，37℃下孵育2小时。对加标20 ng/mL叶酸的样本进行检测，实验结果如表13所示：

表13

结果表明，在血细胞中同时加入混合内标工作液和红细胞裂解液和动物血清，37℃下孵育2小时会使红细胞裂解不完全，萃取率较低，相对标准偏差较大。

对比例6

以下对比例用于说明色谱条件的技术效果：

D6-1：流动相为：A相：含0.2 v/v%甲酸的水；B相：含0.2 v/v%甲酸的乙腈。其余检测条件同实施例1，对标准溶液进行检测，获得实验结果如图15、16所示。2 ng/mL的叶酸标准溶液如图15所示，5 ng/mL的5-甲基四氢叶酸标准溶液如图16所示。

结果显示：流动相B相采用乙腈时，叶酸信号由甲醇中13600降低到816，5-甲基四氢叶酸信号由甲醇中19300降低到839，信号降低20倍左右。

D6-2：流动相为：A相：水；B相：甲醇。其余检测条件同实施例1，对标准溶液进行检测，获得实验结果如图17、图18所示。2 ng/mL的叶酸标准溶液如图17所示，5 ng/mL的5-甲基四氢叶酸标准溶液如图18所示。

结果显示：流动相A相采用纯水，B相采用纯甲醇时，峰形展宽、变差，叶酸信号由甲醇中13600降低到3070，5-甲基四氢叶酸信号由甲醇中19300降低到530，叶酸信号降低4倍左右，5-甲基四氢叶酸信号降低36倍左右。

D6-3：流动相与实施例1相同，不采用梯度洗脱，采用1 v/v% B相等度洗脱。其余检测条件同实施例1，对标准溶液进行检测，获得实验结果如图19、20所示。2 ng/mL的叶酸标准溶液如图19所示，5 ng/mL的5-甲基四氢叶酸标准溶液如图20所示。

结果显示：目标物5.5 min内不出峰。

D6-4：流动相为与实施例1相同，初始梯度条件为15 v/v% B相。其余检测条件同实施例1，对标准溶液进行检测，获得实验结果如图21、22所示。2 ng/mL的叶酸标准溶液如图21所示，5 ng/mL的5-甲基四氢叶酸标准溶液如图22所示。

结果显示：5-甲基四氢叶酸0.49 min出峰，不保留，同时信号降低。

D6-5：离子对选择叶酸：442.3/295.1；5-甲基四氢叶酸：460.4/313.1。其余检测条件同实施例1，对实际样本进行检测，获得实验结果如图23、24所示，叶酸的色谱图如图23所示，5-甲基四氢叶酸的标准曲方程如图24所示。

结果显示，叶酸的该离子对在实际样本中干扰较多，对测定结果的准确性产生影响。5-甲基四氢叶酸的该离子对标准曲方程线性较差。

以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (5)

1.一种红细胞中叶酸和5-甲基四氢叶酸的检测方法，其特征在于，至少包括以下步骤：

S1、制备标准曲线方程，制备标准曲线方程所使用的标准溶液中添加有动物血清，包括：

S11、配制梯度浓度的混合标准工作液、混合内标工作液；

所述混合标准工作液中含有叶酸标准品和5-甲基四氢叶酸标准品，所述混合内标工作液中含有叶酸内标标准品和5-甲基四氢叶酸内标标准品；

所述混合标准工作液的配制方法为：先采用溶解试剂分别配制叶酸标准品和5-甲基四氢叶酸标准品的标准储备液；再将所述标准储备液采用稀释剂分别稀释为标准中间液；将两种所述标准中间液混合，并用稀释液继续稀释，获得梯度浓度的混合标准工作液；

所述混合内标工作液的配制方法为：先采用溶解试剂分别配制叶酸内标标准品和5-甲基四氢叶酸内标标准品的标准储备液；再将所述标准内标储备液采用稀释剂分别稀释为内标中间液；将两种所述内标中间液混合，并用稀释液继续稀释，获得混合内标工作液；

所述溶解试剂为甲醇和0.05 ~ 0.5 mol/L氨水体积比为1：1的混合溶液；

所述稀释剂为甲醇和水体积比为3：7的混合溶液，水中含有质量体积百分比为0.1% ~2%的2,6-二叔丁基对甲酚和/或质量体积百分比为0.1% ~ 1%的二硫苏糖醇；

S12、将梯度浓度的所述混合标准工作液中分别加入所述混合内标工作液，再加入动物血清和红细胞裂解液，制备得到梯度浓度的标准溶液；

所述红细胞裂解液为：含有140 ~ 160 mmol/L的NH₄Cl、5 ~ 15 mmol/L的KHCO₃和0.05~ 0.15 mmol/L的Na₂EDTA的水溶液；

S13、将所述标准溶液中加入蛋白沉淀剂，混合后离心，取上清为所述标准溶液进样液；

S14、使用高效液相色谱质谱联用仪对所述标准溶液进样液进行检测，获得标准曲线方程；

S2、样本前处理，包括：

S21、将EDTA抗凝血离心，获得血细胞，分离出血浆层和血细胞层，弃血浆层，保留血细胞层；EDTA抗凝血0 ~ 5℃条件下运输或保存，72小时内进行操作，所述离心的条件为在0 ~5℃条件下3000 ~ 5000 rpm下离心5 ~ 15 min；

S22、在血细胞中加入混合内标工作液和红细胞裂解液，裂解5 ~ 30分钟后离心取上清；所述离心的条件为0 ~ 5℃下10000 ~ 16000 rpm离心5 ~ 10min；

S23、在S22中获得的上清中加入动物血清，混合后酶解一段时间；所述酶解的条件为35~ 38℃下孵育2 ~ 4小时；使用动物血清作为γ-谷氨酰水解酶将红细胞中贮存的多谷氨酸叶酸形式转换成单谷氨酸叶酸形式；

S24、在S23中获得的酶解产物中加入蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀，混合后离心，取上清为待测样本；离心的条件为0 ~ 5℃下10000 ~ 16000 rpm离心5 ~ 10 min；

在S1和S2的每个检测体系内，所加入的蛋白沉淀剂的体积均相同；

在S1的每个检测体系内，所述混合标准工作液与所述红细胞裂解液的体积比为V₁，在S2的每个检测体系内，所述S22中血细胞与红细胞裂解液的体积比为V₂，V₁ = V₂ = 1：3 ~ 5；

在S12中，所述混合标准工作液与所述混合内标工作液的体积比为1：0.5 ~ 1；所述混合标准工作液与所述动物血清的体积比为1：1 ~ 1.5；

在S22中，所述血细胞与所述混合内标工作液的体积比为1：0.5 ~ 1；

在S23中，所述S22中获得的上清与动物血清的体积比为10：2 ~ 3；

在S22中，所述S22中获得的上清与红细胞裂解液的体积比为2：3 ~ 5；

在S24中，所述S22中获得的上清与蛋白沉淀剂的体积比为1：0.6 ~ 1；

S3、检测所述待测样本，包括：使用高效液相色谱质谱联用仪对所述待测样本进行检测，将检测结果代入所述标准曲线方程，得到所述待测样本中红细胞中叶酸和5-甲基四氢叶酸的浓度；

在S1和S2的每个检测体系内，所加入的动物血清的体积相同；

所述蛋白沉淀剂选自质量体积百分比为3% ~ 10%的磺基水杨酸水溶液或体积百分比为3% ~ 10%高氯酸水溶液；

对所述待测样本和所述标准溶液进样液进行检测的色谱条件中的流动相为：色谱分析所使用的色谱柱为硅胶反相C18柱；

A相为含有体积百分比含量为0.2%甲酸的水溶液，B相为含有体积百分比含量为0.2%甲酸的甲醇溶液；

流速：0.35 ~ 0.45 mL/min；

柱温：40 ~ 50℃；

进样量：1 ~ 10 µL；

分析时间：5.5 min；

梯度洗脱条件为采用梯度洗脱条件1或梯度洗脱条件2进行洗脱：

对所述待测样本和所述标准溶液进样液进行检测的质谱条件为：

采用电喷雾离子源，正离子模式，多反应监测，电喷雾电压：5500 V；离子源温度：550℃；雾化气：50 psi；辅助气：60 psi；

离子对为：叶酸：母离子/子离子442.3/176.1；5-甲基四氢叶酸：母离子/子离子460.3/194.3。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述动物血清选自大鼠血清或人血清。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，

在S1中，分别取混合标准工作液20 μL，加入内标工作液10~20 μL、动物血清20 ~ 30 μL和红细胞裂解液60 ~ 100 μL，混合制成梯度浓度的标准溶液，混合后加入蛋白沉淀剂60~ 100 μL，混合后离心；

在S2中，取血细胞50 μL加入内标工作液25 ~ 50 μL，混合后加入红细胞裂解液150 ~250μL，混匀裂解后离心，取100 μL上清加入20 ~ 30 μL动物血清，水解反应后加入60 ~100 μL的蛋白沉淀剂，混合后离心。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，

在S22中，加入混合内标工作液后1000 ~ 2500 rpm混匀5 ~ 10 min，再加入红细胞裂解液1000 ~ 2500 rpm混匀5 ~ 30 min；

在S23中，所述混合的条件为在1000 ~ 2500 rpm混合5 ~ 10 min，

在S24中，所述混合的条件为在1000 ~ 2500 rpm混匀5 ~ 10 min；所述离心为两次，第一次离心的条件为0 ~ 5℃下10000 ~ 16000 rpm离心5 ~ 10 min，取上清120 μL进行第二次离心，第二次离心的条件为0 ~ 5℃下3000 ~ 5000 rpm离心5 ~ 10 min。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，

在S12中，加入动物血清和红细胞裂解液后，1000 ~ 2000 rpm下涡旋混匀30s ~ 1min；

S13中，加入蛋白沉淀剂后，在转速为1000 ~ 2000 rpm下涡旋混匀5 ~ 10 min，0 ~ 5℃下10000 ~ 16000 rpm离心5 ~ 10 min。

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