ES2352335T3 - Detección de un analito en una muestra de sangre entera hemolizada. - Google Patents

Abstract

Método para detectar un analito en una muestra de sangre entera hemolizada, que comprende las etapas de a) aplicar la muestra de sangre entera hemolizada, de la cual se sabe o se supone que contiene el analito de interés, a una columna rellena de material cromatográfico de acceso restringido (RAM) al que se fija el analito, b) eluir el analito del RAM y c) detectar el analito, de modo que al menos en la etapa (a) se usa un tampón de pH superior a 8,0.

Description

La presente invención se refiere a un método para detectar un analito en una muestra de sangre entera hemolizada. El método comprende las etapas de introducción de una muestra de sangre entera hemolizada (de la cual se sabe o se supone que lleva un analito de interés) en una columna que contiene un material cromatográfico de acceso restringido (RAM) al que se fija el analito, la elución del analito del RAM y la detección del analito, y al menos en su primera etapa se emplea un tampón de pH superior a 8,0. El nuevo método garantiza que la hemoglobina no interfiera en la detección del analito de interés y se puede emplear con facilidad para detectar en línea muchos analitos, p.ej. de una muestra de sangre entera hemolizada, como en la detección de un antibiótico, de folato o de fármacos inmunosupresores como tacrolimus o sirolimus.

Antecedentes de la presente invención

Cuanto más componentes hay en una muestra, más difícil resulta el análisis de un analito diana contenido en ella. Los eritrocitos contienen una cantidad impresionante de proteínas y componentes de bajo peso molecular que pueden interferir en la detección de un analito de interés en un fluido biológico como la sangre entera. Esta es una de las principales razones por la cual en los análisis clínicos rutinarios se usa con preferencia plasma sanguíneo, llamado simplemente plasma (es decir, una muestra de sangre entera anticoagulada, privada de células y eritrocitos) o suero sanguíneo, llamado simplemente suero (es decir, sangre entera coagulada, privada de células, eritrocitos y de la mayor parte de proteínas del sistema de coagulación, particularmente fibrina/fibrinógeno), respectivamente. Las muestras de sangre entera también resultan más difíciles de tratar, p.ej. en comparación con las de suero o plasma. La sangre entera tiende a ser menos estable y la ruptura lenta de los eritrocitos perjudica una medición fiable de muchos analitos interesantes.

Como se ha dicho arriba, el suero o el plasma se pueden obtener de la sangre entera y se pueden usar en la detección de un analito. En teoría las células y los eritrocitos también pueden eliminarse por filtración o centrifugación de la sangre entera. Sin embargo estos métodos no son apropiados para usar en un ajuste diagnóstico rutinario, ni permitirían la medición correcta de analitos presentes, al menos parcialmente, en el interior de los eritrocitos.

La gran mayoría de procedimientos conocidos del estado técnico para detectar un analito en una muestra de sangre entera requieren un tratamiento adicional de la muestra antes de poder cuantificar el analito. En muchos procedimientos el analito de interés se separa primero de la mayoría de sustancias potencialmente interferentes mediante métodos de precipitación o extracción selectiva. La extracción puede llevarse a cabo en fase líquida o sobre una fase sólida, lo cual se ejemplificará ilustrando algunos de los procedimientos utilizados para detectar determinados fármacos inmunosupresores o

folato, respectivamente.

Fármacos inmunosupresores bien conocidos son p.ej. micofenolato mofetil (MMF), rapamicina (RAPA, asimismo conocido como sirolimus) y tacrolimus (FK-506). El control terapéutico de los fármacos inmunosupresores es especialmente importante en los pacientes trasplantados y también en los pacientes de SIDA (véase p.ej.: Drug. Ther. Perspect. 17(22) (2001) 8-12). La mayoría de pacientes que reciben un trasplante de órganos sólidos necesitan terapia inmunosupresora de por vida para evitar el rechazo alogénico. No obstante, como muchos agentes inmunosupresores tienen unos márgenes terapéuticos estrechos y están relacionados con varias toxicidades e interacciones potenciales entre diferentes fármacos, el uso del control de fármacos terapéuticos (TDM) junto con la evaluación clínica de los pacientes puede ser de especial importancia.

El tacrolimus es un antibiótico macrólido que se aprobó primero por la “US Food and Drug Administration (FDA)” [Administración de alimentos y fármacos de EEUU] en 1994 para evitar el rechazo alogénico del trasplante de hígado. Es hasta 100 veces más potente que la ciclosporina in vitro y clínica-mente se relaciona con una mayor disminución de la incidencia del rechazo hístico. La eficacia del tacrolimus se ha demostrado tanto en terapia inmunosupresora primaria para pacientes sujetos a diversos procedimientos de trasplante, como en terapia de recuperación para pacientes con rechazo alogénico agudo y refractario tras un trasplante de hígado o de riñón. La concentración terapéutica mínima está comprendida en el intervalo de 5-20 µg/l.

Dado que al menos una parte del tacrolimus presente en

la circulación está distribuido en los eritrocitos, para el análisis clínico rutinario de este fármaco se usa una muestra de sangre entera. P.ej., el tacrolimus se puede detectar por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), por HPLC conectado a espectrometría de masas (MS), mediante un ensayo radiorreceptor (RRA) o un inmunoensayo (IA). Las dos últimas metodologías no detectan con la misma sensibilidad el tacrolimus ni algunos de sus metabolitos, lo cual puede interferir en el procedimiento utilizado (Murthy J. N., y otros, Clin. Biochem. 31 (1998) 613-617). El procedimiento HPLC-MS puede considerarse el método de referencia, al menos para detectar los distintos metabolitos del tacrolimus. Sin embargo todos los procedimientos arriba mencionados requieren la extracción del tacrolimus de la sangre entera. Normalmente en la rutina clínica para extraer el tacrolimus de la sangre entera se usa acetonitrilo y al parecer no existe ningún método para medir en línea el tacrolimus de una muestra de sangre entera. El sirolimus es un antibiótico macrólido como el tacrolimus. Fue aprobado por primera vez en 1999 por la FDA norteamericana para evitar el rechazo alogénico tras el trasplante de riñón y realmente ha dado resultados prometedores a este respecto, cuando se ha usado intensamente en combinación con ciclosporina y corticosteroides. In vitro, el sirolimus es hasta 100 veces más potente que la ciclosporina y clínicamente puede mostrar un sinergismo con ella, que quizás permita disminuir la dosificación de ciclosporina. La concentración terapéutica mínima está comprendida en el intervalo de 5-15 µg/l.

Al igual que el tacrolimus, hay una cantidad importante

de sirolimus en los eritrocitos. Por lo tanto es necesaria la extracción de una muestra de sangre entera, independientemente del método de detección. En la rutina clínica una muestra que contenga hipotéticamente sirolimus se somete a HPLC y el sirolimus se detecta por luz ultravioleta (UV) o por espectroscopia de masas tándem (MS/MS). Recientemente también se ha descrito un inmunoensayo enzimático por micropartículas (Jones K. y otros, Clinical Therapeutics 22, Suppl. B (2000) B49-B61).

Folato es el nombre genérico de un grupo de moléculas análogas que difieren en su estado de oxidación. Los folatos forman parte del grupo de las vitaminas hidrosolubles B y son importantes como coenzimas para el metabolismo de la homocisteína y para la transferencia de grupos monocarbonados que requiere la replicación de ADN. Un nivel inadecuado de folato está relacionado con un mayor riesgo de defectos del tubo neural y se asocia con enfermedad cardiovascular, anemia, con ciertos cánceres y con la enfermedad de Alzheimer. Las concentraciones de folato en suero o plasma reflejan la ingesta dietética reciente y las concentraciones de folato en eritrocitos indican más bien los trastornos corporales (Gunter E.W. y otros, Clin. Chem. 42 (1996) 1689-1694; Fazili Z. y otros, Clin. Chem. 51 (2005) 2318-2325; Pfeiffer C.M. y otros, Clin. Chem. 50 (2004) 423-432). El folato total en eritrocitos (el folato en glóbulos rojos = folato RBC) es la mejor medida del nivel total de folatos en el cuerpo. En estudios recientes se ha comprobado que el 5-metil-tetrahidrofolato es el vitámero

de folato predominante en los eritrocitos circulantes. Para

diagnosticar la falta de folato se recomienda efectuar las determinaciones no solo en suero o en plasma, sino también en eritrocitos, ya que más del 95% del folato está localizado en ellos. La concentración en los eritrocitos refleja de manera más fidedigna el nivel real de folato.

Se dispone de varios métodos para medir folato en diferentes matrices. Los métodos analíticos principales son los ensayos microbiológicos y radioinmunológicos y los métodos de quimioluminiscencia, cromatografía y espectrometría de masas. La mayoría de los métodos están basados en la unión competitiva del folato a la proteína fijadora de folato. Para medir folato RBC es obviamente necesario el empleo de un reactivo hemolizante. Por ejemplo, en el ensayo Elecsys® (Elecsys es una marca comercial de un miembro del grupo Roche) como reactivo de lisis para determinar el folato RBC se utiliza ácido ascórbico. El reactivo hemolizante Elecsys para folato RBC se emplea junto con el ensayo de folato Elecsys para la determinación cuantitativa de folato en eritrocitos (folato RBC). La sangre entera tratada con anticoagulantes (heparina o EDTA) se diluye con disolución de ácido ascórbico (al 0,2%) y se incuba durante aproximadamente 90 minutos a 20-25ºC. La lisis de los eritrocitos libera el folato intracelular. El hemolizado se usa luego como muestra “prediluida” (análogamente al suero) para la medición subsiguiente en el ensayo de folato Elecsys. El valor de hematocrito hallado en la sangre entera y el efecto diluidor del pretratamiento de la muestra es compensado en el cálculo de la concentración de folato en eri

trocitos (Greiling H., Gressner A.M., Lehrbuch der Klinischen

Chemie und Pathobiochemie [Manual de química clínica y patobioquímica], 3ª ed., Stuttgart-Nueva York, Schattauer (1995), páginas 460-462; Gunter E.W. y otros, Clin. Chem. 42(1996) 1689-1694).

El hemolizado producido por el tratamiento con ácido ascórbico no puede usarse para procedimientos cromatográficos rutinarios porque lleva sustancias interferentes. Para poder emplearlo en un proceso cromatográfico o en una determinación por espectrometría de masas habría que eliminar los residuos celulares y precipitar las proteínas antes del análisis.

Los residuos y las proteínas precipitadas suelen eliminarse de una muestra por centrifugación, filtración fuera de línea o extracción de la fase sólida.

La extracción de fase sólida (SPE) es una técnica cromatográfica ampliamente utilizada, p.ej. para preconcentrar y limpiar muestras analíticas, para purificar diversas sustancias químicas y para separar sustancias tóxicas o valiosas de las soluciones acuosas. La SPE se efectúa normalmente en una columna o cartucho que contiene una resina apropiada. Se han desarrollado procedimientos de SPE con el uso de absorbentes capaces de interactuar con analitos por hidrofobia, intercambio iónico, quelación, sorción y otros mecanismos, fijándolos y separándolos de los fluidos. Como las diversas aplicaciones de SPE pueden requerir diferentes absorbentes para distintas clases de analitos, se necesitan absorbentes con propiedades específicas que posean selectividades únicas para el analito

o clase de analitos de interés. En las patentes US 6,322,695

y US 6,723,236 se pueden encontrar, respectivamente, ejemplos

representativos de materiales SPE y columnas SPE.

Como se desprende de la discusión anterior de los procedimientos del estado técnico actual, la mediación directa, en concreto la mediación en línea de estos analitos a partir de una muestra de sangre entera no es en absoluto posible o como mínimo adolece de etapas de tratamiento complicadas y/o muy lentas. Sin querer relacionarla con la teoría siguiente, bien puede ser que la falta de procedimientos adecuados se deba al menos a dos razones: a) una muestra de sangre entera hemolizada contiene a menudo agregados o precipitados y b) la concentración extremadamente alta de hemoglobina interfiere en el proceso de detección.

Los inventores de la presente invención han afrontado y resuelto ambos problemas. En primer lugar se ha desarrollado un método llamado hemolisis diferencial, que permite p.ej. la lisis completa de los eritrocitos contenidos en una muestra de sangre entera, sin formación de agregados o precipitados interferentes. El procedimiento de la hemolisis diferencial se describe más adelante con cierto detalle.

No obstante los inventores de la presente invención también han encontrado que la elevada concentración de hemoglobina obviamente existente en una muestra de sangre hemolizada tiende a interferir en la detección sensible de un analito de interés. Esto se ha observado usando precisamente los materiales cromatográficos más avanzados, los llamados materiales cromatográficos de acceso restringido (RAMs). Si una muestra de sangre hemolizada se introduce en una columna que contiene

un RAM, siguiendo los procedimientos estándar, la hemoglobina

no se elimina totalmente, sino más bien tiende a fijarse a la columna y por tanto interfiere en la detección del analito.

Los inventores de la presente invención se enfrentaban por tanto al problema de que la hemoglobina existente p.ej. en una muestra de sangre hemolizada – incluso después de la hemolisis diferencial – puede interferir en la detección de un analito de interés. Como es evidente para el especialista, este problema es más acentuado cuanto más sensible y precisa deba ser la medición.

Sin embargo sería muy deseable que la sangre entera se pudiera utilizar directamente como muestra, especialmente en la detección de analitos de bajo peso molecular. Además sería especialmente ventajoso para un procedimiento de detección en línea con el uso de una etapa de separación por cromatografía líquida (LC). También es evidente p.ej. que la detección en línea de un fármaco inmunosupresor en sangre entera sería un progreso importante para un laboratorio de rutina clínica.

Se ha encontrado sorprendentemente, y se pudo comprobar, que la interferencia por hemoglobina, p.ej. de la hemoglobina contenida en una muestra de sangre entera hemolizada, puede evitarse de manera eficiente. Se ha encontrado, y se describe más adelante en detalle, que en condiciones de tamponamiento especiales la hemoglobina no se fija a los RAMs o al menos no interfiere en la detección en línea del analito de interés. En estas condiciones los RAMs se pueden emplear elegantemente para detectar un analito de interés en una muestra de sangre entera hemolizada.

Resumen de la presente invención

En una primera forma de ejecución la presente invención se refiere a un método para detectar un analito en una muestra de sangre entera hemolizada. El método comprende las etapas de introducir la muestra de sangre entera hemolizada (de la cual se sabe o se supone que lleva el analito de interés) en una columna que contiene un material cromatográfico de acceso restringido (RAM) al que se fija el analito, eluir el analito del RAM y detectar el analito, y al menos en la etapa de aplicación de la muestra al RAM se utiliza un tampón de pH superior a 8,0.

En formas de ejecución preferidas se describe p.ej. que el RAM se selecciona entre sílice porosa o partículas porosas de tipo polimérico, cuya superficie interna y/o externa puede tener ciertas modificaciones ventajosas. El método aquí descrito puede emplearse para detectar ciertos analitos clínica-mente importantes.

Descripción detallada de la presente invención

El método según la presente invención se lleva a cabo in vitro, es decir no en el cuerpo humano o animal.

En una primera forma de ejecución la presente invención se refiere a un método para detectar un analito en una muestra de sangre entera hemolizada. El método comprende las etapas de a) introducir la muestra de sangre entera hemolizada (de la cual se sabe o se supone que lleva el analito de interés) en una columna que contiene un material cromatográfico de acceso restringido (RAM), al que se fija el analito, b)

eluir el analito del RAM y c) detectar el analito, y al menos

11 en la etapa (a) se usa un tampón de pH superior a 8,0. A no ser que el contexto dicte otra cosa los artículos “un” y “una” se emplean aquí para referirse a uno más de un (es decir, por lo menos uno) objeto gramatical del artículo. Por ejemplo, “un analito de interés” significa un o más de un analito de interés. Un “material de acceso restringido”, o material cromatográfico de acceso restringido (RAM) conforme a la presente invención, es un material cromatográfico poroso que tiene una superficie interna capaz de fijar el analito de interés y un tamaño de poro adecuado para evitar que la fracción proteica de la sangre hemolizada penetre en dichos poros. Los materiales de acceso restringido originalmente descritos (Boos K.S. y Rudolphi, A., LC-GC 15 (1997) 602-611, y Rudolphi A. y Boos K.S., LC-GC 15 (1997) 814-823) poseen una superficie interna hidrófoba que actúa como un material cromatográfico de fase inversa. La cromatografía basada en tales RAM puede considerarse una combinación de cromatografía de fase inversa y cromatografía de exclusión de tamaños. Los diversos tipos de RAM disponibles son conocidos del especialista. El RAM empleado en un método según la presente invención se elige entre sílice porosa y partículas de tipo polimérico. Las partículas RAM utilizadas en un método según la presente invención se caracterizan además por tener un recubrimiento hidrófilo. El recubrimiento hidrófilo del RAM, es decir, del RAM

fuera de los poros, se basa preferiblemente en un material de

recubrimiento que aporte grupos hidroxilados como alquildiol, grupos carboxilo como carboximetilo, grupos amino como aminopropilo o bis(hidroxietil)aminoetilo respectivamente. También se prefiere el uso de polímeros hidrófilos como polietilenglicol, polivinilalcohol, oligo- y polisacáridos, dextrano, péptidos o proteínas, respectivamente, para hidrofilizar el RAM fuera de los poros. Como ejemplos preferidos de materiales RAM comercialmente asequibles que pueden utilizarse en un método como el aquí descrito cabe mencionar Biotrap 500 MS® (Chromtech, Cogleton, Reino Unido) o LiChrosphere® RP-18 ADS (Merck, Darmstadt, Alemania).

La superficie interna del RAM es capaz de fijar el analito de interés. El especialista seleccionará la superficie interna del RAM empleado en un método conforme a la presente invención de manera que se ajuste a las propiedades químicas del analito de interés. La fijación se puede lograr mediante cualquier interacción apropiada, por ejemplo de señal molecular o de tipo hidrófobo, iónico o polar. El especialista está totalmente familiarizado con dichos tipos de interacción.

En una forma de ejecución preferida el RAM empleado en un método conforme a la presente invención fija el analito de interés por interacción hidrófoba o polar.

Preferentemente los poros internos de la sílice o de las partículas poliméricas usadas en un método conforme a la presente invención están recubiertos con grupos seleccionados entre materiales de intercambio aniónico o catiónico o entre grupos hidrófobos, respectivamente.

Preferentemente la superficie de los poros internos de

la sílice o de las partículas poliméricas usadas en un método como el aquí descrito llevan un recubrimiento hidrófobo cuyo material de fijación se selecciona entre grupos alifáticos, grupos fenilo, péptidos hidrófobos u otros materiales de fase inversa. El grupo alifático tiene preferiblemente entre 4 y 20 átomos de C. También se prefiere que la superficie interna sea una matriz C4-, C8- C12-, C16- o C18. Los materiales preferidos tienen un recubrimiento C4, C8 o C18 de la superficie interna.

El tamaño de poro se elige de manera que el analito o analitos puedan entrar en los poros y por tanto unirse a la superficie interna de los mismos, p.ej. a la fase inversa. Lo ideal es que los componentes poliméricos de la matriz, ordinariamente proteínas de la sangre, en especial hemoglobina, a) queden excluidos de los poros por selección apropiada del tamaño de poro y b) no se adhieran a la superficie externa hidrófila. Si se cumplen estos requisitos, los polímeros no son retenidos por el RAM y atraviesan la columna por el volumen hueco. Además, como los polímeros no pueden entrar en los poros no se produce ningún ensuciamiento de la superficie que pueda alterar las características retentivas del material. En general la separación del analito tiene lugar en una segunda columna rellena de un material de fase inversa estándar. En una forma de ejecución preferida el tamaño de poro del RAM utilizado en un método conforme a la presente invención está comprendido entre 60 y 120 Å, también preferiblemente entre 60 y 100 Å.

Se supone que los RAMs deben usarse para procedimientos

de extracción en línea cuando el analito de interés se halla en una matriz muy difícil. Sin embargo es deseable y, como se ha demostrado, necesario, eliminar la mayor parte posible de proteínas contenidas en una muestra de sangre hemolizada, con el fin de minimizar cualquier interferencia de estas moléculas en la medición de un analito. Dependiendo del tamaño de poro elegido se pueden excluir proteínas por encima de cierto peso molecular. La fracción proteica excluida comprende preferiblemente los polipéptidos de 20 kDa y superiores. También preferiblemente la fracción proteica excluida comprende polipéptidos de 19 kDa y superiores, 18 kDa y superiores, 17 kDa y superiores, 16 kDa y superiores y 15 kDa y superiores.

El límite inferior de exclusión de tamaños de los materiales RAM comercialmente disponibles viene indicada por los respectivos fabricantes y es de unos 15 a 20 kDa. Así como los RAMs funcionan muy bien con polipéptidos de peso molecular aparente mayor de 20 kDa o más, la hemoglobina, que tiene un peso molecular de solo 16 kDa, supone un problema importante con los RAM comercialmente disponibles investigados. De hecho este problema puede ser uno de los motivos, sino el más importante, por el cual en la rutina diagnóstica clínica aún no se ha establecido la detección cromatográfica en línea de un analito contenido en una muestra de sangre hemolizada.

Como se puede ver en los experimentos presentados más adelante la hemoglobina se fija inespecíficamente, por ejemplo, a una columna RAM ADS® comercialmente disponible, si esa columna se usa según un protocolo estándar. Después de eluir

los materiales fijados, incluyendo el analito de interés, la

hemoglobina también se libera del RAM e interfiere en la detección del analito. Sorprendentemente se ha encontrado que la fijación inespecífica de hemoglobina, p.ej. la contenida en una muestra de sangre entera hemolizada, se puede reducir de manera drástica si la muestra que contiene hemoglobina se aplica en un tampón de pH superior a 8,0.

“Aplicar” la muestra con un determinado pH a un RAM no significa necesariamente que la muestra tenga este pH o haya sido ajustada a este pH, sino que el tampón de aplicación de la muestra en el cual ésta se inyecta tiene este pH. El especialista también suele referirse a dicho tampón como primer eluyente o tampón (A). En una forma rutinaria y preferida de cromatografía líquida la columna RAM se equilibra usualmente con el tampón de aplicación y el sistema funciona, es decir, el tampón de aplicación fluye a través del equipo cromatográfico y la muestra se inyecta en la corriente del tampón. Por eso el tampón de aplicación también puede calificarse de eluyente, p.ej. de eluyente (A). Como podrá apreciar el especialista, la capacidad de amortiguación del tampón de aplicación se escogerá de manera que se ajuste a la fuerza tamponadora de la muestra. En el caso de un hemolizado la molaridad del tampón puede ser tan baja como 5 mM. El tampón se usará preferentemente a una concentración aproximada de 10 o 20 mM. Tal como se ha indicado, el especialista puede seleccionar fácilmente la fuerza tamponadora según los requerimientos.

A un pH superior a 8,0 la fijación inespecífica de hemoglobina a un RAM se anula o se reduce hasta un nivel que no

interfiere en la detección de un analito de interés. Preferi

blemente el pH del tampón empleado para aplicar la muestra al RAM es de al menos 8,5 o superior o también preferiblemente de al menos 9,0 o más o de 9,5 o más. El límite superior del intervalo de pH puede elegirse como convenga. El especialista escogerá un pH que no destruya ni el analito de interés ni el RAM empleado. Preferiblemente el límite superior de pH será de 12,5 o menos. También será preferiblemente de 12,0 o menos

o de 11,5 o menos o de 11,0 o menos, respectivamente.

En un equipo en línea elegante y preferido la muestra se aplica a un RAM en condiciones de tamponamiento apropiadas y el RAM se lava con un tampón de lavado adecuado. Ajustando las válvulas y la dirección de flujo del sistema, el analito, si está presente, se eluye, pasa por una columna analítica y se detecta. En otra forma de ejecución preferida el método de la presente invención se lleva a cabo usando el mismo pH para el tampón de aplicación y elución. Como sabe el especialista la elución de un analito de interés puede ajustarse para que cumpla las condiciones más adecuadas al analito investigado. En muchos casos servirá a tal fin un gradiente de elución.

Según la presente invención un analito puede ser cualquier molécula inorgánica u orgánica, incluyendo una biomolécula, pero excluyendo ácidos nucleicos. El analito no será un ácido nucleico, concretamente no será un ADN. Preferiblemente el analito se elige del grupo formado por un polipéptido, un hidrato de carbono y una molécula inorgánica u orgánica de tipo farmacológico. El analito de interés tiene preferiblemente un peso molecular de 10 kDa o menos, con igual prefe

rencia de 9 kDa o menos, de 8 kDa o menos, de 7 kDa o menos,

de 6 kDa o menos o de 5 kDa o menos, respectivamente.

Un polipéptido o una proteína es una molécula compuesta esencialmente por aminoácidos y tiene al menos dos de ellos unidos mediante un enlace peptídico. En el caso de un analito de interés para ser investigado en un método como el revelado aquí el polipéptido estará constituido preferiblemente por al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25 y 30 hasta unos 100 aminoácidos. El polipéptido contendrá preferiblemente de 5 hasta 100, también preferiblemente de 10 a 40, aminoácidos. Como analitos peptídicos de interés cabe mencionar p.ej. las hormonas peptídicas y otros polipéptidos presentes en la circulación, especialmente los liberados de los glóbulos rojos por el tratamiento con un agente solubilizante de membranas conforme a la presente invención.

El método según la presente invención se emplea preferiblemente para detectar en línea un analito de una muestra de sangre entera que contiene dicho analito localizado, al menos en parte, dentro de un glóbulo rojo, por ejemplo sirolimus, tacrolimus o folato.

Según la presente invención, un analito diana preferido se selecciona del grupo formado por los estupefacientes y los fármacos inmunosupresores. Los analitos diana preferidos son los estupefacientes. El estupefaciente se elige preferiblemente del grupo formado por anfetamina, cocaína y metabolitos de cocaína como benzoílecgnonina, metanfetamina, opiato y sus derivados, cannabinoides como tetrahidrocannabinol y fenciclidina.

Otro analito diana preferido es un fármaco inmunosupre

sor. El fármaco inmunosupresor se escoge preferiblemente del grupo formado por ciclosporina (CsA), micofenolato mofetil (MMF), rapamicina (RAPA, igualmente conocido como sirolimus), tacrolimus (FK-506) azatioprina (AZA) y metilprednisolona (MP).

Otro analito diana preferido es el ácido fólico o un vitámero de ácido fólico, respectivamente. Un analito preferido es el folato total, contenido tanto en el plasma sanguíneo como en los glóbulos rojos.

En el método conforme a la presente invención el analito de interés se une primero a un RAM en condiciones apropiadas. Para la detección y/o cuantificación el analito se eluye del RAM y después se detecta o cuantifica por un método adecuado. Preferiblemente el analito de interés se eluye del RAM y después se separa por cromatografía líquida. Preferiblemente el material eluido del RAM se separa además por HPLC de fase inversa.

La cromatografía líquida (LC) es una técnica analítica extremadamente importante que se usa para separar, identificar y cuantificar un analito de interés, incluso si se halla en una mezcla compleja de diversos componentes. Durante la LC los componentes químicos de una mezcla son transportados por el flujo de una fase móvil líquida, a través de un lecho de columna empaquetado con una fase estacionaria apropiada. La fase estacionaria, usualmente partículas de forma irregular o esférica, tiene una superficie adecuada para interacciones reversibles con los analitos. En la cromatografía líquida la

separación se consigue mediante diferencias en las interac

ciones de los analitos, tanto con la fase móvil como con la fase estacionaria. Como apreciará el especialista, hay que elegir una fase estacionaria y una fase móvil que sean apropiadas para los analitos investigados. El usuario identificará asimismo las condiciones cromatográficas adecuadas para mantener la nitidez de las bandas de analito a medida que la muestra atraviesa la columna de fase estacionaria, hacia el detector.

La cromatografía líquida de alto rendimiento, conocida también como cromatografía líquida de alta presión, abreviada HPLC, es una forma especial de cromatografía líquida y hoy en día se usa frecuentemente en bioquímica y química analítica. En comparación con la LC el tamaño de partícula de la fase estacionaria es menor, lo cual según la teoría bien conocida produce menos dispersión de las bandas y picos más estrechos en el cromatograma resultante y por tanto mejora la resolución y la sensibilidad. Debido al menor diámetro de partícula la fase móvil de una HPLC tiene que forzarse a mayor presión a través de la columna.

La fase móvil se elige asegurando la solubilidad de los solutos de la muestra. Para la fase estacionaria se utiliza preferentemente sílice micronizada (pura o modificada químicamente), porque su gran área superficial acentúa las diferencias en las interacciones soluto-fase estacionaria. El uso de una fase estacionaria que interactúa fuertemente con solutos en cuanto a las interacciones soluto-fase estacionaria da unos tiempos de retención muy largos, lo cual no es práctico

desde el punto de vista analítico. Por tanto la fase estacio

naria debe escogerse de tal modo que produzca interacciones débiles a moderadas de los solutos respecto a las de la fase móvil. Como consecuencia la naturaleza del soluto determina el tipo de LC elegido. Las interacciones más fuertes deberían producirse en la fase móvil, para asegurar la solubilidad de la muestra y la rápida elución, mientras que la fase estacionaria debería resolver las diferencias más sutiles entre los solutos. Por ejemplo, los compuestos neutros polares suelen analizarse mejor empleando una fase móvil polar junto con una fase estacionaria no polar que distinga diferencias sutiles en el carácter dispersivo de los solutos. Uno de los aspectos convincentes de la HPLC es que la fase móvil se puede variar para modificar el mecanismo de retención. Para controlar la retención pueden añadirse modificadores a la fase móvil. Así, por ejemplo, el pH es una variable importante en las fases móviles acuosas.

Se pueden distinguir cinco clases generales de LC.

1.

Cromatografía de fase normal, que corresponde al uso de una fase estacionaria polar junto con una fase móvil (dispersiva) no polar.

2.

Cromatografía de fase inversa, la modalidad contraria, que corresponde al uso de una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar (compuesta de uno o más disolventes polares, p.ej. agua, metanol, acetonitrilo y tetrahidrofurano).

3.

Cromatografía de intercambio iónico, que supone interacciones iónicas. En este caso la fase móvil debe favore

cer la ionización, para garantizar la solubilidad de los

solutos iónicos. La fase estacionaria también debe ser parcialmente iónica para promover un poco de retención.

4.

Cromatografía de exclusión de tamaños, que comprende separaciones basadas solamente en el tamaño molecular y supone idealmente la ausencia de adsorción de los solutos por la fase estacionaria.

5.

Cromatografía de afinidad, que se basa en una interacción específica, p.ej. entre los miembros de un par de fijación específica, como un antígeno y su correspondiente anticuerpo o un receptor y su correspondiente ligando. Por ejemplo, un primer componente de un par de fijación está unido a una fase estacionaria adecuada y se usa para captar el segundo componente del par. El segundo componente se puede liberar y aislar por medios apropiados.

La anterior clasificación general de principios de separación no es exhaustiva y por lo tanto tampoco es excluyente; hay otros principios de separación que pueden emplearse para resolver muestras líquidas, p.ej. cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de interacción hidrófila, cromatografía de fase inversa de par iónico, separación basada en materiales de impresión molecular.

Un analito de interés se puede identificar o cuantificar por cualquier método adecuado. Los detectores idóneos y preferidos descubren la presencia de un compuesto que los atraviesa y proporcionan una señal electrónica a una estación de registro o computación de datos. El resultado se emite usualmente en forma de cromatograma y la sustancia buscada suele

encontrarse en un pico determinado. El área o la altura del

pico puede utilizarse para cuantificar la cantidad de analito presente en la muestra investigada.

El detector para un sistema de HPLC es el componente que emite una respuesta a la elución del compuesto de la muestra y a continuación produce un pico en el cromatograma. Se sitúa inmediatamente después de la fase estacionaria para detectar los compuestos a medida que son eluidos de la columna. La amplitud y la altura de los picos se puede ajustar normalmente mediante los reguladores de sintonización gruesa y fina y los parámetros de detección y sensibilidad también puede ser controlados por el especialista. Hay muchos tipos de detectores que puede utilizarse para la HPLC. Algunos de los más habituales son: de índice de refracción (RI), ultravioleta (UV), fluorescencia, los radioquímicos, electroquímicos, de infrarrojo cercano (NIR), espectrometría de masas (MS), resonancia magnética nuclear (RMN) y dispersión de la luz (LS).

Los detectores de índice de refracción (RI) miden la capacidad que tienen las moléculas de la muestra para desviar o refractar la luz. Esta propiedad de cada molécula se designa como su índice de refracción. En la mayoría de detectores RI la luz pasa por una celda de flujo bimodular hacia un fotodetector. Un canal de la celda de flujo controla la fase móvil al atravesar la columna, mientras que el otro canal controla solo la fase móvil. La detección tiene lugar cuando la luz es desviada por las muestras eluidas de la columna y se lee como disparidad entre los dos canales.

Los detectores de fluorescencia miden la capacidad de un

compuesto para absorber y reemitir luz a longitudes de onda

distintas. Cada compuesto tiene una fluorescencia característica. La luz de excitación atraviesa la celda de flujo y la intensidad de la luz emitida es medida por un monocromador y un fotodetector.

La detección radioquímica implica el empleo de material radiomarcado, normalmente con tritio (H3) o carbono-14 (C14). Funciona por detección de fluorescencia asociada a la ionización de partículas beta y es más conocida en la investigación de metabolitos.

Los detectores electroquímicos miden compuestos sometidos a reacciones de oxidación o reducción. Usualmente se basa en la medición de la ganancia o pérdida de electrones de las muestras que migran al pasar entre electrodos a una determinada diferencia de potencial eléctrico.

La espectrometría de masas es una técnica analítica que se usa para medir la relación masa/carga (m/z (o m/q)) de los iones. Se emplea generalmente para analizar la composición de una muestra física, generando un espectro de masas que representa las masas de los componentes de la muestra. La técnica tiene varias aplicaciones, incluyendo: identificación de compuestos desconocidos por la masa del compuesto y/o fragmentos del mismo, determinación de la composición isotópica de uno o más elementos en un compuesto, determinación de la estructura de compuestos observando su fragmentación, cuantificación de la cantidad de un compuesto en una muestra mediante el uso de métodos cuidosamente diseñados (la espectrometría de masas no es inherentemente cuantitativa), estudio de los fundamentos

de la química iónica en fase gaseosa (la química de iones y

especies neutras en el vacío), determinación de otras propiedades físicas, químicas o incluso biológicas de compuestos con una variedad de métodos adicionales.

Un espectrómetro de masas es un aparato empleado para la espectrometría de masas, que proporciona un espectro de masas de una muestra para analizar su composición. En general funciona ionizando los componentes de la muestra y separando los iones de masas diferentes (proporciones m/z), registrando su abundancia relativa mediante la medición de las intensidades del flujo iónico. Un espectrómetro de masas típico comprende tres partes: una fuente de iones, un analizador de masas y un detector.

El tipo de fuente iónica es un factor que influye mucho en qué clases de muestras se pueden analizar por espectrometría de masas. La ionización electrónica y la ionización química se usan para gases y vapores. En las fuentes de ionización química el analito se ioniza por reacciones ion-molécula durante los choques que tienen lugar en la fuente. Dos técnicas usadas frecuentemente con muestras biológicas líquidas y sólidas son la ionización por electropulverización (ESI) y la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI). Otras técnicas son el bombardeo con átomos rápidos (FAB), la pulverización térmica, la ionización química a presión atmosférica (APCI), la espectrometría de masas de iones secundarios (SIMS) y la ionización térmica.

En una forma de ejecución preferida la detección de un analito en un método conforme a la presente invención se rea

liza por espectrometría de masas.

La detección por resonancia magnética nuclear (RMN) se basa en el hecho de ciertos núcleos con número másico impar, incluyendo H y C13, giran de manera aleatoria alrededor de un eje. Sin embargo, cuando se sitúan entre los polos de un imán fuerte, los espines se alinean paralela o antiparalelamente con el campo magnético, siendo la orientación paralela favorecida por su nivel energético ligeramente más bajo. Entonces se bombardean los núcleos con radiación electromagnética que es absorbida, situando los núcleos paralelos a un nivel energético superior y por tanto en “resonancia” con la radiación electromagnética. Cada H o C producirá diferentes espectros dependiendo de su situación y de los átomos o grupos atómicos adyacentes en el compuesto, ya que en las moléculas todos los núcleos están rodeados por nubes electrónicas que cambian con el campo magnético circundante y por lo tanto alteran la frecuencia de absorción.

Cuando una fuente emite un haz paralelo de luz incidente en partículas disueltas, una parte de esta luz se refleja, se absorbe, se transmite o se dispersa. Estos fenómenos pueden medirse con un detector de luz dispersada (LS). Las principales formas de detección LS se llaman nefelometría y turbidimetría. La nefelometría se define como la medición de la luz dispersada por una solución de partículas. Ese método permite detectar la porción de luz dispersada bajo muchos ángulos. La turbidimetría se define como la medición de la disminución de luz transmitida, debido a las partículas disueltas. Mide la luz dispersada como reducción de la luz transmitida a través

de la solución de partículas. Por lo tanto cuantifica la luz

residual transmitida.

Los detectores de infrarrojo cercano trabajan explorando compuestos en un espectro de 700 hasta 1100 nm. Se detectan a ciertas longitudes de onda las vibraciones de elongación y flexión de determinados enlaces químicos en cada molécula.

El método aquí descrito se puede usar para detectar un analito en una muestra de sangre entera hemolizada. Para el especialista es obvio que el método conforme a la presente invención también funcionará con otras muestras de materiales básicos como plasma, suero, orina o líquido cerebroespinal y sangre entera hemolizada. Se prefiere una muestra de sangre entera hemolizada.

Tal como se ha mencionado anteriormente los autores de la presente invención también han encontrado un método de hemolisis diferencial. Este método aún no está públicamente disponible y por tanto se describirá en detalle más adelante. El término “hemolisis diferencial” se refiere a un método de procesamiento de la muestra, que consiste en tratar los eritrocitos con un agente solubilizante de membrana en condiciones idóneas para lisar membranas celulares de glóbulos rojos, evitando mismo tiempo la precipitación de componentes de la muestra. De la descripción siguiente se deduce que el método según la presente invención se practica preferiblemente con una muestra de sangre entera hemolizada diferencialmente.

“Glóbulos rojos” según la presente invención son células rojas de la sangre que carecen de un núcleo celular. Ese tipo de células sanguíneas rojas sin núcleo son p.ej. eritrocitos

maduros como los que se encuentran en la circulación de los

mamíferos. La presente invención no trata de glóbulos rojos nucleados, como p.ej. los conocidos de las especies aviarias. Estos últimos cumplirían los criterios de una célula nucleada

o eucariota.

“Mamífero”, para los fines de la presente invención, se refiere a cualquier animal clasificado como tal, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja y animales de zoológico, de deporte o mascotas, como por ejemplo perros, gatos, ganado, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc. Preferentemente se trata de humanos.

Una “célula eucariota” o “célula nucleada” en el sentido de la presente invención es una célula derivada de un organismo eucariótico, que aún tiene su núcleo celular. Ejemplos de células eucariotas son las células procedentes de tejido nucleado y de cultivos de tejido nucleado y las células sanguíneas nucleadas. Según una forma de ejecución preferida la célula eucariota es una célula sanguínea nucleada tal como un trombocito, un monocito, neutrófilos, eosinófilos o un leucocito. A pesar de contener material genético, las células de organismos inferiores como las bacterias no son eucariotas.

La hemolisis de una muestra de sangre entera puede realizarse por cualquier método hemolítico conocido del estado técnico. La muestra de sangre entera hemolizada se obtiene preferiblemente por hemolisis diferencial. Como se demuestra en la sección de los ejemplos, las propiedades ventajosas de la hemolisis diferencial -es decir, el tratamiento de una muestra líquida con un agente solubilizante de membrana en

condiciones idóneas para lisar membranas de glóbulos rojos,

sin provocar la precipitación de componentes de la muestra se han establecido en el uso de muestras de sangre entera.

La muestra líquida sometida a hemolisis diferencial con un agente solubilizante de membrana apropiado comprende preferiblemente glóbulos rojos y puede incluir o incluye células nucleadas. También preferiblemente la muestra líquida incluye tanto glóbulos rojos como células nucleadas. La muestra líquida empleada en un método sujeto a hemolisis diferencial, y por tanto en un método según la presente invención, será de sangre entera. Como puede apreciarse, una muestra de sangre entera contiene glóbulos rojos sin núcleos y células sanguíneas nucleadas.

Preferiblemente la muestra de sangre entera se procesa de modo directo, es decir, se somete a la hemolisis diferencial inmediatamente después del muestreo. También preferiblemente, la sangre entera se recoge/trata con un anticoagulante para obtener una muestra de sangre entera anticoagulada. Como anticoagulantes son bien conocidos y empleados con frecuencia en la rutina diagnóstica clínica la heparina, el citrato y el EDTA. La muestra conforme a la presente invención es preferiblemente de sangre entera anticoagulada, sobre todo una muestra de sangre entera anticoagulada con citrato o con EDTA que ha sido hemolizada diferencialmente.

En un método de hemolisis diferencial la muestra líquida se trata de manera que se cumplen dos requisitos: a) si hay glóbulos rojos presentes se desestabilizan sus membranas y b) al mismo tiempo no se provoca ninguna precipitación de compo

nentes de la muestra. Como ya se ha mencionado, este proceso

se llama hemolisis diferencial.

En caso de llevar a cabo este método con una muestra de sangre entera, se obtiene una muestra procesada - una muestra de sangre entera hemolizada diferencialmente -que contiene glóbulos rojos lisados, pero ningún precipitado.

Al aplicar un agente solubilizante de membrana idóneo en condiciones adecuadas, la integridad de la membrana celular que es esencial para proteger el contenido de un glóbulo rojo del plasma sanguíneo - se pierde. El contenido de los eritrocitos (p.ej. hemoglobina y también algunos analitos de interés) es liberado al líquido circundante y no precipita ningún componente de la muestra.

Como podrá apreciar el especialista, los componentes de la muestra que interferirían en el análisis subsiguiente son sobre todo ADN y proteínas. Si no se destruyen los núcleos de células eucariotas, como p.ej. linfocitos o monocitos, no se libera ADN de ellos. Como no precipitan proteínas, las que se encuentran en la muestra sometida a hemolisis diferencial no interferirán, al menos de manera significativa, en una etapa cromatográfica rutinaria. Sin embargo, como se ha detallado más arriba, hay componentes de los eritrocitos -particularmente la hemoglobina - que pueden interferir en la detección del analito de interés.

La integridad de los glóbulos rojos se puede comprobar fácilmente con colorantes de vida apropiados. En una forma de ejecución preferida según la presente invención se usa azul de tripano para apreciar la integridad de la membrana de un

glóbulo rojo. Los glóbulos rojos intactos no acumulan azul de

tripano, mientras que un glóbulo rojo con una membrana rota se tiñe con azul de tripano. La integridad de la membrana de un glóbulo rojo se aprecia fácilmente al microscopio después de teñir una muestra con azul de tripano. El porcentaje de glóbulos rojos rotos se calcula contando los glóbulos rojos intactos antes y después del tratamiento, dividiendo luego el primer número por el segundo y multiplicando el resultado por

100. Los glóbulos rojos solubilizados se denominan glóbulos rojos lisados o eritrocitos lisados.

El tratamiento conveniente será adecuado para lisar un glóbulo rojo, sin precipitar al mismo tiempo componentes de la muestra. Es de esperar que en un método según la presente invención el tratamiento hemolítico adecuado también afecte a las membranas externas de las células eucariotas. Sin embargo hay que tener cuidado de que el ADN contenido en los núcleos celulares no se libere a la muestra. El reactivo de hemolisis y las condiciones utilizadas dejarán preferiblemente intacta la membrana nuclear y por lo tanto macroscópicamente intactos los núcleos o al menos no liberarán el ADN de sus proteínas envolventes y estabilizantes. Si se liberara ADN en cantidad importante, dicho ADN podría interferir o interferiría en la manipulación subsiguiente de la muestra. El ADN tiende p.ej. a incrementar mucho la viscosidad del líquido. Entonces ya es imposible pipetear o transferir la muestra o pasarla a través de ciertos filtros o columnas.

También puede y debe procurarse que no precipite ninguna proteína. Como podrá apreciar el especialista, en una muestra

biológica, p.ej. en una muestra de sangre entera, hay muchas

proteínas diferentes. Todas ellas tienen propiedades individuales que influyen en su tendencia a precipitar o agregarse.

Ahora se ha encontrado que es posible describir y definir si el tratamiento de la muestra con un agente solubilizante de membranas se lleva a cabo en condiciones apropiadas, es decir, de modo que se lisen las membranas celulares de los glóbulos rojos, sin causar la precipitación de componentes de la muestra. Tanto los glóbulos rojos no lisados como los componentes de la muestra precipitados tendrían un impacto negativo en las propiedades de tal muestra.

Que las condiciones sean apropiadas para una hemolisis diferencial puede determinarse fácilmente mediante el procedimiento normalizado siguiente. Una muestra de sangre entera con un hematocrito de 40 se diluye 1:10 con el reactivo hemolítico en cuestión. La eficacia de un reactivo para producir hemolisis diferencial se aprecia visualmente. Al lisarse los eritrocitos la mezcla se vuelve transparente. Si precipitan componentes de la muestra, ésta se vuelve turbia o viscosa o ambas cosas.

Como se ha indicado arriba, las condiciones empleadas en un método de hemolisis diferencial conforme a la presente invención se pueden apreciar visualmente con facilidad. Si una muestra de sangre entera se incuba con un reactivo potencialmente apropiado de hemolisis diferencial, como concentración mínima necesaria para hemolizar glóbulos rojos se puede tomar la concentración más baja a la cual la muestra turbia de sangre entera se vuelve transparente o clara. La mayor concen

tración posible es aquella que sigue produciendo una muestra

transparente y no viscosa.

Ha resultado bastante fácil determinar la concentración final mínima apropiada del potencial reactivo hemolítico como aquélla que produce el cambio de transparencia en una muestra de sangre entera tratada. Ese cambio de transparencia corresponde bien a la idoneidad de una muestra así tratada para su análisis directo por HPLC. Sin embargo, en aras de una definición no ambigua, es preferible que la concentración mínima de un reactivo hemolítico sea confirmada por el método de HPLC descrito más adelante.

La concentración máxima posible de reactivo hemolítico es aquella que no produce liberación de ADN y/o precipitación de una proteína, pues entonces la muestra se volvería viscosa

o turbia o ambas cosas y ya no serviría para un análisis HPLC directo. Aunque la viscosidad y la turbidez se puede seguir visualmente, es preferible que la concentración máxima de un reactivo hemolítico sea confirmada por el método de HPLC descrito más adelante.

Tanto una muestra de sangre entera que todavía contenga demasiados eritocitos no lisados como una muestra de sangre entera tratada que lleve componentes precipitados no servirá para ningún procedimiento cromatográfico. Este es el motivo por el cual las condiciones adecuadas para producir hemolisis diferencial se determinan preferiblemente mediante la aplicación normalizada de una muestra de sangre entera, tratada con un reactivo potencial de hemolisis diferencial, a una columna de HPLC.

La hemolisis incompleta y/o la precipitación de compo

nentes de la muestra se evalúa aplicando 50 veces 10 µl de la muestra de sangre entera tratada a una columna de HPLC. Para valorar si un reactivo es adecuado para hemolisis diferencial se mezcla con una muestra de sangre entera. Preferentemente se usa EDTA-sangre con un hematocrito de 40, prediluida 1:10 en suero fisiológico, se mezcla en relación 1:1 con el reactivo hemolítico potencial y se incuba 30 minutos a 20ºC. De esa mezcla, es decir una muestra de sangre entera tratada, se aplican 50 alícuotas de 10 µl a un filtro de 2 mm de diámetro y 0,5 µm de tamaño de poro que forma parte de un sistema de HPLC. Si la frita es parte de una columna de HPLC, la fase estacionaria debe escogerse de manera que no produzca ninguna interferencia o bloqueo. Se regula la retropresión. Un reactivo potencial de hemolisis diferencial que genere un aumento de 20 bar o más en la retropresión – si se compara la retropresión de la inyección 50 con la retropresión de la primera inyección – se consideraría inadecuado. De esta manera pueden identificarse fácilmente las concentraciones finales mínima y máxima de un reactivo adecuado para la hemolisis diferencial.

El filtro utilizado en la evaluación arriba descrita de un reactivo potencial de hemolisis diferencial es preferentemente una frita de HPLC. También preferentemente, la frita es parte de una columna de HPLC de 20 mm de longitud rellena de partículas Symmetry® C18 de 3,5 µm y 100 Å de tamaño de poro como material del lecho, y el diámetro interior de la columna es de 2 mm.

Como podrá apreciar fácilmente el especialista la mues

tra de sangre entera empleada en dicha evaluación se obtiene

de un individuo sano, es decir de una persona sin patologías conocidas y con valores bioquímicos en los límites normales. Se ha visto y establecido que las condiciones apropiadas para satisfacer las exigencias de la hemolisis diferencial se

5 pueden determinar para muchísimos productos químicos. El re-activo de hemolisis diferencial comprende un producto químico membranolítico (= solubilizante de membrana) a la concentración adecuada para producir la hemolisis diferencial después de mezclarlo con la muestra.

10 El agente solubilizante de membrana según la presente invención se basa preferentemente en agua como disolvente y comprende un producto químico o reactivo que efectúa la hemolisis diferencial arriba descrita. Además puede contener preferentemente un tampón y/o un conservante. Los agentes utili

15 zados para la hemolisis diferencial están basados en productos químicos o reactivos con actividad solubilizante de membranas que tienen un peso molecular inferior a 1000 Dalton.

El agente solubilizante de membrana se basa preferentemente en la acción membranolítica de uno o más de los produc20 tos químicos siguientes: KBr, KI y KSCN o una sal formada por

uno o más de los cationes y aniones siguientes: El catión se elige preferiblemente entre

imagen1

donde m es 0 o 1 y n es 4 o 6.

El anión se elige preferiblemente entre cloruro, tetrafluoroborato, octilsulfato, yoduro y tiocianato. También se pueden usar mezclas de los productos químicos arriba citados.

5 Como podrá apreciar el especialista son estos productos químicos los que provocan la hemolisis diferencial, mientras que los demás ingredientes de un reactivo hemolítico pueden servir para diversos fines y p.ej. actuar como tampones o conservantes.

10 El producto químico contenido en un reactivo de hemolisis diferencial es preferiblemente una sal cuyo catión se elige preferiblemente entre

imagen1

15 donde m es 0 o1y n es 4o 6,yel anión se selecciona preferiblemente entre cloruro, tetrafluoroborato, octilsulfato, yoduro y tiocianato.

Los productos químicos membranolíticos adecuados contenidos en un agente solubilizante de membranas se seleccionan 20 preferiblemente del grupo formado por tetrafluoroborato de 1butil-4-metilpiridinio, tetrafluoroborato de 1-butil-3-metilimidazolio, octilsulfato de 1-butil-3-metilimidazolio, cloruro de 1-butil-3-metil-piridinio, cloruro de 1-hexilpiridinio, cloruro de 1-metil-1-octilpirrolidinio, cloruro de N-octil

piridinio, cloruro de 3-carbamoíl-1-octiloximetil-piridinio, KBr, KI y KSCN, y combinaciones de los mismos.

Los productos químicos membranolíticos contenidos en un agente solubilizante de membranas se seleccionan preferiblemente del grupo formado por tetrafluoroborato de 1-butil-4metilpiridinio, tetrafluoroborato de 1-butil-3-metilimidazolio, octilsulfato de 1-butil-3-metilimidazolio, cloruro de 1butil-3-metil-piridinio, cloruro de 1-hexilpiridinio, cloruro de 1-metil-1-octilpirrolidinio, cloruro de N-octil-piridinio y cloruro de 3-carbamoíl-1-octiloximetilpiridinio. También se prefiere el empleo de una mezcla de uno de estos reactivos y KSCN.

Como es evidente para el especialista, una vez determinada una concentración apropiada de un reactivo potencial de hemolisis diferencial en el método anteriormente definido, la cual se basa en una dilución 1 a 20 de una muestra de sangre entera en un reactivo hemolítico potencial, se puede usar, si es preciso, otra proporción de muestra de sangre entera respecto a un reactivo hemolítico ajustado.

Cuando se espera que el analito de interés se encuentre altamente concentrado en la muestra de sangre analizada puede dejarse la misma concentración de reactivo hemolítico determinada en el ajuste anterior y emplear menores relaciones de sangre analizada respecto al reactivo hemolítico, p.ej. 1:30,

1:40 o 1:50. En un agente solubilizante de membrana conforme a la presente invención, el reactivo de hemolisis diferencial se usa preferiblemente, al menos, a la concentración mínima

suficiente para lograr la hemolisis diferencial definida con

anterioridad.

Si el analito de interés se encuentra a una concentración más bien baja no hará falta diluir la muestra de sangre entera a 1:20, sino menos. Ello es factible ajustando correspondientemente la concentración del reactivo hemolítico, de tal modo que su concentración final respecto a sangre entera en la mezcla de ambos quede dentro de la relación determinada respectivamente para las concentraciones mínima y máxima de reactivo hemolítico en la evaluación arriba descrita.

Por ejemplo: se ha encontrado que el empleo de cloruro de 1-metil-1-octilpirrolidinio/KSCN a concentraciones finales de 1% y 0,4%, respectivamente, en un agente solubilizante de membrana según la presente invención es adecuado para lograr el resultado deseado, es decir, la hemolisis diferencial de una muestra de sangre entera a una dilución final de 1:20. La dilución de un analito en la muestra de sangre tratada puede reducirse si la concentración de este reactivo hemolítico se ajusta respectivamente, por ejemplo, al 2% de cloruro de 1metil-1-octil-pirrolidinio y al 0,8% de KSCN. El agente solubilizante de membranas que lleva esta concentración ajustada de reactivo hemolítico, si éste va mezclado 1:1 con una muestra de sangre entera diluida 1:5, también induce la hemolisis diferencial de una muestra de sangre entera. Como la relación de sangre entera a reactivo hemolítico se mantiene constante, esta muestra de sangre tratada se diluye solo 1:10. Si 1 ml de un agente solubilizante de membranas que contiene 10% de cloruro de 1-metil-1-octil-pirrolidinio y 4% de KSCN, respec

tivamente, se mezcla con 1 ml de sangre entera diluida 1:1 en

PBS, también se observa hemolisis diferencial. Como alternativa se podría agregar 1 ml de sangre entera a 2 ml de un agente solubilizante de membranas que contuviera 10% de cloruro de 1-metil-1-octilpirrolidinio y 4% de KSCN, respectivamente.

Para muchas aplicaciones rutinarias es de esperar que la relación ideal de muestra de sangre entera a agente solubilizante de membranas esté comprendida entre 10:1 y 1:20. En un método conforme a la presente invención la muestra de sangre entera se mezcla preferiblemente con el reactivo hemolítico en una relación de 5 a 1 hasta 1 a 15. Con mayor preferencia la relación está comprendida entre 2 a 1 y 1 a 10, también de modo preferente entre 1 a 1 y 1 a 5. La concentración final, es decir la más alta posible de un reactivo hemolítico ajustado para la rutina clínica, dependerá de la solubilidad y también del precio de dicho reactivo.

Un reactivo idóneo para la hemolisis diferencial también se caracteriza porque la concentración (mínima) del producto químico necesaria para romper la membrana de un glóbulo rojo y la concentración (máxima) tolerada de dicho reactivo que no provoque al mismo tiempo la precipitación de componentes de la muestra obedecen al menos a dos motivos distintos. Cuanto más amplio sea el intervalo entre la concentración mínima y la concentración máxima del reactivo responsable de la hemolisis diferencial, más fácilmente podrá usarse dicho reactivo en la rutina diagnóstica clínica.

Asimismo es preferible que el producto químico membrano

lítico contenido en un reactivo de hemolisis diferencial se

utilice a una concentración tal que, una vez mezclado con una muestra, la concentración final de este producto químico membranolítico corresponda al valor medio más 30% de la concentración mínima o menos 30% de la concentración máxima. Además es preferible que la concentración del producto químico membranolítico contenido en el reactivo de hemolisis diferencial se ajuste de manera que después de mezclarlo con una muestra esté comprendida dentro de más o menos el 25%, 20% o 15% del valor medio de la concentración mínima y máxima, respectivamente.

También es preferible que el producto químico membranolítico contenido en un reactivo de hemolisis diferencial se use a una concentración tal que después de mezclarlo con una muestra se obtenga una concentración final de dicho producto químico hemolítico correspondiente a una concentración comprendida entre una y cuatro veces la concentración mínima y también preferiblemente entre 1,5 y 3 veces la concentración mínima determinada como arriba.

El reactivo de hemolisis diferencial en un agente solubilizante de membranas de la presente invención se emplea con preferencia a una concentración no superior al 75% en peso/ volumen, también preferiblemente no superior al 50% en peso/ volumen.

El método de la hemolisis diferencial de una muestra se combina preferiblemente con un método conforme a la presente invención. En este método se emplea preferiblemente una etapa de cromatografía líquida (LC) adicional.

En otra forma de ejecución preferida la presente inven

ción se refiere a un método para detectar un analito en una muestra líquida, que comprende las etapas de conseguir dicha muestra líquida, someterla a un método de tratamiento con un agente solubilizante de membranas capaz de romper la membrana de los glóbulos rojos sin destruir, dado el caso, los núcleos de las células eucariotas, ajustar el pH a un valor superior a 8,0, aplicar la muestra a un RAM y luego eluir el material fijado, someterlo a cromatografía líquida y analizar el analito investigado por medios adecuados. Las etapas de aplicación de la muestra al RAM, de elución y cromatografía de la muestra, así como el método de análisis se efectúan preferiblemente de modo directo (en línea).

En las aplicaciones rutinarias la fase estacionaria, el llamado material del lecho, p.ej. partículas de sílice modificadas para una HPLC de fase inversa, se empaqueta dentro de una columna y se protege con una frita. El material de la frita se elige habitualmente de manera que su tamaño de poro sea inferior al del material del lecho.

En los métodos de HPLC el diámetro de las partículas de la fase estacionaria está comprendido usualmente en el intervalo de 1 hasta 10 µm. Estas pequeñas partículas necesitan la alta presión empleada en la HPLC. El material del lecho suele estar protegido por una frita. Las fritas típicas tienen un tamaño de poro de 1 µm, 0,45 µm o 0,2 µm. Cuanto más pequeñas son las partículas, menor suele ser el tamaño de poro de la frita. Si una muestra lleva un componente capaz de bloquear una frita de HPLC es un inconveniente para cualquier análisis

rutinario. Una muestra de sangre entera sin tratar y una

muestra de sangre entera “sobretratada” que contenga precipitados de sus componentes bloquea rápidamente cualquier frita

o columna de HPLC rutinaria. Como apreciará el especialista, el bloqueo de la frita empleada en una columna de HPLC tendrá lugar más rápidamente cuanto menor sea el tamaño de poro de la frita, el diámetro de las partículas de la fase estacionaria y el diámetro de la columna. Si la frita no se escogiera adecuadamente, p.ej. con tamaño de poro demasiado grande, el tamaño de partícula del material de la columna también importaría y ésta se bloquearía más rápidamente cuanto menor fuera el tamaño de las partículas.

Si se somete una muestra a hemolisis diferencial, p.ej. una muestra sangre entera, la muestra tratada puede aplicarse directamente a una columna de HPLC, sin correr el riesgo de bloquear la columna. Las partículas de fase estacionaria utilizadas en esta etapa de HPLC tienen un diámetro comprendido en el intervalo de 1 a 10 µm, preferiblemente de 2 a 7 µm. La frita empleada en esta etapa de HPLC tienen un tamaño de poro de 0,5 µm o preferiblemente de 0,2 µm.

Tal como se demuestra en los ejemplos, ahora es posible someter una muestra, p.ej. una muestra sangre entera, a hemolisis diferencial, aplicar este hemolizado a un RAM bajo unas condiciones que satisfagan requerimientos específicos de pH, eluir el material fijado al RAM, y detectar la ausencia, la presencia o la cantidad de un analito de interés, como, por ejemplo, un antibiótico o un fármaco inmunosupresor como el tacrolimus o la rapamicina.

Descripción de las figuras

Figura 1

pH 6,6: cromatograma de hemoglobina a 396 nm. El

pico #1 representa la hemoglobina en la fracción

no retenida, el pico #2 representa la hemoglobina

eluida a 15% de tampón B y el pico #3 la hemoglo

bina encontrada después de lavar la columna con

100% de de tampón B.

Figura 2

pH 10,7: cromatograma de hemoglobina a 396 nm. El

pico #1 representa la hemoglobina en la fracción

no retenida; el pico #2 representa la hemoglobina

eluida a 20% de tampón (B).

Figura 3

Estudio del arrastre de hemoglobina a pH 10,7. Se

investigó el arrastre de hemoglobina inyectando un

blanco tras el análisis de una muestra que llevaba

hemoglobina. Como puede verse en el cromatograma

no se detecta hemoglobina a 20% de tampón (B).

Figura 4

Dispositivo experimental para extraer analitos de

hemolizados. La hemoglobina se controló tras la

columna Biotrap 500 MS con detección UV-Vis. Los

analitos se detectaron por espectrometría de masas

tras la columna analítica.

Figura 5

Inyección de un blanco de hemolizado de sangre

entera. El cromatograma indica que no se encuentra

ningún pico en la posición donde debería eluirse

tetraciclina.

Figura 6

Inyección de hemolizado de sangre entera aditivada

con tetraciclina. El cromatograma presenta un pico

nítido para este analito en la posición donde debe

eluirse la tetraciclina.

Figura 7

Cromatografía de un blanco a través de la columna

Biotrap 500 MS después de inyectar hemolizado como

muestra. Como es evidente según este cromatograma

no se detecta hemoglobina.

Figura 8

Curva de calibración de tetraciclina adicionada a

un hemolizado de sangre entera humana. Se observa

una correlación lineal, tal como indica la línea

de extrapolación trazada en esta figura y el alto

coeficiente de correlación calculado (r2 = 0,945).

Figura 9

Dispositivo de análisis HPLC empleado para extraer

y detectar fármacos inmunosupresores de un hemoli

zado de sangre entera.

Figura 10 Extracción de tacrolimus a partir de un hemolizado de sangre entera con un dispositivo SPE-HPLC-UV en línea. Se representa el cromatograma realizado a 291 nm (adsorción máxima del tacrolimus). La flecha indica el pico correspondiente al tacrolimus.

Figura 11 Extracción de rapamicina a partir de un hemolizado de sangre entera con un dispositivo SPE-HPLC-UV en línea. Se representa el cromatograma realizado a 278 nm (la adsorción máxima de la rapamicina). La flecha indica el pico correspondiente a la rapamicina.

Ejemplo 1

Evaluación de varios RAMs a distintos valores de pH Las columnas RAM se instalaron directamente en un sistema

de análisis HPLC. Se inyectaron 10 µl de solución de hemoglo

bina. Primero se efectuaron pruebas con tampones de aplicación de muestra (tampón A de elución) a pH 6,6 y pH 10,7 respectivamente. Para cada valor de pH se registraron las cantidades de hemoglobina no retenida y de hemoglobina retenida en la columna. También se evaluó el arrastre de la hemoglobina, inyectando blancos tras las inyecciones de hemoglobina.

El efluente de la columna se controló a 396 nm (adsorción máxima de la hemoglobina). Las columnas ensayadas son: LiChrospher® RP-18 ADS de Merck (Merck, Darmstadt, Alemania, número de pedido 1.50947.0001) y Biotrap 500 MS de ChromTech Ltd., Cogleton, Reino Unido, número de pedido BMS134K.

a) Evaluación de interferencias por hemoglobina a pH 6,6 (acetato amónico 5 mM)

Se utilizó una columna LiChrospher® RP-18 ADS de Merck. Se introdujeron en la columna 10 µl de muestra (150 mg/ml de hemoglobina disuelta en acetato amónico 5 mM a pH 6,6). Para eluir la hemoglobina se usó una fase móvil con dos tampones:

(A) acetato amónico 5 mM en H2O (pH 6,6) y (B) acetato amónico 5 mM en acetonitrilo (ACN) (pH 6,6), respectivamente. La elución se efectuó isocráticamente a 100% de (A) durante 15 minutos y luego con un gradiente lineal 100% de (A)-0% de (B) hasta 0% de (A)-100% de (B) en 30,0 minutos, seguida de una etapa de lavado a 100% de (B) durante 2,0 minutos para detectar hemoglobina unida reversiblemente al RAM. El flujo fue de 1,5 ml/minuto y todas las etapas se realizaron a temperatura ambiente.

A pH 6,6 la hemoglobina es predominante en la fracción

no retenida (ajustada a 100%), se eluye en parte a aproxima

damente 15% de (B) (24%) y también se encuentra en la etapa de lavado a 100% de (B) (4%). Sin embargo esta separación no es siempre reproducible y la cuantificación correcta de hemoglobina, tanto de la no retenida como de la retenida, es bastante difícil debido a la saturación del detector con el pico de hemoglobina no retenida y a la gran amplitud y llanura de los picos retenidos (véase figura 1). La presencia de hemoglobina en el pico de lavado es crítica, porque muy probablemente supondría la interferencia por hemoglobina en un dispositivo en línea para la medición de un analito contenido en una muestra de hemolizado. Al haber ya hemoglobina en la etapa de lavado, el riesgo de arrastrarla, es decir, el riesgo de interferencia en cualquier detección posterior de analitos por hemoglobina contenida en una muestra aplicada con anterioridad al sistema en línea, es muy elevado y, por ejemplo, podría contaminar las fuentes iónicas de electropulverización empleadas en la detección por espectrometría de masas.

b) Evaluación de interferencias por hemoglobina a pH 10,7 (etanolamina 10 mM)

Se utilizó una columna LiChrospher® RP-18 ADS de Merck. Se introdujeron en la columna 10 µl de muestra (150 mg/ml de hemoglobina disuelta en etanolamina 10 mM a pH 10,7). Para eluir la hemoglobina fijada al RAM se utilizó una fase móvil con dos tampones: (A) etanolamina 10 mM en H2O (pH 10,7) y

(B) etanolamina 10 mM en ACN (pH 10,7), respectivamente. La elución se efectuó isocráticamente a 100% de (A) durante 15 minutos y luego con un gradiente lineal 100% de (A)-0% de (B)

hasta 0% de (A)-100% de (B) en 30,0 minutos, seguida de una

etapa de lavado a 100% de (B) durante 2,0 minutos. El flujo fue de 1,5 ml/minuto y todas las etapas se realizaron a temperatura ambiente. A pH 10,7 la hemoglobina es predominante en la fracción no retenida (ajustada al 100%), se eluye en parte a aproximadamente 20% de (B) (20%) y no se encuentra a un nivel significativo en el pico de lavado (véase figura 2). La ausencia de hemoglobina en el pico de lavado, observada tras la aplicación de 100% de (B), es muy importante, porque indicaría que en estas condiciones de tamponamiento la hemoglobina no causaría ningún efecto memoria, es decir, no estaría presente en la siguiente medición efectuada con la misma columna. A pH 10,7 no se observó casi ningún arrastre. Este valor de pH parece adecuado para evitar que se arrastre hemoglobina entre diferentes inyecciones sobre el RAM y por tanto para evitar efectos de memoria.

Para que un método en línea sea completamente compatible con las condiciones rutinarias también es preciso que no esté alterado por problemas de arrastre. Al medir un analito contenido en una muestra de sangre entera hemolizada, estos problemas serían debidos con mayor probabilidad a un arrastre de hemoglobina, por ser de lejos el polipéptido más abundante en un hemolizado. El arrastre de hemoglobina se estudió realizando una inyección de blanco tras la muestra de hemoglobina. En vez de una muestra con hemoglobina se aplicaron a la misma columna de antes 10 µl de etanolamina 10 mM (pH 10,7). Todas las demás condiciones de tamponamiento/elución permanecieron invariables. Como puede verse en la figura 3 no puede detec

tarse hemoglobina en este blanco, lo cual significa que bajo

esas condiciones de tamponamiento no se encuentra hemoglobina en la fracción no retenida ni en la siguiente etapa. En estas condiciones de tamponamiento no habría ninguna interferencia por hemoglobina en la medición de un analito de interés.

Cabe destacar que estas observaciones tan positivas se hicieron en unas condiciones de tamponamiento/operación muy por encima del intervalo de pH especificado por el fabricante para esta columna RAM.

Ejemplo 2

Cuantificación de hidrocloruro de tetraciclina en hemolizados de sangre entera

En esta serie de experimentos se usó una columna Biotrap 500 MS®. Se hemolizó diferencialmente sangre entera y se usó como muestra o matriz para adicionar un analito de potencial interés. En vista de las experiencias positivas descritas en el ejemplo 1 se emplearon los tampones de aplicación y detección de pH 10,7. Para la detección específica de analitos se usó un espectrómetro de masas del tipo cuadrupolo lineal.

a) Preparación de hemolizados de sangre

Se conservó a +4ºC sangre entera anticoagulada hasta el momento del análisis. El reactivo para hemolisis diferencial se preparó mezclando 0,7 g de C13H28ClN (cloruro de 1-metiloctil-pirrolidinio) y 0,3 g de KSCN en 25 ml de H2O.

Los hemolizados de sangre se obtuvieron mezclando con agitación suave una muestra de sangre diluida 1:10 (en NaCl 150 mM) y reactivo de lisis en proporción 1 a 1. Al cabo de pocos minutos la muestra de sangre quedó transparente y lista

para inyectar en el sistema HPLC-MS. Por desgracia el efecto

espectacular de la hemolisis diferencial no puede apreciarse fácilmente en las reproducciones en blanco y negro. Por lo tanto no se muestra ninguna fotografía. No obstante este procedimiento que proporciona una muestra transparente de sangre entera hemolizada diferencialmente es fácil de reproducir por el especialista. Hay que señalar que fue imposible preparar hemolizados (diferenciales) apropiados después de diluir la sangre en etanolamina 10 mM. Por lo tanto, primero se prepararon hemolizados de sangre en condiciones neutras, mezclando 300 µl de sangre entera con 2,7 ml de NaCl 150 mM y luego con 3 ml de reactivo de lisis. Después la muestra de sangre hemolizada diferencialmente se inyectó en condiciones básicas (en etanolamina 10 mM, pH 10,7) en el aparato de HPLC-MS descrito más adelante.

b) Dispositivo experimental

En la figura 4 se representa un esquema del dispositivo analítico. La muestra se inyectó a través de Biotrap 500 MS a pH 10,7 y después que la hemoglobina contenida en la muestra hubo atravesado la columna el analito de interés se transfirió a la HPLC y a la detección por espectrometría de masas, accionando una válvula de 6 vías. La bomba de carga era una bomba P680 HPLC, de Dionex, Alemania, y el sistema inyector consistía en una válvula Rheodyne de 6 vías (7725), montada con un bucle exterior de 2,5 ml. La hemoglobina se controló con un detector de haz de diodos UVD340U (Dionex) instalado tras la trampa de columna Biotrap 500 MS. La unidad de conmutación constaba de una válvula Rheodyne de 6 vías (7000). La

elución se realizó mediante una columna analítica Prontosil

300-5-C18-H 5 µm (125 x 2,0 mm), de Bischoff Analysentechnik und Geräte Leonberg, Alemania. El aporte de eluyente se efectuó con una bomba Rheos 2000, de Flux Instruments, Suiza. La detección MS de los analitos se realizó con un aparato tipo cuadrupolo lineal, Surveyor MSQ, de Thermo Finnigan, CA, USA.

c) Detección de tetraciclina

Se emplearon dos muestras diferentes y se compararon los respectivos cromatogramas. La primera muestra era de hemolizado puro, sin añadir tetraciclina. La segunda era de hemolizado aditivado con tetraciclina. Para la segunda muestra se introdujeron 30 ng de hidrocloruro de tetraciclina en 3 ml de hemolizado de sangre entera (150 µl de sangre + 1.350 µl de NaCl 150 mM + 1.500 µl de reactivo de lisis). La concentración resultante de hidrocloruro de tetraciclina debe corresponder a 200 pg/µl en sangre entera.

Se inyectaron 2,5 ml de cada muestra a través de Biotrap 500 MS y se lavó con etanolamina 10 mM a 3,2 ml/min. Al cabo de 18 minutos se accionó la válvula de 6 vías y se eluyó a través de la columna analítica a 300 µl/minutos (tampón (A): H2O + 0,05% de TFA, tampón (B): ACN + 0,05% de TFA; gradiente lineal 10-30% de (B) en 7,5 minutos seguido de 30-100% de (B) en 2,5 minutos y condiciones isocráticas de 100% de (B) durante 2 minutos). La detección por espectrometría de masas se llevó a cabo mediante una regulación m/z 445,2 ± 1,0. En las figuras 5 y 6 se representan respectivamente cromatogramas de control iónico correspondientes a una inyección de blanco y a una inyección de 200 pg de hidrocloruro de tetraciclina por

µl de sangre. Como demuestran estas figuras se pudo detectar

tetraciclina a 200 pg/µl en hemolizados de sangre entera. Sin embargo la elución próxima de un compuesto con la misma m/z no permite detectar tetraciclina a niveles mucho más bajos o en muestras menos concentradas. Este problema se afrontará en futuros ensayos, controlando selectivamente la reacción en un espectrómetro de masas de trampa iónica o triple cuadrupolo.

d) Experimentos de arrastre

Para controlar el arrastre de la hemoglobina a través de Biotrap 500 MS se inyectaron 2,5 ml de un hemolizado de sangre entera. La etapa de carga en la Biotrap 500 MS se llevó a cabo con etanolamina 10 mM a 3,2 ml/minuto durante 18 minutos. Después se accionó la válvula de 6 vías y se efectuó una elución por retrolavado con un gradiente de ACN + 0,05% de TFA (10-30% de (B) en 7,5 minutos, 30-100% de (B) en 2,5 minutos, 100% de (B) durante 2,0 minutos y 0% de (B) durante 7,9 minutos).

Durante la elución por retrolavado el bucle de muestra se lavó con un gradiente de etanolamina 10 mM en H2O (A) a etanolamina 10 mM en ACN (B) (por ejemplo 0% de (B) durante 2 minutos, 0-100% de (B) en 4 minutos, 100% de (B) durante 6 minutos y 0% de (B) durante 7,9 minutos).

El arrastre de hemoglobina a través de la Biotrap 500 MS se controló inyectando un blanco tras la inyección de hemolizado. La detección tuvo lugar a 396 nm.

Como se desprende de la figura 7, no se observó ningún arrastre de hemoglobina, incluso cuando el hemolizado preparado por lisis de una muestra de sangre entera se aplicó al

Biotrap 500 MS a pH 10,7.

e) Curva de calibración

Se prepararon cinco muestras constituidas por hidrocloruro de tetraciclina agregado a sangre hemolizada. Las concentraciones de hidrocloruro de tetraciclina en sangre entera fueron de 200 pg/µl, 600 pg/µl, 1.000 pg/µl, 1.500 pg/µl y

2.000 pg/µl. Sus respectivas concentraciones en las soluciones hemolizadas para inyectar fueron: 9,5 pg/µl, 28,5 pg/µl, 47,5 pg/µl, 70,9 pg/µl y 94,3 pg/µl. Se inyectaron 2,5 ml de cada muestra y se analizaron del modo descrito arriba en (c). Las muestras se analizaron dos o tres veces.

Se registró una curva de calibración y se representó en la figura 8. Se observa una correlación lineal (R2 = 0,945) que demuestra la capacidad del Biotrap 500 MS para extraer cuantitativamente la tetraciclina, y por tanto muy probablemente otros antibióticos, de hemolizados de sangre entera en concentraciones clínicamente importantes (200 pg/µl en sangre entera). Las detecciones MRM en analizadores de triple cuadrupolo tendrían que poder evitar los errores de integración debidos a la coelución del analito con otros compuestos y por tanto seguir mejorando la medición de antibióticos. Se espera que las detecciones MRM alcancen límites aún más bajos.

Ejemplo 3

Extracción de fármacos inmunosupresores de un hemolizado de sangre entera

En el ejemplo 2 se ha mostrado la capacidad del Biotrap 500 MS para extraer antibióticos de un hemolizado de sangre entera. Animados por estos resultados positivos se iniciaron

nuevas investigaciones para comprobar si el método también se

podía aplicar a otros analitos de interés. Como los fármacos inmunosupresores son unos analitos de relevancia clínica muy importante se estudió si esta clase de analitos también podía detectarse mediante un elegante procedimiento en línea basado en el método descrito y empleado en el ejemplo 2.

Los analitos ensayados fueron el tacrolimus y la rapamicina. El tacrolimus se halla en el comercio como FK-506 mono-hidrato y se adquirió de Sigma (CAS # 109581-93-3) y la rapamicina (también denominada sirolimus) es igualmente de Sigma (CAS # 53123-88-9).

Se añadieron diferentes cantidades de un fármaco inmunosupresor a un hemolizado de sangre entera. La muestra se inyectó y se extrajo a través de Biotrap 500 MS a pH 10,7. Al cabo de 10 min, el fármaco inmunosupresor (o sea, el analito de interés) se transfirió a la columna analítica, accionando una válvula de 6 vías. En la figura 9 se ha representado un esquema del dispositivo analítico. La bomba de carga era una bomba P680 HPLC de Dionex y el sistema inyector consistía en una válvula Rheodyne de 6 vías (7725), montada con un bucle exterior de 2,5 ml. La unidad de conmutación constaba de una válvula Rheodyne de 6 vías (7000). La elución se realizó a través de una columna analítica Prontosil 300-5-C18-H 5 µm (125 x 2,0 mm), de Bischoff. El aporte de eluyente se realizó con una bomba Rheos 2000, de Flux Instruments. El analito se controló con un detector de haz de diodos UVD340U (Dionex) instalado tras la columna analítica. Por tanto aquí, a diferencia del montaje del ejemplo 2e), se escogió un dispositivo

de detección menos sensible y selectivo.

Primero se inyectó en el sistema HPLC un hemolizado sin añadir ningún fármaco inmunosupresor y se controló a 291 nm y 278 nm (es decir, la absorción máxima del tacrolimus y de la rapamicina, respectivamente).

Después se inyectaron soluciones de tacrolimus y rapamicina en el HPLC-UV, para determinar sus tiempos de retención. En el sistema HPLC-UV se inyectaron cantidades grandes de los inmunosupresores, a fin de lograr detecciones no ambiguas.

Por último se adicionó tacrolimus y rapamicina a hemolizados de sangre entera, que fueron analizados por SPE-HPLC-UV en línea. En las figuras 10 y 11 están representados los cromatogramas obtenidos tras una adición de tacrolimus y rapamicina a un hemolizado, correspondiente a una concentración de 291,1 ng/µL y 20,0 ng/µL, respectivamente. Como se ha demostrado (indicado por la flecha en estas figuras), pudo detectarse sin ambigüedad el tacrolimus y la rapamicina agregados a un hemolizado de sangre entera. Como podrá ver el especialista, las cantidades de fármacos inmunosupresores inyectadas en el sistema SPE-HPLC-UV fueron bastante elevadas. Los límites aproximados de detección con el haz de diodos UV son de 291,1 ng/µL y 20,0 ng/µL para el tacrolimus y la rapamicina, respectivamente. No obstante, como apreciará prontamente el especialista, se alcanzarían límites de detección más bajos, clínicamente relevantes, empleando por ejemplo espectrometría de masas tándem para el control selectivo de la reacción, tal como se ha descrito arriba para determinar tetraciclina.

Así pues, en conclusión, resulta que el uso de tampones

adecuados, en combinación con RAM comercialmente disponibles,

54 permite ahora la detección en línea de muchos analitos de interés a partir de una muestra de sangre entera, y puede tener importancia para el diagnóstico clínico, así como utilidad comercial.

Claims (9)

1. Método para detectar un analito en una muestra de sangre entera hemolizada, que comprende las etapas de

a) aplicar la muestra de sangre entera hemolizada, de la cual se sabe o se supone que contiene el analito de interés, a una columna rellena de material cromatográfico de acceso restringido (RAM) al que se fija el analito, b) eluir el analito del RAM y c) detectar el analito,

de modo que al menos en la etapa (a) se usa un tampón de pH superior a 8,0.

2.

El método de la reivindicación 1, en que el RAM se elige entre sílice porosa y partículas poliméricas porosas.

3.

El método según la reivindicación 1 o 2, en que la superficie interna del RAM fija el analito de interés mediante interacción hidrófoba, iónica o polar.

4.

El método según la reivindicación 3, en que los poros de la sílice porosa o de las partículas poliméricas porosas tienen una superficie interna hidrófoba y un recubrimiento exterior hidrófilo.

5.

El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en que la superficie interna del RAM fija el analito de interés por interacción hidrófoba.

6.

El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en que el tamaño de poro del RAM está comprendido entre 60 y 120 Å.

7.

El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el cual la fracción proteica comprende polipéptidos

de 15 kDa y más grandes.

8.

El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en que el analito se separa posteriormente por HPLC de fase inversa tras ser eluido de la columna RAM.

5 9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en que el analito tiene un peso molecular de 10 kDa o menos.

10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en que el analito se selecciona del grupo constituido

10 por fármacos inmunosupresores, estupefacientes, ácido fólico y vitámeros de ácido fólico.