ES2336382T3

ES2336382T3 - Medicion mejorada de la vitamina d.

Info

Publication number: ES2336382T3
Application number: ES07725793T
Authority: ES
Inventors: Uwe Kobold; Thomas Duelffer; Michael Grol; Rupert Herrmann; Herbert Von Der Eltz; Leopold Von Proff
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2006-06-06
Filing date: 2007-06-04
Publication date: 2010-04-12
Anticipated expiration: 2027-06-04
Also published as: EP2030026A2; US20100285603A1; CN101467048A; US8003400B2; WO2007140962A3; ATE452343T1; DE602007003833D1; CA2649338A1; CA2649338C; CN101467048B; JP2009540275A; JP4953477B2; EP2030026B1; WO2007140962A2

Abstract

Método para la medición de un metabolito de la vitamina D en una muestra, comprendiendo el método las etapas siguientes: a) tratar dicha muestra con un reactivo liberador bajo condiciones apropiadas para liberar el metabolito de la vitamina D respecto de la proteína ligante de vitamina D y no provocar la precipitación de proteínas, b) someter la muestra tratada que se ha obtenido en la etapa (a) a cromatografía líquida, y c) medir el metabolito de la vitamina D durante o después de la cromatografía líquida, en el que dicho reactivo liberador se basa en una sal que presenta un N-heterociclo cuaternario a modo de catión.

Description

Medición mejorada de la vitamina D.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a un método para medir un metabolito de la vitamina D en una muestra, comprendiendo el método las etapas siguientes: (a) tratar dicha muestra con un reactivo liberador de metabolito de la vitamina D bajo condiciones apropiadas para la liberación de un metabolito de la vitamina D a partir de vitamina D-proteína ligante y sin provocar la precipitación de las proteínas, (b) someter la muestra tratada que se ha obtenido en la etapa (a) a una separación cromatográfica, y (c) medir un metabolito de la vitamina D durante o después de dicha separación cromatográfica. La presente invención también se refiere a métodos para determinar el estatus de vitamina D en un sujeto y para la utilización en el diagnóstico de una enfermedad, y a agentes y kits para la utilización en la puesta en práctica de los métodos de la invención.

Tal como indica el término "vitamina", es crucial una ingestión suficiente de vitamina D. El nivel de vitamina D o de metabolitos de vitamina D circulantes en un sujeto se denomina "estatus de vitamina D". La mala nutrición con respecto a la vitamina D es un factor importante en el origen de algunas enfermedades, entre ellas el raquitismo infantil y la osteomalacia, e incluso la osteoporosis en adultos. El conocimiento del estatus de vitamina D mediante la medición de la vitamina D y de los metabolitos de la misma en una muestra clínica resulta muy útil en la evaluación de un paciente y pueden ayudar al médico clínico a establecer un diagnóstico. De esta manera, no es inesperado que se haya producido un incremento constante de los esfuerzos para mejorar los métodos de medición de la vitamina D y metabolitos de la misma en los líquidos corporales.

En la nutrición humana, la vitamina D se encuentra disponible en dos formas: como vitamina D_{2} o como vitamina D_{3}. La vitamina D_{2} se produce en el exterior del cuerpo mediante la irradiación del ergosterol procedente de levaduras y hongos, y se encuentra en el ser humano en el caso de que se ingiera en forma de alimentos enriquecidos o de preparaciones farmacéuticas. La vitamina D_{3}, por otra parte, se forma en animales a partir del 7-deshidrocolesterol bajo exposición a luz ultravioleta. Esta reacción se produce en la piel. La vitamina D_{3} también se encuentra disponible en la dieta, por ejemplo en aceites de hígado de pescado.

La vitamina D nutricional, en forma de vitamina D_{2} o D_{3}, tras su incorporación en el cuerpo humano resulta rápidamente convertida en el metabolito circulante, la 25-hidroxivitamina D, que se encuentra, en el exterior de las células, fuertemente unida a proteína en circulación ligante de vitamina D.

Debido a la rápida conversión de la vitamina D en su primer metabolito, la 25-hidroxivitamina D, la medición de la vitamina D no proporciona una indicación útil del estatus de vitamina D en un sujeto. Otros metabolitos de la vitamina D, tales como la 1\alpha,25-dihidroxivitamina D, circulan a una concentración 1.000 veces inferior a la de los metabolitos 1\alpha-hidroxilados, tales como la 25-hidroxivitamina D, y por lo tanto no contribuyen significativamente a la estimulación del metabolito de vitamina D total circulante. Por ello, los metabolitos l\alpha-hidroxilados no proporcionan una indicación directa o útil del estatus de vitamina D. La 25-hidroxivitamina D es el metabolito con la concentración sérica más alta y resulta fácil de medir. Por lo tanto, se ha convertido en el marcador más común del estatus de vitamina D en un sujeto.

Los metabolitos de la vitamina D también se unen a otras proteínas séricas, por ejemplo a la albúmina, aunque mucho menos estrechamente que a la proteína ligante. Se acepta generalmente que los métodos que facilitan la liberación de la vitamina D de un complejo de vitamina D-proteína ligante de vitamina D también resultarán apropiados para liberarlo de otros complejos menos fuertes. De esta manera, la rápida y fuerte unión de diversos metabolitos de la vitamina D a la proteína ligante de vitamina D es el problema principal durante la detección de un metabolito de la vitamina D y dificulta enormemente la medición. Todos los métodos conocidos actualmente requieren que los metabolitos de la vitamina D se liberen de la proteína ligante de vitamina D. En estos procedimientos, la proteína ligante de vitamina D habitualmente se desnaturaliza. Esto típicamente requiere también una etapa de extracción que separa la proteína ligante de vitamina D conjuntamente con otras proteínas desnaturalizadas respecto del metabolito de interés de la vitamina D y elimina la fracción de proteína desnaturalizada de la muestra. De esta manera, los metabolitos de interés de la vitamina D se encuentran disponibles en una fracción separada y resultan más fáciles de manipular y detectar.

La extracción se ha llevado a cabo mediante varios métodos, incluyendo la extracción basada en un solvente mediante la adición a la muestra de un solvente orgánico, tal como cloroformo, hexano o acetato de etilo y hexano. Las capas orgánicas y acuosas se separan y el solvente se evapora. A continuación, el residuo se reconstituye en un solvente miscible en agua, tal como etanol. También se han utilizado métodos de extracción con cartucho de fase inversa. Entre otros métodos tradicionales se incluyen la utilización de HPLC y la espectroscopía de masas para conseguir la separación de metabolitos individuales de la vitamina D y excluir de la muestra factores interfirientes, tales como proteínas ligantes.

Armbruster F.P. et al. (patente WO nº 99/67211) enseñan que una muestra de suero o de plasma puede tratarse con etanol con el fin de liberar un metabolito de la vitamina D respecto del complejo de éste y proteína ligante de vitamina D. La proteína precipitada se peletiza y se obtiene un metabolito de vitamina D en el sobrenadante. El metabolito de vitamina D comprendido en dicho sobrenadante puede detectarse fácilmente, por ejemplo mediante cualquier método basado en cromatografía líquida.

Se propone una solución alternativa en la patente EP nº 0 753 743. Se recomiendan las sales peryodato para conseguir la liberación de un metabolito de vitamina D respecto de la proteína ligante de vitamina D. De manera rutinaria, el precipitado que comprende la proteína ligante de vitamina D se separa mediante centrifugación y el sobrenadante se utiliza para la detección de un metabolito de interés de la vitamina D.

Vogeser M. et al., Clin. Chem. 50:1415-1417, 2004, han proporcionado recientemente el documento "Candidate reference method for the quantification of circulating 25-hydroxyvitamin D_{3} by liquid chromatography-tandem mass spectrometry" ("Método candidato de referencia para la cuantificación de 25-hidroxivitamina D_{3} circulante mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem"). Para la cuantificación exacta se propone la utilización de 25-hidroxivitamina D_{3} marcada con un isótopo estable. El estándar interno marcado isotópicamente se copurifica con la 25-hidroxivitamina D_{3} natural y mediante la determinación de dicho estándar interno resulta posible compensar las variaciones en el procedimiento de extracción y/o de detección. Al igual que la mayoría de procedimientos rutinarios utilizados para medir un metabolito de la vitamina D, el método descrito por Vogeser et al. se basa en una etapa de extracción con acetonitrilo.

Bouillon R. et al. , Clin. Chem. 30:1731-1736, 1984, describen dos ensayos "directos" para 25-hidroxivitamina D. Aunque los ensayos descritos no requieren una etapa cromatográfica, tal como resulta necesario en métodos más tradicionales, todavía requieren la extracción de la vitamina D de las proteínas ligantes de vitamina D mediante la utilización de precipitación con solvente.

Holick M.F. y Ray R. (patente US nº 5.981.779) describen métodos para el ensayo de la vitamina D y metabolitos de la misma. Su procedimiento se basa en un ensayo de unión competitiva utilizando una proteína ligante purificada de vitamina D como el agente de unión específica. Un requisito para este ensayo también es que debe aislarse en primer lugar un metabolito de interés de la vitamina D de la muestra, separarse de su proteína ligante y únicamente entonces puede realizarse la medición.

Durante la medición de determinadas hormonas esteroides de suero, plasma u otros líquidos biológicos, se utilizan análogos esteroides para desplazar estas hormonas de sus proteínas ligantes. Dichos análogos esteroides deben unirse a las proteínas ligantes de esteroide relevantes y simultáneamente no deben reaccionar cruzadamente con el anticuerpo utilizado en el inmunoensayo. El análogo de esteroide satura la proteína ligante de esteroide, desplazando el esteroide y permitiendo que éste se una a los anticuerpos del inmunoensayo.

En teoría, la utilización de un desplazador competitivo (específico) tal como un análogo de la vitamina D que no reaccione cruzadamente con el anticuerpo del ensayo, debería poder proporcionar un "ensayo directo" (por analogía con los métodos directos de medición de los esteroides). Sin embargo, debido a que la concentración de DBP es muy alta en las muestras de suero, se prevé que resultarían necesarias concentraciones muy altas de dicho análogo de vitamina D.

Recientemente, Laurie et al. (patente US nº 2004/0096900) han demostrado que el ácido 8-anilino-1-naftalensulfónico puede utilizarse para desplazar un metabolito de la vitamina D respecto de la proteína ligante de vitamina D. A continuación, se mide el metabolito de la vitamina mediante un inmunoensayo enzimático competitivo.

Otros procedimientos de ensayo inmunológico para la detección de determinados metabolitos de la vitamina D (ver, por ejemplo, las patentes WO nº 02/57797 y US nº 2004/0132104) deben alcanzar un delicado equilibrio. Por una parte, debe liberarse un metabolito de la vitamina D de la manera más eficiente posible de su proteína ligante; por otra parte, los reactivos utilizados para dicha liberación no deben interferir con el procedimiento de inmunoensayo. Aparentemente estos procedimientos de alguna manera deben alcanzar un compromiso entre estos dos requisitos. Se ha encontrado y demostrado que los ensayos inmunológicos de la vitamina D disponibles en la actualidad adolecen de bas-
tante desventajas, tal como ha sido descrito, por ejemplo, por Zerwekh J.E., Ann. Clin. Biochem. 41:272-281, 2004).

Los inmunoensayos son bastante complicados y requieren muchos reactivos específicos y en la mayoría de casos también aparatos, para producir un resultado clínicamente relevante. Por el contrario, los procedimientos de separación cromatográfica son muchos menos exigentes en términos de los reactivos necesarios. En la actualidad, la mayoría de procedimientos rutinarios para la medición de un metabolito de la vitamina D se basan en por lo menos una etapa de extracción, seguido de por lo menos una etapa de separación cromatográfica. A esta separación cromatográfica habitualmente sigue directamente una etapa apropiada de detección. Representaría una mejora significativa en la rutina clínica poder liberar eficientemente un metabolito de interés de la vitamina D respecto de su proteína ligante, de manera que el método no provocase un impacto negativo sobre otros constituyentes de la muestra, por ejemplo sin precipitación de proteínas, y después se midiese sin ninguna etapa de manipulación manual, por ejemplo sin necesidad de una etapa de extracción y/o de centrifugación.

La presente invención ayuda a superar, o por lo menos a reducir, algunos de los problemas asociados a los procedimientos de la técnica anterior, mediante la provisión de un método para la medición de un metabolito de la vitamina D presente en una muestra, de manera que el método mejorado se combina fácilmente y se basa en un procedimiento estándar de cromatografía líquida y no requiere ninguna manipulación manual.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere a un método para la medición de un metabolito de la vitamina D en una muestra, comprendiendo el método las etapas siguientes: (a) tratar dicha muestra con un reactivo liberador de la vitamina D bajo condiciones apropiadas para la liberación de un metabolito de la vitamina D respecto de proteína ligante de vitamina D y sin provocar la precipitación de las proteínas, (b) someter la muestra tratada que se ha obtenido en la etapa (a) a una separación cromatográfica, y (c) medir un metabolito de la vitamina D durante o después de dicha separación cromatográfica, en la que dicho reactivo liberador se basa en una sal que presenta un N-heterociclo cuaternario a modo de catión.

De esta manera, la presente invención satisface la urgente necesidad de un método simple aunque eficaz para medir un metabolito de interés de la vitamina D en una muestra de suero o plasma. Se basa en el inesperado descubrimiento de un reactivo liberador de vitamina D apropiado que permite la liberación y separación cromatográfica directa en línea de un metabolito de la vitamina D respecto de la proteína ligante de vitamina D. De esta manera, puede detectarse o medirse la cantidad de un metabolito de la vitamina D sin necesidad de extraerlo de la muestra. En esencia, la invención da a conocer por vez primera que los reactivos liberadores de vitamina D apropiados pueden eliminar la necesidad de una etapa de extracción en la detección en línea de la vitamina D. Además, un método nuevo y apropiado basado en la utilización del reactivo liberador de vitamina D resulta adecuado para la utilización rutinaria en laboratorios de bioquímica clínica.

La presente invención puede llevarse a cabo con cualquier muestra de plasma o suero, preferentemente procedente de un individuo. El individuo para el que debe analizarse el plasma o suero puede ser un individuo para el que resulta deseable determinar el estatus de vitamina D. La medición de un metabolito de interés de vitamina D presente en una muestra de plasma o suero puede incluir mediciones tanto cualitativas como cuantitativas, es decir la detección de la presencia de un metabolito de interés de la vitamina D en la muestra, o la determinación de la cantidad de un metabolito de la vitamina D presente, respectivamente. Preferentemente, la cantidad de un metabolito de interés de la vitamina D se compara con una tabla que detalla si la cantidad medida representa una deficiencia o un exceso de dicho metabolito de vitamina D.

Puede medirse uno o más metabolitos cualesquiera de la vitamina D en el método de la presente invención. En una realización preferente, se mide en una muestra un metabolito de interés específico de la vitamina E, aunque se contempla que, para algunas aplicaciones, pueda resultar preferente medir dos o más tipos de los metabolitos de vitamina D en una muestra. Preferentemente, el metabolito de interés de la vitamina D se selecciona de entre el grupo que consiste de 25-hidroxivitamina D_{2}, 25-hidroxivitamina D_{3}, 24,25-dihidroxivitamina D_{3}, 25,26-dihidroxivitamina D y 1,25-dihidroxivitaminas D_{2} y D_{3}. Las 25-hidroxivitaminas D_{2} y D_{3} son metabolitos de la vitamina D medidos preferentemente según el método de la invención. En una realización preferente, el metabolito de la vitamina D es la 25-OH-vitamina D_{3}.

La liberación de la vitamina D se refiere a la separación total o parcial de algunos o todos los metabolitos de la vitamina D respecto de la proteína ligante de vitamina D. Resulta preferente la liberación de sustancialmente la totalidad de los metabolitos de la vitamina D presentes en la muestra respecto de la proteína ligante de vitamina
D.

Ahora ha podido mostrarse y demostrarse que resulta posible liberar un metabolito de interés de vitamina D respecto de su complejo con proteína ligante de vitamina D bajo condiciones que permiten la liberación del metabolito de vitamina D por una parte, y que no provocan la precipitación de proteínas, por otra parte. Con el fin de permitir la liberación del metabolito de vitamina D, resulta necesaria una concentración mínima apropiada del reactivo liberador. La concentración máxima posible es la concentración que todavía no provoca la precipitación de los constituyentes de la muestra, tales como las proteínas.

Se ha encontrado y se ha establecido que la eficacia de un reactivo liberador de vitamina B puede determinarse fácilmente mediante la utilización del sistema Biacore. Para esta evaluación se utiliza un chip Biacore recubierto con estreptavidina. Este chip con estreptavidina seguidamente se satura con 25-hidroxivitamina D_{3} biotinilada y seguidamente con proteína ligante de vitamina D. A continuación, se libera la proteína ligante de vitamina D mediante la aplicación del reactivo candidato liberador de vitamina D al chip de estreptavidina/25-hidroxivitamina D_{3} biotinilada/proteína ligante de vitamina D. La concentración mínima apropiada de reactivo liberador de vitamina D se determina como la concentración mínima que resulta en la liberación de por lo menos 99% de la proteína ligante de vitamina D unida. Estas condiciones imitan muy bien las condiciones presentes al liberarse vitamina D de su proteína ligante en una muestra de suero o plasma. La concentración mínima de un reactivo candidato liberador de vitamina D según se determina con el sistema Biacore es igual a la concentración mínima requerida para la liberación eficiente de 25-OH-vitamina D_{3} respecto de la proteína ligante de vitamina D en una muestra utilizando dicho reactivo candidato liberador de vitamina D.

Tal como se ha indicado, la proteína ligante de vitamina D en el análisis Biacore se diluye en el reactivo candidato liberador de vitamina D. Resulta evidente para el experto en la materia que la concentración final mínima del agente liberador de vitamina D en una mezcla con la muestra bajo investigación debe ser por lo menos igual a la concentración determinada mediante análisis Biacore. En el caso de que, por ejemplo, se mezclen muestra y reactivo liberador de vitamina D en una proporción de 1:1, el agente liberador debe concentrarse doblemente en comparación con la concentración con el sistema Biacore, antes de mezclarlo con la muestra. De esta manera, la concentración mínima determinada tal como se ha indicado anteriormente se encuentra presente en la mezcla de muestra y reactivo liberador.

Los agentes preferentes para la utilización en la presente invención son reactivos químicos que pueden actuar rompiendo o destruyendo el enlace entre un metabolito de la vitamina D y la unión de la misma.

El reactivo liberador de vitamina D de la invención se basa en una sal que presenta un N-heterociclo cuaternario a modo de catión. Los cationes preferentes se seleccionan de entre el grupo que consiste de cationes pirazolio, cationes imidazolio, cationes triazolio, cationes piridinio, cationes piridazinio, cationes pirimidinio, cationes pirazinio y cationes triazinio. Los cationes preferentes son aquellos basados en un núcleo heterocíclico imidazolio. Preferentemente el anión se selecciona de entre aniones inorgánicos halogenados, nitratos, sulfatos, carbonatos, sulfonatos y carboxilatos. Preferentemente el anión puede seleccionarse de entre cloruro, hexafluorofosfato, tetrafluoroborato, trifluoroacetato, benzoato, salicilato y rodanida. Las combinaciones de los caationes y aniones anteriormente indicados en la mayoría de casos son extremadamente miscibles en agua. Muchos incluso son solubles sin agua.

Los reactivos apropiados para la liberación de vitamina D preferentemente se seleccionan de entre el grupo que consiste de tetrafluoroborato de 1-butil-4-metilpiridinio, octilsulfato de 1-butil-3-metil-imidazolio, cloruro de 1-butil-3-metilpiridinio, cloruro de 1-hexilpiridinio, cloruro de 1-metil-1-octilpirrolidinio, cloruro de N-octilpiridinio, cloruro de 3-carbamoil-1-octiloximetilpiridinio, KBr, KJ y KSCN, y de combinaciones de los mismos. Preferentemente, dicha combinación comprende cinco o menos de dichos compuestos. Preferentemente puede utilizarse una mezcla de cuatro, tres o dos de dichos compuestos. También resulta preferente la utilización de un único compuesto.

El reactivo para la hemólisis diferencial también puede seleccionarse de entre el grupo que consiste de tetrafluoroborato de 1-butil-4-metilpiridinio, tetrafluoroborato de 1-butil-3-metilimidazolio, octilsulfato de 1-butil-3-metil-imidazolio, cloruro de 1-butil-3-metilpiridinio, cloruro de 1-hexilpiridinio, cloruro de 1-metil-1-octilpirrolidinio, cloruro de N-octilpiridinio y cloruro de 3-carbamoil-1-octiloximetilpiridinio. Resulta adicionalmente preferente utilizar una mezcla de por lo menos uno de dichos reactivos y KSCN.

Tal como se ha indicado anteriormente, un método para la determinación cromatográfica en línea de un metabolito de la vitamina D en una muestra de suero o plasma resultaría altamente deseable. Inesperadamente ahora se ha podido establecer que dicho método resulta factible y que presenta ventajas evidentes en comparación con la medición rutinaria de un metabolito de la vitamina D. Con el fin de satisfacer dichos requisitos, el metabolito de la vitamina D debe liberarse eficientemente, aunque simultáneamente el reactivo liberador apropiado de la vitamina D no debe provocar la precipitación de las proteínas.

La precipitación de las proteínas en el sentido de la presente invención se evalúa mediante la aplicación de manera estandarizada de una muestra de plasma o suero tratada con un reactivo candidato liberador de vitamina D a una frita estándar, por ejemplo a una frita como parte de una columna de HPLC.

Para evaluar si un reactivo candidato liberador de vitamina D no provoca la precipitación, es decir resulta apropiado para la LC en línea posterior, dicho reactivo se mezcla 1 a 1 con una muestra de plasma o suero y se incuba durante por lo menos 15 minutos y durante como máximo 60 minutos a 20ºC. Se aplican 50 alícuotas de 10 \mul de la muestra procesada de esta manera a una frita con un diámetro de 2 mm y 0,5 \mum de tamaño de poro. Se monitoriza la retropresión. Un reactivo candidato para la liberación de vitamina D que causase un incremento de la retropresión de 20 barias o superior, en el caso de que la retropresión para la inyección 50 y la retropresión para la primera inyección se comparasen entre sí, se consideraría inapropiado. De esta manera, la concentración máxima de un reactivo liberador de vitamina D apropiado puede identificarse fácilmente como no causante en absoluto de un incremento de la retropresión o como causante de un incremento de la retropresión inferior a 20 barias durante el análisis anteriormente indicado.

Preferentemente el filtro utilizado en el análisis anteriormente indicado es una frita para HPLC. Preferentemente dicha frita es de acero inoxidable y presenta un grosor de 1/32 pulgadas. También resulta preferente que la frita forme parte de una columna de HPLC de 20 mm de longitud y diámetro de la columna interior de 2 mm, la cual encuentra rellena de partículas C8 Symmetry® de 3,5 \mum con un tamaño de poro de 100 \ring{A} como material del lecho.

Tal como apreciará fácilmente el experto en la materia, la muestra de suero o plasma utilizada para dicha evaluación se obtiene de un individuo sano, es decir un individuo que no presenta ninguna enfermedad conocida y con valores bioquímicos comprendidos dentro de intervalos normales.

Preferentemente, el reactivo apropiado liberador de vitamina D se caracteriza adicionalmente porque la concentración (mínima) requerida para la liberación de la vitamina D respecto de la proteína ligante de vitamina D y la concentración (máxima) tolerada y que no provoca precipitación se diferencian por lo menos en un factor de dos. Cuanto más amplia sea la ventana entre las concentraciones mínima y máxima, más fácil resultará la utilización de dicho reactivo en el diagnóstico clínico rutinario. Resulta adicionalmente preferente que el reactivo liberador de vitamina D se utiliza a una concentración final correspondiente al valor de la media más/menos 25% de la concentración mínima y la concentración máxima. Resulta adicionalmente preferente que la concentración final se ajuste a un valor comprendido entre más o menos 20% del valor de la media de las concentraciones mínima y máxima.

Mientras que todos los reactivos de la técnica anterior, tales como etanol o acetonitrilo, causaban la precipitación en el caso de que se utilizasen a concentración elevada, algunos de los reactivos actualmente investigados pueden utilizarse a concentraciones muy altas sin provocar en absoluto la precipitación de las proteínas. Preferentemente, el reactivo liberador de vitamina D de la presente invención se utiliza a una concentración no superior a 75% en peso/volumen, también preferentemente no superior a 50% en peso/volumen.

Una muestra de plasma o suero tratada con un reactivo apropiado liberador de vitamina D según la presente invención puede someterse directamente a cromatografía líquida.

La cromatografía líquida (LC) es una técnica analítica extremadamente importante que se utiliza para la separación, identificación y cuantificación de un analito de interés, por ejemplo un metabolito de la vitamina D. Durante la LC, los componentes químicos en una mezcla resultan arrastrados a través de una fase estacionaria por el flujo de una fase líquida móvil. La separación en la cromatografía líquida se consigue por medio de diferencias en las interacciones de los analitos con las fases tanto móvil como estacionaria. Según el criterio del experto en la materia deberán seleccionarse fases tanto estacionaria como móvil apropiadas para los analitos investigados. Además, el usuario identificará las condiciones cromatográficas apropiadas para mantener la definición de las bandas o picos de los analitos a medida que la muestra se desplaza a través de la columna de fase estacionaria hasta el detector.

La cromatografía líquida de alto rendimiento, también conocida como cromatografía líquida a alta presión, abreviada HPLC, es una forma especial de cromatografía líquida y en la actualidad se utiliza frecuentemente en bioquímica y en química analítica. El analito se fuerza a través de una columna de fase estacionaria en un líquido (fase móvil) a alta presión, lo que reduce el tiempo durante el que los componentes separados permanecen en la fase estacionaria y de esta manera el tiempo de difusión dentro de la columna. Esto conduce a picos más definidos en el cromatograma resultante y, por consiguiente, a mejores resolución y sensibilidad en comparación con la LC.

La fase móvil se selecciona para garantizar la solubilidad de los solutos de la muestra. Para la fase estacionaria, se utiliza preferentemente sílice microparticulado (virgen o modificado químicamente), debido a que su elevada área superficial acentúa las diferencias entre interacciones de soluto-fase estacionaria. La utilización de una fase estacionaria que interacciona fuertemente con los solutos, en comparación con las interacciones de soluto-fase móvil resultará en tiempos de retención muy prolongados, una situación que no resulta analíticamente útil. Por lo tanto, la fase estacionaria debe seleccionarse para que proporcione interacciones de soluto débiles a moderadas en comparación con aquéllas producidas en una fase móvil. En consecuencia, la naturaleza del soluto gobierna el tipo de LC seleccionada. Las interacciones más fuertes deben producirse en la fase móvil, para garantizar la solubilidad de la muestra y la fácil elución, mientras que la fase estacionaria debería responder a diferencias más sutiles entre los solutos. Por ejemplo, los compuestos neutros polares habitualmente se analizan mejor utilizando una fase móvil polar conjuntamente con una fase estacionaria no polar que distinga diferencias sutiles en el carácter dispersivo de los solutos. Uno de los aspectos potentes de la HPLC es que la fase móvil puede modificarse para alterar el mecanismo de retención. Pueden añadirse modificadores a la fase móvil para controlar la retención. Por ejemplo, el pH es una variable importante en las fases móviles acuosas.

Pueden distinguirse cinco clases generales de LC:

1. La cromatografía de fase normal exige la utilización de una fase estacionaria polar conjuntamente con una fase móvil (dispersiva) no polar.

2. La cromatografía de fase inversa, la posibilidad contraria, exige la utilización de una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar (compuesta de uno o más de los solventes polares, por ejemplo agua, metanol, acetonitrilo y tetrahidrofurano).

3. La cromatografía de intercambio iónico implica interacciones iónicas. En este caso, la fase móvil debe permitir la ionización para garantizar la solubilidad de los solutos iónicos. La fase estacionaria también debe ser parcialmente iónica para estimular cierta retención. En consecuencia, las interacciones con la fase estacionaria son fuertes, y esto habitualmente se refleja en tiempos de análisis más prolongados y picos anchos.

4. La cromatografía por exclusión de tamaños implica separaciones basadas en el tamaño molecular únicamente e idealmente requieren que no se produzca ninguna interacción energética de los solutos con la fase estacionaria.

5. La cromatografía de afinidad se basa en una interacción específica, por ejemplo entre los miembros de una pareja de unión específica, por ejemplo un antígeno y el anticuerpo o receptor correspondiente y el ligando correspondiente. Por ejemplo, un primer miembro de una pareja de unión se une a una fase estacionaria apropiada, utilizándolo para capturar el segundo miembro de la pareja de unión. El segundo miembro puede liberarse y aislarse por medios apropiados.

La clasificación general de los principios de separación proporcionados anteriormente no es exhaustiva y por lo tanto no es limitativa; existen otros principios de separación que pueden utilizarse para la separación de muestras líquidas, por ejemplo la cromatografía de interacción hidrofóbica, la cromatografía de interacción hidrofílica, la cromatografía de pares iónicos, la separación basada en materiales con huella molecular.

En aplicaciones rutinarias, la fase estacionaria, el denominado material de lecho, por ejemplo partículas de sílice en una aplicación de RP-HPLC, se empaqueta en una columna apropiada y se protege con una frita. El material de la frita habitualmente se selecciona para que presente, por ejemplo, un tamaño de poro menor que el tamaño de poro entre partículas del material del lecho.

En los métodos de HPLC, el diámetro de las partículas de la fase estacionaria habitualmente se encuentra comprendido en el intervalo de entre 1 y 10 \mum. Estas partículas pequeñas requieren la utilización de una presión elevada en la HPLC. El material del lecho habitualmente se protege con una frita. Las fritas típicas presentan un tamaño de poro de 1 \mum, 0,45 \mum ó 0,2 \mum. Cuanto más pequeñas sean las partículas, más pequeño es habitualmente el tamaño de poro de la frita. En el caso de que una muestra comprenda un constituyente capaz de bloquear una frita de HPLC, el bloqueo resultará perjudicial para cualquier análisis rutinario. Tal como apreciará el experto en la materia, el bloqueo de la frita utilizada en una columna de HPLC se producirá más rápidamente cuanto más pequeño sea el tamaño de poro de la frita y menor sea la columna y, correspondientemente, el diámetro de la frita. En el caso de que no se seleccione apropiadamente la frita, es decir que presente un tamaño de poro excesivamente grande, el tamaño de partícula del material de la columna también resultaría importante y la columna misma se bloquearía más rápidamente cuanto más pequeñas fuesen las partículas. Sin embargo, el experto en la materia seleccionará el tamaño de poro de la frita para satisfacer los requisitos de protección del material del lecho de la columna.

En el caso de que una muestra de plasma o suero se trate, por ejemplo, con acetonitrilo para liberar la vitamina D de su complejo con proteína ligante de vitamina D, una gran cantidad de proteínas resultan desnaturalizadas y precipitan. Dicha muestra no puede aplicarse a una columna de HPLC en cualquier contexto rutinario, debido a que bloquearía la columna y provocaría la parada de todo el sistema.

Mediante el tratamiento de la muestra de suero o plasma con un reactivo liberador de vitamina D según la presente invención ahora resulta posible aplicar directamente dicha muestra tratada a una columna de HPLC sin correr el riesgo de bloquearla. Preferentemente esta etapa de la HPLC se lleva a cabo en línea con la muestra obtenida mediante le tratamiento con el reactivo liberador de vitamina D. Preferentemente, las partículas de fase estacionaria utilizadas en dicha etapa de HPLC se encuentran comprendidas en el intervalo de entre 1 y 10 \mum, también preferentemente en el intervalo de entre 2 y 7 \mum de diámetro. Preferentemente, la frita utilizada en dicha etapa de HPLC presenta un tamaño de poro de 0,5 \mum o, también preferentemente, de 0,2 \mum.

Tal como se ha indicado anteriormente, debe procurarse que el reactivo liberador de vitamina D no provoque la precipitación de las proteínas.

El analito de interés puede detectarse mediante cualquier medio apropiado. Los detectores apropiados y preferentes detectan el paso de un compuesto y proporcionan una señal electrónica a un registrador u ordenador-estación de datos. Los resultados habitualmente se encuentran en forma de cromatograma y habitualmente se encuentra una sustancia de interés en un pico determinado. El área del pico o la altura del pico pueden utilizarse para cuantificar la cantidad de analito presente en la muestra investigada.

El detector para un sistema de HPLC es el componente que emite una respuesta producida por el compuesto eluido de la muestra, proporcionando posteriormente una señal de un pico en el cromatograma. Se sitúa inmediatamente después de la fase estacionaria con el fin de detectar los compuestos a medida que son eluidos de la columna. Los parámetros de detección y de sensibilidad pueden ser controlados por el experto en la materia. Existen muchos tipos de detector que pueden utilizarse con la HPLC. Entre algunos de los detectores más comunes se incluyen: índice refractivo (IR), ultravioleta (UV), fluorescente, radioquímico, electroquímico, infrarrojo cercano (IR-cercano), espectrometría de masa (EM), resonancia magnética nuclear (RMN) y dispersión lumínica (LS).

Los detectores del índice refractivo (IR) miden la capacidad de las moléculas de la muestra de curvar o refractar la luz. Esta propiedad, referida a cada molécula o compuesto, se denomina índice refractivo. Para la mayoría de detectores de IR, la luz pasa a través de una célula de flujo bimodular hasta un fotodetector. Un canal de la célula de flujo dirige la fase móvil que pasa a través de la columna, mientras que otra dirige únicamente la fase móvil. La detección se produce al curvarse la luz debido a las muestras que eluyen por la columna, y esto se lee como una disparidad entre los dos canales.

Los detectores de fluorescencia miden la capacidad de un compuesto de absorber y después reemitir la luz a longitudes de onda determinadas, respectivamente. Cada compuesto capaz de emitir la luz fluorescente presenta longitudes de onda de excitación y de emisión características. La luz de excitación pasa a través de la célula de flujo, mientras que el fotodetector en posición ortogonal mide la luz emitida a una longitud de onda específica.

La detección radioquímica implica la utilización de material marcado radioactivamente, habitualmente tritio (^{3}H) o carbono-14 (^{14}C). Funciona a partir de la detección de fluorescencia asociada a la ionización de partículas beta, y se utiliza más frecuentemente en la investigación de metabolitos.

Los detectores electroquímicos miden compuestos que experimentan reacciones de oxidación o reducción. Esto habitualmente se lleva a cabo midiendo la ganancia o pérdida de electrones a partir de muestras que migran, al pasar entre electrodos a una diferencia determinada de potencial eléctrico.

La espectrometría de masas es una técnica analítica utilizada para medir la proporción de masa-carga (m/z (o m/q)) de los iones. Se utiliza más generalmente para analizar la composición de una muestra física mediante la generación de un espectro de masas que representa las masas de los componentes de la muestra. La técnica presenta varias aplicaciones, entre ellas: la identificación de compuestos desconocidos a partir de la masa del compuesto y/o de fragmentos del mismo; la determinación de la composición isotópica de uno o más elementos en un compuesto; la determinación de la estructura de los compuestos mediante la observación de la fragmentación del compuesto; la cuantificación de la cantidad de un compuesto en una muestra utilizando métodos cuidadosamente diseñados (la espectrometría de masas no es inherentemente cuantitativa); el estudio de los fundamentos de la química de los iones en fase gaseosa (la química de iones y partículas neutras en el vacío); la determinación de otras propiedades físicas, químicas o incluso biológicas de compuestos mediante una diversidad de otros enfoques.

Un espectrómetro de masas es un dispositivo utilizado para la espectrometría de masas y produce un espectro de masas de una muestra para analizar su composición. Esto se consigue normalmente mediante ionización de la muestra y separación de los iones de masa diferente y el registro de su abundancia relativa mediante la medición de las intensidades de flujo iónico. Un espectrómetro de masas típico comprende tres partes: una fuente de iones, un analizador de masas y un detector.

El tipo de fuente de iones es un factor contributivo que influye fuertemente sobre qué tipos de muestras pueden analizarse mediante espectrometría de masas. La ionización de electrones y la ionización química se utilizan para gases y vapores. En las fuentes de ionización química, el analito se ioniza mediante reacciones químicas de moléculas iónicas durante colisiones en la fuente. Dos técnicas utilizadas con frecuencia con muestras biológicas líquidas y sólidas incluyen la ionización por electropulverización (ESI) y la ionizacion/desorción láser asistida por matriz (MALDI). Entre otras técnicas se incluyen el bombardeo atómico rápido (FAB), la termopulverización, la ionización química a presión atmosférica (APCI), la espectrometría de masas de iones secundarios (SIMS) y la ionización térmica.

La detección por resonancia magnética nuclear (RMN) se basa en el hecho de que determinados núcleos con masas impares, incluyendo H y ^{13}C, giran en torno a un eje de una manera aleatoria. Sin embargo, al introducirlas en un campo magnético fuerte, los espins se alinean en paralelo o antiparalelo respecto al campo magnético, favoreciéndose la orientación paralela debido a que presenta una energía ligeramente inferior. Los núcleos magnéticos puede absorber energía RF al introducirlos en un campo magnético de una potencia específica. Al producirse esta absorción, se dice que el núcleo se encuentra en resonancia. Resulta interesante para los científicos analistas que diferentes átomos dentro de una molécula resuenan a frecuencias diferentes a una potencia de campo determinada. La observación de las frecuencias de resonancia de una molécula permite al usuario descubrir información estructural sobre la molécula.

Al emitir una fuente un haz paralelo de luz que incide sobre partículas en solución, cierta cantidad de luz resulta reflejada, absorbida, transmitida o dispersada. Estos fenómenos pueden medirse con un detector de dispersión lumínica (LS). Las formas más prominentes de detección de LS se denominan nefelometría y turbidometría. La nefelometría se define como la medición de la intensidad de la luz dispersada que emana de un volumen iluminado de una suspensión. La proporción entre la intensidad dispersada y la intensidad de iluminación se compara con un estándar de propiedades conocidas. La turbidometría se define como la medición de la reducción de la luz transmitida debido a las partículas que se encuentran en solución. Mide la dispersión de la luz como una reducción de la luz transmitida a través de la solución de partículas. Por lo tanto, cuantifica la luz residual transmitida.

Los detectores de infrarrojo funcionan mediante el escaneo de compuestos en un espectro de entre 700 y 1.100 nm. Las vibraciones de estiramiento y flexión de enlaces químicos particulares en cada molécula se detectan a determinadas longitudes de onda.

Un metabolito de la vitamina D preferentemente se detecta mediante espectrometría de masas.

En un aspecto adicional, el método según la presente invención se utiliza para determinar el estatus de vitamina D de un sujeto.

En una realización adicional de la invención se proporciona un kit que comprende agente liberador de vitamina D según la presente invención. El kit preferentemente también comprende una tabla que muestra la correlación entre los resultados del ensayo y la cantidad de metabolito de vitamina D presente en la muestra. El kit preferentemente también comprende instrucciones de utilización.

Una gran ventaja del método según la presente invención es que, en el caso de que exista una necesidad diagnóstica de evaluación de más de un metabolito de la vitamina D, ésta puede satisfacerse con facilidad. Preferentemente, la muestra se analiza para por lo menos dos metabolitos de vitamina D de interés que se seleccionan de entre el grupo que consiste de 25-hidroxivitamina D_{2}, 1,25-dihidroxivitamina D_{3}, 25-hidroxivitamina D_{3}, 24,25-dihidroxivitamina D_{3}, 25,26-dihidroxivitamina D_{3}.

Preferentemente la 25-OH-vitamina D_{3}, la 1,25-dihidroxivitamina-D_{3} y la 2 4,25-dihidroxivitamina-D_{3} se evalúan de una sola vez utilizando el método según la presente invención. El método según la presente invención puede combinarse con las ventajas de utilizar un estándar interno marcado isotópicamente.

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En una realización preferente, la presente invención se refiere a un método para medir un metabolito de la vitamina D en una muestra, comprendiendo el método las etapas siguientes:

a): añadir a dicha muestra un metabolito de la vitamina D marcado con un isótopo,

b): tratar dicha muestra con un reactivo liberador según la invención bajo condiciones apropiadas para liberar el metabolito de vitamina D respecto de la proteína ligante de vitamina D,

c): someter la muestra tratada que se ha obtenido en la etapa (b) a cromatografía líquida, y

d): medir el metabolito de vitamina D durante o después de la cromatografía líquida, preferentemente mediante espectroscopía de masas.

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En una realización preferente adicional, la presente invención se refiere a un reactivo liberador de vitamina D apropiado para liberar 25-OH-vitamina D respecto de la proteína ligante de vitamina D sin provocar la precipitación de las proteínas según la invención, que comprende además un metabolito de la vitamina D marcado con un isótopo. Dicho metabolito de la vitamina D marcado con un isótopo preferentemente es una 25-OH-vitamina D_{3} marcada con un isótopo. La concentración del metabolito de vitamina D marcado con un isótopo es conocida y preferentemente se ajusta para que se iguale a la concentración fisiológicamente relevante del metabolito de vitamina D de interés.

En todavía una realización adicional, la presente invención se refiere a un kit que comprende un reactivo liberador de vitamina D y además un metabolito de vitamina D marcado con un isótopo, en el que dicho metabolito de vitamina D marcado con un isótopo puede encontrarse presente como componente separado o ya contenido dentro del reactivo liberador de vitamina D, y en el que dicho reactivo liberador se basa en una sal que presenta un N-heterociclo cuaternario a modo de catión.

Los ejemplos y figuras siguientes se proporcionan para ayudar a la comprensión de la presente invención, el alcance real de la cual se proporciona en las reivindicaciones adjuntas. Se entiende que pueden llevarse a cabo modificaciones de los procedimientos proporcionados sin apartarse del espíritu de la invención.

Descripción de las figuras

Figura 1

Síntesis de 25-hidroxivitamina D_{3} biotinilada

Las etapas utilizadas en la síntesis de un conjugado de biotina-25-hidroxivitamina D_{3} se ilustran esquemáticamente.

Figura 2

Separación de proteína ligante de vitamina D respecto de la 25-hidroxivitamina D_{3}

Para cada uno de los reactivos liberadores sometidos a ensayo se muestra la dependencia de la concentración.

Figura 3

Inyección de muestra

Se proporcionan los parámetros de la válvula del sistema de HPLC automático para los modos de inyección de muestra y de lavado.

Figura 4

Transferencia de analito

Se muestran los parámetros de la válvula del sistema de HPLC automático para la transferencia de la fracción que contiene el analito desde la columna de extracción hasta la columna analítica.

Figura 5

Elución de analito

Se proporcionan los parámetros de válvula del sistema de HPLC automático para la elución isocrática del analito de la columna analítica.

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Figura 6

Etapa de lavado

Se muestran los parámetros de la válvula del sistema de HPLC automático para la transferencia de los componentes de elución tardía de la muestra hasta el residuo.

Figura 7

Cromatograma típico

En la parte izquierda se proporciona un cromatograma típico para la transición m/z de 401 a 257. En la parte derecha se proporciona un cromatograma típico para la transición m/z de 407 a 263 de la 25-hidroxivitamina D_{3} marcada con un isótopo.

Figura 8

Curva de calibración

Se ilustra una curva de calibración típica basada en 25-hidroxivitamina D_{3} pura.

Ejemplo 1 Síntesis de un conjugado de 25-hidroxivitamina D_{3} biotinilada

Las etapas utilizadas en la síntesis del conjugado de biotina-25-hidroxivitamina D_{3} se ilustran esquemáticamente en la figura 1.

En esta síntesis, la 25-hidroxivitamina D_{3} se activa químicamente en la posición 3 del esquema de la vitamina D ilustrado en la fórmula I. En la 25-hidroxivitamina D_{3}, la posición 25 de la fórmula I porta un grupo OH.

1

1.1 Síntesis de 25-hidroxivitamina D_{3}-éter 3,2'-cianoetílico

En un matraz de fondo redondo con tres cuellos y dotado de un termómetro interno, se disolvieron 20 mg (50 \mumoles) de 25-hidroxivitamina D_{3} (Sigma-Aldrich, nº H-4014) en 10 ml de acetonitrilo seco bajo una atmósfera de argón. La solución se mezcló con 1,5 ml de terc-butanol/acetonitrilo (9:1) y después se enfrió a 6ºC en un baño de hielo. A continuación, se añadieron 820 \mul de una solución en acrilnitrilo (de una solución de 86 \mul de acrilnitrilo en 1,0 ml de acetonitrilo) y la mezcla se agitó y se incubó durante 15 minutos a 6ºC. Seguidamente,, se añadieron 205 \mul de una solución orgánica de hidruro potásico (25 mg de KH en 0,5 ml de terc-butanol/acetonitrilo 9:1). La mezcla de reacción se incubó bajo agitación durante 45 minutos a 6ºC y después durante 60 minutos adicionales a 4ºC. Durante un periodo corto se formó un precipitado intermediario y después se obtuvo una solución transparente. A continuación, la mezcla de reacción se diluyó con 10 ml de éter metil-terc-butílico y después se lavó dos veces con 10 ml de H_{2}O. Se secó la fase orgánica mediante la adición de 1 g de sulfato sódico libre de agua, se filtró a través de una frita G3 y finalmente se eliminó el solvente orgánico mediante la aplicación de un vacío. El sólido viscoso restante se secó adicionalmente mediante la aplicación de un alto vacío. Se obtuvieron en esta etapa aproximadamente 55 mg de material viscoso seco incoloro.

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1.2 25-hidroxivitamina D_{3}-éter 3,3-aminopropílico

El nitrilo obtenido en la etapa 1.1 se disolvió en 15 ml de éter dietílico. Bajo agitación se añadió una suspensión consistente de 7,5 mg de hidruro de litio en 7,5 ml de éter dietílico. La mezcla se agitó durante una hora a temperatura ambiente (RT). A continuación, se añadió una suspensión de 38,4 mg de hidruro de litio-aluminio en 6,6 ml de éter dietílico. La mezcla de reacción se enturbió y se agitó durante una hora adicional a RT. Seguidamente la mezcla de reacción se enfrió a una temperatura de entre 0ºC y 5ºC en un baño de hielo y se diluyó lentamente mediante la adición de 35 ml de agua en total. Mediante la adición de 6, 6 ml de KOH 10 M el valor del pH se volvió altamente alcalino.

Se extrajo el material orgánico tres veces con 65 ml de éter metil-terc-butílico cada vez. La fase orgánica agrupada se secó mediante la adición de 5 g de sulfato sódico libre de agua, se filtró a través de una frita G3 y finalmente se eliminó el solvente orgánico mediante la aplicación de un vacío. El sólido viscoso restante se secó adicionalmente mediante la aplicación de un alto vacío. El material crudo obtenido en la presente etapa se disolvió en una mezcla de 5 ml de DMSO y 3,0 ml de acetonitrilo y se purificó mediante HPLC preparativa. Los eluyentes utilizados fueron: eluyente A=H_{2}O con ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1%, y eluyente B=95% de acetonitrilo y 5% de H_{2}O con TFA al 0,1%. El gradiente aplicado pasó en 100 minutos de 50% de eluyente B a 100% de eluyente B. El material de la columna era Vydac C18/300 \ring{A}/15 a 20 \mum y la columna presentaban un diámetro de 5 cm y una longitud de 25 cm. Se llevó a cabo la cromatografía a RT con un caudal de 30 ml/minuto. Se monitorizó la elución a 226 nm. Las fracciones que comprendían el producto deseado con una pureza de por lo menos 85% según se determinó mediante HPLC analítica (Vydac C18/300 \ring{A}/5 \mum/4,6x250 mm) se agruparon y se liofilizaron. El rendimiento del producto incoloro deseado fue de aproximadamente 70%.

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1.3 Síntesis de conjugado 25-hidroxivitamina D_{3}-éter 3,3'-N-(hemisuberil)aminopropílico-biotina-(beta-Ala)-Glu-Glu-Lys(épsilon)

Se disolvieron 15,9 mg (35 \mumoles) de 25-hidroxivitamina D_{3}-éter 3,3'-aminopropílico (obtenido tal como se describe en la etapa 1.2) en 3,5 ml de DMSO. Se añadieron 34,4 mg (42 \mumoles) de éster de biotín-(beta-Ala)-Glu-Glu-Lys(epsilon)-hemisuberat-N-hidroxisuccinimida (Roche Applied Science, nº 11866656) y 15 \mul de trietilamina y la mezcla se agitó durante la noche a RT. La mezcla de reacción se diluyó con 4,5 ml de DMSO filtrado por un microfiltro de 0,45 \mum y finalmente se sometió a HPLC preparativa. En esta HPLC preparativa, se aplicaron las condiciones indicadas en el Ejemplo 1.2. Las fracciones que comprendían el producto deseado con una pureza de por lo menos 85% según determinación mediante HPLC analítica (Vydac C18/300 \ring{A}/5 \mum/4,6x250 mm) se agruparon y se liofilizaron. El rendimiento del conjugado de 25-hidroxivitamina D_{3}-éter 3,3'-N-(hemisuberil)aminopropílico-biotín-(beta-Ala)-Glu-Glu-Lys (épsilon), o abreviadamente "25-hidroxivitamina D_{3}-biotina" fue de aproximadamente 36%.

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Ejemplo 2 Evaluación de la liberación de vitamina D respecto de la proteína ligante de vitamina D

Se utilizó el sistema Biacore para evaluar si un reactivo considerado un candidato potencial para liberar la vitamina D respecto de la proteína ligante de vitamina B era eficiente en la liberación de un metabolito de la vitamina D respecto de la proteína ligante de vitamina D.

Se utilizó un chip detector recubierto de estreptavidina (chip detector-SA, Biacore AB, BR-1000-32) para la inmovilización de un metabolito de vitamina D biotinilado de interés. La evaluación se llevó a cabo óptimamente mediante la utilización del metabolito de la vitamina D, la 25-OH-vitamina D_{3}.

En primer lugar se incubó el chip detector con una concentración saturante de 25-hidroxivitamina D_{3} biotinilada. A continuación, se cargó el chip con una cantidad saturante de proteína ligante de vitamina D. Seguidamente, se incubó el chip saturado con proteína ligante de vitamina D con una solución de cloruro sódico por una parte, y por otra parte con un agente candidato liberador de vitamina D en diversas concentraciones. Se realizó un seguimiento de la liberación de proteína ligante de vitamina D durante 3 minutos. Un reactivo candidato liberador de vitamina D que causase la liberación de por lo menos 99% de la proteína ligante de vitamina D en el sistema anteriormente indicado se consideró apropiado para cumplir los requisitos mínimos para un reactivo liberador de vitamina D utilizado en la detección de un metabolito de la vitamina D en una muestra de 25-hidroxivitamina-D_{3} en suero o plasma.

Entre cada análisis, se regeneró el chip-SA recubierto de 25-hidroxivitamina D_{3} mediante lavado con Gly 10 mM/HCl, pH 1,7, durante 1 minuto. A modo de control no específico se utilizó una célula de flujo de referencia recubierta con biotina en el mismo chip. Los datos de la célula de flujo de referencia se restaron de aquellos correspondientes a la célula de flujo bioespecífica. De esta manera, se obtuvieron datos específicos libres de efectos no específicos.

TABLA 1 Concentración de reactivo liberador requerido para la liberación de >95% de la proteína ligante de vitamina D respecto de 25-OH-vitamina D_{3}

2

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Tal como puede observarse en la Tabla 1, anteriormente, la separación eficiente de 25-OH-vitamina D_{3} respecto de la proteína ligante de vitamina D resulta posible con cualquiera de los reactivos proporcionados en la misma. La dependencia de la concentración de esta separación se ilustra adicionalmente en la figura 2.

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Ejemplo 3 Método para la cuantificación de 25-hidroxivitamina D_{3} circulante utilizando cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem

Se ha desarrollado un método sencillo de dilución isotópica-cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem para la detección de 25-hidroxivitamina D_{3}. El método es similar al de Vogeser et al., supra. Brevemente, dicho método consiste en lo siguiente:

para la estandarización interna se utilizó 25-hidroxivitamina D_{3} marcada con un isótopo estable. Se añadió acetonitrilo a la muestra con el fin de liberar el analito respecto de la proteína ligante de vitamina D. Se llevó a cabo la precipitación manual de la proteína, seguido de la extracción automática en línea en fase sólida con transferencia directa al sistema de espectrometría de masas en tándem. Se utilizó la ionización química a presión atmosférica (APCI) en el modo positivo. Para la 25-hidroxivitamina D_{3} nativa, se registró la transición 401>257 m/z. Para el estándar interno marcado con seis átomos de deuterio se registró la transición 407>263.

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Procedimiento analítico Estándares

Se obtuvo la 25-hidroxivitamina D_{3} (25-hidroxicolecalciferol) de Sigma (Deisenhofen, Alemania) (pureza: 98%; peso molecular: 400,7). Se preparó una solución madre con una concentración de 3.250 nmoles/l en metanol.

Para la utilización como estándar interno, se adquirió de Synthetica (Suecia) 25-hidroxivitamina D_{3} marcada isotópicamente: 26,27-hexadeuterio-25-hidroxivitamina D_{3} (pureza química: 95%; pureza isotópica: 99,9%). Se preparó una solución de estándar interno de trabajo con una concentración de 570 nmoles/l en metanol.

Se utilizó un sistema Agilent HPLC 1100 de gradiente binario, dotado de desgasificador y automuestreador. El espectrómetro de masas utilizado era un aparato Quantum Ultra EMR de Thermo Electron de triple cuadrupolo dotado de fuente de iones APCI.

Se introdujeron 100 \mul de suero en tazas de polipropileno de 2 ml utilizando una pipeta, añadiendo después 25 \mul de la solución de trabajo de estándar interno. Tras mezclar con vórtex, las muestras se dejaron en un vórtex durante 5 minutos a temperatura ambiente. Para la equilibración, las muestras seguidamente se mantuvieron a 37ºC durante dos horas. Se añadieron 300 \mul de acetonitrilo para liberar el analito y el estándar interno marcado con un isótopo estable de los enlaces con la proteína, y para precipitar las proteínas. Las muestras se dejaron en un mezclador vórtex durante 10 minutos y después se mantuvieron a una temperatura de entre 4ºC y 8ºC durante una hora. Tras centrifugar durante 20 minutos a 16.000xg en una centrífuga de laboratorio estándar, se obtuvo un sobrenadante transparente y un pellet de proteínas estables. El sobrenadante se transfirió a un vial de HPLC y se introdujo en el automuestreador.

Para la extracción en línea en fase sólida, se utilizó una columna de extracción de 25x4 mm LiChrospher RP-18 ADS, de 25 \mum (Merck) en combinación con una válvula Rheodyne de conmutación de seis vías de alta presión.

El procedimiento de extracción automático en fase sólida consistía de cinco etapas:

1.: Inyección de la muestra desproteinizada en la columna de extracción ADS (fig. 3) con eluyente A (5% de metanol en agua, caudal: 3 ml/minuto). Se eliminaron los componentes hidrofílicos de la muestra y se transfirieron al residuo. Simultáneamente, se equilibró la columna analítica con eluyente C (90% de metanol, 10% de acetato amónico 0,5 mM, caudal en un gradiente escalonado de caudales: de 0 a 9 minutos, 0,85 ml/minuto, y de 9 a 17 minutos, 1,2 ml/minuto).

2.: El analito enriquecido procedente de la columna de extracción se transfirió a la columna analítica en el modo de retrolavado con eluyente C (fig. 4).

3.: Elución isocrática del analito de la columna analítica y separación de los componentes de la matriz con eluyente C, y la columna de extracción se regenera con eluyente B (metanol/acetonitrilo 50/50, caudal: 3 ml/minuto) (fig. 5).

4.: Equilibración del sistema con caudal incrementado de eluyente C (fig. 3).

5.: Transferencia de los componentes de elución tardía de la matriz al residuo.

Se muestra un cromatograma típico en la figura 7.

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Tabla horaria para el intercambio de columnas

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Temperaturas de columna:: RT (columna de captura)

\quad: 30ºC (columna analítica)

Temperatura del inyector:: 8ºC

Volumen de inyección:: 70 \mul

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Configuración de los parámetros de MS/MS

Los parámetros de la fuente de iones a presión atmosférica (APCI) y los parámetros de ajuste del espectrómetro de masas se fijaron y se optimizaron siguiendo las instrucciones del fabricante con el fin de obtener la máxima sensibilidad para la detección HVD. La resolución del analizador del MS se fijó a una anchura de pico de 0,7 amu. Se utilizó argón como el gas de colisión y la presión del gas se fijó en 1,5 mTorr, la energía de colisión para la fragmentación MS/MS se optimizó para obtener la señal máxima para las transiciones iónicas 401 a 257 (para 25-OH-D_{3}) y 407 a 263 (para el estándar interno).

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Calibración

En la serie analítica, se llevó a cabo una calibración de seis puntos utilizando una solución pura de 25-hidroxivitamina D_{3} en metanol/agua (1/1) cubriendo el intervalo de concentraciones de entre 10 ng/ml y hasta 300 ng/ml. En la figura 8 se proporciona una curva de calibración típica.

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Ejemplo 4 Método para la cuantificación de la 25-hidroxivitamina D_{3} circulante, incluyendo la liberación de la vitamina D respecto de la proteína ligante de vitamina D sin precipitación de las proteínas

Los detalles del procedimiento son iguales a los del Ejemplo 3, aunque con un cambio significativo en la preparación de la muestra.

Se introdujeron con una pipeta 100 \mul de suero en tazas de polipropileno de 2 ml, añadiendo después 25 \mul de la solución de trabajo de estándar interno. Tras mezclar con vórtex, las muestras se dejaron en un mezclador vórtex durante 5 minutos a temperatura ambiente. Para la equilibración, seguidamente las muestras se mantuvieron a 37ºC durante dos horas.

A dicha muestra de suero equilibrada se añadió una alícuota de 100 \mul de reactivo liberador de vitamina D. El reactivo liberador de vitamina D en el presente ejemplo consistía de una solución al 50% (peso/volumen) de tetrafluoroborato de 1-butil-4-metilpiridinio en agua. La mezcla se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente y se transfirió al automuestreador del sistema HPLC. El procedimiento siguiente para la detección de la 25-hidroxivitamina D_{3} es idéntico al proporcionado en el Ejemplo 3.

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Ejemplo 5 Resultados de la comparación entre métodos

Se procesaron muestras de suero de cuatro pacientes de acuerdo con los procedimientos de los Ejemplos 3 y 4, respectivamente. La medición según el nuevo procedimiento (ver el Ejemplo 4) se repitió una vez y los valores medios también se proporcionan en la Tabla 2.

TABLA 2 Valores para la 25-hidroxivitamina D_{3} obtenida con dos métodos diferentes

5

Tal como puede apreciarse en la Tabla 2, los datos recogidos con el nuevo método son comparables a los datos recogidos con el método de referencia propuesto. El nuevo método presenta la ventaja de que los datos se obtienen sin precipitación ni centrifugación en un sistema HPLC MS/MS en línea.

Claims

1. Método para la medición de un metabolito de la vitamina D en una muestra, comprendiendo el método las etapas siguientes:

a): tratar dicha muestra con un reactivo liberador bajo condiciones apropiadas para liberar el metabolito de la vitamina D respecto de la proteína ligante de vitamina D y no provocar la precipitación de proteínas,

b): someter la muestra tratada que se ha obtenido en la etapa (a) a cromatografía líquida, y

c): medir el metabolito de la vitamina D durante o después de la cromatografía líquida,

en el que dicho reactivo liberador se basa en una sal que presenta un N-heterociclo cuaternario a modo de catión.

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2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha cromatografía líquida es una cromatografía de columna que se lleva a cabo mediante la utilización de una columna que comprende una frita y un material de lecho.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha frita presenta un tamaño de poro de 0,2 ó 0,5 \mum.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho material de lecho es particulado y las partículas presentan un diámetro de entre 1 y 10 \mum.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha cromatografía líquida es cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).

6. Método según la reivindicación 1, en el que dicho reactivo liberador es un reactivo que es capaz de liberar por lo menos 99% de la 25-OH-vitamina D_{3} respecto de la proteína ligante de vitamina D.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el metabolito de la vitamina D es 25-OH-vitamina D_{3}.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha muestra es de suero sanguíneo o plasma sanguíneo.

9. Utilización de un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la evaluación del estatus de vitamina D de un individuo.

10. Kit que comprende un reactivo liberador de la vitamina D y además un metabolito de la vitamina D marcado con un isótopo, en el que dicho metabolito de la vitamina D marcado con un isótopo puede encontrarse presente en formad e componente separado o ya se encuentra contenido dentro del reactivo liberador de la vitamina D y en el que dicho reactivo liberador está basado en una sal que presenta un N-heterociclo cuaternario a modo de catión.