JP7157212B2

JP7157212B2 - 質量分析によってジヒドロキシビタミンｄ代謝物を検出するための方法

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Publication number: JP7157212B2
Application number: JP2021107427A
Authority: JP
Inventors: ホルムキスト，ブレット; ジェイ．クラーク，ナイジェル; キャストン－ボールダーラマ，アン; イー．ライツ，リチャード
Original assignee: クエストダイアグノスティックスインヴェストメンツインコーポレイテッド
Priority date: 2007-11-28
Filing date: 2021-06-29
Publication date: 2022-10-19
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Also published as: EP2215447B1; BRPI0819605B1; JP2019179036A; CA3000272A1; US8852951B2; CA2706953C; US8389292B2; WO2009070594A1; JP5616231B2; JP2016197110A; US11650216B2; US8173442B2; CA2706953A1; EP2215447A1; US7972868B2; EP2215447A4; US20110226945A1; JP6538004B2; JP2021170011A; US20200158688A1

Description

本発明は、ジヒドロキシビタミンＤ代謝物の検出に関する。特定の局面では、本発明は
、ビタミンＤ代謝物を質量分析によって検出するための方法に関する。

ビタミンＤはカルシウム（Ｃａ²⁺）恒常性の正の調節において重要な生理学的役割を有
する必須の栄養である。ビタミンＤは、日光に対する暴露によって皮膚で新規に生成され
ることができ、または食餌から吸収することができる。ビタミンＤには以下の２つの形態
がある；ビタミンＤ₂（エルゴカルシフェロール）およびビタミンＤ₃（コレカルシフェロ
ール）。ビタミンＤ₃は動物によって新規に合成される形態である。これは、アメリカで
製造されるミルク製品およびある種の食品に添加される一般的なサプリメントでもある。
食餌および内因性に合成されたビタミンＤ₃の両方とも代謝活性化を受けて生理活性の代
謝物を生じるはずである。ヒトではビタミンＤ₃活性化の最初の工程は主として肝臓で生
じ、水酸化されて中間の代謝物２５－ヒドロキシビタミンＤ₃（２５－ヒドロキシコレカ
ルシフェロール；カルシフェジオール；２５ＯＨＤ₃）が形成される。カルシフェジオー
ルは循環中のビタミンＤ₃の主な形態である。次いで、循環する２５ＯＨＤ₃は腎臓によっ
て１，２５－ジヒドロキシビタミンＤ₃（カルシトリオール；１，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃）に
変換され、これは一般には、最高の生物学的活性を有するビタミンＤ₃の代謝物であると
考えられる。

ビタミンＤ₂は、真菌および植物の供給源由来である。いくつかの店頭販売の食餌性サ
プリメントは、コレカルシフェロール（ビタミンＤ₃）ではなくエルゴカルシフェロール
（ビタミンＤ₂）を含む。ドリスドールは米国で利用可能なビタミンＤの唯一の高力価の
処方箋書式であり、エルゴカルシフェロールで処方される。ビタミンＤ₂はヒトではビタ
ミンＤ₃と同様の経路の代謝活性化を受け、代謝物２５－ヒドロキシビタミンＤ₂（２５Ｏ
ＨＤ₂）および１，２５－ジヒドロキシビタミンＤ₃（１，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂）を形成する
。ビタミンＤ₂およびビタミンＤ₃はヒトでは生物学的に等価であると長らくみなされてき
たが、近年の報告では、ビタミンＤのこれらの２つの形態の生理活性およびバイオアベイ
ラビリティにおいて相違がある場合があることが示唆されている（非特許文献１）。

ビタミンＤ、不活性なビタミンＤ前駆体の測定は、臨床的な状況ではまれであって、診
断的な価値は少ない。むしろ、２５－ヒドロキシビタミンＤ₃および２５－ヒドロキシビ
タミンＤ₂（総２５－ヒドロキシビタミンＤ；“２５ＯＨＤ”）の血清レベルがビタミン
Ｄの栄養状態およびある種のビタミンＤ類似体の有効性の有用な指標である。従って、２
５ＯＨＤの測定はカルシウム代謝の障害の診断および管理で共通して用いられる。これに
関して、低レベルの２５ＯＨＤは、低カルシウム血症、低リン酸血症、二次性副甲状腺機
能更新症、アルカリホスファターゼ上昇、成体の骨軟化症および小児のくる病などの疾患
に関連するビタミンＤ欠損の指標である。ビタミンＤ中毒が疑われる患者では、２５ＯＨ
Ｄのレベルの上昇によって、この障害を、高カルシウム血症を生じる他の障害から識別す
る。

１，２５（ＯＨ）₂Ｄの測定はまた臨床的な状況で用いられる。例えば、特定の疾患状
態、例えば、腎不全は、循環する１，２５（ＯＨ）₂Ｄのレベル低下によって診断するこ
とができ、そして１，２５（ＯＨ）₂Ｄのレベル上昇は、過剰な副甲状腺ホルモンの指標
であることができ、またはサルコイドーシスまたは特定のタイプのリンパ腫などの特定の
疾患の指標でもあり得る。

ビタミンＤ代謝物の検出は、２５－ヒドロキシビタミンＤ₃および２５－ヒドロキシビ
タミンＤ₂に同時に特異的な抗体を用いるラジオイムノアッセイによって行われている。
現在の免疫学ベースのアッセイは２５－ヒドロキシビタミンＤ₃および２５－ヒドロキシ
ビタミンＤ₂を別々に分離しないので、ビタミンＤ栄養の欠損の原因は、他の試験を行う
ことなしには決定できない。近年では、質量分析を用いて特定のビタミンＤ代謝物を検出
するための方法を開示している報告が公開されている。例えば、非特許文献２；非特許文
献３；非特許文献４；および非特許文献５は、液体クロマトグラフィーおよび質量分析を
用いて種々のビタミンＤ代謝物を検出するための方法を開示する。これらの方法には、質
量分析による検出の前に代謝物を誘導体化することが必要である。誘導体化されない１，
２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を液体クロマトグラフィー／質量分析によって検出する方法は、非特許
文献６に開示されている。

アーマスら（Ａｒｍａｓｅｔ．ａｌ．，）（２００４）ジャーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド・メタボリズム（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）８９：５３８７～５３９１ヤン・ビーら（ＹｅｕｎｇＢ，ｅｔａｌ．，）ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）．１９９３，６４５（１）：１１５～２３東達也ら（ＨｉｇａｓｈｉＴ，ｅｔａｌ．，）ステロイズ（Ｓｔｅｒｏｉｄｓ．）２０００，６５（５）：２８１～９４東達也ら（ＨｉｇａｓｈｉＴ，ｅｔａｌ．，）バイオロジカル・アンド・ファーマシューティカル・ブリティン（ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ．）２００１，２４（７）：７３８～４３東達也ら（ＨｉｇａｓｈｉＴ，ｅｔａｌ．，）ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・アンド・バイオメディカル・アナリシス（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌａｎｄＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＡｎａｌｙｓｉｓ）２００２，２９（５）：９４７～５５キスマイヤーおよびソン（ＫｉｓｓｍｅｙｅｒａｎｄＳｏｎｎｅ），ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー・エー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＡ．）２００１，９３５（１－２）：９３～１０３

本発明は、タンデム型質量分析等の質量分析によって、サンプル中のジヒドロキシビタ
ミンＤ代謝物の存在または量を検出するための方法を提供する。

一局面では、１つ以上のジヒドロキシビタミンＤ代謝物の存在または量をタンデム型質
量分析によって決定するための方法が提供され、この方法は以下を包含する：（ａ）サン
プルから１つ以上のジヒドロキシビタミンＤ代謝物を免疫精製する工程と；（ｂ）この免
疫精製されたジヒドロキシビタミンＤ代謝物（単数または複数）をＨＰＬＣによってさら
に精製する工程と；（ｃ）工程（ｂ）から得られたビタミンＤ代謝物の量をタンデム型質
量分析によって決定する工程であって：（ｉ）このジヒドロキシビタミンＤ代謝物（単数
または複数）の前駆イオンを生成すること；（ｉｉ）この前駆イオンの１つ以上の断片イ
オンを生成すること；および（ｉｉｉ）（ｃ）もしくは（ｄ）または両方で生成された１
つ以上のこのイオンの存在または量を検出して、この検出されたイオンの量をこのサンプ
ル中のこのジヒドロキシビタミンＤ代謝物（単数または複数）の存在または量に対して関
連付けることによる工程。特定の好ましい実施形態では、ジヒドロキシビタミンＤ代謝物
は、固体支持体に結合された抗ジヒドロキシビタミンＤ抗体を用いてサンプルから免疫精
製され；好ましくはこのジヒドロキシビタミンＤ代謝物は免疫粒子を用いて免疫精製され
；好ましくはこの免疫粒子はそれらの表面上に抗ジヒドロキシビタミンＤ抗体を有する。
特定の実施形態では、このジヒドロキシビタミンＤ代謝物（単数または複数）は１α，２
５（ＯＨ）₂Ｄ₂を含み；特定の実施形態では、このジヒドロキシビタミンＤ代謝物（単数
または複数）は１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を含み；ある特に好ましい実施形態では、１α，
２５（ＯＨ）₂Ｄ₂および１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の存在または量を単一のアッセイで検出
するための方法が提供される。

上記の局面の特定の好ましい実施形態では、ジヒドロキシビタミンＤ代謝物（単数また
は複数）は質量分析の前に誘導体化され；いくつかの特に好ましい実施形態では、ジヒド
ロキシビタミンＤ代謝物（単数または複数）はクックソン型（Ｃｏｏｋｓｏｎ－ｔｙｐｅ
）試薬（例えば、４置換の１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン；ＴＡＤ）で誘導
体化され；特定の特に好ましい実施形態では、ジヒドロキシビタミンＤ代謝物（単数また
は複数）は４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン（ＰＴＡＤ）で誘
導体化され；かつさらに他の特に好ましい実施形態では、ジヒドロキシビタミンＤ代謝物
（単数または複数）は４’－カルボキシフェニル－ＴＡＤで誘導体化される。特定の好ま
しい実施形態では、ジヒドロキシビタミンＤ代謝物（単数または複数）は１α，２５（Ｏ
Ｈ）₂Ｄ₂を含み；この１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂は質量分析の前に４－フェニル－１，２，
４－トリアゾリン－３，５－ジオン（ＰＴＡＤ）で誘導体化される；そしてさらに好まし
くは、１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂の前駆イオンは、５８６．３７±０．５の質量／電荷比を
有する。特定の好ましい実施形態では、ジヒドロキシビタミンＤ代謝物（単数または複数
）は１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を含み；この１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃は質量分析の前に４－
フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン（ＰＴＡＤ）で誘導体化され；そ
してさらに好ましくは１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の前駆イオンは、５７４．３７±０．５の
質量／電荷比を有する。特定の好ましい実施形態では、このジヒドロキシビタミンＤ代謝
物（単数または複数）は質量分析の前に４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，
５－ジオン（ＰＴＡＤ）で誘導体化され、この断片イオンは、３１４．１２±０．５の質
量／電荷比を有している少なくとも１つのイオンを含む。

いくつかの好ましい実施形態では、ジヒドロキシビタミンＤ代謝物（単数または複数）
は質量分析の前には誘導体化されない。特定の特に好ましい実施形態では、ジヒドロキシ
ビタミンＤ代謝物（単数または複数）は１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂を含み、この１α，２５
（ＯＨ）₂Ｄ₂は質量分析の前には誘導体化されず、さらに好ましくはこの非誘導体化１α
，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂の前駆イオンは、４１１．３５±０．５の質量／電荷比を有する。特
定の特に好ましい実施形態では、このジヒドロキシビタミンＤ代謝物（単数または複数）
は１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を含み、この１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃は質量分析前には誘導体
化されず、さらに好ましくは非誘導体化１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の前駆イオンは３９９．
３５±０．５の質量／電荷比を有する。特定の特に好ましい実施形態では、ジヒドロキシ
ビタミンＤ代謝物（単数または複数）は誘導体化されず、この断片イオンは１５１．１２
±０．５および１３５．１２±０．５の質量／電荷比を有しているイオンからなる群より
選択される１つ以上のイオンを含む。

特に好ましい実施形態では、単一のアッセイでタンデム型質量分析によってヒトの身体
サンプル中の１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂および１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の量を決定するため
の方法が提供され、この方法は以下を含む：（ａ）サンプルから１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂
および１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を免疫精製する工程と；（ｂ）１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂お
よび１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオ
ン（ＰＴＡＤ）で誘導体化する工程と；（ｃ）工程（ｂ）から誘導体化された１α，２５
（ＯＨ）₂Ｄ₂および１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃をＨＰＬＣによって精製する工程と；（ｄ）
工程（ｃ）から得られた１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂および１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の量をタ
ンデム型質量分析によって決定する工程であって：（ｉ）５８６．３７±０．５の質量／
電荷比を有している誘導体化された１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂の前駆イオン、および５７４
．３７±０．５の質量／電荷比を有している誘導体化された１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の前
駆イオンを生成すること；（ｉｉ）工程（ｉ）由来の前駆イオンの１つ以上の断片イオン
を生成することであって、ここで断片イオンの少なくとも１つが３１４．１２±０．５の
質量／電荷比を有すること；ならびに（ｉｉｉ）工程（ｉ）もしくは（ｉｉ）または両方
で生成された１つ以上のイオンの存在または量を検出すること、およびこの検出されたイ
オンをサンプル中の１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂および１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の存在または
量に対して関連付けることによる工程。

本明細書において用いる場合、「ジヒドロキシビタミンＤ代謝物」という用語は、ビタ
ミンＤまたは合成のビタミンＤ類似体の生合成経路または代謝経路によって形成される、
動物の循環中で見出され得る任意のジヒドロキシビタミンＤ代謝物を指す。好ましくはこ
のジヒドロキシビタミンＤ代謝物は、１位置および２５位置でヒドロキシル化される。特
に好ましい実施形態では、ビタミンＤ代謝物は１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ₃（
１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃）または１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ₂（１α，２５（
ＯＨ）₂Ｄ₂）である。特定の好ましい実施形態では、このジヒドロキシビタミンＤ代謝物
は哺乳動物、さらに好ましくはヒトの体液中に自然に存在する。特定の特に好ましい実施
形態では、本明細書に記載されるような方法は、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ₃
（１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃）および／または１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ₂（１
α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂）を検出し、２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ；２５，２６－
ジヒドロキシビタミンＤ；および１α，３α－ジヒドロキシビタミンＤからなる群より選
択される１つ以上のジヒドロキシビタミン－Ｄ代謝物は検出しない。

本明細書において用いる場合、「精製」または「精製する」という用語は、サンプルの
１つ以上の他の成分に対して目的の１つ以上の分析物の量を富化する手順を指す。本明細
書において用いる場合、精製とは全ての他の分析物からの単離を要するわけではない。好
ましい実施形態では、精製工程または手順を用いて、１つ以上の干渉性物質、例えば、質
量分析による分析物イオンの検出を妨げ得る方法または物質中で用いられる装置の操作を
妨げるであろう１つ以上の物質を除去してもよい。

本明細書において用いる場合、「免疫精製」または「免疫精製する」という用語は、目
的の１つ以上の分析物を富化するために、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体
などの抗体を利用する精製手順を指す。免疫精製は、当該分野で周知である任意の免疫精
製方法を用いて行ってもよい。しばしば免疫精製手順は、固体支持体、例えば、カラム、
ウェル、チューブ、ゲル、カプセル、粒子などに対して結合するか、コンジュゲートする
か、そうでなければ付着した抗体を利用する。本明細書において用いる場合、免疫精製は
限定するものではないが、当該分野で免疫沈降と呼ばれる場合が多い手順、および当該分
野でアフィニティークロマトグラフィーと呼ばれる場合が多い手順を包含する。

本明細書において用いる場合、「免疫粒子」という用語は、カプセル、ビーズ、ゲル粒
子などであって、その表面（その粒子の上および／または中のいずれか）に対して結合す
るか、コンジュゲートするか、そうでなければ付着している抗体を有するものを指す。特
定の好ましい実施形態では、免疫粒子は、セファロースまたはアガロースビーズである。
別の好ましい実施形態では、免疫粒子はガラス、プラスチックもしくはシリカビーズ、ま
たはシリカゲルである。

本明細書において用いる場合、「抗ジヒドロキシビタミンＤ抗体」という用語は、１つ
以上のジヒドロキシビタミンＤ代謝物について親和性を有する任意のポリクローナル抗体
またはモノクローナル抗体を指す。特定の好ましい実施形態では、抗ジヒドロキシビタミ
ンＤ抗体は１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃および１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂に結合する。いくつか
の好ましい実施形態では、抗ジヒドロキシビタミンＤ抗体は１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃およ
び１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂と等しいかまたは同様の親和性で結合する。他の好ましい実施
形態では、抗ジヒドロキシビタミンＤ抗体は、１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃と１α，２５（Ｏ
Ｈ）₂Ｄ₂よりも有意に高い親和性で結合し；別の好ましい実施形態では、この抗ジヒドロ
キシビタミンＤ抗体は１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂と１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃よりも有意に高
い親和性で結合する。種々の実施形態では、ジヒドロキシビタミンＤ代謝物以外の化学種
に対する抗ジヒドロキシビタミンＤ抗体の特異性は、変化し得；例えば、特定の好ましい
実施形態では、この抗ジヒドロキシビタミンＤ抗体は、ジヒドロキシビタミンＤ代謝物に
対して特異的であり従って、ジヒドロキシビタミンＤ代謝物以外の化学種（例えば、他の
ビタミンＤ代謝物、例えば、ビタミンＤまたは２５－ヒドロキシビタミンＤ）には親和性
をほとんど有さないかまたは全く有さないが、他の好ましい実施形態では、この抗ジヒド
ロキシビタミンＤ抗体は非特異的であり、従ってジヒドロキシビタミンＤ代謝物以外の特
定の化学種に結合する（例えば、非特異的な抗ジヒドロキシビタミンＤ抗体は、他のビタ
ミンＤ代謝物、例えば、ビタミンＤまたは２５－ヒドロキシビタミンＤに結合し得る）。

本明細書に開示される方法のいくつかの好ましい実施形態では、ジヒドロキシビタミン
Ｄ代謝物（単数または複数）は、質量分析前に誘導体化されない。他の好ましい実施形態
では、このビタミンＤ代謝物は、質量分析前に誘導体化される。

本明細書において用いる場合、「生体サンプル」とは、生物学的な供給源由来の任意の
サンプルを指す。本明細書において用いる場合、「体液」は、個体の体液から単離され得
る任意の液体を意味する。例えば、「体液」は、血液、血漿、血清、胆汁、唾液、尿、涙
、汗などを包含し得る。

本明細書において用いる場合、「誘導体化」とは、２つの分子を反応させて新規な分子
を形成することを意味する。誘導体化剤としては、クックソン型（Ｃｏｏｋｓｏｎ－ｔｙ
ｐｅ）試薬（例えば、４置換の１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン；ＴＡＤ）；
イソチオシアナート基、ジニトロ－フルオロフェニル基、ニトロフェノキシカルボニル基
、および／またはフタルアルデヒド基を挙げることができる。特定の好ましい実施形態で
は、誘導体化は、例えば、Ｖｒｅｅｋｅｎ，ｅｔ．，ａｌ．，Ｂｉｏｌ．ＭａｓｓＳｐ
ｅｃ．２２：６２１～６３２；非特許文献２；非特許文献４；または非特許文献５に開示
される方法などの方法を用いて行う。好ましい実施形態では、この誘導体化剤はクックソ
ン型試薬である。特に好ましい誘導体化剤としては、４－フェニル－１，２，４－トリア
ゾリン－３，５－ジオン（ＰＴＡＤ）；４’－カルボキシフェニル－ＴＡＤ；４－［４－
（６－メトキシ－２－ベンゾオキサゾリル）フェニル］－１，２，４－トリアゾリン－３
，５－ジオン（ＭＢＯＴＡＤ）；４－［２－（６，７－ジメトキシ－４－メチル－３－オ
キソ－３，４－ジヒドロキノキサリル）エチル］－１，２，４－トリアゾリン－３，５－
ジオン（ＤＭＥＱＴＡＤ）；４－ニトロフェニル－ＴＡＤ；４－ペンタフルオロフェニル
－ＴＡＤ；４－フェロセニルエチル－ＴＡＤ；４－四級アミン－ＴＡＤ；などが挙げられ
る。特定の好ましい実施形態では、誘導体化はクロマトグラフィーの前に行われる；しか
し他の好ましい実施形態では、誘導体化はクロマトグラフィーの後に、例えば、Ｖｒｅｅ
ｋｅｎ，ｅｔ．，ａｌ．，Ｂｉｏｌ．ＭａｓｓＳｐｅｃ．２２：６２１～６３２に記載
の方法と類似の方法を用いて行われる。

本明細書において用いる場合、「クロマトグラフィー」とは、液体または気体によって
担持される化学的な混合物が、静止的な液体または固相の周囲または上に流れるにつれて
、化学物質の示差的な分布の結果として成分に分けられるプロセスを指す。

本明細書において用いる場合、「液体クロマトグラフィー」（ＬＣ）とは、微細に分け
られた物質のカラムを通じて、またはキャピラリーの通路を通じて液体が均一に浸透する
ような液体溶液の１つ以上の成分の選択的な遅延のプロセスを意味する。この遅延の結果
、静止期（単数または複数）に対してこの液体が動くので、１つ以上の静止期とバルクの
液体（すなわち、移動相）との間の混合物の成分の分布が生じる。「液体クロマトグラフ
ィー」は、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）および高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）を包含する。

本明細書において用いる場合、「ＨＰＬＣ」または「高速液体クロマトグラフィー」と
は、液体クロマトグラフィーであって、静止相、代表的には濃密に充填されたカラムを通
じて圧力下で移動相を強制することによって分離の程度が増大される液体クロマトグラフ
ィーを指す。

本明細書において用いる場合、「ガスクロマトグラフィー」という用語は、クロマトグ
ラフィーであって、サンプル混合物が気化されて、液体または粒子状固体からなる静止相
を含むカラムを通じて移動する搬送ガス（窒素またはヘリウム）の流れに注入され、その
静止期の化合物の親和性に従ってその成分化合物に分けられるクロマトグラフィーを指す
。

本明細書において用いる場合、「質量分析」（ＭＳ）とは、その質量によって化合物を
特定するための分析技術を指す。ＭＳ技術は一般には（１）化合物をイオン化して荷電さ
れた化合物を形成する工程；および（２）荷電された化合物の分子量を検出して質量対電
荷比（ｍ／ｚ）を算出する工程を含む。この化合物は、任意の適切な手段によってイオン
化および検出され得る。「質量分析計」は一般には、イオン化装置およびイオン検出器を
備える。例えば、「ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙＦｒｏｍＳｕｒｆａｃｅｓ
」と題された米国特許第６，２０４，５００号、「ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐａｒ
ａｔｕｓｆｏｒＴａｎｄｅｍＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」と題された同
第６，１０７，６２３号、「ＤＮＡＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＢａｓｅｄＯｎＭａ
ｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」と題された同第６，２６８，１４４号、「Ｓｕｒｆａ
ｃｅ－ＥｎｈａｎｃｅｄＰｈｏｔｏｌａｂｉｌｅＡｔｔａｃｈｍｅｎｔＡｎｄＲ
ｅｌｅａｓｅＦｏｒＤｅｓｏｒｐｔｉｏｎＡｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎＯｆＡ
ｎａｌｙｔｅｓ」と題された同第６，１２４，１３７号、Ｗｒｉｇｈｔｅｔａｌ．，
ＰｒｏｓｔａｔｅＣａｎｃｅｒａｎｄＰｒｏｓｔａｔｉｃＤｉｓｅａｓｅｓ２
：２６４～７６（１９９９）；ならびにＭｅｒｃｈａｎｔおよびＷｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ２１：１１６４～６７（２０００）を参照のこと。

本明細書において用いる場合、「電子イオン化」という用語は、気相または蒸気相中の
目的の分析物が電子の流れと相互作用する方法を指す。分析物での電子の衝撃は分析物イ
オンを生じ、これが次に質量分析技術に供され得る。

本明細書において用いる場合、「化学的イオン化」という用語は、試薬ガス（例えば、
アンモニア）が電子衝撃に供され、分析物イオンが試薬ガスイオンおよび分析物分子の相
互作用によって形成される方法を指す。

本明細書において用いる場合、「高速電子衝撃」という用語は、高エネルギー原子のビ
ーム（しばしばＸｅまたはＡｒ）が不揮発性サンプルに衝突し、サンプル中に含まれる分
子を脱着およびイオン化する方法を指す。試験サンプルを、グリセロール、チオグリセロ
ール、ｍ－ニトロベンジルアルコール、１８－クラウン－６クラウンエーテル、２－ニト
ロフェニルオクチルエーテル、スルホラン、ジエタノールアミン、およびトリエタノール
アミンなどの粘性の液体マトリックスに溶解する。

本明細書において用いる場合、「電界脱離」という用語は、不揮発性の試験サンプルを
イオン化表面に置き、強電界を用いて分析物イオンを生成する方法を指す。

本明細書において用いる場合、「イオン化」という用語は、１つ以上の電子単位に等し
い正味の電荷を有している分析物イオンを生成するプロセスを指す。負のイオンとは、１
つ以上の電子単位の正味の負の電荷を有しているイオンであるが、正のイオンとは、１つ
以上の電子単位の正味の正の電荷を有しているイオンである。

「負のイオンモードで操作する」という用語は、負のイオンが検出される質量分析法を
指す。同様に「正のイオンモードで操作する」とは、正のイオンが検出される質量分析法
を指す。

本明細書において用いる場合、「脱離」という用語は、表面からの分析物の除去、およ
び／または気相への分析物の進入を指す。

第二の局面では、サンプル中の１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂の存在または量を決定するため
の方法が提供され、この方法は（ａ）サンプル中の１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂を４－フェニ
ル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン（ＰＴＡＤ）で誘導体化する工程；（ｂ
）この誘導体化された１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂をＨＰＬＣによって精製する工程；（ｃ）
５８６．３７±０．５の質量／電荷比を有している誘導体化された１α，２５（ＯＨ）₂
Ｄ₂の前駆イオンを生成する工程；（ｄ）前駆イオンの１つ以上の断片イオンを生成する
工程であって、断片イオンの少なくとも１つが３１４．１２±０．５の質量／電荷比を有
しているイオンを含む工程；ならびに（ｅ）工程（ｃ）もしくは（ｄ）またはその両方で
生成された１つ以上のイオンの存在または量を検出し、この検出されたイオンをサンプル
中の１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂の存在または量に対して関連付ける工程を含む。特定の好ま
しい実施形態では、サンプル中の１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂は工程（ａ）の前に免疫精製に
よって精製され；好ましくはこの免疫精製は、免疫粒子による免疫精製を含む；好ましく
はこの免疫粒子は、この表面に対して結合した抗ジヒドロキシビタミンＤ代謝物を有する
。この局面のいくつかの好ましい実施形態では、この方法はさらに、サンプル中の１α，
２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の存在または量を検出する工程を含み；好ましくはこの１α，２５（Ｏ
Ｈ）₂Ｄ₃は質量分析の前に４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン（
ＰＴＡＤ）で誘導体化され；さらに好ましくはこの１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の前駆イオン
が５７４．３７±０．５の質量／電荷比を有する。

第三の局面では、サンプル中の１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の存在または量をタンデム型質
量分析によって決定するための方法が提供され、この方法は（ａ）サンプル中の１α，２
５（ＯＨ）₂Ｄ₃を４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン（ＰＴＡＤ
）で誘導体化する工程と；（ｂ）誘導体化された１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃をＨＰＬＣによ
って精製する工程と；（ｃ）５７４．３７±０．５の質量／電荷比を有している誘導体化
された１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の前駆イオンを生成する工程と；（ｄ）この前駆イオンの
１つ以上の断片イオンを生成する工程であって、この断片イオンの少なくとも１つが３１
４．１２±０．５の質量／電荷比を有しているイオンを含む工程と；（ｅ）工程（ｃ）も
しくは（ｄ）またはその両方で生成されたこの１つ以上のイオンの存在または量を検出す
る工程、およびこの検出されたイオンをこのサンプル中のこの１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の
存在または量に対して関連付ける工程と；を含む。特定の好ましい実施形態では、このサ
ンプル中の１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃は工程（ａ）の前に免疫精製によって精製され；好ま
しくはこの免疫精製は、免疫粒子での免疫精製を含み；好ましくはこの免疫粒子は、表面
に結合した抗ジヒドロキシビタミンＤ代謝物抗体を有する。この局面のいくつかの好まし
い実施形態では、この方法はさらに、サンプル中の１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂の存在または
量を決定する工程を含み；好ましくはこの１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂は、質量分析の前に４
－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン（ＰＴＡＤ）で誘導体化され；
さらに好ましくはこの１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂の前駆イオンは、５８６．３７±０．５の
質量／電荷比を有する。

第四の局面では、サンプル中の１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂の存在または量をタンデム型質
量分析によって決定するための方法が提供され、この方法は（ａ）１α，２５（ＯＨ）₂
Ｄ₂をＨＰＬＣによって精製する工程；（ｂ）４１１．３５±０．５の質量／電荷比を有
している１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂の前駆イオンを生成する工程；（ｃ）この前駆イオンの
１つ以上の断片イオンを生成する工程であって、この１つ以上の断片イオンが１５１．１
２±０．５および１３５．１２±０．５の質量／電荷比を有しているイオンからなる群よ
り選択される１つ以上のイオンを含む、工程；ならびに（ｄ）工程（ｂ）もしくは（ｃ）
またはその両方で生成されたこの１つ以上のイオンの存在または量を検出する工程、およ
びこの検出されたイオンをこのサンプル中の１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂の存在または量に対
して関連付ける工程を含む。この局面の好ましい実施形態では１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂は
質量分析の前には誘導体化されていない。特定の好ましい実施形態では、サンプル中の１
α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂が工程（ａ）の前に免疫精製によって精製され；好ましくはこの免
疫精製は、免疫粒子での免疫精製を含み；好ましくはこの免疫粒子は、表面に結合した抗
ジヒドロキシビタミンＤ代謝物抗体を有する。この局面のいくつかの好ましい実施形態で
は、この方法はさらに、サンプル中の１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の存在または量を決定する
工程を含み；好ましくはこの１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃は質量分析の前に誘導体化されてお
らず；さらに好ましくはこの１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の前駆イオンは３９９．３５±０．
５の質量／電荷比を有する。

第五の局面では、サンプル中の１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の存在または量をタンデム型質
量分析によって決定するための方法が提供され、この方法は：（ａ）１α，２５（ＯＨ）
₂Ｄ₃をＨＰＬＣによって精製する工程；（ｂ）３９９．３５±０．５の質量／電荷比を有
している１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の前駆イオンを生成する工程；（ｃ）この前駆イオンの
１つ以上の断片イオンを生成する工程であって、この断片イオンが、１５１．１２±０．
５および１３５．１２±０．５の質量／電荷比を有しているイオンからなる群より選択さ
れる１つ以上のイオンを含む工程；ならびに（ｄ）工程（ｂ）もしくは（ｃ）またはその
両方で生成された１つ以上のイオンの存在または量を検出する工程、およびこの検出され
たイオンをこのサンプル中の１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の存在または量に対して関連付ける
工程を含む。この局面の好ましい実施形態では、この１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃は質量分析
の前に誘導体化されない。特定の好ましい実施形態では、サンプル中の１α，２５（ＯＨ
）₂Ｄ₃は工程（ａ）の前に免疫精製によって精製され；好ましくはこの免疫精製は免疫粒
子での免疫精製を含み；好ましくはこの免疫粒子は表面に結合した抗ジヒドロキシビタミ
ンＤ代謝物抗体を有する。この局面のいくつかの好ましい実施形態では、この方法はさら
に、サンプル中の１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂の存在または量を決定する工程を含み；好まし
くはこの１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂は質量分析の前に誘導体化されておらず；さらに好まし
くはこの１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂の前駆イオンは４１１．３５±０．５の質量／電荷比を
有する。

「約、およそ、ほぼ（ａｂｏｕｔ）」という用語は、定量的な測定に関して本明細書に
おいて用いる場合、示される値プラスマイナス１０％を指す。

試験サンプル中のジヒドロキシビタミンＤ代謝物を検出および定量する方法が開示され
る。本明細書に開示されるいくつかの好ましい方法は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）
、最も好ましくはＨＰＬＣを利用して、選択された分析物を精製し、この精製と質量分析
（ＭＳ）の固有の方法とを組み合わせて、これによって試験サンプル中のジヒドロキシビ
タミンＤ代謝物を検出および定量するための高速アッセイシステムを提供する。特定の特
に好ましい実施形態では、ジヒドロキシビタミンＤ代謝物は質量分析前に免疫精製される
。この好ましい実施形態は特に、大規模な臨床検査室への適用に十分適している。特異性
が向上しており、他のジヒドロキシビタミンＤ代謝物アッセイで必要な時間とサンプルよ
りも少ない時間とサンプルとで達成される、ジヒドロキシビタミンＤ代謝物を検出および
定量する方法が提供される。

適切な試験サンプルは、目的の分析物を含むかもしれない任意の試験サンプルを含む。
例えば、分析物の製造の間に得られるサンプルを分析して、製造プロセスの組成物および
収率を決定してもよい。いくつかの好ましい実施形態では、サンプルは生物学的サンプル
；すなわち、任意の生物学的供給源、例えば、動物、細胞培養物、有機培養物などから得
られるサンプルである。特定の好ましい実施形態では、サンプルは哺乳動物、例えば、イ
ヌ、ネコ、ウマなどから得られる。特に好ましい哺乳動物は霊長類、最も好ましくはヒト
である。特に好ましいサンプルとしては血液、血漿、血清、毛髪、筋肉、尿、唾液、涙液
、脳脊髄液、または他の組織サンプルが挙げられる。このようなサンプルは、例えば、患
者；すなわち、疾患または病態の診断、予防または処置のための臨床状況に自らいる生き
ている人から得てもよい。この試験サンプルは好ましくは、患者から得られる、例えば血
清である。

質量分析のためのサンプル調製
質量分析前にサンプル中の他の成分に対してジヒドロキシビタミンＤ代謝物を富化する
か、またはサンプル中のジヒドロキシビタミンＤ代謝物の濃度を増大する方法が用いられ
得る。このような方法としては例えば、濾過、遠心分離、薄層クロマトグラフィー（ＴＬ
Ｃ）、電気泳動、例えば、キャピラリー電気泳動、アフィニティ分離、例えば、イムノア
フィニティー分離、抽出方法、例えば、酢酸エチル抽出およびメタノール抽出、ならびに
カオトロピック剤または上記の任意の組み合わせなどが挙げられる。

サンプルを処理または精製して質量分析による分析に適切な調製物を得ることができる
。このような精製は通常、クロマトグラフィー、例えば、液体クロマトグラフィーを含み
、かつまたクロマトグラフィーの前に行われる追加の精製手順を含んでもよい。サンプル
のタイプまたはクロマトグラフィーのタイプに依存して、この目的に種々の手順を用いる
ことができる。例としては濾過、抽出、沈殿、遠心分離、脱脂、希釈、それらの組み合わ
せなどが挙げられる。タンパク質沈殿は、液体の生体サンプル、例えば、血清または血漿
をクロマトグラフィーのために調製する１つの好ましい方法である。このようなタンパク
質精製の方法は、当該分野で周知であり、例えば、Ｐｏｌｓｏｎｅｔａｌ．，Ｊｏｕ
ｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＢ７８５：２６３～２７５（２００
３）は、本発明の方法での使用に適切なタンパク質沈殿方法を記載している。タンパク質
沈殿を用いて、上清に可溶性のジヒドロキシビタミンＤ代謝物を残したままサンプルから
ほとんどのタンパク質を除去することができる。サンプルを遠心分離して、沈殿したタン
パク質から液体上清を分離してもよい。次いで、得られた上清を液体クロマトグラフィー
および引き続く質量分析的な分析に適用してもよい。本発明の一実施形態では、このタン
パク質沈殿は、１容積の液体サンプル（例えば、血漿）を約４倍容積のメタノールに対し
て添加する工程を含む。特定の実施形態では、タンパク質沈殿の使用によって、ＨＰＬＣ
および質量分析の前の高乱流液体クロマトグラフィー（「ＨＴＬＣ」）またはオンライン
抽出の必要性がなくなる。このような実施形態によれば、この方法は、（１）目的のサン
プルのタンパク質沈殿を行う工程；および（２）オンライン抽出または高乱流液体クロマ
トグラフィーを用いることなくＨＰＬＣ－質量分析計上に上清を直接ロードする工程を含
む。

免疫精製
特に好ましい実施形態では、この方法は、質量分析の前にジヒドロキシビタミンＤ代謝
物を免疫精製する工程を含む。この免疫精製工程は、当該分野で周知の任意の免疫精製方
法を用いて行うことができる。しばしばこの免疫精製手順は、固体支持体、例えば、カラ
ム、ウェル、チューブ（試験管）、カプセル、粒子などに対して結合するか、コンジュゲ
ートするか、固定するかそうでなければ付着した抗体を利用する。一般には、免疫精製方
法は、目的の分析物を含むサンプルと抗体とをインキュベートして、その結果その分析物
をこの抗体に結合させる工程、（２）１回以上の洗浄工程を行う工程、および（３）抗体
からこの分析物を溶出する工程を含む。

特定の実施形態では、免疫精製のインキュベーション工程を溶液中の抗体とともに行い
、その抗体を引き続き洗浄工程の前に固体表面に結合させるか付着させる。特定の実施形
態では、これは、抗ジヒドロキシビタミンＤ抗体である一次抗体、およびこの一次の抗ジ
ヒドロキシビタミンＤ抗体に親和性を有する固体表面に結合された二次抗体を用いて行う
ことができる。別の実施形態では、この一次抗体はインキュベーション工程の前に固体表
面に結合される。

適切な固体支持体としては限定するものではないが、チューブ（試験管）、スライド、
カラム、ビーズ、カプセル、粒子、ゲルなどが挙げられる。いくつかの好ましい実施形態
では、この固体支持体は、マルチ－ウェルプレート、例えば、９６ウェルプレート、３８
４ウェルプレートなどである。特定の好ましい実施形態では、この固体支持体は、セファ
ロースまたはアガロースビーズまたはゲルである。抗体（例えば、抗ジヒドロキシビタミ
ンＤ抗体または二次抗体）が固体支持体に対して結合、付着、固定またはカップリングさ
れ得る多数の方法、例えば、共有結合または非共有結合吸着、親和性結合、イオン結合な
どが当該分野では周知である。特定の好ましい実施形態では、抗体はＣＮＢｒを用いてカ
ップシングされ、例えば、この抗体はＣＮＢｒ活性化セファロースに対してカップリング
され得る。他の実施形態では、この抗体は、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ
／Ｇ、またはプロテインＬなどの抗体結合タンパク質を通じて固体支持体に結合される。

免疫精製方法の洗浄工程は一般には、固体支持体を洗浄して、その結果その固体支持体
上に抗ジヒドロキシビタミンＤ抗体に結合したままジヒドロキシビタミンＤ代謝物を残す
工程を含む。免疫精製の溶出工程は一般には、抗ジヒドロキシビタミンＤ抗体に対するジ
ヒドロキシビタミンＤ代謝物の結合を破壊する溶液の添加を含む。例示的な溶出溶液とし
ては、有機溶液（好ましくは、エタノール）、塩溶液および高または低ｐＨの溶液が挙げ
られる。

特定の好ましい実施形態では、免疫精製は、抗ジヒドロキシビタミンＤ抗体を有してい
る免疫粒子を用いて行う。特定の好ましい実施形態では、ジヒドロキシビタミンＤ代謝物
および免疫粒子を含有している可能性のある試験サンプルを、インキュベーション、およ
び免疫粒子に結合された抗ジヒドロキシビタミンＤ抗体に対するジヒドロキシビタミンＤ
代謝物の結合のために、試験管中で混合する；この試験管を遠心分離してペレット中に免
疫粒子を残す；その上清を除去する；その免疫粒子を、ペレットに溶液を添加することお
よび再遠心分離することによって１回以上洗浄し；そのジヒドロキシビタミンＤ代謝物を
、免疫粒子に溶出溶液を添加することによって溶出し、その試験管を遠心分離して、ペレ
ットに免疫粒子を残し；そしてジヒドロキシビタミンＤ代謝物を含む上清を収集する。関
連の好ましい実施形態では、その免疫精製は、抗ジヒドロキシビタミンＤ抗体を有してい
る免疫粒子を含むカラムまたはカートリッジを用いて行う。好ましくは、このようなカラ
ムまたはカートリッジを遠心分離して、ある方式で配列して、溶液がその中に含まれる免
疫粒子を保持しながら流れることを可能にする。特定の好ましい実施形態では、その溶液
を、重力、遠心分離または圧力によってそのカラムまたはカートリッジを強制的に通過さ
せる。カラムの使用によって、インキュベーション、洗浄および溶出工程を行う容易さが
改善され得る。いくつかの好ましい実施形態では、この免疫精製は、アフィニティークロ
マトグラフィー；好ましくは自動的アフィニティークロマトグラフィー；好ましくはアフ
ィニティー－ＨＰＬＣ；または好ましくはＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ（以前はＡｍｅｒ
ｓｈａｍｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が市販しているＡＫＴＡＦＰＬＣクロマトグラフ
ィック・システムなどの自動的なシステムを用いるアフィニティークロマトグラフィーに
よって行う。

特定の実施形態では、サンプル調製および免疫精製は、市販のキット由来の方法および
試薬を用いて行うことができる。例えば、ＩＤＳＩｎｃ（ＦｏｕｎｔａｉｎＨｉｌｌ
ｓ，ＡＺ）は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の前にジヒドロキシビタミンＤを抽出お
よび免疫抽出するための指示および試薬を備える１，２５－ジヒドロキシビタミンＤ¹²⁵
Ｉラジオイムノアッセイキット（ＣａｔａｌｏｇｕｅＮｕｍｂｅｒＡＡ－５４Ｆ１）
を供給する。その全体が出典明記によって本明細書に援用されるキットである、カタログ
番号ＡＡ－５４Ｆ１ＩＤＳ，Ｉｎｃ．の「ＰｒｏｄｕｃｔＳｕｐｐｏｒｔ」文書を参
照のこと。詳細には、ＩＤＳジヒドロキシビタミンＤＲＩＡキットは、硫酸デキスト
ラン／塩化マグネシウム脱脂質工程および１，２５ジヒドロキシビタミンＤに特異的なモ
ノクローナル抗体に結合される粒子の懸濁物を含むイムノカプセルデバイスを用いる免疫
抽出工程を含む。従って、本明細書に記載される方法の特定の実施形態では、このサンプ
ルを、ＩＤＳのキットまたは方法、試薬およびＩＤＳキットに示されるものと類似のジヒ
ドロキシビタミンＤ免疫精製デバイスを用いてビタミンＤ免疫精製に供する。抗体および
ジヒドロキシ精製の免疫精製デバイスはまた、ＡＬＰＯＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓａ
ｌｅｍ，ＮＨ）が市販している１，２５－（ＯＨ）２－ビタミンＤＩｍｍｕｎｏＴｕｂ
ｅＥＬＩＳＡＫｉｔ（カタログ番号３０－２１１３）とともに提供される。このキッ
トは抗１，２５－（ＯＨ）₂ビタミン－Ｄ検出抗体（カタログ番号Ｋ２１１３Ａ１）、１
，２５－ジヒドロキシビタミンＤの免疫精製のためのＩｍｍｕｎｏＴｕｂｅｃｏｌｕｍ
ｎｓ（カタログ番号Ｋ２１１３．ＳＩ）ならびに１，２５－ジヒドロキシビタミンＤを免
疫精製するために用いられ得る緩衝液および他の試薬を備える。本明細書に記載される方
法の特定の実施形態では、ＡＬＰＯＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓキットの１つ以上の成分を
用いて１，２５－ジヒドロキシビタミンＤを免疫精製する。

液体クロマトグラフィー
一般には、クロマトグラフィーは質量分析前に行われ、好ましくはこのクロマトグラフ
ィーは液体クロマトグラフィー、より好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ
）である。いくつかの好ましい実施形態では、このクロマトグラフィーはガスクロマトグ
ラフィーではない。好ましくは、本発明の方法は、サンプルまたは目的のジヒドロキシビ
タミンＤ代謝物を質量分析の前にガスクロマトグラフィーにかけることなく行う。

高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む液体クロマトグラフィー（ＬＣ）は、
比較的遅い層流技術に依拠する。伝統的なＨＰＬＣ分析は、カラム充填に依拠し、ここで
はカラムを通じたサンプルの層流はサンプルからの目的の分析物の分離の基礎である。当
業者は、このようなカラムでの分離が拡散性プロセスであることを理解する。ＨＰＬＣは
生物学的サンプル中の化合物の分離に首尾よく適用されている。しかし、質量分析（ＭＳ
）での分離および引き続く分析の前には大量のサンプル調製が必要であり、そのせいでこ
の技術は労働集約的になっている。さらに、ほとんどのＨＰＬＣシステムは質量分析をそ
の完全能力までは利用せず、それによって１つのＨＰＬＣシステムだけを単一のＭＳ装置
に接続することになり、その結果多数のアッセイを行うためには長時間が必要となる。

質量分析前にサンプルを浄化するためのＨＰＬＣの使用に関連する種々の方法が記載さ
れている。例えば、Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＤｒｕｇ
Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ２２：６０８～１２（２０００）（血液サンプルの手動的な沈殿
、続いて手動的なＣ１８固相抽出、Ｃ１８分析カラム上のクロマトグラフィーのためのＨ
ＰＬＣへの注入、およびＭＳ／ＭＳ分析（ｍａｎｕａｌｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ
ｏｆｂｌｏｏｄｓａｍｐｌｅｓ，ｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙｍａｎｕａｌＣ１８
ｓｏｌｉｄｐｈａｓｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｉｎｔｏａｎ
ＨＰＬＣｆｏｒｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｏｎａＣ１８ａｎａｌｙｔ
ｉｃａｌｃｏｌｕｍｎ，ａｎｄＭＳ／ＭＳａｎａｌｙｓｉｓ））；ならびにＳａｌ
ｍｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ２２Ｓｕｐｌ．Ｂ：Ｂ７１
－Ｂ８５（２０００）（血液サンプルの手動的な沈殿、続いて手動的なＣ１８固相抽出、
Ｃ１８分析カラム上のクロマトグラフィーのためのＨＰＬＣへの注入、およびＭＳ／ＭＳ
分析（ｍａｎｕａｌｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｏｆｂｌｏｏｄｓａｍｐｌｅｓ
，ｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙｍａｎｕａｌＣ１８ｓｏｌｉｄｐｈａｓｅｅｘｔｒ
ａｃｔｉｏｎ，ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｉｎｔｏａｎＨＰＬＣｆｏｒｃｈｒｏｍａｔ
ｏｇｒａｐｈｙｏｎａＣ１８ａｎａｌｙｔｉｃａｌｃｏｌｕｍｎ，ａｎｄＭ
Ｓ／ＭＳａｎａｌｙｓｉｓ））。

当業者は、本発明における使用に適切であるＨＰＬＣ装置およびカラムを選択できる。
クロマトグラフィーカラムは代表的には、化学部分の分離（すなわち、断片化）を容易に
する媒体（すなわち、充填材料）を含む。この培地は、わずかな粒子を含んでもよい。こ
の粒子は、種々の化学的部分と相互作用してその化学的部分の分離を促進する結合された
表面を含む。適切な結合された表面の１つは、アルキル結合した表面などの疎水性結合し
た表面である。アルキル結合した表面は、Ｃ－４、Ｃ－８、またはＣ－１８結合したアル
キル基、好ましくはＣ－１８結合した基を含み得る。クロマトグラフィーカラムは、サン
プルを受容するための入口ポート、および分画されたサンプルを含む溶出液を廃棄するた
めの出口ポートを備える。一実施形態では、サンプル（または精製前のサンプル）を入口
ポートでカラムに加え、溶媒または溶媒混合物で溶出し、出口ポートで排出する。異なる
溶媒モードを、目的の分析物を溶出するために選択してもよい。例えば、液体クロマトグ
ラフィーは、勾配モード、アイソクラチックモード、または多型（すなわち、混合）モー
ドを用いて行ってもよい。クロマトグラフィーの間、物質の分離は、溶出液の選択（「移
動相」としても公知）、勾配溶出および勾配条件の選択、温度などのような変数によって
達成される。

特定の実施形態では、分析物は、目的の分析物がカラム充填物質によって可逆性に保持
されるが、１つ以上の他の物質が保持されない条件下でカラムにサンプルを加えることに
よって精製され得る。これらの実施形態では、目的の分析物がカラムによって保持される
第一の移動相条件を使用してもよく、そして第二の移動相条件を引き続き使用して、一旦
、保持されていない物質が洗い流されれば、カラムから保持された物質を除去してもよい
。あるいは、分析物は、目的の分析物が１つ以上の他の物質に比べて種々の速度で溶出す
る移動相条件下でカラムにサンプルを加えることによって精製され得る。このような手順
は、サンプルの１つ以上の他の成分に対して目的の１つ以上の分析物の量を富化し得る。

近年では、高乱流液体クロマトグラフィー（「ＨＴＬＣ」）はまた、高速液体クロマト
グラフィーとも呼ばれ、質量分析によって分析前にサンプル調製に加えられている。例え
ば、Ｚｉｍｍｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ８５４：２３～３５
（１９９９）を参照のこと；また米国特許第５，９６８，３６７号；同第５，９１９，３
６８号；同第５，７９５，４６９号；および同第５，７７２，８７４号も参照のこと。伝
統的なＨＰＬＣ分析は、カラム充填に依拠し、ここではカラムを通したサンプルの層流は
サンプルからの目的の分析物の分離を基礎とする。当業者は、このようなカラムの分離が
拡散性のプロセスであることを理解するであろう。対照的に、乱流、例えば、ＨＴＬＣの
カラムおよび方法によって提供される乱流は、質量移動の速度を増強することができ、提
供される分離特徴を改善すると考えられる。いくつかの実施形態では、高乱流液体クロマ
トグラフィー（ＨＴＬＣ）は、単独でまたは１つ以上の精製方法と組みわせて、質量分析
の前に目的のジヒドロキシビタミンＤ代謝物を精製してもよい。このような実施形態では
、サンプルを、分析物を捕獲するＨＴＬＣ抽出カートリッジを用いて抽出してもよく、次
いでイオン化の前に第二のＨＴＬＣカラム上で、または分析的ＨＰＬＣカラム上に溶出お
よびクロマトグラフィーしてもよい。これらのクロマトグラフィー手順を含む工程は、自
動的な形式で連結することが可能で、分析物の精製の間の操作者の関与のための要件を最
小化することができる。この方法の特定の実施形態では、サンプルをＨＴＬＣカラム上の
ローディングの前に上記の様なタンパク質沈殿に供し；別の実施形態では、サンプルをタ
ンパク質沈殿の供することなくＨＴＬＣ上に直接ロードしてもよい。

近年では、ビタミンＤ₃代謝物のＡ環のヒドロキシル基のエピマー化はビタミンＤ₃代謝
物および生体内活性化の重要な局面であること、ならびに細胞型に依存して、ビタミンＤ
₃代謝物の３－Ｃエピマー（例えば、３－エピ－２５（ＯＨ）Ｄ₃；３－エピ－２４，２５
（ＯＨ）₂Ｄ₃；および３－エピ－１，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃）は主要な代謝産物である場合が
多いことが研究によって示されている。Ｋａｍａｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，２７９：１５８９７～１５９０７（２００４）を参照のこと。Ｋａｍａｏらはさ
らに、キラルＨＰＬＣを用いて３－Ｃエピマーを含む、種々のビタミンＤ代謝物を分離す
る方法を提供する。従って、本発明はまた、（１）キラルクロマトグラフィー、好ましく
はキラルＨＰＬＣによって１つ以上の特異的ビタミンＤ代謝物を分離すること；および（
２）本明細書に記載されるような質量分析方法を用いて１つ以上のビタミンＤ代謝物の存
在および／または量を検出することによって、サンプル中の１つ以上のビタミンＤ代謝物
、好ましくはビタミンＤ₃代謝物の特異的なエピマーの有無および／または量を検出する
方法を提供する。Ｋａｍａｏらが記載したキラルクロマトグラフィー手順は、本発明の方
法に適切であるが、当業者は、やはり適切である多数の他のキラルクロマトグラフィー方
法があることを理解する。好ましい実施形態では、この方法は、もしサンプル中にあれば
、キラルクロマトグラフィーを用いて、２５（ＯＨ）Ｄ₃を３－エピ－２５（ＯＨ）Ｄ₃か
ら分離する工程；および質量分析を用いてサンプル中の２５（ＯＨ）Ｄ₃および３－エピ
－２５（ＯＨ）Ｄ₃の存在および／または量を検出する工程を含む。関連の実施形態では
、この方法は、もしサンプル中にあれば、キラルクロマトグラフィーを用いて、１α，２
５（ＯＨ）₂Ｄ₃を３－エピ－１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃から分離する工程；および質量分析
を用いてサンプル中の１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃および３－エピ－１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃
の存在および／または量を検出する工程を含む。本発明の特定の実施形態では、キラルク
ロマトグラフィーを上記のＨＴＬＣ方法と組み合わせて用いる。

質量分析による検出および定量
サンプル中の１つ以上のジヒドロキシビタミンＤ代謝物の存在または量を検出するため
の方法が開示される。特定の局面では、この方法は、ジヒドロキシビタミンＤ代謝物（単
数または複数）をイオン化する工程、このイオン（単数または複数）を質量分析によって
検出する工程、およびこのイオン（単数または複数）の存在または量をサンプル中のジヒ
ドロキシビタミンＤ代謝物（単数または複数）の存在または量に対して関連付ける工程を
含む。この方法は、（ａ）サンプル中に存在する場合、ジヒドロキシビタミンＤ代謝物を
精製する工程、（ｂ）この精製されたジヒドロキシビタミンＤ代謝物をイオン化する工程
、および（ｃ）このイオンの存在または量を検出する工程であって、このイオンの存在ま
たは量をサンプル中のジヒドロキシビタミンＤ代謝物の存在または量に関連付ける工程を
含み得る。好ましい実施形態では、このイオン化工程（ｂ）は、（ｉ）サンプル中に存在
する場合、ジヒドロキシビタミンＤ代謝物をイオン化して、イオンを生成する工程；（ｉ
ｉ）このジヒドロキシビタミンＤ代謝物イオンを質量分析によって単離して前駆イオンを
得る工程、および（ｉｉｉ）単離された前駆イオンと不活性な衝突ガスとの間の衝突を果
たして、質量分析計で検出可能な少なくとも１つの断片イオンを生成する工程を含み得る
。特定の好ましい実施形態では、この前駆イオンはジヒドロキシビタミンＤ代謝物のプロ
トン化および脱水されたイオンである。

さらに提供されるのは、試験サンプル中のジヒドロキシビタミンＤ代謝物の存在または
量をタンデム型質量分析によって決定するための方法である。この方法は、（ａ）ジヒド
ロキシビタミンＤ代謝物のプロトン化および脱水された前駆イオンを生成する工程；（ｂ
）この前駆イオンの１つ以上の断片イオンを生成する工程；ならびに（ｃ）工程（ａ）も
しくは（ｂ）またはその両方で生成した１つ以上のイオンの存在または量を検出して、こ
の検出されたイオンをサンプル中のジヒドロキシビタミンＤ代謝物の存在または量に関連
付ける工程を含み得る。

本発明の特定の好ましい実施形態では、少なくとも１つの断片イオンが検出され、ここ
ではこの前駆イオンおよび／または少なくとも１つの断片イオンの存在または量を、サン
プル中のジヒドロキシビタミンＤ代謝物の存在または量に関連付ける。好ましくは、少な
くとも１つの断片イオンが目的のジヒドロキシビタミンＤ代謝物について特異的である。
いくつかの実施形態では、本発明の方法を用いて、単独のアッセイで２つ以上のジヒドロ
キシビタミンＤ代謝物を検出および定量してもよい。

質量分析は、質量分析計を用いて行い、質量分析計には、断片化されたサンプルをイオ
ン化し、さらなる分析のために荷電された分子を生成するためのイオン源を備える。例え
ば、サンプルのイオン化は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン
化（ＡＰＣＩ）、光イオン化、電子イオン化、高速原子衝撃（ＦＡＢ）／液体二次イオン
化（ＬＳＩＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、フィールド
・イオン化、フィールド・デソープション、熱スプレー／プラズマスプレーイオン化、お
よび粒子ビームイオン化によって行ってもよい。当業者は、イオン化方法の選択は、測定
されるべき分析物、サンプルのタイプ、検出器のタイプ、正対負のモードの選択などに基
づいて決定できることを理解する。

サンプルがイオン化された後、そのように生成された正に荷電されるかまたは負に荷電
されたイオンを分析して、質量対電荷比（すなわち、ｍ／ｚ）を決定することができる。
質量対電荷比を決定するための適切な分析装置としては、四重極アナライザー、イオント
ラップアナライザー、および飛行時間アナライザーが挙げられる。このイオンはいくつか
の検出モードを用いて検出され得る。例えば、選択されたイオンを検出してもよく（すな
わち、選択性イオンモニタリングモード（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｉｏｎｍｏｎｉｔｏｒ
ｉｎｇｍｏｄｅ）（ＳＩＭ）を用いる）、あるいはイオンは、走査モード、例えば、多
重反応モニタリング（ｍｕｌｔｉｐｌｅｒｅａｃｔｉｏｎｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）（
ＭＲＭ）または選択反応モニタリング（ｓｅｌｅｃｔｅｄｒｅａｃｔｉｏｎｍｏｎｉ
ｔｏｒｉｎｇ）（ＳＲＭ）を用いて検出してもよい。好ましくは、質量対電荷比は、四重
極アナライザーを用いて決定される。例えば、「四重極（ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ）」また
は「四重極イオントラップ（ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅｉｏｎｔｒａｐ）」装置では、振
動高周波電界中のイオンは電極間で印加されるＤＣ電位、ＲＦシグナルの振幅およびｍ／
ｚに対して比例する力を受ける。この電圧および振幅は、特定のｍ／ｚを有するイオンの
みが四重極の長さを移動するが、他の全てのイオンが偏向されるように選択され得る。従
って、四重極装置は、「質量フィルター」として、および「質量検出器」として両方で、
この装置に注入されたイオンのために作用し得る。

当業者は、「タンデム型質量分析」または「ＭＳ／ＭＳ」を使用することによってＭＳ
技術の分解能を増強し得る。この技術では、目的の分子から生成された前駆イオン（親イ
オンとも呼ばれる）をＭＳ装置中で濾過してもよく、この前駆イオンが引き続き、断片化
されて１つ以上の断片イオン（娘イオンまたは生成物イオンとも呼ばれる）を生じ、次に
これが第二のＭＳ手順で分析される。前駆イオンの注意深い選択によって、特定の分析物
によって生成されるイオンのみが断片化チャンバに渡され、ここで不活性ガスの原子と衝
突して娘イオンを生じる。前駆イオンおよび断片イオンの両方が所定のセットのイオン化
／断片化条件下で再現性の方式で産生されるので、ＭＳ／ＭＳ技術は、極めて強力な分析
ツールをもたらすことができる。例えば、濾過／断片化の組み合わせを用いることによっ
て妨害物質を排除することが可能で、特に、生体サンプルなどの複雑なサンプルでは有用
であり得る。

さらに、飛行時間アナライザー（「ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ」）と連結されたマトリックス
支援レーザー脱離イオン化などの技術での近年の進歩によって、極めて短いイオンパルス
でフェントモルレベルで分析物を分析することが可能になる。飛行時間アナライザーとタ
ンデムＭＳとを組み合わせる質量分析器も当業者には周知である。さらに、複数の質量分
析工程を「ＭＳ／ＭＳ」として公知の方法で組み合せてもよい。ＭＳ／ＭＳ／ＴＯＦ、Ｍ
ＡＬＤＩ／ＭＳ／ＭＳ／ＴＯＦ、またはＳＥＬＤＩ／ＭＳ／ＭＳ／ＴＯＦ質量分析などの
種々の他の組み合わせを使用してもよい。

質量分析計は代表的には、使用者にイオンスキャンを提供する；すなわち、所定の範囲
を超える特定のｍ／ｚを有する各々のイオンの相対量（例えば、１００～１０００ａｍｕ
）。分析アッセイの結果、すなわち、質量スペクトルは、当該分野で公知の多数の方法に
よって、もとのサンプル中の分析物の量に対して関連付けられ得る。例えば、サンプルお
よび分析パラメーターが注意深く制御されていることを考慮すれば、所定のイオンの相対
量を、元の分子の相対量から絶対量に変換する表と比較することができる。あるいは、分
子標準はサンプルとともに流されてもよく、標準的な曲線をそれらの標準から生成したイ
オンに基づいて構築してもよい。このような標準曲線を用いて、所定のイオンの相対量を
、もとの分子の絶対量に変換してもよい。特定の好ましい実施形態では、内部標準を用い
て、ジヒドロキシビタミンＤ代謝物の量を計算するための標準曲線を作製する。このよう
な標準曲線を作製および用いる方法は、当該分野で周知であり、かつ当業者は適切な内部
標準を選択できる。例えば、ジヒドロキシビタミンＤ代謝物の同位体を内部標準として用
いてもよく、好ましい実施形態では、このジヒドロキシビタミンＤ代謝物は、重水素化さ
れたジヒドロキシビタミンＤ代謝物、例えば、１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂－［２６，２６，
２６，２７，２７，２７］－²Ｈもしくは１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃－［６，１９，１９’
］－²Ｈまたはその両方である。もとの分子の存在または量に対してイオンの存在または
量を関連付けるための多数の他の方法が当業者に周知である。

本発明の方法の１つ以上の工程を、自動的な機械を用いて行ってもよい。特定の実施形
態では、１つ以上の精製工程をオンラインで行い、さらに好ましくは全ての精製および質
量分析工程を、オンライン方式で行ってもよい。

特定の実施形態、例えば、前駆イオンがさらなる断片化のために単離されるＭＳ／ＭＳ
では、衝突活性化解離を、さらなる検出のための断片イオンを生成するために用いる場合
が多い。ＣＡＤでは、前駆イオンは、不活性ガスとの衝突、および引く続く「単分子分解
」と呼ばれるプロセスによる断片を通じてエネルギーを得る。十分なエネルギーは前駆イ
オン中に沈着され、その結果イオン内の特定の結合が振動エネルギーの増大によって破壊
され得る。

特に好ましい実施形態では、ジヒドロキシビタミンＤ代謝物は、以下の様なＬＣ－ＭＳ
／ＭＳを用いて検出および／または定量される。そのサンプルを液体クロマトグラフィー
、好ましくはＨＰＬＣに供し、このクロマトグラフィーのカラムからの液体溶媒の流れは
、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳアナライザーの加熱されたネブライザーの界面に入り、その溶媒／分
析物の混合物がその界面の加熱配管中で蒸気に変換される。噴霧溶媒に含まれたその分析
物（すなわち、ジヒドロキシビタミンＤ代謝物）をその界面のコロナ放電針でイオン化し
、これによって噴霧された溶媒／分析物混合物に大きい電圧を印加する。このイオン、す
なわち、前駆イオンは、装置の開口部を通過して、第一の四重極に入る。四重極１および
３（Ｑ１およびＱ３）は質量フィルターであって、それによって、その質量対電荷比（ｍ
／ｚ）に基づいてイオン（すなわち、「前駆」イオンおよび「断片」イオン）を選択する
ことが可能になる。四重極２（Ｑ２）は衝突セルであり、ここでイオンが断片化される。
質量分析計の第一の四重極（Ｑ１）は、分析されるべき特定のジヒドロキシビタミンＤ代
謝物の質量対電荷比を有する分子を選択する。特定のジヒドロキシビタミンＤ代謝物の前
駆イオンの正確なｍ／ｚ比を有する前駆イオンは衝突チャンバ（Ｑ２）に通ることが可能
であるが、任意の他のｍ／ｚを有する望ましくないイオンは四重極の横で衝突して排除さ
れる。Ｑ２に入る前駆イオンは中性のアルゴンガス分子および断片と衝突する。この過程
は衝突活性化解離（ＣＡＤ）と呼ばれる。生成された断片イオンは、四重極３（Ｑ３）に
通過し、ここでこの望ましいジヒドロキシビタミンＤ代謝物の断片イオンが選択されるが
、他のイオンは排除される。

本発明の方法は、正または負のイオンモードのいずれかで行われるＭＳ／ＭＳを必要と
する場合がある。当該分野で周知の標準的な方法を用いて、当業者は、四重極３（Ｑ３）
での選択のために用いられ得るジヒドロキシビタミンＤ代謝物の特定の前駆イオンの１つ
以上の断片イオンを特定することができる。

目的のジヒドロキシビタミンＤ代謝物の前駆イオンがアルコールまたはアミン基を含む
場合、前駆イオンの脱水または脱アミノを丁重に呈する断片イオンが共通して形成される
。アルコール基を含む前駆イオンの場合、脱水によって形成されるこのような断片イオン
は、前駆イオンからの１つ以上の水分子の損失によって生じる（すなわち、前駆イオンと
断片イオンとの間のｍ／ｚにおける相違は１つの水分子の損失について約１８、または２
つの水分子の損失について約３６などである）。アミン基を含む前駆イオンの場合、脱ア
ミノによって形成されるこのような断片イオンは、１つ以上のアンモニア分子の損失によ
って生じる（すなわち、前駆イオンと断片イオンとの間のｍ／ｚにおける相違は、１つの
アンモニア分子の損失について約１７、または２つのアンモニア分子の損失について約３
４などである）。同様に、１つ以上のアルコールおよびアミン基を含む前駆イオンは共通
して、１つ以上の水分子および／または１つ以上のアンモニア分子の損失を呈する断片イ
オンを形成する（例えば、前駆イオンと断片イオンとの間のｍ／ｚの相違が１つの水分子
の損失および１つのアンモニア分子の損失について約３５である場合）。一般には、前駆
イオンの脱水または脱アミノを呈する断片イオンは、特定の分析物について特定の断片イ
オンではない。

イオンは検出器と衝突するので、それらは、デジタルシグナルに変換される電子のパル
スを生じる。得られたデータを、コンピューターに中継して、これがイオン収集対時間の
カウントをプロットする。得られた質量クロマトグラムは、伝統的なＨＰＬＣ方法で作製
したクロマトグラムと類似である。特定のイオンに相当するピーク下面積、またはこのよ
うなピークの振幅を測定して、面積または振幅を目的の分析物（ビタミンＤ代謝物）の量
と相関させる。特定の実施形態では、断片イオン（単数または複数）および／または前駆
イオンの曲線下面積、またはピークの振幅を測定してジヒドロキシビタミンＤ代謝物の量
を決定する。上記のとおり、所定のイオンの相対量を、内部分子標準、例えば、⁶Ｄ－２
５ＯＨＤ₃の１つ以上のイオンのピークに基づいた較正標準曲線を用いて、元の分析物、
すなわち、ジヒドロキシビタミンＤ代謝物の絶対量に変換してもよい。

本発明の特定の局面では、種々のイオンの量を、曲線下面積、またはピークの振幅を測
定することによって決定し、そしてイオンの量の比を計算およびモニターする（すなわち
、「娘イオン比モニタリング」）。本発明の特定の実施形態では、ジヒドロキシビタミン
Ｄ代謝物の前駆イオンの量と１つ以上の断片イオンの量の比（単数または複数）を計算し
て、同様に測定したジヒドロキシビタミンＤ代謝物の分子標準の比（単数または複数）に
対して比較してもよい。ジヒドロキシビタミンＤ代謝物の２つ以上の断片イオンがモニタ
ーされる実施形態では、種々の断片イオンについての比（単数または複数）を、前駆イオ
ンに比べた断片イオン（単数または複数）の比の代わりに、またはそれに加えて決定して
もよい。このような比がモニターされる実施形態では、分子標準に比較してサンプル中の
イオン比に実質的な相違がある場合、サンプル中の分子は結果を妨げている可能性が高い
。逆に、サンプルおよび分子標準におけるイオン比が同様であるならば、妨害がないとい
う信頼が増大している。従って、サンプル中のこのような比をモニタリングすること、お
よびこの比を確証的な分子標準の比と比較することを用いて、この方法の正確性を増大し
てもよい。

本発明の特に好ましい実施形態では、サンプル中の２つ以上のジヒドロキシビタミンＤ
代謝物の有無または量を、上記のＭＳ／ＭＳ方法を用いて単一アッセイで検出する。

以下の実施例は、本発明の例示を助ける。これらの実施例は決して本発明の範囲を限定
するものではない。

実施例１：ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ₃および１α，
２５－ジヒドロキシビタミンＤ₂の決定
５０μｌの内部標準混合物（１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３－［６，１９，１９］－２Ｈを
５０ｐｇ／５０マイクロリットルで用い、かつ１α，２５（ＯＨ）２Ｄ２－［２６，２６
，２６，２７，２７，２７］－２Ｈを２００ｐｇ／５０マイクロリットルで用いてスパイ
クした剥離血清）を試験管に添加し、次いで５００μｌの較正溶液、品質管理試験溶液、
または血清標準、続いて内部標準混合物を添加した。その溶液を、５０μｌのＭｇＣｌ₂
／硫酸デキストラン溶液を添加して、徹底的に混合することによって脱脂した。その試験
管を次に、２０分間遠心分離して、５００μｌの上清を、ＡＬＰＣＯＤｉａｇｎｏｓｔ
ｉｃｓ（カタログ番号Ｋ２１１３．ＳＩ）の抗ジヒドロキシビタミンＤ免疫カプセルを含
むＩｍｍｕｎｏＴｕｂｅカートリッジに移した。そのカートリッジをシェーカー上で室温
で２時間インキュベートした。次いでそのビーズを７５０μｌの脱イオン水で３回洗浄し
た。そのビーズを、カートリッジを遠心分離することによって洗浄の間に排出させた。ビ
ーズに結合したジヒドロキシビタミンＤを、２５０μｌのエタノールを用いて直接ガラス
のＨＰＬＣインサート中に溶出し、次いで窒素下で完全に乾燥させた。次いでサンプルを
、５０μｌの５０マイクロリットルの４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５
－ジオン（ＰＴＡＤ）溶液（アセトニトリル中０．８ｍｇ／ｍＬ）を添加することによっ
て誘導体化した。その誘導体化反応を、５０μｌの脱イオン水を添加することによって停
止した。

次いでこのＨＰＬＣインサートを、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳアナライザーへローディングする
ためにＨＰＬＣオートサンプラーに移した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳは、検出器として大気圧化
学イオン化（ＡＰＣＩ）源を備えるＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎＬＣ－ＭＳ／ＭＳ
アナライザー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎＱｕａｎｔｕｍＴＳＱ（Ｓ／Ｎ：Ｔ
ＱＵ００６５５））を用いて行った。オートサンプラーを用いて、ＨＰＬＣカラム上に９
０μＬの抽出されたサンプル上清を注入した。液体クロマトグラフィーは、Ｓｙｎｅｒｇ
ｉ（商標）Ｍａｘ－ＲＰＣ－１２Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘカラム泳動で０．８ｍＬ／
分で行った。２つの移動相溶液をＨＰＬＣに用いた：移動相Ａは、ＨＰＬＣ等級の水中の
０．１％ギ酸であり、移動相Ｂは１００％のアセトニトリルであった。総泳動時間は１：
３１～２：３１（６０秒）の衝突ウインドウで５．００分であった。開始条件（２０秒）
は５０％の移動相Ａおよび５０％の移動相Ｂであった；この勾配（１６０秒）は５０％の
移動相Ａおよび５０％の移動相Ｂから２％の移動相Ａおよび９８％の移動相Ｂであった；
洗浄工程（６０秒）は２％の移動相Ａおよび９８％の移動相Ｂであった；そして再調節工
程は５０％の移動相Ａおよび５０％の移動相Ｂであった。

ＨＰＬＣカラムを出ていく液体溶媒の流れは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎＬＣ－
ＭＳ／ＭＳアナライザーの加熱されたネブライザーの界面に入り、ジヒドロキシビタミン
Ｄ代謝物はＡＰＣＩを用いて正のモードで測定された。その溶媒／分析物混合物を最初に
、この界面の加熱配管中で蒸気に変換した。その噴霧された溶媒中に含まれる分析物を、
その界面のコロナ放電針によってイオン化し（正の電荷を加えた）、これによって噴霧さ
れた溶媒／分析物の混合物に大きい電圧を印加する。イオンはこの装置の開口部を通過し
て、第一の四重極に入る。四重極１および３（Ｑ１およびＱ３）は質量フィルターであっ
て、その質量対電荷比（ｍ／ｚ）に基づいたイオンの選択を可能にする。四重極２（Ｑ２
）は衝突セルであって、ここでイオンが断片化される。

質量分析計の第一の四重極（Ｑ１）は、１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂、１α，２５（ＯＨ）
₂Ｄ₃、⁶Ｄ－１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂（内部標準）および－１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃（内
部標準）の質量対電荷比を有する分子を選択した。これらのｍ／ｚ比を有するイオン（下
の表を参照のこと）によって、衝突チャンバへ（Ｑ２）の通過が可能になったが、任意の
他のｍ／ｚを有する望ましくないイオンは、四重極の横で衝突して、排除される。Ｑ２に
入るイオンは天然のアルゴンガス分子および断片と衝突する。生成された断片イオンは、
四重極３（Ｑ３）に通過して、ここで１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂、１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃
、⁶Ｄ－１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂（内部標準）および－１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃（内部標
準）の断片イオンが選択され（下の表を参照のこと）、他のイオンが排除される。以下の
質量移行をバリデーションの間の検出および定量のために用いた：

イオンは検出器と衝突するので、それらは、デジタルジグナルに変換される電子のパル
スを生じる。得られたデータをコンピューターに中継して、これがイオン収集対時間のカ
ウントをプロットする。得られた質量クロマトグラムは、伝統的なＨＰＬＣ方法で作製し
たクロマトグラムと同様である。

分析物および内部標準（１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３－［６，１９，１９’］－２Ｈおよ
び１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂－［２６，２６，２６，２７，２７，２７］－²Ｈ）ピークの
面積比を用いて、較正曲線を構築し、次にこれを用いて分析物濃度を計算した。較正曲線
を用いて、１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂および１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の濃度を患者のサンプ
ル中で定量した。

実施例２：アッセイ内およびアッセイ間の正確性
１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂および１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃のストック溶液をプールした血
清に添加して、低プール（ＬｏｗＰｏｏｌ）（１０～１５ｎｇ／ｍＬの各々の代謝物）
、中－低プール（Ｍｅｄｉｕｍ－ＬｏｗＰｏｏｌ）（２５～３５ｎｇ／ｍＬの各々の代
謝物）、中－高プール（Ｍｅｄｉｕｍ－ＨｉｇｈＰｏｏｌ）（５５～６５ｎｇ／ｍＬの
各々の代謝物）および高プール（ＨｉｇｈＰｏｏｌ）（１１５～１３０ｎｇ／ｍＬ）を
作製した。各々の低（Ｌｏｗ）、中－低（Ｍｅｄｉｕｍ－Ｌｏｗ）、中－高（Ｍｅｄｉｕ
ｍ－Ｈｉｇｈ）および高（Ｈｉｇｈ）のプール由来の４つのアリコートを、実施例１に記
載されるＬＣ－ＭＳ／ＭＳプロトコールを用いて単一アッセイで分析した。以下の正確な
値を決定した：

本明細書において言及または引用される、論文、特許および特許出願、ならびに全ての
他の文書および電気的に利用可能な情報の内容は、あたかも各々の個々の刊行物が参照に
よって援用されると詳細にかつ個々に示されるのと同じ程度までその全体が出典明記によ
って本明細書に援用される。出願人は、任意のこのような論文、特許、特許出願または他
の物理的および電子的な文書由来の任意のかつ全ての物質および情報を本出願に物理的に
組み込む権利を留保する。

本明細書に例示的に記載される本発明は、本明細書に詳細に開示されていないなんらの
要素（単数または複数）、制限（単数または複数）もなしに適切に実施され得る。従って
、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含んでいる、包含している、挙げられ
る（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する、含んでいる（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」など
の用語は、広範にかつ限定なしに読みとられるべきである。さらに、本明細書に使用され
る用語および表現は説明の用語として用いられており、限定ではなく、このような用語お
よび表現の使用において、示されかつ記載される特徴の任意の等価物またはその一部を排
除するという意図はないが、種々の改変が特許請求される本発明の範囲内で可能であると
いうことが認識される。従って、本発明は、本明細書に具体化される本発明の好ましい実
施形態および任意の特徴、修飾および変動によって詳細に記載されているが、本明細書の
開示は当業者によって頼られる場合があり、このような改変および変動は、本発明の範囲
内であるとみなされることが理解されるべきである。

本発明は、本明細書に広範にかつ一般的に記載されている。一般的な開示内におさまっ
ている下位の種および亜属の分類の各々も、本発明の一部を形成する。これは、本発明の
一般的記述を包含しており、ただし、条件付きであるかまたは消極的な限定があり、除外
される物質が本明細書に特に引用されるか否かにかかわらず、その属からなんらかの対象
を取り除く。

他の実施形態が以下の特許請求の範囲内である。さらに、本発明の特徴または局面は、
マーカッシュグループに関して記載されており、当業者は本発明がマーカッシュグループ
の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関して本明細書に記載されてい
ることを認識する。

Claims

タンデム型質量分析によってヒトから得られた血漿または血清サンプル中の１つ以上のジヒドロキシビタミンＤ代謝物の量を決定するための方法であって：
（ｉ）液体クロマトグラフィーによってヒト血漿または血清サンプルから１つ以上のジヒドロキシビタミンＤ代謝物を富化する工程；
（ｉｉ）大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）により前記１つ以上のジヒドロキシビタミンＤ代謝物をイオン化することによって、前記１つ以上のジヒドロキシビタミンＤ代謝物の前駆イオンを生成する工程；
（ｉｉｉ）前記前駆イオンの１つ以上の断片イオンを生成する工程、ここで前記１つ以上の断片イオンは、１５１．１２±０．５および１３５．１２±０．５の質量／電荷比を有しているイオンからなる群より選択される１つ以上のイオンを含む；および
（ｉｖ）工程（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）または両方で生成された１つ以上の前記イオンの量を検出して、検出されたイオンの前記量を前記サンプル中の前記１つ以上のジヒドロキシビタミンＤ代謝物の量に対して関連付ける工程、
を含む方法。
前記液体クロマトグラフィーが、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による富化を含む、請求項１に記載の方法。
前記富化が、免疫精製による富化をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
前記１つ以上のジヒドロキシビタミンＤ代謝物が、
１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂、
１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃、または
１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂および１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を含み、
前記代謝物の前記量が単一のアッセイで決定される、請求項１―３のいずれか１項に記載の方法。
前記１つ以上のジヒドロキシビタミンＤ代謝物が質量分析の前に誘導体化されない、請求項１－４のいずれか１項に記載の方法。
前記１つ以上のジヒドロキシビタミンＤ代謝物が１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂を含み、前記１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂の前記前駆イオンが４１１．３５±０．５の質量／電荷比を有する、または
前記１つ以上のジヒドロキシビタミンＤ代謝物が１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を含み、前記１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の前記前駆イオンが３９９．３５±０．５の質量／電荷比を有する、請求項５に記載の方法。
前記１つ以上のジヒドロキシビタミンＤ代謝物が質量分析の前に誘導体化される、請求項１－４のいずれか１項に記載の方法。
前記１つ以上のジヒドロキシビタミンＤ代謝物が質量分析の前に、４－置換の１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン（ＴＡＤ）、４’－カルボキシフェニル－ＴＡＤ、または４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン（ＰＴＡＤ）で誘導体化される、請求項７に記載の方法。
前記１つ以上のジヒドロキシビタミンＤ代謝物が１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂を含み、前記１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂が質量分析の前に４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン（ＰＴＡＤ）で誘導体化される、または、
前記１つ以上のジヒドロキシビタミンＤ代謝物が１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を含み、前記１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃が質量分析の前に４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン（ＰＴＡＤ）で誘導体化される、請求項７に記載の方法。
前記１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₂の前記前駆イオンが５８６．３７±０．５の質量／電荷比を有する、または、
前記１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の前記前駆イオンが５７４．３７±０．５の質量／電荷比を有する、請求項９に記載の方法。
前記１つ以上の断片イオンが、３１４．１２±０．５の質量／電荷比を有しているイオンを含む、請求項１０に記載の方法。