JP7019372B2 - ビタミンｄ代謝物の選択的測定法 - Google Patents
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Description
本発明は、試料中に含まれるビタミンＤ代謝物を、液体クロマトグラフ－質量分析計（ＬＣ－ＭＳ）を用いて同定及び／又は定量する方法に関する。
ビタミンＤは、ビタミンＤ受容体を介して生体内カルシウム濃度を調節する作用を有する、生理学的に必要不可欠な脂溶性ビタミンである。ビタミンＤは、くる病、骨粗鬆症及び骨軟化症等の骨代謝疾患、並びに、認知症、うつ病、糖尿病、多発性硬化症、小児ビタミンＤ欠乏症、大腸がん、及び心血管疾患などの様々な疾患と密接な関係があると考えられている。したがって、ビタミンＤ量を把握することは、疾患の解明や薬理効果の判定などに有用である。
ビタミンＤは、動物由来のビタミンＤ３と植物由来のビタミンＤ２との２種類に主に大別される。ビタミンＤ３は、動物では、皮膚において、紫外線により７－デヒドロコレステロールから光化学的に合成される。ビタミンＤ３は、肝臓で代謝されて２５－ヒドロキシビタミンＤ３に変換され、血中のビタミンＤ結合蛋白と結合して、血中を循環する。
２５－ヒドロキシビタミンＤ３は、血中に存在する最も高濃度なビタミンＤ３代謝物の１つである。２５－ヒドロキシビタミンＤ３は、腎臓において、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３に変換される。
１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３は、最も大きな生理学的作用を有するビタミンＤ３代謝物であると考えられている。１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３は、腎疾患や慢性肉芽腫症による高カルシウム血症の診断に用いられるなど、ビタミンＤ３の生理学的作用を直接評価したり、病態を診断したりする上で、非常に重要なビタミンＤ３代謝物である。また、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３は、副甲状腺での副甲状腺ホルモンの合成や分泌において、ネガティブフィードバックとして働き、生命の維持においても非常に重要な役割を有している。
腎臓において代謝されなかった２５－ヒドロキシビタミンＤ３は、肝臓において代謝されて、２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３や２３，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３に変換される。これらは、更に代謝されてカルシトロン酸に変換され、尿中に排泄される。２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３は、間葉系幹細胞において骨芽細胞の分化を誘導する作用を有していると考えられており、ビタミンＤ３の体外への排泄に関係しているだけではなく、生理学的作用も有していることが知られている。
ビタミンＤ２は、植物由来のビタミンＤであることから、動物においては、食餌によって体内に吸収される。ビタミンＤ２は、ビタミンＤ３と同様の代謝を受け、ビタミンＤ３と同様の生理学的作用を示すことが示唆されている。ビタミンＤ２の生理学的作用の強さは、ビタミンＤ３と比較して同程度又はそれ以下と言われている。ビタミンＤ２は、食餌によるビタミンＤの補充目的の点で、重要視されている。
試料中に含まれるビタミンＤの量と病態との関連を精査するには、ビタミンＤ代謝物を網羅的かつ正確に測定することが求められる。ヒトにおいて、臨床の現場では、血中の２５－ヒドロキシビタミンＤ３と２５－ヒドロキシビタミンＤ２との総和（「トータル２５－ヒドロキシビタミンＤ」とも言われる。）及び１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３は、免疫学的測定法を用いてそれぞれ測定されている。しかしながら、トータル２５－ジヒドロキシビタミンＤの測定において、免疫学的測定法では２５－ヒドロキシビタミンＤ３と２５－ヒドロキシビタミンＤ２とを区別して測定することはできない。また、免疫学的測定法では、ビタミンＤ代謝物を網羅的に把握するためには、それぞれの代謝物を個別に測定する必要があるので、必要とされる試料の量は多くなる。しかしながら、新生児及び小児並びに動物実験に用いられるラット及びマウスなどの血液は、多量に採取することが困難であるから、免疫学的測定法ではビタミンＤ代謝物を網羅的に測定することはできない。よって、このような試料中のビタミンＤ代謝物を網羅的に把握し、精確に定量するためには、少ない試料量でも、ビタミンＤ代謝物を網羅的かつ精確に測定できる方法が必要である。
ビタミンＤ代謝物を網羅的に測定する方法としては、ＬＣ－ＭＳによる測定法が知られている。また、特異的で高感度なビタミンＤ測定法としては、クックソン型誘導体化試薬である４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオンを用いる方法が報告されている（非特許文献１、特許文献１）。誘導体化を用いたこの方法では、２５－ヒドロキシビタミンＤ３や２５－ヒドロキシビタミンＤ２等のビタミンＤ代謝物の測定が可能である。しかしながら、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３は、４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオンによる誘導体化後に、Ｃ１８カラムを用いて分析を行った場合、試料中の共雑物によって測定が妨害され、目的物の正確な濃度測定を行うことができない（非特許文献２、３）。１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３を測定しているとの報告もあるが（非特許文献４、５）、クロマトパターンから判断するに、これらの報告では共雑物も含めて１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３として測定をしていると考えられる。この試料中の共雑物を除き、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３を選択的に測定する方法として、免疫精製を行う方法が報告されている（特許文献２、非特許文献６、７）。しかしながら、これらの報告では、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３と選択的に反応する抗体が用られており、２５－ヒドロキシビタミンＤ３に代表されるその他のビタミンＤ代謝物は、抗体の交差性によって捕捉されるため、十分な回収率を得ることができず、ビタミンＤ代謝物を網羅的かつ高感度に測定することができない。
Clin. Chim. Acta., 403, 145-151 (2009)
Anal. Bioanal. Chem., 391, 1917-1930 (2008)
Anal. Biochem., 418, 126-133 (2011)
Anal. Chem., 82, 2488-2497 (2010)
Anal. Bioanal. Chem., 398, 779-789 (2010)
Clin. Chem., 57, 1279-1285 (2011)
Clin. Chem., 58, 1711-1716 (2012)
本発明の課題は、試料中に含まれるビタミンＤ代謝物を、ＬＣ－ＭＳを用いて網羅的かつ高感度に測定できる方法を提供することである。
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、試料中に含まれるビタミンＤ代謝物に４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオンを反応させること、及び、得られた反応物を、官能基がＣ１８でかつ固定相の残存シラノールがエンドキャッピング処理されていないＯＤＳカラムを用いる液体クロマトグラフ－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）に供することにより、試料中に存在するビタミンＤ代謝物を、ＬＣ－ＭＳを用いて網羅的かつ高感度に検出及び／又は定量できることを見出し、本発明を完成するに至った。
よって、本発明は、特に、以下のものを提供する。
［１］ 試料中に含まれるビタミンＤ代謝物を検出及び／又は定量する方法であって、
ア．試料中に存在するビタミンＤ代謝物に４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオンを反応させる工程と、
イ．工程アで得られた反応物を、官能基がＣ１８でかつ固定相の残存シラノールがエンドキャッピング処理されていないＯＤＳカラムを用いる液体クロマトグラフ－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）に供する工程と
を含む、方法。
［２］ 試料を免疫精製する工程を含まない、［１］に記載の方法。
［３］ 前記ビタミンＤ代謝物が、２５－ヒドロキシビタミンＤ３、２５－ヒドロキシビタミンＤ２、２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３、２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ２、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ２、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３、３－エピ－２５－ヒドロキシビタミンＤ３、３－エピ－２５－ヒドロキシビタミンＤ２、２５－ヒドロキシビタミンＤ３－３－サルフェートからなる群から選択される少なくとも１つである、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］ 工程アの前に、試料について、以下：
ｉ）有機溶媒による除タンパクを行うこと、
ii）液液抽出による抽出を行うこと、及び
iii）固相抽出カラムによる精製を行うこと
からなる群より選択される少なくとも１つの処理を行うことを含む、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］ 工程iii）の精製が、逆相－イオン交換ミックスモード固相抽出カラムを用いる精製である、［４］に記載の方法。
［６］ ＬＣ－ＭＳが、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳである、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］ １α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３の前駆イオンが、５７４．５±０．５又は６２３．５±０．５の質量／電荷比を有するイオンを含む、［６］に記載の方法。
［８］ １α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３の前駆イオンが、５７４．５±０．５の質量／電荷比を有する、［７］に記載の方法。
［９］ １α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３の断片イオンが、３１４．０±０．５の質量／電荷比を有するイオンを含む、［６］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１］ 試料中に含まれるビタミンＤ代謝物を検出及び／又は定量する方法であって、
ア．試料中に存在するビタミンＤ代謝物に４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオンを反応させる工程と、
イ．工程アで得られた反応物を、官能基がＣ１８でかつ固定相の残存シラノールがエンドキャッピング処理されていないＯＤＳカラムを用いる液体クロマトグラフ－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）に供する工程と
を含む、方法。
［２］ 試料を免疫精製する工程を含まない、［１］に記載の方法。
［３］ 前記ビタミンＤ代謝物が、２５－ヒドロキシビタミンＤ３、２５－ヒドロキシビタミンＤ２、２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３、２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ２、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ２、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３、３－エピ－２５－ヒドロキシビタミンＤ３、３－エピ－２５－ヒドロキシビタミンＤ２、２５－ヒドロキシビタミンＤ３－３－サルフェートからなる群から選択される少なくとも１つである、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］ 工程アの前に、試料について、以下：
ｉ）有機溶媒による除タンパクを行うこと、
ii）液液抽出による抽出を行うこと、及び
iii）固相抽出カラムによる精製を行うこと
からなる群より選択される少なくとも１つの処理を行うことを含む、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］ 工程iii）の精製が、逆相－イオン交換ミックスモード固相抽出カラムを用いる精製である、［４］に記載の方法。
［６］ ＬＣ－ＭＳが、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳである、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］ １α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３の前駆イオンが、５７４．５±０．５又は６２３．５±０．５の質量／電荷比を有するイオンを含む、［６］に記載の方法。
［８］ １α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３の前駆イオンが、５７４．５±０．５の質量／電荷比を有する、［７］に記載の方法。
［９］ １α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３の断片イオンが、３１４．０±０．５の質量／電荷比を有するイオンを含む、［６］～［８］のいずれかに記載の方法。
従来、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３等のビタミンＤ代謝物をＬＣ－ＭＳを用いて測定する際には、クロマトグラム上で夾雑物による干渉を受け、正確に１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３等のビタミンＤ代謝物を測定することが不可能であった。
しかしながら、本発明によれば、夾雑物と１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３等の目的とするビタミンＤ代謝物とを分離することが可能となる。
したがって、本発明によれば、試料中に存在するビタミンＤ代謝物を、ＬＣ－ＭＳを用いて網羅的かつ高感度に検出及び／又は定量できる。そして、好ましい実施態様によれば、免疫精製を行わなくても、試料中に存在するビタミンＤ代謝物を網羅的かつ高感度に検出及び／又は定量できる。
特に、本発明によれば、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３の検出及び／又は定量を、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３以外のビタミンＤ代謝物と同時に行うことが可能であるから、ビタミンＤ代謝物の中でも最も生理学的作用が強いと考えられている１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３と、これ以外のビタミンＤ代謝物とを含め、ビタミンＤ代謝物を網羅的かつ高感度に測定することができる。
また、本発明によれば、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３とこれ以外のビタミンＤ代謝物とを、少量の試料からでも同時に把握することができることから、新生児や小児等の血液を多量に採取することが困難な被験体からの試料であっても、被験体のビタミンＤ環境を網羅的に把握することができるので、疾病の診断や病態の評価に非常に有効な手段が得られる。更に、本発明は、ラットやマウスなどの実験動物にも適用できることから、病態の解明や新薬の開発に有効な手段となる。
特に、本発明においては、試料の免疫精製が必須ではないことから、ビタミンＤ代謝物のみならず、４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオンと反応できるその他広範囲の化合物（例えば、７－デヒドロコレステロール）も同時に分析することが可能であり、ビタミンＤ代謝物以外にも、病態の評価・解明に必要な様々な物質を網羅的に把握することが可能となる。
しかしながら、本発明によれば、夾雑物と１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３等の目的とするビタミンＤ代謝物とを分離することが可能となる。
したがって、本発明によれば、試料中に存在するビタミンＤ代謝物を、ＬＣ－ＭＳを用いて網羅的かつ高感度に検出及び／又は定量できる。そして、好ましい実施態様によれば、免疫精製を行わなくても、試料中に存在するビタミンＤ代謝物を網羅的かつ高感度に検出及び／又は定量できる。
特に、本発明によれば、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３の検出及び／又は定量を、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３以外のビタミンＤ代謝物と同時に行うことが可能であるから、ビタミンＤ代謝物の中でも最も生理学的作用が強いと考えられている１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３と、これ以外のビタミンＤ代謝物とを含め、ビタミンＤ代謝物を網羅的かつ高感度に測定することができる。
また、本発明によれば、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３とこれ以外のビタミンＤ代謝物とを、少量の試料からでも同時に把握することができることから、新生児や小児等の血液を多量に採取することが困難な被験体からの試料であっても、被験体のビタミンＤ環境を網羅的に把握することができるので、疾病の診断や病態の評価に非常に有効な手段が得られる。更に、本発明は、ラットやマウスなどの実験動物にも適用できることから、病態の解明や新薬の開発に有効な手段となる。
特に、本発明においては、試料の免疫精製が必須ではないことから、ビタミンＤ代謝物のみならず、４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオンと反応できるその他広範囲の化合物（例えば、７－デヒドロコレステロール）も同時に分析することが可能であり、ビタミンＤ代謝物以外にも、病態の評価・解明に必要な様々な物質を網羅的に把握することが可能となる。
本発明の一実施態様では、試料中に含まれるビタミンＤ代謝物を検出及び／又は定量する方法であって、
ア．試料中に存在するビタミンＤ代謝物に４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオンを反応させる工程と、
イ．工程アで得られた反応物を、官能基がＣ１８でかつ固定相の残存シラノールがエンドキャッピング処理されていないＯＤＳカラムを用いる液体クロマトグラフ－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）に供する工程と
を含む、方法を提供する。
ア．試料中に存在するビタミンＤ代謝物に４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオンを反応させる工程と、
イ．工程アで得られた反応物を、官能基がＣ１８でかつ固定相の残存シラノールがエンドキャッピング処理されていないＯＤＳカラムを用いる液体クロマトグラフ－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）に供する工程と
を含む、方法を提供する。
本発明の好ましい実施態様では、上記方法は、試料を免疫精製する工程を含まない。
本明細書における「試料」とは、特に限定されるものではなく、生物由来、環境由来又は工業製品由来など、どのような由来の試料であってもよい。
生物由来の試料としては、例えば、ヒトを含む動物の、体液（例えば、血液（全血、血清、血漿など）、唾液、涙液、汗、尿、胆汁など）、糞、組織、細胞、細胞培養液、及び、これらから得られる又は臓器から得られる調製物（例えば、ホモジネート）、並びに植物の抽出物などの生物に関連する試料を挙げることができる。生物由来の試料は、天然のものであっても、人工的に作製されたものであってもよい。中でも、生物由来の試料としては、ヒトを含む動物の血液、唾液、尿、組織、生体細胞が好ましい。
環境由来の試料としては、例えば、土壌、汚水、廃水、河川水、海水などの環境から得られる試料が挙げられる。環境由来の試料は、環境から得られたそのままのものでも、何らかの処理を行った後のものであってもよい。中でも、環境由来の試料としては、廃水、河川水が好ましい。
工業製品由来の試料としては、食料品、医薬品などが挙げられる。中でも、工業製品由来試料としては、医薬品が好ましい。
上記試料は、本明細書中に記載される方法を実施するに際し、その実施がしやすいように、適宜、希釈や濃縮をしたり、可溶化可能な溶媒に溶解するなどしたりしてもよい。
生物由来の試料としては、例えば、ヒトを含む動物の、体液（例えば、血液（全血、血清、血漿など）、唾液、涙液、汗、尿、胆汁など）、糞、組織、細胞、細胞培養液、及び、これらから得られる又は臓器から得られる調製物（例えば、ホモジネート）、並びに植物の抽出物などの生物に関連する試料を挙げることができる。生物由来の試料は、天然のものであっても、人工的に作製されたものであってもよい。中でも、生物由来の試料としては、ヒトを含む動物の血液、唾液、尿、組織、生体細胞が好ましい。
環境由来の試料としては、例えば、土壌、汚水、廃水、河川水、海水などの環境から得られる試料が挙げられる。環境由来の試料は、環境から得られたそのままのものでも、何らかの処理を行った後のものであってもよい。中でも、環境由来の試料としては、廃水、河川水が好ましい。
工業製品由来の試料としては、食料品、医薬品などが挙げられる。中でも、工業製品由来試料としては、医薬品が好ましい。
上記試料は、本明細書中に記載される方法を実施するに際し、その実施がしやすいように、適宜、希釈や濃縮をしたり、可溶化可能な溶媒に溶解するなどしたりしてもよい。
本明細書における「ビタミンＤ代謝物」とは、ビタミンＤ２又はビタミンＤ３に水酸基が結合したり硫酸抱合やグルクロン酸抱合するなどして、生合成経路及び／又は代謝経路によって形成される任意の代謝化合物を意味する。そのような代謝化合物としては、例えば、２５－ヒドロキシビタミンＤ３、２５－ヒドロキシビタミンＤ２、２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３、２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ２、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ２、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３、３－エピ－２５－ヒドロキシビタミンＤ３、３－エピ－２５－ヒドロキシビタミンＤ２、２５－ヒドロキシビタミンＤ３－３－サルフェートなどの生体内又は自然界に存在するビタミンＤ代謝物を挙げることができる。好ましい実施態様では、ビタミンＤ代謝物は、２５－ヒドロキシビタミンＤ３、２５－ヒドロキシビタミンＤ２、２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３、２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ２、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ２、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３、３－エピ－２５－ヒドロキシビタミンＤ３、３－エピ－２５－ヒドロキシビタミンＤ２、２５－ヒドロキシビタミンＤ３－３－サルフェートからなる群から選択される少なくとも１つである。
本明細書において、「ビタミンＤ代謝物を検出及び／又は定量する」との表現と「ビタミンＤ代謝物を測定する」との表現とは、明らかに違うことを示していないか又は文意に反しない限り、相互交換可能に用いられる。
本明細書における「４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン」とは、ＣＡＳ登録番号４２３３－３３－４の下記式（Ｉ）に示す化合物である。
上記工程アでは、試料中に存在するビタミンＤ代謝物に４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオンを反応させる。
具体的な反応条件は、試料に応じて適宜最適な条件を設定すればよく、試料中のビタミンＤ代謝物を４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン誘導体化できる条件であれば特段限定されない。例えば、試料と４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオンとは、アセトニトリル、酢酸エチル、アセトン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン等の不活性溶媒中で反応させることができる。反応は、－１０℃乃至８０℃の範囲内の温度で行うことができ、５℃乃至４０℃の範囲内の温度で行うことが好ましい。反応に使用する４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオンの量は、特に制限されるものではないが、一般に、測定に使用する試験管一本あたり、０．０１乃至０．５ｍＬ程度を使用すればよく、０．０２５乃至０．１ｍＬ程度を使用するのが好ましい。
具体的な反応条件は、試料に応じて適宜最適な条件を設定すればよく、試料中のビタミンＤ代謝物を４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン誘導体化できる条件であれば特段限定されない。例えば、試料と４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオンとは、アセトニトリル、酢酸エチル、アセトン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン等の不活性溶媒中で反応させることができる。反応は、－１０℃乃至８０℃の範囲内の温度で行うことができ、５℃乃至４０℃の範囲内の温度で行うことが好ましい。反応に使用する４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオンの量は、特に制限されるものではないが、一般に、測定に使用する試験管一本あたり、０．０１乃至０．５ｍＬ程度を使用すればよく、０．０２５乃至０．１ｍＬ程度を使用するのが好ましい。
上記工程イでは、工程アで得られた反応物を、官能基がＣ１８でかつ固定相の残存シラノールがエンドキャッピング処理されていないＯＤＳカラムを用いる液体クロマトグラフ－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）に供する。
本明細書における「官能基がＣ１８でかつ固定相の残存シラノールがエンドキャッピング処理されていないＯＤＳカラム」とは、オクタデシルシリル（Ｏｃｔａ Ｄｅｃｙｌ Ｓｉｌｙｌ）基（Ｃ１８Ｈ３７Ｓｉ）で表面が修飾されたシリカゲルが固定相として充填されたカラム（ＯＤＳカラム）であって、固定相の残存シラノールに対して所謂エンドキャッピング処理を行っていないカラムを意味する。エンドキャッピング処理は、ＯＤＳカラムの分野で周知の技術事項であるが、簡単に説明すると以下のような処理である。ＯＤＳ充填剤は、通常、シリカゲルのシラノール基にオクタデシルシラン化合物を反応させて作製されるが、シリカゲル表面の全てのシラノール基が反応するわけではない。そして、残存するシラノール基が、塩基性化合物のピークをテーリングさせたり、吸着させたりする。そこで、残存シラノール基にトリメチルモノクロルシラン等のシラン化合物を結合させることが「エンドキャッピング処理」と呼ばれている。例えば、市販のカラムの場合、エンドキャッピング処理が行われているカラムには、通常、その旨がカタログや仕様説明書などに明記されている。したがって、本明細書における「官能基がＣ１８でかつ固定相の残存シラノールがエンドキャッピング処理されていないＯＤＳカラム」とは、上記のようなエンドキャッピング処理がされていないカラムを意味する。官能基がＣ１８でかつ固定相の残存シラノールがエンドキャッピング処理されていないＯＤＳカラムは、発明の実施に際し自己で作製してもよいし、既製品として種々上市されているものを使用してもよい。本発明で使用されるエンドキャッピング処理されていないＯＤＳカラムとしては、官能基がＣ１８でかつ固定相の残存シラノールがエンドキャッピング処理されていないものであれば特段限定されるものではないが、例えば、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｃ１８ ＳＢカラム、ＺＯＲＢＡＸ ＳＢ－Ｃ１８カラム、ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－ＡＬカラム、ＸＳｅｌｅｃｔ ＨＳＳ Ｃ１８ ＳＢカラムなどが挙げられ、好ましくはＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｃ１８ ＳＢカラムである。
そして、本発明の特徴の一つは、後述するＬＣ－ＭＳの液体クロマトグラフを、官能基がＣ１８でかつ固定相の残存シラノールがエンドキャッピング処理されていないＯＤＳカラムで行うことである。
そして、本発明の特徴の一つは、後述するＬＣ－ＭＳの液体クロマトグラフを、官能基がＣ１８でかつ固定相の残存シラノールがエンドキャッピング処理されていないＯＤＳカラムで行うことである。
本明細書における「ＬＣ－ＭＳ」とは、液体クロマトグラフと質量分析とを組み合わせた装置を用いて行う分析方法を表し、液体クロマトグラフ部と質量分析部とはそれぞれ、１つであっても、複数が結合したものであってもよい。ＬＣ－ＭＳの中でも、質量分析部が複数結合したタンデム型の質量分析を用いるＬＣ－ＭＳ／ＭＳが好ましい。ＬＣ－ＭＳにおけるイオン化は、例えば、大気圧化学イオン化法、ＥＳＩ、大気圧光イオン化法などが挙げられるが、中でも、正イオン検出ＥＳＩを用いることが好ましい。
また、質量分析部としては、例えば、磁場型、四重極型、飛行時間型のものなどが挙げられるが、定量性が良く、ダイナミックレンジが広く、直線性が良好なことから、四重極型を使用することが好ましい。
イオンの検出方法としては、目的とするイオンのみを選択的に検出する選択イオンモニタリングや、１つ目の質量分析部で精製したイオン種のうち１つを前駆イオンとして選択し、２つ目の質量分析部で、その前駆イオンの開裂によって生じるプロダクトイオンを検出する、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）などが挙げられる。中でも、選択性が増し、ノイズが減ることによって、シグナル／ノイズ比が向上することから、ＳＲＭが好ましい。
本明細書における「前駆イオン」とは、ＭＳ／ＭＳにおいて、１つ目の質量分析部で選択されるイオンを意味する。前駆イオン（precursor ion）は、本技術分野で、親イオン、分子量関連イオン、プロトン化分子とも呼ばれている。
本発明の方法を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて行う場合、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３の前駆イオンが、５７４．５±０．５又は６２３．５±０．５の質量／電荷比を有するイオンを含むことが好ましく、５７４．５±０．５の質量／電荷比を有するイオンを含むことが特に好ましい。
本発明の方法を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて行う場合、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３の前駆イオンが、５７４．５±０．５又は６２３．５±０．５の質量／電荷比を有するイオンを含むことが好ましく、５７４．５±０．５の質量／電荷比を有するイオンを含むことが特に好ましい。
本明細書における「断片イオン」とは、ＭＳ／ＭＳにおいて、２つ目の質量分析部で、前駆イオンの開裂によって生じるプロダクトイオン（product ion）を意味する。ＭＳ／ＭＳでは、断片イオンが２つ目の質量分析部で分離され検出される。
本発明の方法を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて行う場合、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３の断片イオンが、３１４．０±０．５の質量／電荷比を有するイオンを含むことが好ましい。
本発明の方法を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて行う場合、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３の断片イオンが、３１４．０±０．５の質量／電荷比を有するイオンを含むことが好ましい。
ＬＣ－ＭＳで使用する移動相としては、試料をＬＣ－ＭＳに適した状態に可溶化可能な溶媒であれば特段限定されるものではなく、例えば、ＬＣ－ＭＳで移動相として使用されることが知られている溶媒を用いることができる。例えば、そのような移動相となる溶媒としては、メチルアミン、ギ酸、酢酸、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、アセトニトリル、及びメタノール、並びにこれらいずれか２種以上の混和物が挙げられる。移動相には、必要に応じてグラジエントをかけてもよい。目的とするビタミンＤ代謝物が１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３である場合、移動相としてギ酸又はメチルアミンとアセトニトリルとを必要に応じてグラジエントをかけて使用することが好ましい。
試料中に存在するビタミンＤ代謝物に４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオンを反応させる前に、試料について、以下：
ｉ）有機溶媒による除タンパクを行うこと、
ii）液液抽出による抽出を行うこと、及び
iii）固相抽出カラムによる精製を行うこと
からなる群より選択される少なくとも１つの処理を行ってもよい。試料にこのような処理を行うと、一層効果的又は効率的に、ビタミンＤ代謝物を検出及び／又は定量することができる。
ｉ）有機溶媒による除タンパクを行うこと、
ii）液液抽出による抽出を行うこと、及び
iii）固相抽出カラムによる精製を行うこと
からなる群より選択される少なくとも１つの処理を行ってもよい。試料にこのような処理を行うと、一層効果的又は効率的に、ビタミンＤ代謝物を検出及び／又は定量することができる。
上記ｉ）の有機溶媒による除タンパクを行う際の具体的な手法は特段限定されるものではなく、試料に応じて適宜、具体的な手法や有機溶媒を選択することができる。そのような手法としては、例えば、有機溶媒を添加後、振盪した後に遠心分離し、有機溶媒層を分取するなどの手法が挙げられる。使用される有機溶媒としては、例えば、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、メタノール、エタノール、アセトンなどが挙げられ、中でも、アセトニトリルが好ましい。
上記ii）の液液抽出による抽出を行う際の具体的な手法は特段限定されるものではなく、試料に応じて適宜、具体的な手法や抽出溶媒を選択することができる。そのような手法としては、例えば、有機溶媒を添加後、振盪した後に遠心分離し、有機溶媒層を分取するなどの手法が挙げられる。使用される抽出溶媒としては、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、メチル－ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル、ヘキサン、並びにこれらいずれか２種以上の混和物などが挙げられ、中でも、メチル－ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルとヘキサンとの混和物が好ましい。
上記iii）の固相抽出カラムによる精製を行う際の具体的手法は特段限定されるものではなく、試料に応じて適宜、具体的な手法や抽出溶媒を選択することができる。そのような手法としては、例えば、簡易カラムクロマトグラフィーなどが挙げられる。固相抽出（ＳＰＥ）用のカラムとしては、Ｃ１８固相抽出カラム、逆相－陰イオン交換ミックスモードポリマーの固相抽出カラム、逆相－陽イオン交換ミックスモードポリマーの固相抽出カラム、順相固層抽出カラムなどが挙げられ、市販されているものを使用することもできる。充填剤の分離モードには、逆相、順相、分配、イオン交換、分子ふるい、アフィニティーなどが挙げられるが、中でも、逆相、順相又はイオン交換、或いはそれらのミックスモードを用いるのが好ましい。特に、逆相－イオン交換ミックスモード固相抽出カラムを用いる精製を行うことが好ましい。逆相－陰イオン交換ミックスモードポリマーの固相抽出カラムとしては、ウォーターズ社製のＯａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社のＨｙｐｅｒＳｅｐ（登録商標）Ｒｅｔａｉｎ ＡＸ、シグマアルドリッチ社のＳｕｐｅｌ－Ｓｅｌｅｃｔ ＳＡＸ ＳＰＥ、フェノメネクス社のＳｔｒａｔａ－Ｘ－Ａなどが挙げられる。
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明するものであるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］
ヒト血清由来の試料中のビタミンＤ代謝物（１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３、２５－ヒドロキシビタミンＤ３、３－エピ－２５－ヒドロキシビタミンＤ３、２５－ヒドロキシビタミンＤ２、２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３）の測定
ヒト血清由来の試料中のビタミンＤ代謝物（１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３、２５－ヒドロキシビタミンＤ３、３－エピ－２５－ヒドロキシビタミンＤ３、２５－ヒドロキシビタミンＤ２、２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３）の測定
１． ビタミンＤ代謝物を含む試料の作製
試験管にヒト血清０．２ｍＬを加え、アセトニトリル溶液で２ｍＬにし、５分振とう後遠心分離し、得られた溶媒を留去した。残渣に、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液１ｍＬ、メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル／ヘキサン（２：８）を加え、５分間振とう後、水層を凍結分離し、そして、残存する溶媒を減圧下で留去した。残渣をアセトニトリル０．５ｍＬで溶解した後、精製水１ｍＬを加え、予めメタノール３ｍＬ、精製水３ｍＬでコンディショニングしたＯａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸカートリッジ（ウォーターズ社）に負荷した。０．２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液１ｍＬ、精製水２ｍＬ、４０％アセトニトリル１ｍＬで洗浄後、アセトニトリル／メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（６：４）１ｍＬで１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３、２５－ヒドロキシビタミンＤ３、３－エピ－２５－ヒドロキシビタミンＤ３、２５－ヒドロキシビタミンＤ２及び２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３を溶出し、溶出液を遠心エバポレーターで留去し、ビタミンＤ代謝物を含む試料を作製した。
試験管にヒト血清０．２ｍＬを加え、アセトニトリル溶液で２ｍＬにし、５分振とう後遠心分離し、得られた溶媒を留去した。残渣に、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液１ｍＬ、メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル／ヘキサン（２：８）を加え、５分間振とう後、水層を凍結分離し、そして、残存する溶媒を減圧下で留去した。残渣をアセトニトリル０．５ｍＬで溶解した後、精製水１ｍＬを加え、予めメタノール３ｍＬ、精製水３ｍＬでコンディショニングしたＯａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸカートリッジ（ウォーターズ社）に負荷した。０．２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液１ｍＬ、精製水２ｍＬ、４０％アセトニトリル１ｍＬで洗浄後、アセトニトリル／メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（６：４）１ｍＬで１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３、２５－ヒドロキシビタミンＤ３、３－エピ－２５－ヒドロキシビタミンＤ３、２５－ヒドロキシビタミンＤ２及び２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３を溶出し、溶出液を遠心エバポレーターで留去し、ビタミンＤ代謝物を含む試料を作製した。
２． ４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオンでのビタミンＤ代謝物の誘導体化
前項１．で得られたビタミンＤ代謝物を含む試料に、４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン１ｍｇのアセトニトリル溶液０．０５ｍＬを加え、よく振り混ぜた後、室温で１時間放置し、試料中に含まれるビタミンＤ代謝物を４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン誘導体化した。反応後、反応液に酢酸エチル／ヘキサン／酢酸（１５：３５：１）を０．５ｍＬ加え、よく振り混ぜた後に、予めアセトン３ｍＬ、ヘキサン３ｍＬでコンディショニングしたＩｎｅｒｔＳｅｐ（登録商標）ＳＩカートリッジへ負荷した。カートリッジカラムを、ヘキサン１ｍＬ、アセトン／ヘキサン（４０：６０）２ｍＬで洗浄した後、アセトン／ヘキサン（８０：２０）で４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン誘導体を溶出し、溶出液を減圧下で留去した。残留物を４０％アセトニトリル０．１ｍＬで溶解し、ビタミンＤ代謝物の４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン誘導体を含む溶液とした。
前項１．で得られたビタミンＤ代謝物を含む試料に、４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン１ｍｇのアセトニトリル溶液０．０５ｍＬを加え、よく振り混ぜた後、室温で１時間放置し、試料中に含まれるビタミンＤ代謝物を４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン誘導体化した。反応後、反応液に酢酸エチル／ヘキサン／酢酸（１５：３５：１）を０．５ｍＬ加え、よく振り混ぜた後に、予めアセトン３ｍＬ、ヘキサン３ｍＬでコンディショニングしたＩｎｅｒｔＳｅｐ（登録商標）ＳＩカートリッジへ負荷した。カートリッジカラムを、ヘキサン１ｍＬ、アセトン／ヘキサン（４０：６０）２ｍＬで洗浄した後、アセトン／ヘキサン（８０：２０）で４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン誘導体を溶出し、溶出液を減圧下で留去した。残留物を４０％アセトニトリル０．１ｍＬで溶解し、ビタミンＤ代謝物の４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン誘導体を含む溶液とした。
３． ４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン誘導体を含む溶液のＬＣ－ＭＳ測定
上記２．で得られたビタミンＤ代謝物の４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン誘導体を含む溶液０．０２ｍＬを、下記表１に示す条件でＬＣ－ＭＳ測定に供した。
また、分析カラムをＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｃ１８ ＳＢカラムから、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｃ１８カラム又はＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラムに変更しての同一試料の測定も行った。
結果を図１及び図２に示す。
上記２．で得られたビタミンＤ代謝物の４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン誘導体を含む溶液０．０２ｍＬを、下記表１に示す条件でＬＣ－ＭＳ測定に供した。
また、分析カラムをＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｃ１８ ＳＢカラムから、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｃ１８カラム又はＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラムに変更しての同一試料の測定も行った。
結果を図１及び図２に示す。
官能基がＣ１８でかつ固定相の残存シラノールがエンドキャッピング処理されていないＯＤＳカラムであるＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｃ１８ ＳＢカラムを用いてＬＣ－ＭＳによって試料を測定した場合、３．７６ｍｉｎに１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３のピークが観察された（図１の上段のクロマトグラム）。
一方、官能基がＣ１８でかつ固定相の残存シラノールがエンドキャッピング処理されているＯＤＳカラムである、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｃ１８カラム、又はＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（非特許文献２及び非特許文献５と同じ分析カラム）を用いてＬＣ－ＭＳによって試料を測定した場合、それぞれ３．５７ｍｉｎ付近及び３．４２ｍｉｎ付近に夾雑物由来のピークがあることによって、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３のピークを同定することはできなかった（図１の中段及び下段のクロマトグラム）。
一方、官能基がＣ１８でかつ固定相の残存シラノールがエンドキャッピング処理されているＯＤＳカラムである、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｃ１８カラム、又はＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（非特許文献２及び非特許文献５と同じ分析カラム）を用いてＬＣ－ＭＳによって試料を測定した場合、それぞれ３．５７ｍｉｎ付近及び３．４２ｍｉｎ付近に夾雑物由来のピークがあることによって、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３のピークを同定することはできなかった（図１の中段及び下段のクロマトグラム）。
更に、エンドキャッピング処理されていないカラムであるＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｃ１８ ＳＢカラムを用いてＬＣ－ＭＳで測定した場合には、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３以外に、２５－ヒドロキシビタミンＤ３、３－エピ－２５－ヒドロキシビタミンＤ３、２５－ヒドロキシビタミンＤ２及び２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３も同定することができた（図２）。
［実施例２］
１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３及び２５－ヒドロキシビタミンＤ３の同時定量の再現性
１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３及び２５－ヒドロキシビタミンＤ３の同時定量の再現性
試験管に、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（１、５０、又は１６００ｐｇ／５０μＬ）及び２５－ヒドロキシビタミンＤ３（０．０１、０．５、又は１６ｎｇ／５０μＬ）の両方を含むアセトニトリル溶液５０μＬを添加し、アセトニトリルで２ｍＬにして、ＱＣ（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ）試料を作製した。ＱＣ試料に、内部標準（１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３－ｄ６及び２５－ヒドロキシビタミンＤ３－ｄ６を各２００ｐｇ／５０μＬ）を加え、実施例１と同様にしてＬＣ－ＭＳ測定に供して、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３及び２５－ヒドロキシビタミンＤ３の同時測定の再現性を試験した。
なお、検量線試料は、試験管に、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（１、５、１０、１００、５００、又は２０００ｐｇ／５０μＬ）及び２５－ヒドロキシビタミンＤ３（０．０２、０．１、０．２、２、１０、又は４０ｎｇ／５０μＬ）の両方を含むアセトニトリル溶液５０μＬを添加し、アセトニトリルで２ｍＬにして、作製した。
結果を表２及び表３に示す。
なお、検量線試料は、試験管に、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（１、５、１０、１００、５００、又は２０００ｐｇ／５０μＬ）及び２５－ヒドロキシビタミンＤ３（０．０２、０．１、０．２、２、１０、又は４０ｎｇ／５０μＬ）の両方を含むアセトニトリル溶液５０μＬを添加し、アセトニトリルで２ｍＬにして、作製した。
結果を表２及び表３に示す。
これらの結果から明らかなように、本発明に従う測定方法によれば、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３及び２５－ヒドロキシビタミンＤ３の同時測定時の真度及び精度は良好であり、再現性よくこれらを同時測定可能であることが分かる。
また、これらの結果から、本発明に従う測定方法によれば、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３は１ｐｇ／ｔｕｂｅ、２５－ヒドロキシビタミンＤ３は０．０１ｎｇ／ｔｕｂｅというそれぞれが非常に低い濃度でも、これらの化合物を定量できることが分かる。
また、これらの結果から、本発明に従う測定方法によれば、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３は１ｐｇ／ｔｕｂｅ、２５－ヒドロキシビタミンＤ３は０．０１ｎｇ／ｔｕｂｅというそれぞれが非常に低い濃度でも、これらの化合物を定量できることが分かる。
［実施例３］
移動相として、０．１％ギ酸溶液／アセトニトリルの代わりにメチルアミン／アセトニトリルを使用して、ビタミンＤ代謝物の４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン誘導体のＬＣ／ＭＳ測定を行う。この場合、Anal. Bioanal. Chem., 398, 779-789 (2010)のTable 1の記載を考慮すると、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３の前駆イオンは、６２３±０．５の質量／電荷比を有する。
移動相として、０．１％ギ酸溶液／アセトニトリルの代わりにメチルアミン／アセトニトリルを使用して、ビタミンＤ代謝物の４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン誘導体のＬＣ／ＭＳ測定を行う。この場合、Anal. Bioanal. Chem., 398, 779-789 (2010)のTable 1の記載を考慮すると、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３の前駆イオンは、６２３±０．５の質量／電荷比を有する。
以上の実施例の結果から明らかなように、本発明は、ビタミンＤ代謝物それぞれを検出及び／又は定量することが可能であるだけではなく、これらを網羅的かつ高感度に検出及び／又は定量することが可能である。
Claims (9)
- 試料中に含まれるビタミンＤ代謝物を検出及び／又は定量する方法であって、
ア．試料中に存在するビタミンＤ代謝物に４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオンを反応させる工程と、
イ．工程アで得られた反応物を、官能基がＣ１８でかつ固定相の残存シラノールがエンドキャッピング処理されていないＯＤＳカラムを用いる液体クロマトグラフ－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）に供する工程と
を含む、方法。 - 試料を免疫精製する工程を含まない、請求項１に記載の方法。
- 前記ビタミンＤ代謝物が、２５－ヒドロキシビタミンＤ３、２５－ヒドロキシビタミンＤ２、２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３、２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ２、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ２、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３、３－エピ－２５－ヒドロキシビタミンＤ３、３－エピ－２５－ヒドロキシビタミンＤ２、２５－ヒドロキシビタミンＤ３－３－サルフェートからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１又は２に記載の方法。
- 工程アの前に、試料について、以下：
ｉ）有機溶媒による除タンパクを行うこと、
ii）液液抽出による抽出を行うこと、及び
iii）固相抽出カラムによる精製を行うこと
からなる群より選択される少なくとも１つの処理を行うことを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。 - 工程iii）の精製が、逆相－イオン交換ミックスモード固相抽出カラムを用いる精製である、請求項４に記載の方法。
- ＬＣ－ＭＳが、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳである、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
- １α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３の前駆イオンが、５７４．５±０．５又は６２３．５±０．５の質量／電荷比を有するイオンを含む、請求項６に記載の方法。
- １α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３の前駆イオンが、５７４．５±０．５の質量／電荷比を有する、請求項７に記載の方法。
- １α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３の断片イオンが、３１４．０±０．５の質量／電荷比を有するイオンを含む、請求項６～８のいずれか一項に記載の方法。
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