JP2007515625A - 生物由来サンプルの選択的処理のためのフルオラス標識化 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2003年11月14日出願の米国仮特許出願第60/520,736号明細書および2004年9月22日出願の同第60/612,345号明細書に関する。本特許出願は、35U.S.C.第119条(e)および他の適用可能な法律または規則に従ってこれらの出願の優先権、および利益を請求する。
本発明は、プロテオミクスおよびメタボロミクスサンプルなど複合サンプルの分析のためのフルオラスベースの方法、および関連フルオラス組成物に関する。
37C.F.R.1.71(e)に従い、出願人は、本開示の一部が著作権保護対象である材料を含むことに言及する。著作権所有者は、特許商標庁の特許ファイルまたは記録に現れているように、特許文献または特許開示のいずれかによる複製に異議はないが、そのほかの点では、すべての著作権を何であれ留保する。
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本発明を詳細に説明する前に、本発明が、もちろん変化しうる特定のデバイスまたは生物系に限定されないことが理解されなければならない。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、限定することが意図されていないことも理解すべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されているように、単数形の「a」、「an」、および「the」は、内容が明らかに別段に規定していない限り複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「フルオラス部分(a fluorous moiety)」への言及は、2つもしくはそれ以上のフルオラス部分の組合せを含み、「生物由来サンプル」への言及は、サンプルなどの混合物を含む。
フルオラスベースの分離法の独自の選択性は、複合混合物から標準種の選択的単離のための新規の方法を提供し、生物学的ベースの親和性方法に典型的な非特異的相互作用の多くを削減する。ペルフルオロアルキル基などのフルオラス部分は、主に「似た」または同様の組成物(例えば、それ自体、または他のフルオラス含有組成物)と結合する傾向がある。この特性は、化学合成中、およびフルオラスクロマトグラフィーにおいて、液液および液固抽出のために当業者によって利用されている。フルオラス含有組成物と非フルオラス含有組成物との間の材料分離は、フルオラス標識に付着された化学エンティティの性質(例えば、分子量)と無関係に達成されうる。また、異なる鎖長さのフルオラス標識を有する化学種が互いに分離され、結合種の性質にかかわらず持続する保持特性を証明しうる。
本発明の方法は、プロテオミクスおよびメタボロミクスサンプルを含むが、これらに限定されない1つもしくはそれ以上の生物由来サンプルで実行される。これらのサンプルは、化学合成中間体の有機反応混合物と異なり、複数の成分を有する複合組成物である。かかるものとして、本発明の方法は、複数のサンプルメンバーを有するサンプル、例えば、少なくとも25の成分、または少なくとも50の成分、または少なくとも100の成分、または少なくとも1,000の成分、またはさらに何万もの成分(例えば、少なくとも10,000の成分、100,000の成分、100万の成分、もしくはそれ以上)の複合集団を有する生物由来製剤により使用されうる。
本発明の方法では1つもしくはそれ以上のフルオラス標識試薬が使用される。これらのフルオラス組成物は通常、化学反応性官能基および5個もしくはそれ以上のフッ素原子を有するフルオラス部分を含む。場合により、化学反応性官能基は、それにフルオラス部分が付着されるバイオコンジュゲーション剤の一部である。例えば、生物由来サンプルのペプチド成分の標識のための実施形態において、フルオラス標識試薬はしばしばアミノ酸コンジュゲーション剤のフルオラス誘導体である。本発明は新規のフルオラス標識試薬、特に水性適合性フルオラス標識試薬を提供するが、本発明の方法はこれらの薬剤に限定されず、かかるものとして多くの周知のフッ素含有試薬(ルオ(Luo)ら(2001年)Science 291:1766−1769頁に記載されているフッ素結合チオール試薬など)のいずれかで実行されうる。
通常、本発明のフルオラス標識試薬は、5個もしくはそれ以上のフッ素原子を有する少なくとも1つのフルオラス部分を含有する。本発明において使用するための例となるフルオラス部分が表1に示されている。場合により、本発明の組成物は少なくとも6、7、8、9、10、11、12、13、15、17、20個のもしくはそれ以上のフッ素原子を有する。一部の組成物実施形態において、フッ素原子は隣接炭素原子(例えば、ペルフルオロアルキル鎖)に結合されている。あるいは、フルオラス部分は、非フルオラス化学領域によって分離された炭素結合フッ素原子の2つもしくはそれ以上の「クラスタ」として提供されうる。例えば、本発明のフルオラス部分としては、−CF2−、−CF2CH2−、および−CFH−要素、直鎖または分岐鎖のいずれか、および場合により、非フルオラスCH2−要素がちりばめられているさまざまな組合せが挙げられるが、これらに限定されない。場合により、他のハロゲンも(フッ素原子に加えて)本発明の組成物に組込まれうる。
上記の1つもしくはそれ以上のフルオラス部分に加えて、本発明のフルオラス標識試薬は少なくとも1つの化学反応性官能基(一部の実施形態においては、「バイオコンジュゲーション剤」の一部のみを表す)を含む。化学反応性官能基は、フルオラス標識を生物由来サンプルにおける標的種に結合させるために使用される。
生体分子に存在する最も高い反応性官能価の中にはスルフヒドリル基がある。アルキル化またはジスルフィド交換反応は通常、スルフヒドリル含有分子(例えば、システイン側鎖)のバイオコンジュゲーションに使用される。例えば、マレイミドおよびアクリレートマイケル受容体は、安定したチオエーテル結合を形成することによってスルフヒドリル基を不可逆的にアルキル化するために使用されうる(例えば、図32Bに示されているホモシステインのフルオラス標識を参照)。かかるものとして、これらの化学反応性官能基は本発明の方法および組成物における使用に適している。本発明において使用するための例となるマレイミド型フルオラス標識試薬としては、N−(3−(ペルフルオロオクチル))プロピルマレイミド2a、およびN−(3−(ペルフルオロヘキシル))プロピルマレイミド2bが挙げられるが、これらに限定されない。標識スルフヒドラル部分の他のマイケル受容体型フルオラス標識試薬としては、1H,1H,2H,2H−ペルフルオロオクチルアクリレート4a、および1H,1H,2H,2H−ペルフルオロデシルアクリレート4bが挙げられるが、これらに限定されない。
アミノ基およびグアニジノ基などの窒素含有部分も生物由来(例えば、プロテオミクスまたはメタボロミクス)サンプル内の修飾に対して標的されうる反応性官能価である。
ケトおよび/またはアルデヒド部分は、目的とする一部の生体分子(例えば、ステロイド誘導体、さまざまな医薬中間体、または分解生成物におけるケトン基)に天然に存在するさらに別の反応性官能基であり、または多くの処理によって目的とする選択サンプルメンバーへ導入されうる。これらの化学官能価は、例えば、ヒドラジンの誘導体(フルオラス標識ヒドラジンを形成する)またはアミノオキシ化合物(フルオラス標識オキシムを形成する)を使用することにより、フルオラス標識に対して標的されうる。
メチオニン残基を有するアミノ酸配列もフルオラス標識されうる。メチオニン側鎖は、メチオニン標識反応が通常、酸性(2−3)pHで実行されることを除き、システイン残基について記載されたのと同じようにハロゲンβ−ケトンと反応する。場合により、結果として生じる結合は開裂され、β−メルカプトエタノールなどチオールとの反応とともにメチオニン含有ペプチドを元に戻すことができる。メチオニン残基と使用するための例となるフルオラス標識試薬は、N−ヨードアセチル−3−(ペルフルオロオクチル)プロピルアミン6aである。
トリプトファン残基のインドール部分は、さまざまなスルフェニルハライドと反応され、インドール環における2位でスルフェニル基を導入することができる。本発明のトリプトファン標識フルオラス標識試薬としては、2−ニトロ−4−(N−(3−(ペルフルオロオクチル)プロピル)カルボキサミド)ベンゼンスルホニルクロリド9などフルオラススルフェニルハライドが挙げられるが、これに限定されない。
追加のフルオラス標識試薬をさまざまな選択的化学ライゲーション反応に基づき調製し、こうしてシス−ジエン、アルキン、および隣接ジオールを含むがこれらに限定されないサンプル集団内の多くの他の(天然または導入)化学官能価を標的しうる。例えば、フルオラス試薬を調製することができる2つのきわめて直角の化学ライゲーション法は「シュタウディンンガー(Staudinger)ライゲーション」(ホスパン支持種、検討のために、ケーン(Koehn)ブライバウアー(Breibauer)(2004年)Ang.Chem.Int.Ed.43:3106−3116頁を参照)またはフイスゲン(Huisgen)1,3−双極子環状付加型ライゲーション反応(アルキン支持基質を標的するための「クリック」化学、ロストフセフ(Rostovtsev)ら(2002年) Angew Chem Int Ed 41:2596−2599頁、および本明細書で引用された文献を参照)。これらの方法は、複合混合物からの特定の種の単離から標的種の順序配置までのさまざまなプロテオミクス用途においてどんどん普及している。アルキン含有生物由来サンプル成分の標的において使用するための例となるフルオラスアジドが表2に示されている。
場合により、本発明のフルオラス標識試薬は、追加のアミノ酸結合官能基を誘導体化するための追加の化学反応性官能基をさらに含みうる。これらの実施形態において、フルオラス部分は2つの化学反応性官能基間のリンカーとして作用する。同様のまたは異なる官能基のいずれかが第1および第2の官能価によって標的されうる。したがって、多重化学反応性官能基を有する組成物実施形態のために、バイオコンジュゲーション要素は同じ構造であること、またはアミノ酸残基の同じ型に対する親和性を有する必要はない(すなわち、二又フルオラス標識試薬を使用して異種の化学エンティティを結合させることができる)。
プロテオミクスサンプルおよびフルオラス標識試薬を提供した後、本発明の分析方法における次のステップは、プロテオミクスサンプルの1つもしくはそれ以上の成分(例えば、複数のアミノ酸含有成分のメンバー)を修飾するステップを含む。1つもしくはそれ以上のフルオラス標識をプロテオミクスサンプルの標的サンプルへ組込み、かつ修飾プロテオミクスサンプル成分を形成することによって、フルオラス含有化合物の自己結合特性を本明細書で提供されている方法の分離するステップにおいて使用することができる。
−CH2CH2(CF2)nCH2CH2−
[式中、nは3〜20の整数である。]によって表される。
本発明の方法は、分離された成分で質量分析を実行し、それによってプロテオミクスサンプルを分析するステップをさらに含む。多くの質量分析法が本発明において使用されうるが、タンデムMSが特に有用である。好ましくは、本発明の方法において使用されるフルオラス標識試薬は化学的に安定した組成物であり、フルオラス部分が低エネルギー衝突に対する質量分析条件(例えば、衝突活性化解離(CAD)条件)下に不活性であるようになっている。
本発明の方法は、例えば、プロテオミクスまたはメタボロミクスサンプル成分の翻訳後修飾の変化を検査するために使用されうる。翻訳後修飾(PTM)としては、グリコシル化、リン酸化、硫酸化、脂肪酸付着などが挙げられるが、これらに限定されない。
別の態様において、本発明は、a)複数のアミノ酸含有成分(タンパク質、ペプチドなど)を有するプロテオミクスサンプルを提供するステップと、b)5個もしくはそれ以上のフッ素原子を有するフルオラス部分に結合されたアミノ酸コンジュゲーション剤を有するフルオラス標識試薬を提供するステップと、c)プロテオミクスサンプルをフルオラス標識試薬と反応させ、処理プロテオミクスサンプルを形成し、それによってフルオラス標識をプロテオミクスサンプルの1つもしくはそれ以上のメンバー成分へ組込み、かつフルオラス修飾(すなわち標識)成分を形成するステップと、d)処理プロテオミクスサンプルの第1の部分を質量分析によって分析し、第1の一連の質量スペクトルデータを生成させるステップと、e)処理プロテオミクスサンプルの第2の部分を質量分析によって分析し、第2の一連の質量スペクトルデータを生成し、ここで第2の部分のフルオラス修飾成分は分析する前にフルオラス親和性基質を使用するフルオラスベースの分離法によって除去されているステップと、f)第1および第2の一連の質量スペクトルデータを比較し、第1の部分には存在し、第2の部分には存在しない1つもしくはそれ以上の質量スペクトルピークを測定し、それによってプロテオミクスサンプルを分析するステップとを含むプロテオミクスサンプルを分析するための方法を提供する。
例えば、ベースタンパク質またはPTMの量的分別ディスプレイを評価するための化学標識に基づくペアのサンプルの分析のためのさまざまな方法が当該技術において記載されている。これらの方法において使用される化学標識は通常、別々の独立した機能(分別定量化の場合には3つ)を実行する2つの異なる成分から調製される。第1の部分は目的とするペプチドにおける官能基の化学標識を方向づけるが、第2の部分は標識ペプチドの選択的単離を可能にする。かかる化学標識の例としては、同位体コード化親和性タギング(ICAT)方法において使用されるものが挙げられる(ギジ(Gygi)ら「Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope−coded affinity tags」(1999年)Nature Biotechnology 10:994−999頁)、および、セリンおよびトレオニンリン酸化分析のために使用されるチオール型マイケル付加試薬(例えば、ゴーシュ(Goshe)ら、上記を参照)が挙げられる。
別の態様において、本発明は、標識種のフルオラス含量に基づく生物由来サンプル(例えば、プロテオミクスまたはメタボロミクス)サンプルの成分の分離のための方法を提供する。複数のアミノ酸含有成分(タンパク質、ペプチドなど)を有するプロテオミクスまたはメタボロミクスサンプルなど生物由来サンプルは、本明細書に記載された(例えば、5個もしくはそれ以上のフッ素原子を有するフルオラス部分に結合された化学反応性官能基を有する)フルオラス標識試薬で処理される。サンプルのメンバー成分はフルオラス標識試薬で標識され、一部のメンバー成分は単一フルオラス標識に結合されるが、他のメンバー成分は1つ以上のフルオラス標識に結合されるようになっている。次いで、サンプルメンバーはフルオラス含量に従って画分されうるが、処理サンプルはフルオラス分離組成物(例えば、フルオラス親和性基質)と結合しており、結合単一標識成分の結合多重標識成分から別個に選択的溶出を可能にする。
さらに別の態様において、本発明は、フルオラスベースの分離法を使用するプロテオミクスサンプルの多重分離の追加の方法を提供する。多重分離は、2つもしくはそれ以上のフルオラス標識試薬を使用する、一連の生物由来サンプル(すなわち、各メンバーサンプルが複数の成分を有する2つもしくはそれ以上のプロテオミクスまたはメタボロミクスサンプル)で実行される。通常、フルオラス標識試薬は、5個もしくはそれ以上のフッ素原子を有するフルオラス部分に結合されたアミノ酸コンジュゲーション試薬である。一連のサンプルの第1のメンバー(すなわち、第1の複数の成分)は第1のフルオラス標識試薬で処理され、それによって第1のサンプルにおける1つもしくはそれ以上の成分(例えば、タンパク質、ペプチドなど)を標識する。同じように、一連の第2のメンバーが第2の(異なる)フルオラス標識試薬で処理され、それによって第2のサンプルの1つもしくはそれ以上の成分を標識する。場合により、追加のサンプルセットが、追加のフルオラス標識試薬を使用して標識されうる。場合によりこれらの方法で使用される第1、第2、および追加のフルオラス標識試薬は異なる化学構造を有し、好ましくは、フルオラス標識試薬は、それの中に組込まれたフッ素原子の数において異なる。
本発明は、プロテオミクスまたはメタボロミクスサンプルの分別定量化のための一連のフルオラス標識試薬も提供する。一連のフルオラス標識試薬は通常、本明細書に記載されているように2つもしくはそれ以上のフルオラス標識試薬を含み、これらは1つもしくはそれ以上の安定した同位体で区別をつけて標識される。さまざまな安定した同位体が使用されうるが、一連のフルオラス標識試薬においてより一般的に使用される同位体は、ジュウテリウム(2H)、炭素−13(13C)、窒素−15(15N)、および酸素−18(18O)である。ペアのフルオラス標識試薬間の同位体の差異は、例えば、フルオラス部分(例えば、13C−ペルフルオロアルキル基)、化学反応性官能基の保持部分、またはフルオラスおよびコンジュゲーション部分を結合させる随意的なリンカー領域において配置されうる。分別定量化分析において使用されうる例となるペアのフルオラス標識試薬は、化合物6aと6b、および6cと6dである。
追加の態様において、本発明は、本明細書に示された組成物および/または方法を具体化するキットを提供する。本発明のキットは、場合により、以下の1つもしくはそれ以上を含んでなる。すなわち(1)本明細書に記載された1つもしくはそれ以上のフルオラス標識試薬、(2)フルオラス固相抽出を実行するためのフルオラス基質または他の材料、(3)本明細書に記載された方法を実施するための、および/または本明細書に記載されたフルオラス標識試薬を使用するための説明書、(4)1つもしくはそれ以上の生物由来サンプル成分(例えば、分析中の対象として使用)、(5)成分または組成物を保持するための容器、および(6)包装材料。
図1に示されているものなど、フルオラス固相抽出処置において使用されるフルオラスカラムは、以下のように調製されうる。溶融シリカキャピラリー(360/200μmO.D./L.D.、長さ約15cm)を最初に「カシール(Kasil)」フリットし、次いで高圧下(500〜1000psi、社内ビルド圧力容器を使用)、フルオロフラッシュ(Fluoroflash)(商標)フルオラス逆相シリカゲル(FRPSG、ペルフルオロオクタン結合相、5μm粒子、フルオラス・テクノロジーズ社(Fluorous Technologies,Inc.)から入手可能、Pittsburgh、ペンシルベニア州(PA))のスラリーでパックし、約5〜8cmの総床長さを得た。FRPSGのへら先端を500μL MeOHに磁気攪拌で添加することによって調製した。「カシール(Kasil)」材料を450μL Kasil No.1ケイ酸カリウム(ザ・PQ社(The PQ Corp.)、Valley Forge、ペンシルベニア(PA))を88μLホルムアミドと混合した後、ボルテックス混合によって調製した。混合物を1分間(〜5000rpm)遠心分離し、上部200μLを除去し、保存した。次いで、溶融シリカキャピラリーを迅速に保存溶液へ浸漬し、1〜2cmの金属をキャピラリーの一端へ入れた。「浸漬」キャピラリーを100℃で1時間乾燥させ、冷却させ、セラミックカッターで約1〜2mmのKasilフリット長さに切断し、キャピラリーの全長を約10cmとした。最後に、フリットしたキャピラリーを上記のFRPSGスラリーで充填し、20〜50カラム体積(CV)の99%メタノール/10mMギ酸アンモニウムで活性化した。
O−メチルイソウレアまたは2−メトキシ−4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾールを使用するリシンε−アミノ基の選択的反応が図3Aに示されている。通常、リシン残基を本明細書に記載されたμC18Ziptips(商標)で捕捉後に修飾した。先端をそれぞれの溶液で数回吸引し、先端床を完全に反応溶液に浸漬して50℃オーブン中でインキュベートした。
チオール型フルオラス標識試薬を使用するマイケル付加によるリン酸化および/またはグリコシル化セリンまたはトレオニン残基のβ−脱離およびその後の標識を示す例となる反応スキームが図2Aおよび2Bに示されている。
BSAからのシステイニルペプチドのアクリレートフルオラス標識試薬へのマイケル付加を示す例となる反応スキームが図4Aに示されている。この反応スキームを使用して生成された例となるデータは、図20に示されている比較MSプロフィールを含み、かつ標識ペプチドのタンデムMSデータは図21および図22に示されている。
代替として、フルオロヨードアセトアミドアルキル化剤(N−[(3−ペルフルオロオクチル)−プロピル]−ヨードアセトアミド(化合物6a)をチオール標的フルオラス標識試薬として使用した。BSAを固定化TCEPで低減し、Tpで8時間、37℃下に消化し、以前に既述したように脱塩した。水20μL中トリプシン消化物100pmolを1M炭酸アンモニウム5μL、THF 20μL、および500mM N−[(3−ペルフルオロオクチル)−プロピル]ヨードアセトアミド5μL(500mM THF中保存溶液)と混合し、30分間、37℃下に暗所で反応させた。冷却させた後、50%メタノール/50 mM重炭酸アンモニウム450μLを添加し、混合した。過剰なフルオラスヨードアセトアミドを数mgの3−メルカプトプロピル官能化シリカゲル(アルドリッチ(Aldrich)、Milwaukee、ウィスコンシン州(WI))の添加した後、数時間、暗所において室温下に攪拌して除去した。次いで、スラリーを3Kセルロース分子量カットオフフィルタによりろ過した後、ろ過シリカゲルのメタノール洗浄(100μL)を行った。次いで、混合されたろ液および洗浄液を真空で乾燥させ、60%メタノール/10mMギ酸アンモニウム中で再構成した。
NHS−エステル型フルオラス標識試薬の合成(およびこの試薬を使用する一級アミンのアミド化)を示す例となる反応スキームが図3Bに示されている。ペプチドの単一標識(例えば、「直鎖」ペプチドのN末端標識)に加えて、本発明の一部の実施形態においては、この標識反応スキームはプロテオミクスサンプルメンバーの二重標識のために使用される(例えば、ユビキチン化または分子間ジスルフィド反応によって形成されるものなど「分岐鎖」ペプチドの場合)。直鎖および分岐鎖標識ペプチドの概略図が図3Cに示されているが、比較MSプロフィール(パネルA:未処理、B:フルオラス標識、C:非保持、およびD:フルオラス親和性基質によって保持された種)が図25に示されている。これらの実験においては、ポリユビキチン鎖(アフィニチ・リサーチ・プロダクツ(Affiniti Research Products)、Exeter、英国(UK))を100mM重炭酸アンモニウム、4M尿素、pH8.0の溶液中トリプシンで消化した。
固形イースト(S.cerevisiae)をベーカリー用品店から購入し、その後に液体N2下に粉砕し、−80℃下に保存した。細胞タンパク質をトリゾール(Trizole)(商標)試薬(インビトロジェン(Invitrogen)、Carlsbad、カリフォルニア州(CA))を使用して単離し、その後に酸化溶液(例えば、最初に室温(RT)下に2時間放置し、次いで4℃下に保存された88%ギ酸4.5mLおよび30%H2O2溶液0.5mL)50μL中4℃下に一夜のインキュベーションによって酸化した。最後に、酸化タンパク質画分を100mM重炭酸アンモニウムへ透析し、上述したようにTpで消化した。
テストステロン、アンドロステロン、およびプロゲステロンなど中性ステロイド化合物は、骨格筋成長の刺激や生殖および関連組織の維持など多くの代謝的役割を果たす。本発明は、遊離(すなわち、非コンジュゲート)ケトン部分を有するオキソステロイドのフルオラス標識の方法および組成物を提供し、それによって生物由来サンプルにおける複数の代謝産物からの化合物の部分的な精製の機序を提供する。分析されるメタボロミクスサンプルの複雑性の削減に加えて、ステロイドケトン部分の、例えば、アミノオキシ型フルオラス標識試薬との反応により、しばしば開始代謝産物よりも大きなプラスのエレクトロスプレーイオン化効率を有する標識分子が得られ、潜在的に質量分析による分析中の標識種の検出特性を増強(かつこれらの感度を改善)する。
同様の反応スキームが、隣接したヒドロキシル部分を標的する多くの周知の化学のいずれかを使用する、隣接ジオールを有する代謝産物種のフルオラス標識のためにデザインされうる。例えば、ヒガシ(Higashi)ら(2002年、Analytical Sci.18:1301−1307頁)によって記載されているものなどのボロン酸含有試薬がフルオラス部分で置換またはさらに修飾され、本発明において使用するためのフルオラス標識試薬を得ることができる。1つの例となる実施形態において、フルオラスボロン酸含有試薬18が、4−ヒドロキシエストラジオールを誘導体化するために使用される(図31B参照)。
同じように、ビタミンDなどシス−ジエン部分を含有する分子を、フルオラス標識に置換または別の方法で結合されているクックソン(Cookson)型試薬(例えば、マレイミド)を使用して標識することができる。例となる実施形態として、フルオラスクックソン型試薬13が、シス−ジエン含有分子ビタミンD2を誘導体化するために使用される(図31Cを参照)。アミノオキシ型フルオラス標識試薬による中性ステロイド種の標識についても確認されるように、フルオラス標識の添加はエレクトロスプレーイオン化効率を変化させる追加の利点を有する(例えば、標識試薬が荷電能を有さないと仮定して、非標識代謝産物よりも大きなプラスのESイオン化効率を提供する)。例えば、ヤン(Yeung)ら「Cookson−type derivatization to enhance MS efficiency」(1995年)Biochem. Pharmacol. 49:1099頁、およびウェルナー(Werner)ら「Use of fluorous dienophiles as scavengers」(2003年)Org.Letters 5:3293頁を参照。
「クリック化学」ライゲーションと呼ばれることもある、ユイスゲン(Huisgen)1,3−双極子環化付加型ライゲーション反応は、末端アルキン部分を有する(または組込むように修飾されている)生物由来サンプル成分を標的するためにも使用されうる。これらの反応において、アジド型フルオラス標識試薬は、通常、トリアゾールを形成するエクセロゲン(exerogenic)過程であるサンプル中のアルキン含有標的種と反応する(例えば、ロストフセフ(Rostovtsev)ら(2002年)Angew Chem Int Ed 41:2596−2599頁、および本明細書に引用された文献を参照)。追加の利点が、水性および有機反応条件下でのアジド試薬の安定性であり、こうして非水性環境で生物由来サンプルを生成または調製する必要を削減する。
二級、三級、および四級アミンとは対照的に一級アミンを含有する生物由来サンプルは、チオール型フルオラス標識試薬およびo−フタルアルデヒドを使用してフルオラス標識に選択的に標的されうる(図32A)。チオールの存在下のo−フタルアルデヒドとの一級アミンの反応は、例えば、蛍光誘導体を得るポリペプチド溶解物の誘導体化のために使用される公知の反応である(例えば、ジョーンズ(Jones)とギリガン(Gilligan)(1983年)J.Chromatogr.266:471−482頁を参照)。
遊離チオール部分を含有する生物由来サンプルメンバーは、例えば、本明細書に記載された多くのマレイミド型フルオラス標識試薬のいずれかを使用してフルオラス標識されうる。図32Bは、代謝産物ホモシステインがフルオラス標識試薬2Bと反応される例となる反応を示す。
例となるペアの同位体試薬としては、トリデカフルオロオクチルアクリレート(化合物4a)およびその3,4,5,6,7,8−13C6トリデカフルオロオクチル類似体が挙げられるが、これらに限定されない。比較されるタンパク質サンプル(1mg)をTCEPで低減し、トリプシンで消化する。消化物をジメチルホルムアミド(DMF)200μL、および100mM炭酸ナトリウム2.5μL、pH8.0中で脱塩、乾燥、および再構成する。トリデカフルオロオクチルアクリレート4aまたは13C6類似体を各サンプルに個別に添加し、反応を一夜、室温で進行させる。サンプルを混合し、未反応アクリレートを、N−2−メルカプトエチルアミノメチルポリスチレンビーズ(ノバ・バイオケム(Nova Biochem)4mgで室温下に2時間のインキュベーションによって混合物から除去する。フルオラス固相抽出(FSPE)を実施例1に記載されているように実行し、フルオラス標識(およびシステイン含有)ペプチドを単離するが、その各々はシステイン部分当たり6ドルトンで分離された同位体ペアとして存在する。2つのサンプル間の相対濃度はペアのシグナル強度で示される。
本発明は、同じタンパク質内、またはタンパク質複合体の一部として存在する異なるタンパク質間の2つもしくはそれ以上の化学部分の相対的な3次元配向(例えば、3Dマッピング)を測定するための方法も提供する。この態様において、異種または同種多官能性フルオラス標識試薬は、タンパク質における2つの特定の化学部分(アミノ酸官能価)と選択的に反応するために必要な適切な化学反応性官能基を含む。フルオラス標識試薬による架橋に標的される2つの特定の化学官能価は、フルオラス標識試薬における化学反応性官能基によって架けられたものと同等もしくはそれ以下の距離内に存在しなければならない。次いで、異種または同種多官能性フルオラス標識試薬のフルオラス部分は、これら架橋種を選択的に単離するために使用される。
本明細書で開示された化合物および誘導体を使用するさらに別の実施形態において、本発明は多重サンプルの同時分析のための方法を提供する。この態様において、同じ化学反応性官能基を有するが、異なるフルオラス部分を有する一連の試薬が個別に一連のサンプルを標識するために使用され、各サンプルが異なるフルオラスタグと反応されるようになっている。結果として生じるサンプルはプールされ、かつフルオラス標識種はFSPEを使用して非表紙機種から分離される。次いで、保持種はバッチ溶出され、同時に(すなわち、MALDI TOF MSによって)分析され、分析物間の質量の差を有し、これはタグの性質とともにそれから生じるサンプルの同一性を示すと同時に、標識種の相対強度がそれぞれの濃度と比例することを示す。あるいは、プールされ、保持されたサンプルはフルオラスクロマトグラフィーにかけられ、標識サンプルがそのフッ素含量と比例した順序でカラムから溶出するようになっている。また、異なるタグがもっぱら異なる反応条件で使用され、所定のペプチドが、アミノ酸官能価および/またはPTMのどの組合せが存在したかを示す異なる長さのいくつかのタグを有しうるようになっている。
図5は、チョウ(Zhou)ら(2000年)Nature Biotechnol.19:375−378頁によって記載された方法と同様に、リン酸化ペプチドのフルオラス標識の例となる多重ステップ反応スキームを示す。この反応は、酸性条件下のカルボン酸メチル化、ホスホラミデートを示すシスタミンのEDC介在結合、フルオラスマイケル受容体によるアルキル化、およびFSPE後のメチル化ホスホペプチドの酸放出を含み、ホスホセリン、ホスホトレオニン、およびホスホチロシン含有種の単離および/または富化を提供する。
以下の実施例は、無傷タンパク質がフルオラス標識され、1Dゲルおよびゲル中消化など代表的なタンパク質操作において容易に処理されうることを示す。
本発明のフルオラス標識試薬は、フルオラス標識は開裂または別の方法で結合生物由来サンプル成分から放出され、例えば、富化または単離過程中に生物由来成分の回収を促進しうる実施形態も含む。
ペプチド捕捉および脱塩
μC18ジップチップス(Ziptips)(商標)(ミリポア(Millipore)、Bedford、マサチューセッツ州(MA))を使用し、標識前のペプチドを捕捉し、濃縮し、脱塩した。80%アセトニトリル/0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)(v/v)5×10μLアリコートを吸引することによって活性化を実行した。チップを同様に0.1%TFAを使用することによって平衡化した。ペプチドサンプルを0.1〜0.5%TFA(v/v)中で調製し、反復吸引によってロードした。フルオラス誘導体化ペプチドのローディングは、好ましくは、ローディング溶液中で最小20〜25%メタノールの添加により実行され、沈殿を低減した。次いで、チップを0.1%TFA(v/v)のアリコートで洗浄し、80%アセトニトリル/0.1%TFA(v/v)の4〜5μLアリコート中で反復吸引によってペプチド溶出した。
フルオロフラッシュ(Fluoroflash)、トリデカフルオロシリカ(TDF)&ペンタフルオロフェニルシリカ(PFP)(シリサイクル(Silicycle)、Montreal、ケベック州(QC)、カナダ)180Å孔径、3μm粒子をフリット溶融シリカ(360/200または360/100μm O.D./I.D.)へ圧力パックし、約12cmの長さにした。勾配溶出をギ酸アンモニウム修飾移動相を使用して実行し、ESIによってQqTOF質量分析計に接続した。
MALDI−TOF MSを遅延抽出/リフレクターモードでBruker Biflex IIIを使用して実行した。最初にサンプルを2,5−ジヒドロキシ安息香酸基質の保存溶液(DHB、50%アセトニトリル/0.2%トリフルオロ酢酸v/v中10mg/mL)と混合することによって乾燥液滴法を使用してMALDI標的上にペプチドを沈殿させた。レーザー減衰を40〜45で設定し、平均数百ショットとした。加速電圧を19kV(IS/1)&15.2kV(IS/2)に設定し、レフレクトロン電圧を18.7kVで設定した。
Claims (101)
- 分析のために生物由来サンプルにおいて1つもしくはそれ以上の化合物を調製するための方法であって、前記方法が、
5個もしくはそれ以上のフッ素原子を含んでなるフルオラス部分に結合された化学反応性官能基を含んでなるフルオラス標識試薬を提供するステップと、
前記フルオラス標識試薬を生物由来サンプル中の1つもしくはそれ以上のメンバーの化合物に前記化学反応性官能基を介して結合させ、フルオラス標識サンプルメンバーを産生し、それによって分析のための前記生物由来サンプルを調製するステップ
とを含んでなる方法。 - 前記生物由来サンプルがプロテオミクスサンプルを含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記生物由来サンプルがメタボロミクスサンプルを含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記生物由来サンプルが細胞溶解物を含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記生物由来サンプルが血液、尿、唾液、または組織サンプルを含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記生物由来サンプルが1つもしくはそれ以上のプレ画分されたサンプルを含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記1つもしくはそれ以上のプレ画分されたサンプルが、1つもしくはそれ以上のゲル電気泳動バンドを含んでなる、請求項6に記載の方法。
- 前記1つもしくはそれ以上のプレ画分されたサンプルが、1つもしくはそれ以上のカラムクロマトグラフィー画分を含んでなる、請求項6に記載の方法。
- 前記フルオラス標識サンプルメンバーを、前記フルオラス標識試薬に対する親和性を有する分離組成物を使用して非修飾メンバーから分離するステップをさらに含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記分離組成物がフルオラス液相を含んでなる、請求項9に記載の方法。
- 前記分離組成物がフルオラス部分で官能化された基質の2次元表面を含んでなる、請求項9に記載の方法。
- 前記分離組成物がフルオラス親和性基質を含んでなり、かつ前記フルオラス標識サンプルメンバーを前記非修飾メンバーから分離するステップが、固相抽出またはフルオラスカラムクロマトグラフィーを実行するステップと、カラム流出物を収集するステップとを含んでなる、請求項9に記載の方法。
- 前記フルオラス親和性基質がフルオラスシリカゲルを含んでなる、請求項12に記載の方法。
- 前記フルオラス親和性基質がフルオロ有機ポリマーを含んでなる、請求項12に記載の方法。
- 前記カラム流出物を収集するステップが、前記生物由来サンプルの非結合画分を収集するステップを含んでなる、請求項12に記載の方法。
- 前記カラム流出物を収集するステップが、前記生物由来サンプルの結合画分を溶出するステップを含んでなる、請求項12に記載の方法。
- 前記結合画分を溶出するステップが、単一標識サンプルメンバーを多重標識サンプルメンバーから分離するステップを含んでなる、請求項16に記載の方法。
- 前記生物由来サンプルの1つもしくはそれ以上のメンバーを分析するステップをさらに含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記生物由来サンプルを分析するステップが、前記生物由来サンプルの分離された画分で質量分析を実行するステップを含んでなる、請求項18に記載の方法。
- 前記分離されたサンプル画分が、フルオラス標識サンプルメンバーを含んでなる、請求項19に記載の方法。
- 前記分離されたサンプル画分が、非フルオラス標識サンプルメンバーを含んでなる、請求項19に記載の方法。
- 前記生物由来サンプルを分析するステップが、前記分離された画分のMSデータを前記生物由来サンプルの非反応アリコートのMSデータと比較するステップを含んでなる、請求項19に記載の方法。
- 前記質量分析がタンデムMSを含んでなる、請求項19に記載の方法。
- 前記質量分析がレーザー脱離イオン化TOF MSを含んでなる、請求項19に記載の方法。
- 前記フルオラス標識試薬が、質量分析のための標準イオン化または画分条件下で画分されない、請求項19に記載の方法。
- 前記化学反応性官能基が、マレイミド、ハロゲンβ−ケトン、ジスルフィド交換試薬、フェニルグリオキサル、無水物、アクリレート、アジド、チオール、ジヒドロキシ−ボラン、ボロン酸、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホN−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジアルキルピロカーボネート、マイケルドナー、アミノオキシ化合物、またはヒドラジン含有化合物を含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記フルオラス標識試薬がアミノ酸コンジュゲーション剤を含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記フルオラス部分が、式CF3(CF2)n[式中nは2〜10の整数である]を有するフルオロアルキル部分を含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記フルオラス部分が、式CF3(CF2)n[式中nは3〜7の整数である]を有するフルオロアルキル部分を含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記フルオラス部分が分岐鎖フルオロアルキル部分を含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記フルオラス標識試薬が、フルオロアルキルリンカーによって結合された第1および第2の化学反応性官能基を含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記フルオラス標識試薬が、2つもしくはそれ以上の試薬を含んでなり、第1のフルオラス標識試薬および第2のフルオラス標識試薬が分離組成物のその親和性において異なる、請求項1に記載の方法。
- 前記フルオラス標識試薬が、
CF3(CF2)7CH2CH2SH、
CF3(CF2)5CH2CH2SH、
CF2H(CF2)5CH2CH2SH、
(CF3CF2)2CF(CF2)2CH2CH2SH、
(CF3CF2)2CH(CF2)2CH2CH2SH、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
CF3(CF2)5CH2CH2CH2N3、
CF3(CF2)7CH2CH2CH2N3、
、
、
、
、
CF3(CF2)5CH2CH2CH2NH2、
、
CF3(CF2)3CH2CH2(C=O)CH2ONH2、
CF3(CF2)5CH2CH2(C=O)CH2ONH2、
CF3(CF2)7CH2CH2(C=O)CH2ONH2、
H2NCH2CH2CH2(CF2)6CH2CH2SH、
、
、
、
、および
[式中Aはアミノ酸である。]からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。 - 前記生物由来サンプルに過ヨウ素酸酸化を実行し、かつ前記フルオラス標識試薬を結合させる前に1つもしくはそれ以上のアルデヒド基を有するサンプル成分を生成させるステップをさらに含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記生物由来サンプルにおける1つもしくはそれ以上のメンバーの化合物がリン酸化アミノ酸含有成分を含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記リン酸化アミノ酸含有成分が、1つもしくはそれ以上のリン酸化セリン残基、1つもしくはそれ以上のリン酸化トレオニン残基、1つもしくはそれ以上のリン酸化チロシン残基、またはそれの組合せを含んでなる、請求項35に記載の方法。
- 前記リン酸化アミノ酸含有成分が少なくとも1つのリン酸化セリン残基またはリン酸化トレオニン残基を含んでなり、かつ
前記フルオラス標識試薬を前記生物由来サンプルにおける1つもしくはそれ以上のリン酸化アミノ酸含有成分に結合させるステップが、
a)塩基を前記生物由来サンプルに添加し、塩基性反応混合物を形成するステップと、
b)前記塩基性反応混合物における1つもしくはそれ以上のリン酸化アミノ酸含有成分でβ−脱離反応を実行するステップと、
c)前記フルオラス標識試薬を前記反応混合物に添加し、ここで前記フルオラス標識試薬の化学反応性官能基がチオールを含んでなるステップと、
d)前記β−脱離反応の生成物でマイケル付加反応を実行し、それによってフルオラス部分をリン酸化の以前の部分で結合させるステップと
を含んでなる請求項35に記載の方法。 - 前記フルオラス標識試薬が、CF3(CF2)7CH2CH2SH、またはCF3(CF2)5CH2CH2SHを含んでなる、請求項37に記載の方法。
- 前記フルオラス標識試薬を前記生物由来サンプルにおける1つもしくはそれ以上のリン酸化アミノ酸含有成分に結合させるステップが、
a)酸性条件下でサンプルメンバーにカルボン酸メチル化を実行するステップと、
b)リン酸化サンプルメンバーのリン酸基にシスタミンを結合させ、それによってホスホラミデート標識メンバーを産生するステップと、
c)前記シスタミンを低減し、前記ホスホラミデート標識メンバーに遊離チオールを生成させるステップと、
d)前記フルオラス標識試薬により前記ホスホラミデート標識メンバーに遊離チオールをアルキル化し、それによってフルオラス標識メンバーを生成させるステップと
を含んでなる、請求項35に記載の方法。 - 前記フルオラス標識メンバーを酸で処理するステップと、
前記フルオラス標識を開裂し、こうしてメチル化ホスホペプチドを再生するステップと
をさらに含んでなる、請求項39に記載の方法。 - フルオラス標識サンプルメンバーを前記メチル化ホスホペプチドから放出させる前に前記フルオラス標識サンプルメンバーを非標識サンプルメンバーから分離するステップを含んでなる、請求項40に記載の方法。
- 前記生物由来サンプルにおける1つもしくはそれ以上のメンバーの化合物が、グリコシル化サンプルメンバーを含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記生物由来サンプルにおける1つもしくはそれ以上のグリコシル化サンプルメンバーに前記フルオラス標識試薬を結合させるステップが、
a)前記グリコシル化サンプルメンバーに1つもしくはそれ以上の糖を酸化させ、反応混合物において1つもしくはそれ以上のアルデヒド部分を生成させるステップと、
b)前記フルオラス標識試薬を前記反応混合物に添加し、ここで前記化学反応性官能基がヒドラジンまたはアミノオキシ部分を含んでなるステップと、
c)前記アルデヒド部分を前記ヒドラジンまたは前記アミノオキシ部分と結合させ、それによって前記グリコシル化サンプルメンバーをフルオラス標識するステップと
を含んでなる、請求項42に記載の方法。 - 前記1つもしくはそれ以上の糖を酸化するステップが、過ヨウ素酸化反応を実行するステップを含んでなる、請求項43に記載の方法。
- 生物由来サンプルの1つもしくはそれ以上のメンバーを分離するための方法であって、前記方法が、
5個もしくはそれ以上のフッ素原子を含んでなるフルオラス部分に結合された化学反応性官能基を含んでなる少なくとも1つのフルオラス標識試薬と前記生物由来サンプルを反応させ、それによってフルオラス標識を1つもしくはそれ以上のサンプルメンバーに付着させ、標識サンプルメンバーを形成するステップと、
前記フルオラス標識に対する親和性を有する組成物と使用することにより、前記フルオラス標識サンプルメンバーを非標識サンプルメンバーから分離するステップと
を含んでなる方法。 - 前記フルオラス標識に対する親和性を有する組成物がフルオラス親和性基質を含んでなり、かつ前記フルオラス標識サンプルメンバーを前記非修飾メンバーから分離するステップが、固相抽出またはフルオラスカラムクロマトグラフィーを実行するステップと、カラム流出物を収集するステップとを含んでなる、請求項45に記載の方法。
- 前記フルオラス親和性基質がフルオラスシリカゲルを含んでなる、請求項46に記載の方法。
- 前記フルオラス標識に対する親和性を有する組成物が基質の表面に結合されており、かつ前記フルオラス標識サンプルメンバーを前記非標識サンプルメンバーから分離するステップが、前記生物由来サンプルを前記表面に塗布するとともに、前記非標識サンプルメンバーを洗浄によって前記表面から除去するステップを含んでなる、請求項45に記載の方法。
- 前記基質がMALDIプレートまたはDIOSプレートを含んでなる、請求項48に記載の方法。
- 前記生物由来サンプルが複数のアミノ酸含有成分を含んでなる、請求項45に記載の方法。
- 前記複数のアミノ酸含有成分がタンパク質分解ペプチドを含んでなる、請求項50に記載の方法。
- フルオラスベースの分離法を使用する生物由来サンプルの成分の分離のための方法であって、前記方法が、
複数のアミノ酸含有成分を含んでなる生物由来サンプルを提供するステップと、
前記生物由来サンプルをフルオラス標識試薬で処理し、1つもしくはそれ以上のフルオラス標識で前記サンプルの1つもしくはそれ以上のメンバー成分を標識し、ここで前記フルオラス標識試薬が、5個もしくはそれ以上のフッ素原子を含んでなるフルオラス部分に結合された化学反応性官能基を含んでなるステップと、
前記処理されたサンプルをフルオラス親和性基質と組合わせるステップと、
結合単一標識成分を別々に結合多重標識成分から選択的に溶出し、それによって生物由来サンプルの成分を分離するステップと
を含んでなる方法。 - 1つもしくはそれ以上のメンバー成分を標識するステップが、前記メンバー成分の末端残基を標識するステップを含んでなる、請求項52に記載の方法。
- 前記生物由来サンプルが1つもしくはそれ以上のユビキチン化成分を含んでなり、かつ前記サンプルを処理するステップが、
前記生物由来サンプルをトリプシンで開裂し、それによって第1の部分と第2の部分を含んでなる複数のタンパク質分解断片を生成し、ここでタンパク質分解断片の第1の部分のメンバーが第1のペプチドN末端を有し、かつタンパク質分解断片の第2の部分のメンバーが第1のペプチドN末端と第2のユビキチン由来N末端を有するステップを有するステップと、
前記タンパク質分解断片のリシン残基のイプシロンアミノ基を遮断するステップと、
前記タンパク質分解断片の第1および第2のN末端を前記フルオラス標識試薬で標識し、それによって単一標識タンパク質分解断片の第1の部分と多重標識タンパク質分解断片の第2の部分を産生するステップと
をさらに含んでなる請求項52に記載の方法。 - 前記遮断するステップが前記リシン残基のグアニジン化を含んでなる、請求項54に記載の方法。
- 前記生物由来サンプルが1つもしくはそれ以上のジスルフィド架橋含有成分を含んでなり、かつ前記サンプルを処理するステップが、
前記ジスルフィド架橋含有成分をトリプシンで開裂し、それによって2つのN末端を有する1つもしくはそれ以上のジスルフィド連結タンパク質分解断片を生成させるステップと、
ジスルフィド連結タンパク質分解断片の前記2つのN末端を標識するステップと
を含んでなる、請求項52に記載の方法。 - 前記フルオラス親和性基質がフルオラスシリカゲルを含んでなる、請求項52に記載の方法。
- 質量分析によって溶出フルオラス標識成分を分析するステップをさらに含んでなる、請求項52に記載の方法。
- フルオラスベースの分離法を使用する一連の生物由来サンプルの成分の多重分離のための方法であって、前記方法が、
一連の生物由来サンプルを提供し、各メンバーサンプルが複数の成分を含んでなるステップと、
5個もしくはそれ以上のフッ素原子を含んでなるフルオロアルキル部分に結合された化学反応性官能基を含んでなる2つもしくはそれ以上のフルオラス標識試薬を提供するステップと、
第1のサンプルを第1のフルオラス標識試薬で処理し、第1のサンプルの1つもしくはそれ以上の成分を標識するステップと、
第2のサンプルを第2のフルオラス標識試薬で処理し、それによって第2のサンプルの1つもしくはそれ以上の成分を標識し、ここで前記第1および第2のフルオラス標識試薬がそれに組込まれた多くのフッ素原子の点で異なるステップと、
第1および第2のサンプルを混合し、混合サンプルを形成するステップと、
前記混合サンプル上でフルオラスベースの分離を実行し、それによって前記一連の生物由来サンプルの成分を分離するステップと
を含んでなる方法。 - 前記一連のサンプルの1つもしくはそれ以上の追加のメンバーを1つもしくはそれ以上の追加のフルオラス標識試薬で処理し、前記試薬が互いに、かつ前記第1および第2のフルオラス標識試薬とそれに組込まれたフッ素原子の数で異なるステップと、
前記追加の処理サンプルを前記フルオラスベースの分離を実行する前に前記第1および第2のサンプルと混合するステップと
をさらに含んでなる、請求項59に記載の方法。 - 前記フルオラスベースの分離法を実行するステップが、前記フルオラス標識成分のフルオラス固相抽出を実行し、それによって非標識成分をフルオラス標識成分から分離するステップを含んでなる、請求項59に記載の方法。
- 前記フルオラスベースの分離法を実行するステップが、フルオラス親和性基質を使用するメンバー成分を画分するステップを含んでなる、請求項59に記載の方法。
- 前記メンバー成分を画分するステップが、前記第1のフルオラス標識試薬で標識された成分を前記第2のフルオラス標識試薬で標識された成分から分離するステップを含む、請求項62に記載の方法。
- 前記非標識成分または前記フルオラス標識成分を質量分析によって分析するステップをさらに含んでなる、請求項59に記載の方法。
- 複数の生物由来成分を含んでなる複合組成物を分析するための方法であって、前記方法が、
そのフルオラス部分が化学反応性官能基に結合されている、5個もしくはそれ以上のフッ素原子を含んでなるフルオラス部分を含んでなるフルオラス標識試薬を提供するステップと、
前記複合組成物の1つもしくはそれ以上のメンバーを前記フルオラス標識試薬で修飾し、フルオラス標識成分および非標識成分を含んでなる修飾組成物を形成するステップと、
前記フルオラス標識試薬の前記フルオラス部分に対する親和性を有する分離組成物を使用する前記修飾組成物を画分するステップと、
分離サンプル画分で質量分析を実行し、かつ質量スペクトルデータを生成し、それによって前記複合組成物を分析するステップと
を含んでなる方法。 - 生物由来サンプルを分析するための方法であって、
5個もしくはそれ以上のフッ素原子を含んでなるフルオロアルキル部分に結合された化学反応性官能基を含んでなるフルオラス標識試薬と前記生物由来サンプルを反応させ、それによってフルオラス標識を前記生物由来サンプルの1つもしくはそれ以上のメンバー成分に組込み、フルオラス修飾成分を形成するステップと、
前記処理サンプルの第1の部分を質量分析によって分析し、第1の一連の質量スペクトルデータを生成させるステップと、
前記処理サンプルの第2の部分を質量分析によって分析し、第2の一連の質量スペクトルデータを生成し、ここで前記第2の部分の前記フルオラス修飾成分が分析前にフルオラス親和性基質を使用して除去されているステップと、
前記第1および第2の一連の質量スペクトルデータを比較し、前記第1の部分に存在し、かつ前記第2の部分に存在しない1つもしくはそれ以上の質量スペクトルピークを測定し、それによって前記生物由来サンプルを分析するステップと
を含んでなる方法。 - 前記第1の部分に存在し、かつ前記第2の部分に存在しない質量スペクトルピークを識別するステップをさらに含んでなる、請求項66に記載の方法。
- 前記生物由来サンプルがプロテオミクスまたはメタボロミクスサンプルを含んでなる、請求項66に記載の方法。
- 前記プロテオミクスまたはメタボロミクスサンプルが複数のアミノ酸含有成分を含んでなり、かつ前記フルオラス標識試薬の前記化学反応性官能基がアミノ酸コンジュゲーション剤を含んでなる、請求項68に記載の方法。
- 化学反応性官能基を含んでなるバイオコンジュゲーション剤に結合されたフルオラス部分を含んでなるフルオラス標識試薬であって、前記フルオラス標識試薬が5個もしくはそれ以上のフッ素原子を含んでなる、フルオラス標識試薬。
- 前記フルオラス部分が隣接炭素原子に結合された5個もしくはそれ以上のフッ素原子を含んでなる、請求項70に記載のフルオラス標識試薬。
- 前記フルオラス部分が、非フルオラスリンカー領域によって分離された炭素結合フッ素原子の2つもしくはそれ以上のクラスタを含んでなる、請求項70に記載のフルオラス標識試薬。
- 前記標識試薬が前記バイオコンジュゲーション剤における第1の位置で結合された第1のフルオラス部分と、前記バイオコンジュゲーション剤における第2の位置で結合された第2のフルオラス部分とを含んでなる、請求項70に記載のフルオラス標識試薬。
- 前記標識試薬が水性適合試薬を含んでなる、請求項70に記載のフルオラス標識試薬。
- 前記フルオラス部分が、1つもしくはそれ以上の13C原子、15N、18O原子、またはジュウテリウム原子を含んでなる、請求項70に記載のフルオラス標識試薬。
- 前記化学反応性官能基が同位体標識を含んでなる、請求項70に記載のフルオラス標識試薬。
- 前記フルオラス標識試薬が、前記バイオコンジュゲーション剤と1つもしくはそれ以上の前記フッ素部分との間に位置した非フルオラスリンカーヨウ素をさらに含んでなる、請求項70に記載のフルオラス標識試薬。
- 前記リンカー要素が、長さが2〜20個の炭素のアルキル鎖を含んでなる、請求項77に記載のフルオラス標識試薬。
- 前記リンカー要素が、1つもしくはそれ以上の13C原子、15N、18O原子、またはジュウテリウム原子を含んでなる、請求項77に記載のフルオラス標識試薬。
- 前記リンカー要素が放出可能な要素を含んでなる、請求項77に記載のフルオラス標識試薬。
- 前記放出可能な要素がペプチド開裂部位を含んでなる、請求項80に記載のフルオラス標識試薬。
- 前記放出可能な要素がジスルフィド結合を含んでなる、請求項80に記載のフルオラス標識試薬。
- 前記試薬が、
である、請求項82に記載のフルオラス標識試薬。 - 前記試薬が、
である、請求項82に記載のフルオラス標識試薬。 - 前記化学反応性官能基が、マレイミド、ハロゲンβ−ケトン、ジスルフィド交換試薬、フェニルグリオキサル誘導体、無水物、アクリレート、NHSエステル、チオール、ジアルキルピロカーボネート、アミノオキシ基、またはヒドラジンを含んでなる、請求項70に記載のフルオラス標識試薬。
- 前記化学反応官能基が同位体標識を含んでなる、請求項70に記載のフルオラス標識試薬。
- 前記フルオラス標識試薬が、フルオラスアルキルチオール、フルオラスアルコキサミン、フルオラスNHSエステル、フルオラススルホ‐NHSエステル、またはフルオラスアジドを含んでなる、請求項70に記載のフルオラス標識試薬。
- 前記フルオラス標識試薬が、第2のバイオコンジュゲーション剤をさらに含んでなる、請求項70に記載のフルオラス標識試薬。
- 前記フルオラス標識試薬が、第1および第2のアミノ酸結合官能基を誘導体化するための第1および第2のバイオコンジュゲーション剤を含んでなり、かつ前記第1および第2のアミノ酸結合官能基が同様の官能基である、請求項88に記載のフルオラス標識試薬。
- 前記フルオラス標識試薬が、
である、請求項89に記載のフルオラス標識試薬。 - 前記フルオラス標識試薬が、第1および第2のアミノ酸結合官能基を誘導体化するための第1および第2のバイオコンジュゲーション剤を含んでなり、ここで前記第1および第2のアミノ酸結合官能基が異なる官能基である、請求項88に記載のフルオラス標識試薬。
- 前記フルオラス標識試薬が質量分析のための標準イオン化および/または断片化条件下で不活性である、請求項70に記載のフルオラス標識試薬。
- 前記フルオラス標識試薬が、
CF2H(CF2)5CH2CH2SH、
(CF3CF2)2CF(CF2)2CH2CH2SH、
(CF3CF2)2CH(CF2)2CH2CH2SH、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
CF3H(CF2)5CH2CH2CH2N3、
CF3H(CF2)7CH2CH2CH2N3、
、
、
、
、
、
CF3(CF2)7CH2CH2(C=O)CH2ONH2、
CF3(CF2)5CH2CH2(C=O)CH2ONH2、
CF3(CF2)3CH2CH2(C=O)CH2ONH2、
H2NCH2CH2CH2(CF2)6CH2CH2SH、
、
、
、および
[式中Aはアミノ酸である。]からなる群から選択される、請求項70に記載のフルオラス標識試薬。 - 生物由来サンプルの分別定量化のための一連のフルオラス標識試薬であって、前記一連が請求項70に記載の2つもしくはそれ以上のフルオラス標識試薬を含んでなり、前記フルオラス標識試薬が1つもしくはそれ以上の安定したアイソトープで区別をつけて標識される一連のフルオラス標識試薬。
- 前記安定したアイソトープがジュウテリウムを含んでなる、請求項94に記載の一連のフルオラス標識試薬。
- 前記安定したアイソトープが13Cを含んでなる、請求項94に記載の一連のフルオラス標識試薬。
- 前記安定したアイソトープが15Nを含んでなる、請求項94に記載の一連のフルオラス標識試薬。
- 前記安定したアイソトープが18Oを含んでなる、請求項94に記載の一連のフルオラス標識試薬。
- 基質の表面上でフルオラス標識サンプルのフルオラスおよび非フルオラス成分を画分するための方法であって、前記方法が、
フルオラス標識に対する親和性を有する組成物を提供し、前記組成物が前記基質の表面の第1の部分に結合されるステップと、
フルオラス成分および非フルオラス成分を含んでなるフルオラス標識サンプルを前記基質の表面上へ装填し、かつ前記サンプルの前記フルオラス成分をフルオラス標識に対する親和性を有する前記組成物と結合させるステップと、
前記非フルオラス成分を除去し、それによって前記基質表面上でフルオラス標識サンプルを画分するステップと
を含んでなる方法。 - 前記基質がMALDIプレートまたはDIOSプレートを含んでなる、請求項99に記載の方法。
- 前記非フルオラス成分を除去するステップが前記基質の表面を洗浄するステップを含んでなる、請求項99に記載の方法。
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