CN109142611A - 一种基于疏水基团修饰的sumo化肽段的富集方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于疏水基团修饰的SUMO化肽段的富集方法，包括：封闭多肽侧链的自由氨基、强疏水基团标记、反相色谱固定相富集。首先对SUMO化修饰的蛋白质样品进行酶解，在肽段水平上特异性封闭多肽侧链的自由氨基，然后通过SUMO化肽段的两个N端的α‑氨基引入两个强疏水基团，非SUMO化肽段引入一个强疏水基团，最后依据两类肽段在反相色谱固定相上保留行为的差异实现SUMO化肽段与非SUMO化肽段的分离，从而实现对蛋白质样品中的SUMO化肽段的富集。本发明的优点是标记效率高、去除效率高、选择性高、处理步骤简单、且减少了样品的损失和非特异性吸附。
Description
技术领域
本发明涉及SUMO化肽段的富集方法，即一种基于疏水基团修饰的SUMO化肽段的富集方法，以实现复杂蛋白质样品SUMO化肽段的高效和高选择性富集。
背景技术
泛素化修饰是生物体内常见的翻译后修饰之一，也是最早发现的一种与蛋白质相连的修饰方式，在蛋白质降解方面发挥着重要作用。近十几年来科学家们相继发现了一些类泛素蛋白，其中小泛素相关修饰物(small ubiquitin-like modifiers,SUMO)是最受瞩目的一类。SUMO在多个细胞生理活动中都发挥着重要的调节作用，例如维持基因组稳定性、调节细胞周期、调控细胞分化和转录因子活性、参与信号转导等。许多SUMO修饰蛋白如转录因子在细胞中的丰度很低，并且在正常状态下只有小部分蛋白质底物被修饰。在进行质谱分析时，复杂样品中蛋白质的浓度范围很广，高丰度的蛋白质会对低丰度SUMO修饰蛋白质质谱信号产生抑制。此外，在对蛋白质SUMO修饰多肽(位点)进行分析时，SUMO修饰蛋白质酶解产物中大量的非修饰肽段对SUMO修饰肽段产生极大干扰。上述因素严重影响了SUMO修饰蛋白及其修饰位点的鉴定和定量效率。
为了提高对SUMO修饰的鉴定效率，人们发展了多种基于生物标记的富集方法。通常是对SUMO进行His-tag标记或者变异后，利用镍柱或者抗体对SUMO修饰蛋白和多肽进行亲和富集(Proceedings of the National Academy of Sciences 2014,111,12432-12437；Nature Communication 2014,5,5409；Nature Communication 2015,6,7289)。此类方法有助于提高对SUMO修饰的鉴定效率，但是只适用于基因可改变的生物样品(如细胞)，对于组织、血液等样品则无能为力；此外，对SUMO序列进行改变可能影响SUMO的性质和功能，因此无法准确反映样品中蛋白质的真实修饰状态。因此，亟需发展普适性的野生型SUMO修饰蛋白质及修饰多肽富集方法。
为克服以上方法所存在的问题，我们选择了效率高且简易快速的标记方法于SUMO修饰肽段引入富集标签，并采用易获取且无显著非特异性吸附的材料对SUMO修饰肽段进行富集，以实现SUMO化肽段的高效高选择性无歧视富集。
发明内容
本发明发展了一种SUMO化肽段的富集方法，标记效率高，富集效率高，选择性高，对不同性质SUMO化肽段无歧视。
为了实现该目的，本发明的技术方案是：
1)采用蛋白水解酶酶解SUMO化修饰的底物蛋白
将生物样品中的蛋白质溶解于含2-8M盐酸胍pH为6-10的缓冲液中，加入终浓度10-100mM的二硫苏糖醇，45-90℃孵育30-120min后,加入终浓度20-500mM的丙烯酰胺，反应30-120min后，另加入终浓度10-100mM的二硫苏糖醇，孵育10-30min后，加入蛋白水解酶进行酶解，蛋白水解酶酶用量为蛋白质质量的1/5-1/100，25-45℃孵育2-48h，得到溶液A；
酶为胰蛋白酶，蛋白内切酶Glu-C，蛋白内肽酶Arg-C,金属蛋白内切酶Lys-N,胰凝乳蛋白酶，木瓜蛋白酶，弹性蛋白酶，或胃蛋白酶中的一种或二种以上。
2)采用特殊试剂特异性地封闭多肽中赖氨酸侧链的自由氨基
于溶液A中加入终浓度10-4000mM的特殊试剂，温度4-70℃，pH为8-14，反应0.5-48h后，将肽段样品固载到C18反相捕集柱，去除溶剂及过量试剂，高有机相下洗脱肽段，蒸发溶剂，将肽段溶于pH为6-12的缓冲液中，得到溶液B；
能够特异性地封闭多肽中赖氨酸侧链的自由氨基的试剂有醛类、酸酐类、卤化物、胍基化试剂、琥珀酰化类或Traut’s试剂中的一种或二种以上。
3)采用带有碳链的氨基活性试剂作为强疏水基团标记肽段N端的α-氨基
于溶液B中加入终浓度1-500mM带有碳链的氨基活性试剂，反应1-48h，反应温度25-70℃，得到溶液C；
带有碳链的氨基活性试剂，其所带碳链长度为8-20，且含有醛基基团或琥珀酰亚胺酯基团；
缓冲液由不含有伯胺以及仲胺基团的缓冲盐配置而成；
缓冲液浓度为5-500mM，pH为6-12。
4)采用反相色谱固定相分离SUMO修饰肽段与非修饰肽段
将溶液C的溶剂进行挥发，采用上样溶液溶解后，上样到反相色谱固定相上，材料与蛋白质重量比为10-100 00，将色谱固定相采用上样溶液清洗后，采用洗脱溶液分离并洗脱SUMO修饰肽段与非修饰肽段；
反相材料为C18反相色谱固定相，C8反相色谱固定相，苯基反相色谱固定相中的一种或二种以上；
按体积百分浓度计，上样溶液：2-30％乙腈+0.001％-2％三氟乙酸，其余为水；洗脱溶液：30％-98％乙腈+0.001％-2％三氟乙酸或甲酸，其余为水。
本发明的优点有：
1、胍基化试剂特异性地封闭赖氨酸侧链的自由氨基，避免了非N端氨基对后续标记步骤的干扰，提高了SUMO化肽段的富集选择性和回收率；
2、疏水基团标记的高效率，以及反相色谱固定相与疏水基团标记的SUMO化肽段的强疏水作用，引起多肽色谱保留时间的显著变化，促进SUMO修饰肽段与非修饰肽段的高效分离，从而得到SUMO化肽段的高选择性富集；
3、反相色谱固定相对不同性质SUMO化肽段无非特异性吸附，避免了SUMO化肽段的丢失。
4、方法过程中无需额外的样品纯化，富集步骤少，过程简单，有效减少了样品的损失，从而得到高效的富集。
5、方法简易，不需要对样品中的SUMO进行生物标记和变异，与之前发展的方法相比，适用于任意样品中野生型SUMO修饰位点的富集，能够更准确地反映生命活动过程中SUMO修饰的状态。
附图说明
图1SUMO化肽段的富集流程
图2带有长碳链的氨基活性试剂(C18-S-S-NHS)的化学结构
图3(a)实施例1富集前酵母细胞的提取蛋白的胰蛋白酶酶解产物中的SUMO化肽段的MALDI-TOF质谱图；
图3(b)实施例1富集后酵母细胞的提取蛋白的胰蛋白酶酶解产物中的SUMO化肽段的MALDI-TOF质谱图。
具体实施方式
实施例1
如图1所示，SUMO修饰的蛋白质样品经过变性还原烷基化后酶解，在肽段水平上特异性封闭多肽侧链的自由氨基，然后通过肽段N端的α-氨基于SUMO化肽段上引入两个强疏水基团，非SUMO化肽段引入一个强疏水基团，最后依据两类肽段在反相色谱固定相上保留行为的差异实现SUMO化肽段与非SUMO化肽段的分离，从而得到蛋白质样品中的SUMO化修饰肽段。
以酵母细胞为样品，100μg提取蛋白溶于100μl含6M盐酸胍的100mM pH为8的磷酸盐缓冲液，加入2μl 100mM二硫苏糖醇，56℃变性还原1h后，加入2μl 300mM丙烯酰胺反应1h后，另加入2μl 100mM二硫苏糖醇，孵育10min后，加入胰蛋白酶进行酶解，其中酶用量为样品质量的1/50(w/w)，温度为37℃，酶解12h。加入终浓度100mM的O-甲基异脲封闭肽段侧链的自由氨基，温度37℃，pH为11，反应4h后，将肽段样品固载到C18反相捕集柱(4.6mm i.d.×1cm)，去除溶剂及过量胍基化试剂，高有机相下洗脱肽段，蒸发溶剂。将肽段溶于200μl50mM pH 8的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中。往酶解产物中加入1mL 10mg/mL十六醛(溶于正丙醇)，40μl 600mM氰基硼氢化钠水溶液，50℃反应过夜。将溶液冻干，随后溶于30％(v/v)B相(A相，2％乙腈+0.1％三氟乙酸水溶液；B相，98％乙腈+0.1％三氟乙酸水溶液)，通入C18分离柱(2.3mm i.d.×15cm，填料粒度5μm，孔径)，采用30％B相上样后，30min内按梯度30-90％B，分离并洗脱肽段，收集SUMO化肽段流分，冻干。MALDI-TOF质谱分析证明SUMO化肽段得到了高效高选择性的富集。
实施例2
以酵母细胞为样品，100μg提取蛋白溶于100μl含6M盐酸胍的100mM pH为8的磷酸盐缓冲液，加入2μl 100mM二硫苏糖醇，56℃变性还原1h后，加入2μl 300mM丙烯酰胺反应1h后，另加入2μl 100mM二硫苏糖醇，孵育10min后，加入胰蛋白酶进行酶解，其中酶用量为样品质量的1/50(w/w)，温度为37℃，酶解12h。加入终浓度100mM的O-甲基异脲封闭肽段侧链的自由氨基，温度37℃，pH为11，反应4h后，将肽段样品固载到C18反相捕集柱(4.6mm i.d.×1cm)，去除溶剂及过量胍基化试剂，高有机相下洗脱肽段，蒸发溶剂。将肽段溶于200μl50mM pH 8的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中。向酶解产物中加入1mL 10mg/mL氨基活性试剂(C14-S-S-NHS，溶于二甲基甲酰胺)，40℃反应8h。将溶液冻干，随后溶于30％(v/v)B相(A相，2％乙腈+0.1％三氟乙酸水溶液；B相，98％乙腈+0.1％三氟乙酸水溶液)，通入C18分离柱(2.3mm i.d.×15cm，填料粒度5μm，孔径)，采用30％B相上样后，30min内按梯度30-90％B，分离并洗脱肽段，收集SUMO化肽段流分，冻干。结果与实施例1相同，MALDI-TOF质谱分析证明SUMO化肽段得到了高效高选择性的富集。
实施例3
以酵母细胞为样品，100μg提取蛋白溶于100μl含6M盐酸胍的100mM pH为8的磷酸盐缓冲液，加入2μl 100mM二硫苏糖醇，56℃变性还原1h后，加入2μl 300mM丙烯酰胺反应1h后，另加入2μl 100mM二硫苏糖醇，孵育10min后，加入胰蛋白酶进行酶解，其中酶用量为样品质量的1/50(w/w)，温度为37℃，酶解12h。加入终浓度100mM的O-甲基异脲封闭肽段侧链的自由氨基，温度37℃，pH为11，反应4h后，将肽段样品固载到C18反相捕集柱(4.6mm i.d.×1cm)，去除溶剂及过量胍基化试剂，高有机相下洗脱肽段，蒸发溶剂。将肽段溶于200μl50mM pH 8的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中。向酶解产物中加入1mL 20mg/mL氨基活性试剂(C18-S-S-NHS，溶于二甲基甲酰胺)，50℃反应4h。将溶液冻干，随后溶于30％(v/v)B相(A相，2％乙腈+0.1％三氟乙酸水溶液；B相，98％乙腈+0.1％三氟乙酸水溶液)，通入C18分离柱(2.3mm i.d.×15cm，填料粒度5μm，孔径)，采用30％B相上样后，30min内按梯度30-90％B，分离并洗脱肽段，收集SUMO化肽段流分，冻干。结果与实施例1相同，MALDI-TOF质谱分析证明SUMO化肽段得到了高效高选择性的富集。
实施例4
以人血清为样品，100μg提取蛋白溶于100μl含6M盐酸胍的100mM pH为8的磷酸盐缓冲液，加入2μl 100mM二硫苏糖醇，56℃变性还原1h后，加入2μl 300mM丙烯酰胺反应1h后，另加入2μl 100mM二硫苏糖醇，孵育10min后，加入胰蛋白酶进行酶解，其中酶用量为样品质量的1/50(w/w)，温度为37℃，酶解12h。加入终浓度100mM的O-甲基异脲封闭肽段侧链的自由氨基，温度37℃，pH为11，反应4h后，将肽段样品固载到C18反相捕集柱(4.6mm i.d.×1cm)，去除溶剂及过量胍基化试剂，高有机相下洗脱肽段，蒸发溶剂。将肽段溶于200μl50mM pH 8的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中。往酶解产物中加入1mL 10mg/mL十六醛(溶于正丙醇)，40μl 600mM氰基硼氢化钠水溶液，50℃反应过夜。将溶液冻干，随后溶于30％(v/v)B相(A相，2％乙腈+0.1％三氟乙酸水溶液；B相，98％乙腈+0.1％三氟乙酸水溶液)，通入C18分离柱(2.3mm i.d.×15cm，填料粒度5μm，孔径)，采用30％B相上样后，30min内按梯度30-90％B，分离并洗脱肽段，收集SUMO化肽段流分，冻干。结果与实施例1相同，MALDI-TOF质谱分析证明SUMO化肽段得到了高效高选择性的富集。
实施例5
以人血清为样品，100μg提取蛋白溶于100μl含6M盐酸胍的100mM pH为8的磷酸盐缓冲液，加入2μl 100mM二硫苏糖醇，56℃变性还原1h后，加入2μl 300mM丙烯酰胺反应1h后，另加入2μl 100mM二硫苏糖醇，孵育10min后，加入胰蛋白酶进行酶解，其中酶用量为样品质量的1/50(w/w)，温度为37℃，酶解12h。加入终浓度100mM的O-甲基异脲封闭肽段侧链的自由氨基，温度37℃，pH为11，反应4h后，将肽段样品固载到C18反相捕集柱(4.6mm i.d.×1cm)，去除溶剂及过量胍基化试剂，高有机相下洗脱肽段，蒸发溶剂。将肽段溶于200μl50mM pH 8的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中。向酶解产物中加入1mL 10mg/mL氨基活性试剂(C14-S-S-NHS，溶于二甲基甲酰胺)，40℃反应8h。将溶液冻干，随后溶于30％(v/v)B相(A相，2％乙腈+0.1％三氟乙酸水溶液；B相，98％乙腈+0.1％三氟乙酸水溶液)，通入C18分离柱(2.3mm i.d.×15cm，填料粒度5μm，孔径)，采用30％B相上样后，30min内按梯度30-90％B，分离并洗脱肽段，收集SUMO化肽段流分，冻干。结果与实施例1相同，MALDI-TOF质谱分析证明SUMO化肽段得到了高效高选择性的富集。
实施例6
以人血清为样品，100μg提取蛋白溶于100μl含6M盐酸胍的100mM pH为8的磷酸盐缓冲液，加入2μl 100mM二硫苏糖醇，56℃变性还原1h后，加入2μl 300mM丙烯酰胺反应1h后，另加入2μl 100mM二硫苏糖醇，孵育10min后，加入胰蛋白酶进行酶解，其中酶用量为样品质量的1/50(w/w)，温度为37℃，酶解12h。加入终浓度100mM的O-甲基异脲封闭肽段侧链的自由氨基，温度37℃，pH为11，反应4h后，将肽段样品固载到C18反相捕集柱(4.6mm i.d.×1cm)，去除溶剂及过量胍基化试剂，高有机相下洗脱肽段，蒸发溶剂。将肽段溶于200μl50mM pH 8的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中。向酶解产物中加入1mL 20mg/mL氨基活性试剂(C18-S-S-NHS，溶于二甲基甲酰胺)，50℃反应4h。将溶液冻干，随后溶于30％(v/v)B相(A相，2％乙腈+0.1％三氟乙酸水溶液；B相，98％乙腈+0.1％三氟乙酸水溶液)，通入C18分离柱(2.3mm i.d.×15cm，填料粒度5μm，孔径)，采用30％B相上样后，30min内按梯度30-90％B，分离并洗脱肽段，收集SUMO化肽段流分，冻干。结果与实施例1相同，MALDI-TOF质谱分析证明SUMO化肽段得到了高效高选择性的富集。
Claims (8)
1.一种基于疏水基团修饰的SUMO化肽段的富集方法，包括：
封闭酶解后蛋白中的多肽侧链的自由氨基；肽段N端修饰上强疏水基团；反相色谱固定相分离疏水性差异明显的SUMO化肽段与非SUMO化肽段，从而实现SUMO化肽段的富集。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：封闭多肽侧链的自由氨基的过程，采用特殊试剂特异性地封闭多肽中赖氨酸侧链的自由氨基，而不封闭肽段N端的α-氨基；试剂有醛类、酸酐类、卤化物、胍基化试剂、琥珀酰化类或Traut’s试剂中的一种或二种以上。
3.按照权利要求1所述的方法，特征在于：肽段N端修饰上强疏水基团的过程，采用带有碳链的氨基活性试剂作为强疏水基团标记肽段N端的α-氨基。
4.按照权利要求1所述的方法，特征在于：采用反相色谱固定相分离SUMO化肽段与非SUMO化肽段的过程，利用标记后SUMO化肽段与非SUMO化肽段间的疏水性差异，在反相色谱固定相上分离SUMO化肽段与非SUMO化肽段，从而实现SUMO化肽段的富集。
5.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：封闭多肽侧链的自由氨基的过程，
1)所述的能够特异性地封闭多肽中赖氨酸侧链的自由氨基的试剂有醛类、酸酐类、卤化物、胍基化试剂、琥珀酰化类或Traut’s试剂中的一种或二种以上；
2)特异性地封闭多肽中赖氨酸侧链的自由氨基的反应条件可以是：封闭试剂的终浓度10-4000mM，温度4-70℃，于pH为8-14缓冲液中，反应0.5-48h。
6.按照权利要求1或3所述的方法，其特征在于：
肽段N端修饰上强疏水基团的过程，
1)所述的带有碳链的氨基活性试剂，其所带碳链长度为8-20，且含有醛基基团或琥珀酰亚胺酯基团；试剂结构如下(n＝7-19)：
2)于缓冲液中，加入带有碳链的氨基活性试剂的终浓度1-500mM，反应1-48h，反应温度25-70℃；
3)缓冲液由不含有伯胺以及仲胺基团的缓冲盐配置而成；
4)缓冲液浓度为5-500mM，pH为6-12。
7.按照权利要求1或4所述的方法，其特征在于：
1)反相色谱固定相为C18反相色谱固定相，C8反相色谱固定相，苯基反相色谱固定相中的一种或二种以上；
2)所述的反相色谱固定相材料与蛋白质重量比为10-100 00。
8.按照权利要求1所述的方法，其可应用于生物样品中含赖氨酸肽段，SUMO修饰肽段，泛素化修饰肽段，蛋白交联肽段以及含有二硫键肽段中的一种或二种以上的富集；蛋白为从生物样品中提取的蛋白，生物样品为细胞、组织、体液中的一种或二种以上。
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