JP2008511311A - リン酸化タンパク質分析用ゲル内標識化及びゲル内単離方法及びそれを利用したタンパク質のリン酸化位置同定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、
1)ポリマー性ゲルマトリックス内に留まるリン酸化タンパク質からリン酸基の脱リン酸化と、収得された脱リン酸化アミノ酸残基に対する求核性標識物質によるゲル内のコンジュゲート付加工程、
2)ポリマー性ゲルマトリックスからリン酸化タンパク質のゲル内の化学的標識反応に使用された試薬の選択的除去工程、
3)本来リン酸化された残基だったが、標識化反応によって標識されたアミノ酸残基での加水分解の結果として、生成されたペプチドを含むペプチド混合物を得るために、ポリマー性ゲル内に留まる標識されたタンパク質のゲル内の単離工程、及び
4)ポリマー性ゲルマトリックスから遊離される単離されたペプチドをクロマトグラフィーで精製及び分離して質量分析する工程等で構成される、リン酸化タンパク質分析用ゲル内の標識化方法及び、ゲル内の加水分解方法を利用するタンパク質のリン酸化位置同定方法を提供する。
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に記述するが、本発明の範囲がこれに限定されるものではない。
タンパク質試料は、生物学的培地から通常的な方法にしたがって抽出して製造する。抽出されたタンパク質は、6Mグアニジン塩酸塩で変性される。タンパク質のシステイン残基のジスルフィド結合は、約37℃で約1時間の間トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩で還元し、形成されたチオール基は、公知された方法にしたがってアルキル化反応を利用して保護したり、酸化反応を利用してスルホン酸に酸化したりされる。製造されたタンパク質または標準試料タンパク質は、ゲル電気泳動分野で使用する通常的な方法にしたがい、1Dまたは2Dゲル電気泳動方法によって分離することができ、ポリアクリルアミドゲル内に固定される。ポリアクリルアミドゲルは、必要によって多様なアクリルアミド濃度を有する溶液から製造される。ゲル内で分離したタンパク質は、通常的な方法によってクマシーブリリアントブルーG−250(Coomassie Brilliant Blue G−250)のような染色試薬または銀窒酸塩で染色して可視化される。
タンパク質を含む染色された部分のゲルを切り取ってゲル脱染色を遂行する。クマシブルーで染色されたゲルをメタノールまたはアセトニトリルを含むアンモニウムビカーボネート溶液に入れて脱染色を遂行する。銀窒酸塩で染色されたゲルは、30Mmカリウムフェリシアニドと100mMチオ硫酸ナトリウム1:1溶液を使用して脱染色する。脱染色されたゲルは、アセトニトリルで洗って真空で乾燥する。
50mMアンモニウムビカーボネート(45μL)及びトリプシン(0.1mg/μL、6μL)の混合溶液をタンパク質を含むゲルに付加して反応溶液を約12ないし18時間37℃で培養した。上澄み液をピペットで集めて、ゲルを50%アセトニトリル/0.1%トリフルオロ酢酸溶液(100μL)で洗って先の上澄み液と合わせた後、真空乾燥した。
Claims (22)
- a)ポリマー性ゲルマトリックス内に固定化されたリン酸化タンパク質のリン酸化位置を標識試薬混合物を使用して標識する工程、
b)標識されたタンパク質を酵素で加水分解して加水分解されたペプチドを得る工程、及び
c)前記加水分解されたペプチドを分析する工程とからなることを特徴とする、リン酸化タンパク質分析用ゲル内標識方法及び標識されたタンパク質分析を通じたタンパク質リン酸化位置同定方法。 - 前記ポリマー性ゲルマトリックスが、ポリアクリルアミドゲルであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリアクリルアミドゲルが、1ないし30%濃度のアクリルアミドを含む溶液から製造されるゲルから選択されることを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 前記標識試薬混合物が、塩基、標識物質、還元剤、及び金属触媒から選択される一つ以上を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記塩基が、無機塩基であることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 前記塩基が、有機塩基であることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 前記標識物質が、スルフヒドリル(sulfhydryl)官能基を有する化合物から選択されることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 前記スルフヒドリル(sulfhydryl)官能基が、ジスルフィド(disulfide)形態の標識物質を還元剤で還元することによって製造されることを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- 前記還元剤が、トリス(2−シアノエチル)ホスフィン(TCNEP)、トリス(2−カルボキシルエチル)ホスフィン(TCEP)、トリス(ハイドロキシプロピル)ホスフィン(THPP)、及びトリブチルホスフィン(TBP)からなる群から選択されるものであることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 前記スルフヒドリル(sulfhydryl)官能基が、標識反応工程前に塩基性加水分解または求核置換方法で保護されたスルフヒドリル基を脱保護することにより製造されることを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- 前記標識物質が、グアニジノアルカンチオール、アミノアルカンチオール、メルカプトアルカノール、アルカンチオール、アルカンジチオール、ジアルキルアミノアルカンチオール及びアルコキシアルカンチオールからなる群から選択されることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 前記標識物質が、グアニジノアルカンチオール、アミノアルカンチオール、メルカプトアルカノール、アルカンチオール、アルカンジチオール、ジアルキルアミノアルカンチオール及びアルコキシアルカンチオールからなる群から選択され、選択された標識物質を構成する少なくても一つ以上の原子が事実上の化学的構造及び反応性が同じで、質量値だけが他の同位元素に置換された(isotopically coded)標識物質同等体であることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 前記リン酸化位置が、リン酸化セリン及びリン酸化スレオニンから選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記酵素が、加水分解酵素の中から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記酵素が、トリプシン、エンドプロテイナーゼArg−C及びエンドプロテイナーゼLys−Cからなる群から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記加水分解されたペプチドが、クロマトグラフィーによって分離された後、またはクロマトグラフィーによる分離過程なしに質量分析機によって質量分析されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- a)ポリアクリルアミドゲルに維持されたリン酸化タンパク質からリン酸基の脱リン酸化を誘導して、得られたタンパク質の脱リン酸化されたアミノ酸残基を、標識物質でゲル内標識を遂行する工程、
b)リン酸化タンパク質のゲル内標識反応に使用された試薬をポリアクリルアミドゲルから標識されたタンパク質の流出なしに選択的に除去する工程、
c)標識物質で標識されたタンパク質をプロテアーゼでゲル内加水分解してペプチド混合物を得る工程、及び
d)ポリアクリルアミドゲルから流出する加水分解されたペプチド混合物をクロマトグラフィーで分離して質量分析する工程とからなることを特徴とする、リン酸化タンパク質分析用ゲル内標識化方法及び標識化されたタンパク質分析を通じたタンパク質リン酸化位置同定方法。 - 前記タンパク質からリン酸基の脱リン酸化が、塩基性水溶液条件で遂行されることを特徴とする、請求項17に記載の方法。
- 前記ポリアクリルアミドゲルが、5ないし15%濃度のアクリルアミドを含む溶液から製造されるゲルから選択されることを特徴とする、請求項17に記載の方法。
- 前記標識物質が、グアニジノエタンチオール、アミノエタンチオール、メルカプトエタノール、エタンジチオール、ジメチルアミノエタンチオール、トリメチルアンモニウムエタンチオール、ジエチルアミノエタンチオール、メトキシエタンチオール及びエトキシエタンチオールからなる群から選択されることを特徴とする、請求項17に記載の方法。
- 前記標識物質が、グアニジノエタンチオール、アミノエタンチオール、メルカプトエタノール、エタンジチオール、ジメチルアミノエタンチオール、トリメチルアンモニウムエタンチオール、ジエチルアミノエタンチオール、メトキシエタンチオール及びエトキシエタンチオールからなる群から選択され、選択された標識物質を構成する少なくとも一つ以上の原子が事実上の化学的反応性が同じで、質量値だけが他の同位元素に置換された(isotopically coded)標識物質同等体であることを特徴とする、請求項17に記載の方法。
- 前記標識物質が、自体のジスルフィド(disulfide)形態から標識反応中に生成されることを特徴とする、請求項17に記載の方法。
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