KR100693111B1 - 인산화 단백질의 질량 분석 및 인산화 위치 분석용 표지물질 - Google Patents
인산화 단백질의 질량 분석 및 인산화 위치 분석용 표지물질 Download PDFInfo
- Publication number
- KR100693111B1 KR100693111B1 KR1020040008046A KR20040008046A KR100693111B1 KR 100693111 B1 KR100693111 B1 KR 100693111B1 KR 1020040008046 A KR1020040008046 A KR 1020040008046A KR 20040008046 A KR20040008046 A KR 20040008046A KR 100693111 B1 KR100693111 B1 KR 100693111B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- labeling
- phosphorylated
- peptide
- group
- protein
- Prior art date
Links
- 238000002372 labelling Methods 0.000 title claims abstract description 112
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 title claims abstract description 68
- 239000000463 material Substances 0.000 title claims abstract description 35
- 108091005981 phosphorylated proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 31
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title abstract description 49
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 title abstract description 35
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 title abstract description 35
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 119
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 46
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 43
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims abstract description 40
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 34
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 20
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims abstract description 19
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 claims abstract description 15
- 125000002795 guanidino group Chemical group C(N)(=N)N* 0.000 claims abstract description 15
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims abstract description 5
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 25
- AZPZDUFVNKSRGI-UHFFFAOYSA-N 2-(1-sulfanylethyl)guanidine Chemical compound CC(S)N=C(N)N AZPZDUFVNKSRGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- -1 mono-N-protected guanidino group Chemical group 0.000 claims description 16
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 9
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 claims description 6
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 claims description 6
- CHZAMJVESILJGH-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-cyanoethyl)phosphanyl]propanenitrile Chemical compound N#CCCP(CCC#N)CCC#N CHZAMJVESILJGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 5
- TUQOTMZNTHZOKS-UHFFFAOYSA-N tributylphosphine Chemical compound CCCCP(CCCC)CCCC TUQOTMZNTHZOKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- YICAEXQYKBMDNH-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(3-hydroxypropyl)phosphanyl]propan-1-ol Chemical compound OCCCP(CCCO)CCCO YICAEXQYKBMDNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N Phosphine Chemical compound P XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 claims description 2
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 claims description 2
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 claims description 2
- 229910000073 phosphorus hydride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- HHEYGEJOMQFDFN-UHFFFAOYSA-N 3-(2-cyanoethyldisulfanyl)propanenitrile Chemical compound N#CCCSSCCC#N HHEYGEJOMQFDFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims 1
- 238000010534 nucleophilic substitution reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 9
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 abstract description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 abstract description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 3
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 abstract description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 40
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 36
- 238000007259 addition reaction Methods 0.000 description 23
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 21
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 12
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 9
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 9
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical group N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 6
- 235000021247 β-casein Nutrition 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 239000002585 base Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 1,1-ethanedithiol Chemical compound CC(S)S DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010001441 Phosphopeptides Proteins 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000001597 immobilized metal affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VPXAFUNZRQJIBK-BYPYZUCNSA-N (2r)-2-[2-(diaminomethylideneamino)ethylamino]-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound NC(=N)NCCN[C@@H](CS)C(O)=O VPXAFUNZRQJIBK-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- KEWLVUBYGUZFKX-UHFFFAOYSA-N 2-ethylguanidine Chemical compound CCNC(N)=N KEWLVUBYGUZFKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N O-phosphoryl-L-serine Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 229950006137 dexfosfoserine Drugs 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 3
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- USRGIUJOYOXOQJ-GBXIJSLDSA-N phosphothreonine Chemical compound OP(=O)(O)O[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O USRGIUJOYOXOQJ-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 235000021249 α-casein Nutrition 0.000 description 3
- PAWSVPVNIXFKOS-UHFFFAOYSA-N 2-aminobut-2-enoic acid zwitterion Chemical compound CC=C([NH3+])C([O-])=O PAWSVPVNIXFKOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- UQBOJOOOTLPNST-UHFFFAOYSA-N Dehydroalanine Chemical compound NC(=C)C(O)=O UQBOJOOOTLPNST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 2
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000007068 beta-elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000003495 polar organic solvent Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- ZQXIMYREBUZLPM-UHFFFAOYSA-N 1-aminoethanethiol Chemical compound CC(N)S ZQXIMYREBUZLPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LJGHYPLBDBRCRZ-UHFFFAOYSA-N 3-(3-aminophenyl)sulfonylaniline Chemical compound NC1=CC=CC(S(=O)(=O)C=2C=C(N)C=CC=2)=C1 LJGHYPLBDBRCRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-carboxyethyl)phosphanyl]propanoic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012988 Dithioester Substances 0.000 description 1
- NPTGGVQJYRSMCM-GLLZPBPUSA-N Gln-Gln-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NPTGGVQJYRSMCM-GLLZPBPUSA-N 0.000 description 1
- XXCDTYBVGMPIOA-FXQIFTODSA-N Glu-Asp-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XXCDTYBVGMPIOA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- HNVFSTLPVJWIDV-CIUDSAMLSA-N Glu-Glu-Gln Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O HNVFSTLPVJWIDV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ZYLJULGXQDNXDK-GUBZILKMSA-N Leu-Gln-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ZYLJULGXQDNXDK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- HPBCTWSUJOGJSH-MNXVOIDGSA-N Leu-Glu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O HPBCTWSUJOGJSH-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- 238000006845 Michael addition reaction Methods 0.000 description 1
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- OPEVYHFJXLCCRT-AVGNSLFASA-N Phe-Gln-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O OPEVYHFJXLCCRT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical group OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- SRTCFKGBYBZRHA-ACZMJKKPSA-N Ser-Ala-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SRTCFKGBYBZRHA-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- LGXUZJIQCGXKGZ-QXEWZRGKSA-N Val-Pro-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N LGXUZJIQCGXKGZ-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- GQMNEJMFMCJJTD-NHCYSSNCSA-N Val-Pro-Gln Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O GQMNEJMFMCJJTD-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000004703 alkoxides Chemical class 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 1
- 229940118888 barium cation Drugs 0.000 description 1
- NZMBEOVSCFWSKC-UHFFFAOYSA-N barium(1+) Chemical compound [Ba+] NZMBEOVSCFWSKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003637 basic solution Substances 0.000 description 1
- 238000004850 capillary HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 125000005022 dithioester group Chemical group 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- HHFAWKCIHAUFRX-UHFFFAOYSA-N ethoxide Chemical compound CC[O-] HHFAWKCIHAUFRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 108010085617 glycopeptide alpha-N-acetylgalactosaminidase Proteins 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000035990 intercellular signaling Effects 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000001906 matrix-assisted laser desorption--ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000000074 matrix-assisted laser desorption--ionisation tandem time-of-flight detection Methods 0.000 description 1
- NBTOZLQBSIZIKS-UHFFFAOYSA-N methoxide Chemical compound [O-]C NBTOZLQBSIZIKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 235000003715 nutritional status Nutrition 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000009822 protein phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000010206 sensitivity analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 239000003774 sulfhydryl reagent Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- DUYAAUVXQSMXQP-UHFFFAOYSA-M thioacetate Chemical compound CC([S-])=O DUYAAUVXQSMXQP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 238000001419 two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2440/00—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material
- G01N2440/40—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material addition of nucleotides or derivatives, e.g. adenylation, flavin attachment
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
- G01N2458/15—Non-radioactive isotope labels, e.g. for detection by mass spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2560/00—Chemical aspects of mass spectrometric analysis of biological material
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
본 발명은 1) 인산화 단백질 또는 인산화 펩티드의 하나 이상의 세린 잔기 및/또는 트레오닌 잔기를 탈인산화시키는 제 1단계; 2) 상기 제 1단계의 탈인산화된 아미노산 잔기를 R-L-G의 구조(이 구조 중, R은 탈인산화된 아미노산 부위와 선택적으로 결합하는 친핵성 작용기이고, G는 양이온 형성을 유발시키는 친양성자성 작용기이며, L은 상기 친핵성 작용기와 친양성자성 작용기를 연결시켜 주는 링커임)로 이루어진 펩티드 반응성 표지물질로 표지시키는 제 2단계; 및 3) 상기 제 2단계에서 표지된 단백질 또는 펩티드 유도체를 양이온 질량 분석방법으로 검출하는 제 3단계를 포함하는 인산화 단백질 또는 인산화 펩티드의 질량 분석방법 또는 인산화 위치 분석방법에 있어서, 상기 제 2단계의 표지물질은 구아니디노기를 친양성자성 작용기(G)로 사용하는 것을 특징으로 하는 인산화 단백질 또는 인산화 펩티드의 질량 분석방법 또는 인산화 위치 분석방법 및 상기 분석방법의 표지반응용 표지물질에 관한 것이다. 본 발명의 표지물질을 이용하면 기존의 분석방법에 비해 분석 감도가 뛰어나며, 펩티드 내부의 인산화 위치도 정확하게 분석할 수 있으므로, 단백질의 인산화 상태에 따른 세포 신호전달 과정 등 다양한 단백질의 생체 내에서의 기능에 대한 연구 및 여러 질병의 진단에 유용하게 이용될 수 있다.
Description
도 1은 포스포세린(phosphoserine)(X = H) 및 포스포트레오닌(phosphothreonine)(X=CH3)의 탈인산화를 유발하는 β-이탈 반응(β-elimination) 및 표지물질 부가반응(Michael addition reaction)을 통한 인산화 펩티드의 표지화과정을 나타낸 모식도이고,
도 2a는 서열번호 1로 기재되는 β-카제인(casein) 일인산화 포스포펩티드(monophosphopeptide)(10 p㏖)의 매스 스펙트럼(mass spectrum)이고(이때, 상기 펩티드의 3번째 잔기인 세린이 인산화),
도 2b는 서열번호 1로 기재되는 β-카제인 일인산화 포스포펩티드(1 p㏖)를 탈인산화시키고 표지물질로 표지시킨 시료의 매스 스펙트럼(mass spectrum)이고(이때, 상기 펩티드의 3번째 잔기인 세린이 탈인산화 및 표지화),
도 3은 서열번호 1로 기재되는 β-카제인 일인산화 포스포펩티드를 탈인산화시키고, GET(guanidinoethanethiol)로 표지시킨 시료의 MS/MS 스펙트럼이고(이때, GEC는 상기 GET와 탈인산화된 세린 잔기가 결합하여 생성되는 구아니디노에틸시스테인(guanidinoethylcysteine)을 나타낸다),
도 4은 서열번호 2로 기재되는 α-카제인 일인산화 포스포펩티드를 탈인산화시키고, GET로 표지시킨 시료의 MS/MS 스펙트럼이다(이때, GEC는 상기 GET와 탈인산화된 세린 잔기가 결합하여 생성되는 구아니디노에틸시스테인을 나타낸다).
본 발명은 인산화 단백질의 질량 분석 및 인산화 위치 분석에 사용되는 표지물질에 관한 것으로, 구체적으로는 단백질의 인산화된 아미노산의 위치를 분석하는 방법에 관한 것이다.
단백질은 세포내에서 진행되는 거의 모든 작용에 관여하는 매우 중요한 세포구성 요소이므로, 세포에 존재하는 단백질들에 대한 전반적인 분석과 동정은 세포 및 생물에 있어서 다양한 생명활동을 이해하고, 나아가 새로운 질병치료법을 찾는데 있어서도 매우 중요한 역할을 한다.
일반적으로 단백질들은 생체내에서 수식화(post-translational modification)가 이루어진다. 단백질의 수식화 반응 중에서 가장 대표적인 것이 단백질의 인산화(phosphorylation)이다. 단백질의 인산화는 주로 티로신(tyrosine), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 히스티딘(histidine) 및 리신(lysine) 등의 아미노산 자리에서 일어난다.
단백질의 가역적 인산화는 세포내외간의 신호전달에 있어서 중요한 역할을 담당한다. 세포 신호전달 과정(cell signaling pathway)에 참여하는 많은 단백질들은 키나제(kinase)라는 효소에 의하여 인산화되고, 포스포타제(phosphotase)라는 효소에 의하여 탈인산화된다. 많은 질병이 특정 단백질의 비정상적 인산화/탈인산화와 관련되어 있음이 밝혀지고 있다.
단백질의 인산화 상태에 있어서의 이상(irregularity)에 대한 빠르고 정확한 스크리닝은 세포내 또는 세포간의 신호전달 현상을 이해하는데 크게 도움이 될 것이며, 다양한 질병 상태를 효과적으로 진단할 수 있는 방법의 개발에도 기여할 것이다.
현재, 단백질을 분석할 수 있는 가장 강력한 방법 중의 하나는 연속 매스 스펙트로메트리(tandem mass(MS/MS) spectrometry)로 단백질을 보다 작은 질량의 펩티드(peptide) 상태로 가수 분해한 다음 분석을 수행한다. 그러나, 상기 매스 스펙트로메트리 방법을 이용하여 인산기를 함유한 인산화 펩티드들을 분석하는 경우, 비인산화 펩티드의 분석의 경우에 비하여 몇 가지 문제점이 있다.
첫째, 단백질의 인산화는 통상 가역적으로 일어나고, 이 경우 인산화 가능한 부위는 부분적으로 인산화될 수 있으므로, 단백질 절단 후 생성되는 인산화 펩티드의 양은 비당량적으로 적게 존재하는 경우가 많다. 둘째, 인산화 펩티드는 내부에 존재하는 인산기의 존재로 인하여 펩티드의 분석에서 일반적으로 사용하는 양이온 방식의 질량분석에서 심각한 이온화 억제효과가 있다. 그 결과, 질량분석에 있어서 인산화 펩티드의 검출 감도가 비인산화 펩티드에 비하여 매우 떨어진다. 셋째, 인산기의 화학적 불안정성으로 인하여 인산화 펩티드들의 질량분석 과정 중에 인산기의 부분적 탈인산화가 유발될 수 있다. 이는 인산화 단백질의 질량분석 감도를 떨어뜨릴 수 있고, 매스 스펙트럼의 해석을 복잡하게 하며 MS/MS 서열분석(sequencing)을 이용한 아미노산 서열분석을 불완전하게 하는 결과를 가져온다.
이러한 문제점들을 해결하고자 하는 방법으로 인산기를 β-이탈(elimination)시키는 반응을 이용하는 방법이 있다. 인산기의 β-이탈 반응은 염기성 용매하에서 인산화 펩티드 또는 인산화 단백질의 포스포세린(phosphoserine) 및 포스포트레오닌(phosphothreonine)에 존재하는 인산기를 정량적으로 β-이탈시켜 상기 아미노산 잔기가 각각 디하이드로알라닌(dehydroalanine) 및 β-메틸디하이드로알라닌(β-methyldehydroalanine)으로 변환시키는 반응으로, 질량분석을 하기 전에 시료 펩티드 또는 단백질에서 인산기를 미리 제거하는 것이다. 시료 펩티드 또는 단백질에서 인산기를 제거하게 되면 기존의 인산화 펩티드의 질량분석 과정에서 제기된 문제점, 즉 산성 인산기의 존재로 인한 이온화 억제 및 인산기의 화학적 불안정성에 기인한 부분적 탈인산화 등의 문제점들이 제거될 수 있다. 그러나 이러한 탈인산 화 결과 생성된 펩티드들, 즉 디하이드로알라닌 및 β-메틸디하이드로알라닌은 화학적으로 불안정하기 때문에 의도적으로 적당하게 디자인된 다양한 친핵체(nucleophile)와 부가반응(Michael addition)을 일으켜서 안정화된 펩티드 상태로 변환될 수 있다. 따라서 탈인산화 반응을 통하여 질량분석에 있어서의 인산화 펩티드들이 갖고 있는 문제점들을 해결하는 동시에, 인산화된 아미노산 자리에 특정한 질량수 등 다양한 정보 및 기능을 갖는 표지물질(tag)을 도입시켜 인산화 펩티드의 분석을 용이하게 할 수 있다.
인산기의 β-이탈/ 표지물질의 부가반응을 통하여 도입되는 표지물질(tag)은 부가반응을 잘 일으키는 티올(thiol)기를 포함하며, 일반적으로 중성 작용기 또는 펩티드내에 양이온의 생성을 촉진하는 아민기와 같은 염기성 작용기를 갖도록 선택할 수 있으므로, 기본적으로 인산화 펩티드들의 질량분석 감도를 획기적으로 증가시킬 수 있다. 그 이유는 질량분석 과정에서 쉽게 부분적으로 탈인산화 되는 원래의 인산화 펩티드들과는 달리, 인산기의 β-이탈/표지물질의 부가반응을 통하여 도입된 표지물질을 포함하는 펩티드 유도체는 일반적인 질량분석 조건에서 상대적으로 화학적 안정도가 높아서 MS/MS 실험을 이용하여 보다 양호한 아미노산 서열분석을 가능하게 한다.
인산기의 β-이탈/표지물질의 부가반응의 또 다른 장점은, β-이탈 반응과 부가반응에는 영향을 주지 않으면서 표지된 펩티드의 질량분석에서는 질량차이로 인한 구분이 가능하도록, 안정한 동위원소로 치환된 표지물질(stable isotope coded tag)을 함께 사용함으로써 서로 다른 원천(source)으로부터 얻은 시료들간의 상대적인 정량이 가능하다는 점이다. 즉 안정한 동위원소로 치환된 표지물질은 인산기의 β-이탈/표지물질 부가반응에 있어서 원래의 표지물질과 동일한 반응성을 가지며, 질량분석에 있어서의 분석 감도 또한 차이가 없고, 단지 매스 스펙트럼 상에 기록되는 각 펩티드 유도체들의 질량 값에서만 차이가 나타나므로 시료간의 상대적인 정량을 가능케 한다.
인산기의 β-이탈/표지물질 부가반응에 있어서 또 하나의 중요한 장점은 표지물질에 적당한 친화 상호작용을 갖는 작용기를 도입함으로써, 인산화 펩티드의 표지물질 유도체만을 선택적으로 정제, 농축할 수 있다는 점이다. 그 예로, 오다 등은 에탄디티올(ethanedithiol)을 탈인산화된 펩티드와 비오틴(biotin) 구조를 갖는 리간드 표지물질을 연결하는 링커(linker)로써 사용하였다(Oda, Y. et al., 2001, Nature Biotechnology, 19, 379-382). 에탄디티올을 통하여 인산화 펩티드의 인산화되었던 자리에 연결된 비오틴기와 상호 친화작용하는 스트렙타비딘(streptavidin)을 이용하면 원래 인산화되었던 펩티드들만을 펩티드 시료로부터 선택적으로 분리, 농축할 수 있다. 또한, 링커로 다른 질량의 동위원소로 치환된 에탄디티올을 사용할 경우, 이들 동위원소간의 질량차를 이용하여 서로 다른 원천으로부터 얻은 시료들 간의 상대적인 정량도 가능하다. 이밖에도 다양한 종류의 티올기를 포함하는 친핵체들이 인산화 펩티드 및 단백질들을 표지하기 위하여 사용되었다.
그럼에도 불구하고 종종 생체내에 극미량으로 존재하는 또는 부분적 인산화 에 의하여 비당량적(substoichiometric amount)으로 존재하는 인산화 단백질의 분석 및 인산화 부위의 효과적 분석을 위해서는 보다 개선된 질량분석 방법의 개발이 절실하다.
이에, 본 발명자들은 극미량의 인산화 단백질 및 단백질내의 인산화된 아미노산 위치의 정확한 분석을 위한 새로운 표지물질과 이를 이용한 분석방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 인산화 단백질을 고감도로 분석하고, 단백질내의 인산화 위치를 효율적으로 규명하기 위하여, 인산화된 아미노산 잔기를 선택적으로 표지시킬 수 있는 새로운 표지물질, 상기 표지물질을 이용하여 인산화 단백질의 인산화 아미노산 잔기를 선택적으로 표지시키고 분석하는 방법 및 단백질의 인산화 정도를 상대적으로 정량하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 인산화 단백질 또는 인산화 펩티드의 하나 이상의 세린 잔기 및/또는 트레오닌 잔기를 탈인산화(dephosphorylation)시키는 제 1단계;
2) 상기 제 1단계의 탈인산화된 아미노산 잔기를 R-L-G의 구조(이 구조 중, R은 탈인산화된 아미노산 부위와 선택적으로 결합하는 친핵성 작용기이고, G는 양이온 형성을 유발시키는 친양성자성 작용기이고, L은 상기 친핵성 작용기와 친양성자성 작용기를 연결시켜 주는 링커(linker)임)로 이루어진 펩티드 반응성 표지물질(tag)로 표지시키는 제 2단계; 및
3) 상기 제 2단계에서 표지된 단백질 또는 펩티드 유도체를 양이온 질량 분석방법으로 검출하는 제 3단계를 포함하는 인산화 단백질 또는 인산화 펩티드의 질량 분석방법 또는 인산화 위치 분석방법에 있어서,
상기 제 2단계의 표지물질은 모노-N-보호된 구아니디노기, 디-N-보호된 구아니디노기, N'-보호된 구아니디노기 및 아민이 보호되지 않은 구아니디노기로 구성된 구아니디노기로부터 선택되는 것을 친양성자성 작용기(G)로 사용하는 인산화 단백질 또는 인산화 펩티드의 질량 분석방법 또는 인산화 위치 분석방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 분석방법에서 동위원소로 치환된 표지물질 및 동위원소로 치환되지 않은 표지물질을 서로 다른 원천(source)으로부터 얻은 하나 이상의 펩티드 시료에 각각 표지반응시켜서 분석함으로써, 이들 각 시료들에 존재하는 인산화 펩티드들 간의 상대적인 인산화 정도 또는 인산화 위치를 비교하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 분석 방법에 사용할 수 있는 표지 반응용 표지물질을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
1) 인산화 단백질 또는 인산화 펩티드의 하나 이상의 세린 잔기 및/또는 트레오닌 잔기를 탈인산화(dephosphorylation)시키는 제 1단계;
2) 상기 제 1단계의 탈인산화된 아미노산 잔기를 R-L-G의 구조(이 구조 중, R은 탈인산화된 아미노산 부위와 선택적으로 결합하는 친핵성 작용기이고, G는 양이온 형성을 유발시키는 친양성자성 작용기이며, L은 상기 친핵성 작용기와 친양성자성 작용기를 연결시켜 주는 링커(linker)임)로 이루어진 펩티드 반응성 표지물질(tag)로 표지시키는 제 2단계; 및
3) 상기 제 2단계에서 표지된 단백질 또는 펩티드 유도체를 양이온 질량 분석방법으로 검출하는 제 3단계를 포함하는 인산화 단백질 또는 인산화 펩티드의 질량 분석방법 또는 인산화 위치 분석방법에 있어서,
상기 제 2단계의 표지물질은 모노-N-보호된 구아니디노기, 디-N-보호된 구아니디노기, N'-보호된 구아니디노기 및 아민이 보호되지 않은 구아니디노기로 구성된 구아니디노기로부터 선택되는 것을 친양성자성 작용기(G)로 사용하는 것을 특징으로 하는 인산화 단백질 또는 인산화 펩티드의 질량 분석방법 또는 인산화 위치 분석방법을 제공한다.
본 발명의 분석방법에 있어서, 상기 제 1단계의 분석하고자 하는 인산화 단백질 또는 인산화 펩티드는 장기의 조직, 세포내의 조직 부위에 따라서, 시간 경과에 따라서, 환경 및 영양상태에 따라서, 또는 질병의 유무 및 진행 정도에 따라 각각 다르게 준비하는 것이 바람직하다. 상기 준비된 단백질은 그 크기에 특정한 제한이 없는 바, 올리고펩티드(oligopeptide), 폴리펩티드(polypeptide) 또는 단백질이 모두 가능하다. 상기 단백질은 정제의 편의에 따라, 당업자에게 공지된 방법인 변성(denaturation), 환원(reduction), 시스테인 알킬레이션(cysteine alkylation) 또는 탈당화(deglycosylation)와 같은 시료 전처리 과정을 거칠 수 있다. 또한, 일반적으로 알려진 방법(예; 2D PAGE, 친화 크로마토그래피 등)에 따라 전체 단백질 시료는 부분적으로 분리 또는 정제될 수 있다.
또한, 고분자량의 인산화 단백질들은 상기 기재된 적절한 시료 전처리 후 다양한 단백질 가수분해 효소를 이용하여 보다 작은 분자량의 펩티드 조각으로 가수분해되는 것이 바람직하다. 일반적으로 단백질을 펩티드 조각으로 가수분해시키기 위해서는 리신(lysine)과 아르기닌(arginine)의 아미드(amide) 결합을 절단하는 트립신(trypsin) 또는 리신과 아르기닌 자리만을 절단하는 효소 등을 선택적으로 사용할 수 있다.
상기 제 1단계에 있어서, 상기 탈인산화는 하기 반응식 1로 나타낸 β-이탈 반응을 통하여 수행하는 것이 바람직하다(도 1 참조).
<반응식 1>
상기에서 X가 H인 경우는 세린이고, CH3인 경우에는 트레오닌이다.
β-이탈 반응을 통한 인산화 아미노산 잔기의 탈인산화는 염기성 수용액 또는 수용성 유기용매를 일정량 포함하는 수용액을 이용하여 수행하는 것이 바람직하고, 이들 상기 염기성 수용액은 탈인산화를 유발시킬 수 있는 염기로 다양한 것을 포함할 수 있는데 이중에서, 하이드록시드(hydroxide), 메톡시드(methoxide) 및 에톡시드(ethoxide) 용액과 같은 알콕시드(alkoxide) 염기를 포함하는 것이 보다 바람직하다. 또한, 상기 염기성 반응 조건하에서 의도하지 않은 펩티드의 분해 및 변형을 방지하고 탈인산화 반응을 촉진시키기 위하여, 추가로 반응을 촉매할 수 있는 금속 양이온을 첨가하는 것이 바람직하고, 촉매 역할을 할 수 있는 첨가물로서 상기 금속 양이온은 2족 양이온 것이 더욱 바람직하다. 상기 2족 양이온으로는 Mg2+, Ca2+, Sr2+ 및 Ba2+으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
상기 2족 금속 양이온을 촉매로 사용하게 되면, 반응용액의 온도를 크게 높이지 않고, 지나치게 강하지 않은 염기 조건에서, DMF(dimethylformamide), DMSO(dimethylsulfoxide) 등과 같은 비휘발성 극성 유기용매의 사용 없이도 효과적으로 탈인산화 반응을 진행시킬 수 있다. 또한, 비휘발성 극성 유기용매를 사용하게 되면, 탈인산화 반응 이후에 진행될 표지물질 부가반응 뒤 수행할 수 있는 크로마토그래피를 통한 정제 또는 질량분석 과정에서 번거로운 문제들을 야기할 가능성이 있으므로, 2족 금속 양이온을 이용한 촉매반응으로 진행시키는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 β-이탈 반응을 수행하기 위하여 염기성 용액으로는 NaOH 용액을 사용하였고, 추가적으로 촉매 역할을 하는 2족 양이온 용액으로 BaCl2 용액을 사용하였다.
상기 제 1단계에서 β-이탈 반응에 의하여 인산화 아미노산의 인산기가 제거되므로, 인산화 세린은 디하이드로알라닌(dehydroalanine)으로, 인산화 트레오닌은 β-메틸디하이드로알라닌(β-methyldehydroalanine)으로 변화되게 된다. 상기 인산기가 제거된 부위는 티올(thiol)기를 포함하는 표지물질의 친핵성 작용기(친핵체, nucleophile)에 대하여 좋은 수용체(receptor)로 작용하여, 이후의 부가반응(Michael addition)을 통하여 표지물질로 표지된 단백질 또는 펩티드로 변환된다.
또한, 본 발명의 분석방법에 있어서, 상기 제 2단계의 R-L-G의 구조를 갖는 펩티드 반응성 표지물질로 표지시키는 단계는 하기 반응식 2에 나타난 부가반응으로 진행시키는 것이 바람직하다(도 1 참조).
<반응식 2>
상기에서 X가 H인 경우는 디하이드로알라닌이고, CH3인 경우에는 β-메틸디하이드로알라닌이며, Taq는 표지물질을 나타낸다.
상기 제 2단계에 있어서, 표지물질 부가반응에 사용되는 펩티드 반응성 표지물질(tag)은 탈인산화된 아미노산 부위와 선택적으로 결합하는 친핵성 작용기(R), 양이온 형성을 유발시키는 친양성자성 작용기(G) 및 상기 친핵성 작용기와 친양성자성 작용기를 연결시켜 주는 링커(L)가 연결된 R-L-G의 구조로 이루어진 물질이다. 상기에서 펩티드 반응성 표지물질이라 함은 표지물질이 펩티드와 결합 또는 반응할 수 있음을 나타낸다.
본 발명의 표지물질은 상기 제 1단계의 β-이탈 반응에 의하여 인산화 아미노산의 탈인산화로 생성된 α,β-불포화 구조(α,β-conjugate system) 부위에 부가반응을 잘 일으킬 수 있는 강한 친핵체로 작용할 수 있는 친핵성 작용기(R)를 포함한다. 친핵성 작용기는 강한 친핵성을 나타내는 다양한 작용기를 모두 사용가능하나, 티올(thiol)기를 포함하는 친핵체를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 표지물질에 사용되는 친핵성 작용기인 티올기는 설프히드릴(sulfhydryl)기, 설프히드릴기의 이황체(disulfide) 또는 보호된(protected) 설프히드릴기 상태로 존재할 수 있다.
설프히드릴(sulfhydryl)기는 표지물질에서 바람직한 형태로 다음과 같은 구조식으로 나타낼 수 있다 : HS - 링커 - NHCNH(NH2).
설프히드릴기의 이황체는 표지물질에서 바람직한 형태로 다음과 같은 구조식으로 나타낼 수 있다: (H2N)HNCHN - 링커 - S - S - 링커 - NHCNH(NH2).
이때, 상기 티올기가 일반적으로 시판되는 이황체(disulfide) 상태로 존재하게 될 경우 친핵성이 없기 때문에 부가반응을 위해서는 산화상태의 표지물질을 친핵성이 있는 티올 상태의 표지물질로 환원시켜주어야 한다. 이를 위하여, 본 발명에서는 친핵성이 없는 이황체를 인산화 단백질의 부가반응 직전 또는 부가반응과 함께 환원(reduction)시킴으로써 더 이상의 정제과정 없이 바로 티올 친핵체로 작용하도록 한다. 이때, 사용되는 친핵성이 없는 이황체를 환원시킬 수 있는 환원제는 별다른 제거과정 없이 바로 표지물질과 함께 부가반응에 사용되므로, 부가반응에 부정적인 영향을 미쳐서는 아니된다. 따라서, 유기환원제로 많이 사용되는 티오 계열의 환원제(예를 들면, 에탄디티올(ethanedithiol). 머캅토에탄올(mercaptoethaneol), 디티오트레이톨(dithiothreitol) 등)는 이들 자신이 표지물질과 같은 친핵체로 작용하므로 환원제로 사용되는 것이 바람직하지 아니하다. 대신에 상기 요건을 충족시킬 수 있는 환원제는 트리스(2-시아노에틸)포스핀(tris(2-cyanoethyl)phosphine, TCNEP), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP), 트리스(하이드록시프로필)포스핀(tris(hydroxypropyl)phosphine, THPP) 및 트리부틸포스핀(tributylphosphine, TBP)으로 구성된 군으로부터 선택된 유기 포스핀 계열의 트리알킬포스핀(trialkylphosphine) 제제를 사용하는 것이 바람직하며, 또는 이것이 고분자물질에 고정화된 형태(immobilized form)의 것을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 환원제는 표지물질을 환원시켜 줄뿐만 아니라 계속 이어지는 부가반응 및 분석과정에서의 표지된 펩티드 또는 단백질의 산화를 방지시키는 기능도 한다.
아울러, 상기 이황체 형태의 친핵성 작용기 이외에 친핵체의 티올기 및 구아니디노(guanidino)기가 적절한 보호기(PG1, PG2)에 의하여 보호된 형태의 친핵성 작용기를 갖는 표지물질을 출발물질로 사용할 수도 있다. 보호된 설프히드릴기는 표지물질에서 바람직한 형태로 다음과 같은 구조식으로 나타낼 수 있다: PG1 - S - 링커 - NHCNH(NH) - PG2.
또한, 상기 보호된 설프히드릴기는 상기 제 2단계 직전 또는 동시에 자유(free) 설프히드릴기로 탈보호(deprotection)되는 것이 바람직하고, 상기 설프히드릴기의 탈보호는 염기 가수분해(base hydrolysis) 또는 친핵성 치환(nucleophile displacement)에 의하여 이루어지는 것이 보다 바람직하다.
티올기, 즉 설프히드릴기의 보호기에는 티오 에스터(thio ester), 디티오 에스터(dithio ester), 티오 이써(thio ether) 등이 있을 수 있으며, 특히 티오 에스터의 경우(예, 티오아세테이트(thioacetate))는 부가반응 조건인 염기성 조건에서 미리 탈보호될 수 있으므로, 별도의 활성화 과정 없이도 부가반응에 사용될 수 있는 장점이 있다. 또한, 상기 구조식에서 PG2는 일반적인 구아니디노 보호기로서 염기성에서 불안정한 경우는 부가반응 이전에, 산성조건에서 불안정한 경우는 부가 반응 이후에 탈보호시킬 수 있다.
다음으로, 상기 제 2단계에서 사용한 표지물질을 구성하는 친양성자성 작용기(G)는 양이온 질량분석 과정에서 표지물질이 결합된 단백질 또는 펩티드의 검출강도를 증가시키기 위하여, 양이온 형성을 유발시키는 구아니디노 작용기를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 구아니디노 작용기는 필요에 따라 모노-N-보호된 구아니디노기, 디-N-보호된 구아니디노기 및 N'-보호된 구아니디노기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 아민이 보호되지 않은 구아니딘 -NHCNH(NH2)을 사용하는 것이 가장 바람직하다.
일반적으로 전자쌍 공여자(donor)로 작용하는 아미노기(-NH2)는 양이온의 형성을 용이하게 하며, 따라서 질량분석과정에서 펩티드의 검출감도를 증가시키는 경향이 있다. 최근에 톰슨 등은 아미노에탄티올(aminoethanethiol)을 화학 표지물질로 사용하여 인산화 펩티드를 분석한 바 있다(Thompson, A.J. et al., 2003, Analytical Chemistry, 75, 3232-3243). 또한, 인산화 펩티드가 아닌 C-말단이 리신(lysine)인 일반 비인산화 펩티드를 분석하는데 있어서, 리신의 측쇄(side chain)에 존재하는 아미노기를 화학시약을 사용하여 구아니디노기로 치환함으로써 펩티드의 질량분석 감도를 획기적으로 증가시켰다(Hale, J.E. et al., 2000, Analytical Biochemistry, 287, 110-117).
그러나 본 발명에서는 인산화 펩티드의 인산화 아미노산 자리를 표지하기 위하여 구아니디노기가 미리 도입된 표지물질을 사용함으로써, 이 표지물질로 표지된 펩티드의 양이온화 경향이 극대화되도록 하고, 이에 따라 이들 펩티드들의 질량분석 감도 또한 크게 증가되도록 하는 것이 큰 특징이다.
또한, 강한 친핵체로 작용하는 티올기와 강한 친양성자성 작용기인 구아니디노기는 적당한 크기 및 구조를 갖는 링커(linker, L)로 서로 연결되어지는 것이 바람직하다. 상기 링커는 다양한 구조를 포함할 수 있으나, 기본적으로 하이드로카본(hydrocarbon), 에틸렌 옥시드(ethylene oxide), 펩티드(peptide) 등의 기본골격을 포함할 수 있으며, 표지된 펩티드들의 분리, 분석 기법에 따라 다양하게 선택할 수 있다.
또한, 친양자성 작용기인 구아니디노기와 연결된 링커 부분은 인산화 펩티드의 상대적 정량을 위하여, 안정한 동위원소(stable isotope)로 표지물질을 치환시킬 수 있는 공간을 확보하여 준다. 예를 들면, 동위원소적으로 치환된 부분을 포함하는 링커로 표지물질을 구성함으로써 화학적 차이 없이 오직 표지물질의 질량 차이에 기인된 매스 스펙트럼 상의 일정한 질량차를 나타낼 수 있으므로, 인산화 단백질의 상대정량을 용이하게 해준다. 안정한 동위원소로는 2H, 13C, 15N, 17O, 18O 및 34S로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 인산화 펩티드에 대한 고감도 질량분석을 위해서는 링커의 크기(질량)는 너무 크지 않아야 하며, 부가반응에 입체적 크기 방해요소(steric factor) 등의 부정적 작용이 적어야하며, 부가반응 등의 반응조건 및 질량분석 조건에서 화학적으로 안정하여야 한다.
본 발명의 분석 방법에 있어서, 가장 특징이 되는 점은 상기 제 2단계의 표지물질로 모노-N-보호된 구아니디노기, 디-N-보호된 구아니디노기, N'-보호된 구아니디노기 및 아민이 보호되지 않은 구아니디노기로 구성된 구아니디노기로부터 선택되는 친양성자성 작용기(G)인 것을 특징으로 하는 표지물질을 사용하는 것이다. 상기 표지물질은 구아니디노알칸티올(guanidinoalkanethiol) 또는 구아니디노에탄티올(guanidinoethanthiol)을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 표지물질은 상기 표지물질을 직접 합성하거나 구입하여 사용하여도 되고, 상기 표지물질의 전구체를 사용하여 환원반응 또는 탈보호반응을 수행해 제조한 표지물질을 사용하여도 무방하다. 상기 표지물질의 전구체로는 구아니디노알칸디설피드(guanidinoalkanedisulfide) 또는 구아니디노알킬 티오에스테르(guanidinoalkyl thioester, 예를 들면 알킬-CO-S-(CH2)nNHCNH(NH2) 또는 아릴-CO-S-(CH2)nNHCNH(NH2))인 것이 바람직하다. 본 발명의 표지물질로는 구아니디노에탄티올(GET)을 사용하는 것이 보다 바람직하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 전구체로 구아니디노에탄디설피드(guanidinoethanedisulfide, GEDS)를 반응용액상에서 환원제로 환원시킨후 제조된 구아니디노에탄티올(GET)을 표지물질로 사용하였다. 상기 구아니디노에탄티올의 티올기는 일반적인 티올 시약과 유사하게 공기에 노출되었을 경우, 쉽게 구아니디노에탄디설피드(guanidinoethanedisulfide, GEDS)로 산화된다.
본 발명의 방법에서 사용된 인산화된 펩티드의 표지를 위하여 사용된 표지물질을 포함한 시약들은 표지반응 후 별도의 제거과정 없이 질량분석을 수행할 수 있고, 필요에 따라 다양한 크로마토그래피법으로 정제 후 분석을 진행할 수도 있다. 표지물질을 포함한 표지반응에 사용된 시약들은 무기물이거나 극성이 크고 수용성이므로, 예를 들면 역상 크로마토그래피법에 근거한 다양한 분석기법들을 이용하면 펩티드로부터 쉽게 표지물질을 포함한 과량의 반응시약들을 제거할 수 있다.
또한, 본 발명의 분석방법에 있어서, 탈인산화된 펩티드에 대한 표지물질의 부가반응은 탈인산화 반응과 동일조건하에서도 잘 진행되므로, 탈인산화 반응(제 1단계)과 동시에 탈인산화된 펩티드에 대한 표지물질의 부가반응(제 2단계)을 진행시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 분석방법에 있어서, 상기 제 3단계의 표지물질로 표지된 펩티드를 검출하는 단계는 널리 알려진 크로마토그래피 및 질량분석 방법을 이용하여 분석하는 것이 바람직하다. 이때, 비교하고자하는 각각의 서로 다른 시료에 화학적으로는 동일하지만 오직 질량수에서만 차이가 나는 안정한 동위원소로 치환된 표지물질(stable isotopically labelled tag)을 사용하여 시료 각각을 표지시킨 다음, 두 시료를 합친 후 질량분석을 수행하면 일정한 질량차이를 갖는 쌍으로 나타나는 피크(peak)들을 얻을 수 있고, 이들 피크들의 강도(intensity)로부터 각각의 시료에 존재하는 인산화 펩티드를 상대적으로 정량할 수도 있다.
인산화 단백질을 효소를 사용하여 가수분해를 수행하면 인산화된 펩티드들은 인산화 아미노산 잔기가 없는 일반 펩티드들과의 혼합물로서 존재하게 된다. 이러한 상태 자체로도 표지화 반응을 수행할 수도 있으나, 분석 데이터의 복잡성을 줄이는 등의 분석필요에 따라 인산화된 펩티드들로부터 고정화된 금속친화 크래마토그래피(immobilized metal affinity chromatography, IMAC) 등과 같은 다양한 방법에 의하여 비인산화된 펩티드들을 제거한 후 인산화 펩티드들만을 가지고 표지화반응을 수행할 수 있다. 상기 방법은 인산화 단백질에 대한 분석과정에 있어서 질량분석을 수행하기 전에 적용할 수 있으며, 종래의 펩티드의 분리, 정제 및 분석에 적용되는 크로마토그래피법, 친화 농축법(affinity enrichment), 매스 분석(mass analysis), MS/MS 펩티드 서열분석(peptide sequencing) 등의 다양한 기법들과 함께 연계하여 활용된다.
화학 태그에 비오틴(biotin) 등과 같은 특정 친화 상호 작용을 할 수 있는 작용기를 도입한다면 태그로 표지된 펩티드만을 선택적으로 분리, 농축할 수도 있다. 태그에 형광 염색제(fluorescent dye)를 도입한 형광태그를 이용하면 표지된 펩티드의 고감도 분광학적 검출 및 정량이 가능하다.
인산화 펩티드의 인산기를 제거하고 그 자리에 양이온화를 촉진시킬 수 있는 능력이 있는 작용기를 포함한 화학태그를 도입함으로써, 산성의 인산기에 기인되어 양이온 질량분석 과정에서 나타나던 시료의 이온화 억제효과에 의한 분석 감도 저하 현상이 극복되었으며, 더 나아가 특정한 질량수의 변화로부터 인산화 위치 분석도 용이하게 할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 분석방법에서 동위원소로 치환된 표지물질 및 동위원소로 치환되지 않은 표지물질을 서로 다른 원천(source)으로부터 얻은 하나 이상의 펩티드 시료에 각각 표지반응시켜서 분석함으로써, 이들 각 시료들에 존재하는 인산화 펩티드들 간의 상대적인 인산화 정도 또는 인산화 위치를 비교하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 서로 다른 원천(source)으로부터 얻은 시료 사이의 정량적 비교 또는 서로 다른 발현 상태를 갖는 시료간의 상대적 정량 등에 유용하게 응용될 수 있다. 즉, 각각 서로 다른 질량수를 갖는 안정한 동위원소로 치환된 태그를 이용하여 서로 다른 두 시료를 각각 펩티드 표지시킨 후 두 시료를 섞은 다음 합쳐진 시료에 대하여 질량분석 등을 수행함으로써 서로 다른 장기 조직간의, 서로 다른 세포 내부의 조직 부위간의, 발현 시간의 경과에 따른, 서로 다른 환경 또는 영양 상태에 따른, 질병의 유무 및 진행 상태에 따른 단백질의 수식화 상태의 차이점을 상대적으로 정량할 수 있다. 화학적 차이 없이 오직 태그의 질량 차이에 기인된 질량 스펙트럼상의 차이만을 유도해 줄 수 있는 동위원소들로는 2H, 13C, 15N, 17O, 그리고 34S 등을 예로 들 수 있으며, 이들 서로 다른 동위원소로 치환된 표지물질들은 태그의 구조에 따라 일정한 질량차를 보여주게 된다.
따라서 본 발명의 분석방법은 서로 다른 장기조직, 서로 다른 세포내 하위 구조체에 있어서, 발현 시간의 경과에 따른, 서로 다른 환경 또는 영양 상태에 따른, 질병의 유무 및 진행 상태에 따른 단백질의 수식화 정도의 차이점을 추적하는데 응용될 수 있다. 또한, 본 발명의 분석방법은 단백질의 인산화 상태에 영향을 미치는 물질을 동정하기 위한 연구에도 적용할 수 있고, 그에 따라 다양한 질병의 진단 및 치료제 개발 연구에 응용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 분석 방법에 사용할 수 있는 표지 반응용 표지물질을 제공한다.
본 발명의 표지 반응용 표지물질은 구아니디노알칸티올 또는 구아니디노에탄티올을 사용하는 것이 바람직하고, 상기 표지물질의 전구체인 구아니디노알칸디설 피드 또는 구아니디노알킬 티오에스테르를 사용하여 환원반응 또는 탈보호반응을 수행해 제조한 표지물질을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 표지물질은 구아니디노에탄티올인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에서 제조한 표지물질 시약 및 이를 이용한 인산화 단백질의 인산화 위치 분석방법은 다양한 단백질에 있어서 인산화 상태를 파악하는데 효과적으로 사용될 수 있다. 특히 불안정한 인산기를 제거하고 대신 상대적으로 안정하고 양이온 질량분석에서의 감도를 증가시킬 수 있는 표지물질을 도입시켰기 때문에 표지된 펩티드의 MS/MS 서열분석을 용이하게 할 뿐 아니라, 질량분석 감도도 크게 증가시켜 준다. 또한, 표지물질의 도입으로 인한 인산화 펩티드에 있어서의 특징적 질량의 변화는 비인산화 펩티드로부터 인산화 펩티드를 용이하게 구별할 수 있게 하여 준다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 시료 제조
분석하고자 하는 표준 단백질 또는 단백질 추출물은 정제의 편의에 따라 잘 알려진 방법에 따라 시료 전처리 과정을 거쳤다. 구체적으로, 단백질 시료는 6M 구아니딘 하이드로클로라이드(guanidine hydrochloride)에서 변성화(denaturation)시키고, TCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine)ㆍHCl을 가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 시스테인(cysteine) 자리의 이황화 결합(disulfide bond)을 환원시켰다. 또한, 단백질에 존재할 수 있는 O-연결된 올리고사카라이드(O-linked oligosaccharide)는 염기성의 표지반응 조건에서 인산기와 같이 베타-이탈화 반응을 일으킬 수 있으므로, O-글리카나제(O-glycanase) 등을 사용하여 표지반응 전에 미리 제거시켰다. 그러나, 본 발명에서 표준 단백질로 사용한 서열번호 1로 기재되는 베타-카제인(β casein)의 경우 O-연결된 올리고사카라이드가 존재함에도 불구하고 최적화된 표지반응 조건에서 O-연결된 올리고사카라이드의 이탈화 부반응은 관찰되지 않았다. 환원된 시스테인 자리는 아이오도아세트아미드(iodoacetamide) 등의 알킬화 시약을 사용하여 보호(blocking)시키거나 또는 퍼포믹산(performic acid)을 사용하여 산화시켰다. 과량으로 사용된 시약은 젤 여과(gel filtration) 또는 투석(dialysis) 등의 방법으로 제거하고, 트립신(trypsin) 등의 가수분해 효소를 사용하여 단백질을 절단하였다(digestion). 바륨(barium) 양이온을 촉매로 사용하고 하이드록시드(hydroxide) 이온을 염기로 사용하여 표지반응을 수행하였다. 또한, 표지반응을 수행하기 전에 고정된 금속 친화 크로마토그래피(immobilized metal affinity chromatography, IMAC) 방법으로 인산화 펩티드들만을 농축한 다음 표지반응을 수행할 수도 있다.
<실시예 2> 표지화 반응
구아니디오에탄티올(guanidinoethanethiol, 이하 “GET"라 약칭함) 20 μmol을 증류수 30 ㎕에 녹여서 표지시약 용액을 준비하였다. 또는, 표지시약으로써 GET의 이황(disulfide) 전구체를 사용할 경우에는 GEDSㆍ2HCl (guanidinoethanedisulfide 2hydrochloride) 10 μmol을 증류수 10 ㎕에 녹인 후 TCNEP(tris(2-cyanoethyl)phosphine)(500 mM) 20 ㎕를 가하고 45℃에서 약 30분 동안 방치하여 전구체를 활성화시킨 후 표지시약 용액으로 사용하였다. 상기 실시예 1에서 전처리한 단백질 시료를 진공 건조한 시료 펩티드(약 20 ㎍)를 증류수 13 ㎕에 녹인 후 이를 상기에서 준비한 표지시약 용액 43 ㎕와 혼합하였다. 상기 혼합된 용액에 5.0 N NaOH 용액 6 ㎕, 1.0 M BaCl2 용액 2 ㎕를 계속하여 가하고 45℃에서 약 2 내지 3시간 동안 반응시켰다. 상기 반응용액의 온도를 5℃ 이하로 냉각하고 1.0% 초산 수용액을 가하여 중화시켰다. 0.1% 초산 또는 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid) 수용액으로 적절히 희석하여 펩티드의 분석을 진행하였다.
<실시예 3> GET(구아니디노에탄티올)-표지된 펩티드의 분석
액체크로마토그래피/매트릭스 보조 레이져 탈착 이온화 질량 분석법(Liquid chromatography/The matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry, 이하 “LC/MALDI MS”라 약칭함) 및 액체크로마토그래피/전자분무 이온화 질량 분석법(Liquid chromatography/The electrospray ionization mass spectrometry, LC/ESI MS) 등은 표지된 펩티드들의 분석에 매우 유용하다. 표지반 응에 사용된 모든 시료들은 작은 분자량의 극성이 매우 큰 유기물질이거나 무기염들이므로 역상 크로마토그래피 방법을 용하여 표지된 펩티드 시료들을 정제할 수 있으며, 이어서 펩티드 유도체들을 농도기울기 용출(gradient elution)하여 바로 ESI 질량분석기로 도입하여 질량분석을 수행하거나, 또는 MALDI 시료 플레이트에 연속적으로 로딩(loading)함으로써 질량분석(mass spectrometry, MS) 및 MS/MS 분석을 수행할 수 있다. 시료의 정제 및 분리를 위하여 LC 패킹사의 LC Packings Probot을 LC Packing Ultimate micro-capillary HPLC system에 연결하였으며, 시료를 연속적으로 MALDI 플레이트에 로딩하였다. 그리고 난 후, AB 4700 프로테오믹스 분석기(AB 4700 Proteomics Analyzer)(Applied Biosystems, Framingham, MA, USA)를 사용하여 MALDI TOF/TOF(time-of-flight/time-of-flight) 질량분석을 수행하였다.
그 결과, 서열번호 1로 기재되는 인산화 단백질 베타 카제인(β-casein)을 트립신으로 가수분해한 후 얻은 인산화 펩티드(FQSPEEQQQTEDELQDK, SP는 인산화 세린(phosphoserine)을 나타낸다)를 GET-TAG로 표지한 경우(도 2b, m/z 2083.0002 피크)는 GET-TAG로 표지하지 않은 펩티드(도 2a, m/z 2062.0083 피크)에 비하여 질량수가 21만큼 증가하여 검출되었다. 따라서, 이러한 특정한 펩티드의 질량 값의 변화는 비인산화 펩티드들로부터 인산화 펩티드들을 구별하는데 매우 유용함을 알 수 있었다.
또한, 인산화 펩티드에 대하여 표지화 반응을 수행하지 않고 10 pmol의 시료를 사용하여 분석한 것(도 2a)과, 표지화 반응 후 1 pmol의 시료를 사용하여 분석한 것(도 2b)을 비교한 결과 표지화 반응을 수행하여 분석한 경우가 더 적은 시료를 사용하여 분석하였음에도 불구하고 피크의 강도는 매우 크게 증가하였다. 이를 통해 본 발명의 분석방법은 펩티드에 대한 검출감도를 크게 증가시켜줌을 알 수 있었다.
또한, 인산화 세린이 표지화 반응에 의하여 구아니디노에틸시스테인(guanidinoethylcysteine, 이하 “GEC”라 약칭함)으로 바뀜에 따라 GEC의 단편이온(fragment ion)에 해당하는 m/z 188.0의 질량차이 만큼의 b2 피크와 b3 피크 간격을 나타냄을 확인하였다(도 3). 따라서, MS/MS 분석법을 통해 펩티드 내부의 인산화 위치를 손쉽게 규명할 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 다른 인산화 단백질인 서열번호 2로 기재되는 알파 카제인의 인산화 펩티드(VPQLEIVPNSPAEER)를 MS/MS 분석한 결과, GEC의 단편이온에 해당하는 m/z 188.0의 질량차이 만큼의 y4 피크와 y5 피크 간격을 나타냄을 확인하였다(도 4
).
이상의 예에서 볼 수 있듯이 본 발명을 통하여 개발된 새로운 표지물질 및 그의 표지화 방법은 인산화 펩티드의 고감도 분석과, 펩티드 내부의 인산화 아미노산 자리의 정확히 규명에 매우 유용한 방법임을 알 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 분석 방법 및 이에 사용된 표지물질은 생체내의 단백질의 인산화 상태 및 인산화 정도를 효과적으로 분석하는데 유용하며, 다양한 질병의 진단 및 치료제 개발 등에 응용될 수 있으며, 단백질의 생체 내에서의 역할 등을 좀더 이해하는데 기여할 수 있다.
<110> KOREA BASIC SCIENCE INSTITUTE
<120> Selective labeling agent for phosphoproteome analysis and
phosphorylated site analysis
<130> 3p-12-05
<160> 2
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> fragment of beta-casein
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)
<223> PHOSPHORYLATION,
<400> 1
Phe Gln Ser Glu Glu Gln Gln Gln Thr Glu Asp Glu Leu Gln Asp Lys
1 5 10 15
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> fragment of alpha-casein
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)
<223> PHOSPHORYLATION,
<400> 2
Val Pro Gln Leu Glu Ile Val Pro Asn Ser Ala Glu Glu Arg
1 5 10
Claims (18)
1) 인산화 단백질 또는 인산화 펩티드의 세린 잔기 및 트레오닌 잔기 중의 어느 한쪽의 잔기 또는 양쪽 모두의 잔기를 탈인산화(dephosphorylation)시키는 제 1단계;
2) 상기 제 1단계의 탈인산화된 아미노산 잔기를 R-L-G의 구조(이 구조 중, R은 탈인산화된 아미노산 부위와 선택적으로 결합하는 친핵성 작용기이고, G는 양이온 형성을 유발시키는 친양성자성 작용기이며, L은 상기 친핵성 작용기와 친양성자성 작용기를 연결시켜 주는 링커(linker)임)로 이루어진 펩티드 반응성 표지물질(tag)로 표지시키는 제 2단계; 및
3) 상기 제 2단계에서 표지된 단백질 또는 펩티드 유도체를 질량 분석방법으로 검출하는 제 3단계를 포함하는 인산화 단백질 또는 인산화 펩티드의 질량 분석방법에 있어서,
상기 제 2단계의 표지물질은 모노-N-보호된 구아니디노기, 디-N-보호된 구아니디노기, N'-보호된 구아니디노기 및 아민이 보호되지 않은 구아니디노기로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 친양성자성 작용기(G)로 사용하는 것을 특징으로 하는 인산화 단백질 또는 인산화 펩티드의 질량 분석방법.
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 상기 제 2단계의 표지물질의 친핵성 작용기(R)는 설프히드릴(sulfhydryl)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서, 설프히드릴기는 탈인산화 아미노산 잔기에 대한 표지반응 직전에 또는 표지반응 중에, 설프히드릴기의 이황체를 트리스(2-시아노에틸)포스핀(tris(2-cyanoethyl)phosphine, TCNEP), 트리스(2-카복시에틸)포스핀(tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP), 트리스(하이드록시프로필)포스핀(tris(hydroxypropyl)phosphine, THPP) 및 트리뷰틸포스핀(tributylphosphine, TBP)으로 구성된 군으로부터 선택되는 트리알킬포스핀(trialkylphosphine) 제제로 환원시킴으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서, 설프히드릴기는 탈인산화 아미노산 잔기에 대한 표지반응 직전에 또는 표지반응 중에, 보호된 설프히드릴기를 염기 가수분해 또는 친핵성 치환에 의해 탈보호시킴으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 제 2단계의 표지물질의 링커(linker, L)는 하이드로카본(hydrocarbon), 에틸렌 옥시드(ethylene oxide) 또는 펩티드(peptide)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 기본골격으로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 제 3단계의 표지된 단백질은 질량 분석을 수행하기 전에 효소적 방법 또는 화학적 방법으로 표지된 펩티드로 가수분해되어 분석되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항의 분석방법에서, 표지물질을 추가로 2H, 13C, 15N, 17O, 18O 및 34S로 구성된 군으로부터 선택되는 동위원소로 치환시킴으로써, 상기 동위원소로 치환되지 않은 표지물질과 상기 동위원소로 치환한 표지물질 각각을 시료에 각각 표지반응시킨 후, 표지화된 두 시료를 합쳐서 질량분석을 수행하는 방법.
제 1항의 인산화 단백질 또는 인산화 펩티드의 질량 분석방법에서의 표지화에 이용되는 표지물질에 있어서,
상기 표지물질은 구아니디노알칸티올인 것을 특징으로 하는 표지물질.
제 10항에 있어서, 상기 구아니디노알칸티올은 구아니디노에탄티올인 것을 특징으로 하는 표지물질.
제 10항에 있어서, 상기 구아니디노알칸티올은 구아니디노알칸디설피드 또는 구아니디노알킬 티오에스테르로 구성되는 표지물질의 전구체로부터 환원 반응 또는 탈보호 반응에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 표지물질.
제 1항에 있어서, 상기 표지물질은 구아니디노알칸티올인 것을 특징으로 하는 방법.
제 13항에 있어서, 상기 구아니디노알칸티올은 구아니디노에탄티올인 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서, 상기 구아니디노알칸티올은 구아니디노알칸디설피드 또는 구아니디노알킬 티오에스테르로 구성되는 표지물질의 전구체로부터 환원 반응 또는 탈보호 반응에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9항에 있어서, 상기 표지물질은 구아니디노알칸티올인 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 상기 구아니디노알칸티올은 구아니디노에탄티올인 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 상기 구아니디노알칸티올은 구아니디노알칸디설피드 또는 구아니디노알킬 티오에스테르로 구성되는 표지물질의 전구체로부터 환원 반응 또는 탈보호 반응에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020040008046A KR100693111B1 (ko) | 2004-02-06 | 2004-02-06 | 인산화 단백질의 질량 분석 및 인산화 위치 분석용 표지물질 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020040008046A KR100693111B1 (ko) | 2004-02-06 | 2004-02-06 | 인산화 단백질의 질량 분석 및 인산화 위치 분석용 표지물질 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20050079558A KR20050079558A (ko) | 2005-08-10 |
| KR100693111B1 true KR100693111B1 (ko) | 2007-03-12 |
Family
ID=37266477
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020040008046A KR100693111B1 (ko) | 2004-02-06 | 2004-02-06 | 인산화 단백질의 질량 분석 및 인산화 위치 분석용 표지물질 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100693111B1 (ko) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100560127B1 (ko) * | 2004-09-04 | 2006-03-13 | 한국기초과학지원연구원 | 인산화 단백질 분석용 겔-내 표지화 및 겔-내 단리 방법및 이를 이용한 단백질의 인산화 위치 동정 방법 |
| CN110609078B (zh) * | 2019-09-20 | 2022-03-11 | 南京谱利健生物技术有限公司 | 一种检测蛋白磷酸化和乙酰氨基葡萄糖化关联作用的方法 |
-
2004
- 2004-02-06 KR KR1020040008046A patent/KR100693111B1/ko not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20050079558A (ko) | 2005-08-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1425586B1 (en) | Mass labels | |
| JP4300029B2 (ja) | ゲルフリー定性及び定量的プロテオーム分析のための方法及び装置、ならびにその使用 | |
| US20020168644A1 (en) | Methods for isolation and labeling of sample molecules | |
| AU2003249692A1 (en) | Methods for quantitative proteome analysis of glycoproteins | |
| KR101081053B1 (ko) | 가변질량 라벨링제와 이를 이용한 아미노산 서열 및 단백질정량 동시 분석방법 | |
| US20110028330A1 (en) | Compounds and methods for the labelling and affinity-selection of proteins | |
| Zahedi et al. | Phosphoproteomics of human platelets: A quest for novel activation pathways | |
| JP4271687B2 (ja) | リン酸化タンパク質の質量分析及びリン酸化位置分析用標識物質 | |
| Schmidt et al. | Enhanced detection and identification of multiply phosphorylated peptides using TiO2 enrichment in combination with MALDI TOF/TOF MS | |
| JP4659040B2 (ja) | リン酸化タンパク質分析用ゲル内標識化及びゲル内単離方法及びそれを利用したタンパク質のリン酸化位置同定方法 | |
| US20050221413A1 (en) | Sulfenyl compound, labeling reagent, and method of analyzing peptide | |
| KR100693111B1 (ko) | 인산화 단백질의 질량 분석 및 인산화 위치 분석용 표지물질 | |
| EP1267170A1 (en) | Method for characterising polypeptides | |
| US20040106150A1 (en) | Inverse labeling method for the rapid identification of marker/target proteins | |
| EP2108654A1 (en) | Selective enrichment of n-terminally modified peptides from complex samples | |
| EP1916526A1 (en) | Method for diagnostic and therapeutic target discovery by combining isotopic and isobaric labels | |
| US20090053817A1 (en) | Fixed charge reagents | |
| Buchowiecka | Modified cysteine S-phosphopeptide standards for mass spectrometry-based proteomics | |
| García-Murria et al. | Simple chemical tools to expand the range of proteomics applications | |
| US7402407B1 (en) | Chemically targeted positional identification of post-translationally phosphorylated peptides | |
| AU2002331952B2 (en) | Mass labels | |
| AU2003232742A1 (en) | Solid-phase assisted spectroscopic and spectrometric analysis of complex biopolymer mixtures | |
| AU2002331952A1 (en) | Mass labels |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20040206 |
|
| PA0201 | Request for examination | ||
| PG1501 | Laying open of application | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20050823 Patent event code: PE09021S01D |
|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20060120 Patent event code: PE09021S01D |
|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20060728 Patent event code: PE09021S01D |
|
| E90F | Notification of reason for final refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Final Notice of Reason for Refusal Patent event date: 20061127 Patent event code: PE09021S02D |
|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| PE0701 | Decision of registration |
Patent event code: PE07011S01D Comment text: Decision to Grant Registration Patent event date: 20061221 |
|
| GRNT | Written decision to grant | ||
| PR0701 | Registration of establishment |
Comment text: Registration of Establishment Patent event date: 20070305 Patent event code: PR07011E01D |
|
| PR1002 | Payment of registration fee |
Payment date: 20070306 End annual number: 3 Start annual number: 1 |
|
| PG1601 | Publication of registration | ||
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20100305 Start annual number: 4 End annual number: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20110307 Year of fee payment: 5 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20110307 Start annual number: 5 End annual number: 5 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee | ||
| PC1903 | Unpaid annual fee |