JP4271687B2 - リン酸化タンパク質の質量分析及びリン酸化位置分析用標識物質 - Google Patents
リン酸化タンパク質の質量分析及びリン酸化位置分析用標識物質 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4271687B2 JP4271687B2 JP2005518451A JP2005518451A JP4271687B2 JP 4271687 B2 JP4271687 B2 JP 4271687B2 JP 2005518451 A JP2005518451 A JP 2005518451A JP 2005518451 A JP2005518451 A JP 2005518451A JP 4271687 B2 JP4271687 B2 JP 4271687B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- phosphorylated
- peptide
- labeling
- mass spectrometry
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 238000002372 labelling Methods 0.000 title claims description 124
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims description 102
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims description 55
- 108091005981 phosphorylated proteins Proteins 0.000 title claims description 31
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 title claims description 30
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 title claims description 30
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 115
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 57
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 43
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims abstract description 28
- -1 mono-N-protected guanidino group Chemical group 0.000 claims abstract description 23
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 125000002795 guanidino group Chemical group C(N)(=N)N* 0.000 claims abstract description 14
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 34
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 24
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 20
- AZPZDUFVNKSRGI-UHFFFAOYSA-N 2-(1-sulfanylethyl)guanidine Chemical compound CC(S)N=C(N)N AZPZDUFVNKSRGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 16
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 claims description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 9
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 8
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 7
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 5
- CHZAMJVESILJGH-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-cyanoethyl)phosphanyl]propanenitrile Chemical compound N#CCCP(CCC#N)CCC#N CHZAMJVESILJGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 4
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 claims description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 4
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 4
- YICAEXQYKBMDNH-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(3-hydroxypropyl)phosphanyl]propan-1-ol Chemical compound OCCCP(CCCO)CCCO YICAEXQYKBMDNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 3
- TUQOTMZNTHZOKS-UHFFFAOYSA-N tributylphosphine Chemical compound CCCCP(CCCC)CCCC TUQOTMZNTHZOKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 claims description 2
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 2
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 claims description 2
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 3
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 claims 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims 1
- 238000010534 nucleophilic substitution reaction Methods 0.000 claims 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 28
- 108010001441 Phosphopeptides Proteins 0.000 abstract description 7
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine group Chemical group NC(=N)N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 abstract description 5
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 abstract description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 40
- 238000007259 addition reaction Methods 0.000 description 26
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 22
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 11
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 10
- 238000007068 beta-elimination reaction Methods 0.000 description 9
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 8
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 8
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical group N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 235000021247 β-casein Nutrition 0.000 description 6
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 1,1-ethanedithiol Chemical compound CC(S)S DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 239000002585 base Substances 0.000 description 4
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000001597 immobilized metal affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 4
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 4
- VPXAFUNZRQJIBK-BYPYZUCNSA-N (2r)-2-[2-(diaminomethylideneamino)ethylamino]-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound NC(=N)NCCN[C@@H](CS)C(O)=O VPXAFUNZRQJIBK-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 238000006845 Michael addition reaction Methods 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 3
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 3
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 3
- USRGIUJOYOXOQJ-GBXIJSLDSA-N phosphothreonine Chemical compound OP(=O)(O)O[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O USRGIUJOYOXOQJ-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- 230000009822 protein phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N O-phosphoryl-L-serine Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N Phosphine Chemical compound P XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 229950006137 dexfosfoserine Drugs 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 108010085617 glycopeptide alpha-N-acetylgalactosaminidase Proteins 0.000 description 2
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000003495 polar organic solvent Substances 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- 235000021249 α-casein Nutrition 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZQXIMYREBUZLPM-UHFFFAOYSA-N 1-aminoethanethiol Chemical compound CC(N)S ZQXIMYREBUZLPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWSVPVNIXFKOS-UHFFFAOYSA-N 2-aminobut-2-enoic acid zwitterion Chemical compound CC=C([NH3+])C([O-])=O PAWSVPVNIXFKOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LJGHYPLBDBRCRZ-UHFFFAOYSA-N 3-(3-aminophenyl)sulfonylaniline Chemical compound NC1=CC=CC(S(=O)(=O)C=2C=C(N)C=CC=2)=C1 LJGHYPLBDBRCRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 0 CCCNC(*C)C1O[C@@]1C Chemical compound CCCNC(*C)C1O[C@@]1C 0.000 description 1
- UQBOJOOOTLPNST-UHFFFAOYSA-N Dehydroalanine Chemical compound NC(=C)C(O)=O UQBOJOOOTLPNST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012988 Dithioester Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000004703 alkoxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002152 alkylating effect Effects 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 229940118888 barium cation Drugs 0.000 description 1
- NZMBEOVSCFWSKC-UHFFFAOYSA-N barium(1+) Chemical compound [Ba+] NZMBEOVSCFWSKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003637 basic solution Substances 0.000 description 1
- 238000004850 capillary HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000006477 desulfuration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000023556 desulfurization Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005022 dithioester group Chemical group 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- HHFAWKCIHAUFRX-UHFFFAOYSA-N ethoxide Chemical compound CC[O-] HHFAWKCIHAUFRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035990 intercellular signaling Effects 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000001906 matrix-assisted laser desorption--ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000000074 matrix-assisted laser desorption--ionisation tandem time-of-flight detection Methods 0.000 description 1
- NBTOZLQBSIZIKS-UHFFFAOYSA-N methoxide Chemical compound [O-]C NBTOZLQBSIZIKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229910000073 phosphorus hydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000003774 sulfhydryl reagent Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- DUYAAUVXQSMXQP-UHFFFAOYSA-M thioacetate Chemical compound CC([S-])=O DUYAAUVXQSMXQP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 238000001419 two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/13—Amines
- A61K31/155—Amidines (), e.g. guanidine (H2N—C(=NH)—NH2), isourea (N=C(OH)—NH2), isothiourea (—N=C(SH)—NH2)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
- G01N2458/15—Non-radioactive isotope labels, e.g. for detection by mass spectrometry
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、リン酸化タンパク質の質量分析及びリン酸化位置分析に使用される標識物質に関するもので、詳細には、タンパク質のリン酸化されたアミノ酸の位置を分析する方法に関するものである。
タンパク質は、細胞内で進行するほとんど全ての作用に関与する非常に重要な細胞構成要素であるため、細胞に存在するタンパク質に対する全般的な分析と動静は、細胞及び生物における様々な生命活動を理解し、さらに、新しい疾病治療法を求めるにおいても非常に重要な役割を果たす。
一般的にタンパク質は、生体内で翻訳後修飾(post-translational modification)が行われる。タンパク質の翻訳後修飾反応の中で、最も代表的なものがタンパク質のリン酸化(phosphorylation)である。タンパク質のリン酸化は、主にチロシン(tyrosine)、セリン(serine)、スレオニン(threonine)、ヒスチジン(histidine)及びリジン(lysine)等のアミノ酸の位置で行われる。
タンパク質の可逆的リン酸化は、細胞内外間のシグナル伝達において重要な役割を担当する。細胞シグナル伝達経路(cell signaling pathway)に関わる多くのタンパク質は、キナーゼ(kinase)という酵素によってリン酸化され、ホスファターゼ(phosphatase)という酵素によって脱リン酸化される。多くの疾病が特定タンパク質の非正常的リン酸化/脱リン酸化と関連していることが証明されている。
タンパク質のリン酸化状態においての異常(irregularity)に対する迅速で正確なスクリーニングは、細胞内または細胞間のシグナル伝達事象を理解するのに大きく役立ち、様々な疾病状態を効果的に診断できる方法の開発にも寄与すると考えられる。
現在、タンパク質を分析できる最も強力な方法の中の一つは、タンデムマススぺクトロメトリー(tandem mass(MS/MS) spectrometry)で、タンパク質をより小さい質量のペプチド状態に加水分解した後、分析を実施する。しかし、前記マススぺクトロメトリー法を利用してリン酸基を含有したリン酸化ペプチドを分析する場合、非リン酸化ペプチドの分析の場合に比べて幾つかの問題点がある。
第1に、タンパク質のリン酸化は通常可逆的に行われ、この場合、リン酸化可能な部位は部分的にリン酸化されるため、タンパク質切断後に生成されるリン酸化ペプチドの量は 非当量的に少なく存在する場合が多い。第2に、リン酸化ペプチドは内部に存在するリン酸基の存在により、ペプチドの分析で一般的に使用する陽イオン方式の質量分析で深刻なイオン化抑制効果がある。その結果、質量分析においてリン酸化ペプチドの検出感度が非リン酸化ペプチドに比べて非常に劣る。第3に、リン酸基の化学的不安定性により、リン酸化ペプチドの質量分析過程中にリン酸基の部分的脱リン酸化が誘発され得る。これは、リン酸化タンパク質の質量分析感度を劣下させ、マススペクトルの解析を複雑にし、MS/MS配列分析(sequencing)を利用したアミノ酸配列分析を不完全にする結果をもたらす。
このような問題点を解決する方法として、リン酸基をβ離脱(elimination)させる反応を利用する方法がある。リン酸基のβ離脱反応は、塩基性溶媒下でリン酸化ペプチドまたはリン酸化タンパク質のホスホセリン(phosphoserine)及びホスホスレオニン(phosphothreonine)に存在するリン酸基を定量的にβ離脱させ、前記アミノ酸残基が各々ジヒドロアラニン(dehydroalanine)及びβ-メチルジヒドロアラニン(β-methyldehydroalanine)に変換させる反応で、質量分析をする前に試料ペプチドまたはタンパク質でリン酸基を予め除去することである。試料ペプチドまたはタンパク質でリン酸基を除去すると、既存のリン酸化ペプチドの質量分析過程で提起された問題点、即ち酸性リン酸基の存在によるイオン化抑制及びリン酸基の化学的不安定性に起因した部分的脱リン酸化等の問題点を解決することができる。しかし、このような脱リン酸化の結果、生成されたペプチド、即ちジヒドロアラニン及びβ-メチルジヒドロアラニンは化学的に不安定であるため、意図的に適当にデザインされた様々な求核剤(nucleophile)と付加反応(Michael addition)を起こして安定化されたペプチド状態に変換させることができる。したがって、脱リン酸化反応を通じて、質量分析におけるリン酸化ペプチドが有する問題点を解決すると同時に、リン酸化されたアミノ酸位に特定の質量数等多様な情報及び機能を有する標識物質(tag)を導入してリン酸化ペプチドの分析を容易にできる。
リン酸基のβ離脱/標識物質の付加反応を通じて導入される標識物質(tag)は、付加反応をよく起こすチオール基を含み、一般的に中性作用基またはペプチド内に陽イオンの生成を促進するアミン基のような塩基性作用基を有するように選択できるため、基本的にリン酸化ペプチドの質量分析感度を画期的に増加させることができる。その理由は、質量分析過程で簡単に部分的に脱リン酸化される従来のリン酸化ペプチドとは異なり、リン酸基のβ離脱/標識物質の付加反応を通じて導入された標識物質を含むペプチド誘導体は、一般的な質量分析条件で相対的に化学的安定度が高くてMS/MS実験を利用してより良好なアミノ酸配列分析を可能にする。
リン酸基のβ離脱/標識物質の付加反応のもう一つの長所は、β離脱反応と付加反応には影響を与えないで、標識されたペプチドの質量分析では質量差による区分ができるように、安定した同位元素で置換された標識物質(stable isotope coded tag)を共に使用することにより、互いに異なる源(source)から得た試料間の相対的な定量が可能であるという点である。即ち、安定した同位元素で置換された標識物質は、リン酸基のβ離脱/標識物質付加反応において本来の標識物質と同一の反応性を有し、質量分析においての分析感度も差がない。但し、マススペクトル上に記録される各ペプチド誘導体の質量値においてのみ差が表れるため、試料間の相対的な定量を可能にする。
リン酸基のβ離脱/標識物質付加反応におけるもう一つの重要な長所は、標識物質に適当な親和相互作用を有する作用基を導入することにより、リン酸化ペプチドの標識物質誘導体だけを選択的に精製、濃縮できるという点である。その例として、オダらは、エタンジチオール(ethanedithiol)を、脱リン酸化されたペプチドとビオチン(biotin)構造を有するリガンド標識物質を連結するリンカー(linker)として使用した(非特許文献1)。エタンジチオールを通じてリン酸化ペプチドのリン酸化された位置に連結されたビオチン基と相互親和作用するストレプトアビジン(streptavidin)を利用すると、本来リン酸化されていたペプチドだけをペプチド試料から選択的に分離、濃縮できる。また、リンカーに異なる質量の同位元素で置換されたエタンジチオールを使用する場合、これらの同位元素間の質量差を利用して互いに異なる源(source)から得た試料間の相対的な定量も可能である。その以外にも様々な種類のチオール基を含む求核剤がリン酸化ペプチド及びタンパク質を標識するため使用された。
それにも関わらず、時々生体内に極微量で存在する、または部分的リン酸化によって非当量的(substoichiometric amount)に存在するリン酸化タンパク質の分析及びリン酸化部位の効果的分析のためには、より改善された質量分析方法の開発が必要である。
それで、本発明者らは、極微量のリン酸化タンパク質及びタンパク質内のリン酸化されたアミノ酸位置の正確な分析のため、新しい標識物質とそれを利用した分析方法を開発することによって本発明を完成した。
Oda,Y.ら、Nature Biotechnology、2001年、第19巻、379-382頁
Oda,Y.ら、Nature Biotechnology、2001年、第19巻、379-382頁
本発明の目的は、リン酸化タンパク質を高感度で分析し、タンパク質内のリン酸化位置を効率的に解明するため、リン酸化されたアミノ酸残基を選択的に標識することができる新しい標識物質、前記標識物質を利用してリン酸化タンパク質のリン酸化アミノ酸残基を選択的に標識して分析する方法及びタンパク質のリン酸化程度を相対的に定量する方法を提供することである。
前記目的を達成するため、本発明は
1)リン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの一つ以上のセリン残基及び/またはスレオニン残基を脱リン酸化(dephosphorylation)する工程;
2)前記工程1の脱リン酸化されたアミノ酸残基をR-L-Gの構造からなるペプチド反応性標識物質(tag)で標識する工程であって、Rは脱リン酸化されたアミノ酸部位と選択的に結合する親核性作用基、Gは陽イオン形成を誘発させる親陽性子性作用基、Lは前記親核性作用基と親陽性子性作用基とを連結させるリンカー(linker)である、工程;及び
3)工程2で標識されたタンパク質またはペプチド誘導体を陽イオン質量分析方法で検出する工程
を含むリン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの質量分析方法またはリン酸化位置分析方法であって、
前記工程2の標識物質に、モノ-N-保護グアニジノ基、ジ-N-保護グアニジノ基、N'-保護グアニジノ基及びアミンが保護されていないグアニジノ基からなる群より選択される基を親陽性子性作用基(G)として使用する、リン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの質量分析方法またはリン酸化位置分析方法を提供する。
1)リン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの一つ以上のセリン残基及び/またはスレオニン残基を脱リン酸化(dephosphorylation)する工程;
2)前記工程1の脱リン酸化されたアミノ酸残基をR-L-Gの構造からなるペプチド反応性標識物質(tag)で標識する工程であって、Rは脱リン酸化されたアミノ酸部位と選択的に結合する親核性作用基、Gは陽イオン形成を誘発させる親陽性子性作用基、Lは前記親核性作用基と親陽性子性作用基とを連結させるリンカー(linker)である、工程;及び
3)工程2で標識されたタンパク質またはペプチド誘導体を陽イオン質量分析方法で検出する工程
を含むリン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの質量分析方法またはリン酸化位置分析方法であって、
前記工程2の標識物質に、モノ-N-保護グアニジノ基、ジ-N-保護グアニジノ基、N'-保護グアニジノ基及びアミンが保護されていないグアニジノ基からなる群より選択される基を親陽性子性作用基(G)として使用する、リン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの質量分析方法またはリン酸化位置分析方法を提供する。
また、本発明は、前記分析方法において同位元素で置換された標識物質及び同位元素で置換されていない標識物質を、互いに異なる源(source)から得た一つ以上のペプチド試料に、各々標識反応させて分析することにより、これらの各試料に存在するリン酸化ペプチド間の相対的なリン酸化程度またはリン酸化位置を比較する方法を提供する。
また、本発明は、前記分析方法に使用できる標識反応用標識物質を提供する。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、
1)リン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの一つ以上のセリン残基及び/またはスレオニン残基を脱リン酸化(dephosphorylation)する工程;
2)前記工程1の脱リン酸化されたアミノ酸残基をR-L-Gの構造からなるペプチド反応性標識物質(tag)で標識する工程であって、Rは脱リン酸化されたアミノ酸部位と選択的に結合する親核性作用基、Gは陽イオン形成を誘発させる親陽性子性作用基、Lは前記親核性作用基と親陽性子性作用基とを連結させるリンカー(linker)である、工程;及び
3)工程2で標識されたタンパク質またはペプチド誘導体を陽イオン質量分析方法で検出する工程
を含むリン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの質量分析方法またはリン酸化位置分析方法であって、
前記工程2の標識物質に、モノ-N-保護グアニジノ基、ジ-N-保護グアニジノ基、N'-保護グアニジノ基及びアミンが保護されていないグアニジノ基からなる群より選択される基を親陽性子性作用基(G)として使用することを特徴とするリン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの質量分析方法またはリン酸化位置分析方法を提供する。
1)リン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの一つ以上のセリン残基及び/またはスレオニン残基を脱リン酸化(dephosphorylation)する工程;
2)前記工程1の脱リン酸化されたアミノ酸残基をR-L-Gの構造からなるペプチド反応性標識物質(tag)で標識する工程であって、Rは脱リン酸化されたアミノ酸部位と選択的に結合する親核性作用基、Gは陽イオン形成を誘発させる親陽性子性作用基、Lは前記親核性作用基と親陽性子性作用基とを連結させるリンカー(linker)である、工程;及び
3)工程2で標識されたタンパク質またはペプチド誘導体を陽イオン質量分析方法で検出する工程
を含むリン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの質量分析方法またはリン酸化位置分析方法であって、
前記工程2の標識物質に、モノ-N-保護グアニジノ基、ジ-N-保護グアニジノ基、N'-保護グアニジノ基及びアミンが保護されていないグアニジノ基からなる群より選択される基を親陽性子性作用基(G)として使用することを特徴とするリン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの質量分析方法またはリン酸化位置分析方法を提供する。
本発明の分析方法において、前記工程1の分析しようとするリン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドは、臓器の組織、細胞内の組織部位、時間の経過、環境及び栄養状態によって、または疾病の有無及び進行程度によって、各々別に準備することが好ましい。前記準備されたタンパク質は、その大きさに特定の制限がないため、オリゴペプチド(oligopeptide)、ポリペプチド(polypeptide)またはタンパク質がすべて可能である。前記タンパク質は精製の便宜によって、当業者に公知の方法である変性(denaturation)、還元(reduction)、システインアルキル化(cysteine alkylation)または脱糖化(deglycosylation)のような試料前処理過程を経ることができる。また、一般的に知られた方法(例;2D PAGE、アフィニティークロマトグラフィー等)によって全体タンパク質試料は、部分的に分離または精製することができる。
また、高分子量のリン酸化タンパク質は、前記記載された適切な試料前処理後、多様なタンパク質加水分解酵素を利用してより小さい分子量のペプチドに加水分解することが好ましい。一般的にタンパク質をペプチドに加水分解するためには、リジン(lysine)とアルギニン(arginine)のアミド(amide)結合を切断するトリプシン(trypsin)またはリジンとアルギニン位置だけを切断する酵素等を選択的に使用できる。
前記工程1において、前記脱リン酸化は、下記スキーム1で示したβ離脱反応を通じて実施することが好ましい(図1参照)。
式中、XがHである場合はセリンであり、CH3である場合にはスレオニンである。
β離脱反応を通じたリン酸化アミノ酸残基の脱リン酸化は、塩基性水溶液または水溶性有機溶媒を一定量含む水溶液を利用して実施することが好ましく、前記塩基性水溶液は、脱リン酸化を誘発させることができる塩基として多様なものを含む。この中で、ヒドロキシド(hydroxide)、メトキシド(methoxide)及びエトキシド(ethoxide)溶液のようなアルコキシド(alkoxide)塩基を含むことがより好ましい。また、前記塩基性反応条件下で意図しないペプチドの分解及び変形を防止し、脱リン酸化反応を促進させるため、追加に反応を触媒できる金属陽イオンを添加することが好ましく、触媒の役割をする添加物として前記金属陽イオンは、第2族陽イオンがより好ましい。前記第2族陽イオンとしては、Mg2+、Ca2+、Sr2+及びBa2+からなる群より選択することが好ましい。
前記第2族金属陽イオンを触媒として使用すると、反応溶液の温度を大きく高めず、強すぎない塩基条件で、DMF(ジメチルホルムアミド)、DMSO(ジメチルスルホキシド)等のような非揮発性極性有機溶媒を使用しなくても、効果的に脱リン酸化反応を進行させることができる。また、非揮発性極性有機溶媒を使用すると、脱リン酸化反応以後に進行される標識物質付加反応の後に実施できるクロマトグラフィーを通じた精製または質量分析過程で、複雑な問題を引き起こす可能性があるため、第2族金属陽イオンを利用した触媒反応で進行させることが好ましい。本発明の好ましい実施例では、β離脱反応を実施するため、塩基性溶液としてはNaOH溶液を使用し、追加的に触媒の役割をする第2族陽イオン溶液としてBaCl2溶液を使用した。
工程1でβ離脱反応によってリン酸化アミノ酸のリン酸基が除去されるため、リン酸化セリンはジヒドロアラニンに、リン酸化スレオニンはβ-メチルジヒドロアラニンに変化する。前記リン酸基が除去された部位は、チオール基を含む標識物質の親核性作用基(求核剤)に対して良好な受容体(receptor)として作用し、以後の付加反応(Michael addition)を通じて、標識物質で標識されたタンパク質またはペプチドに変換される。
また、本発明の分析方法において、前記工程2のR-L-Gの構造を有するペプチド反応性標識物質で標識させる工程は、下記のスキーム2に示した付加反応で進行させるのが好ましい(図1参照)。
式中、XがHである場合はジヒドロアラニンであり、CH3である場合にはβ-メチルジヒドロアラニンであり、Tagは標識物質を示す。
前記工程2において、標識物質付加反応に使用するペプチド反応性標識物質(tag)は、脱リン酸化されたアミノ酸部位と選択的に結合する親核性作用基(R)、陽イオン形成を誘発させる親陽性子性作用基(G)及び前記親核性作用基と親陽性子性作用基とを連結させるリンカー(L)が連結されたR-L-Gの構造からなる物質である。前記でペプチド反応性標識物質というのは、標識物質がペプチドと結合または反応できることを示す。
本発明の標識物質は、工程1のβ-離脱反応によってリン酸化アミノ酸の脱リン酸化で生成されたα,β共役系(α,β-conjugate system)部位に付加反応をよく引き起こす強い求核剤として作用できる親核性作用基(R)を含む。親核性作用基は、強い親核性を示す多様な作用基をすべて使用できるが、チオール基を含む求核剤を使用するのが好ましい。本発明の標識物質に使用される親核性作用基であるチオール基は、スルフヒドリル(sulfhydryl)基、スルフヒドリル基の二硫化物(disulfide)または保護(protected)スルフヒドリル基状態で存在できる。
スルフヒドリル(sulfhydryl)基は、標識物質の好ましい形態として次のような構造式で示される:HS-リンカー-NHCNH(NH2)。
スルフヒドリル基の二硫化物は、標識物質の好ましい形態として次のような構造式で示される:(H2N)HNCHN-リンカー-S-S-リンカー-NHCNH(NH2)。
ここで、前記チオール基が一般的に市販される二硫化物(disulfide)状態で存在する場合は親核性がないため、付加反応のためには酸化状態の標識物質を、親核性を有するチオール状態の標識物質に還元させなければならない。このため、本発明では親核性を有しない二硫化物を、リン酸化タンパク質の付加反応直前または付加反応と共に還元させることにより、それ以上の精製過程を行わずに、直ちにチオール求核剤として作用するようにする。ここで、使用する親核性を有しない二硫化物を還元させることができる還元剤は、特別な除去過程なく、そのまま標識物質と共に付加反応に使用するため、付加反応に否定的な影響を及ばしてはならない。したがって、有機還元剤として多く使用されるチオール系の還元剤(例えば、エタンジチオール(ethanedithiol)、メルカプトエタノール(mercaptoethanol)、ジチオスレイトール(dithiothreitol)等)は、これら自体が標識物質のような求核剤として作用するため、還元剤として使用するのは好ましくない。その代わりに、前記要件を満たす還元剤は、トリス(2-シアノエチル)ホスフィン(tris(2-cyanoethyl)phosphine,TCNEP)、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(tris(2-carboxyethyl)phosphine,TCEP)、トリス(ヒドロキシプロピル)ホスフィン(tris(hydroxypropyl)phosphine,THPP)及びトリブチルホスフィン(tributylphosphine,TBP)からなる群より選択された有機ホスフィン系のトリアルキルホスフィン(trialkylphosphine)製剤を使用するのが好ましく、または、これが高分子物質に固定された形態(immobilized form)のものを使用するのが好ましい。また、前記還元剤は、標識物質を還元させるだけではなく、続けて起こる付加反応及び分析過程での標識されたペプチドまたはタンパク質の酸化を防止する機能もする。
さらに、前記二硫化物形態の親核性作用基以外に求核剤のチオール基及びグアニジノ(guanidino)基が、適切な保護基(PG1、PG2)によって保護された形態の親核性作用基を有する標識物質を出発物質として使用することもできる。保護スルフヒドリル基は、標識物質に好ましい形態として次の構造式で示される:PG1-S-リンカー-NHCNH(NH)-PG2。
また、前記保護スルフヒドリル基は、工程2直前または同時に遊離(free)スルフヒドリル基で脱保護されることが好ましく、前記スルフヒドリル基の脱保護は、塩基加水分解(base hydrolysis)または親核性置換(nucleophile displacement)によって行なうことがさらに好ましい。
チオール基、即ちスルフヒドリル基の保護基には、チオエステル(thio ester)、ジチオエステル(dithio ester)、チオエーテル(thio ether)等があり得る。特にチオエステルの場合(例、チオアセテート(thioacetate))は、付加反応条件である塩基性条件で予め脱保護(deprotection)される可能性があるため、別途の活性化過程なしでも付加反応に使用できる長所がある。また、前記構造式でPG2は一般的なグアニジノ(guanidino)保護基として、塩基性で不安定な場合は付加反応前に、酸性条件で不安定な場合は付加反応後に脱保護させることができる。
次に、前記工程2で使用した標識物質を構成する親陽性子性作用基(G)は、陽イオン質量分析過程で標識物質が結合したタンパク質またはペプチドの検出感度を増加させるため、陽イオン形成を誘発させるグアニジノ作用基を使用するのが好ましい。前記グアニジノ作用基は、必要に応じてモノ-N-保護グアニジノ基、ジ-N-保護グアニジノ基及びN'-保護グアニジノ基からなる群より選択することができ、アミンが保護されていないグアニジン(guanidine, -NHCNH(NH2)を使用するのが最も好ましい。
一般的に電子供与体(donor)として作用するアミノ基(-NH2)は、陽イオンの形成を容易にする。したがって、質量分析過程でペプチドの検出感度を増加させる傾向がある。最近、トンプソンらは、アミノエタンチオール(aminoethanethiol)を化学標識物質として使用してリン酸化ペプチドを分析した(Thompson,A.J.ら、Analytical Chemistry、2003年、第75巻、3232-3243頁)。また、リン酸化ペプチドではないC末端がリジン(lysine)である一般非リン酸化ペプチドを分析するのに、リジンの側鎖(side chain)に存在するアミノ基を化学試薬を使用してグアニジノ基に置換することにより、ペプチドの質量分析感度を画期的に増加させた(Hale,J.E.ら、Analytical Biochemistry、2000年、第２８７巻、110-117頁)。
しかし、本発明では、リン酸化ペプチドのリン酸化アミノ酸位を標識するため、グアニジノ基が予め導入された標識物質を使用することにより、この標識物質で標識されたペプチドの陽イオン化傾向が極大化されるようにし、これによってこのペプチドの質量分析感度も大きく増加されるようにするのが大きい特徴である。
また、強い求核剤として作用するチオール基と強い親陽性子性作用基であるグアニジノ基は、適当な大きさ及び構造を有するリンカー(linker, L)で互いに連結することが好ましい。前記リンカーは、多様な構造を含むことができるが、基本的に炭化水素(hydrocarbon)、エチレンオキシド(ethylene oxide)、ペプチド(peptide)等の基本骨格を含み、標識されたペプチドの分離、分析技法によって多様に選択できる。
また、親陽子性作用基であるグアニジノ基と連結されたリンカー部分は、リン酸化ペプチドの相対的定量のため、安定した同位元素(stable isotope)で標識物質を置換させる空間を確保してくれる。例えば、同位元素的に置換された部分を含むリンカーで標識物質を構成することにより、化学的な差がなく、ただ標識物質の質量差に起因したマススペクトル上の一定の質量差を示すことができるため、リン酸化タンパク質の相対定量を容易にする。安定した同位元素としては、2H、13C、15N、17O、18O及び34Sからなる群より選択されるものを使用するのが好ましい。リン酸化ペプチドに対する高感度質量分析のためには、リンカーの大きさ(質量)は大きすぎてはならず、付加反応に立体因子(steric factor)等の否定的作用が少なく、付加反応等の反応条件及び質量分析条件で化学的に安定していなければならない。
本発明の分析方法において、最大の特徴は、前記工程2の標識物質にモノ-N-保護グアニジノ基、ジ-N-保護グアニジノ基、N'-保護グアニジノ基及びアミンが保護されていないグアニジノ基で構成されたグアニジノ基から選択される親陽性子性作用基(G)であることを特徴とする標識物質を使用することである。前記標識物質は、グアニジノアルカンチオール(guanidinoalkanethiol)またはグアニジノエタンチオール(guanidinoethanthiol)を使用するのが好ましい。本発明の標識物質は、前記標識物質を直接合成するか購入して使用してもよく、前記標識物質の前駆体を使用して還元反応または脱保護反応を実施して製造した標識物質を使用しても構わない。前記標識物質の前駆体としては、グアニジノアルカンジスルフィド(guanidinoalkanedisulfide)またはグアニジノアルキルチオエステル(guanidinoalkyl thioester、例えば、アルキル-CO-S-(CH2)nNHCNH(NH2)またはアリール-CO-S-(CH2)nNHCNH(NH2))であるのが好ましい。本発明の標識物質としては、グアニジノエタンチオール(GET)を使用するのがより好ましい。本発明の好ましい実施例では、前駆体としてグアニジノエタンジスルフィド(guanidinoethanedisulfide, GEDS)を反応溶液上で還元剤で還元させた後、製造されたグアニジノエタンチオール(GET)を標識物質に使用した。前記グアニジノエタンチオールのチオール基は、一般的なチオール試薬と同様、空気に露出した場合、簡単にグアニジノエタンジスルフィド(guanidinoethanedisulfide, GEDS)に酸化される。
本発明の方法で使用したリン酸化されたペプチドの標識のため使用した標識物質を含む試薬は、標識反応後に別途の除去過程なしに質量分析を実施でき、必要に応じて多様なクロマトグラフィーで精製後分析を進行することもできる。標識物質を含む標識反応に使用した試薬は、無機物であるか極性が大きくて水溶性であるため、例えば、逆相クロマトグラフィーに基づいた多様な分析技法を利用すると、ペプチドから簡単に標識物質を含む過剰量の反応試薬を除去できる。
また、本発明の分析方法において、脱リン酸化されたペプチドに対する標識物質の付加反応は、脱リン酸化反応と同一の条件下でも良好に進行されるため、脱リン酸化反応(工程1)と同時に脱リン酸化されたペプチドに対する標識物質の付加反応(工程2)を進行させるのが好ましい。
本発明の分析方法において、前記工程3の標識物質で標識されたペプチドを検出する工程は、公知のクロマトグラフィー及び質量分析方法を利用して分析するのが好ましい。ここで、比較しようとする各々の互いに異なる試料に化学的には同一であるが、ただ質量数だけが異なる安定した同位元素で置換された標識物質(stable isotopically labelled tag)を使用して試料各々を標識した後、両試料を合わせて質量分析を実施すると、一定の質量差を有する対で表れるピーク(peak)を得られ、このピークの強度(intensity)から各々の試料に存在するリン酸化ペプチドを相対的に定量することもできる。
リン酸化タンパク質を酵素を使用して加水分解を実施すると、リン酸化ペプチドは、リン酸化アミノ酸残基がない一般ペプチドとの混合物として存在するようになる。このような状態でも標識化反応を実施することもできるが、分析データの複雑性を減らす等の必要に応じて、リン酸化ペプチドから固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(immobilized metal affinity chromatography, IMAC)等のような多様な方法によって非リン酸化されたペプチドを除去した後、リン酸化ペプチドだけで標識化反応を実施することができる。前記方法は、リン酸化タンパク質に対する分析過程において質量分析を実施する前に適用され、従来のペプチドの分離、精製及び分析に適用されるクロマトグラフィー、アフィニティー濃縮法(affinity enrichment)、質量分析(mass analysis)、MS/MSペプチド配列分析(peptide sequencing)等の多様な技法と共に活用される。
化学Tagにビオチン(biotin)等のような特定親和相互作用ができる作用基を導入すると、Tagで標識されたペプチドだけを選択的に分離、濃縮できる。Tagに蛍光染色剤(fluorescent dye)を導入した蛍光Tagを利用すると、標識されたペプチドの高感度分光学的検出及び定量も可能である。
リン酸化ペプチドのリン酸基を除去してその位置に陽イオン化を促進できる能力がある作用基を含んだ化学Tagを導入することにより、酸性のリン酸基に起因して陽イオン質量分析過程で表れる試料のイオン化抑制効果による分析感度低下現状が克服され、さらに特定の質量数の変化からリン酸化位置分析も容易にできる。
また、本発明は、前記分析方法で同位元素で置換された標識物質及び同位元素で置換されていない標識物質を、互いに異なる源(source)から得た一つ以上のペプチド試料に各々標識反応させて分析することにより、これらの各試料に存在するリン酸化ペプチド間の相対的なリン酸化程度またはリン酸化位置を比較する方法を提供する。
本発明の方法は、互いに異なる源(source)がら得た試料間の定量的比較または互いに異なる発現状態を有する試料間の相対的定量等に有用に応用することができる。即ち、各々互いに異なる質量数を有する安定した同位元素で置換されたTagを利用し、互いに異なる二つの試料を各々ペプチド標識させた後、二つの試料を混ぜて合わせた試料に対して質量分析等を実施することにより、互いに異なる臓器組織間の、互いに異なる細胞内部の組織部位間の、発現時間の経過による、互いに異なる環境または栄養状態による、疾病の有無及び進行状態によるタンパク質の翻訳後修飾状態の差異を相対的に定量できる。化学的な差がなく単にTagの質量差に起因した質量スペクトル上の差のみを誘導できる同位元素の例としては、2H、13C、15N、17O、また34S等が挙げられ、これらの互いに異なる同位元素で置換された標識物質は、Tagの構造によって一定の質量差を示す。
したがって、本発明の分析方法は、互いに異なる臓器組織、互いに異なる細胞内下位構造体において、発現時間の経過による、互いに異なる環境または栄養状態による、疾病の有無及び進行状態による、タンパク質の翻訳後修飾の程度の差異を追跡するのに応用できる。また、本発明の分析方法は、タンパク質のリン酸化状態に影響を及ぼす物質を同定するための研究にも適用でき、それによって多様な疾病の診断及び治療剤開発研究に応用できる。
また、本発明は、前記分析方法に使用できる標識反応用標識物質を提供する。
本発明の標識反応用標識物質は、グアニジノアルカンチオールまたはグアニジノエタンチオールを使用するのが好ましく、前記標識物質の前駆体であるグアニジノアルカンジスルフィドまたはグアニジノアルキルチオエステルを使用して還元反応または脱保護反応を実施して製造した標識物質を使用するのが好ましい。本発明の標識物質は、グアニジノエタンチオールがより好ましい。
本発明で製造した標識物質試薬及びそれを利用したリン酸化タンパク質のリン酸化位置分析方法は、多様なタンパク質においてリン酸化状態を把握するのに効果的に使用できる。特に、不安定なリン酸基を除去する代わりに、相対的に安定して陽イオン質量分析での感度を増加させることができる標識物質を導入させたため、標識されたペプチドのMS/MS配列分析を容易にするのみならず、質量分析感度も大きく増加させる。また、標識物質の導入によるリン酸化ペプチドにおける特徴的な質量の変化は、非リン酸化ペプチドからリン酸化ペプチドを容易に区別できるようにする。
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。但し、下記実施例は、本発明の例示にすぎず、本発明は下記実施例に限定されない。
<実施例1> 試料調製
分析しようとする標準タンパク質またはタンパク質抽出物は、精製の便宜のため公知の方法によって試料前処理過程を経た。詳細には、タンパク質試料は、6M塩酸グアニジン(guanidine hydrochloride)で変性(denaturation)させ、TCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine)・HClを加えて37℃で1時間反応させてシステイン(cysteine)位置の二硫化物結合(disulfide bonde)を還元させた。また、タンパク質に存在できるO-連結オリゴ糖(O-linked oligosaccharide)は、塩基性の標識反応条件でリン酸基のようにβ離脱化反応を起こすことができるため、O-グリカナーゼ(O-glycanase)等を使用して標識反応前に予め除去した。しかし、本発明で標準タンパク質として使用した配列番号:1に記載されるβ-カゼイン(β-casein)の場合、O-連結オリゴ糖が存在するにも関わらず、最適化された標識反応条件でO-連結オリゴ糖の離脱化副反応は観察されなかった。還元されたシステインの位置は、ヨードアセトアミド(iodoacetamide)等のアルキル化試薬を使用して保護(blocking)するかまたは過ギ酸(performic acid)を使用して酸化させた。使用した過剰量の試薬は、ゲル濾過(gel filtration)または透析(dialysis)等の方法で除去し、トリプシン(trypsin)等の加水分解酵素を使用してタンパク質を切断した(digestion)。バリウム(barium)陽イオンを触媒に使用してヒドロキシド(hydroxide)イオンを塩基として使用して標識反応を実施した。また、標識反応を実施する前に、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(immobilized metal affinity chromatography, IMAC)方法でリン酸化ペプチドだけを濃縮した後、標識反応を実施することもできる。
分析しようとする標準タンパク質またはタンパク質抽出物は、精製の便宜のため公知の方法によって試料前処理過程を経た。詳細には、タンパク質試料は、6M塩酸グアニジン(guanidine hydrochloride)で変性(denaturation)させ、TCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine)・HClを加えて37℃で1時間反応させてシステイン(cysteine)位置の二硫化物結合(disulfide bonde)を還元させた。また、タンパク質に存在できるO-連結オリゴ糖(O-linked oligosaccharide)は、塩基性の標識反応条件でリン酸基のようにβ離脱化反応を起こすことができるため、O-グリカナーゼ(O-glycanase)等を使用して標識反応前に予め除去した。しかし、本発明で標準タンパク質として使用した配列番号:1に記載されるβ-カゼイン(β-casein)の場合、O-連結オリゴ糖が存在するにも関わらず、最適化された標識反応条件でO-連結オリゴ糖の離脱化副反応は観察されなかった。還元されたシステインの位置は、ヨードアセトアミド(iodoacetamide)等のアルキル化試薬を使用して保護(blocking)するかまたは過ギ酸(performic acid)を使用して酸化させた。使用した過剰量の試薬は、ゲル濾過(gel filtration)または透析(dialysis)等の方法で除去し、トリプシン(trypsin)等の加水分解酵素を使用してタンパク質を切断した(digestion)。バリウム(barium)陽イオンを触媒に使用してヒドロキシド(hydroxide)イオンを塩基として使用して標識反応を実施した。また、標識反応を実施する前に、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(immobilized metal affinity chromatography, IMAC)方法でリン酸化ペプチドだけを濃縮した後、標識反応を実施することもできる。
<実施例2> 標識化反応
グアニジノエタンチオール(guanidinoethanethiol、以下「GET」と略称する)20μmolを蒸溜水30μlに溶解して標識試薬溶液を準備した。または、標識試薬としてGETの二硫(disulfide)前駆体を使用する場合には、GEDS・2HCl (guanidinoethanedisulfide 2hydrochloride)10μmolを蒸溜水10μlに溶解した後、TCNEP(tris(2-cyanoethyl)phosphine)(500mM)20μlを加え、45℃で約30分間放置して前駆体を活性化させた後、標識試薬溶液として使用した。前記実施例1で前処理したタンパク質試料を真空乾燥した試料ペプチド(約20μl)を蒸溜水13μlに溶解した後、これを前記で準備した標識試薬溶液43μlと混合した。前記混合した溶液に5.0N NaOH溶液6μl、1.0M BaCl2溶液2μlを続けて加え、45℃で約2〜3時間反応させた。前記反応溶液の温度を5℃以下に冷却し、1.0%酢酸水溶液を加えて中和させた。0.1%酢酸またはトリフルオロ酢酸(trifluoroacetic acid)水溶液で適切に希釈してペプチドの分析を進行した。
グアニジノエタンチオール(guanidinoethanethiol、以下「GET」と略称する)20μmolを蒸溜水30μlに溶解して標識試薬溶液を準備した。または、標識試薬としてGETの二硫(disulfide)前駆体を使用する場合には、GEDS・2HCl (guanidinoethanedisulfide 2hydrochloride)10μmolを蒸溜水10μlに溶解した後、TCNEP(tris(2-cyanoethyl)phosphine)(500mM)20μlを加え、45℃で約30分間放置して前駆体を活性化させた後、標識試薬溶液として使用した。前記実施例1で前処理したタンパク質試料を真空乾燥した試料ペプチド(約20μl)を蒸溜水13μlに溶解した後、これを前記で準備した標識試薬溶液43μlと混合した。前記混合した溶液に5.0N NaOH溶液6μl、1.0M BaCl2溶液2μlを続けて加え、45℃で約2〜3時間反応させた。前記反応溶液の温度を5℃以下に冷却し、1.0%酢酸水溶液を加えて中和させた。0.1%酢酸またはトリフルオロ酢酸(trifluoroacetic acid)水溶液で適切に希釈してペプチドの分析を進行した。
<実施例3> GET(グアニジノエタンチオール)で標識されたペプチドの分析
液体クロマトグラフィー/マトリックス補助レーザー脱着イオン化質量分析法(Liquid chromatography/The matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry、以下「LC/MALDI MS」と略称する)及び液体クロマトグラフィー/電子噴霧イオン化質量分析法(Liquid chromatography/The electrospray ionization mass spectrometry,LC/ESI MS)等は、標識されたペプチドの分析に非常に有用である。標識反応に使用したすべての試料は、小さい分子量で極性が非常に大きい有機物質かまたは無機塩であるため、逆相クロマトグラフィー法を応用して標識ペプチド試料を精製することができる。続いて、ペプチド誘導体を濃度勾配溶出法(gradient elution)を利用して直ちにESI質量分析機に導入して質量分析を実施するか、またはMALDI試料プレートに連続的にローディング(loading)することによって質量分析(mass spectrometry, MS)及びMS/MS分析を実施できる。試料の精製及び分離のために、LCパッキング社のLCパッキングプロボト(Packings Probot)をLCパッキングウルチメートマイクロ-キャピラリー(Packing Ultimate micro-capillary)HPLCシステムに連結し、試料を連続的にMALDIプレートにローディングした。その後、AB 4700 プロテオミクス分析機(AB 4700 Proteomics Analyzer)(Applied Biosystems,Framingham,MA,米国)を使用してMALDI TOF/TOF(time-of-flight/time-of-flight)質量分析を実施した。
液体クロマトグラフィー/マトリックス補助レーザー脱着イオン化質量分析法(Liquid chromatography/The matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry、以下「LC/MALDI MS」と略称する)及び液体クロマトグラフィー/電子噴霧イオン化質量分析法(Liquid chromatography/The electrospray ionization mass spectrometry,LC/ESI MS)等は、標識されたペプチドの分析に非常に有用である。標識反応に使用したすべての試料は、小さい分子量で極性が非常に大きい有機物質かまたは無機塩であるため、逆相クロマトグラフィー法を応用して標識ペプチド試料を精製することができる。続いて、ペプチド誘導体を濃度勾配溶出法(gradient elution)を利用して直ちにESI質量分析機に導入して質量分析を実施するか、またはMALDI試料プレートに連続的にローディング(loading)することによって質量分析(mass spectrometry, MS)及びMS/MS分析を実施できる。試料の精製及び分離のために、LCパッキング社のLCパッキングプロボト(Packings Probot)をLCパッキングウルチメートマイクロ-キャピラリー(Packing Ultimate micro-capillary)HPLCシステムに連結し、試料を連続的にMALDIプレートにローディングした。その後、AB 4700 プロテオミクス分析機(AB 4700 Proteomics Analyzer)(Applied Biosystems,Framingham,MA,米国)を使用してMALDI TOF/TOF(time-of-flight/time-of-flight)質量分析を実施した。
その結果、配列番号:1に記載のリン酸化タンパク質β-カゼイン(β-casein)をトリプシンで加水分解した後に得たリン酸化ペプチド(FQSPEEQQQTEDELQDK,SPは、リン酸化セリン(phosphoserine)を示す)をGET-TAGで標識した場合(図2b、m/z 2083.0002ピーク)は、GET-TAGで標識していないペプチド(図2a、m/z 2062.0083ピーク)に比べて質量数が21ほど増加して検出された。したがって、このような特定のペプチドの質量値の変化は、非リン酸化ペプチドからリン酸化ペプチドを区別するのに非常に有用であることが分かる。
また、リン酸化ペプチドに対して標識化反応を実施せず、10pmolの試料を使用して分析したもの(図2a)と、標識化反応後1pmolの試料を使用して分析したもの(図2b)を比較した結果、標識化反応を実施して分析した場合の方がより少ない試料を使用して分析したにも関わらず、ピークの強度は非常に大きく増加した。これを通じて、本発明の分析方法は、ペプチドに対する検出感度を大きく増加させることが分かる。
また、リン酸化セリンが標識化反応によってグアニジノエチルシステイン(guanidinoethylcysteine、以下「GEC」と略称する)に変わるにつれて、GECの断片イオン(fragment ion)に相当するm/z 188.0の質量差程度のb2ピークとb3ピーク間隔が現れるのを確認した(図3)。したがって、MS/MS分析法を通じてペプチド内部のリン酸化位置を容易に解明できることが分かる。
また、他のリン酸化タンパク質である配列番号:2に記載のα-カゼインのリン酸化ペプチド(VPQLEIVPNSPAEER)をMS/MS分析した結果、GECの断片イオンに相当するm/z 188.0の質量差程度のy4ピークとy5ピーク間隔が現れるのを確認した(図4)。
以上の例から分かるように、本発明を通じて開発された新しい標識物質及びその標識化方法は、リン酸化ペプチドの高感度分析と、ペプチド内部のリン酸化アミノ酸位置の正確な解明において非常に有用な方法であることが分かる。
前記で詳しく述べたように、本発明の分析方法及びそれに使用した標識物質は、生体内のタンパク質のリン酸化状態及びリン酸化程度を効果的に分析するのに有用であり、多様な疾病の診断及び治療剤の開発等に応用することができ、タンパク質の生体内での役割等をより詳しく理解するのに寄与しうる。
Claims (12)
1)リン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの一つ以上のセリン残基及び/またはスレオニン残基を脱リン酸化(dephosphorylation)する工程;
2)工程1の脱リン酸化されたアミノ酸残基をR-L-Gの構造からなるペプチド反応性標識物質(tag)で標識する工程であって、Rは脱リン酸化されたアミノ酸部位と選択的に結合する親核性作用基、Gは陽イオン形成を誘発させる親陽性子性作用基、Lは前記親核性作用基と親陽性子性作用基とを連結させるリンカー(linker)である、工程；及び
3)工程2で標識されたタンパク質またはペプチド誘導体を質量分析方法で検出する工程を含む、リン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの質量分析方法またはリン酸化位置分析方法であって、
工程2の標識物質に、モノ-N-保護グアニジノ基、ジ-N-保護グアニジノ基、N'-保護グアニジノ基及びアミンが保護されていないグアニジノ基からなる群より選択される基を親陽性子性作用基(G)として使用する、リン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの質量分析方法またはリン酸化位置分析方法。
2)工程1の脱リン酸化されたアミノ酸残基をR-L-Gの構造からなるペプチド反応性標識物質(tag)で標識する工程であって、Rは脱リン酸化されたアミノ酸部位と選択的に結合する親核性作用基、Gは陽イオン形成を誘発させる親陽性子性作用基、Lは前記親核性作用基と親陽性子性作用基とを連結させるリンカー(linker)である、工程；及び
3)工程2で標識されたタンパク質またはペプチド誘導体を質量分析方法で検出する工程を含む、リン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの質量分析方法またはリン酸化位置分析方法であって、
工程2の標識物質に、モノ-N-保護グアニジノ基、ジ-N-保護グアニジノ基、N'-保護グアニジノ基及びアミンが保護されていないグアニジノ基からなる群より選択される基を親陽性子性作用基(G)として使用する、リン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの質量分析方法またはリン酸化位置分析方法。
工程1のリン酸化ペプチドが、多様な臓器組織、細胞内分割または膜タンパク質から得られるリン酸化タンパク質を酵素的方法または化学的方法で加水分解して製造されることを特徴とする、請求項1記載の方法。
工程1のリン酸化ペプチドが、一つ以上の互いに異なる疾病状態で、互いに異なる化学的、物理的条件で、または互いに異なる環境的、営養学的条件で発現されるリン酸化タンパク質各々を、酵素的方法または化学的方法で加水分解することによって製造されることを特徴とする、請求項1記載の方法。
工程2の標識物質の親核性作用基(R)が、スルフヒドリル(sulfhydryl)であることを特徴とする、請求項1記載の方法。
スルフヒドリル基が、脱リン酸化アミノ酸残基に対する標識反応直前にまたは標識反応中に、スルフヒドリル基の二硫化物をトリス(2-シアノエチル)ホスフィン(tris(2-cyanoethyl)phosphine,TCNEP)、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(tris(2-carboxyethyl)phosphine,TCEP)、トリス(ヒドロキシプロピル)ホスフィン(tris(hydroxypropyl)phosphine,THPP)及びトリブチルホスフィン(tributylphosphine,TBP)からなる群より選択されるトリアルキルホスフィン(trialkylphosphine)製剤で還元させることによって製造されることを特徴とする、請求項4記載の方法。
スルフヒドリル基が、脱リン酸化アミノ酸残基に対する標識反応直前にまたは標識反応中に、保護スルフヒドリル基を塩基加水分解または親核性置換で脱保護させることによって製造されることを特徴とする、請求項4記載の方法。
工程2の標識物質のリンカー(linker,L)が、炭化水素(hydrocarbon)、エチレンオキシド(ethylene oxide)またはペプチド(peptide)からなる群より選択されるものを基本骨格として含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
工程3の標識されたタンパク質が、質量分析を実施する前に酵素的方法または化学的方法で標識されたペプチドで加水分解されて分析されることを特徴とする、請求項1記載の方法。
標識物質をさらに2H、13C、15N、17O、18O及び34Sからなる群より選択される同位元素で置換させることにより、前記同位元素で置換されていない標識物質と前記同位元素で置換した標識物質各々を一つ以上の試料に各々標識反応させた後、標識化された両試料を合わせて質量分析を実施することにより、各々の試料に存在するリン酸化タンパク質またはペプチドに対する相対的定量を実施する方法及びリン酸化位置を確認する、請求項1記載の分析方法。
脱リン酸化されたアミノ酸部位と選択的に結合する親核性作用基 (R) 、モノ -N- 保護グアニジノ基、ジ -N,N'- 保護グアニジノ基、 N'- 保護グアニジノ基及びアミンが保護されていないグアニジノ基からなる群より選択され、陽イオン形成を誘発させる親陽性子性作用基 (G) 及び前記親核性作用基と親陽性子性作用基とを連結させるリンカー (linker, L) からなる化合物を有効成分として含む、リン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの質量分析またはリン酸化位置分析における標識用組成物。
前記化合物が、グアニジノアルカンチオールまたはグアニジノエタンチオールであることを特徴とする、請求項10記載のリン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの質量分析またはリン酸化位置分析における標識用組成物。
前記化合物が、グアニジノアルカンジスルフィド及びグアニジノアルキルチオエステルからなる前駆体から還元反応または脱保護反応によって製造されることを特徴とする、請求項10記載のリン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの質量分析またはリン酸化位置分析における標識用組成物。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/KR2004/000256 WO2005075993A1 (en) | 2004-02-10 | 2004-02-10 | Selective labeling agent for phosphoproteome analysis and phosphorylated site analysis |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2006515674A JP2006515674A (ja) | 2006-06-01 |
| JP4271687B2 true JP4271687B2 (ja) | 2009-06-03 |
Family
ID=34836659
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005518451A Expired - Lifetime JP4271687B2 (ja) | 2004-02-10 | 2004-02-10 | リン酸化タンパク質の質量分析及びリン酸化位置分析用標識物質 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7250266B2 (ja) |
| EP (1) | EP1642129B1 (ja) |
| JP (1) | JP4271687B2 (ja) |
| AT (1) | ATE405831T1 (ja) |
| DE (1) | DE602004015989D1 (ja) |
| WO (1) | WO2005075993A1 (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006037095A2 (en) * | 2004-09-28 | 2006-04-06 | Baylor University | Spatially-defined modification of fresh tissue using covalent chemistry |
| KR100805775B1 (ko) | 2005-08-08 | 2008-02-21 | 한국기초과학지원연구원 | 변형된 폴리펩티드(Ｍｏｄｉｆｉｅｄｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ)의 서열 및 변형 정보를 분석하는방법 |
| WO2008029281A2 (en) | 2006-02-10 | 2008-03-13 | Invitrogen Corporation | Labeling and detection of post translationally modified proteins |
| US8859734B2 (en) * | 2006-09-29 | 2014-10-14 | Intel Corporation | Method for the selective enrichment and labeling of phosphorproteins |
| WO2012111775A1 (ja) | 2011-02-16 | 2012-08-23 | 株式会社セルシード | セリン、スレオニンの翻訳後修飾解析用標識剤 |
| US9328275B2 (en) * | 2014-03-07 | 2016-05-03 | Prc Desoto International, Inc. | Phosphine-catalyzed, michael addition-curable sulfur-containing polymer compositions |
| KR101675303B1 (ko) * | 2014-08-19 | 2016-11-11 | 한국표준과학연구원 | 마이크로 중공사막 효소 반응기-텐덤 질량분석법을 이용한 단세포군 항체 기반 온라인 인단백질 프로테오믹스 분석방법 |
| US10814036B2 (en) | 2016-11-07 | 2020-10-27 | Baylor University | Drug-eluting live tissue for transplantation |
| CN110609078B (zh) * | 2019-09-20 | 2022-03-11 | 南京谱利健生物技术有限公司 | 一种检测蛋白磷酸化和乙酰氨基葡萄糖化关联作用的方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001086306A2 (en) * | 2000-05-05 | 2001-11-15 | Purdue Research Foundation | Affinity selected signature peptides for protein identification and quantification |
| WO2002046770A2 (en) * | 2000-10-23 | 2002-06-13 | Genetics Institute, Llc | Isotope-coded ionization-enhancing reagents (icier) for high-throughput protein identification and quantitation using matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry |
| US6818454B2 (en) * | 2001-02-16 | 2004-11-16 | Battelle Memorial Institute | Phosphoprotein binding agents and methods of their use |
| US20030017507A1 (en) * | 2001-05-30 | 2003-01-23 | Johnson Richard S. | Relative protein quantitation phosphoproteins using stable isotope labeling |
| NZ529985A (en) * | 2001-06-07 | 2006-02-24 | Xzillion Gmbh & Co | Method for characterizing polypeptides |
| US7425451B2 (en) * | 2002-12-13 | 2008-09-16 | Agilent Technologies, Inc. | Triazine derivatives as universal peptide isotope tag reagents (U-PIT) |
-
2004
- 2004-02-10 AT AT04709767T patent/ATE405831T1/de not_active IP Right Cessation
- 2004-02-10 EP EP04709767A patent/EP1642129B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-10 JP JP2005518451A patent/JP4271687B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-10 WO PCT/KR2004/000256 patent/WO2005075993A1/en not_active Application Discontinuation
- 2004-02-10 DE DE602004015989T patent/DE602004015989D1/de not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-04-21 US US10/907,945 patent/US7250266B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2005075993A1 (en) | 2005-08-18 |
| EP1642129A4 (en) | 2006-07-26 |
| JP2006515674A (ja) | 2006-06-01 |
| EP1642129A1 (en) | 2006-04-05 |
| ATE405831T1 (de) | 2008-09-15 |
| DE602004015989D1 (de) | 2008-10-02 |
| EP1642129B1 (en) | 2008-08-20 |
| US7250266B2 (en) | 2007-07-31 |
| US20050176093A1 (en) | 2005-08-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Leitner et al. | Current chemical tagging strategies for proteome analysis by mass spectrometry | |
| US7183116B2 (en) | Methods for isolation and labeling of sample molecules | |
| Thompson et al. | Characterization of protein phosphorylation by mass spectrometry using immobilized metal ion affinity chromatography with on-resin β-elimination and Michael addition | |
| Leitner et al. | Chemistry meets proteomics: The use of chemical tagging reactions for MS‐based proteomics | |
| US7250266B2 (en) | Selective labeling agent for phosphoproteome analysis and phosphorylated site analysis | |
| Leitner | A review of the role of chemical modification methods in contemporary mass spectrometry-based proteomics research | |
| EP1397686B1 (en) | Method for characterizing polypeptides | |
| JP2004503780A (ja) | リンペプチドの選択的標識および単離ならびにプロテオーム分析への適用 | |
| Schmidt et al. | Enhanced detection and identification of multiply phosphorylated peptides using TiO2 enrichment in combination with MALDI TOF/TOF MS | |
| JP3976048B2 (ja) | スルフェニル化合物、ラベル化試薬、及びペプチドの解析方法 | |
| US7629744B2 (en) | In-gel tagging and in-gel digestion for phosphoproteins analysis and phosphorylation site identification | |
| WO2004097427A1 (en) | Methods for peptide analysis using mass spectrometry | |
| EP1265072A1 (en) | Method for characterising polypeptides | |
| EP1267170A1 (en) | Method for characterising polypeptides | |
| US20140017797A1 (en) | Protein affinity tag and uses thereof | |
| US20040106150A1 (en) | Inverse labeling method for the rapid identification of marker/target proteins | |
| KR100693111B1 (ko) | 인산화 단백질의 질량 분석 및 인산화 위치 분석용 표지물질 | |
| Buchowiecka | Modified cysteine S-phosphopeptide standards for mass spectrometry-based proteomics | |
| Schoneich | Proteomics in aging research | |
| AU2002302837A1 (en) | Characterising polypeptides | |
| AU2002310610A1 (en) | Characterising polypeptides |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080723 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081021 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090129 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090225 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120306 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120306 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130306 Year of fee payment: 4 |