JP3976048B2 - スルフェニル化合物、ラベル化試薬、及びペプチドの解析方法 - Google Patents
スルフェニル化合物、ラベル化試薬、及びペプチドの解析方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3976048B2 JP3976048B2 JP2004517238A JP2004517238A JP3976048B2 JP 3976048 B2 JP3976048 B2 JP 3976048B2 JP 2004517238 A JP2004517238 A JP 2004517238A JP 2004517238 A JP2004517238 A JP 2004517238A JP 3976048 B2 JP3976048 B2 JP 3976048B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- labeled
- labeling
- reagent
- compound
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 192
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 138
- 238000002372 labelling Methods 0.000 title claims description 112
- -1 Sulphenyl compound Chemical class 0.000 title claims description 40
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 53
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 50
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 49
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 29
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 28
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 claims description 24
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 17
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 claims description 16
- 125000000962 organic group Chemical group 0.000 claims description 12
- 125000004646 sulfenyl group Chemical group S(*)* 0.000 claims description 12
- 239000000470 constituent Substances 0.000 claims description 11
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 11
- NTNKNFHIAFDCSJ-IDEBNGHGSA-N (2-nitrophenyl) thiohypochlorite Chemical compound [O-][N+](=O)[13C]1=[13CH][13CH]=[13CH][13CH]=[13C]1SCl NTNKNFHIAFDCSJ-IDEBNGHGSA-N 0.000 claims description 10
- NCBOVAWEMBIIFK-IDEBNGHGSA-N (4-nitrophenyl) thiohypochlorite Chemical compound [O-][N+](=O)[13C]1=[13CH][13CH]=[13C](SCl)[13CH]=[13CH]1 NCBOVAWEMBIIFK-IDEBNGHGSA-N 0.000 claims description 7
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 7
- GPXDNWQSQHFKRB-IDEBNGHGSA-N (2,4-dinitrophenyl) thiohypochlorite Chemical compound [O-][N+](=O)[13C]1=[13CH][13CH]=[13C](SCl)[13C]([N+]([O-])=O)=[13CH]1 GPXDNWQSQHFKRB-IDEBNGHGSA-N 0.000 claims description 6
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 claims description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 6
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 claims description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- JWUKZUIGOJBEPC-UHFFFAOYSA-N phenyl thiohypochlorite Chemical compound ClSC1=CC=CC=C1 JWUKZUIGOJBEPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- UUVOHMQWLRUWAU-IDEBNGHGSA-N 4-chlorosulfanyl-3-nitrobenzoic acid Chemical compound OC(=O)[13C]1=[13CH][13CH]=[13C](SCl)[13C]([N+]([O-])=O)=[13CH]1 UUVOHMQWLRUWAU-IDEBNGHGSA-N 0.000 claims description 3
- YMCNJWZZZMBZBP-IDEBNGHGSA-N [N+](=O)([O-])[13C]=1[13C](=[13C]([13CH]=[13CH][13CH]=1)SCl)[N+](=O)[O-] Chemical compound [N+](=O)([O-])[13C]=1[13C](=[13C]([13CH]=[13CH][13CH]=1)SCl)[N+](=O)[O-] YMCNJWZZZMBZBP-IDEBNGHGSA-N 0.000 claims 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 33
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 29
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 27
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 21
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 15
- 229960000258 corticotropin Drugs 0.000 description 15
- 239000000275 Adrenocorticotropic Hormone Substances 0.000 description 14
- 102400000739 Corticotropin Human genes 0.000 description 14
- 101800000414 Corticotropin Proteins 0.000 description 14
- IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N corticotropin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)C1=CC=C(O)C=C1 IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N 0.000 description 14
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 13
- 102400001370 Galanin Human genes 0.000 description 12
- 101800002068 Galanin Proteins 0.000 description 12
- 102100033468 Lysozyme C Human genes 0.000 description 12
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 12
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 12
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 12
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 12
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 12
- SLZIZIJTGAYEKK-CIJSCKBQSA-N molport-023-220-247 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CN)[C@@H](C)O)C1=CNC=N1 SLZIZIJTGAYEKK-CIJSCKBQSA-N 0.000 description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 7
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 7
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 7
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000012412 Presenilin-1 Human genes 0.000 description 6
- 108010036933 Presenilin-1 Proteins 0.000 description 6
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 6
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 6
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 6
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 6
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 5
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 5
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 5
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 4
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 4
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 4
- NTNKNFHIAFDCSJ-WDBXEELJSA-N (6-nitro(1,2,3,4,5,6-12C6)cyclohexa-1,3,5-trien-1-yl) thiohypochlorite Chemical compound [N+](=O)([O-])[12C]1=[12C]([12CH]=[12CH][12CH]=[12CH]1)SCl NTNKNFHIAFDCSJ-WDBXEELJSA-N 0.000 description 3
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000007623 carbamidomethylation reaction Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 125000004119 disulfanediyl group Chemical group *SS* 0.000 description 3
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 3
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 3
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 125000001041 indolyl group Chemical group 0.000 description 3
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 2
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 2
- 108010065081 Phosphorylase b Proteins 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JTEHHIYMJNIERD-BVNCJLROSA-N S(Cl)Cl.[N+](=O)([O-])[13C]1=[13CH][13CH]=[13CH][13CH]=[13CH]1 Chemical compound S(Cl)Cl.[N+](=O)([O-])[13C]1=[13CH][13CH]=[13CH][13CH]=[13CH]1 JTEHHIYMJNIERD-BVNCJLROSA-N 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002152 alkylating effect Effects 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 125000004104 aryloxy group Chemical group 0.000 description 2
- UENWRTRMUIOCKN-UHFFFAOYSA-N benzyl thiol Chemical compound SCC1=CC=CC=C1 UENWRTRMUIOCKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LKMCJXXOBRCATQ-FJULHRIISA-N benzylsulfanyl(1,2,3,4,5,6-13C6)cyclohexatriene Chemical compound C(C1=CC=CC=C1)S[13C]1=[13CH][13CH]=[13CH][13CH]=[13CH]1 LKMCJXXOBRCATQ-FJULHRIISA-N 0.000 description 2
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- MVPPADPHJFYWMZ-UHFFFAOYSA-N chlorobenzene Chemical compound ClC1=CC=CC=C1 MVPPADPHJFYWMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003918 fraction a Anatomy 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 230000002140 halogenating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 230000003345 hyperglycaemic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000752 ionisation method Methods 0.000 description 2
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 2
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N sulfuryl dichloride Chemical compound ClS(Cl)(=O)=O YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N tetrachloromethane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 238000001419 two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 235000021241 α-lactalbumin Nutrition 0.000 description 2
- WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dichloroethane Chemical compound ClCCCl WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFCFYVKQTRLZHA-IDEBNGHGSA-N 1-chloro-2-nitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)[13C]1=[13CH][13CH]=[13CH][13CH]=[13C]1Cl BFCFYVKQTRLZHA-IDEBNGHGSA-N 0.000 description 1
- WFIYPADYPQQLNN-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(4-bromopyrazol-1-yl)ethyl]isoindole-1,3-dione Chemical compound C1=C(Br)C=NN1CCN1C(=O)C2=CC=CC=C2C1=O WFIYPADYPQQLNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AMWFIHQXLDZZDD-AHANXHTPSA-N C(CCl)Cl.C(C1=CC=CC=C1)S[13C]1=[13C]([13CH]=[13CH][13CH]=[13CH]1)[N+](=O)[O-] Chemical compound C(CCl)Cl.C(C1=CC=CC=C1)S[13C]1=[13C]([13CH]=[13CH][13CH]=[13CH]1)[N+](=O)[O-] AMWFIHQXLDZZDD-AHANXHTPSA-N 0.000 description 1
- 239000000055 Corticotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010026389 Gramicidin Proteins 0.000 description 1
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 1
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 1
- 101710132698 Lysozyme 3 Proteins 0.000 description 1
- 108010053229 Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 241001417524 Pomacanthidae Species 0.000 description 1
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 125000004414 alkyl thio group Chemical group 0.000 description 1
- 108010027597 alpha-chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- UHOVQNZJYSORNB-IDEBNGHGSA-N benzene-13c6 Chemical class [13CH]1=[13CH][13CH]=[13CH][13CH]=[13CH]1 UHOVQNZJYSORNB-IDEBNGHGSA-N 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000007336 electrophilic substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002101 electrospray ionisation tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000012156 elution solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 230000026030 halogenation Effects 0.000 description 1
- 238000005658 halogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 108091008147 housekeeping proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 238000010534 nucleophilic substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000013777 protein digestion Effects 0.000 description 1
- 238000000575 proteomic method Methods 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005932 reductive alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
- ZWCXYZRRTRDGQE-LUPIJMBPSA-N valyl gramicidin a Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC=O)C(C)C)CC(C)C)C(=O)NCCO)=CNC2=C1 ZWCXYZRRTRDGQE-LUPIJMBPSA-N 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C313/00—Sulfinic acids; Sulfenic acids; Halides, esters or anhydrides thereof; Amides of sulfinic or sulfenic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfinic or sulfenic groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
- C07C313/08—Sulfenic acids; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
- C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
- C07B2200/05—Isotopically modified compounds, e.g. labelled
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
- G01N2458/15—Non-radioactive isotope labels, e.g. for detection by mass spectrometry
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は、生体細胞又は組織中の発現タンパク質の網羅的解析に関し、より詳しくは、発現タンパク質の解析に好適な化合物、それを用いたラベル化試薬、及びラベル化試薬を用いた発現タンパク質の定量的解析技術に関する。
スルフェニル化合物は、トリプトファン残基のインドール環と反応するため、従来からトリプトファン残基の選択的ラベル化試薬として知られている。タンパク質の解析法としては、従来から２次元ゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）による方法が用いられている。この方法においては、まず、生体試料から抽出されたタンパク質を２Ｄ−ＰＡＧＥを用いて分離・精製し、２次元的に得られるゲルイメージから目的とするスポットを切り出す。次いで還元アルキル化、酵素消化などの工程を経てマススペクトロメトリーにより（例えばＰＭＦ法）、注目するスポットがどのようなタンパク質であるかを解析する。また、ディファレンシャルディスプレイにより２種の生体試料中のタンパク質の相対量比を求めることができる。
しかしこの方法では、高濃度で含まれるタンパク質（ハウスキーピングタンパク質）が存在する場合、低濃度で存在する調節タンパク質などは細胞全体のライセートを分析した場合、ほとんど検出できないという問題がある。また、ディファレンシャルディスプレイでの定量性が不十分であること、ゲル板の不均一性に起因する再現性の無さ、高分子タンパク質の分離が困難であることなども問題であった。
一方、昨今のポストゲノムの流れの中で、タンパク質の効率的な消化方法、消化によって生じた複雑なポリペプチド混合物の分離方法、及びポリペプチドのアミノ酸配列を解析するマススペクトルのイオン化法が開発され、ペプチドをマススペクトルで解析できるようになった。これに伴い、マススペクトルを応用するという観点からのペプチドの解析法が種々考案されてきており、新規で有用なラベル化試薬が求められている。このような観点から開発された試薬の１つに、ＩＣＡＴ（Isotope Coded Affinity Tag）試薬が挙げられる。これを用いる方法は、ワシントン大学のAebersoldらにより開発された、タンパク質発現量の変化を定量する方法の１つである。（例えば、非特許文献：R.Aebersold et al.,NatureBiotech.,1999,17,994-999、特許文献：ＷＯ ００／１１２０８参照）ＩＣＡＴ法ではタンパク質中のシステイン残基に注目し、ビオチンを含有する特殊なアルキル化試薬によりシステインのＳＨ基をラベル化する。この方法は発現された広い量的な差異を持つ生体内タンパク質を定量することができ、タンデムマスと組み合わせて発現量が変化したタンパク質の同定も可能である。
しかし、タンパク質中のシステイン含量が大きいため、上記の方法では最終的に得られるマススペクトルが複雑であることが予想される。また、ラベル化されたペプチドフラグメントを分離するためにアビジンカラムという特殊なカラムを必要とすることや、反応試薬の分子量が比較的大きい（６００程度）ため反応性が十分でないことも問題である。
Ｒ・エバーソールドら（R.Aebersold et al.）著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）、１９９９年、第１７巻、ｐ．９９４−９９９
国際公開第００／１１２０８号パンフレット
発明の目的
そこで、本発明の目的は、反応性及び選択性に優れ、マススペクトルでの解析が容易で定量性も高く、かつ特殊なカラムを必要としないラベル化試薬に用いることができるスルフェニル化合物、それを用いたラベル化試薬、及びそのラベル化試薬を用いたタンパク質・ペプチドの解析方法を提供することにある。
そこで、本発明の目的は、反応性及び選択性に優れ、マススペクトルでの解析が容易で定量性も高く、かつ特殊なカラムを必要としないラベル化試薬に用いることができるスルフェニル化合物、それを用いたラベル化試薬、及びそのラベル化試薬を用いたタンパク質・ペプチドの解析方法を提供することにある。
発明の概要
本発明者らは、鋭意検討した結果、同位体で標識された少なくとも１つの構成元素を有するスルフェニル化合物によって、上記目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明者らは、鋭意検討した結果、同位体で標識された少なくとも１つの構成元素を有するスルフェニル化合物によって、上記目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明には、以下の発明が含まれる。
（１） 一般式：
Ｒ−Ｓ−Ｘ （Ｉ）
（式中、Ｒは、同位体で標識された少なくとも１つの構成元素を有する有機基を表し、Ｘは脱離基を表す。）
で表されるスルフェニル化合物であって、
２−ニトロ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド、４−ニトロ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド、２，４−ジニトロ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド、及び２−ニトロ−４−カルボキシ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリドからなる群から選ばれるスルフェニル化合物。
（１） 一般式：
Ｒ−Ｓ−Ｘ （Ｉ）
（式中、Ｒは、同位体で標識された少なくとも１つの構成元素を有する有機基を表し、Ｘは脱離基を表す。）
で表されるスルフェニル化合物であって、
２−ニトロ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド、４−ニトロ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド、２，４−ジニトロ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド、及び２−ニトロ−４−カルボキシ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリドからなる群から選ばれるスルフェニル化合物。
（２） 一般式：
Ｒ−Ｓ−Ｘ （Ｉ）
（式中、Ｒは、同位体で標識された少なくとも１つの構成元素を有する有機基を表し、Ｘは脱離基を表す。）
で表されるスルフェニル化合物を含むラベル化試薬であって、
前記スルフェニル化合物が、２−ニトロ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド、４−ニトロ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド、２，４−ジニトロ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド、及び２−ニトロ−４−カルボキシ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリドからなる群から選ばれる、ラベル化試薬。
Ｒ−Ｓ−Ｘ （Ｉ）
（式中、Ｒは、同位体で標識された少なくとも１つの構成元素を有する有機基を表し、Ｘは脱離基を表す。）
で表されるスルフェニル化合物を含むラベル化試薬であって、
前記スルフェニル化合物が、２−ニトロ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド、４−ニトロ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド、２，４−ジニトロ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド、及び２−ニトロ−４−カルボキシ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリドからなる群から選ばれる、ラベル化試薬。
（３） ペプチドの解析の用途における、（２）に記載のラベル化試薬。
以下、本明細書においてペプチドとは、タンパク質を含む意味で用いる。
以下、本明細書においてペプチドとは、タンパク質を含む意味で用いる。
（４） 前記スルフェニル化合物から選ばれた１つの化合物（以下、「重い試薬」と表記する。）と、前記重い試薬と同一構造であり且つ前記同位体で標識されていない化合物（以下、「軽い試薬」と表記する。）とをそれぞれ別個に含む、（２）又は（３）に記載のラベル化試薬。
本発明のラベル化試薬は、前記重い試薬は、前記軽い試薬との分子量の差が３〜１２、好ましくは６〜１０となるように設計されていることが好ましい。
本発明のラベル化試薬は、前記重い試薬は、前記軽い試薬との分子量の差が３〜１２、好ましくは６〜１０となるように設計されていることが好ましい。
（５） 一般式：
Ｒ−Ｓ−Ｘ （Ｉ）
（式中、Ｒは、同位体で標識された少なくとも１つの構成元素を有する有機基を表し、Ｘは脱離基を表す。）
で表されるスルフェニル化合物を含むラベル化試薬を用いるペプチドの解析法であって、
前記式（Ｉ）で表される同位体で標識されたスルフェニル化合物が、２−ニトロ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド、４−ニトロ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド、２，４−ジニトロ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド、及び２−ニトロ−４−カルボキシ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリドからなる群から選ばれる、ペプチドの解析法。
Ｒ−Ｓ−Ｘ （Ｉ）
（式中、Ｒは、同位体で標識された少なくとも１つの構成元素を有する有機基を表し、Ｘは脱離基を表す。）
で表されるスルフェニル化合物を含むラベル化試薬を用いるペプチドの解析法であって、
前記式（Ｉ）で表される同位体で標識されたスルフェニル化合物が、２−ニトロ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド、４−ニトロ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド、２，４−ジニトロ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド、及び２−ニトロ−４−カルボキシ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリドからなる群から選ばれる、ペプチドの解析法。
（６） 前記ラベル化試薬が、前記式（Ｉ）で表される同位体で標識されたスルフェニル化合物から選ばれた１つの化合物（重い試薬）と、前記選ばれた化合物と同一構造であり且つ前記同位体で標識されていない化合物（軽い試薬）とをそれぞれ別個に含む、（５）に記載のペプチドの解析法。
本発明のペプチドの解析法においては、前記重い試薬が、前記軽い試薬との分子量の差が３〜１２、好ましくは６〜１０となるように設計されていることが好ましい。
本発明のペプチドの解析法においては、前記重い試薬が、前記軽い試薬との分子量の差が３〜１２、好ましくは６〜１０となるように設計されていることが好ましい。
（７） 前記ラベル化試薬を用いて、解析すべきペプチドのアミノ酸残基をラベル化し、得られたラベル化ペプチドをマススペクトロメトリーにより測定する、（５）又は（６）に記載のペプチドの解析法。
（８） （i）解析すべきペプチドを、前記重い試薬及び前記軽い試薬のいずれか一方を用いてラベル化し、ラベル化された解析すべきペプチドを得て、
（ii）別途、対照ペプチドを、前記重い試薬及び前記軽い試薬のいずれか他方を用いてラベル化し、ラベル化された対照ペプチドを得て、
（iii）（i）で得られたラベル化された解析すべきペプチドと（ii）で得られたラベル化された対照ペプチドとを混合し、
（iv）混合したラベル化ペプチドをマススペクトロメトリーによって測定する、（７）に記載のペプチドの解析法。
（ii）別途、対照ペプチドを、前記重い試薬及び前記軽い試薬のいずれか他方を用いてラベル化し、ラベル化された対照ペプチドを得て、
（iii）（i）で得られたラベル化された解析すべきペプチドと（ii）で得られたラベル化された対照ペプチドとを混合し、
（iv）混合したラベル化ペプチドをマススペクトロメトリーによって測定する、（７）に記載のペプチドの解析法。
（９） 必要に応じて酵素消化及び／又は還元とアルキル化とによる化学的処理を行う、（７）又は（８）に記載のペプチドの解析法。
（１０） 前記酵素消化を前記ラベル化の前又は後に行う、（９）に記載のペプチドの解析法。
（１１） 前記化学的処理を前記ラベル化の前又は後に行う、（９）に記載のペプチドの解析法。
（１２） 前記化学的処理、前記酵素消化、及び前記ラベル化をこの順で行う、（９）に記載のペプチドの解析法。
（１３） 前記化学的処理、前記ラベル化、及び前記酵素消化をこの順で行う、（９）に記載のペプチドの解析法。
（１４） 前記ラベル化、前記化学的処理、及び前記酵素消化をこの順で行う、（９）に記載のペプチドの解析法。
（１５） 前記ラベル化の後、必要に応じゲル濾過による分離と逆相カラムを用いる分離とを含むラベル化ペプチドの精製を行う、（７）に記載のペプチドの解析法。
（１６） 前記アミノ酸残基がトリプトファン残基である、（７）に記載のペプチドの解析法。
本発明は、式：
Ｒ−Ｓ−Ｘ （Ｉ）
（式中、Ｒは、同位体で標識された少なくとも１つの構成元素を有する有機基を表し、Ｘは脱離基を表す。）
で表されるスルフェニル化合物である。このスルフェニル化合物は、同定すべき化合物のラベル化試薬として用いることができ、特に、ペプチド解析におけるラベル試薬として有用である。
Ｒ−Ｓ−Ｘ （Ｉ）
（式中、Ｒは、同位体で標識された少なくとも１つの構成元素を有する有機基を表し、Ｘは脱離基を表す。）
で表されるスルフェニル化合物である。このスルフェニル化合物は、同定すべき化合物のラベル化試薬として用いることができ、特に、ペプチド解析におけるラベル試薬として有用である。
また、前記重い試薬と前記軽い試薬とをそれぞれ別個に含む２種の試薬を組み合わせたラベル化試薬を用いることにより、マススペクトルを応用したペプチドの解析が容易になる。
上記式（Ｉ）中、有機基Ｒは、構成元素としてＣ、Ｈ、Ｎ、場合によりＯ及び／又はＰを含む置換基である。また、前記同位体は安定同位体が好ましく、このようなものとしては、２Ｈ、13Ｃ、15Ｎ、17Ｏ、18Ｏなどが挙げられる。
重い試薬と軽い試薬とを組み合わせてペプチドのラベル化試薬として用いるとき、重い試薬によってラベル化されたペプチド及び軽い試薬によってラベル化されたペプチドを混合してマススペクトロメトリ−によって測定する。この場合、前述の同位体の存在によって、それぞれのラベル化ペプチドの質量数に差が生じる。この差は、重い試薬の分子量と軽い試薬の分子量との差に相当する。
このとき、質量数の差は３〜１２ダルトンが好ましく、６〜１０ダルトンがより好ましい。質量数の差が３ダルトン以上開くことにより、重い試薬による化学修飾を受けたラベル化ペプチドと、軽い試薬による化学修飾を受けたラベル化ペプチドとの双方のスペクトルピークが重なりにくくなるため、解析がしやすい。
このことから、本発明のスルフェニル化合物の分子量は、その化合物と同一構造であり且つ同位体で標識されていない化合物の分子量よりも３〜１２大きいことが好ましく、６〜１０大きいことがより好ましい。従って、本発明のスルフェニル化合物が同位体として２Ｈ、13Ｃ、15Ｎ、17Ｏなどの質量数が１大きい同位体のみを含む場合、同位体で標識された構成元素の数は３以上、例えば３〜１２個が好ましく、６〜１０個がより好ましい。
一方、本発明のスルフェニル化合物が同位体として18Ｏなどの質量数が２大きい同位体を含む場合は、３以上の質量数の差を与えるために３個以上の同位体を必要としない場合もある。例えば、同位体として18Ｏのみを含むスルフェニル化合物の場合、18Ｏで標識された構成元素が２個あれば、マススペクトルにおいて４ダルトンの差が生じ、好ましい質量数の差を与えることができる。
そして、これら本発明のスルフェニル化合物を重い試薬とし、軽い試薬とを組み合わせたラベル化試薬として用いる場合は、重い試薬の分子量は、軽い試薬の分子量との差が３〜１２となるように設計されることが好ましく、６〜１０となるように設計されることがより好ましい。
前記（Ｉ）式中の有機基Ｒは、置換されていても良いアルキル基又は置換されていても良いアリール基であることが好ましい。前記置換されていても良いアルキル基が有する置換基は、ＮＯ２基、ＣＯＯＨ基、ＳＯ３Ｈ基、ＯＨ基、アルコキシ基、アリール基、アリールオキシ基などが挙げられるが、これらに限定されない。
また、前記置換されていても良いアリール基が有する置換基は、ＮＯ２基、ＣＯＯＨ基、ＳＯ３Ｈ基、ＯＨ基、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、アリールオキシ基などが挙げられるが、これらに限定されない。
これら置換基は、当該試薬の反応性、溶解性などを調節するため適宜選択することができる。
また、前記有機基Ｒは、置換されていても良いフェニル基であることが好ましい。
好ましく設定された有機基Ｒを有することにより、ラベル化試薬として用いた時に、逆相カラムなど通常のカラムにより容易にラベル化ペプチドの分離ができるようになる。
前記（Ｉ）式中の脱離基Ｘとしては、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉなどのハロゲン原子が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のスルフェニル化合物の分子量は、ラベル化すべきペプチドとの反応性を考慮して、１９０程度が好ましい。
本発明のスルフェニル化合物は、２−ニトロ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド、４−ニトロ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド、２，４−ジニトロ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド、及び２−ニトロ−４−カルボキシ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリドからなる群から選ばれる。
本発明のスルフェニル化合物は、対応するジスルフィド、チオール、スルフィドなどからハロゲン化などの方法により合成できる。例えば、有機基Ｒとして６個の13Ｃで標識されたフェニル基を有するスルフェニル化合物を、例えばスルフィドから合成する方法として、以下に記述する方法が挙げられる。
まず、前駆体のスルフィドは、例えばニトロ［13Ｃ６］クロロベンゼンなどの［13Ｃ６］ベンゼン誘導体にベンジルメルカプタンを反応させることにより、［13Ｃ６］フェニルベンジルスルフィドとして得る。
次に、得られた［13Ｃ６］フェニルベンジルスルフィドに、ハロゲン化剤を反応させ、目的とするスルフェニル化合物を得る。ハロゲン化剤としては、スルフリルクロリドや臭素などを用いると良い。溶媒としては、四塩化炭素、エチレンクロリドなどを用いると良い。反応条件としては、例えば１０℃〜４５℃で５分〜１時間かけて反応させる。
これらの諸条件は、当業者が適宜定めると良い。
これらの諸条件は、当業者が適宜定めると良い。
このようにして得られたスルフェニル化合物の同定は、得られたスルフェニル化合物のマススペクトルと、その化合物と同一構造であり且つ同位体標識されていない化合物のマススペクトルとを比較することによって行うことができる。また、双方の13Ｃ及び１ＨＮＭＲをそれぞれ比較することによっても同定を行うことができる。
本発明のスルフェニル化合物を用いることにより、同定すべき化合物に目印として標識置換基（Ｒ−Ｓ−基）を導入することができるため、ラベル化試薬として用いることができる。
スルフェニル化合物は、ペプチド中に存在するトリプトファン残基のインドール環と選択的に反応することが知られているため、特に本発明の同位体で標識されたスルフェニル化合物は、ペプチドの解析におけるラベル化試薬として有用である。
トリプトファンはタンパク質において、機能面及び活性面において重要な役割を演じているアミノ酸である。トリプトファンを含むペプチドとしては、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、ガラニン（Galanin）、副甲状腺ホルモン（PTH）、α−キモトリプシン、グラミシジンＡ、リゾチームなどが挙げられる。
トリプトファンのタンパク質中含有量は、アミノ酸の中でも最も少ない部類に属するため、ラベル化反応及び酵素消化後のペプチドのマススペクトルが単純となり、その解析が容易となる。これはプロテオーム解析を行う上で大変有利である。
スルフェニル化合物（同位体で標識された本発明のスルフェニル化合物及び従来の標識されていないスルフェニル化合物）は、トリプトファン残基が有するインドール環への求電子置換反応によって、トリプトファン残基をラベル化する。この反応は、ＩＣＡＴ法におけるシステイン残基とＩＣＡＴ試薬との求核置換反応よりも反応性が高いということが期待できる。
スルフェニル化合物によるラベル化によって生成したラベル化トリプトファン残基含有ペプチドは、ラベル化前のトリプトファン残基含有ペプチドよりも疎水性が高いため、ＩＣＡＴ法で用いるような特殊なカラムを使用することなくその分離・精製を行うことができる。たとえば、ゲル濾過や逆相カラムなどで十分分離・精製が可能である。
本発明のペプチドの解析法は、解析すべきペプチドのアミノ酸残基をラベル化し、得られたラベル化ペプチドをマススペクトロメトリーにより測定する。解析すべきペプチドは、２種以上のペプチドの混合物である場合もある。本発明は、ラベル化反応、マススペクトルの測定の工程を含む。重い試薬と軽い試薬とを組み合わせたラベル化試薬を用いる場合は、ラベル化反応、必要に応じラベル化ペプチドの混合、及びマススペクトルの測定の工程を含む。
また本発明は、必要に応じ、好ましくは酵素的処理によるペプチドの断片化（酵素消化）、及び／又は還元とアルキル化とによる化学的処理の工程を含む。
さらに本発明は、必要に応じ、ゲル濾過による分離と、逆相カラムを用いる分離とを含む精製の工程を含む。
上記工程のうち、ラベル化、酵素消化、及び化学的処理の各工程を組み合わせた本発明における過程としては、（ａ）酵素消化の後にラベル化を行う過程、（ｂ）ラベル化の後に酵素消化を行う過程、（ｃ）化学的処理の後にラベル化を行う過程、（ｄ）ラベル化の後に化学的処理を行う過程、（ｅ）化学的処理、酵素消化、及びラベル化をこの順で行う過程、（ｆ）化学的処理、ラベル化、及び酵素消化をこの順で行う過程、及び、（ｇ）ラベル化、化学的処理、及び酵素消化をこの順で行う過程が挙げられる。
重い試薬と軽い試薬とを組み合わせたラベル化試薬を用いる場合、解析すべきペプチドのサンプルとは別に、対照ペプチドのサンプルを用意する。解析すべきペプチドが２種以上のペプチドの混合物である場合は、対照ペプチドも対応する２種以上のペプチドの混合物を用いることができる。サンプルの例としては、例えば、解析すべきペプチドのサンプルが病細胞に由来するタンパク質であり、対照ペプチドのサンプルが前記病細胞に対応する正常細胞に由来するタンパク質である場合が挙げられる。この場合、対応するこれらのサンプルは互いにペプチド構成が異なる。解析すべきペプチドのサンプル及び対照ペプチドのサンプルとしては、それぞれ１種類ずつ用いても良いし、一方及び／又は他方を２種類以上用いても良い。
ラベル化反応は、通常の方法を用いて行う。重い試薬と軽い試薬とを組み合わせたラベル化試薬を用いる場合は、解析すべきペプチドを、重い試薬及び軽い試薬のいずれか一方を用いてラベル化を行い、別途、対照ペプチドを、重い試薬及び軽い試薬のいずれか他方を用いてラベル化を行う。例えば、解析すべきペプチドを重い試薬を用い、対照ペプチドを軽い試薬を用いてラベル化しても良いし、解析すべきペプチドを軽い試薬を用い、対照ペプチドを重い試薬を用いてラベル化しても良い。
このようにして別々にラベル化することによって、少なくとも２種類のラベル化ペプチドを得ることができる。
本発明においては、ラベル化に加え、必要に応じて、ペプチドの断片化を行うことができる。断片化は酵素消化によって行うことが好ましい。（以下、断片化を酵素消化によって行うとして本発明を説明する。）酵素消化は前記ラベル化の前又は後に行うことができる。すなわち本発明には（ａ）酵素消化の後にラベル化を行う過程、又は（ｂ）ラベル化の後に酵素消化を行う過程が含まれる。
酵素消化に用いる酵素は、高い基質特異性を有するトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、トロンビン、プラスミン、カリクレイン、ウロキナーゼなどのエンドペプチダーゼが好ましい。酵素消化によって、ペプチドはペプチドフラグメントに断片化される。
また、本発明においては、ラベル化に加え、必要に応じ、還元反応とアルキル化反応とによる化学的処理を行うことができる。後述する理由で、化学的処理と前記ラベル化との順番は任意である。すなわち本発明には、（ｃ）化学的処理の後にラベル化を行う過程、（ｄ）ラベル化の後に化学的処理を行う過程が含まれる。アルキル化の形態としては、Ｓ−カルバミドメチル化やＳ−カルボキシメチル化などが挙げられるが、これらに限定されない。
解析すべきペプチドはシステイン残基やジスルフィド結合を有することがある。システイン残基のＳＨ基は反応性が高いため、ジスルフィド結合を形成しジチオ基に変化しやすく、予期せぬペプチド構造を形成することがある。ジスルフィド結合は高いｐＨ環境において他のジスルフィド結合と交換する性質があるため、通常高いｐＨ環境で行われる酵素消化の段階でペプチド構造が変化し、解析が困難になることがある。化学的処理を行うと、この問題を回避することができる。すなわち化学的処理においては、酵素消化で影響を受けやすいジチオ基を、前記還元反応によってジスルフィド結合を還元的に開裂させ、アルキル化することによってアルキルチオ基へ変化させる。
従って、前記酵素消化と化学的処理とを組み合わせて行う場合（すなわち、本発明においてラベル化、酵素消化、及び酵素消化を組み合わせて行う場合）は、化学的処理の後に酵素消化を行うことが好ましい。
ここで、前記したように、酵素消化は前記ラベル化の前でも後でも行うことができる。従って、（化学的処理の後に行われる）酵素消化をラベル化の前に行う場合は、本発明には、（ｅ）化学的処理、酵素消化、及びラベル化をこの順で行う過程が含まれる。
一方、（化学的処理の後に行われる）酵素消化をラベル化の後に行う場合は、酵素消化はこれら３つの工程で最後に行うこととなる。酵素消化の前に行われる化学的処理とラベル化との順番は前述のように任意であるため、この場合、本発明には、（ｆ）化学的処理、ラベル化、及び酵素消化をこの順で行う過程、又は、（ｇ）ラベル化、化学的処理、及び酵素消化をこの順で行う過程が含まれる。
化学的処理とラベル化との順番が任意である理由は次のとおりである。
解析すべきペプチドがシステイン残基を有する場合、システイン残基は本発明におけるラベル化によって、トリプトファン残基と同様にラベル化され得る。従って、システイン残基のラベル化という副反応を回避する目的で、前記化学的処理はラベル化の前に行うことができる。
解析すべきペプチドがシステイン残基を有する場合、システイン残基は本発明におけるラベル化によって、トリプトファン残基と同様にラベル化され得る。従って、システイン残基のラベル化という副反応を回避する目的で、前記化学的処理はラベル化の前に行うことができる。
しかし、前記化学的処理はラベル化の後に行うこともできる。前述のように、解析すべきペプチドにシステイン残基が含まれている場合、このシステイン残基はラベル化において副反応をもたらす。このとき、システイン残基とラベル化試薬とが反応して形成される結合はジスルフィド結合である。副反応で形成されたジスルフィド結合は、前記化学的処理によって還元的開裂及びアルキル化することができる。従って、本発明においては、化学的処理をラベル化の後に行うこともできる。
以上の理由で、本発明において化学的処理とラベル化との順番は任意である。
以上の理由で、本発明において化学的処理とラベル化との順番は任意である。
前述のようにして、解析すべきペプチドからラベル化ペプチド又はラベル化ペプチドフラグメントを得る。（以下、ラベル化ペプチド又はラベル化ペプチドフラグメントを単にラベル化ペプチド分子と表記する。また、ラベル化反応が未反応のペプチド又はペプチドフラグメントを未ラベル化ペプチド分子と表記する。）ラベル化ペプチド分子は、精製されることが好ましい。ラベル化ペプチド分子は、トリプトファン残基がラベル化されており、未ラベル化ペプチド分子よりも疎水性が高い。このため、通常使用されるＯＤＳなどを用いた逆相カラムによって、ラベル化ペプチド分子と未ラベル化ペプチド分子との分離が容易にできる。従って本発明においては、ＩＣＡＴ法で用いるような特殊なカラムを使用する必要がなくなるという利点がある。
また、逆相カラムでの精製を行う前に、ゲル濾過を行うことがより好ましい。ゲル濾過用担体は、セファデックス、バイオゲル、アガロースゲルなどが挙げられるが、セファデックスが好ましい。また、セファデックスはLH20が最適である。ゲル濾過によって、未反応及び加水分解を受けたラベル化試薬を分離することができ、より純度の高いラベル化ペプチド分子を得ることができる。
必要に応じ精製されたラベル化ペプチド分子は、マススペクトロメトリ−によって測定される。重い試薬と軽い試薬とを組み合わせたラベル化試薬を用いた場合は、マススペクトルの測定を行う前に、解析すべきペプチドのサンプル及び対照ペプチドのサンプルを混合することができる。これによりそれぞれのサンプルのラベル化ペプチド分子が混合される。それぞれのラベル化ペプチド分子は、マススペクトルの測定時に混合された状態であれば良いため、混合する時期は、ラベル化の後、マススペクトルの測定の前であれば、酵素消化、化学的処理、又は精製のいずれの段階でも良い。混合されたラベル化ペプチド分子は、マススペクトロメトリ−によって測定される。
マススペクトロメトリ−のイオン化法としては、ＦＤ法、ＳＩＭＳ法、ＦＡＢ法、ＭＡＬＤＩ法、ＥＳＩ法などが挙げられる。分析計としては、二重収束質量分析計、四重極型分析計、飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計、フーリエ変換質量分析計、イオンサイクロトロン質量分析計などが挙げられる。
本発明においては、マススペクトル（ＭＳ）の結果と、タンデムマススペクトル（ＭＳ／ＭＳ）の結果とを組み合わせてペプチドの解析を行うことができる。
重い試薬と軽い試薬とを組み合わせたラベル化試薬を用いた場合、マススペクトル（ＭＳ）では、軽い試薬の分子量と重い試薬の分子量との差に相当する質量数の差を有するフラグメントイオンの対ピークを見つけることができる。この積分比は、それぞれのサンプルに存在するラベル化ペプチドのモル比に相当し、すなわち、対応するもとの解析すべきペプチドと対照ペプチドとのモル比に相当する。また、タンデムマススペクトル（ＭＳ／ＭＳ）と、データベースの検索とにより得られる配列情報から、それぞれのラベル化ペプチド分子に相当するもとの解析すべきペプチドと対照ペプチドとをそれぞれ同定することができる。
なお、解析すべきペプチドのサンプル又は対照ペプチドのサンプルのいずれか一方には含まれているペプチドが、いずれか他方には対応するペプチドとして含まれていない場合がある。すなわち、サンプルの一方にはペプチドが発現していて、いずれか他方には対応するペプチドが発現していない場合がある。この場合、マススペクトルにおいては、一方にシグナルが観測されるが、他方には対応するシグナルが観測されないため、混合されたサンプルのスペクトルからはこのようなペプチド由来のシグナルを見つけることは困難である。従ってこのような場合は、本発明のペプチドの解析法における全ての工程、すなわち、ラベル化、酵素消化、化学的処理、精製、及びマススペクトルの測定を、各サンプルにおいて別々に行うと良い。そして、スペクトルチャートの横軸（質量／電荷）(m/z)を等幅にして出力し、両者を比較して見ることで相対量比が１：０のシグナルを探し求めることによって解析を行うことができる。
前述のように、本発明によると、適切なスルフェニル化合物を得ることによって、ペプチド解析におけるラベル化をより反応性良く、より選択性良く行うことができるラベル化試薬を提供することができる。また、そのような反応性及び選択性に優れたラベル化試薬をペプチドの解析に用いることによって、解析すべきタンパク質のサンプル、及び対照ペプチドのサンプルにそれぞれ存在している対応ペプチドの種類とその発現量の違いとをより正確且つ容易に知ることができる。また、特定のペプチドがサンプル中の他のペプチドに比べてどれ位含まれているかということもより正確且つ容易に知ることができる。このように本発明によると、発現タンパク質の網羅的解析をより定量的且つ効率的に行うことができる。本発明の方法によると、発現タンパク質レベルで通常細胞と病細胞とのペプチド構成の違いを知ることができるため、病細胞の活動化段階をコントロールしているメカニズム等を解明する手がかりを知ることができる。すなわち、本発明によって明らかにされたペプチドが特定の疾患に関与するものである場合、該ペプチドを標的として特異的に作用し、その機能を効果的に制御する化合物をコンピュータで理論的にデザインすることによって、医薬品候補化合物を創出することができる。また、該ペプチドをコードする遺伝子の情報を見出し、該遺伝子の発現を特異的に制御する物質を医薬品候補化合物として創出することができる。本発明の方法は、これら医薬品候補化合物の創出をより効率的なものにすることができる。
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
［実施例１：スルフェニル化合物の合成］
本実施例では、２−ニトロ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド（重い試薬）を、対応するスルフィドから合成した。
本実施例では、２−ニトロ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド（重い試薬）を、対応するスルフィドから合成した。
（スルフィドの合成）
１ｇ（６．１×１０−３ｍｏｌ）の２−ニトロクロロ［13Ｃ６］ベンゼンを１ｍｌのメタノールに溶解し、ここに０．８ｇ（６．６×１０−３ｍｏｌ）のベンジルメルカプタン、０．８ｍｌ（０．０１ｍｏｌ）のピリジンを加え、１６時間加熱還流した。室温に放冷し２−ニトロ［13Ｃ６］フェニルベンジルスルフィドを析出させ、この結晶を濾別し、メタノールで洗浄した。風乾後黄色結晶として２−ニトロ［13Ｃ６］フェニルベンジルスルフィド１．３８ｇ（９０％）が得られた。
１ｇ（６．１×１０−３ｍｏｌ）の２−ニトロクロロ［13Ｃ６］ベンゼンを１ｍｌのメタノールに溶解し、ここに０．８ｇ（６．６×１０−３ｍｏｌ）のベンジルメルカプタン、０．８ｍｌ（０．０１ｍｏｌ）のピリジンを加え、１６時間加熱還流した。室温に放冷し２−ニトロ［13Ｃ６］フェニルベンジルスルフィドを析出させ、この結晶を濾別し、メタノールで洗浄した。風乾後黄色結晶として２−ニトロ［13Ｃ６］フェニルベンジルスルフィド１．３８ｇ（９０％）が得られた。
（重い試薬の合成）
前述のようにして得られた２−ニトロ［13Ｃ６］フェニルベンジルスルフィド１．３８ｇ（５．５×１０−３ｍｏｌ）にエチレンクロリド１０ｍｌを加え、さらにスルフリルクロリド９４０ｍｇ（７．９×１０−３ｍｏｌ）を加え、室温で撹拌した。反応溶液を湯浴で５０〜６０℃に加温しながら減圧濃縮した。得られた油状物に石油エーテルを加え、生じた結晶を濾別した。結晶を石油エーテルで洗浄し風乾して２−ニトロ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリドを９３８ｍｇ（８７％）を得た。
前述のようにして得られた２−ニトロ［13Ｃ６］フェニルベンジルスルフィド１．３８ｇ（５．５×１０−３ｍｏｌ）にエチレンクロリド１０ｍｌを加え、さらにスルフリルクロリド９４０ｍｇ（７．９×１０−３ｍｏｌ）を加え、室温で撹拌した。反応溶液を湯浴で５０〜６０℃に加温しながら減圧濃縮した。得られた油状物に石油エーテルを加え、生じた結晶を濾別した。結晶を石油エーテルで洗浄し風乾して２−ニトロ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリドを９３８ｍｇ（８７％）を得た。
（同定）
得られた重い試薬と、対応する軽い試薬（２−ニトロ［12Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド）とをそれぞれマススペクトロメトリ−により測定した。重い試薬と軽い試薬の構造式を化１に示す。式中、*は、13Ｃで標識された炭素原子を表す。
得られた重い試薬と、対応する軽い試薬（２−ニトロ［12Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド）とをそれぞれマススペクトロメトリ−により測定した。重い試薬と軽い試薬の構造式を化１に示す。式中、*は、13Ｃで標識された炭素原子を表す。
・重い試薬
(m/z) 195.10(M+, 34.1), 160.10(15.2), 144.10(4.7), 131.10(25.0), 114.10(15.6), 99.20(100.0), 83.10(10.6), 71.20(32.3), 54.20(12.3)
・軽い試薬
(m/z) 189.00(M+, 35.3), 154.10(15.8), 138.10(4.9), 125.10(26.3), 108.10(17.6), 93.10(100.0), 78.10(14.1), 66.10(32.2), 50.20(15.3)
(m/z) 195.10(M+, 34.1), 160.10(15.2), 144.10(4.7), 131.10(25.0), 114.10(15.6), 99.20(100.0), 83.10(10.6), 71.20(32.3), 54.20(12.3)
・軽い試薬
(m/z) 189.00(M+, 35.3), 154.10(15.8), 138.10(4.9), 125.10(26.3), 108.10(17.6), 93.10(100.0), 78.10(14.1), 66.10(32.2), 50.20(15.3)
重い試薬と軽い試薬とのマススペクトルを比較すると、分子イオン及びベンゼン環を有するフラグメントイオンは全て６ダルトンの差があり、それぞれのフラグメントピークの強度は全て同程度であった。
［実施例２：分離実験］
モデルペプチドとしてACTH、Galanin及びPTH、ラベル化試薬として２−ニトロ［12Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド（軽い試薬）を用い、ラベル化されたペプチドとラベル化されていないペプチドとが分離されるかどうかを確認する実験を行った。
モデルペプチドとしてACTH、Galanin及びPTH、ラベル化試薬として２−ニトロ［12Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド（軽い試薬）を用い、ラベル化されたペプチドとラベル化されていないペプチドとが分離されるかどうかを確認する実験を行った。
ACTH１６０μｇ（５．４×１０−８ｍｏｌ）を７０％酢酸水溶液１００μｌに溶解した。ここに２−ニトロ［12Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド０．４１ｍｇ（４０ｍｏｌ）を加え、室温下１時間ボルテックスミキサーにより撹拌した。反応溶液を氷冷後、氷冷したエーテル８００μｌを加え、遠心分離した。沈殿を氷冷したエーテルで洗浄し、ラベル化体を得た。ラベル化したペプチドと、ラベル化に供しなかったペプチドとをそれぞれ混合し、逆相カラム（ＬＣ）による分離を行った。Galanin及びPTHについても同様にして分離を行い、それぞれの保持時間を以下に示した。（ラベル化したペプチドは、mod-を用いて表した。）なお、簡略された系であるため、酵素消化は行わなかった。
（保持時間）
ACTH １６．５７分
mod-ACTH ３４．７８分
Galanin ２１．７８分
mod-Galanin ３５．２７分
PTH ２４．７８分
mod-PTH ３５．４７分
ACTH １６．５７分
mod-ACTH ３４．７８分
Galanin ２１．７８分
mod-Galanin ３５．２７分
PTH ２４．７８分
mod-PTH ３５．４７分
（条件）
Ａ buffer ：０．０１Ｍ ＨＣＯＯＨ−Ｅｔ３Ｎ（ｐＨ ４．５）
Ｂ液 ：ＣＨ３ＣＮ
Ｂ液の勾配：０％〜１００％を５０分かけて流した。
カラム ：Shimpack VP-ODS、２５０*４．５ｍｍ
Ａ buffer ：０．０１Ｍ ＨＣＯＯＨ−Ｅｔ３Ｎ（ｐＨ ４．５）
Ｂ液 ：ＣＨ３ＣＮ
Ｂ液の勾配：０％〜１００％を５０分かけて流した。
カラム ：Shimpack VP-ODS、２５０*４．５ｍｍ
上に示すように、ラベル化されたものとそうでないものとでは、３種全てにおいて保持時間に１０〜１８分の差が生じた。従って、ＬＣによってラベル化ペプチドのみを分離できることが分かった。
また、２−ニトロ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド（重い試薬）を用いて同様の分離実験を行ったところ、保持時間は同一であったため、重い試薬でもラベル化ペプチドのみを分離できることが分かった。
［実施例３：分離実験］
（ラベル化）
モデルタンパク質としてリゾチームを用い、実施例２と同じ趣旨の分離実験を行った。本実施例では、ラベル化、化学的処理、及び酵素消化をこの順で行った。
リゾチームを実施例２と同様の方法で「軽い試薬」を用いてラベル化し、洗浄、凍結乾燥した。次いで以下に示す方法により化学的処理（ジスルフィド結合の還元及びＳ−カルバミドメチル化）と酵素消化とを行った。
（ラベル化）
モデルタンパク質としてリゾチームを用い、実施例２と同じ趣旨の分離実験を行った。本実施例では、ラベル化、化学的処理、及び酵素消化をこの順で行った。
リゾチームを実施例２と同様の方法で「軽い試薬」を用いてラベル化し、洗浄、凍結乾燥した。次いで以下に示す方法により化学的処理（ジスルフィド結合の還元及びＳ−カルバミドメチル化）と酵素消化とを行った。
（ジスルフィド結合の還元）
ここに、１００ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３溶液を加えて溶解し、１つのジスルフィド結合に対し５０倍量のＤＴＴを加え、５６℃で１時間反応させた。
ここに、１００ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３溶液を加えて溶解し、１つのジスルフィド結合に対し５０倍量のＤＴＴを加え、５６℃で１時間反応させた。
（Ｓ−カルバミドメチル化）
反応溶液を室温まで放冷後、ヨードアセトアミドの１００ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３溶液を加え、室温で１時間反応させた。反応溶液をセファデックスＧ１０のカラムで精製し、凍結乾燥した。
反応溶液を室温まで放冷後、ヨードアセトアミドの１００ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３溶液を加え、室温で１時間反応させた。反応溶液をセファデックスＧ１０のカラムで精製し、凍結乾燥した。
（酵素消化）
ここに５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３−５ｍＭ ＣａＣｌ２溶液に溶解したトリプシンを適当量加え、３７℃、１６時間反応させた。
ここに５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３−５ｍＭ ＣａＣｌ２溶液に溶解したトリプシンを適当量加え、３７℃、１６時間反応させた。
上述の一連の処理を行って得られたラベル化ペプチドフラグメントを含む消化物を、ＬＣにより分離した。このときのＬＣチャートを図１に示す。図１においては、横軸に保持時間（分；min）、縦軸にピーク強度（mAU）を表す。その結果、保持時間２９〜３９分の画分（detected fraction a）に目的とするラベル化ペプチドフラグメントが全て含まれていた。表１は、ＬＣの前（before LC）におけるリゾチーム由来ペプチドと、ＬＣの後（after LC）にdetected fraction a（Fr.a）において観測されたリゾチーム由来ペプチドフラグメントとのマススペクトルにおける（質量／電荷）(m/z)を比較してまとめたものである。表中、括弧内の数字はアミノ酸配列の番号を表し、Ｗが付された数字はラベル化されたトリプトファンを含有するペプチドフラグメントを表す。
（条件）
Ａ：０．１％ＴＦＡ
Ｂ：０．０７％ＴＦＡ ｉｎ ＣＨ３ＣＮ
Ｂの勾配：０％〜１００％を１００分かけて流した。
カラム：Shimpack VP-ODS、１５０*４．６ｍｍ
Ａ：０．１％ＴＦＡ
Ｂ：０．０７％ＴＦＡ ｉｎ ＣＨ３ＣＮ
Ｂの勾配：０％〜１００％を１００分かけて流した。
カラム：Shimpack VP-ODS、１５０*４．６ｍｍ
上に示すように、ＬＣによってラベル化ペプチドフラグメントのみを分離できることが分かった。
また、２−ニトロ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド（重い試薬）を用いて同様の分離実験を行ったところ、重い試薬でもラベル化ペプチドのみを分離できることが分かった。
［実施例４：分離実験］
本実施例では、ラット（ウィスター(Wister)）血清を用い、ラベル化、酵素消化及び分離精製後、実際に目的とするトリプトファン含有ペプチドフラグメントがどのように濃縮されてくるのかを調べる実験を行った。サンプルは、ラット血清２μｌ（総蛋白量１００μｇ）を２サンプル用意し、それぞれについて一方のサンプルは「軽い試薬」、他方のサンプルは「重い試薬」を用いて実施例２と同様にしてラベル化した。これらを混合し、実施例３と同様にして化学的処理及び酵素消化を行い、ラベル化ペプチドフラグメントを含む消化物を得た。次いでセファデックスＬＨ２０のカラムで分離精製を次のような条件で行った。
本実施例では、ラット（ウィスター(Wister)）血清を用い、ラベル化、酵素消化及び分離精製後、実際に目的とするトリプトファン含有ペプチドフラグメントがどのように濃縮されてくるのかを調べる実験を行った。サンプルは、ラット血清２μｌ（総蛋白量１００μｇ）を２サンプル用意し、それぞれについて一方のサンプルは「軽い試薬」、他方のサンプルは「重い試薬」を用いて実施例２と同様にしてラベル化した。これらを混合し、実施例３と同様にして化学的処理及び酵素消化を行い、ラベル化ペプチドフラグメントを含む消化物を得た。次いでセファデックスＬＨ２０のカラムで分離精製を次のような条件で行った。
カラム容量：２．０ｍｌ
分取容量 ：１２０μｌ
溶離溶媒 ：３０％アセトニトリル
分取容量 ：１２０μｌ
溶離溶媒 ：３０％アセトニトリル
分取後、１フラクションづつMALDI−TOFMSで確認を行い、６ダルトンの差で現れるラベル化ペプチドフラグメントのピークを観測した。図２は、このピーク対の数をカウントし、グラフ化したものである。図２は、横軸に分取番号（fraction number）、縦軸にピーク対の数（number of pair peaks）を表す。図２が示すように、フラクションの１６から２３くらいまで目的のピーク対が見られた。すなわち、分取については１．８ｍｌから２．８ｍｌの計１ｍｌを取れば良いことがわかった。また実際は、これより多少多めにとってもかまわない事がわかった。
［実施例５］
本実施例では、トリプトファン残基とシステイン残基とを両方有するペプチドを用いた。実施例３及び４のように、ラベル化を化学的処理の前に行う場合、システイン残基はトリプトファン残基と同様にラベル化され、ラベル化の直後は、システイン残基及びトリプトファン残基が両方ラベル化されたペプチドが生成し得る。このペプチドが化学的処理後にはトリプトファン残基のみがラベル化されたペプチドに変換されることを確認する実験を行った。
本実施例では、トリプトファン残基とシステイン残基とを両方有するペプチドを用いた。実施例３及び４のように、ラベル化を化学的処理の前に行う場合、システイン残基はトリプトファン残基と同様にラベル化され、ラベル化の直後は、システイン残基及びトリプトファン残基が両方ラベル化されたペプチドが生成し得る。このペプチドが化学的処理後にはトリプトファン残基のみがラベル化されたペプチドに変換されることを確認する実験を行った。
NDDGGFSEEWEAQRDSHLGC（配列表の配列番号１）の配列を有するペプチド、presinilin-1(331-349)-Cys（Bachem社製、MW=2252.3）を用い、実施例２と同様にしてラベル化を行った。ラベル化前のペプチドのMALDI-TOFMSのスペクトルチャート（シグナル強度：１０８ｍＶ）を図３下段に示し、ラベル化によって得られたラベル化ペプチドのMALDI-TOFMSのスペクトルチャート（シグナル強度：２１ｍＶ）を図３中段に示す。なお、図３中の全てのチャートにおいて、横軸は（質量／電荷）（(Mass/Charge)；(m/z)）を表し、縦軸はイオンの相対強度（%Int.）を表す。これらチャートが示すように、(m/z)=２２５２．０４のシグナルを与える配列表の配列番号１のペプチドが、(m/z)=２５５９．４４のシグナルを与える化合物に変化した。これは、トリプトファンとシステインの両方がラベル化されたペプチドNDDGGFSEEW(Nbs)EAQRDSHLGC(Nbs)（配列表の配列番号2）に相当する。ここでW(Nbs)は、ラベル化されたトリプトファン残基を表し、C(Nbs)は、ラベル化されたシステイン残基を表す。
次に、還元・アルキル化による一連の化学的処理を、それぞれTCEPとヨードアセトアミドとによって行った。このとき得られたペプチドのMALDI-TOFMSのスペクトルチャート（シグナル強度：６０ｍＶ）を図３上段に示す。これらチャートが示すように、(m/z)=２５５９．４４のシグナルを与える配列表の配列番号２のペプチドが、(m/z)=２４３６．６のシグナルを与える化合物へと変化した。これはラベル化によるシステイン上の標識置換基が還元剤で開裂し、ヨードアセトアミドによりアミドメチル化（AM）されたペプチドNDDGGFSEEW(Nbs)EAQRDSHLGC(AM)（配列表の配列番号３）である。ここで、C(AM)は、アミドメチル化されたシステイン残基を表す。
［実施例６：定量的解析］
まず、サンプルペプチドとしてACTH、Galaninを用い、２つの異なる状態の細胞をこれらのペプチドの含有比率を次のように設定することでモデル化した。
まず、サンプルペプチドとしてACTH、Galaninを用い、２つの異なる状態の細胞をこれらのペプチドの含有比率を次のように設定することでモデル化した。
・セルＡ ACTH：Galanin＝１：１（モル比）
・セルＢ ACTH：Galanin＝１：２（モル比）
・セルＡとセルＢとの含有ACTH比 セルＡ：セルＢ＝１：１（モル比）
・セルＡとセルＢとの含有Galanin比 セルＡ：セルＢ＝１：２（モル比）
・セルＢ ACTH：Galanin＝１：２（モル比）
・セルＡとセルＢとの含有ACTH比 セルＡ：セルＢ＝１：１（モル比）
・セルＡとセルＢとの含有Galanin比 セルＡ：セルＢ＝１：２（モル比）
次に、これら各々の系について、セルＡについては「軽い試薬」を用い、セルＢについては「重い試薬」を用い、実施例２と同様の方法でラベル化反応を行った。これらの系は簡略化されたものであるため、化学的処理及び酵素消化は行わなかった。
さらに、ラベル化反応後のこれら２つの系を混合し、セファデックスＧ２５を用いてゲル濾過した。
ゲル濾過したペプチドを、ＬＣを用いてラベル化ペプチドのみを分離した。このようにして得られたラベル化ペプチドを、MALDI−TOFMSによって測定した。得られたマススペクトルを図４及び図５（図４の続き）に示した。図４及び図５において、横軸は（質量／電荷）（(Mass/Charge)；(m/z)）を表し、縦軸はイオンの相対強度（%Int.）を表す。
マススペクトルの結果より、イオンのピーク強度比から、設定したペプチド含有率が正確に反映された。なお、「軽い試薬」によって修飾を受けたペプチドをL-mod、「重い試薬」によって修飾を受けたペプチドをH-modと表記した。
・イオンピーク
(m/z)＝3086.60［ACTH(L-mod)］、3092.64［ACTH(H-mod)］、3316.68［Galanin(L-mod)］、3322.68［Galanin(H-mod)］
・ピーク強度比
ACTH(L-mod)：ACTH(H-mod)＝１：１
Galanin(L-mod)：Galanin(H-mod)＝１：２
(m/z)＝3086.60［ACTH(L-mod)］、3092.64［ACTH(H-mod)］、3316.68［Galanin(L-mod)］、3322.68［Galanin(H-mod)］
・ピーク強度比
ACTH(L-mod)：ACTH(H-mod)＝１：１
Galanin(L-mod)：Galanin(H-mod)＝１：２
［実施例７：定量的解析］
モデルペプチドとして、α−ラクトアルブミン( LCA_BOVIN )、グリセルアルデヒド−３−フォスフェートデヒドロゲナーゼ( G3P_RABIT )、フォスフォリラーゼＢ( PHS2_RABIT )、及びオボアルブミン( OVAL_CHICK )（全てシグマ社製）を用い、２つの異なる状態の細胞をこれらのペプチドの含有比率を次のように設定することでモデル化した。
モデルペプチドとして、α−ラクトアルブミン( LCA_BOVIN )、グリセルアルデヒド−３−フォスフェートデヒドロゲナーゼ( G3P_RABIT )、フォスフォリラーゼＢ( PHS2_RABIT )、及びオボアルブミン( OVAL_CHICK )（全てシグマ社製）を用い、２つの異なる状態の細胞をこれらのペプチドの含有比率を次のように設定することでモデル化した。
・セルA LCA_BOVIN、G3P_RABIT、PHS2_RABIT、OVAL_CHICK
（全て１２．５μｇずつ含有）
・セルＢ LCA_BOVIN、G3P_RABIT、PHS2_RABIT、OVAL_CHICK
（全て２５μｇずつ含有）
・セルＡとセルＢとの含有ペプチド比 セルA：セルB＝１：２（モル比）
（全て１２．５μｇずつ含有）
・セルＢ LCA_BOVIN、G3P_RABIT、PHS2_RABIT、OVAL_CHICK
（全て２５μｇずつ含有）
・セルＡとセルＢとの含有ペプチド比 セルA：セルB＝１：２（モル比）
次に、これら各々の系について、セルＡについては「軽い試薬」を用い、セルＢについては「重い試薬」を用い、実施例２と同様の方法でラベル化反応を行った。ラベル化後２つの溶液を混合し、次いで実施例３と同様に化学的処理及び酵素消化を行い、ラベル化ペプチドフラグメントを含む消化物を得た。この消化物をセファデックスＬＨ２０のカラムで分離精製してMALDI-TOFMS分析を行った。その結果を表２に示す。表２には遺伝子名（Gene Name）、同定されたペプチドの配列（Peptide Sequence Identified）、（軽い試薬でラベル化されたペプチドの量）／（重い試薬でラベル化されたペプチドの量）の実測比（Observed Ratio (13C0 / 13C6)）、（軽い試薬でラベル化されたペプチドの量）／（重い試薬でラベル化されたペプチドの量）の理論比（Expected Ratio (13C0 / 13C6)）、実測比の平均と理論比との差（Mean+-SD）、及びエラー値（Error(%)）を示す。
表２に示すように、用いたサンプルペプチド各々について、ラベル化ペプチドフラグメントに由来するトリプトファン含有ペプチドフラグメントが同定できた。さらに、観測されたそれぞれの実測比については、エラー値が９％以下であり、理論比と良い一致を示した。
（同定されたペプチドフラグメント）
・LCA_BOVIN由来
IWCK（配列表の配列番号４）
LDQWLCEK（配列表の配列番号５）
LDQWLCEKL（配列表の配列番号６）
VGINYNLAHK（配列表の配列番号７）
・G3P_RABIT由来
GLWEK（配列表の配列番号８）
GLWEKAFK（配列表の配列番号９）
・PHS2_RABIT由来
LWR
LISWYDNEFGYSNR（配列表の配列番号１０）
・OVAL_CHICK由来
WIR
EWTR（配列表の配列番号１１）
EWTRMVIR（配列表の配列番号１２）
・LCA_BOVIN由来
IWCK（配列表の配列番号４）
LDQWLCEK（配列表の配列番号５）
LDQWLCEKL（配列表の配列番号６）
VGINYNLAHK（配列表の配列番号７）
・G3P_RABIT由来
GLWEK（配列表の配列番号８）
GLWEKAFK（配列表の配列番号９）
・PHS2_RABIT由来
LWR
LISWYDNEFGYSNR（配列表の配列番号１０）
・OVAL_CHICK由来
WIR
EWTR（配列表の配列番号１１）
EWTRMVIR（配列表の配列番号１２）
［実施例８：定量的解析］
本実施例ではラット（ウィスター）の血清にサンプル蛋白質である卵白リゾチーム（シグマ社製）を加えて、実際にリゾチーム由来のシグナルが観測されるかどうかを調べた（スパイクテスト）。２つの異なる状態の細胞をこのペプチドの含有量を次のように設定することでモデル化した。
本実施例ではラット（ウィスター）の血清にサンプル蛋白質である卵白リゾチーム（シグマ社製）を加えて、実際にリゾチーム由来のシグナルが観測されるかどうかを調べた（スパイクテスト）。２つの異なる状態の細胞をこのペプチドの含有量を次のように設定することでモデル化した。
・セルA ラット血清５μｌ + 卵白リゾチーム３μｇ（０．２１ｎｍｏｌ）
・セルＢ ラット血清５μｌ + 卵白リゾチーム６μｇ（０．４２ｎｍｏｌ）
・セルAとセルＢとの含有リゾチーム比 セルA：セルＢ＝１：２ （モル比）
なお、用いたラット血清５μｌ中の総蛋白量は０．２８ｍｇ、アルブミンは０．１４ｍｇ（２．１ｎｍｏｌ）である。
・セルＢ ラット血清５μｌ + 卵白リゾチーム６μｇ（０．４２ｎｍｏｌ）
・セルAとセルＢとの含有リゾチーム比 セルA：セルＢ＝１：２ （モル比）
なお、用いたラット血清５μｌ中の総蛋白量は０．２８ｍｇ、アルブミンは０．１４ｍｇ（２．１ｎｍｏｌ）である。
次に、これら各々についてセルAにつては「重い試薬」を用い、セルＢについては「軽い試薬」を用い実施例２と同様の方法でラベル化反応を行った。ラベル化後の反応溶液を混合し、次いで実施例３と同様に化学的処理及び酵素消化を行い、ラベル化ペプチドフラグメントを含む消化物を得た。この消化物をセファデックスＬＨ２０のカラムで分離精製してMALDI-TOFMS分析を行った。このときのスペクトルチャートを図６に示す。図６中、横軸は（質量／電荷）（(Mass/Charge)；(m/z)）を表し、縦軸はイオンの相対強度（%Int.）を表す。図６に示すようにリゾチーム由来のフラグメント、(m/z)＝１１９９．３３、１２０５．２７が観測され、ピークの強度比は２：１であった。従って、実測比（observed ratio）は２であり、理論比（expected ratio）２と一致した。すなわち、エラー値は０％である。このことは、生体サンプル中においても添加したリゾチームの相対比がそのまま酵素消化後に得られたペプチドフラグメントの相対比として得られたことを示している。
上記実施例の結果が示すように、本発明の方法を用いるとエラー値が全て９％以下となり、高い定量性を示した。
［実施例９：定量的解析］
本実施例では実際の生体試料を用いて定量的解析を行った。
以下の２つの系統のラット血清を用いた。
本実施例では実際の生体試料を用いて定量的解析を行った。
以下の２つの系統のラット血清を用いた。
Ａ：SPF/VAF Crj Wister rat（正常ラット）
Ｂ：SPF/VAF GK/Crj rat （高血糖ラット、血糖値３７２ｍｇ／ｄｌ）
Ｂ：SPF/VAF GK/Crj rat （高血糖ラット、血糖値３７２ｍｇ／ｄｌ）
各々のラットからの血清を２μｌずつサンプルとして用い、LCQ DecaXP（Thermo Finnigan社製）−LCAd-Vpシステム（(株)島津製作所製）によってESI-MS/MS測定を行った以外は実施例７と同様に定量的解析を行った。その結果、その結果を表３に示す。表３には遺伝子名（Gene Name）、同定されたペプチドの配列（Peptide Sequence Identified）、（正常ラット由来のペプチドの量）／（高血糖ラット由来のペプチドの量）の実測比（Observed Ratio (Wister / GK)）を示す。
（同定されたペプチドフラグメント）
AWAVAR（配列表の配列番号１３）
NTAAWAK（配列表の配列番号１４）
WKIRK（配列表の配列番号１５）
AWAVAR（配列表の配列番号１３）
NTAAWAK（配列表の配列番号１４）
WKIRK（配列表の配列番号１５）
上述のように、実施例においては、スルフェニル化合物として２−ニトロ［13Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリドを合成し、それをラベル化試薬として用い、ACTH、Galanin、PTH、リゾチーム、ラット血清、presinilin-1(331-349)-Cys、α−ラクトアルブミン、グリセルアルデヒド−３−フォスフェートデヒドロゲナーゼ、フォスフォリラーゼＢ、及びオボアルブミンの解析に用いた。しかし、本発明は、上記スルフェニル化合物に限られることなく、一般式（I）で表されるすべてのスルフェニル化合物に適用される。また、本発明のラベル化試薬は、一般式（I）で表されるすべてのスルフェニル化合物を用いることができる。さらに、本発明の方法は、上記ペプチドに限られることなく、タンパク質を含めるすべてのペプチドに適用することができる。そのため、前述の実施例はあらゆる点で単なる例示に過ぎず、限定的に解釈してはならない。さらに、特許請求の範囲の均等範囲に属する変更は、全て本発明の範囲内のものである。
なお、配列表フリーテキスト（人工配列の記載(Description of Artificial Sequence)）において、配列番号１は、プレセニリン−１(３３１−３４９)−Cysであり、配列番号２は、ラベル化されたプレセニリン−１(３３１−３４９)−Cysであり、配列番号３はアミドメチル化されたラベル化プレセニリン−１(３３１−３４９)−Cysである。
本発明によれば、反応性及び選択性に優れ、マススペクトルでの解析が容易で定量性も高く、かつ特殊なカラムを必要としないラベル化試薬に用いることができるスルフェニル化合物、それを用いたラベル化試薬、及びそのラベル化試薬を用いたタンパク質・ペプチドの解析方法が提供される。
配列番号１は、プレセニリン−１(３３１−３４９)−Cysであり、配列番号２は、ラベル化されたプレセニリン−１(３３１−３４９)−Cysであり、配列番号３はアミドメチル化されたラベル化プレセニリン−１(３３１−３４９)−Cysである。
Claims (16)
- 一般式：
Ｒ−Ｓ−Ｘ （Ｉ）
（式中、Ｒは、同位体で標識された少なくとも１つの構成元素を有する有機基を表し、Ｘは脱離基を表す。）
で表されるスルフェニル化合物であって、
２−ニトロ［ 13 Ｃ ６ ］ベンゼンスルフェニルクロリド、４−ニトロ［ 13 Ｃ ６ ］ベンゼンスルフェニルクロリド、２，４−ジニトロ［ 13 Ｃ ６ ］ベンゼンスルフェニルクロリド、及び２−ニトロ−４−カルボキシ［ 13 Ｃ ６ ］ベンゼンスルフェニルクロリドからなる群から選ばれるスルフェニル化合物。 - 一般式：
Ｒ−Ｓ−Ｘ （Ｉ）
（式中、Ｒは、同位体で標識された少なくとも１つの構成元素を有する有機基を表し、Ｘは脱離基を表す。）
で表されるスルフェニル化合物を含むラベル化試薬であって、
前記スルフェニル化合物が、２−ニトロ［ 13 Ｃ ６ ］ベンゼンスルフェニルクロリド、４−ニトロ［ 13 Ｃ ６ ］ベンゼンスルフェニルクロリド、２，４−ジニトロ［ 13 Ｃ ６ ］ベンゼンスルフェニルクロリド、及び２−ニトロ−４−カルボキシ［ 13 Ｃ ６ ］ベンゼンスルフェニルクロリドからなる群から選ばれる、ラベル化試薬。 - ペプチドの解析の用途における、請求項２に記載のラベル化試薬。
- 前記スルフェニル化合物から選ばれた１つの化合物と、前記選ばれた１つの化合物（重い試薬）と同一構造であり且つ前記同位体で標識されていない化合物（軽い試薬）とをそれぞれ別個に含む、請求項２に記載のラベル化試薬。
- 一般式：
Ｒ−Ｓ−Ｘ （Ｉ）
（式中、Ｒは、同位体で標識された少なくとも１つの構成元素を有する有機基を表し、Ｘは脱離基を表す。）
で表されるスルフェニル化合物を含むラベル化試薬を用いるペプチドの解析法であって、
前記式（Ｉ）で表される同位体で標識されたスルフェニル化合物が、２−ニトロ［ 13 Ｃ ６ ］ベンゼンスルフェニルクロリド、４−ニトロ［ 13 Ｃ ６ ］ベンゼンスルフェニルクロリド、２，４−ジニトロ［ 13 Ｃ ６ ］ベンゼンスルフェニルクロリド、及び２−ニトロ−４−カルボキシ［ 13 Ｃ ６ ］ベンゼンスルフェニルクロリドからなる群から選ばれる、ペプチドの解析法。 - 前記ラベル化試薬が、前記式（Ｉ）で表される同位体で標識されたスルフェニル化合物から選ばれた１つの化合物（重い試薬）と、前記選ばれた化合物と同一構造であり且つ前記同位体で標識されていない化合物（軽い試薬）とをそれぞれ別個に含む、請求項５に記載のペプチドの解析法。
- 前記ラベル化試薬を用いて、解析すべきペプチドのアミノ酸残基をラベル化し、得られたラベル化ペプチドをマススペクトロメトリーにより測定する、請求項５に記載のペプチドの解析法。
- （ｉ）解析すべきペプチドを、前記式（Ｉ）で表される同位体で標識されたスルフェニル化合物から選ばれた１つの化合物（重い試薬）、及び前記選ばれた化合物と同一構造であり且つ前記同位体で標識されていない化合物（軽い試薬）のいずれか一方を用いてラベル化し、ラベル化された解析すべきペプチドを得て、
（ｉｉ）別途、対照ペプチドを、前記重い試薬及び前記軽い試薬のいずれか他方を用いてラベル化し、ラベル化された対照ペプチドを得て、
（ｉｉｉ）（ｉ）で得られたラベル化された解析すべきペプチドと（ｉｉ）で得られたラベル化された対照ペプチドとを混合し、
（ｉｖ）混合したラベル化ペプチドをマススペクトロメトリーによって測定する、請求項７に記載のペプチドの解析法。 - 必要に応じて酵素消化及び／又は還元とアルキル化とによる化学的処理を行う、請求項７に記載のペプチドの解析法。
- 前記酵素消化を前記ラベル化の前又は後に行う、請求項９に記載のペプチドの解析法。
- 前記化学的処理を前記ラベル化の前又は後に行う、請求項９に記載のペプチドの解析法。
- 前記化学的処理、前記酵素消化、及び前記ラベル化をこの順で行う、請求項９に記載のペプチドの解析法。
- 前記化学的処理、前記ラベル化、及び前記酵素消化をこの順で行う、請求項９に記載のペプチドの解析法。
- 前記ラベル化、前記化学的処理、及び前記酵素消化をこの順で行う、請求項９に記載のペプチドの解析法。
- 前記ラベル化の後、必要に応じゲル濾過による分離と逆相カラムを用いる分離とを含むラベル化ペプチドの精製を行う、請求項７に記載のペプチドの解析法。
- 前記アミノ酸残基がトリプトファン残基である、請求項７に記載のペプチドの解析法。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002191496 | 2002-06-28 | ||
| JP2002191497 | 2002-06-28 | ||
| JP2002191496 | 2002-06-28 | ||
| JP2002191497 | 2002-06-28 | ||
| PCT/JP2003/004308 WO2004002950A1 (ja) | 2002-06-28 | 2003-04-03 | スルフェニル化合物、ラベル化試薬、及びペプチドの解析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2004002950A1 JPWO2004002950A1 (ja) | 2005-10-27 |
| JP3976048B2 true JP3976048B2 (ja) | 2007-09-12 |
Family
ID=30002326
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004517238A Expired - Fee Related JP3976048B2 (ja) | 2002-06-28 | 2003-04-03 | スルフェニル化合物、ラベル化試薬、及びペプチドの解析方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20050221413A1 (ja) |
| EP (1) | EP1533296A4 (ja) |
| JP (1) | JP3976048B2 (ja) |
| AU (1) | AU2003236369A1 (ja) |
| WO (1) | WO2004002950A1 (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1739419A4 (en) * | 2004-04-13 | 2008-12-03 | Shimadzu Corp | METHOD FOR MEASURING SUBSTANCES BY MEANS OF MASS SPECTROSCOPY AND KIT THEREFOR |
| US20050224710A1 (en) * | 2004-04-13 | 2005-10-13 | Eiichi Matsuo | Method for measuring hydrophobic peptides using maldi mass spectrometer |
| KR100611313B1 (ko) * | 2004-06-30 | 2006-08-10 | 고려대학교 산학협력단 | 폴리펩티드의 ｎ-말단 치환용 화합물, 이를 이용한폴리펩티드 내의 아미노산 서열분석 및 정량방법 |
| US7354996B2 (en) | 2004-09-07 | 2008-04-08 | Shimadzu Corporation | Method and kit for quantitative analysis of protein |
| JP4854271B2 (ja) * | 2005-11-01 | 2012-01-18 | キユーピー株式会社 | 血清コレステロール低下に関与するｃｙｐ７ａ１酵素活性化剤 |
| WO2007108140A1 (ja) * | 2006-03-22 | 2007-09-27 | Shimadzu Corporation | 電気泳動法及び質量分析法を用いるタンパク質試料の同定及び定量法 |
| JP4609370B2 (ja) * | 2006-04-24 | 2011-01-12 | 株式会社島津製作所 | 硫黄含有ペプチドの処理法及び硫黄原子含有ペプチドの解析法 |
| EP2028492A4 (en) | 2006-06-05 | 2009-06-10 | Shimadzu Corp | TUMOR MARKERS AND METHOD FOR DETERMINING THE IMPACT OF ANY CANNULAR DISEASE |
| JPWO2008032868A1 (ja) * | 2006-09-15 | 2010-01-28 | 株式会社島津製作所 | 腎癌の腫瘍マーカー及び腎癌の罹患の識別方法 |
| JP4775714B2 (ja) * | 2006-11-27 | 2011-09-21 | 株式会社島津製作所 | タンパク質同定方法、およびタンパク質同定装置 |
| JP2017161447A (ja) * | 2016-03-11 | 2017-09-14 | 株式会社島津製作所 | 分析方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3701044B2 (ja) * | 1995-04-24 | 2005-09-28 | 住友精化株式会社 | シアノベンゼンスルフェニルハライドおよびそれを用いる３−置換ベンゾイソチアゾールの製造方法 |
| US6670194B1 (en) * | 1998-08-25 | 2003-12-30 | University Of Washington | Rapid quantitative analysis of proteins or protein function in complex mixtures |
| WO2001012594A1 (fr) * | 1999-08-12 | 2001-02-22 | Nippon Finechemical Co., Ltd. | Procede de preparation de chlorures de sulfenyle aromatiques et autres |
-
2003
- 2003-04-03 US US10/518,358 patent/US20050221413A1/en not_active Abandoned
- 2003-04-03 EP EP03761759A patent/EP1533296A4/en not_active Withdrawn
- 2003-04-03 AU AU2003236369A patent/AU2003236369A1/en not_active Abandoned
- 2003-04-03 WO PCT/JP2003/004308 patent/WO2004002950A1/ja active Application Filing
- 2003-04-03 JP JP2004517238A patent/JP3976048B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2003236369A1 (en) | 2004-01-19 |
| US20050221413A1 (en) | 2005-10-06 |
| JPWO2004002950A1 (ja) | 2005-10-27 |
| EP1533296A1 (en) | 2005-05-25 |
| WO2004002950A1 (ja) | 2004-01-08 |
| EP1533296A4 (en) | 2006-06-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20080242838A1 (en) | Labeling reagent and methods of use | |
| JP2004533610A (ja) | タンパク質サンプルを分析するためのプロセス | |
| EP1397686B1 (en) | Method for characterizing polypeptides | |
| JP3976048B2 (ja) | スルフェニル化合物、ラベル化試薬、及びペプチドの解析方法 | |
| US7250266B2 (en) | Selective labeling agent for phosphoproteome analysis and phosphorylated site analysis | |
| US20050042713A1 (en) | Characterising polypeptides | |
| US20050042676A1 (en) | Characterising polypeptides | |
| KR100611313B1 (ko) | 폴리펩티드의 ｎ-말단 치환용 화합물, 이를 이용한폴리펩티드 내의 아미노산 서열분석 및 정량방법 | |
| US9581601B2 (en) | Method of detection of amino acid sequence and/or identification of peptides and proteins, by use of a new derivatization reagent and synthesis of 5-formyl-benzene-1,3-disulphonic acid as derivatization reagent | |
| JP2010509569A (ja) | タンパク質ラベリングにおけるアリールボロン酸の使用 | |
| US20060234314A1 (en) | Selective binding and analysis of macromolecules | |
| KR20050079558A (ko) | 인산화 단백질의 질량 분석 및 인산화 위치 분석용 표지물질 | |
| AU2002310610A1 (en) | Characterising polypeptides | |
| AU2002302837A1 (en) | Characterising polypeptides | |
| AU2003287673A1 (en) | Method for analysing amino acids, peptides and proteins using mass spectroscopy of fixed charge-modified derivatives |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070220 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070420 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070529 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070611 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100629 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 3976048 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100629 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110629 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110629 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120629 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130629 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130629 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140629 Year of fee payment: 7 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |