JP2017161447A - 分析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】質量分析計を用いて、インタクトなタンパク質を分析する方法を提供する。【解決手段】質量分析計（３０）は、イオン化部（２）、第一質量分離部（３）、開裂部（４）、第二質量分離部（５）；および検出部（６）を備える。分析対象のタンパク質をインタクトなタンパク質として含む試料が質量分析計に導入され、イオン化部（２）でイオン化される。イオン化は、例えばエレクトロスプレーイオン化法により行われる。第一質量分離部（３）は、特定のｍ／ｚを有するイオンをプリカーサイオンとして選別する。本発明の分析方法では、プリカーサイオンとして、タンパク質の多価イオンが選別される。【選択図】図１

Description

本発明は、質量分析計を用いたタンパク質の分析方法に関する。

血液等の生体試料中のタンパク質濃度を正確に定量することは、機能研究、病態把握、医薬品開発等において重要である。例えば、インスリンは、生体中の血糖を下げるホルモンであり、血中のインスリン濃度を測定することにより、糖尿病の診断や病態把握、治療奏功の判定が行われている。

生体試料中の特定のタンパク質を高感度に検出して定量可能な手法として、ＥＬＩＳＡ法等の免疫学的測定法が広く用いられている。免疫学的測定法は、抗体やキット等の消耗品が高価であることや、キットの個体差等に起因する測定誤差が生じ易いことが問題である。

近年、生体試料等の様々な夾雑物を含有する試料中の特定のタンパク質やペプチドを個別に定量可能な手法として、質量分析（ＭＳ）を用いた分析方法が注目されている（例えば特許文献１参照）。中でも、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）とタンデム型質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）とを組み合わせたＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いたマルチプル・リアクション・モニタリング（ＭＲＭ）は、多様な夾雑物を含む試料中の目的物質を高精度で定量可能であり、生体試料中のタンパク質の分析方法としての応用が進んでいる。

ＭＲＭでは、試料中の各成分がＬＣで時間的に分離されて質量分析計に導入される。質量分析計に導入された試料は、イオン化プローブでイオン化され、様々なイオンを生じる。プローブで発生したイオン（プリカーサイオン）は、前段のＭＳで、ｍ／ｚに基づいて検出対象となる特定のイオンが選択され、コリジョンセルで、衝突誘起解離（ＣＩＤ）により複数種のイオン（プロダクトイオン）を生成する。後段のＭＳで、ｍ／ｚに基づいて特定のプロダクトイオンが検出器へ透過され、検出器でプロダクトイオンが定量される。分析対象のタンパク質のプリカーサイオンとプロダクトイオンの組み合わせ（トランジション）およびＣＩＤのコリジョンエネルギーを予め選択しておけば、測定ごとに条件の最適化を行う必要がない。そのため、簡便な手法で、生体試料中に含まれる微量のタンパク質を高感度に分析することが可能である。

タンパク質の多くは、数千Ｄａ〜数万Ｄａの分子量を有する。一方、質量分析計の質量ダイナミックレンジには限界がある。例えば、四重極型質量分析計で検出可能なｍ／ｚの上限は２０００〜３０００程度である。そのため、ＭＲＭ分析では、質量分析計での分析に適した分子量を有するように、タンパク質の前処理が行われるのが一般的である。

タンパク質を低分子量化する前処理としては、プロテアーゼ消化により、タンパク質を特定のアミノ酸配列位置で切断する方法が一般的である。タンパク質にジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合が残存していると、プロテアーゼ消化により生じるペプチドフラグメントの種類が多様となり、ＭＲＭトランジションの予測が困難となる。そのため、インスリンのようにジスルフィド結合を有するタンパク質が分析対象である場合は、試料の前処理として、還元アルキル化等によりジスルフィド結合を切断後にプロテアーゼ消化を行うのが一般的である。

ＷＯ２０１２／１２１３０２号パンフレット

上記のように、タンデム型質量分析計を用いたタンパク質の分析は、分析方法自体は簡便である。一方で、ジスルフィド結合の切断やプロテアーゼ消化等の前処理は、工数および時間を要する。また、前処理による試料のロスが生じ、定量性の低下を招く場合がある。

多種多様な夾雑物を含む生体試料のプロテアーゼ消化を実施すると、生体試料中に含まれる分析対象以外のタンパク質もプロテアーゼ消化されるため、膨大な種類のペプチド断片が生成する。そのため、検出および定量に最適なペプチド断片の選択は容易ではない。

上記に鑑み、本発明は、プロテアーゼ消化やジスルフィドの切断等の前処理を行わずに、インタクトなタンパク質を質量分析計により分析可能な分析方法の提供を目的とする。

本発明に用いられる質量分析計は、いわゆるタンデム型の質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）である。質量分析計は、イオン化部、第一質量分離部、開裂部、第二質量分離部、および検出部を備える。このような質量分析計の好ましい例として、トリプル四重極質量分析計が挙げられる。イオン化部におけるタンパク質のイオン化法としては、エレクトロスプレーイオン化法が好ましい。

本発明の分析方法では、試料が質量分析計のイオン化部に導入される。試料中には、分析対象のタンパク質がインタクトなタンパク質として含まれている。イオン化部でイオン化された試料は、第一質量分離部に導入される。第一質量分離部では、特定のｍ／ｚを有するイオンがプリカーサイオンとして選別される。本発明の分析方法では、プリカーサイオンとして多価イオンが選別される。プリカーサイオンのｍ／ｚは、５００〜２０００が好ましい。

選別されたプリカーサイオンは、開裂部に導入され、複数種のプロダクトイオンを生成する。プロダクトイオンは第二質量分離部に導入され、ｍ／ｚに基づいて選別される。第二質量分離部で選別された特定のｍ／ｚを有するプロダクトイオンは、検出部で検出される。第二質量分離部では、５００以上のｍ／ｚを有するプロダクトイオンが選別されることが好ましい。

本発明の分析方法では、インスリン等のジスルフィド結合を有するタンパク質をインタクトのまま質量分析計に導入してもよい。特に、分析対象のタンパク質が３０００〜１００００Ｄａの分子量を有する場合に、高精度での分析が可能である。分析対象がインスリンである場合、第一質量分離部では、インスリンの４価〜６価のイオンがプリカーサイオンとして選別されることが好ましい。

本発明の分析方法により、生体試料等の夾雑物を含む試料中の特定のタンパク質を検出・定量することが可能である。本発明の分析方法は、プロテアーゼ処理等を行うことなく、インタクトなタンパク質を質量分析計に導入するため、簡便かつ低コストである。

ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いた分析方法の概要を示す概念図である。 ヒトインスリン標品のプリカーサスキャンのＭＳクロマトグラムである。 ヒトインスリン標品のプリカーサスキャンのマススペクトルである。 ヒトインスリン標品のＭＲＭ分析結果であり、（Ａ）はＭＲＭクロマトグラム、（Ｂ）はピーク面積に基づく検量線である。 ヒト血漿へのインスリンのスパイク試料のＭＲＭ分析結果であり、（Ａ）はＭＲＭクロマトグラム、（Ｂ）はピーク面積に基づく検量線である。 （Ａ）および（Ｂ）は、それぞれ健常人から採取した血漿のＭＲＭクロマトグラムである。

本発明の分析方法では、質量分析計を用いて試料中のタンパク質の検出や定量分析が行われる。

［試料の準備］
まず、分析対象となる試料が準備される。分析対象となる試料はタンパク質を含むものであれば特に限定されない。分析対象試料としては、血液、血清、血漿、組織抽出液、細胞抽出液、尿、脳脊髄液等の生体試料が挙げられる。生体試料中には、様々なタンパク質が含まれている。また、タンパク質以外にも多種多様な夾雑物が含まれている。

分析対象試料は、質量分析計への導入前に、脱塩、可溶化、濃縮、乾燥等の処理が行われてもよい。例えば、脱塩および濃縮は、固相抽出（ＳＰＥ）用のスピンカラムやウェルプレート等を用いて行うことができる。また、固相抽出操作を自動化したオンラインＳＰＥシステムとＬＣ／ＭＳ／ＭＳとを組み合わせることにより、生体試料をそのままインジェクションして分析に供することもできる。

本発明の分析方法では、インタクトなタンパク質が質量分析計に導入される。そのため、試料の前処理として、プロテアーゼ処理等のタンパク質の一次構造を変化させる処理や、ジスルフィド結合等のアミノ酸残基間の共有結合を切断する処理を行う必要がない。なお、尿素変性やｐＨ変性のように、共有結合の切断を伴わない変性処理を行うことは差支えない。

タンパク質を含む生体試料の分析前処理として一般に行われる還元アルキル化やプロテアーゼ消化では、高濃度の試薬を試料に添加する必要がある。本発明の方法では、これらの処理を必要としないため、質量分析におけるイオンサプレッションやノイズを低減できる。

ここで、「インタクトなタンパク質」とは、正常状態で合成され生体中に存在するタンパク質であり、生体から採取後に、ペプチド結合やジスルフィド結合等の共有結合の切断が人為的に行われていないものを指す。プレプロタンパク質、プロタンパク質等プロセシングされる前のタンパク質や、プロセシングを受けたタンパク質も、「インタクトなタンパク質」に含まれる。細胞内で起こるプロセシング、タンパク質の寿命によるペプチド断片化、生体内の細胞外でのタンパク質分解等は、いずれも非人為的なプロセスであり、これらのプロセシングを受けたタンパク質が生体から抽出されたものも、「インタクトなタンパク質」に含まれる。

必要に応じて脱塩や濃縮等を行った後、試料を質量分析計に導入する。生体試料は、種々の夾雑物を含有しているため、試料が質量分析計に導入される前に、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）により、試料中の各成分が時間的に分離されることが好ましい。すなわち、本発明の分析方法は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）とタンデム質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）とを組み合わせたＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて行われることが好ましい。

ＬＣ／ＭＳ／ＭＳでは、試料中の各成分が、質量分析の前段のＬＣで時間的に分離される。そのため、各成分の保持時間に従って、プリカーサイオンとプロダクトイオンのｍ／ｚの組（トランジション）を切り替えることにより、分析対象タンパク質由来のプロダクトイオンを高精度かつ高感度で検出できる。

図１は、タンデム型質量分析計を用いた分析方法の概要を示す概念図である。質量分析計は、真空ポンプ（不図示）により真空排気される分析室３０の内部に、イオン化部２、第一質量分離部３、開裂部４、第二質量分離部５、および検出部６を備える。

イオン化部２で、分析対象のタンパク質を含む試料がイオン化される。イオン化の方法は特に限定されず、電子イオン化（ＥＩ）法、化学イオン化（ＣＩ）法、脱離電子イオン化（ＤＥＩ）法、脱離化学イオン化（ＤＣＩ）法、高速原子衝突（ＦＡＢ）法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法等が挙げられる。

中でも、タンパク質の構造を破壊することなくイオン化が可能であり、液体クロマトグラフィーからの試料の導入が容易であることから、ＥＳＩ法が好ましい。また、本発明の分析方法では、プリカーサイオンとして多価イオンが選択されることから、多価イオンを生成しやすいＥＳＩ法が適している。

第一質量分離部３および第二質量分離部５は、ｍ／ｚに基づいてイオンを分離するように構成されている。質量分離部における分離方法としては、四重極（Ｑ）型、四重極イオントラップ（ＱＩＴ）型、飛行時間（ＴＯＦ）型等が挙げられる。第一質量分離部３と第二質量分離部５のイオン分離方法は同一でも異なっていてもよい。第一質量分離部と第二質量分離部の組み合わせとしては、Ｑ／Ｑ、Ｑ／ＴＯＦ、ＴＯＦ／ＴＯＦ等が挙げられる。本発明の分析方法においては、第一質量分離部３および第二質量分離部５がいずれもＱ型であり、両者の間に、質量分離の機能を有していない四重極を備えるトリプル四重極（ＱｑＱ）型の質量分析計が好ましく用いられる。

トリプル四重極質量分析計は、それぞれ４本のロッド電極から成る３段の四重極３，４，５、およびイオンを検出してイオン量に応じた検出信号を出力する検出器６を備える。第一段四重極３および第三段四重極５は四重極マスフィルタである。第二段四重極４は単なる四重極（または多重極）のイオンガイドであり、質量分離の機能を有していない。

第一段四重極３には、直流電圧と高周波電圧とを合成した電圧が印加され、これにより発生する電場の作用により、イオン化部２で生成された各種イオンの中で特定のｍ／ｚを有する目的イオンのみがプリカーサイオンとして選別される。

第二段四重極４は、密閉性が高いコリジョンセル９に収納されている。このコリジョンセル９内には、アルゴン等のＣＩＤガスが導入される。第一段四重極３から第二段四重極４に送られたプリカーサイオンは、コリジョンセル９内でＣＩＤガスと衝突し、衝突誘起解離による開裂を生じてプロダクトイオンが生成される。この開裂の態様は様々であるため、通常、一種のプリカーサイオンからｍ／ｚの異なる複数種のプロダクトイオンが生成する。これら各種のプロダクトイオンがコリジョンセル９から、第三段四重極５に導入される。通常、第二段四重極４には、高周波電圧のみが印加されるか、または高周波電圧に直流バイアス電圧を加算した電圧が印加され、この第二段四重極４はイオンを収束させつつ後段の第三段四重極５に輸送するイオンガイドとして機能する。

第三段四重極５には、第一段四重極３と同様に、直流電圧と高周波電圧とを合成した電圧が印加される。これにより発生する電場の作用により、第三段四重極５では特定のｍ／ｚを有するプロダクトイオンのみが選別され、検出器６に透過される。第３段四重極５に印加する直流電圧および高周波電圧を適宜変化させることにより、第三段四重極５を通過し得るイオンのｍ／ｚを走査（プロダクトイオンスキャン）することができる。

第三段四重極５で選別されたプロダクトイオンは、検出器６で検出され、検出されたプロダクトイオン量に応じた電気信号がデータ処理部（不図示）に送信される。データ処理部は、プロダクトイオンのマススペクトル（ＭＳ／ＭＳスペクトル）を作成することができ、プロダクトイオンのピーク面積から、プロダクトイオン量を定量できる。

本発明の分析方法では、第一質量分離部において、プリカーサイオンとして多価イオンが選択される。分子量の大きいタンパク質でも、多価イオンであればｍ／ｚが小さいため、質量分析計の質量ダイナミックレンジ内でインタクトなタンパク質のイオンを検出および選別できる。

例えば、四重極の質量ダイナミックレンジの上限は２０００〜３０００程度である。分析対象がインスリン（５８０７Ｄａ）である場合、１価イオンは四重極のダイナミックレンジ外であるが、３価正イオン（ｍ／ｚ １９３７．３）、４価正イオン（ｍ／ｚ １４５３）、５価正イオン（ｍ／ｚ １１６２．５）、６価正イオン（ｍ／ｚ ９６９）は、四重極のダイナミックレンジ内のｍ／ｚを有する。

プリカーサイオンのｍ／ｚは、５００〜２０００の範囲内が好ましく、９００〜１５００がより好ましい。分析対象のタンパク質がインスリンである場合、プリカーサイオンの価数は４価〜６価が好ましく、５価イオンが特に好ましい。

より分子量の大きいタンパク質を分析対象とする場合、ｍ／ｚが上記範囲となるように、より価数の大きい多価イオンをプリカーサとして選択すればよい。ただし、イオン価数の増大に伴ってＭＳの価数分布が大きくなるため、選別対象のプリカーサイオンの生成量が減少する傾向がある。そのため、高精度の分析結果を得る観点から、プリカーサイオンの価数は２０以下が好ましく、１０以下がより好ましい。

プリカーサイオンの価数およびｍ／ｚが上記範囲内であれば、ＥＳＩによるイオン生成量が大きいため、分析精度に優れる。そのため、本発明の方法を、生体試料中の分析対象タンパク質の濃度の定量にも応用可能である。本発明の方法の適用に好適なタンパク質の分子量は、２０００〜１００００Ｄａであり、３０００〜８０００Ｄａが特に適している。

第一質量分離部３で分離され選別されたプリカーサイオンとしての多価イオンは、開裂部４で開裂され、複数種のプロダクトイオンが生成する。プロダクトイオンは第二質量分離部５でｍ／ｚに基づいて分離・選別される。開裂部４で生成するイオンの種類および量は、ＣＩＤのコリジョンエネルギーに依存する。そのため、第二質量分離部５で選別されるプロダクトイオンに応じて、当該プロダクトイオンの生成量が最大となるコリジョンエネルギー（最適コリジョンエネルギー）を分析条件に組み込んでおくことが好ましい。

タンデム型質量分析計を用いたＭＲＭ分析では、プリカーサイオンを適切に選択することに加えて、定量性および再現性の良いプロダクトイオンを選択することが好ましい。様々な夾雑物を含有する試料のＭＲＭ分析では、分析対象以外のタンパク質やペプチドが、分析対象のタンパク質やペプチドと同一のプリカーサイオンやプロダクトイオンを生じる可能性がある。

質量分析計の検出器で検出されたプロダクトイオン量に基づいて、試料中の分析対象タンパク質の含有量（濃度）を算出できる。例えば、タンパク質の量とプロダクトイオン量とを予め関連付けておくことにより、プロダクトイオン量から試料中のタンパク質の含有量を算出できる。

タンパク質の含有量とプロダクトイオン量とを関連付ける方法としては、例えば、外部標準による検量線（標準曲線）を用いる方法が挙げられる。検量線は、本分析（試料の分析）と同一の条件で、タンパク質濃度が既知の標準試料の分析を行い、濃度とプロダクトイオンのピーク面積（あるいはピーク強度）とをプロットすることによって得られる。分析対象試料に予め内部標準を加えて測定を行い、内部標準に由来するプロダクトイオン量と、分析対象のタンパク質に由来するプロダクトイオン量とを関連付けることもできる。

前述のように、本発明の分析方法は、ジスルフィド結合の切断やプロテアーゼ処理等を行うことなく、インタクトなタンパク質を質量分析計に導入するため、簡便かつ低コストである。また、これらの前処理を必要としないため、試料のロスが少なく、高い分析精度を実現可能である。

試料中のタンパク質のプロテアーゼ消化を行うと、分析対象以外のタンパク質もプロテアーゼ消化されるため、数残基〜数十残基のペプチド断片が多数産生される。そのため、分析対象以外のタンパク質由来のペプチドが、分析対象のタンパク質由来のペプチドと同一のアミノ酸配列を有する場合があり、分析対象のタンパク質に特有のプリカーサイオンとプロダクトイオンの組み合わせを適切に選択することが困難な場合がある。

これに対して、本発明の方法では、プロテアーゼ消化が行われないため、試料内に含まれるペプチドの種類を低減できる。また、プリカーサイオンとしてインタクトなタンパク質の多価イオンが選択されるため、分析対象以外のタンパク質から、分析対象のタンパク質由来のプロダクトイオンと同一のプロダクトイオンが生成する確率は極めて低い。そのため、本発明の分析方法は、ＭＲＭトランジションの選択を容易に行い得るとの利点を有する。

以下に、ヒトインスリンの分析例を示し、本発明を具体的に説明する。ヒトインスリンは２１アミノ酸残基からなるＡ鎖と３０アミノ酸残基からなるＢ鎖とが２本のジスルフィド結合により結合した分子量５８０７Ｄａのペプチドホルモンであり、Ａ鎖内にも１つのジスルフィド結合を有している。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。以下における％は、特に断りがない限り重量％である。

本実施例では、高速液体クロマトグラフ‐トリプル四重極型ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム（島津製作所製、ＬＣＭＳ−８０６０）により、以下に示す条件で分析を行った。

＜ＬＣ条件＞
ＬＣシステム：高速液体クロマトグラフ Nexera X2
分析カラム： Shim-pack ODS-III
流速： ０．４ｍｌ／分
移動相： Ａ液 ０．１％ギ酸水溶液、Ｂ液 ０．１％ギ酸アセトニトリル溶液
グラジエントプログラム：以下の表１に示す通り
＜ＭＳ条件＞
イオン化モード： ＥＳＩ（＋）

［実験例１］精製タンパク質溶液を用いた検証および検量線の作成
＜試料のＳＰＥ処理＞
９６ウェルの陰イオン交換ＳＰＥプレートにメタノール（５００μｌ）を加えて遠心し、次いで超純水（５００μｌ）を加えて遠心した。所定量のヒトインスリンの標品を添加して遠心した後、５％アンモニア水（５００μｌ）を加えて遠心し、次いで１０％アセトニトリル（５００μｌ）を加えて遠心し、溶出液を回収した。ＳＰＥ処理後の試料に４０％酢酸（２００μｌ）を添加して、分析用試料とした。

＜ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析＞
（プリカーサスキャン）
ヒトインスリン標品のプリカーサスキャンのＭＳクロマトグラムを図２、マススペクトルを図３に示す。図２および図３に示すように、ＬＣ溶出時間４．８分に、ｍ／ｚ ９６９、１１６２、１４５２のピークが確認された。これらのピークは、それぞれインスリンの６価、５価、４価のイオンと同定された。

（プロダクトスキャン）
インスリンの４価イオン、５価イオンおよび６価イオンをプリカーサイオンとして選択し、プロダクトスイオンスキャンを行い、表２に示すプリカーサイオンとプロダクトイオンのｍ／ｚの組合せ、および各プロダクトイオンの最適コリジョンエネルギー（ＣＥ）を得た。

表２に示すトランジションの中で、プリカーサイオン：ｍ／ｚ １１６２．５（５価イオン）、プロダクトイン：ｍ／ｚ １４１０．１の組み合わせが、最も大きなプロダクトイオン検出量を示した。以下では、このＭＲＭ条件で分析を実施した。

＜検量線の作成＞
ＳＰＥプレートにロードするインスリンの量を変化させて、ＭＲＭ分析を行った。結果を図４に示す。図４（Ａ）は、ＭＲＭクロマトグラムであり、インスリンのロード量が２ｆｍｏｌの試料でも、プロダクトイオンが検出されていることが分かる。インスリンのロード量を横軸、プロダクトイオン量（ピーク面積）の対数を縦軸としてプロットしたところ、インスリンの両とピーク面積の対数との間に線形関係がみられ、図４（Ｂ）に示す検量線が得られた。

［実験例２］スパイクテスト
＜試料の前処理＞
血漿（５００μｌ）を、容量２ｍｌのチューブに採取し、５０％酢酸を（５μｌ）を添加し、次いで５％アンモニア水（５００μｌ）を添加した。この試料に、所定濃度（１ｐＭ、１０ｐＭ、３０ｐＭ、１００ｐＭ）となるようにインスリン標品を添加した後、ＳＰＥプレートにロードし、実施例１と同様にして分析用試料を調製した。

＜ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析＞
上記実施例１と同様の条件でＭＲＭ分析を実施した結果を図５に示す。図５（Ａ）はＭＲＭクロマトグラムであり、インスリンのスパイク濃度が１ｐＭの試料でも、プロダクトイオンが検出されていることが分かる。インスリンのロード量を横軸、プロダクトイオン量（ピーク面積）の対数を縦軸としてプロットしたところ、インスリンの両とピーク面積の対数との間に線形関係がみられ、図５（Ｂ）に示す検量線が得られた。

図５（Ｂ）の検量線の濃度０への外挿入値（切片）と検量線の傾きから、インスリンをスパイクしていない血漿中のインスリン濃度が約３０ｐＭと見積もられた。図５（Ａ）では、インスリンがスパイクされていない血漿のクロマトグラムのピーク高さの推定値が点線で示されている。図５（Ａ）の右側に両矢印で示されている範囲（ピーク高さ）が、濃度約３０ｐＭに対応している。

［実施例３］ヒト血漿のＭＲＭ分析
２人の健常人から採取した血漿を試料として、実施例２と同様に前処理を行った後、インスリンをスパイクせずにＭＲＭ分析を実施した。結果を図６（Ａ）および図（Ｂ）に示す。

上記実施例２では、内因のインスリン以外に種々の夾雑を含むヒト血漿へのスパイクテストにおいて、インスリンのスパイク量に依存した面積強度変化がみられた。また、実施例３の結果から、インスリンをスパイクしていない血漿を試料とした場合にも、同一のＭＲＭ条件で、インスリン由来のプロダクトイオンの検出が確認された。

これらの結果から、上記表２のＭＲＭ分析条件が、多数の夾雑物を含む生体試料中のインスリン濃度の定量に有効であることが確認された。すなわち、４価〜６価の多価イオンをプリカーサイオンとして、表２に示すトランジション（プロダクトイオンとプリカーサイオンの組み合わせ）を用いてＭＳ／ＭＳ分析を実施することにより、インタクトなインスリンを高精度で検出および定量可能である。

なお、ｍ／ｚの値は、質量分析計の分離精度や検出器の種類等により多少の差異を生じるため、インスリンのＭＲＭ分析で適用可能なプリカーサイオンおよびプロダクトイオンのｍ／ｚは、表２に示す値の±１の範囲であれば許容できる。また、表２に示すｍ／ｚを有するプリカーサイオンおよびプロダクトイオンの同位体を選別対象としてＭＲＭ分析を実施してもよい。

Claims (9)

1. 質量分析計を用いたタンパク質の分析方法であって、
   質量分析計は、試料をイオン化するイオン化部；特定のｍ／ｚを有するイオンをプリカーサイオンとして選別する第一質量分離部；第一質量分離部で選別されたプリカーサイオンから複数種のプロダクトイオンを生成する開裂部；前記プロダクトイオンをｍ／ｚに基づいて選別する第二質量分離部；および前記第二質量分離部で選別された特定のｍ／ｚを有するプロダクトイオンを検出する検出部を備え、
   分析対象のタンパク質をインタクトなタンパク質として含む試料が質量分析計のイオン化部に導入され
   前記第一質量分離部において、前記タンパク質の多価イオンが前記プリカーサイオンとして選別される、分析方法。
2. 前記イオン化部において、エレクトロスプレーイオン化法により前記タンパク質のイオン化が行われる、請求項１に記載の分析方法。
3. 前記質量分析計がトリプル四重極質量分析計である、請求項１または２のいずれか１項に記載の分析方法。
4. 前記プリカーサイオンのｍ／ｚが５００〜２０００である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の分析方法。
5. 前記プロダクトイオンのｍ／ｚが５００以上である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の分析方法。
6. 分析対象のタンパク質がジスルフィド結合を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の分析方法。
7. 分析対象のタンパク質の分子量が、２０００〜１００００Ｄａである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の分析方法。
8. 分析対象のタンパク質がインスリンである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の分析方法。
9. 前記プリカーサイオンが４価〜６価のイオンである、請求項８に記載の分析方法。

Images