JP2004503780A - リンペプチドの選択的標識および単離ならびにプロテオーム分析への適用 - Google Patents
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Abstract
天然および合成のオリゴマーおよびポリマー中のリン酸基を、カルボン酸基のような化学的に関連のある基の存在下で、選択的に標識するための方法が提供される。この方法は、リンペプチド、リンタンパク質およびリン脂質を含む、生物学的なオリゴマーおよびポリマーに対して特に適用可能である。特定の実施形態において、タンパク質およびペプチド中のリン酸基を選択的に標識することは、例えば、複雑なタンパク質の混合物中のリンタンパク質およびリンペプチドの分離、単離ならびに検出を容易にする。選択的標識を使用して、オリゴマーまたはポリマー（例えば、ペプチドまたはタンパク質）中のリン酸基にリン酸標識を選択的に導入し得る。この標識の存在の検出を使用して、オリゴマーまたはポリマー中のリン酸基の存在を検出する。この方法は、リンタンパク質またはリンペプチドの検出に有用である。
Description
【０００１】
（発明の分野）
リン酸基の選択的な化学標識のための一般的な方法が提供され、この方法は１または数個のリン酸基を含む分子の非常に特異的な精製を容易にする。この方法は、リンタンパク質およびリンペプチドにおけるリン酸の選択的標識に適用可能である。質量分析技術と組み合わせた場合、この方法を使用して複雑な混合物中のリン酸化されたタンパク質を検出および同定し得、そしてリン酸化されたアミノ酸を正確に同定し得る。本発明は、プロテオミクス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）分野における適用性を有し、プロテオミクス分野において、本発明は、細胞または組織中のタンパク質リン酸化の定量的で全体的な分析を容易にする。
【０００２】
（発明の背景）
タンパク質は、実際に全ての生物学的プロセスの制御および実施に必須である。タンパク質の合成速度および半減期は転写後に制御され、故にそれらの発現のレベルもまた、転写後に制御される。さらに、タンパク質の活性は、しばしば転写後修飾によって（特にタンパク質のリン酸化において）調節され、タンパク質と他の分子（ＤＮＡおよびタンパク質を含む）との関連性に依存する。タンパク質の発現レベルも活性状態も、遺伝子配列またはさらには対応するｍＲＭＡの転写物の発現レベルから直接的に明らかではない。従って、生物学的システムの完全な説明は、そのシステムを構成するタンパク質の同定、定量および活性の状態を示す測定を含まなければならない。細胞または組織で発現されるタンパク質のラージスケール（最終的には全体的な）分析は、プロテオーム分析と呼ばれている（Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｓ．Ｒ．、Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｍ．Ｒ．、Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ，Ｄ．Ｆ．、およびＤｕｎｎ，Ｍ．Ｊ．（１９９７）、「Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｆｒｏｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．７：１６８〜１７３）。
【０００３】
現在、ゲノム技術の自動化の処理能力およびそのレベルに近接するタンパク質分析技術は存在しない。最も一般的なプロテオーム分析の実施は、複雑なタンパク質サンプルの分離（最も一般的には二次元ゲル電気泳動（２ＤＥ）による）、その後の分離されたタンパク質種の逐次の同定に基づく（Ｄｕｃｒｅｔ，Ａら（１９９８）、「Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｅｌｅｃｔｏｒｏｓｐｒａｙ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」、Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．７：７０６〜７１９；Ｇａｒｒｅｌｓ，Ｊ．Ｉ．ら（１９９７）、「Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｂｕｎｄａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」、１８：１３４７〜１３６０；Ｌｉｎｋ，Ａ．Ｊ．ら（１９９７）、「Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｔｙｐｅ−ｓｔｒａｉｎ ＮＣＴＣ ８１４３」、Ｅｌｅｃｔｏｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：１３１４〜１３３４；Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ，Ａ．ら（１９９６）、「Ｌｉｎｋｉｎｇ ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｗｏ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｇｅｌｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１４４４０〜１４４４５；Ｇｙｇｉ，Ｓ．Ｐ．ら（１９９９）、「Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｍＲＮＡ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｉｎ ｙｅａｓｔ」、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９：１７２０〜１７３０；Ｂｏｕｃｈｅｒｉｅ，Ｈ．ら（１９９６）、「Ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｇｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １７：１６８３〜１６９９）。
【０００４】
２ＤＥアプローチは、強力な質量分析技術ならびにタンパク質およびペプチドの質量スペクトルデータと配列のデータベースとを相関させることにより、迅速かつ確証的にタンパク質を同定するコンピュータアルゴリズムの開発によって、変革を受けてきた（Ｅｎｇ，Ｊ．、ＭｃＣｏｒｍａｃｋ，Ａ．，およびＹａｔｅｓ，Ｊ．Ｉ．（１９９４）、「Ａｎ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａｌ ｄａｔａ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ」、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．５：９７６〜９８９；Ｍａｎｎ，Ｍ．およびＷｉｌｍ，Ｍ．（１９９４）、「Ｅｒｒｏｒ−ｔｏｌｅｒａｎｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ ｂｙ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６６：４３９０〜４３９９；Ｙａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．ら（１９９５）、「Ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７：１４２６〜１４３６）。
【０００５】
この技術は、銀染色を含む従来のタンパク質染色法によって検出可能な本質的に任意のタンパク質の同定を現在可能にしている感度レベルに達した（Ｆｉｇｅｙｓ，Ｄ．およびＡｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ．（１９９８）、「Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｙ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９：８８５〜８９２；Ｆｉｇｅｙｓ，Ｄ．ら（１９９８）、「Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｍｅｓ」、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９：１８１１〜１８１８；Ｆｉｇｅｙｓ，Ｄ．ら（１９９７）、「Ａ ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎ ｔｒａｐ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：３１５３〜３１６０；Ｆｉｇｅｙｓ，Ｄ．ら（１９９６）、「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｍｉｃｒｏｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ−ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｚｏｎｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ−ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ−ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１５７９〜１５８３；Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ，Ａ．ら（１９９６）、「Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉｌｖｅｒ−ｓｔａｉｎｅｄ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌｓ」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８：８５０〜８５８）。しかし、サンプルが処理される、この一連の様式は、サンプルの処理能力を制限する。最も感度の高い方法は自動化が困難であり、調節タンパク質のような少量のタンパク質は、予備的な富化なしには検出さず、従って、この技術のダイナミックレンジ（ｄｙｎａｍｉｃ ｒａｎｇｅ）を事実上制限する。２ＤＥに基づくアプローチにおいて、タンパク質は、２ＤＥゲルの染色されたスポットのデンシトメトリーによって定量される。
【０００６】
マイクロキャピラリー液体クロマトグラフィー（μＬＣ）およびデータベース検索と連結した、自動化されたデータ依存性のエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）タンデム質量分析（ＭＳｎ）のための方法および装置の開発は、ゲル分離タンパク質同定の感度およびスピードを顕著に増加させてきた。プロテオーム分析に対する２ＤＥ／ＭＳｎアプローチの代替として、複雑なタンパク質混合物の消化により生成されたペプチド混合物のタンデム質量分析による直接分析が、提唱されてきた（Ｄｏｎｇｒ’ｅ，Ａ．Ｒ．ら（１９９７）、「Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｔａｎｄｅｍ−ｍａｓｓ−ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、「Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：４１８〜４２５」）。μＬＣ−Ｍｓ／ＭＳはまた、ゲル電気泳動での分離なしに混合物から直接個々のタンパク質をラージスケールで同定するために首尾よく使用されてきた（Ｌｉｎｋ，Ｊ．ら（１９９９）、「Ｄｉｒｅｃｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：６７６〜６８２；Ｏｐｉｔｅｃｋ，Ｇ．Ｊ．ら（１９９７）、「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｏｎ−ｌｉｎｅ ＬＣ／ＬＣ／ＭＣ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：１５１８〜１５２４）。
【０００７】
これらのアプローチは、タンパク質同定を劇的に加速するが、分析されたタンパク質の定量は、質量分析が本来定量的デバイスではないという観点に起因して、容易に決定され得ない。質量分析法によるタンパク質混合物の直接的な質量分析は、安定同位体希釈理論（これによって、２つの化学的に同一な分析物（内部標準を代表する分析物および測定されるサンプル）が、同一な化学組成物であるが、質量の異なる安定同位元素のタグで標識される）の適用によって定量的になされ得る。この原理は、同位体でコードされた親和性タグ（ｉｓｏｔｏｐｅ ｃｏｄｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇ）（ＩＣＡＴ）と呼ばれる化学試薬クラスの開発によって、定量的プロテオーム分析において実施されてきた（Ｇｙｇｉ，Ｓ．Ｐ．ら（１９９９）、「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｕｓｉｎｇ ｉｓｏｔｏｐｅ−ｃｏｄｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇｓ」、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７、９９４〜９９９）。ＩＣＡＴ試薬およびその複雑なタンパク質混合物の分析への適用は、２ＤＥ／ＭＳｎアプローチが遭遇するダイナミックレンジの問題を実質的に軽減することが示されている。
【０００８】
タンパク質のリン酸化は、細胞内の最も重要な調節事象の１つである。多数の酵素およびプロセスの活性状態ならびに特定のタンパク質の機能的複合体への会合は、しばしばタンパク質の可逆的なリン酸化によって制御される（Ｇｒａｖｅｓ，Ｊ．Ｄ．およびＫｒｅｂｓ，Ｅ．Ｄ．（１９９９）、「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ」，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．８２、１１１〜１２１；Ｋｏｃｈ，Ｃ．Ａ．ら（１９９１）、「ＳＨ２ ａｎｄ ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎｓ：ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２、６６８〜６７４；Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．（１９９４）、「１００１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ ｒｅｄｕｘ−ｔｏｗａｒｄｓ ２０００」、Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５，３６７〜３７６）。タンパク質のリン酸化を研究する本質的な目的は、リンタンパク質のリン酸化部位の生物学的機能の同定、定量および決定である。このような研究の困難性のほとんどは、多くのリンタンパク質が、非常に定量でしか存在しないという事実にある。さらに、タンパク質は、しばしば低い化学量論でリン酸化され、かつ複数の部位でリン酸化される。従って、このような分析に十分な量の純粋なリンタンパク質を獲得することは、一般的に困難である。タンパク質のリン酸化部位の分析のための現在の方法の全ては、１回につき１つの精製されたリンタンパク質に焦点が当てられている（Ｖｅｒｍａ，Ｒ．ら（１９９７）、「Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｃ１ｐ ｂｙ Ｇ１ Ｃｄｋ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｉｔｓ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｔｒｙ ｉｎｔｏ Ｓ ｐｈａｓｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８、４５５〜６０；Ｗａｔｔｓ，Ｊ．Ｄ．ら（１９９４）、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｓｏｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｊｕｒｋａｔ Ｔ ｃｅｌｌ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ＺＡＰ−７０」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、２９５２０〜２９５２９；Ｇｉｎｇｒａｓ，Ａ．Ｃ．ら（１９９９）、「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ４Ｅ−ＢＰ１ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ：ａ ｎｏｖｅｌ ｔｗｏ−ｓｔｅｐ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ」、Ｇｅｎｅ Ｄｅｖ．１３、１４２２〜１４３７）。細胞性タンパク質は、協調的にリン酸化され、特定の生物学的プロセスを制御するので、タンパク質のリン酸化による生物学的システムを制御する複雑なメカニズムを、現在の技術を使用して研究することは、困難である。
【０００９】
リンペプチドは、代表的に、タンパク質消化において稀かつ低容量であるので、質量分析のためには、非常に精製されているか、または富化されたリンペプチドサンプルが必要である。ＭＳ分析前にリンペプチドを選択的に富化することの必要性は、単一の精製されたリンタンパク質よりもむしろタンパク質の混合物が分析される場合に、特に急務である。さらに、タンパク質のリン酸化を直接的に定量するＭＳに基づく方法は、現在のところ利用可能ではない。タンパク質リン酸化の定量的な研究は、しばしば、３２Ｐ放射性標識のような方法を含む（Ｏｄａ，Ｙ．ら（１９９９）、「Ａｃｃｕｒａｔｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ ９６：６５９１〜６５９６）。従って、タンパク質の複雑な混合物からのリン酸化部位の同定およびその定量の両方を可能にする、ＭＳに基づく方法はプロテオーム分析の必須部分である。
【００１０】
従って、特に複雑なタンパク質混合物中のタンパク質リン酸化の分析のためのより迅速かつ一般的な方法（これは、個々のリンタンパク質が均質になるまでの精製を必要としない）の実質的な必要性が当該分野に存在する。本発明はこのような方法を提供する。
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、天然のリン酸基ならびにカルボン酸基のような化学的に関連する基が存在する合成オリゴマーおよび合成ポリマーのリン酸基を選択的に標識する方法を提供する。この方法は、生物学的なオリゴマーおよびポリマー（リンペプチド、リンタンパク質およびリン脂質を含む）に特に適用可能である。タンパク質およびペプチド中のリン酸基の選択的標識は、例えば、タンパク質の複雑な混合物中のリンタンパク質およびリンペプチドの分離、単離、および検出を容易にする。選択的な標識を使用してオリゴマーまたはポリマー（例えば、ペプチドまたはタンパク質）中のリン酸基にリン酸標識を選択的に導入し得る。この標識の存在の検出は、オリゴマーまたはポリマーのリン酸基の存在を検出するために使用される。この方法は、特にリンタンパク質またはリンペプチドの検出にその用途がある。リン酸標識は、担色標識、放射性標識、同位体標識、蛍光もしくはりん光標識、親和性標識、またはリン酸標識、親和性標識あるいは固相材料へのオリゴマーもしくはポリマー（タンパク質もしくはペプチド）の選択的な結合を可能にする反応性基（もしくは潜在的な反応性基）を保有するリンカー基であり得る。
【００１２】
リン酸基のその親和性標識への選択的な結合、または固体支持体への選択的な結合は、少なくとも１つのリン酸基を保有するオリゴマーもしくはポリマー（例えば、タンパク質もしくはペプチド）の選択的な単離を可能にする。親和性標識の存在は、親和性標識に特異的に結合する捕捉試薬を使用して、選択的に標識されたオリゴマーまたはポリマーを捕捉することを可能にする。オリゴマーまたはポリマーの固体表面への選択的な共有結合を可能にするリンカーの存在は、サンプル中の選択的に標識されたオリゴマーまたはポリマーを非選択的に標識された（リン酸化されていない）種から物理的に分離することを可能にする。この方法は、カルボン酸基の存在下でリン酸基を有するタンパク質およびペプチド（リンタンパク質およびリンペプチド）を選択的に標識するために特に有用である。本発明のこの方法を使用して、リンタンパク質およびリンペプチドをリン酸化されていないタンパク質の混合物および／またはリン酸化されていないペプチドの混合物から特異的に分離し得、従って、サンプル中のこれらの種の低いレベルに起因する検出の問題を克服し得る。
【００１３】
特定の実施形態において、この方法は、１以上のサンプル中のリンペプチドおよびリンタンパク質の分離、検出および同定に適用される。この方法は、ペプチドまたはタンパク質中の１以上のリン酸基の存在の検出を可能にするリン酸標識を選択的に導入することに簡単に使用され得る。この方法はまた、ペプチドもしくはタンパク質中のリン酸化部位に親和性標識を選択的に導入するか、またはリンタンパク質もしくはリンペプチドを固体表面へ選択的に結合させるために使用され得る。
【００１４】
周知の質量分析法と組み合わせた場合、本発明の選択的標識方法は、混合物からのリンペプチドの分離を容易にし、質量分析によるリンペプチドの検出を容易にし、そしてタンデム質量分析によるペプチドの配列決定を容易にする。当該分野で公知の方法が、サンプル中で検出されたリンペプチドの配列からサンプル中のリンタンパク質を同定するために適用され得る。差示的な同位体標識のための方法と組み合わせた場合、本発明の方法を使用して、異なるサンプル中のリンペプチドおよびリンタンパク質の相対量を定量し得る。これらの定量的な方法は、異なる供給源由来（例えば、異なる細胞型もしくは異なる生物由来）のサンプル中、刺激（例えば、薬物の投与もしくは潜在的な毒性物質との接触）によってか、環境の変化（例えば、栄養レベル、温度、時間の経過）によってか、あるいはサンプルの起源である細胞、組織もしくは生物の状態あるいは細胞状態の変化（例えば、疾患状態、悪性度、部位特異的変異、遺伝子ノックアウト）によって、差示的に影響されるサンプル中のリン酸化の状態を比較を可能にする。このようなスクリーニングで同定されたリンタンパク質は、変化した状態のマーカーとして機能し得る。任意の天然に存在する環境または人工的に制御された環境からのリンペプチドおよびリンタンパク質は、本明細書の方法によって評価され得る。この方法は、天然に存在するタンパク質もしくはペプチドの混合物、ならびに組換えもしくは合成方法に由来するタンパク質あるいはペプチドの混合物に適用され得る。
【００１５】
本発明の選択的な標識方法は、リンペプチドおよびリンタンパク質に適用する場合に、以下の工程を包含する：
（１）タンパク質を含む１以上のサンプル中のタンパク質またはペプチドのカルボン酸基を、サンプル中のタンパク質またはペプチドの任意のリン酸基が保護されない（遊離のリン酸基として残る）ように、不変的（ｐｅｒｍｅｎｅｎｔｌｙ）かつ選択的に保護する工程；
（２）次に、サンプルのタンパク質またはペプチドの遊離リン酸基と、標識（例えば、リン酸標識、放射性標識、同位体標識、もしくは親和性標識）またはリンタンパク質もしくはリンペプチドを標識もしくは固体表面に選択的に結合させるのを容易にする反応性基もしくは潜在的な反応性基を保有するリンカーとを選択的に反応させる工程；および
（３ａ）選択的に標識されたタンパク質もしくはペプチドを、少なくとも１つのリン酸基の存在の測定として標識の存在を使用して検出する工程；あるいは
（３ｂ）リン酸基を有さないタンパク質およびペプチドから分離されるリン酸ペプチドならびに／またはリン酸タンパク質の選択的な単離を容易にするための、親和性標識または固体表面へのペプチドまたはタンパク質の選択的な結合。
【００１６】
好ましい実施形態において、リン酸基の選択的標識は、１以上のサンプル中のタンパク質およびペプチドと保護基（例えば、アミン）（縮合触媒の存在下でカルボン酸基およびリン酸基と反応し、そしてカルボン酸基およびリン酸基の両方を保護する）との開始反応によって達成される。アミンは、カルボン酸（または対応するエステル）と反応し、カルボキシアミド結合を形成する。アミンは、リン酸基またはリン酸エステル基と反応し、ホスホルアミド結合を形成する。次に、保護されたタンパク質およびペプチドの標識されたホスホルアミド結合は、カルボキシアミド結合を切断しない試薬で選択的に切断される。このことは、選択的に標識され得るか、または固体表面に結合され得る、遊離リン酸基の再生をもたらす。特定の実施形態において、アミン（例えば、エタノールアミン）は、全てのカルボン酸基および全てのリン酸基の最初の保護のために使用され得る。例えば、カルボジイミドにより触媒されるアミンとペプチドまたはタンパク質の縮合は、アミド結合およびホスホルアミド結合を形成する。エタノールアミンは、弱い酸条件（例えば、トリフルオロ酢酸（ｔｆａ）の１０〜３０重量％水溶液が、弱い酸条件の例示である）での処理によって、タンパク質またはペプチドのリン酸基から選択的に切断され得る。過剰の保護剤（例えば、過剰のアミン）は、ペプチドを逆相カラムで徹底的に洗浄することによって除去され得る。特定の実施形態において、遊離のリン酸は、反応性官能基（潜在的な反応性基（例えば、スルフヒドリル基）を含む）を保有するリンカー基と反応する。リンカー基は、固体支持体へリンタンパク質またはリンペプチドを結合するために使用され得るか、またはリンペプチドおよびリンタンパク質とリン酸標識との選択的な標識のために使用され得る。例えば、カルボジイミドにより触媒される縮合反応を使用して、シスタミンを遊離のリン酸基に結合し得る。シスタミンのジスルフィド結合は、切断されて反応性のスルフヒドリル基を生じ得る（シスタミンは、潜在的な反応性基を保有する基の例である）。
【００１７】
サンプル中の他のタンパク質から選択的に分離および単離されるリンペプチドまたはリンタンパク質を、親和性標識もしくは固体支持体から切断し、そしてタンデム質量分析を含む従来の質量分析技術によって分析して検出し、配列決定によって同定するか、または１以上のサンプル中のリンペプチドもしくはリンタンパク質を定量する。
【００１８】
異なるサンプル中のタンパク質および／またはペプチドを、差示的に同位体で標識し、異なるサンプル中の同一のペプチドもしくはタンパク質の量の比較を容易にし得る。同位体標識は、代表的にカルボン酸保護基で導入される（例えば、エタノールアミンのようなアミン基）。
【００１９】
この方法において、タンパク質またはペプチドのアミン基はまた、好ましくは、アミノ酸のアミン側鎖の基（例えば、リジン側鎖のε−アミノ基、および／またはペプチドα−アミノ基）との反応のために選択された保護基で処理される。この処理は、サンプル調製の間のアミン側鎖の架橋を制御する。スルフヒドリルリンカー基が使用された場合、ジスルフィド基を還元する試薬でサンプルを処理することが好ましい。選択的に標識されたサンプルはまた、サンプル調製の間に形成され得るチロシンの付加物を除去するために、必要に応じてヒドロキシアミンで処理される。
【００２０】
本発明はまた、リン酸基の選択的な標識のためのキットを提供し、このキットは、選択的標識を実施するために必要な試薬および必要に応じてこのキット試薬と共に使用するためのポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを含む。試薬キットは、カルボン酸／リン酸反応性の保護基、およびリンタンパク質もしくはリンペプチドのリン酸基に選択的に結合する標識またはリンカー基を備える。このキットはまた、反応を容易にするために必要な任意の触媒または縮合試薬（例えば、カルボジイミド）を含む。さらに、このキットは、必要に応じて、アミド結合の存在下でホスホルアミド結合の選択的な切断のための試薬を含む（例えば、選択的切断のための弱い酸条件を生じるために使用され得る希酸）。キットは、選択されたサンプル数をアッセイするために予め測定されたアリコートの試薬を含み得る。
【００２１】
この標識は、親和性標識であり得、もしそうであるならば、このキットは、好ましくは、親和性標識と共に使用するために適切な捕捉試薬を含む。キットは、必要に応じてアミンのための保護基（例えば、ｔ−ｂｏｃまたはｆ−ｍｏｃ）、および固相材料を含む。このキットはさらに、異なるサンプル中のリンタンパク質およびリンペプチドの量（または相対量）をの定量的決定を可能にする、差示的に同位体標識された保護基、リンカー、親和性標識、もしくは他の標識（蛍光、発色団、あるいはりん光）のセットを含み得る。蛍光、発色団、放射性標識、または他の標識に関して、異なる型の標識が、異なるサンプルのリン酸を標識するために使用され得る。例えば、別々に検出可能であり、そして個々に定量され得る異なる蛍光標識（例えば、フルオレセインアミン、ローダミンアミン）を使用して異なるサンプルを標識し得、そして異なるサンプル中の標識されたペプチドの相対量を検出し得る。さらに、キットは必要に応じて、選択的標識を実施するための説明書、ならびにリンペプチドおよびリンタンパク質を検出、同定、または定量するためのキットと組み合わせて使用され得る種々の型の分析を導入するための指導書を含み得る。
【００２２】
特定の実施形態において、本発明は以下を提供する：
天然もしくは合成のペプチドまたはタンパク質と保護基とを反応させ、この保護基は、ホスホルアミド結合を形成することによってそのペプチドまたはタンパク質中のリン酸基を保護し、そしてアミド結合を形成することによってそのペプチドまたはタンパク質中のカルボン酸基を保護するように作用し；その後、アミド結合を実質的に切断することなしに、ホスホルアミド結合を実質的に選択的に切断し、ペプチドまたはタンパク質中の遊離のリン酸基を再生させる条件下で、保護されたペプチドまたはタンパク質を処理し；そして、カルボン酸基が保護されたまま残っているペプチドまたはタンパク質中の遊離リン酸基を、リン酸と反応する官能基を含む標識もしくはタグ、あるいはリンペプチドを結合するか、またはリンペプチドを固体支持体へ結合させるように機能する２以上の官能基を含むリンカーと反応させることによって、１以上の天然もしくは合成のペプチドまたはタンパク質中のリン酸基を、１以上のカルボン酸基の存在下で選択的に標識またはタグ化するための方法。
【００２３】
実質的に一方の結合を切断し、実質的に他方の結合を切断しない試薬とは、一方の結合の切断：他方の結合の切断の比が、少なくとも約１０：１の比（反応速度または検出される切断生成物の量について測定）を示し、そして好ましくは、一方の結合の切断：他方の結合の切断の比が、少なくとも約２０：１の比、そしてより好ましくは、少なくとも約１００：１の比を示す。当然のことながら、本明細書中の方法への適用のために、結合を選択的に切断するための試薬は、好ましくは、他の結合のいかなる測定可能な切断もなく、１つの結合を切断するように選択される。
【００２４】
この方法において、リンペプチドまたはリンタンパク質は、リンカーのスルフヒドリル基との反応を介して固体支持体材料へ共有結合し得、この固体支持体は、スルフヒドリル基との反応のための固定化されたヨードアセチル基を含み得る。この方法において、リンペプチドまたはリンタンパク質は、固体支持体への結合、または親和性標識を介するリンペプチドの捕捉試薬への結合によって、混合物から分離され得る。
【００２５】
ペプチド中の任意のリン酸基が保護されずに残るように、１以上のサンプル中のペプチドのカルボン酸基を選択的に保護し；サンプル中のペプチドの保護されていないリン酸基を、直接的または間接的にリン酸と反応する官能基を有する標識を用いて、選択的に標識し；標識を保有するペプチドを検出し、サンプル中のリンペプチドを検出することによって、ペプチドの混合物を含む１以上のサンプル中の１以上のリンペプチドを検出するための方法。この標識は、放射性標識、同位体標識、蛍光標識、担色標識、または親和性標識であり得る。この標識はまた、少なくとも１つの反応性基または少なくとも１つの潜在的な反応性基を保有する反応性標識であり得る。潜在的な反応性基は、反応のために活性化されなければならない基である（例えば、潜在的な反応性基は、保護基を保有する基であり得、保護基が除去された際に反応性になる）。
【００２６】
この方法において、タンデム質量分析を使用して、ペプチドのアミノ酸配列およびこのペプチド配列内のリン酸化されたアミノ酸の正確な位置を決定し得る。リンペプチドの相対量の定量は、差示的に同位体標識された標識またはタグの使用によって達成され得る。タンデム質量分析を使用してまた、サンプル中の１以上のリンペプチドを検出し得、そして１以上のサンプル中に存在する差示的に同位体標識された標識またはタグの相対量を測定することによって２以上のサンプル中の１以上のリンペプチドの相対量を決定し得る。
【００２７】
この方法はまた、１以上のサンプル中のペプチドと保護基（カルボン酸またはそのエステルと反応し、そしてリン酸基とも反応する）とを反応させ；そしてホスホルアミド結合が実質的に切断されかつアミド結合が実質的に切断されないように十分な弱い酸性下で保護されたペプチドを反応させることによって、ペプチド中で遊離リン酸基を選択的に再生するための酸性試薬を使用することによる、ペプチド混合物中のリンペプチドを選択的に標識するためのキットを提供する。このキットはさらに、次に記載の１以上のいずれかを含み得る：放射性標識、安定同位体標識、蛍光標識、担色標識、親和性標識、対応する親和性標識を有する捕捉試薬、反応性標識、アミン基のための保護基、１以上の固体支持体、ヨードアセチル化された固体支持体、タンパク質消化を行うための１以上の酵素；および本明細書中の検出方法または分離方法の種々の酵素反応もしくは化学反応を実施するための試薬。
【００２８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、混合物中のリンペプチドおよびリンタンパク質の存在を検出するための方法、混合物中に存在するリンペプチドおよびリンタンパク質を同定するための方法、ならびに１以上の混合物中のリンペプチドおよびリンタンパク質の相対量を決定するための方法を提供する。この方法は、ペプチドにカルボン酸基（またはエステル基）およびアミン基の存在下で、ペプチドのリン酸基に対して選択的に共有結合を形成する（ｆｒｏｍ）能力に基づく。より詳細には、本方法は、カルボン酸の存在下で、標識またはリンカーをリン酸基に選択的に結合する能力に基づく。特に、本方法は、アミド結合を切断しない弱い酸条件下で、ホスホルアミド結合を切断する能力に依存する。従って、本方法におけるリン酸基への選択的な標識または連結は、ペプチドおよびタンパク質の（Ｃ末端およびアミノ酸側鎖基の）カルボン酸基のアミドへの最初の変換、そしてペプチドおよびタンパク質のリン酸基のホスホラミデートへの変換によって、起こる。その後、ホスホラミデートは、アミドを切断することなしに選択的に切断され、そして遊離リン酸基は、選択された標識またはリンカーと反応し、１以上のサンプル中のリンペプチドの検出、同定および定量を容易にする。
【００２９】
アミド結合およびホスホルアミド結合を形成するための好ましい方法は、遊離のアミンとの縮合による方法である。縮合は、当該分野で公知の種々の縮合触媒を使用して達成され得るが、カルボジイミドの使用が好ましい方法である。一般的に、任意のアミンが使用され得るが、アルカノールアミン（例えば、エタノールアミン）が好ましい。このアミンは、単純に保護基として働いて、リン酸基との選択的な反応を容易にし得る。このリン酸基は、検出可能な標識を保有し得る（例えば、検出され得る基もしくは部分（例えば、放射性標識、蛍光標識など）を保有する）か、あるいは反応し得る基もしくは部分（反応性官能基）、反応するようになり得る基（潜在的反応性基）または別の種への結合を形成し得る基、もしくは別の種と複合体を形成し得る基（例えば、捕捉試薬に結合するか、もしくは捕捉試薬と複合体を形成する親和性標識）を保有し得る。
【００３０】
ホスホルアミド結合は、弱い酸条件の使用によって、アミド結合の存在下で選択的に切断される。酸の強度および酸性条件への暴露時間の長さの両方を管理することによって、ホスホルアミド結合の選択的な切断を得ることができる。好ましい処理は、希トリフルオロ酢酸（例えば、水中１０容量％以下）を、最大で数時間の選択された時間にわたって使用する。その後、遊離リン酸基を、種々の標識またはリンカーと反応させ得る。例えば、サンプル中のリンペプチドの存在は、リン酸基に選択的に結合した選択された標識の存在によって検出され得る。リンペプチドは、リン酸化されていないペプチドから、固体支持体への選択的な結合（例えば、リン酸基へ選択的に結合するリンカー基を介する）によって、分離され得る。リンペプチドの固体支持体への選択的な結合を使用して、１以上のサンプル中のリンペプチドを単離および精製し得、そして分析方法による（特に質量分析法による）リンペプチドの検出および同定を容易にし得る。
【００３１】
本明細書中の方法の特定の実施形態において、種々の天然の供給源または合成の供給源から生成され得るペプチド混合物は、ペプチド中のアミン基（Ｎ末端およびアミノ酸側鎖基中のアミン基）を保護するように処理される。アミンは好ましくは、当該分野で公知のようにｔ−Ｂｏｃ化学を使用して保護される。アミンが保護されたペプチドのカルボン酸およびリン酸基は、次に、（同位体で標識され得る）遊離アミン（好ましくは、エタノールアミン）と縮合されて、アミドおよびホスホルアミデートを、それぞれ形成する。異なるペプチドサンプルの差示的な同位体標識は、異なるサンプルを、差示的に標識したアミン（重水素化されていないエタノールアミンが、第一のサンプルに使用され得、そして重水素化されたエタノールアミンが、第二のサンプルで使用され得る）で処理することによって、達成される。他の安定な同位体でコード化されたアミン試薬が使用され得る。
【００３２】
アミンが保護され、そしてペプチド中のカルボン酸基および任意のリン酸基がそれぞれアミドおよびホスホラミデートに変換されたペプチドは、次に、弱い酸条件下で処理されて、ホスホルアミド結合を選択的に切断し、アミド結合を実質的にインタクトままにする。サンプル中の任意のリンペプチドが、遊離リン酸基を保有し、そして異なるサンプル中のリンペプチドが、差示的に同位体で標識される。各サンプル中のリンペプチドは、次に、リン酸基とシスタミンとの縮合によって生成されるスルフヒドリルリンカーを介して固体支持体に結合して選択され得る。次に、結合したシスタミンを還元し、固体支持体上のヨードアセチル基と反応し得る遊離スルフヒドリル基を生成する。シスタミンは、固体支持体への結合のために還元（例えば、ジチオスレイトール、ＤＴＴ、またはトリス［２−カルボキシルエチルホスフィン］（ｔｒｉｓ［２−ｃａｒｂｏｘｌｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ］）（ＴＣＥＰ）を用いる）によって活性化される、潜在的な反応性基として機能する。
【００３３】
サンプル中のリンペプチドは、固体支持体に結合しており、十分な洗浄後に（例えば、トリフルオロ酢酸を使用して）支持体から切り離される。好ましくは、アミン保護基もこの反応において、切断される。これらの工程は、精製され、同位体で標識されたリンペプチドを提供し、このようなリンペプチドは、タンデム質量分析に供され得る。ＣＩＤ質量スペクトルは、サンプル中に存在する任意のリンペプチドの配列を提供し、そしてリン酸化されたアミノ酸残基の存在および配置を示す。得られたペプチド配列情報を使用して、データベース検索を実施し、検出されたリンペプチドのタンパク質供給源を決定し得る。同じ質量分析計の質量スキャンで検出された、異なるサンプル中の差示的に同位体標識されたリンペプチドの相対シグナル強度は、異なるサンプル中の標識されたリンペプチドの存在比の測定を可能にする。
【００３４】
本発明の方法は、いくつかの利点を有する。ペプチドのアミン基は保護され、そして他のペプチドのカルボン酸基とアミド結合を形成しないので、ペプチドの架橋および他の人為的反応を最小にする。カルボン酸基は、保護されたままであり、したがって差示的な同位体標識のために提供され得る。
【００３５】
リン酸基を標識しているアミンの固体支持体への共有結合は、本発明の方法の好ましい実施である。なぜなら、固定化されたリンペプチドのストリンジェントな洗浄、および酸処理による固定化されたリンペプチドの特異的な放出を可能にするからである。リン酸基を標識するために、システインの使用が好ましい。なぜなら、ブロックされていない残りのカルボン酸基を有する任意のペプチド（リン酸基を含有するか否かに拘わらず）が、スルフヒドリル基に変換され、そして固体支持体に不可逆的に結合たままであるからである。システイン残基の存在は、上記方法を妨害するが、システイン基は、ヨードアセトアミドまたは任意の他の公知のアルキル化剤によって、必要に応じてアルキル化され得る。任意のタンパク質サンプルを、このリンペプチド単離方法に供する前に、タンパク質サンプルは、ジチオスレイトールによって還元され得、次いで、変性条件下で過剰のヨードアセトアミドによって、アルキル化され得る。従って、本発明の方法の固相に基づく実施形態は、高度に特異的なリンペプチド精製のための効率的な方法として役立ち、そしてカルボキシル基の誘導体化によって導入される安定な同位体タグは、リンペプチドの相対的定量のための基礎として役立つ。リンペプチドの結合（例えば、スルフヒドリル基を介する）を容易にし、そしてこの方法のペプチド、試薬、および洗浄条件に対して他の点では比較的不活性な官能基で誘導体化され得る任意の固体材料が使用され得る。例えば、固相でのペプチド合成に有用な任意の固相材料が使用され得る。ガラスビーズが、好ましい固相材料である。
【００３６】
蛍光標識、担色標識、放射性標識、または他の標識に関して、異なる型の標識が、異なるサンプル中のリン酸を標識するために使用され得る。例えば、別々のリン酸でありかつ個々に測定され得る異なる蛍光標識（例えば、フルオレセインアミン、ローダミンアミン）を使用して、異なるサンプルを標識し得、そして異なるサンプル中の標識されたペプチドの相対量を検出し得る。また、これらの標識を使用して、ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣまたはＣＥ（キャピラリー電気泳動）によって分離し得、そして蛍光測定によってペプチドの相対量を検出し得る。異なるサンプル中のペプチドの相対量の定量的測定を実施するために、システムを較正することが好ましい（異なる標識での検出の相違を説明するため）。例えば、異なる蛍光標識を使用する場合、異なる標識の量子収量の差異について較正することが好ましい。
【００３７】
図１は、本発明の選択的標識方法を示す。示されるように、ペプチド（１）を、最初にアミン保護基（２）（例えば、ｔ−Ｂｏｃ（ｔ−ブトキシジカルボネート））と反応させる。種々の有用なアミン保護基が当該分野で公知であり、本方法において適用するために容易に利用可能である。選択される保護基は、本方法で使用される他の試薬と適合性でなければならない。次に、保護されたアミン基を有するペプチド（３）を、カルボン酸基およびリン酸基を保護するように反応する試薬（４）（例えば、アミン）を用いて処理する。アミン基は、カルボン酸基と反応して、アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を形成するか、またはリン酸基と反応して、ホスホラミデート結合（−ＰＯ２−ＮＨ−）を形成する。完全に保護されたペプチド（５）を処理して、選択的にホスホルアミド結合を切断し、リン酸基から保護を取り除く。弱い酸条件（６）を使用して、リン酸基を選択的に再生する。例えば、保護されたペプチドを、トリフルオロ酢酸（ｔｆａ）で処理し得る（室温で、水中約３０容量％以下で約１時間、好ましくは、水中約２０％で約１時間、そしてより好ましくは、１０％で３０分）。弱い酸条件は、ｔｆａのような強酸の希釈した形態で使用を含む。所望の化学を達成する他の弱い酸条件は、慣用的な実験によって決定され得、このような処理は、ホスホルアミドの切断を最大にし、そしてアミドの切断を最小にするように変化させられる。
【００３８】
リン酸の保護基が取り除かれている、保護されたペプチド（７）を処理して、遊離リン酸基を選択的に標識する。例えば、スルフヒドリルまたは他の反応性基を含むリンカー（８）は、リン酸基に選択的に結合され得る。リンカー基は、リン酸基へ結合するための官能基（例えば、アミノ基）および標識または固体表面へ連結するための官能基を含む。あるいは、この方法のこの時点で、リン酸基へ結合するための官能基を保有する標識（親和性標識、または蛍光標識もしくは放射性標識のような任意のリン酸標識）は、リン酸へ直接結合され得る。図１に示されるように、リンカー基の官能基は、潜在的な官能基（これは、標識を付加する反応または固体表面に共有結合する反応の前に活性化させなければならない）であるかもしれない。示された場合において、シスタミンは、潜在的なスルフヒドリル官能基（−Ｓ−Ｓ−結合）を保有し、この潜在的なスルフヒドリル官能基は、ジスルフィド結合を還元する試薬（９、例えば、ＴＣＥＰまたはＤＴＴ）の添加によって活性化される。
【００３９】
図１は、リンカー基のスルフヒドリル官能基を介するリンペプチドの共有結合を示す。スルフヒドリル基のリンカーを保有するペプチド（１０）を、ヨードアセチル基を保有する誘導化されたビーズ（１１）と反応させる。種々の型の固体材料が、本方法での使用のために利用可能である。固相材料（ビーズ、表面、層などの形態）を、結合を容易にするために誘導体化する。リンペプチド（１０）との反応後、固体に残っている反応性基を、適切なキャッピング試薬を用いて（例えば、ＤＴＴ（１２）を用いて）キャップまたは保護し得る。固体支持体に共有結合したリンペプチド（１３）は、サンプル中の他のペプチドから物理的に分離され得、そして非特異的に結合したあらゆるペプチドは、洗浄により取り除かれ得る。
【００４０】
図１は、結合したリンペプチドをヒドロキシルアミン（１４）で処理する工程を示す。より詳細には、結合したペプチドを保有するビーズ（１３）を洗浄し、そして１Ｍのヒドロキシルアミン（１４、ｐＨ１０．０）中で約２時間にわたってインキュベートしてチロシンを再生する。なぜなら、チロシン残基は、カルボジイミドと付加物を形成し得るからである。この工程は、この方法においてカルボジイミド試薬が使用される場合、カルボジイミド試薬と付加物を形成しているかもしれない結合したペプチドにおいてチロシンを再生するために、必要に応じてではあるが、好ましい。５％ヒドロキシルアミンとの約３０分間の処理が、チロシンを再生するに十分であることが見出されている。
【００４１】
結合していないペプチドは、５Ｍの塩化ナトリウム、アセトニトリルおよび水で連続的に洗浄することによって、除去される。各洗浄工程の容量は、最低、１０カラム床容量からなるが、より大きな容量もまた使用され得る。次に、結合したリンペプチドは、強酸条件（１５）下で処理されて、固体表面へのリンカーが切断され、そしてアミン保護基（２）が除去される。しかし、遊離の（すなわち、放出された）リンペプチド（１６）のカルボン酸基は、まだ保護されている。これらの保護基は、質量分析法による定量的ペプチド分析に有用な差示的な同位体標識を保有するように使用され得る。アミン反応性保護基（２）の切断なしに固体支持体からリンペプチドを選択的に切断する条件を使用することもまた、望ましくあり得る。種々の異なる条件を使用して切断される種々の保護基が、当該分野で利用可能である。当業者は、保護基、リンカー、および固体支持材料からリンカーを切断する際に、アミン反応性保護基を保持することが可能な切断条件を選択し得る。ペプチドが固体表面から切断された後にアミン反応性保護基が保持される場合、アミン反応性保護基は、差示的な同位体標識にも使用され得る。
【００４２】
分離され乾燥されたリンペプチドは、ＬＣ−ＭＳ分析のために水に再懸濁される。本明細書中の方法によって選択的に標識および単離されたリンペプチドは、好ましくは質量分析技術によって分析される。この方法で使用される保護基およびリンカーは、好ましくは、固相材料からの放出の際に保持されるペプチドへの任意の改変が、質量スペクトル分析およびタンデム質量分析方法によるペプチドの配列決定を顕著には妨害しないように選択される。
【００４３】
本願発明と共通の発明者を有する、米国特許出願番号０９／３８３，０６２（１９９９年８月２５日出願）および対応国際特許出願ＷＯ９９／１９４１５（１９９９年８月２５日出願）は、タンパク質の混合物中のタンパク質またはタンパク質の機能の迅速かつ定量的分析のための分析用試薬および質量分析に基づく方法を提供する。この方法は、「親和性標識したタンパク質反応性試薬」と称される試薬を使用する。この試薬は、複雑な混合物からのペプチドの選択的な単離を可能にする。この試薬は、リンカー基を介してタンパク質反応性基（これは、特定のタンパク質の官能基と選択的に反応する）に共有結合した親和性標識を含む。このリンカーは、差示的に同位体標識され得る。この試薬および方法は、複雑なタンパク質混合物中のタンパク質の検出および同定に適用され得、ここで、この方法により単離されたペプチドは、この混合物中のタンパク質の存在の特徴である。単離されたペプチドは、質量分析（ＭＳ）技術によって特徴づけられる。特に、単離されたペプチドの配列は、タンデムＭＳ（ＭＳｎ）技術を使用して、そして配列データベース検索技術の適用によって決定され得、配列決定されたペプチドの起源のタンパク質が同定され得る。親和性標識されたタンパク質反応性試薬はまた、単離されたペプチドの差示的な同位体標識に対して提供されて、異なるサンプル中のタンパク質の相対量の定量的決定を容易にし得、そして内部標準のために提供されて、サンプル中に存在する１以上のタンパク質の絶対的な量の定量的な決定を容易にし得る。本発明は、複雑な混合物中のリンペプチドの選択的標識のための方法、およびリンペプチドの選択的単離のための方法を提供し、これらは、米国特許出願番号０９／３８３／０６２ＵＳならびに国際特許出願ＷＯ９９／１９４１５に記載の本方法および用途とともに使用され得る。これらの特許出願は、とりわけ、記載されている差示的同位体標識、質量分析方法および選択的標識方法の適用の説明について、本明細書中の開示と矛盾しない範囲において、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【００４４】
以下の参照文献は、質量分析技術のタンパク質同定（特に、プロテオーム分析に関する）への適用に関する：Ｉｄｅｋｅｒ Ｔ、Ｔｈｏｒｓｓｏｎ Ｖ、Ｒａｎｉｓｈ ＪＡ、Ｃｈｒｉｓｔｍａｓ Ｒ、Ｂｕｈｌｅｒ Ｊ、Ｅｎｇ ＪＫ、Ｂｕｍｇａｒｎｅｒ Ｒ、Ｇｏｏｄｌｅｔｔ ＤＲ、Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ Ｒ、Ｈｏｏｄ Ｌ「Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｇｅｏｍｉｃ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙ ｐｅｒｔｕｒｂｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｎｅｔｗｏｒｋ」Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００１ Ｍａｙ ４；２９２（５５１８）：９２９〜３４；Ｇｙｇｉ ＳＰ、Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ Ｒ．「Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ」Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０００ Ｏｃｔ；４（５）：４８９〜９４；Ｇｙｇｉ ＳＰ、Ｒｉｓｔ ｂ、Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ Ｒ「Ｍｅａｓｕｒｅｉｎｇ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｏｎ ｂｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ」Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００ Ａｕｇ；１１（４）：３９６〜４０１；Ｇｏｏｄｌｅｔｔ ＤＲ、Ｂｒｕｃｅ ＪＥ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＧＡ、Ｒｉｓｔ Ｂ、Ｐａｓａ−Ｔｏｌｉｃ Ｌ、Ｆｉｅｈｎ Ｏ、Ｓｍｉｔｈ ＲＤ、Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ Ｒ．「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｃｃｕｒａｔｅ ｍａｓｓ ｏｆ ａ ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈｉｎｇ」Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．２０００ Ｍａｒ １５；７２（６）：１１１２〜８；およびＧｏｏｄｌｅｔｔ ＤＲ、Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ Ｒ、Ｗａｔｔｓ ＪＤ．「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｋｉｎａｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｓ ａ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０００；１４（５）：３４４〜８；Ｚｈｏｕ，Ｈら（Ａｐｒ ２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：３７５〜３７８。これらの参考文献は、本願開示と矛盾しない限りにおいて、本明細書中で参考として援用される。
【００４５】
本発明の方法に供されるペプチド混合物は、天然のサンプルまたは合成のサンプルから生成され得、そしてタンパク質サンプルの化学的、物理的、または酵素的消化の結果物であり得る。タンパク質は、任意の酵素的に適切な方法を使用して消化され得る（例えば、トリプシン消化）。消化物中のペプチドは、好ましくは約１０〜約５０アミノ酸長の範囲の大きさであり、より好ましくは、タンデム質量分析法を使用するペプチド配列決定を容易にするようにサイジングされている。当業者は、目的のタンパク質サンプルでの使用に適切なタンパク質消化プロトコルを選択し得る。
【００４６】
リン酸基の存在下において、アミンは、カルボン酸を選択的に標識するための、好ましい試薬である。任意のアミン試薬は、一般的に、この保護基の機能を提供する。エタノールアミンのようなアルカノールアミンは、好ましいアミン試薬である。当業者は、同様の選択的な標識機能を提供する他の試薬を見出し得ることを理解する。当業者は、過度の実験に頼ることなしに、選択的標識のための他の試薬を同定および選択し得る。しかし、使用される保護基はまた、本発明の反応での使用に適切でなければならない。本明細書中で記載されるようなカルボン酸基の選択的保護のために適切な当該分野で公知の任意の方法および試薬は、本発明に包含されることが意図される。カルボン酸基を選択手基に保護するために使用されるアミンに関して、アミンとカルボン酸基およびリン酸基との反応は、好ましくは、カップリング剤の存在下で行われる。この反応に使用され得るカップリング剤として、とりわけ、ジシクロヘキシルカルボジイミド、または２，３，５，６−テトラフルオロフェニルトリフルオロアセテートが挙げられる。さらに、４−ジメチルアミノプリジンのようなカップリング触媒が使用され得る。
【００４７】
本発明の選択的標識方法は、保護をリン酸基から選択的に除去するが、カルボン酸基からは除去しない処理を使用する。特に、保護されたペプチドは、ホスホラミダート結合を切断するが、アミド結合は切断しない酸性条件（本明細書においては、弱い酸条件）で処理される。これらの弱い酸条件下での処理は、ペプチドのアミン基およびカルボン酸基を脱保護することなしに、リン酸とエタノールアミン間のホスホアミド結合を切断する。例えば、長期の酸処理を包含しない限り、ｔＢｏｃ保護は、ほとんどインタクトなまま残る。当業者は、同様の機能を提供する他の処理条件が見出され得ることを理解する。当業者は、過度の実験に頼ることなしに、リン酸の保護基を選択的に除去するための他の試薬を同定および選択し得る。本明細書に記載されるようなリン酸保護基の選択的な除去を達成する、当該分野で公知の任意のこのような方法および試薬が、本発明によって包含されることが意図される。
【００４８】
所望される場合、選択的に標識されたペプチドを、支持体に結合するための適切な官能基を保有するリンカーを結合させることによって、固体支持体へ結合させ得る。固体支持体へのリンペプチドの結合は、ヨウ素とのスルフヒドリル基反応を介する結合によって、例示される。当業者は、スルフヒドリルおよびヨード以外の官能基が、固体支持体物質への結合を完成するために使用され得ることを理解する。このような結合を作製するための種々の方法が、当該分野で公知である。リンペプチドの固体支持体への選択的結合の機能を達成する任意の方法および試薬は、本発明によって包括されることが意図される。
【００４９】
特に例示されるような本発明の方法は、逆相カラムでのペプチドの洗浄工程を使用し、ペプチドサンプルから所望されない物質を除去する。当業者は、本明細書中で特に記載される方法以外のこのような物質を除去するための方法が当該分野で公知であり、そして所望の結果を達成するために本明細書中の方法に容易に適用され得ることを理解する。所望でない物質を洗浄または除去するための当該分野で公知のこのような全ての方法は、本明細書によって包括されることが意図される。
【００５０】
１以上のサンプル中のタンパク質リン酸化の定量的な比較分析のための手段が、図２に示される。ペプチドサンプルは、２つの細胞状態から調製される（１および２）。実施例のように、差示的に同位体標識されたカルボン酸／リン酸基のアミン保護試薬（各サンプルについて１つ（例えば、２つのサンプル各々について、ｄ０−またはｄ４−エタノールアミン）を使用して、全てのカルボン酸基および最初にペプチドサンプル中の任意のリン酸をを差示的に同位体標識する。カルボキシル基としては、ペプチドのＣ末端およびグルタミン酸残基ならびにアスパラギン酸残基の側鎖（ならびに稀なアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸由来の任意のカルボン酸側鎖）が挙げられる。リン酸基を保護しているエタノールアミン基は、選択的に除去されて遊離リン酸基を生じる。次に、遊離リン酸基は、リンペプチドの分離を容易にするリンカーで誘導体化される。本方法を使用して最終的に精製される全てのリンペプチドについて、ペプチドのＣ末端に結合した少なくとも１つの標識された保護基（例えば、エタノールアミン）が存在する。その構造に依存して、所定のリンペプチドは、１を超える標識された保護基を有し得る。
【００５１】
差示的に同位体標識されたピーク間の質量の差異は、標識間の同位体の質量の差異およびペプチドの荷電状態（これは、天然の同位体分布に基づいて質量分析装置自身において決定され得る）に依存する。同位体に関係するペプチドは、これらが質量分析装置によって分析される場合に、実施されるマイクロキャピラリー高速液体カラムクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）から本質的に同時に溶出するので、所定のペプチドに起因する多重のピークは、差示的に標識されたペプチドそれぞれ（例えば、ｄ０−およびｄ４−エタノールアミンで差示的に標識された２つのサンプルについての二重項）について現れる。差示的に同位体標識したサンプル中の同一ペプチド由来の多重項（例えば、二重項）ピークにおける相対的なピーク強度は、異なるサンプル中のそのペプチドの相対的濃度を、直接的に得る。この定量方法の根底にある理論は、同位体的に関連するペプチドが、化学的に同一であり、従って、完全に相互の内部標準を示すことである。異なるサンプル由来の差示的に同位体標識されたペプチドからの質量分析装置によって生成されたシグナル強度はそれぞれ、これらのサンプルに存在するペプチド分子の相対量を正確に反映する。
【００５２】
リンペプチドの配列およびリン酸化部位の同定は、タンデム質量分析およびコンピュータ支援データベース検索プログラム（例えば、ＳＥＱＵＥＳＴ（登録商標、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）（ＭｃＣｏｒｍａｃｋ，Ａ．Ｌ．ら（１９９６）「Ｄｉｒｅｃｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｂｙ ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ ａｎｄ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ａｔ ｔｈｅ Ｌｏｗ−Ｆｅｍｔｏｍｏｌｅ Ｌｅｖｅｌ」Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９．７６７〜７７６；Ｅｎｇ，Ｊ．Ｋ．ら（１９９４）「Ａｎ Ａｐｐｒｏａｃｈ と Ｃｏｒｒｅｌａｔｅ Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｄａｔａ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ」Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｏｍ．、５、９７６〜９８９；米国特許第５，５３８，８９７号（Ｊｕｌ．２３，１９９６）Ｙａｔｅｓ，ＩＩＩら））によって決定され得る。タンデム質量分析装置の第一段階において、任意の所定のリンペプチドが選択され、そして衝突誘導解離（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（ＣＩＤ）に供される。生じるフラグメントイオンのスペクトルは、いわゆるＣＩＤスペクトルとして、質量分析装置の第二段階で記録される。この工程が、サンプル中に存在する他の（理想的には、全ての）ペプチドで繰り返される。ＣＩＤ工程は、一般的にペプチド結合でフラグメント化を引き起こし、そしてほとんどの部分について異なるアミノ酸は、異なる質量のピークを得るので、ＣＩＤスペクトル単独で、しばしば、ペプチド配列を決定するのに十分な情報を提供する。ペプチド配列決定およびタンパク質の同定は、配列検索コンピュータプログラム（例えば、ＳＥＱＵＥＳＴＴＭ（これは、全ての公知のゲノム配列を考慮に入れて、可能な全ての理論的ＣＩＤスペクトルを計算し、それらを、実験的なＣＩＤスペクトルと一致度および配列同定について比較する））を使用することによって、容易にされる。Ｃ末端、グルタミン酸、アスパラギン酸および任意の他の酸性側鎖基に対する質量の改変が公知であり、この情報は、コンピュータ解析に組み込まれ得る。また、リン酸化に起因する質量の変化がまた、公知であり、コンピュータ解析に組み込まれ得る。データを、セリン残基、チロシン残基、およびスレオニン残基に対する任意の可能なリン酸化について検索し得、従って、リン酸化部位の同定が可能になる。
【００５３】
本発明の方法は、実質的には化学的に同一であるが、質量によって識別可能な試薬対または試薬セットを生成するために同位体標識される保護基を使用し得る。例えば、一対の保護基の試薬（一方は、同位体的に重く、そして他方は、同位体的に軽い）は、２つのサンプル（１以上の既知のタンパク質を既知量含有する参照サンプルであり得る）の比較に使用され得る。例えば、保護基における、任意の１以上の水素原子、窒素原子、酸素原子、または硫黄原子は、それらの同位体的に安定な同位体：２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏまたは３４Ｓと置換され得る。差示的な同位体標識は好ましくは、カルボン酸保護基において、本発明のペプチドへ導入される。
【００５４】
本発明の方法は、リンペプチドの検出または分離のために親和性標識もしくはリン酸標識を使用し得る。本発明の方法は、任意のリン酸標識（放射性標識、蛍光標識、担色標識などが挙げられるが、これらに限定されない）を使用し得る。この標識は、サンプル中のリンペプチドのリン酸に選択的に結合し、その検出が、リン酸の存在を検出する。
【００５５】
適切な親和性標識は、捕捉試薬（ＣＲ）に共有または非共有のいずれかで選択的に結合し、かつ高親和性で結合する。ＣＲ−Ａの相互作用または結合は、非特異的に結合した化合物を除去するための種々の溶液を用いる過剰かつ複数回の洗浄後に、インタクトなまま残るべきである。親和性標識は、ＣＲを除いてアッセイ系の成分に最小限に結合するか、または好ましくはまったく結合せず、そして反応容器の表面に有意に結合しない。他の成分または表面と親和性標識との任意の非特異的な相互作用は、ＣＲ−Ａをインタクトなまま残す複数回の洗浄によって、阻害されるべきである。さらに、ペプチド、基質または反応産物を放出するＡおよびＣＲの相互作用は、例えば、置換リガンドの添加によってか、または温度条件もしくは溶媒条件を変化させることによっても阻害させ得なければならない。好ましくは、ＣＲまたはＡのいずれもアッセイ系の他の成分と化学的に反応せず、そして両方の基は、アッセイまたは実験の間にわたって化学的に安定であるべきである。親和性標識は、好ましくは、分析されるサンプル液に可溶性であり、かつＣＲは、不溶性樹脂（例えば、アガロースまたは制御された孔のあるガラス）に結合した場合でさえ、サンプル液中に可溶性のままであるべきである。ＣＲに関して、用語「可溶性」は、ＣＲが十分に水和されているか、またはそうでない場合には溶媒和されており、その結果、ＣＲがＡへの結合のために適切に機能することを意味する。ＣＲまたはＣＲ含有結合体は、捕捉Ａが添加された場合を除いて、分析されるサンプル中に存在するべきではない。本発明において有用な親和性標識は、親和性標識のリン酸基への結合（好ましくは、所望である場合、または所望される時に、選択的に切断され得る共有結合を介する）を可能にする官能基を含む。
【００５６】
ＡとＣＲの対の例として以下が挙げられる：
ｄ−ビオチン試薬または構造的に改変されたビオチンベースの試薬（アビジン／ストレプトアビジン（例えば、これは、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）−アガロース、オリゴマー性アビジン−アガロース、またはモノマー性アビジン−アガロースの形態で使用される）のタンパク質へ結合するｄ−イミノビオチン（ｄ−ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ）を含む）；
任意の１，２−ジオール（例えば、１，２−ジヒドロキシエタン（ＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨ））、および１，２−ジヒドロキシアルカン（その環状アルカン（例えば、ホウ酸アルキルもしくはホウ酸アリールまたはホウ酸エステル（例えば、固体支持体物質（例えば、アガロース）へアルキル基またはアリール基を介して結合し得るフェニル−Ｂ（ＯＨ）２またはヘキシルＢ（Ｏエチル）２）と結合する１，２−ジヒドロキシシクロヘキサン）を含む）；
マルトース結合タンパク質（および任意の他の糖／糖結合タンパク質対、またはより一般的には上記のような特性を有する任意のリガンド／リガンド結合タンパク質対）へ結合するマルトース；
任意の抗体に対するハプテン（例えば、ジニトロフェニル基）（ここで、このハプテンは、ハプテンを認識する抗ハプテン抗体へ結合する。例えば、ジニトロフェニル基は、抗ジニトロフェニル−ＩｇＧへ結合する；
遷移金属に結合するリガンド（例えば、オリゴマー性のヒスチジンは、Ｎｉ（ＩＩ）に結合する）。遷移金属ＣＲは、樹脂に結合し、キレートした遷移金属（例えば、ニトリロ三酢酸にキレートしたＮｉ（ＩＩ）またはイミノジ酢酸にキレートしたＮｉ（ＩＩ））の形態で使用され得る；
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに結合するグルタチオン。
【００５７】
ＣＲへのＡの共有結合は、例えば、ＣＲのヨードアセトアミドとＡのスルフヒドリル基との反応によって、達成され得る。
【００５８】
一般的に、上記の適切な基準を満たす親和性富化のために通常使用される任意のＡ−ＣＲ対が、使用され得る。ビオチンおよびビオチンベースの親和性タグが好ましい。特定の目的のために、ビオチンは構造的に改変される（例えば、ＥＳＩ−ＭＳ分析に適合する溶媒（例えば、１０〜２０％の有機溶媒を含む希酸）条件下で、アビジンまたはストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）カラムから溶出するｄ−イミノビオチン）。ｄ−イミノビオチンでタグ化した（ｔａｇｇｅｄ）化合物は、ｐＨ４以下の溶媒で溶出することが予測される。ｄ−イミノビオチンタグしたタンパク質反応性試薬は、対応するビオチンタグした試薬について本明細書に記載された方法によって、合成され得る。
【００５９】
置換リガンド（ＤＬ）を必要に応じて使用して、ＣＲをＡで置換する。適切なＤＬは、代表的には、添加されない限りサンプル中には存在しない。ＤＬは、分析されるサンプル中で化学的かつ酵素的に安定であるべきであり、そしてサンプル中の成分（ＣＲ以外）と反応も結合もすべきでなく、また反応容器の壁と非特異的に結合すべきではない。ＤＬは、好ましくはＭＳ分析中にペプチドのようなフラグメント化を受けず、そしてサンプル中のその存在が、タグ化したペプチド、基質または反応生成物である結合体のイオン化を有意に抑制すべきでない。
【００６０】
ＤＬ自身は、好ましくは、質量分析の間のイオン化が最小であり、そして好ましくは、ＤＬクラスターを構成するイオンの形成が、最小である。ＤＬの選択は、使用されるＡおよびＣＲの基に依存する。一般的に、ＤＬは、合理的な時間的尺度（ほとんどがＤＬの添加後１週間以内であるが、好ましくは、数分または１時間以内である）でＣＲをＡに置換するように選択される。ＣＲに対するＤＬの親和性は、ＣＲのためのＡを含むタグ化された成分の親和性に匹敵するか、またはそれよりもより強い親和性であるべきである。さらに、ＤＬは、ＣＲからのＡを含むタグ化された化合物の溶出の間に使用される溶媒に可溶性であるべきである。好ましくは、ＤＬは、遊離ＡまたはＡの誘導体もしくはＡの構造的改変体である。ＤＬの例として、ｄ−ビオチンもしくはｄ−ビオチン誘導体、特に、ＭＳにおいてクラスター形成を抑制するか、またはイオン化を抑制する基を含むＤＬが、挙げられる。
【００６１】
本発明の方法は、リン酸基へ結合するリンカー基を使用して、固体支持体へリンペプチドを結合し得る。リンカーはまた、親和性標識またはリン酸標識をリンペプチドに結合させるために使用され得る。使用される任意のリンカーは、好ましくは、分析されるサンプル液に可溶性であり、そして化学的反応に関して安定（例えば、サンプルの成分および本方法で使用される任意の他の試薬と実質的に化学的に不活性）であるべきである。リンカーは、ペプチドに結合する場合、親和性標識とＣＲとの特異的な相互作用を阻害するべきではなく、そしてこの系の他の成分への結合、反応容器表面への結合、もしくはＣＲへの結合が最小であるか、または好ましくは、まったく反応しないリンカーであるべきである。リンカーの任意の非特異的な相互作用は、複数回の洗浄によって壊されるべきである。
【００６２】
本発明の方法によって分析され得るサンプルとしては、以下が挙げられる；細胞ホモジネート；細胞画分；尿、血液、骨髄液を含む生物学的体液；組織ホモジネート；涙液；糞便；唾液；肺洗浄もしくは腹膜洗浄の洗浄液；細胞ホモジネートまたは組織ホモジネートの部分的な画分または完全な画分によって生成されるタンパク質、脂質、炭水化物、および核酸を含む生物学的分子の混合物。
【００６３】
本発明の方法は、質量分析法およびタンデム質量分析法を使用する。種々のＭＳ法が利用可能であり、これらの方法で使用され得るが、マトリックス介助レーザーディソープションイオン化（Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）ＭＳ（ＭＡＬＤＩ／ＭＳ）および電子スプレーイオン化（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）ＭＳ（ＥＳＩ／ＭＳ）法が好ましい。
【００６４】
本発明の方法は、リンペプチド標準サンプル（実施例２、図３Ａ〜Ｃ）；単一リンタンパク質（βカゼイン）の酵素消化物（実施例３、図４Ａ〜４Ｄ）；インビトロでチロシン残基をリン酸化したタンパク質（実施例４、図５Ａ〜Ｃ）；酵母細胞の全溶解物の消化物（実施例５、図６Ａ〜Ｃ、および表１）；ならびにＪｕｒｋａｔ細胞の全溶解物の消化物（表２）におけるリンペプチドの検出および同定への適用によって、説明および例示される。
【００６５】
以下の実施例は、本発明をさらに例示することを意図し、本発明を限定することを意図しない。
【００６６】
（実施例）
（実施例１：リンペプチド単離手順）
ペプチドサンプルを乾燥し、そして以下の工程に従って、図１Ａに示される方法に供した。１）ペプチド混合物を０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ１１）／アセトニトリル（５０％（ｖ／ｖ））に再懸濁した。０．１Ｍのｔ−ブチル−ジカーボネート（ｔＢｏｃ）を室温にて４時間で加えた。２）減圧下でアセトニトリルを除去した。サンプルを、１Ｍのエタノールアミン、２５ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および０．５ＭのＮ，Ｎ’−ジメチルアミノプロピルエチルカルボジイミド・ＨＣｌ（ＥＤＣ）にし、室温で２時間インキュベートした。３）１０％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を、室温にて３０分間で加えた。これらの条件下でのより長期の処理は、有害な結果をもたらさなかった。この時点でサンプルを中和し得るが、中和が、結果に有意な効果を有することは、見出されなかった。次にサンプルを、脱塩し、８０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡでの溶出を使用してＣ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ ＷＡＴ ０２３５９０）から回収した。４）ペプチドを乾燥し、１Ｍのイミダゾール（ｐＨ６．０）に再溶解する。イミダゾールは任意であり、ヒスチジンのような感受性の高いアミノ酸との可能性のあるカルボジイミド付加物の形成を阻害するために使用した。０．５ＭのＥＤＣを室温にて３時間で添加した。サンプルをＣ１８カラムにロードし、水で洗浄し、そしてこのカラムにおいて、１Ｍのシスタミン（ｐＨ８．０）で２時間、５０℃で処理した。ペプチドを水で洗浄し、そして１０ｍＭのＤＴＴで還元し、遊離スルフヒドリル基を生成した。５）ＤＴＴを除去するための洗浄後、ペプチドを８０％のアセトニトリル、０．１％のＴＦＡで溶出し、そして固定されたヨードアセチル基を有するビーズ２０ｍｇと共に少なくとも２時間、ｐＨ８．０（１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＥＤＴＡで滴定した）でインキュベートした。固定化されたヨードアセチル基を有するビーズを、３等量のヨード酢酸無水物および１等量のアミノビーズ（Ｓｉｇｍａ，Ｇ４６４３）とジメチルホルミド中３．３等量のジイソプロピルエチルアミンとの間の２時間の反応によって、調製した。カルボジイミドを有するチロシン付加物の形成は、可能性のある副反応である。このような付加物は、ヒドロキシルアミンのような求核試薬に対して不適である。従って、リンペプチドのビーズへの結合後、１Ｍのヒドロキシルアミン（ｐＨ１０）を使用して、室温で２時間、ビーズをインキュベートした。これによってチロシン残基を回復した。５％のヒドロキシルアミン溶液で３０分間の処理が、代表的にチロシン残基を元に戻すのに十分であることを見出した。次にビーズを連続的に、２ＭのＮａＣｌ、メタノールおよび水で洗浄し、非特異的な結合分子を除去した。６）ビーズを１００％のＴＦＡと共に３０分間インキュベートし、リンペプチドを回収した。同時に、ｔＢｏｃ保護を除去した。回収したサンプルを減圧下で乾燥し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために水に再懸濁した。
【００６７】
（実施例２）
ホスホアンギオテンシンペプチドの等量の２つの別々のサンプルを、本発明の方法によって分析した。２つの異なるサンプル中のカルボン酸基を、軽エタノールアミン（ｄ０−エタノールアミン）または重エタノールアミン（ｄ４−エタノールアミン、ＨＯＣＤ２ＣＤ２ＮＨ２）のいずれかによってブロックした（上記のようにリン酸基を遊離のまま残す）。ホスホアンギオテンシンは、２つのカルボン酸基を含み、故に、［Ｍ＋２Ｈ］２＋イオンについての質量の差異は、差示的に標識されたペプチドについて４である。本発明の選択的標識およびリンペプチドの分離に供された差示的に標識されたサンプルの質量分析の結果を、図３Ａ〜Ｃに図示する。軽標識サンプルおよび重標識サンプルに起因するｍ／ｚ≒６０７および６１１での二重項ピーク［Ｍ＋２Ｈ］２＋は、それぞれ、予測された通りに観察される。さらに、２つのピークの相対比は、予測された通りに約１：１である。これらのピークの各ＣＩＤスペクトルは、改変（標識の結合）によって質量シフトしたフラグメントイオンを除いて、保護されていないペプチドのＣＩＤスペクトルと類似である。差示的標識を達成するために使用されるカルボン酸基の改変は、未知ペプチドの配列を同定するために使用されるＣＩＤスペクトルの質に対して悪影響しない。
【００６８】
リンペプチドの単離を、少しの改変を伴うが、実質的に実施例１のように実施した。ペプチドを、５０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルおよび０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ１１）中に懸濁した。ｔ−ブチロキシ−カルボニル（ｔ−Ｂｏｃ、１Ｍ）を室温にて４時間で加えた。アセトニトリルを減圧下で除去した。アミンを保護したペプチドを減圧下で乾燥し、１ＭのエタノールアミンＨＣｌに再懸濁した。溶液のｐＨを、５０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の添加によって約６に調整した。Ｎ，Ｎ’−デメチルアミノプロピルエチルカルボジイミド・ＨＣｌ（ＥＤＣ）を室温にて４時間で加えた（５ｍｇ／５０μＬ）。アミンを保護したペプチドを、同様の様式で重エタノールアミン（ｄ４−エタノールアミン、ＨＯＣＯ２ＣＤ２−ＮＨ２）で標識した。
【００６９】
標識されたペプチドを含む各溶液と等容量の２０％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸とを１時間混合し、その後、２Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液を使用して反応を中和することによって、差示的に同位体標識されたペプチド中で、リン酸を選択的に脱保護した。中和した溶液を逆相Ｃ１８カラムに充填し、水で過剰に洗浄した。再生されたリン酸基を有するペプチドを、水中８０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルを使用してＣ−１８カラムから溶出し、次に乾燥させた。同位体で重く標識されたペプチドおよび同位体で軽く標識されたペプチドのサンプルを質量分析のために合わせた。
【００７０】
ＬＣＱイオントラップ質量分析装置（Ｆｉｎｎｉｇａｍ ＭＡＴ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を、ＨＰ１１００溶媒送達システム（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）と共に使用した。ペプチドを、カラムに加圧ロードし、次に、Ｇｙｇｉ，Ｓ．Ｐ．ら（１９９９、前出）に記載のように、マイクロキャピラリーＬＳ−ＭＳ／ＭＳによって、溶出および分析した。衝突エネルギーまたはＬＣＱを３０％に設定した。
【００７１】
（実施例４：β−カゼインからリンペプチドの単離）
本発明の方法をまた使用して、十分に特徴付けられたリンタンパク質である、ウシβ−カゼインからリンペプチドを精製および検出した。このペプチドを、実施例２に記載のように標識した。リンタンパク質のトリプシン消化物を、マイクロキャピラリーＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。図４Ａに示されるように、多数のペプチドが、未処理のβ−カゼイン消化物について観察された。図４Ａに示されたペプチドは、ｍ／ｚ＝１０３１．６で、二重に荷電したイオン（ｄｏｕｂｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ ｉｏｎ）であった。衝突誘導解離（ＣＩＤ）（図４Ｃ）（Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ｉ．Ａ．（１９９５）、「Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ」Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｒｅｖ．１４、４９〜７３）によるフラグメント化を選択した場合、そのフラグメントイオンスペクトルは、低エネルギーペプチドフラグメント化について代表的に、ほとんどがｙ−イオン系列を示し、そして親イオンからのＨ３ＰＯ４基の損失に起因する９８Ｄａの損失に対応するｍ／ｚ＝９８３．０でのさらなる主要なシグナルを示した（Ｊｏｎｓｃｈｅｒ，Ｋ．Ｒ．およびＹａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．ＩＩＩ（１９９７）、「Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ／ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ｉｏｎ ｔｒａｐ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、１７３５〜１７４１；Ｑｉｎ，Ｊ．およびＣｈａｉｔ，Ｂ．Ｔ．（１９９７）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ＭＡＬＤＩ ｉｏｎ ｔｒａｐ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９、４００２〜４００９）。このＣＩＤスペクトルのデータベース検索は、配列ＦＱＳ＊ＥＥＱＱＱＴＥＤＥＬＱＤＫ（＊はリン酸基を示す）を有するペプチドを同定した。ホスホセリンのｙ１３イオンおよびｙ１４に対応するｙ１３イオンおよびｙ１４イオン間の質量の差異は、公知のβ−カゼインのリン酸化部位である、このタンパク質のＳｅｒ−５０を確認する。
【００７２】
同じβ−カゼイン消化物をリンペプチド単離手順に供することによって、サンプルの複雑性を顕著に減少し、ｍ／ｚ＝１１８２．５で有意に二重荷電したペプチドのみを得る（図４Ｄ）。このペプチドのＣＩＤスペクトルは、明確なフラグメントイオン系列およびＨ３ＰＯ４の損失に起因するｍ／ｚ＝１１３３．６での主要なシグナルを示した（図４Ｄ）。このスペクトルのデータベース検索は、図４Ｂにおけるスペクトルのように同一のペプチドを同定した。同一のペプチドについての見かけの質量の増加（図４Ａと４Ｂ、および４Ｃと４Ｄを比較のこと）は、単離手順の間に７つすべてのカルボン酸基（アスパラギン酸、グルタミン酸、およびＣ末端）が、エタノールアミンで定量的に改変されたことに起因する。
【００７３】
（実施例４）
本発明の工程についてのサンプル回収効率を、ホスホチロシン含有ペプチド、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を使用して調査した。ＭＢＰを、チロシンキナーゼＬｃｋの触媒性ドメインおよび放射性標識したＡＴＰを（既知の特異的活性で）使用して、インビトロでリン酸化した。リン酸化したペプチドをトリプシンで消化し、そして５ｐｍｏｌのリンペプチドを、カルボン酸基をｄ４−エタノール−アミンでブロックすること以外は、前記と同様にして、単離した。
【００７４】
単離されたリンペプチドのイオンクロマトグラムを、図５Ａに示す。ここで、ｍ／２＝６３０．１（２＋）で最も顕著なイオンを、フラグメント化のために選択した。このイオンのＣＩＤを図５Ｂに示す。これは、Ｍ．Ｐ．のＴＨＹ＊ＧＳＬＰＱＫのようなリンペプチドを明確に同定した（Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ．ら（１９９１）、「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｔｅ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａ ｔｈｅ ｌｏｗ ｐｉｃｏｍｏｌｅ ｌｅｖｅｌ ｂｙ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９：５１〜６０）。６つの工程の手順全体にわたるリンペプチドの回収効率を、この手順の各工程の後に回収された放射活性カウントを測定することによって評価し、最終的な収率は、一貫して開始物質の約２０％であった。
【００７５】
（インビトロでのキナーゼ反応）
バキュロウイルスで発現されたＬｃｋキナーゼドメイン−ＧＳＴ（グルタチオン５−トランスフェラーゼ）融合タンパク質１７μｇ、２０μｇのＭＢＰ、および１０μＣｉの３２Ｐ含有ＡＴＰを、２５ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｎＣｌ２、０．２５ｍＭのＡＴＰを含有する緩衝液４０μｌ中において、３０℃で１時間、インキュベートした。１時間後、６Ｍの尿素を反応を停止させるために加えた。還元およびアルキル化を、１０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を３０分間加え、続いて５０ｍＭのヨードアセトアミドで２時間インキュベートすることによって実施した。サンプルを水で１ｍｌまで希釈し、１μｇのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を３７℃で４時間加えた。次に、ペプチドを、Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ、ＭＡ、カタログ番号ＷＡＴ０２３５９０）で脱塩し、８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡでの溶出によって、回収した。回収された放射性標識されたペプチドを、セレンコフカウント（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ ｃｏｕｎｔｉｎｇ）によって定量した。これから、推定５ｐｍｏｌのリン酸化されたペプチドを、リン酸ペプチドの単離および回収効率の評価のために採取した。重水素化したｄ４−エタノールアミン（Ｉｓｏｔｅｃ、Ｍｉａｍｉｓｂｕｒｇ，ＯＨ）を使用して、この実験におけるカルボン酸基をブロックした。
【００７６】
（実施例５：酵母中のリンタンパク質のプロファイリング）
酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（ＢＷＧ１−７Ａ）を、対数増殖期の中期まで、２％のグルコースを炭素源として含むＹＰＤ培地で増殖させ、遠心分離によって、回収した。タンパク質抽出物を、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ）に記載のガラスビーズ法によって調製した。ＤＮＡｓｅ１（２０Ｕ／ｍｌ）およびＲＮＡｓｅ（１０μｇ／ｍｌ）の混合物を、氷上において３０分間加えた。タンパク質濃度を、Ｂｉｏｒａｄタンパク質アッセイを使用して決定し、次に、５００μｇのタンパク質抽出物を、６Ｍの尿素を含む０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中で変性させた。ＤＴＴ（１０ｍＭ、３０分）の添加、それに続くヨードアセトアミドとの２時間のインキュベーションによって、タンパク質を、還元およびアルキル化した。次に、サンプルを透析し、その後、トリプシンを用いて、３７℃で一晩消化した。得られたペプチド混合物を、上記のように、逆相Ｃ１８カラムによって、脱塩した。サンプルを、実施例１のように処理した。
【００７７】
この方法によってリンペプチドを単離し、そしてＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析することによって、ＣＩＤスペクトルを記録し、酵母配列データベースを検索した。図６Ａは、カラム保持時間について記録された総イオン強度を示し、これは、サンプルの複雑さを示している。図６Ｂは、図６Ａに示される時間範囲にわたって観察されたｍ／ｚ値（積分値）を示す。観察された主要なペプチドのピーク（このピークもまた、ＣＩＤの間の９８Ｄａの損失を示す）を、アスタリスク（＊）で印をつける。これは、検出されたペプチドの大部分が、実際にリン酸化されていることを確認する。さらに、この方法の選択性は、同定をもたらすＣＩＤスペクトルの８０％以上が、リンペプチド由来であるという事実によって明らかであった。さらに、同定されたいくつかのリン酸化されていないペプチド由来のＣＩＤスペクトルは、一般的に低強度の前駆体イオンから生じた。従って、高度に複雑な開始物質を用いる場合でさえ、低レベルの非特異的なペプチド骨格のみが、ＭＳの単離手順を成し遂げ、その感受性を確認する。示される実施例において、図６Ｂにおけるｍ／ｚ＝１０３２．７でのイオンを、ＣＩＤのために選択し、このスペクトルを、図６Ｃに示す。明らかなフラグメントイオン系列を観察することに加えて、Ｈ３ＰＯ４の損失を受けた後の二重荷電した親イオンに対応する主なシグナルは、ｍ／ｚ＝９８３．８で明らかである。
【００７８】
以下のデータベース検索によって、ペプチドをエノラーゼ由来でありかつ示された配列を有するとして同定した。このペプチドは、３つの可能性のあるスレオニンリン酸化部位を含み、そして、親イオンの質量は、このペプチドが、単一のリン酸基を含むことを示した。ｙ−７〜ｙ−１３のイオンは、リン酸がＮ末端スレオニン上にないことを確認した。ｙ−５イオンおよびｙ−６イオンの２つの可能性のある対は、リン酸化された他の２つのスレオニン残基のいずれか一方に対応する。従って、このペプチドについての正確なリン酸化部位を決定し得なかった。さらに、このペプチドの可能性のあるモノリン酸化種の両方の混合物が、ＬＣカラムから同時に溶出してしまった可能性を排除できない。
【００７９】
表１は、同様の様式で得られたさらなるＣＩＤスペクトルのデータベース検索の後に同定されたタンパク質（および遺伝子名）を、決定されたリンペプチドの配列とともに列挙する。ポジティブに同定された全てのペプチドは、単独でリン酸化された種であり、そしてこれらは、セリン残基またはスレオニン残基がリン酸化されていた。表１はまた、これが明確に決定される場合、ペプチド内のリン酸化部位の位置を示し、または観察されたＣＩＤデータが２以上のリン酸化部位間を区別できなかった場合には、可能性のあるリン酸化部位を示す。図６Ｃに見られるように、このような場合は、リンペプチドの同定を妨げず、そして代表的に、リン酸化部位をヒドロキシルアミノ酸のクラスターに限定し得る。
【００８０】
複数のセリンリン酸化部位またはスレオニンリン酸化部位を有するペプチドは同定されなかった。多くの場合において、Ｈ３ＰＯ４の損失に対応するイオンは、フラグメント化工程を支配し、配列決定のためのペプチド結合での不十分なフラグメント化を生じる。この効果は、単一のペプチド中の複数のホスホセリン部位またはホスホスレオニン部位によって、倍加される（ｂｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｅｄ）。非常に巨大なサイズのペプチドまたは非常に小さなサイズのペプチドは、一般的にＭＳ配列決定に適切ではない；さらに、このようなペプチドは、この方法における脱塩工程の間に損失され得る。従って、この方法が、所定のタンパク質の全てのリン酸化部位を完全に決定し得るか否かは、リン酸化部位が、ＭＳ分析に適する大きさ／疎水性のペプチドを含んでいるか否かに依存し、これは、全てのＭＳに基づく方法に共通する制限である。このような場合においては、代替的なタンパク質分解酵素が考えられ得る。酵母溶解物での実験において、チロシンリン酸化ペプチドは同定されなかった。これは、有意に低濃度であることに起因するようである。
【００８１】
同定されたほとんどのタンパク質は、解糖系酵素（エノラーゼ、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセラートキナーゼ、およびピルビン酸キナーゼを含む）であることが見出された。タンパク質が単離された細胞は、グルコースを炭素源として利用するので、このサンプル中に主に存在する、主要な種である解糖系酵素のリン酸化部位の同定は、おそらく驚くべきことではない。また、他の高度に発現されたタンパク質（例えば、ピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイム１、リボゾームタンパク質およびヒートショックタンパク質）由来のリンペプチドを同定した。興味深いことには、表１に列挙されたタンパク質のほとんどが、公知のリンペプチドであるとして、そのデータベースに記載されていなかった。しかし、我々のグループおよび他のグループからの以前の研究は、多重２Ｄゲルスポット（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ２Ｄ ｇｅｌ ｓｐｏｔ）（Ｇｙｇｉ，Ｓ．Ｐ．ら（１９９９）「Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｍＲＮＡ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｉｎ ｙｅｓｔ」Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９、１７２０〜１７３０；Ｆｕｔｃｈｅｒ Ｂ．ら（１９９９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９、７３５７〜６８）において、表１に列挙される多くのタンパク質を同定しており、同一のタンパク質の差示的にリン酸化された形態であることと一致する。従って、これらの２Ｄゲルデータは、本明細書中でなされた同定と一致し、このことは、これらのタンパク質が、インビボで実際にリン酸化されているという主張を支持する。少量の調節タンパク質由来のリンペプチドは、この実験では同定されなかったが、それでもなお、この方法自体は、ラージスケールのサンプル調製に適合するか、または目的の富化されたタンパク質の複合体の分析に適する。次の画分化（この単離の前かまたは後のいずれか）は、少量のタンパク質の同定を非常に容易にするはずである。
【００８２】
（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよびデータベース解析）
ＬＣＱイオントラップ質量分析装置（Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＭＡＴ，ＣＡ）を、ＨＰ１１００溶媒送達システム（Ａｇｉｌｅｎｔ，ＣＡ）と共に使用した。ペプチドをカラムに加圧下でロードし、次いで、以前に記載されたように（Ｇｙｇｉ，Ｓ．Ｐ．ら（１９９９）「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｕｓｉｎｇ ｉｓｏｔｏｐｅ−ｃｏｄｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇｓ」Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７、９９４〜９９９）、マイクロキャピラリーＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって溶出し、そして分析した。ＬＣＱについての衝突エネルギーは、３０％に設定した。ＳＥＱＵＥＳＴ（Ｅｎｇ，Ｊ．ら（１９９４）「Ａｎ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａｌ ｄａｔａ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ」Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．５、９７６〜９８９）をペプチド配列について酵母ＹＰＤデータベースを検索するため、およびリン酸化部位の同定のために使用した。検索パラメータは、リン酸化に起因するセリン、スレオニン、およびチロシンへの差示的な質量の改変、エタノールアミンタグに起因するアスパラギン酸、グルタミン酸およびＣ末端に対する定常的な質量の改変、ならびにヨードアセトアミドによるアルキル化に起因するシステインに対する定常的な質量の改変を含んだ。差示的な質量の改変は、改変されたかまたは改変されなかったアミノ酸残基の両方の可能性を、データベース検索において使用したことを意味し、一方定常的な質量の改変は、改変されたアミノ酸残基のみを使用したことを意味する。
【００８３】
上に概略された手順に類似の手順を使用して、Ｊｕｒｋａｔ細胞由来のリンペプチドを単離および同定した。これらの実験において同定されたリンペプチドのリストを、表２に示す。
【００８４】
当業者は、本明細書中に詳細に開示した以外の、保護基、標識、試薬、固相材料、酸処理（弱い酸または強酸）、同位体標識、精製および洗浄手順が、本発明の方法を実施するために使用され得ることを理解する。本明細書中に詳細に開示されたものに加えて、種々の機能的に等価な試薬、方法および技術が、当該分野で公知であり、そして本発明の実施に対して、高価な過度の実験なしに容易に使用され得るか、または適応され得る。本明細書で具体的に使用した物質および方法の、当該分野で公知の全ての機能的等価物および公知の変形が、本発明に包含されることが意図される。
【００８５】
本明細書中で引用された全ての参考文献は、本明細書と矛盾しない限りにおいて、本明細書中で参考として援用される。
【００８６】
【表１】
ａ遺伝子の名称は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔの命名法に従う（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ）。
ｂ配列およびリン酸化部位を、ＳＥＱＵＥＳＴ１８によって、同定した（テキストを参照のこと）。
ｃアスタリスクの複数のマークは、正確なリン酸化部位のあいまいさを示す。全てのペプチドは、単独てリン酸化されている。
＊アスタリスクの左側のセリン残基またはチロシン残基でのリン酸化部位を示している。
【００８７】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のリンぺプチド／リンタンパク質の標識および精製の化学反応を示すスキームである。
【図２】図２は、２つの異なるサンプル中のリンペプチドおよびリンタンパク質の定量的比較を示すフローチャートである。
【図３】図３は、実施例１に記載の差示的に標識されたホスホアンギオテンシンサンプルの質量分析の結果を示す。
【図４】図４Ａ〜Ｄは、本発明のリンペプチド単離手段のリンタンパク質（β−カゼイン）への適用の結果を示す。βカゼインのトリプシン消化物を、本発明の手順に従ってリンペプチドを単離する前（図４Ａおよび４Ｃ）と後（図４Ｂおよび４Ｄ）の両方において、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。１０ｐｍｏｌの出発物質をリンペプチドの単離に使用した。図４Ａは、リンペプチドの単離前のβカゼイン消化物（１ｐｍｏｌ）のイオンクロマトグラムである。ｍ／ｚ＝１０３１．６のピークは、β−カゼインのトリプシン消化物の予測されるリンペプチドの二重荷電形態（ｄｏｕｂｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ ｆｏｒｍ）を示す。図４Ｂは、β−カゼインのトリプシン消化物の単離されたリンペプチドのイオンクロマトグラムである。ｍ／ｚ＝１１８２．５のピークは、β−カゼイン由来のトリプシン処理リンペプチド（これは図４Ａに示される）と同じだが、その７番目のカルボン酸基がエタノールアミンでさらに改変されているリンペプチドの二重荷電形態を示す。図４Ｃは、図４Ｂにおけるβ−カゼイン消化物のＣＩＤスペクトルである。ｍ／ｚ＝９３８．０のピークは、選択された親イオン（ｍ／ｚ＝１０３１．６）からＨ３ＰＯ４基を差し引いた二重荷電形態を示す。図４Ｄは、図４Ｃにおけるβ−カゼイン消化物の単離されたリンペプチドのＣＩＤスペクトルである。さらに、ｍ／ｚ＝１１３３．６のピークは、選択された親イオン（ｍ／ｚ＝１１８２．５）からＨ３ＰＯ４を差し引いた二重荷電形態を示し、そしてペプチドの同定に使用されるｙ−イオン系列が示されている。ｂ−イオン系列は、強度がずっと低く、明瞭化のために省略される。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、Ｌｃｋチロシン−ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）キナーゼ反応混合物からのリンペプチドの単離を示す。図５Ａは、インビトロでのＬｃｋとＭＢＰとの間のキナーゼ反応から生成されたタンパク質混合物のトリプシン消化物から単離されたリンペプチドののＬＣ−ＭＳイオンクロマトグラムである。図５Ｂは、最も強度の高いイオン（ｍ／ｚ＝６３０．１、２＋イオン）のＣＩＤマススペクトルである。このピークをＣＩＤ分析およびデータベース検索に供し、チロシン残基がリン酸化されている、ＭＢＰ由来のＴＨＹ＊ＧＳＬＰＱＫとしてこのペプチドを同定した。
【図６】図６Ａ〜Ｃは、酵母の細胞溶解物からのリンペプチドの単離の結果を示す。図６Ａは、全酵母細胞溶解物のトリプシン消化物から単離されたリンペプチドのＬＣ−ＭＳクロマトグラムである。図６Ｂは、図６Ａに示されるように、２４．７と２６．５分との間の保持時間で、ＬＣカラムから溶出するイオンの積分質量スペクトルである。ＣＩＤで９８Ｄａの損失をさらに示した主なイオンピークは、これらがリンペプチドであることを示しており、アスタリスク（＊）で示される。図６Ｃは、図６Ｂにおいて、ｍ／ｚ＝１０３２．７に示されるペプチドピークについて記録されたＣＩＤスペクトルである。このスペクトルは、このリンペプチドをエノラーゼ由来のＴＡＧＩＱＩＶＡＤＤＬＴ＊ＶＴ＊ＮＰＡＲとして同定するのに十分であった。しかし、スレオニンリン酸化の厳密な部位は、明確には規定されなかった。なぜなら、ｙ５イオンおよびｙ６イオンを割り当てることが困難であったためである。従って、リン酸について可能性のある両方の位置が、示された（＊）が、親イオンの質量は、１リン酸化種として、ペプチドを確認する。
（発明の分野）
リン酸基の選択的な化学標識のための一般的な方法が提供され、この方法は１または数個のリン酸基を含む分子の非常に特異的な精製を容易にする。この方法は、リンタンパク質およびリンペプチドにおけるリン酸の選択的標識に適用可能である。質量分析技術と組み合わせた場合、この方法を使用して複雑な混合物中のリン酸化されたタンパク質を検出および同定し得、そしてリン酸化されたアミノ酸を正確に同定し得る。本発明は、プロテオミクス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）分野における適用性を有し、プロテオミクス分野において、本発明は、細胞または組織中のタンパク質リン酸化の定量的で全体的な分析を容易にする。
【０００２】
（発明の背景）
タンパク質は、実際に全ての生物学的プロセスの制御および実施に必須である。タンパク質の合成速度および半減期は転写後に制御され、故にそれらの発現のレベルもまた、転写後に制御される。さらに、タンパク質の活性は、しばしば転写後修飾によって（特にタンパク質のリン酸化において）調節され、タンパク質と他の分子（ＤＮＡおよびタンパク質を含む）との関連性に依存する。タンパク質の発現レベルも活性状態も、遺伝子配列またはさらには対応するｍＲＭＡの転写物の発現レベルから直接的に明らかではない。従って、生物学的システムの完全な説明は、そのシステムを構成するタンパク質の同定、定量および活性の状態を示す測定を含まなければならない。細胞または組織で発現されるタンパク質のラージスケール（最終的には全体的な）分析は、プロテオーム分析と呼ばれている（Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｓ．Ｒ．、Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｍ．Ｒ．、Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ，Ｄ．Ｆ．、およびＤｕｎｎ，Ｍ．Ｊ．（１９９７）、「Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｆｒｏｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．７：１６８〜１７３）。
【０００３】
現在、ゲノム技術の自動化の処理能力およびそのレベルに近接するタンパク質分析技術は存在しない。最も一般的なプロテオーム分析の実施は、複雑なタンパク質サンプルの分離（最も一般的には二次元ゲル電気泳動（２ＤＥ）による）、その後の分離されたタンパク質種の逐次の同定に基づく（Ｄｕｃｒｅｔ，Ａら（１９９８）、「Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｅｌｅｃｔｏｒｏｓｐｒａｙ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」、Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．７：７０６〜７１９；Ｇａｒｒｅｌｓ，Ｊ．Ｉ．ら（１９９７）、「Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｂｕｎｄａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」、１８：１３４７〜１３６０；Ｌｉｎｋ，Ａ．Ｊ．ら（１９９７）、「Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｔｙｐｅ−ｓｔｒａｉｎ ＮＣＴＣ ８１４３」、Ｅｌｅｃｔｏｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：１３１４〜１３３４；Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ，Ａ．ら（１９９６）、「Ｌｉｎｋｉｎｇ ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｗｏ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｇｅｌｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１４４４０〜１４４４５；Ｇｙｇｉ，Ｓ．Ｐ．ら（１９９９）、「Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｍＲＮＡ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｉｎ ｙｅａｓｔ」、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９：１７２０〜１７３０；Ｂｏｕｃｈｅｒｉｅ，Ｈ．ら（１９９６）、「Ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｇｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １７：１６８３〜１６９９）。
【０００４】
２ＤＥアプローチは、強力な質量分析技術ならびにタンパク質およびペプチドの質量スペクトルデータと配列のデータベースとを相関させることにより、迅速かつ確証的にタンパク質を同定するコンピュータアルゴリズムの開発によって、変革を受けてきた（Ｅｎｇ，Ｊ．、ＭｃＣｏｒｍａｃｋ，Ａ．，およびＹａｔｅｓ，Ｊ．Ｉ．（１９９４）、「Ａｎ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａｌ ｄａｔａ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ」、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．５：９７６〜９８９；Ｍａｎｎ，Ｍ．およびＷｉｌｍ，Ｍ．（１９９４）、「Ｅｒｒｏｒ−ｔｏｌｅｒａｎｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ ｂｙ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６６：４３９０〜４３９９；Ｙａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．ら（１９９５）、「Ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７：１４２６〜１４３６）。
【０００５】
この技術は、銀染色を含む従来のタンパク質染色法によって検出可能な本質的に任意のタンパク質の同定を現在可能にしている感度レベルに達した（Ｆｉｇｅｙｓ，Ｄ．およびＡｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ．（１９９８）、「Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｙ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９：８８５〜８９２；Ｆｉｇｅｙｓ，Ｄ．ら（１９９８）、「Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｍｅｓ」、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９：１８１１〜１８１８；Ｆｉｇｅｙｓ，Ｄ．ら（１９９７）、「Ａ ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎ ｔｒａｐ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：３１５３〜３１６０；Ｆｉｇｅｙｓ，Ｄ．ら（１９９６）、「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｍｉｃｒｏｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ−ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｚｏｎｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ−ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ−ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１５７９〜１５８３；Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ，Ａ．ら（１９９６）、「Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉｌｖｅｒ−ｓｔａｉｎｅｄ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌｓ」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８：８５０〜８５８）。しかし、サンプルが処理される、この一連の様式は、サンプルの処理能力を制限する。最も感度の高い方法は自動化が困難であり、調節タンパク質のような少量のタンパク質は、予備的な富化なしには検出さず、従って、この技術のダイナミックレンジ（ｄｙｎａｍｉｃ ｒａｎｇｅ）を事実上制限する。２ＤＥに基づくアプローチにおいて、タンパク質は、２ＤＥゲルの染色されたスポットのデンシトメトリーによって定量される。
【０００６】
マイクロキャピラリー液体クロマトグラフィー（μＬＣ）およびデータベース検索と連結した、自動化されたデータ依存性のエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）タンデム質量分析（ＭＳｎ）のための方法および装置の開発は、ゲル分離タンパク質同定の感度およびスピードを顕著に増加させてきた。プロテオーム分析に対する２ＤＥ／ＭＳｎアプローチの代替として、複雑なタンパク質混合物の消化により生成されたペプチド混合物のタンデム質量分析による直接分析が、提唱されてきた（Ｄｏｎｇｒ’ｅ，Ａ．Ｒ．ら（１９９７）、「Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｔａｎｄｅｍ−ｍａｓｓ−ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、「Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：４１８〜４２５」）。μＬＣ−Ｍｓ／ＭＳはまた、ゲル電気泳動での分離なしに混合物から直接個々のタンパク質をラージスケールで同定するために首尾よく使用されてきた（Ｌｉｎｋ，Ｊ．ら（１９９９）、「Ｄｉｒｅｃｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：６７６〜６８２；Ｏｐｉｔｅｃｋ，Ｇ．Ｊ．ら（１９９７）、「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｏｎ−ｌｉｎｅ ＬＣ／ＬＣ／ＭＣ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：１５１８〜１５２４）。
【０００７】
これらのアプローチは、タンパク質同定を劇的に加速するが、分析されたタンパク質の定量は、質量分析が本来定量的デバイスではないという観点に起因して、容易に決定され得ない。質量分析法によるタンパク質混合物の直接的な質量分析は、安定同位体希釈理論（これによって、２つの化学的に同一な分析物（内部標準を代表する分析物および測定されるサンプル）が、同一な化学組成物であるが、質量の異なる安定同位元素のタグで標識される）の適用によって定量的になされ得る。この原理は、同位体でコードされた親和性タグ（ｉｓｏｔｏｐｅ ｃｏｄｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇ）（ＩＣＡＴ）と呼ばれる化学試薬クラスの開発によって、定量的プロテオーム分析において実施されてきた（Ｇｙｇｉ，Ｓ．Ｐ．ら（１９９９）、「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｕｓｉｎｇ ｉｓｏｔｏｐｅ−ｃｏｄｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇｓ」、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７、９９４〜９９９）。ＩＣＡＴ試薬およびその複雑なタンパク質混合物の分析への適用は、２ＤＥ／ＭＳｎアプローチが遭遇するダイナミックレンジの問題を実質的に軽減することが示されている。
【０００８】
タンパク質のリン酸化は、細胞内の最も重要な調節事象の１つである。多数の酵素およびプロセスの活性状態ならびに特定のタンパク質の機能的複合体への会合は、しばしばタンパク質の可逆的なリン酸化によって制御される（Ｇｒａｖｅｓ，Ｊ．Ｄ．およびＫｒｅｂｓ，Ｅ．Ｄ．（１９９９）、「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ」，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．８２、１１１〜１２１；Ｋｏｃｈ，Ｃ．Ａ．ら（１９９１）、「ＳＨ２ ａｎｄ ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎｓ：ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２、６６８〜６７４；Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．（１９９４）、「１００１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ ｒｅｄｕｘ−ｔｏｗａｒｄｓ ２０００」、Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５，３６７〜３７６）。タンパク質のリン酸化を研究する本質的な目的は、リンタンパク質のリン酸化部位の生物学的機能の同定、定量および決定である。このような研究の困難性のほとんどは、多くのリンタンパク質が、非常に定量でしか存在しないという事実にある。さらに、タンパク質は、しばしば低い化学量論でリン酸化され、かつ複数の部位でリン酸化される。従って、このような分析に十分な量の純粋なリンタンパク質を獲得することは、一般的に困難である。タンパク質のリン酸化部位の分析のための現在の方法の全ては、１回につき１つの精製されたリンタンパク質に焦点が当てられている（Ｖｅｒｍａ，Ｒ．ら（１９９７）、「Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｃ１ｐ ｂｙ Ｇ１ Ｃｄｋ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｉｔｓ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｔｒｙ ｉｎｔｏ Ｓ ｐｈａｓｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８、４５５〜６０；Ｗａｔｔｓ，Ｊ．Ｄ．ら（１９９４）、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｓｏｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｊｕｒｋａｔ Ｔ ｃｅｌｌ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ＺＡＰ−７０」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、２９５２０〜２９５２９；Ｇｉｎｇｒａｓ，Ａ．Ｃ．ら（１９９９）、「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ４Ｅ−ＢＰ１ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ：ａ ｎｏｖｅｌ ｔｗｏ−ｓｔｅｐ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ」、Ｇｅｎｅ Ｄｅｖ．１３、１４２２〜１４３７）。細胞性タンパク質は、協調的にリン酸化され、特定の生物学的プロセスを制御するので、タンパク質のリン酸化による生物学的システムを制御する複雑なメカニズムを、現在の技術を使用して研究することは、困難である。
【０００９】
リンペプチドは、代表的に、タンパク質消化において稀かつ低容量であるので、質量分析のためには、非常に精製されているか、または富化されたリンペプチドサンプルが必要である。ＭＳ分析前にリンペプチドを選択的に富化することの必要性は、単一の精製されたリンタンパク質よりもむしろタンパク質の混合物が分析される場合に、特に急務である。さらに、タンパク質のリン酸化を直接的に定量するＭＳに基づく方法は、現在のところ利用可能ではない。タンパク質リン酸化の定量的な研究は、しばしば、３２Ｐ放射性標識のような方法を含む（Ｏｄａ，Ｙ．ら（１９９９）、「Ａｃｃｕｒａｔｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ ９６：６５９１〜６５９６）。従って、タンパク質の複雑な混合物からのリン酸化部位の同定およびその定量の両方を可能にする、ＭＳに基づく方法はプロテオーム分析の必須部分である。
【００１０】
従って、特に複雑なタンパク質混合物中のタンパク質リン酸化の分析のためのより迅速かつ一般的な方法（これは、個々のリンタンパク質が均質になるまでの精製を必要としない）の実質的な必要性が当該分野に存在する。本発明はこのような方法を提供する。
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、天然のリン酸基ならびにカルボン酸基のような化学的に関連する基が存在する合成オリゴマーおよび合成ポリマーのリン酸基を選択的に標識する方法を提供する。この方法は、生物学的なオリゴマーおよびポリマー（リンペプチド、リンタンパク質およびリン脂質を含む）に特に適用可能である。タンパク質およびペプチド中のリン酸基の選択的標識は、例えば、タンパク質の複雑な混合物中のリンタンパク質およびリンペプチドの分離、単離、および検出を容易にする。選択的な標識を使用してオリゴマーまたはポリマー（例えば、ペプチドまたはタンパク質）中のリン酸基にリン酸標識を選択的に導入し得る。この標識の存在の検出は、オリゴマーまたはポリマーのリン酸基の存在を検出するために使用される。この方法は、特にリンタンパク質またはリンペプチドの検出にその用途がある。リン酸標識は、担色標識、放射性標識、同位体標識、蛍光もしくはりん光標識、親和性標識、またはリン酸標識、親和性標識あるいは固相材料へのオリゴマーもしくはポリマー（タンパク質もしくはペプチド）の選択的な結合を可能にする反応性基（もしくは潜在的な反応性基）を保有するリンカー基であり得る。
【００１２】
リン酸基のその親和性標識への選択的な結合、または固体支持体への選択的な結合は、少なくとも１つのリン酸基を保有するオリゴマーもしくはポリマー（例えば、タンパク質もしくはペプチド）の選択的な単離を可能にする。親和性標識の存在は、親和性標識に特異的に結合する捕捉試薬を使用して、選択的に標識されたオリゴマーまたはポリマーを捕捉することを可能にする。オリゴマーまたはポリマーの固体表面への選択的な共有結合を可能にするリンカーの存在は、サンプル中の選択的に標識されたオリゴマーまたはポリマーを非選択的に標識された（リン酸化されていない）種から物理的に分離することを可能にする。この方法は、カルボン酸基の存在下でリン酸基を有するタンパク質およびペプチド（リンタンパク質およびリンペプチド）を選択的に標識するために特に有用である。本発明のこの方法を使用して、リンタンパク質およびリンペプチドをリン酸化されていないタンパク質の混合物および／またはリン酸化されていないペプチドの混合物から特異的に分離し得、従って、サンプル中のこれらの種の低いレベルに起因する検出の問題を克服し得る。
【００１３】
特定の実施形態において、この方法は、１以上のサンプル中のリンペプチドおよびリンタンパク質の分離、検出および同定に適用される。この方法は、ペプチドまたはタンパク質中の１以上のリン酸基の存在の検出を可能にするリン酸標識を選択的に導入することに簡単に使用され得る。この方法はまた、ペプチドもしくはタンパク質中のリン酸化部位に親和性標識を選択的に導入するか、またはリンタンパク質もしくはリンペプチドを固体表面へ選択的に結合させるために使用され得る。
【００１４】
周知の質量分析法と組み合わせた場合、本発明の選択的標識方法は、混合物からのリンペプチドの分離を容易にし、質量分析によるリンペプチドの検出を容易にし、そしてタンデム質量分析によるペプチドの配列決定を容易にする。当該分野で公知の方法が、サンプル中で検出されたリンペプチドの配列からサンプル中のリンタンパク質を同定するために適用され得る。差示的な同位体標識のための方法と組み合わせた場合、本発明の方法を使用して、異なるサンプル中のリンペプチドおよびリンタンパク質の相対量を定量し得る。これらの定量的な方法は、異なる供給源由来（例えば、異なる細胞型もしくは異なる生物由来）のサンプル中、刺激（例えば、薬物の投与もしくは潜在的な毒性物質との接触）によってか、環境の変化（例えば、栄養レベル、温度、時間の経過）によってか、あるいはサンプルの起源である細胞、組織もしくは生物の状態あるいは細胞状態の変化（例えば、疾患状態、悪性度、部位特異的変異、遺伝子ノックアウト）によって、差示的に影響されるサンプル中のリン酸化の状態を比較を可能にする。このようなスクリーニングで同定されたリンタンパク質は、変化した状態のマーカーとして機能し得る。任意の天然に存在する環境または人工的に制御された環境からのリンペプチドおよびリンタンパク質は、本明細書の方法によって評価され得る。この方法は、天然に存在するタンパク質もしくはペプチドの混合物、ならびに組換えもしくは合成方法に由来するタンパク質あるいはペプチドの混合物に適用され得る。
【００１５】
本発明の選択的な標識方法は、リンペプチドおよびリンタンパク質に適用する場合に、以下の工程を包含する：
（１）タンパク質を含む１以上のサンプル中のタンパク質またはペプチドのカルボン酸基を、サンプル中のタンパク質またはペプチドの任意のリン酸基が保護されない（遊離のリン酸基として残る）ように、不変的（ｐｅｒｍｅｎｅｎｔｌｙ）かつ選択的に保護する工程；
（２）次に、サンプルのタンパク質またはペプチドの遊離リン酸基と、標識（例えば、リン酸標識、放射性標識、同位体標識、もしくは親和性標識）またはリンタンパク質もしくはリンペプチドを標識もしくは固体表面に選択的に結合させるのを容易にする反応性基もしくは潜在的な反応性基を保有するリンカーとを選択的に反応させる工程；および
（３ａ）選択的に標識されたタンパク質もしくはペプチドを、少なくとも１つのリン酸基の存在の測定として標識の存在を使用して検出する工程；あるいは
（３ｂ）リン酸基を有さないタンパク質およびペプチドから分離されるリン酸ペプチドならびに／またはリン酸タンパク質の選択的な単離を容易にするための、親和性標識または固体表面へのペプチドまたはタンパク質の選択的な結合。
【００１６】
好ましい実施形態において、リン酸基の選択的標識は、１以上のサンプル中のタンパク質およびペプチドと保護基（例えば、アミン）（縮合触媒の存在下でカルボン酸基およびリン酸基と反応し、そしてカルボン酸基およびリン酸基の両方を保護する）との開始反応によって達成される。アミンは、カルボン酸（または対応するエステル）と反応し、カルボキシアミド結合を形成する。アミンは、リン酸基またはリン酸エステル基と反応し、ホスホルアミド結合を形成する。次に、保護されたタンパク質およびペプチドの標識されたホスホルアミド結合は、カルボキシアミド結合を切断しない試薬で選択的に切断される。このことは、選択的に標識され得るか、または固体表面に結合され得る、遊離リン酸基の再生をもたらす。特定の実施形態において、アミン（例えば、エタノールアミン）は、全てのカルボン酸基および全てのリン酸基の最初の保護のために使用され得る。例えば、カルボジイミドにより触媒されるアミンとペプチドまたはタンパク質の縮合は、アミド結合およびホスホルアミド結合を形成する。エタノールアミンは、弱い酸条件（例えば、トリフルオロ酢酸（ｔｆａ）の１０〜３０重量％水溶液が、弱い酸条件の例示である）での処理によって、タンパク質またはペプチドのリン酸基から選択的に切断され得る。過剰の保護剤（例えば、過剰のアミン）は、ペプチドを逆相カラムで徹底的に洗浄することによって除去され得る。特定の実施形態において、遊離のリン酸は、反応性官能基（潜在的な反応性基（例えば、スルフヒドリル基）を含む）を保有するリンカー基と反応する。リンカー基は、固体支持体へリンタンパク質またはリンペプチドを結合するために使用され得るか、またはリンペプチドおよびリンタンパク質とリン酸標識との選択的な標識のために使用され得る。例えば、カルボジイミドにより触媒される縮合反応を使用して、シスタミンを遊離のリン酸基に結合し得る。シスタミンのジスルフィド結合は、切断されて反応性のスルフヒドリル基を生じ得る（シスタミンは、潜在的な反応性基を保有する基の例である）。
【００１７】
サンプル中の他のタンパク質から選択的に分離および単離されるリンペプチドまたはリンタンパク質を、親和性標識もしくは固体支持体から切断し、そしてタンデム質量分析を含む従来の質量分析技術によって分析して検出し、配列決定によって同定するか、または１以上のサンプル中のリンペプチドもしくはリンタンパク質を定量する。
【００１８】
異なるサンプル中のタンパク質および／またはペプチドを、差示的に同位体で標識し、異なるサンプル中の同一のペプチドもしくはタンパク質の量の比較を容易にし得る。同位体標識は、代表的にカルボン酸保護基で導入される（例えば、エタノールアミンのようなアミン基）。
【００１９】
この方法において、タンパク質またはペプチドのアミン基はまた、好ましくは、アミノ酸のアミン側鎖の基（例えば、リジン側鎖のε−アミノ基、および／またはペプチドα−アミノ基）との反応のために選択された保護基で処理される。この処理は、サンプル調製の間のアミン側鎖の架橋を制御する。スルフヒドリルリンカー基が使用された場合、ジスルフィド基を還元する試薬でサンプルを処理することが好ましい。選択的に標識されたサンプルはまた、サンプル調製の間に形成され得るチロシンの付加物を除去するために、必要に応じてヒドロキシアミンで処理される。
【００２０】
本発明はまた、リン酸基の選択的な標識のためのキットを提供し、このキットは、選択的標識を実施するために必要な試薬および必要に応じてこのキット試薬と共に使用するためのポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを含む。試薬キットは、カルボン酸／リン酸反応性の保護基、およびリンタンパク質もしくはリンペプチドのリン酸基に選択的に結合する標識またはリンカー基を備える。このキットはまた、反応を容易にするために必要な任意の触媒または縮合試薬（例えば、カルボジイミド）を含む。さらに、このキットは、必要に応じて、アミド結合の存在下でホスホルアミド結合の選択的な切断のための試薬を含む（例えば、選択的切断のための弱い酸条件を生じるために使用され得る希酸）。キットは、選択されたサンプル数をアッセイするために予め測定されたアリコートの試薬を含み得る。
【００２１】
この標識は、親和性標識であり得、もしそうであるならば、このキットは、好ましくは、親和性標識と共に使用するために適切な捕捉試薬を含む。キットは、必要に応じてアミンのための保護基（例えば、ｔ−ｂｏｃまたはｆ−ｍｏｃ）、および固相材料を含む。このキットはさらに、異なるサンプル中のリンタンパク質およびリンペプチドの量（または相対量）をの定量的決定を可能にする、差示的に同位体標識された保護基、リンカー、親和性標識、もしくは他の標識（蛍光、発色団、あるいはりん光）のセットを含み得る。蛍光、発色団、放射性標識、または他の標識に関して、異なる型の標識が、異なるサンプルのリン酸を標識するために使用され得る。例えば、別々に検出可能であり、そして個々に定量され得る異なる蛍光標識（例えば、フルオレセインアミン、ローダミンアミン）を使用して異なるサンプルを標識し得、そして異なるサンプル中の標識されたペプチドの相対量を検出し得る。さらに、キットは必要に応じて、選択的標識を実施するための説明書、ならびにリンペプチドおよびリンタンパク質を検出、同定、または定量するためのキットと組み合わせて使用され得る種々の型の分析を導入するための指導書を含み得る。
【００２２】
特定の実施形態において、本発明は以下を提供する：
天然もしくは合成のペプチドまたはタンパク質と保護基とを反応させ、この保護基は、ホスホルアミド結合を形成することによってそのペプチドまたはタンパク質中のリン酸基を保護し、そしてアミド結合を形成することによってそのペプチドまたはタンパク質中のカルボン酸基を保護するように作用し；その後、アミド結合を実質的に切断することなしに、ホスホルアミド結合を実質的に選択的に切断し、ペプチドまたはタンパク質中の遊離のリン酸基を再生させる条件下で、保護されたペプチドまたはタンパク質を処理し；そして、カルボン酸基が保護されたまま残っているペプチドまたはタンパク質中の遊離リン酸基を、リン酸と反応する官能基を含む標識もしくはタグ、あるいはリンペプチドを結合するか、またはリンペプチドを固体支持体へ結合させるように機能する２以上の官能基を含むリンカーと反応させることによって、１以上の天然もしくは合成のペプチドまたはタンパク質中のリン酸基を、１以上のカルボン酸基の存在下で選択的に標識またはタグ化するための方法。
【００２３】
実質的に一方の結合を切断し、実質的に他方の結合を切断しない試薬とは、一方の結合の切断：他方の結合の切断の比が、少なくとも約１０：１の比（反応速度または検出される切断生成物の量について測定）を示し、そして好ましくは、一方の結合の切断：他方の結合の切断の比が、少なくとも約２０：１の比、そしてより好ましくは、少なくとも約１００：１の比を示す。当然のことながら、本明細書中の方法への適用のために、結合を選択的に切断するための試薬は、好ましくは、他の結合のいかなる測定可能な切断もなく、１つの結合を切断するように選択される。
【００２４】
この方法において、リンペプチドまたはリンタンパク質は、リンカーのスルフヒドリル基との反応を介して固体支持体材料へ共有結合し得、この固体支持体は、スルフヒドリル基との反応のための固定化されたヨードアセチル基を含み得る。この方法において、リンペプチドまたはリンタンパク質は、固体支持体への結合、または親和性標識を介するリンペプチドの捕捉試薬への結合によって、混合物から分離され得る。
【００２５】
ペプチド中の任意のリン酸基が保護されずに残るように、１以上のサンプル中のペプチドのカルボン酸基を選択的に保護し；サンプル中のペプチドの保護されていないリン酸基を、直接的または間接的にリン酸と反応する官能基を有する標識を用いて、選択的に標識し；標識を保有するペプチドを検出し、サンプル中のリンペプチドを検出することによって、ペプチドの混合物を含む１以上のサンプル中の１以上のリンペプチドを検出するための方法。この標識は、放射性標識、同位体標識、蛍光標識、担色標識、または親和性標識であり得る。この標識はまた、少なくとも１つの反応性基または少なくとも１つの潜在的な反応性基を保有する反応性標識であり得る。潜在的な反応性基は、反応のために活性化されなければならない基である（例えば、潜在的な反応性基は、保護基を保有する基であり得、保護基が除去された際に反応性になる）。
【００２６】
この方法において、タンデム質量分析を使用して、ペプチドのアミノ酸配列およびこのペプチド配列内のリン酸化されたアミノ酸の正確な位置を決定し得る。リンペプチドの相対量の定量は、差示的に同位体標識された標識またはタグの使用によって達成され得る。タンデム質量分析を使用してまた、サンプル中の１以上のリンペプチドを検出し得、そして１以上のサンプル中に存在する差示的に同位体標識された標識またはタグの相対量を測定することによって２以上のサンプル中の１以上のリンペプチドの相対量を決定し得る。
【００２７】
この方法はまた、１以上のサンプル中のペプチドと保護基（カルボン酸またはそのエステルと反応し、そしてリン酸基とも反応する）とを反応させ；そしてホスホルアミド結合が実質的に切断されかつアミド結合が実質的に切断されないように十分な弱い酸性下で保護されたペプチドを反応させることによって、ペプチド中で遊離リン酸基を選択的に再生するための酸性試薬を使用することによる、ペプチド混合物中のリンペプチドを選択的に標識するためのキットを提供する。このキットはさらに、次に記載の１以上のいずれかを含み得る：放射性標識、安定同位体標識、蛍光標識、担色標識、親和性標識、対応する親和性標識を有する捕捉試薬、反応性標識、アミン基のための保護基、１以上の固体支持体、ヨードアセチル化された固体支持体、タンパク質消化を行うための１以上の酵素；および本明細書中の検出方法または分離方法の種々の酵素反応もしくは化学反応を実施するための試薬。
【００２８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、混合物中のリンペプチドおよびリンタンパク質の存在を検出するための方法、混合物中に存在するリンペプチドおよびリンタンパク質を同定するための方法、ならびに１以上の混合物中のリンペプチドおよびリンタンパク質の相対量を決定するための方法を提供する。この方法は、ペプチドにカルボン酸基（またはエステル基）およびアミン基の存在下で、ペプチドのリン酸基に対して選択的に共有結合を形成する（ｆｒｏｍ）能力に基づく。より詳細には、本方法は、カルボン酸の存在下で、標識またはリンカーをリン酸基に選択的に結合する能力に基づく。特に、本方法は、アミド結合を切断しない弱い酸条件下で、ホスホルアミド結合を切断する能力に依存する。従って、本方法におけるリン酸基への選択的な標識または連結は、ペプチドおよびタンパク質の（Ｃ末端およびアミノ酸側鎖基の）カルボン酸基のアミドへの最初の変換、そしてペプチドおよびタンパク質のリン酸基のホスホラミデートへの変換によって、起こる。その後、ホスホラミデートは、アミドを切断することなしに選択的に切断され、そして遊離リン酸基は、選択された標識またはリンカーと反応し、１以上のサンプル中のリンペプチドの検出、同定および定量を容易にする。
【００２９】
アミド結合およびホスホルアミド結合を形成するための好ましい方法は、遊離のアミンとの縮合による方法である。縮合は、当該分野で公知の種々の縮合触媒を使用して達成され得るが、カルボジイミドの使用が好ましい方法である。一般的に、任意のアミンが使用され得るが、アルカノールアミン（例えば、エタノールアミン）が好ましい。このアミンは、単純に保護基として働いて、リン酸基との選択的な反応を容易にし得る。このリン酸基は、検出可能な標識を保有し得る（例えば、検出され得る基もしくは部分（例えば、放射性標識、蛍光標識など）を保有する）か、あるいは反応し得る基もしくは部分（反応性官能基）、反応するようになり得る基（潜在的反応性基）または別の種への結合を形成し得る基、もしくは別の種と複合体を形成し得る基（例えば、捕捉試薬に結合するか、もしくは捕捉試薬と複合体を形成する親和性標識）を保有し得る。
【００３０】
ホスホルアミド結合は、弱い酸条件の使用によって、アミド結合の存在下で選択的に切断される。酸の強度および酸性条件への暴露時間の長さの両方を管理することによって、ホスホルアミド結合の選択的な切断を得ることができる。好ましい処理は、希トリフルオロ酢酸（例えば、水中１０容量％以下）を、最大で数時間の選択された時間にわたって使用する。その後、遊離リン酸基を、種々の標識またはリンカーと反応させ得る。例えば、サンプル中のリンペプチドの存在は、リン酸基に選択的に結合した選択された標識の存在によって検出され得る。リンペプチドは、リン酸化されていないペプチドから、固体支持体への選択的な結合（例えば、リン酸基へ選択的に結合するリンカー基を介する）によって、分離され得る。リンペプチドの固体支持体への選択的な結合を使用して、１以上のサンプル中のリンペプチドを単離および精製し得、そして分析方法による（特に質量分析法による）リンペプチドの検出および同定を容易にし得る。
【００３１】
本明細書中の方法の特定の実施形態において、種々の天然の供給源または合成の供給源から生成され得るペプチド混合物は、ペプチド中のアミン基（Ｎ末端およびアミノ酸側鎖基中のアミン基）を保護するように処理される。アミンは好ましくは、当該分野で公知のようにｔ−Ｂｏｃ化学を使用して保護される。アミンが保護されたペプチドのカルボン酸およびリン酸基は、次に、（同位体で標識され得る）遊離アミン（好ましくは、エタノールアミン）と縮合されて、アミドおよびホスホルアミデートを、それぞれ形成する。異なるペプチドサンプルの差示的な同位体標識は、異なるサンプルを、差示的に標識したアミン（重水素化されていないエタノールアミンが、第一のサンプルに使用され得、そして重水素化されたエタノールアミンが、第二のサンプルで使用され得る）で処理することによって、達成される。他の安定な同位体でコード化されたアミン試薬が使用され得る。
【００３２】
アミンが保護され、そしてペプチド中のカルボン酸基および任意のリン酸基がそれぞれアミドおよびホスホラミデートに変換されたペプチドは、次に、弱い酸条件下で処理されて、ホスホルアミド結合を選択的に切断し、アミド結合を実質的にインタクトままにする。サンプル中の任意のリンペプチドが、遊離リン酸基を保有し、そして異なるサンプル中のリンペプチドが、差示的に同位体で標識される。各サンプル中のリンペプチドは、次に、リン酸基とシスタミンとの縮合によって生成されるスルフヒドリルリンカーを介して固体支持体に結合して選択され得る。次に、結合したシスタミンを還元し、固体支持体上のヨードアセチル基と反応し得る遊離スルフヒドリル基を生成する。シスタミンは、固体支持体への結合のために還元（例えば、ジチオスレイトール、ＤＴＴ、またはトリス［２−カルボキシルエチルホスフィン］（ｔｒｉｓ［２−ｃａｒｂｏｘｌｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ］）（ＴＣＥＰ）を用いる）によって活性化される、潜在的な反応性基として機能する。
【００３３】
サンプル中のリンペプチドは、固体支持体に結合しており、十分な洗浄後に（例えば、トリフルオロ酢酸を使用して）支持体から切り離される。好ましくは、アミン保護基もこの反応において、切断される。これらの工程は、精製され、同位体で標識されたリンペプチドを提供し、このようなリンペプチドは、タンデム質量分析に供され得る。ＣＩＤ質量スペクトルは、サンプル中に存在する任意のリンペプチドの配列を提供し、そしてリン酸化されたアミノ酸残基の存在および配置を示す。得られたペプチド配列情報を使用して、データベース検索を実施し、検出されたリンペプチドのタンパク質供給源を決定し得る。同じ質量分析計の質量スキャンで検出された、異なるサンプル中の差示的に同位体標識されたリンペプチドの相対シグナル強度は、異なるサンプル中の標識されたリンペプチドの存在比の測定を可能にする。
【００３４】
本発明の方法は、いくつかの利点を有する。ペプチドのアミン基は保護され、そして他のペプチドのカルボン酸基とアミド結合を形成しないので、ペプチドの架橋および他の人為的反応を最小にする。カルボン酸基は、保護されたままであり、したがって差示的な同位体標識のために提供され得る。
【００３５】
リン酸基を標識しているアミンの固体支持体への共有結合は、本発明の方法の好ましい実施である。なぜなら、固定化されたリンペプチドのストリンジェントな洗浄、および酸処理による固定化されたリンペプチドの特異的な放出を可能にするからである。リン酸基を標識するために、システインの使用が好ましい。なぜなら、ブロックされていない残りのカルボン酸基を有する任意のペプチド（リン酸基を含有するか否かに拘わらず）が、スルフヒドリル基に変換され、そして固体支持体に不可逆的に結合たままであるからである。システイン残基の存在は、上記方法を妨害するが、システイン基は、ヨードアセトアミドまたは任意の他の公知のアルキル化剤によって、必要に応じてアルキル化され得る。任意のタンパク質サンプルを、このリンペプチド単離方法に供する前に、タンパク質サンプルは、ジチオスレイトールによって還元され得、次いで、変性条件下で過剰のヨードアセトアミドによって、アルキル化され得る。従って、本発明の方法の固相に基づく実施形態は、高度に特異的なリンペプチド精製のための効率的な方法として役立ち、そしてカルボキシル基の誘導体化によって導入される安定な同位体タグは、リンペプチドの相対的定量のための基礎として役立つ。リンペプチドの結合（例えば、スルフヒドリル基を介する）を容易にし、そしてこの方法のペプチド、試薬、および洗浄条件に対して他の点では比較的不活性な官能基で誘導体化され得る任意の固体材料が使用され得る。例えば、固相でのペプチド合成に有用な任意の固相材料が使用され得る。ガラスビーズが、好ましい固相材料である。
【００３６】
蛍光標識、担色標識、放射性標識、または他の標識に関して、異なる型の標識が、異なるサンプル中のリン酸を標識するために使用され得る。例えば、別々のリン酸でありかつ個々に測定され得る異なる蛍光標識（例えば、フルオレセインアミン、ローダミンアミン）を使用して、異なるサンプルを標識し得、そして異なるサンプル中の標識されたペプチドの相対量を検出し得る。また、これらの標識を使用して、ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣまたはＣＥ（キャピラリー電気泳動）によって分離し得、そして蛍光測定によってペプチドの相対量を検出し得る。異なるサンプル中のペプチドの相対量の定量的測定を実施するために、システムを較正することが好ましい（異なる標識での検出の相違を説明するため）。例えば、異なる蛍光標識を使用する場合、異なる標識の量子収量の差異について較正することが好ましい。
【００３７】
図１は、本発明の選択的標識方法を示す。示されるように、ペプチド（１）を、最初にアミン保護基（２）（例えば、ｔ−Ｂｏｃ（ｔ−ブトキシジカルボネート））と反応させる。種々の有用なアミン保護基が当該分野で公知であり、本方法において適用するために容易に利用可能である。選択される保護基は、本方法で使用される他の試薬と適合性でなければならない。次に、保護されたアミン基を有するペプチド（３）を、カルボン酸基およびリン酸基を保護するように反応する試薬（４）（例えば、アミン）を用いて処理する。アミン基は、カルボン酸基と反応して、アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を形成するか、またはリン酸基と反応して、ホスホラミデート結合（−ＰＯ２−ＮＨ−）を形成する。完全に保護されたペプチド（５）を処理して、選択的にホスホルアミド結合を切断し、リン酸基から保護を取り除く。弱い酸条件（６）を使用して、リン酸基を選択的に再生する。例えば、保護されたペプチドを、トリフルオロ酢酸（ｔｆａ）で処理し得る（室温で、水中約３０容量％以下で約１時間、好ましくは、水中約２０％で約１時間、そしてより好ましくは、１０％で３０分）。弱い酸条件は、ｔｆａのような強酸の希釈した形態で使用を含む。所望の化学を達成する他の弱い酸条件は、慣用的な実験によって決定され得、このような処理は、ホスホルアミドの切断を最大にし、そしてアミドの切断を最小にするように変化させられる。
【００３８】
リン酸の保護基が取り除かれている、保護されたペプチド（７）を処理して、遊離リン酸基を選択的に標識する。例えば、スルフヒドリルまたは他の反応性基を含むリンカー（８）は、リン酸基に選択的に結合され得る。リンカー基は、リン酸基へ結合するための官能基（例えば、アミノ基）および標識または固体表面へ連結するための官能基を含む。あるいは、この方法のこの時点で、リン酸基へ結合するための官能基を保有する標識（親和性標識、または蛍光標識もしくは放射性標識のような任意のリン酸標識）は、リン酸へ直接結合され得る。図１に示されるように、リンカー基の官能基は、潜在的な官能基（これは、標識を付加する反応または固体表面に共有結合する反応の前に活性化させなければならない）であるかもしれない。示された場合において、シスタミンは、潜在的なスルフヒドリル官能基（−Ｓ−Ｓ−結合）を保有し、この潜在的なスルフヒドリル官能基は、ジスルフィド結合を還元する試薬（９、例えば、ＴＣＥＰまたはＤＴＴ）の添加によって活性化される。
【００３９】
図１は、リンカー基のスルフヒドリル官能基を介するリンペプチドの共有結合を示す。スルフヒドリル基のリンカーを保有するペプチド（１０）を、ヨードアセチル基を保有する誘導化されたビーズ（１１）と反応させる。種々の型の固体材料が、本方法での使用のために利用可能である。固相材料（ビーズ、表面、層などの形態）を、結合を容易にするために誘導体化する。リンペプチド（１０）との反応後、固体に残っている反応性基を、適切なキャッピング試薬を用いて（例えば、ＤＴＴ（１２）を用いて）キャップまたは保護し得る。固体支持体に共有結合したリンペプチド（１３）は、サンプル中の他のペプチドから物理的に分離され得、そして非特異的に結合したあらゆるペプチドは、洗浄により取り除かれ得る。
【００４０】
図１は、結合したリンペプチドをヒドロキシルアミン（１４）で処理する工程を示す。より詳細には、結合したペプチドを保有するビーズ（１３）を洗浄し、そして１Ｍのヒドロキシルアミン（１４、ｐＨ１０．０）中で約２時間にわたってインキュベートしてチロシンを再生する。なぜなら、チロシン残基は、カルボジイミドと付加物を形成し得るからである。この工程は、この方法においてカルボジイミド試薬が使用される場合、カルボジイミド試薬と付加物を形成しているかもしれない結合したペプチドにおいてチロシンを再生するために、必要に応じてではあるが、好ましい。５％ヒドロキシルアミンとの約３０分間の処理が、チロシンを再生するに十分であることが見出されている。
【００４１】
結合していないペプチドは、５Ｍの塩化ナトリウム、アセトニトリルおよび水で連続的に洗浄することによって、除去される。各洗浄工程の容量は、最低、１０カラム床容量からなるが、より大きな容量もまた使用され得る。次に、結合したリンペプチドは、強酸条件（１５）下で処理されて、固体表面へのリンカーが切断され、そしてアミン保護基（２）が除去される。しかし、遊離の（すなわち、放出された）リンペプチド（１６）のカルボン酸基は、まだ保護されている。これらの保護基は、質量分析法による定量的ペプチド分析に有用な差示的な同位体標識を保有するように使用され得る。アミン反応性保護基（２）の切断なしに固体支持体からリンペプチドを選択的に切断する条件を使用することもまた、望ましくあり得る。種々の異なる条件を使用して切断される種々の保護基が、当該分野で利用可能である。当業者は、保護基、リンカー、および固体支持材料からリンカーを切断する際に、アミン反応性保護基を保持することが可能な切断条件を選択し得る。ペプチドが固体表面から切断された後にアミン反応性保護基が保持される場合、アミン反応性保護基は、差示的な同位体標識にも使用され得る。
【００４２】
分離され乾燥されたリンペプチドは、ＬＣ−ＭＳ分析のために水に再懸濁される。本明細書中の方法によって選択的に標識および単離されたリンペプチドは、好ましくは質量分析技術によって分析される。この方法で使用される保護基およびリンカーは、好ましくは、固相材料からの放出の際に保持されるペプチドへの任意の改変が、質量スペクトル分析およびタンデム質量分析方法によるペプチドの配列決定を顕著には妨害しないように選択される。
【００４３】
本願発明と共通の発明者を有する、米国特許出願番号０９／３８３，０６２（１９９９年８月２５日出願）および対応国際特許出願ＷＯ９９／１９４１５（１９９９年８月２５日出願）は、タンパク質の混合物中のタンパク質またはタンパク質の機能の迅速かつ定量的分析のための分析用試薬および質量分析に基づく方法を提供する。この方法は、「親和性標識したタンパク質反応性試薬」と称される試薬を使用する。この試薬は、複雑な混合物からのペプチドの選択的な単離を可能にする。この試薬は、リンカー基を介してタンパク質反応性基（これは、特定のタンパク質の官能基と選択的に反応する）に共有結合した親和性標識を含む。このリンカーは、差示的に同位体標識され得る。この試薬および方法は、複雑なタンパク質混合物中のタンパク質の検出および同定に適用され得、ここで、この方法により単離されたペプチドは、この混合物中のタンパク質の存在の特徴である。単離されたペプチドは、質量分析（ＭＳ）技術によって特徴づけられる。特に、単離されたペプチドの配列は、タンデムＭＳ（ＭＳｎ）技術を使用して、そして配列データベース検索技術の適用によって決定され得、配列決定されたペプチドの起源のタンパク質が同定され得る。親和性標識されたタンパク質反応性試薬はまた、単離されたペプチドの差示的な同位体標識に対して提供されて、異なるサンプル中のタンパク質の相対量の定量的決定を容易にし得、そして内部標準のために提供されて、サンプル中に存在する１以上のタンパク質の絶対的な量の定量的な決定を容易にし得る。本発明は、複雑な混合物中のリンペプチドの選択的標識のための方法、およびリンペプチドの選択的単離のための方法を提供し、これらは、米国特許出願番号０９／３８３／０６２ＵＳならびに国際特許出願ＷＯ９９／１９４１５に記載の本方法および用途とともに使用され得る。これらの特許出願は、とりわけ、記載されている差示的同位体標識、質量分析方法および選択的標識方法の適用の説明について、本明細書中の開示と矛盾しない範囲において、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【００４４】
以下の参照文献は、質量分析技術のタンパク質同定（特に、プロテオーム分析に関する）への適用に関する：Ｉｄｅｋｅｒ Ｔ、Ｔｈｏｒｓｓｏｎ Ｖ、Ｒａｎｉｓｈ ＪＡ、Ｃｈｒｉｓｔｍａｓ Ｒ、Ｂｕｈｌｅｒ Ｊ、Ｅｎｇ ＪＫ、Ｂｕｍｇａｒｎｅｒ Ｒ、Ｇｏｏｄｌｅｔｔ ＤＲ、Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ Ｒ、Ｈｏｏｄ Ｌ「Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｇｅｏｍｉｃ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙ ｐｅｒｔｕｒｂｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｎｅｔｗｏｒｋ」Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００１ Ｍａｙ ４；２９２（５５１８）：９２９〜３４；Ｇｙｇｉ ＳＰ、Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ Ｒ．「Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ」Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０００ Ｏｃｔ；４（５）：４８９〜９４；Ｇｙｇｉ ＳＰ、Ｒｉｓｔ ｂ、Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ Ｒ「Ｍｅａｓｕｒｅｉｎｇ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｏｎ ｂｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ」Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００ Ａｕｇ；１１（４）：３９６〜４０１；Ｇｏｏｄｌｅｔｔ ＤＲ、Ｂｒｕｃｅ ＪＥ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＧＡ、Ｒｉｓｔ Ｂ、Ｐａｓａ−Ｔｏｌｉｃ Ｌ、Ｆｉｅｈｎ Ｏ、Ｓｍｉｔｈ ＲＤ、Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ Ｒ．「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｃｃｕｒａｔｅ ｍａｓｓ ｏｆ ａ ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈｉｎｇ」Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．２０００ Ｍａｒ １５；７２（６）：１１１２〜８；およびＧｏｏｄｌｅｔｔ ＤＲ、Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ Ｒ、Ｗａｔｔｓ ＪＤ．「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｋｉｎａｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｓ ａ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０００；１４（５）：３４４〜８；Ｚｈｏｕ，Ｈら（Ａｐｒ ２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：３７５〜３７８。これらの参考文献は、本願開示と矛盾しない限りにおいて、本明細書中で参考として援用される。
【００４５】
本発明の方法に供されるペプチド混合物は、天然のサンプルまたは合成のサンプルから生成され得、そしてタンパク質サンプルの化学的、物理的、または酵素的消化の結果物であり得る。タンパク質は、任意の酵素的に適切な方法を使用して消化され得る（例えば、トリプシン消化）。消化物中のペプチドは、好ましくは約１０〜約５０アミノ酸長の範囲の大きさであり、より好ましくは、タンデム質量分析法を使用するペプチド配列決定を容易にするようにサイジングされている。当業者は、目的のタンパク質サンプルでの使用に適切なタンパク質消化プロトコルを選択し得る。
【００４６】
リン酸基の存在下において、アミンは、カルボン酸を選択的に標識するための、好ましい試薬である。任意のアミン試薬は、一般的に、この保護基の機能を提供する。エタノールアミンのようなアルカノールアミンは、好ましいアミン試薬である。当業者は、同様の選択的な標識機能を提供する他の試薬を見出し得ることを理解する。当業者は、過度の実験に頼ることなしに、選択的標識のための他の試薬を同定および選択し得る。しかし、使用される保護基はまた、本発明の反応での使用に適切でなければならない。本明細書中で記載されるようなカルボン酸基の選択的保護のために適切な当該分野で公知の任意の方法および試薬は、本発明に包含されることが意図される。カルボン酸基を選択手基に保護するために使用されるアミンに関して、アミンとカルボン酸基およびリン酸基との反応は、好ましくは、カップリング剤の存在下で行われる。この反応に使用され得るカップリング剤として、とりわけ、ジシクロヘキシルカルボジイミド、または２，３，５，６−テトラフルオロフェニルトリフルオロアセテートが挙げられる。さらに、４−ジメチルアミノプリジンのようなカップリング触媒が使用され得る。
【００４７】
本発明の選択的標識方法は、保護をリン酸基から選択的に除去するが、カルボン酸基からは除去しない処理を使用する。特に、保護されたペプチドは、ホスホラミダート結合を切断するが、アミド結合は切断しない酸性条件（本明細書においては、弱い酸条件）で処理される。これらの弱い酸条件下での処理は、ペプチドのアミン基およびカルボン酸基を脱保護することなしに、リン酸とエタノールアミン間のホスホアミド結合を切断する。例えば、長期の酸処理を包含しない限り、ｔＢｏｃ保護は、ほとんどインタクトなまま残る。当業者は、同様の機能を提供する他の処理条件が見出され得ることを理解する。当業者は、過度の実験に頼ることなしに、リン酸の保護基を選択的に除去するための他の試薬を同定および選択し得る。本明細書に記載されるようなリン酸保護基の選択的な除去を達成する、当該分野で公知の任意のこのような方法および試薬が、本発明によって包含されることが意図される。
【００４８】
所望される場合、選択的に標識されたペプチドを、支持体に結合するための適切な官能基を保有するリンカーを結合させることによって、固体支持体へ結合させ得る。固体支持体へのリンペプチドの結合は、ヨウ素とのスルフヒドリル基反応を介する結合によって、例示される。当業者は、スルフヒドリルおよびヨード以外の官能基が、固体支持体物質への結合を完成するために使用され得ることを理解する。このような結合を作製するための種々の方法が、当該分野で公知である。リンペプチドの固体支持体への選択的結合の機能を達成する任意の方法および試薬は、本発明によって包括されることが意図される。
【００４９】
特に例示されるような本発明の方法は、逆相カラムでのペプチドの洗浄工程を使用し、ペプチドサンプルから所望されない物質を除去する。当業者は、本明細書中で特に記載される方法以外のこのような物質を除去するための方法が当該分野で公知であり、そして所望の結果を達成するために本明細書中の方法に容易に適用され得ることを理解する。所望でない物質を洗浄または除去するための当該分野で公知のこのような全ての方法は、本明細書によって包括されることが意図される。
【００５０】
１以上のサンプル中のタンパク質リン酸化の定量的な比較分析のための手段が、図２に示される。ペプチドサンプルは、２つの細胞状態から調製される（１および２）。実施例のように、差示的に同位体標識されたカルボン酸／リン酸基のアミン保護試薬（各サンプルについて１つ（例えば、２つのサンプル各々について、ｄ０−またはｄ４−エタノールアミン）を使用して、全てのカルボン酸基および最初にペプチドサンプル中の任意のリン酸をを差示的に同位体標識する。カルボキシル基としては、ペプチドのＣ末端およびグルタミン酸残基ならびにアスパラギン酸残基の側鎖（ならびに稀なアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸由来の任意のカルボン酸側鎖）が挙げられる。リン酸基を保護しているエタノールアミン基は、選択的に除去されて遊離リン酸基を生じる。次に、遊離リン酸基は、リンペプチドの分離を容易にするリンカーで誘導体化される。本方法を使用して最終的に精製される全てのリンペプチドについて、ペプチドのＣ末端に結合した少なくとも１つの標識された保護基（例えば、エタノールアミン）が存在する。その構造に依存して、所定のリンペプチドは、１を超える標識された保護基を有し得る。
【００５１】
差示的に同位体標識されたピーク間の質量の差異は、標識間の同位体の質量の差異およびペプチドの荷電状態（これは、天然の同位体分布に基づいて質量分析装置自身において決定され得る）に依存する。同位体に関係するペプチドは、これらが質量分析装置によって分析される場合に、実施されるマイクロキャピラリー高速液体カラムクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）から本質的に同時に溶出するので、所定のペプチドに起因する多重のピークは、差示的に標識されたペプチドそれぞれ（例えば、ｄ０−およびｄ４−エタノールアミンで差示的に標識された２つのサンプルについての二重項）について現れる。差示的に同位体標識したサンプル中の同一ペプチド由来の多重項（例えば、二重項）ピークにおける相対的なピーク強度は、異なるサンプル中のそのペプチドの相対的濃度を、直接的に得る。この定量方法の根底にある理論は、同位体的に関連するペプチドが、化学的に同一であり、従って、完全に相互の内部標準を示すことである。異なるサンプル由来の差示的に同位体標識されたペプチドからの質量分析装置によって生成されたシグナル強度はそれぞれ、これらのサンプルに存在するペプチド分子の相対量を正確に反映する。
【００５２】
リンペプチドの配列およびリン酸化部位の同定は、タンデム質量分析およびコンピュータ支援データベース検索プログラム（例えば、ＳＥＱＵＥＳＴ（登録商標、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）（ＭｃＣｏｒｍａｃｋ，Ａ．Ｌ．ら（１９９６）「Ｄｉｒｅｃｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｂｙ ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ ａｎｄ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ａｔ ｔｈｅ Ｌｏｗ−Ｆｅｍｔｏｍｏｌｅ Ｌｅｖｅｌ」Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９．７６７〜７７６；Ｅｎｇ，Ｊ．Ｋ．ら（１９９４）「Ａｎ Ａｐｐｒｏａｃｈ と Ｃｏｒｒｅｌａｔｅ Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｄａｔａ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ」Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｏｍ．、５、９７６〜９８９；米国特許第５，５３８，８９７号（Ｊｕｌ．２３，１９９６）Ｙａｔｅｓ，ＩＩＩら））によって決定され得る。タンデム質量分析装置の第一段階において、任意の所定のリンペプチドが選択され、そして衝突誘導解離（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（ＣＩＤ）に供される。生じるフラグメントイオンのスペクトルは、いわゆるＣＩＤスペクトルとして、質量分析装置の第二段階で記録される。この工程が、サンプル中に存在する他の（理想的には、全ての）ペプチドで繰り返される。ＣＩＤ工程は、一般的にペプチド結合でフラグメント化を引き起こし、そしてほとんどの部分について異なるアミノ酸は、異なる質量のピークを得るので、ＣＩＤスペクトル単独で、しばしば、ペプチド配列を決定するのに十分な情報を提供する。ペプチド配列決定およびタンパク質の同定は、配列検索コンピュータプログラム（例えば、ＳＥＱＵＥＳＴＴＭ（これは、全ての公知のゲノム配列を考慮に入れて、可能な全ての理論的ＣＩＤスペクトルを計算し、それらを、実験的なＣＩＤスペクトルと一致度および配列同定について比較する））を使用することによって、容易にされる。Ｃ末端、グルタミン酸、アスパラギン酸および任意の他の酸性側鎖基に対する質量の改変が公知であり、この情報は、コンピュータ解析に組み込まれ得る。また、リン酸化に起因する質量の変化がまた、公知であり、コンピュータ解析に組み込まれ得る。データを、セリン残基、チロシン残基、およびスレオニン残基に対する任意の可能なリン酸化について検索し得、従って、リン酸化部位の同定が可能になる。
【００５３】
本発明の方法は、実質的には化学的に同一であるが、質量によって識別可能な試薬対または試薬セットを生成するために同位体標識される保護基を使用し得る。例えば、一対の保護基の試薬（一方は、同位体的に重く、そして他方は、同位体的に軽い）は、２つのサンプル（１以上の既知のタンパク質を既知量含有する参照サンプルであり得る）の比較に使用され得る。例えば、保護基における、任意の１以上の水素原子、窒素原子、酸素原子、または硫黄原子は、それらの同位体的に安定な同位体：２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏまたは３４Ｓと置換され得る。差示的な同位体標識は好ましくは、カルボン酸保護基において、本発明のペプチドへ導入される。
【００５４】
本発明の方法は、リンペプチドの検出または分離のために親和性標識もしくはリン酸標識を使用し得る。本発明の方法は、任意のリン酸標識（放射性標識、蛍光標識、担色標識などが挙げられるが、これらに限定されない）を使用し得る。この標識は、サンプル中のリンペプチドのリン酸に選択的に結合し、その検出が、リン酸の存在を検出する。
【００５５】
適切な親和性標識は、捕捉試薬（ＣＲ）に共有または非共有のいずれかで選択的に結合し、かつ高親和性で結合する。ＣＲ−Ａの相互作用または結合は、非特異的に結合した化合物を除去するための種々の溶液を用いる過剰かつ複数回の洗浄後に、インタクトなまま残るべきである。親和性標識は、ＣＲを除いてアッセイ系の成分に最小限に結合するか、または好ましくはまったく結合せず、そして反応容器の表面に有意に結合しない。他の成分または表面と親和性標識との任意の非特異的な相互作用は、ＣＲ−Ａをインタクトなまま残す複数回の洗浄によって、阻害されるべきである。さらに、ペプチド、基質または反応産物を放出するＡおよびＣＲの相互作用は、例えば、置換リガンドの添加によってか、または温度条件もしくは溶媒条件を変化させることによっても阻害させ得なければならない。好ましくは、ＣＲまたはＡのいずれもアッセイ系の他の成分と化学的に反応せず、そして両方の基は、アッセイまたは実験の間にわたって化学的に安定であるべきである。親和性標識は、好ましくは、分析されるサンプル液に可溶性であり、かつＣＲは、不溶性樹脂（例えば、アガロースまたは制御された孔のあるガラス）に結合した場合でさえ、サンプル液中に可溶性のままであるべきである。ＣＲに関して、用語「可溶性」は、ＣＲが十分に水和されているか、またはそうでない場合には溶媒和されており、その結果、ＣＲがＡへの結合のために適切に機能することを意味する。ＣＲまたはＣＲ含有結合体は、捕捉Ａが添加された場合を除いて、分析されるサンプル中に存在するべきではない。本発明において有用な親和性標識は、親和性標識のリン酸基への結合（好ましくは、所望である場合、または所望される時に、選択的に切断され得る共有結合を介する）を可能にする官能基を含む。
【００５６】
ＡとＣＲの対の例として以下が挙げられる：
ｄ−ビオチン試薬または構造的に改変されたビオチンベースの試薬（アビジン／ストレプトアビジン（例えば、これは、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）−アガロース、オリゴマー性アビジン−アガロース、またはモノマー性アビジン−アガロースの形態で使用される）のタンパク質へ結合するｄ−イミノビオチン（ｄ−ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ）を含む）；
任意の１，２−ジオール（例えば、１，２−ジヒドロキシエタン（ＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨ））、および１，２−ジヒドロキシアルカン（その環状アルカン（例えば、ホウ酸アルキルもしくはホウ酸アリールまたはホウ酸エステル（例えば、固体支持体物質（例えば、アガロース）へアルキル基またはアリール基を介して結合し得るフェニル−Ｂ（ＯＨ）２またはヘキシルＢ（Ｏエチル）２）と結合する１，２−ジヒドロキシシクロヘキサン）を含む）；
マルトース結合タンパク質（および任意の他の糖／糖結合タンパク質対、またはより一般的には上記のような特性を有する任意のリガンド／リガンド結合タンパク質対）へ結合するマルトース；
任意の抗体に対するハプテン（例えば、ジニトロフェニル基）（ここで、このハプテンは、ハプテンを認識する抗ハプテン抗体へ結合する。例えば、ジニトロフェニル基は、抗ジニトロフェニル−ＩｇＧへ結合する；
遷移金属に結合するリガンド（例えば、オリゴマー性のヒスチジンは、Ｎｉ（ＩＩ）に結合する）。遷移金属ＣＲは、樹脂に結合し、キレートした遷移金属（例えば、ニトリロ三酢酸にキレートしたＮｉ（ＩＩ）またはイミノジ酢酸にキレートしたＮｉ（ＩＩ））の形態で使用され得る；
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに結合するグルタチオン。
【００５７】
ＣＲへのＡの共有結合は、例えば、ＣＲのヨードアセトアミドとＡのスルフヒドリル基との反応によって、達成され得る。
【００５８】
一般的に、上記の適切な基準を満たす親和性富化のために通常使用される任意のＡ−ＣＲ対が、使用され得る。ビオチンおよびビオチンベースの親和性タグが好ましい。特定の目的のために、ビオチンは構造的に改変される（例えば、ＥＳＩ−ＭＳ分析に適合する溶媒（例えば、１０〜２０％の有機溶媒を含む希酸）条件下で、アビジンまたはストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）カラムから溶出するｄ−イミノビオチン）。ｄ−イミノビオチンでタグ化した（ｔａｇｇｅｄ）化合物は、ｐＨ４以下の溶媒で溶出することが予測される。ｄ−イミノビオチンタグしたタンパク質反応性試薬は、対応するビオチンタグした試薬について本明細書に記載された方法によって、合成され得る。
【００５９】
置換リガンド（ＤＬ）を必要に応じて使用して、ＣＲをＡで置換する。適切なＤＬは、代表的には、添加されない限りサンプル中には存在しない。ＤＬは、分析されるサンプル中で化学的かつ酵素的に安定であるべきであり、そしてサンプル中の成分（ＣＲ以外）と反応も結合もすべきでなく、また反応容器の壁と非特異的に結合すべきではない。ＤＬは、好ましくはＭＳ分析中にペプチドのようなフラグメント化を受けず、そしてサンプル中のその存在が、タグ化したペプチド、基質または反応生成物である結合体のイオン化を有意に抑制すべきでない。
【００６０】
ＤＬ自身は、好ましくは、質量分析の間のイオン化が最小であり、そして好ましくは、ＤＬクラスターを構成するイオンの形成が、最小である。ＤＬの選択は、使用されるＡおよびＣＲの基に依存する。一般的に、ＤＬは、合理的な時間的尺度（ほとんどがＤＬの添加後１週間以内であるが、好ましくは、数分または１時間以内である）でＣＲをＡに置換するように選択される。ＣＲに対するＤＬの親和性は、ＣＲのためのＡを含むタグ化された成分の親和性に匹敵するか、またはそれよりもより強い親和性であるべきである。さらに、ＤＬは、ＣＲからのＡを含むタグ化された化合物の溶出の間に使用される溶媒に可溶性であるべきである。好ましくは、ＤＬは、遊離ＡまたはＡの誘導体もしくはＡの構造的改変体である。ＤＬの例として、ｄ−ビオチンもしくはｄ−ビオチン誘導体、特に、ＭＳにおいてクラスター形成を抑制するか、またはイオン化を抑制する基を含むＤＬが、挙げられる。
【００６１】
本発明の方法は、リン酸基へ結合するリンカー基を使用して、固体支持体へリンペプチドを結合し得る。リンカーはまた、親和性標識またはリン酸標識をリンペプチドに結合させるために使用され得る。使用される任意のリンカーは、好ましくは、分析されるサンプル液に可溶性であり、そして化学的反応に関して安定（例えば、サンプルの成分および本方法で使用される任意の他の試薬と実質的に化学的に不活性）であるべきである。リンカーは、ペプチドに結合する場合、親和性標識とＣＲとの特異的な相互作用を阻害するべきではなく、そしてこの系の他の成分への結合、反応容器表面への結合、もしくはＣＲへの結合が最小であるか、または好ましくは、まったく反応しないリンカーであるべきである。リンカーの任意の非特異的な相互作用は、複数回の洗浄によって壊されるべきである。
【００６２】
本発明の方法によって分析され得るサンプルとしては、以下が挙げられる；細胞ホモジネート；細胞画分；尿、血液、骨髄液を含む生物学的体液；組織ホモジネート；涙液；糞便；唾液；肺洗浄もしくは腹膜洗浄の洗浄液；細胞ホモジネートまたは組織ホモジネートの部分的な画分または完全な画分によって生成されるタンパク質、脂質、炭水化物、および核酸を含む生物学的分子の混合物。
【００６３】
本発明の方法は、質量分析法およびタンデム質量分析法を使用する。種々のＭＳ法が利用可能であり、これらの方法で使用され得るが、マトリックス介助レーザーディソープションイオン化（Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）ＭＳ（ＭＡＬＤＩ／ＭＳ）および電子スプレーイオン化（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）ＭＳ（ＥＳＩ／ＭＳ）法が好ましい。
【００６４】
本発明の方法は、リンペプチド標準サンプル（実施例２、図３Ａ〜Ｃ）；単一リンタンパク質（βカゼイン）の酵素消化物（実施例３、図４Ａ〜４Ｄ）；インビトロでチロシン残基をリン酸化したタンパク質（実施例４、図５Ａ〜Ｃ）；酵母細胞の全溶解物の消化物（実施例５、図６Ａ〜Ｃ、および表１）；ならびにＪｕｒｋａｔ細胞の全溶解物の消化物（表２）におけるリンペプチドの検出および同定への適用によって、説明および例示される。
【００６５】
以下の実施例は、本発明をさらに例示することを意図し、本発明を限定することを意図しない。
【００６６】
（実施例）
（実施例１：リンペプチド単離手順）
ペプチドサンプルを乾燥し、そして以下の工程に従って、図１Ａに示される方法に供した。１）ペプチド混合物を０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ１１）／アセトニトリル（５０％（ｖ／ｖ））に再懸濁した。０．１Ｍのｔ−ブチル−ジカーボネート（ｔＢｏｃ）を室温にて４時間で加えた。２）減圧下でアセトニトリルを除去した。サンプルを、１Ｍのエタノールアミン、２５ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および０．５ＭのＮ，Ｎ’−ジメチルアミノプロピルエチルカルボジイミド・ＨＣｌ（ＥＤＣ）にし、室温で２時間インキュベートした。３）１０％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を、室温にて３０分間で加えた。これらの条件下でのより長期の処理は、有害な結果をもたらさなかった。この時点でサンプルを中和し得るが、中和が、結果に有意な効果を有することは、見出されなかった。次にサンプルを、脱塩し、８０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡでの溶出を使用してＣ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ ＷＡＴ ０２３５９０）から回収した。４）ペプチドを乾燥し、１Ｍのイミダゾール（ｐＨ６．０）に再溶解する。イミダゾールは任意であり、ヒスチジンのような感受性の高いアミノ酸との可能性のあるカルボジイミド付加物の形成を阻害するために使用した。０．５ＭのＥＤＣを室温にて３時間で添加した。サンプルをＣ１８カラムにロードし、水で洗浄し、そしてこのカラムにおいて、１Ｍのシスタミン（ｐＨ８．０）で２時間、５０℃で処理した。ペプチドを水で洗浄し、そして１０ｍＭのＤＴＴで還元し、遊離スルフヒドリル基を生成した。５）ＤＴＴを除去するための洗浄後、ペプチドを８０％のアセトニトリル、０．１％のＴＦＡで溶出し、そして固定されたヨードアセチル基を有するビーズ２０ｍｇと共に少なくとも２時間、ｐＨ８．０（１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＥＤＴＡで滴定した）でインキュベートした。固定化されたヨードアセチル基を有するビーズを、３等量のヨード酢酸無水物および１等量のアミノビーズ（Ｓｉｇｍａ，Ｇ４６４３）とジメチルホルミド中３．３等量のジイソプロピルエチルアミンとの間の２時間の反応によって、調製した。カルボジイミドを有するチロシン付加物の形成は、可能性のある副反応である。このような付加物は、ヒドロキシルアミンのような求核試薬に対して不適である。従って、リンペプチドのビーズへの結合後、１Ｍのヒドロキシルアミン（ｐＨ１０）を使用して、室温で２時間、ビーズをインキュベートした。これによってチロシン残基を回復した。５％のヒドロキシルアミン溶液で３０分間の処理が、代表的にチロシン残基を元に戻すのに十分であることを見出した。次にビーズを連続的に、２ＭのＮａＣｌ、メタノールおよび水で洗浄し、非特異的な結合分子を除去した。６）ビーズを１００％のＴＦＡと共に３０分間インキュベートし、リンペプチドを回収した。同時に、ｔＢｏｃ保護を除去した。回収したサンプルを減圧下で乾燥し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために水に再懸濁した。
【００６７】
（実施例２）
ホスホアンギオテンシンペプチドの等量の２つの別々のサンプルを、本発明の方法によって分析した。２つの異なるサンプル中のカルボン酸基を、軽エタノールアミン（ｄ０−エタノールアミン）または重エタノールアミン（ｄ４−エタノールアミン、ＨＯＣＤ２ＣＤ２ＮＨ２）のいずれかによってブロックした（上記のようにリン酸基を遊離のまま残す）。ホスホアンギオテンシンは、２つのカルボン酸基を含み、故に、［Ｍ＋２Ｈ］２＋イオンについての質量の差異は、差示的に標識されたペプチドについて４である。本発明の選択的標識およびリンペプチドの分離に供された差示的に標識されたサンプルの質量分析の結果を、図３Ａ〜Ｃに図示する。軽標識サンプルおよび重標識サンプルに起因するｍ／ｚ≒６０７および６１１での二重項ピーク［Ｍ＋２Ｈ］２＋は、それぞれ、予測された通りに観察される。さらに、２つのピークの相対比は、予測された通りに約１：１である。これらのピークの各ＣＩＤスペクトルは、改変（標識の結合）によって質量シフトしたフラグメントイオンを除いて、保護されていないペプチドのＣＩＤスペクトルと類似である。差示的標識を達成するために使用されるカルボン酸基の改変は、未知ペプチドの配列を同定するために使用されるＣＩＤスペクトルの質に対して悪影響しない。
【００６８】
リンペプチドの単離を、少しの改変を伴うが、実質的に実施例１のように実施した。ペプチドを、５０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルおよび０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ１１）中に懸濁した。ｔ−ブチロキシ−カルボニル（ｔ−Ｂｏｃ、１Ｍ）を室温にて４時間で加えた。アセトニトリルを減圧下で除去した。アミンを保護したペプチドを減圧下で乾燥し、１ＭのエタノールアミンＨＣｌに再懸濁した。溶液のｐＨを、５０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の添加によって約６に調整した。Ｎ，Ｎ’−デメチルアミノプロピルエチルカルボジイミド・ＨＣｌ（ＥＤＣ）を室温にて４時間で加えた（５ｍｇ／５０μＬ）。アミンを保護したペプチドを、同様の様式で重エタノールアミン（ｄ４−エタノールアミン、ＨＯＣＯ２ＣＤ２−ＮＨ２）で標識した。
【００６９】
標識されたペプチドを含む各溶液と等容量の２０％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸とを１時間混合し、その後、２Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液を使用して反応を中和することによって、差示的に同位体標識されたペプチド中で、リン酸を選択的に脱保護した。中和した溶液を逆相Ｃ１８カラムに充填し、水で過剰に洗浄した。再生されたリン酸基を有するペプチドを、水中８０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルを使用してＣ−１８カラムから溶出し、次に乾燥させた。同位体で重く標識されたペプチドおよび同位体で軽く標識されたペプチドのサンプルを質量分析のために合わせた。
【００７０】
ＬＣＱイオントラップ質量分析装置（Ｆｉｎｎｉｇａｍ ＭＡＴ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を、ＨＰ１１００溶媒送達システム（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）と共に使用した。ペプチドを、カラムに加圧ロードし、次に、Ｇｙｇｉ，Ｓ．Ｐ．ら（１９９９、前出）に記載のように、マイクロキャピラリーＬＳ−ＭＳ／ＭＳによって、溶出および分析した。衝突エネルギーまたはＬＣＱを３０％に設定した。
【００７１】
（実施例４：β−カゼインからリンペプチドの単離）
本発明の方法をまた使用して、十分に特徴付けられたリンタンパク質である、ウシβ−カゼインからリンペプチドを精製および検出した。このペプチドを、実施例２に記載のように標識した。リンタンパク質のトリプシン消化物を、マイクロキャピラリーＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。図４Ａに示されるように、多数のペプチドが、未処理のβ−カゼイン消化物について観察された。図４Ａに示されたペプチドは、ｍ／ｚ＝１０３１．６で、二重に荷電したイオン（ｄｏｕｂｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ ｉｏｎ）であった。衝突誘導解離（ＣＩＤ）（図４Ｃ）（Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ｉ．Ａ．（１９９５）、「Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ」Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｒｅｖ．１４、４９〜７３）によるフラグメント化を選択した場合、そのフラグメントイオンスペクトルは、低エネルギーペプチドフラグメント化について代表的に、ほとんどがｙ−イオン系列を示し、そして親イオンからのＨ３ＰＯ４基の損失に起因する９８Ｄａの損失に対応するｍ／ｚ＝９８３．０でのさらなる主要なシグナルを示した（Ｊｏｎｓｃｈｅｒ，Ｋ．Ｒ．およびＹａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．ＩＩＩ（１９９７）、「Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ／ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ｉｏｎ ｔｒａｐ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、１７３５〜１７４１；Ｑｉｎ，Ｊ．およびＣｈａｉｔ，Ｂ．Ｔ．（１９９７）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ＭＡＬＤＩ ｉｏｎ ｔｒａｐ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９、４００２〜４００９）。このＣＩＤスペクトルのデータベース検索は、配列ＦＱＳ＊ＥＥＱＱＱＴＥＤＥＬＱＤＫ（＊はリン酸基を示す）を有するペプチドを同定した。ホスホセリンのｙ１３イオンおよびｙ１４に対応するｙ１３イオンおよびｙ１４イオン間の質量の差異は、公知のβ−カゼインのリン酸化部位である、このタンパク質のＳｅｒ−５０を確認する。
【００７２】
同じβ−カゼイン消化物をリンペプチド単離手順に供することによって、サンプルの複雑性を顕著に減少し、ｍ／ｚ＝１１８２．５で有意に二重荷電したペプチドのみを得る（図４Ｄ）。このペプチドのＣＩＤスペクトルは、明確なフラグメントイオン系列およびＨ３ＰＯ４の損失に起因するｍ／ｚ＝１１３３．６での主要なシグナルを示した（図４Ｄ）。このスペクトルのデータベース検索は、図４Ｂにおけるスペクトルのように同一のペプチドを同定した。同一のペプチドについての見かけの質量の増加（図４Ａと４Ｂ、および４Ｃと４Ｄを比較のこと）は、単離手順の間に７つすべてのカルボン酸基（アスパラギン酸、グルタミン酸、およびＣ末端）が、エタノールアミンで定量的に改変されたことに起因する。
【００７３】
（実施例４）
本発明の工程についてのサンプル回収効率を、ホスホチロシン含有ペプチド、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を使用して調査した。ＭＢＰを、チロシンキナーゼＬｃｋの触媒性ドメインおよび放射性標識したＡＴＰを（既知の特異的活性で）使用して、インビトロでリン酸化した。リン酸化したペプチドをトリプシンで消化し、そして５ｐｍｏｌのリンペプチドを、カルボン酸基をｄ４−エタノール−アミンでブロックすること以外は、前記と同様にして、単離した。
【００７４】
単離されたリンペプチドのイオンクロマトグラムを、図５Ａに示す。ここで、ｍ／２＝６３０．１（２＋）で最も顕著なイオンを、フラグメント化のために選択した。このイオンのＣＩＤを図５Ｂに示す。これは、Ｍ．Ｐ．のＴＨＹ＊ＧＳＬＰＱＫのようなリンペプチドを明確に同定した（Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ．ら（１９９１）、「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｔｅ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａ ｔｈｅ ｌｏｗ ｐｉｃｏｍｏｌｅ ｌｅｖｅｌ ｂｙ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９：５１〜６０）。６つの工程の手順全体にわたるリンペプチドの回収効率を、この手順の各工程の後に回収された放射活性カウントを測定することによって評価し、最終的な収率は、一貫して開始物質の約２０％であった。
【００７５】
（インビトロでのキナーゼ反応）
バキュロウイルスで発現されたＬｃｋキナーゼドメイン−ＧＳＴ（グルタチオン５−トランスフェラーゼ）融合タンパク質１７μｇ、２０μｇのＭＢＰ、および１０μＣｉの３２Ｐ含有ＡＴＰを、２５ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｎＣｌ２、０．２５ｍＭのＡＴＰを含有する緩衝液４０μｌ中において、３０℃で１時間、インキュベートした。１時間後、６Ｍの尿素を反応を停止させるために加えた。還元およびアルキル化を、１０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を３０分間加え、続いて５０ｍＭのヨードアセトアミドで２時間インキュベートすることによって実施した。サンプルを水で１ｍｌまで希釈し、１μｇのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を３７℃で４時間加えた。次に、ペプチドを、Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ、ＭＡ、カタログ番号ＷＡＴ０２３５９０）で脱塩し、８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡでの溶出によって、回収した。回収された放射性標識されたペプチドを、セレンコフカウント（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ ｃｏｕｎｔｉｎｇ）によって定量した。これから、推定５ｐｍｏｌのリン酸化されたペプチドを、リン酸ペプチドの単離および回収効率の評価のために採取した。重水素化したｄ４−エタノールアミン（Ｉｓｏｔｅｃ、Ｍｉａｍｉｓｂｕｒｇ，ＯＨ）を使用して、この実験におけるカルボン酸基をブロックした。
【００７６】
（実施例５：酵母中のリンタンパク質のプロファイリング）
酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（ＢＷＧ１−７Ａ）を、対数増殖期の中期まで、２％のグルコースを炭素源として含むＹＰＤ培地で増殖させ、遠心分離によって、回収した。タンパク質抽出物を、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ）に記載のガラスビーズ法によって調製した。ＤＮＡｓｅ１（２０Ｕ／ｍｌ）およびＲＮＡｓｅ（１０μｇ／ｍｌ）の混合物を、氷上において３０分間加えた。タンパク質濃度を、Ｂｉｏｒａｄタンパク質アッセイを使用して決定し、次に、５００μｇのタンパク質抽出物を、６Ｍの尿素を含む０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中で変性させた。ＤＴＴ（１０ｍＭ、３０分）の添加、それに続くヨードアセトアミドとの２時間のインキュベーションによって、タンパク質を、還元およびアルキル化した。次に、サンプルを透析し、その後、トリプシンを用いて、３７℃で一晩消化した。得られたペプチド混合物を、上記のように、逆相Ｃ１８カラムによって、脱塩した。サンプルを、実施例１のように処理した。
【００７７】
この方法によってリンペプチドを単離し、そしてＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析することによって、ＣＩＤスペクトルを記録し、酵母配列データベースを検索した。図６Ａは、カラム保持時間について記録された総イオン強度を示し、これは、サンプルの複雑さを示している。図６Ｂは、図６Ａに示される時間範囲にわたって観察されたｍ／ｚ値（積分値）を示す。観察された主要なペプチドのピーク（このピークもまた、ＣＩＤの間の９８Ｄａの損失を示す）を、アスタリスク（＊）で印をつける。これは、検出されたペプチドの大部分が、実際にリン酸化されていることを確認する。さらに、この方法の選択性は、同定をもたらすＣＩＤスペクトルの８０％以上が、リンペプチド由来であるという事実によって明らかであった。さらに、同定されたいくつかのリン酸化されていないペプチド由来のＣＩＤスペクトルは、一般的に低強度の前駆体イオンから生じた。従って、高度に複雑な開始物質を用いる場合でさえ、低レベルの非特異的なペプチド骨格のみが、ＭＳの単離手順を成し遂げ、その感受性を確認する。示される実施例において、図６Ｂにおけるｍ／ｚ＝１０３２．７でのイオンを、ＣＩＤのために選択し、このスペクトルを、図６Ｃに示す。明らかなフラグメントイオン系列を観察することに加えて、Ｈ３ＰＯ４の損失を受けた後の二重荷電した親イオンに対応する主なシグナルは、ｍ／ｚ＝９８３．８で明らかである。
【００７８】
以下のデータベース検索によって、ペプチドをエノラーゼ由来でありかつ示された配列を有するとして同定した。このペプチドは、３つの可能性のあるスレオニンリン酸化部位を含み、そして、親イオンの質量は、このペプチドが、単一のリン酸基を含むことを示した。ｙ−７〜ｙ−１３のイオンは、リン酸がＮ末端スレオニン上にないことを確認した。ｙ−５イオンおよびｙ−６イオンの２つの可能性のある対は、リン酸化された他の２つのスレオニン残基のいずれか一方に対応する。従って、このペプチドについての正確なリン酸化部位を決定し得なかった。さらに、このペプチドの可能性のあるモノリン酸化種の両方の混合物が、ＬＣカラムから同時に溶出してしまった可能性を排除できない。
【００７９】
表１は、同様の様式で得られたさらなるＣＩＤスペクトルのデータベース検索の後に同定されたタンパク質（および遺伝子名）を、決定されたリンペプチドの配列とともに列挙する。ポジティブに同定された全てのペプチドは、単独でリン酸化された種であり、そしてこれらは、セリン残基またはスレオニン残基がリン酸化されていた。表１はまた、これが明確に決定される場合、ペプチド内のリン酸化部位の位置を示し、または観察されたＣＩＤデータが２以上のリン酸化部位間を区別できなかった場合には、可能性のあるリン酸化部位を示す。図６Ｃに見られるように、このような場合は、リンペプチドの同定を妨げず、そして代表的に、リン酸化部位をヒドロキシルアミノ酸のクラスターに限定し得る。
【００８０】
複数のセリンリン酸化部位またはスレオニンリン酸化部位を有するペプチドは同定されなかった。多くの場合において、Ｈ３ＰＯ４の損失に対応するイオンは、フラグメント化工程を支配し、配列決定のためのペプチド結合での不十分なフラグメント化を生じる。この効果は、単一のペプチド中の複数のホスホセリン部位またはホスホスレオニン部位によって、倍加される（ｂｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｅｄ）。非常に巨大なサイズのペプチドまたは非常に小さなサイズのペプチドは、一般的にＭＳ配列決定に適切ではない；さらに、このようなペプチドは、この方法における脱塩工程の間に損失され得る。従って、この方法が、所定のタンパク質の全てのリン酸化部位を完全に決定し得るか否かは、リン酸化部位が、ＭＳ分析に適する大きさ／疎水性のペプチドを含んでいるか否かに依存し、これは、全てのＭＳに基づく方法に共通する制限である。このような場合においては、代替的なタンパク質分解酵素が考えられ得る。酵母溶解物での実験において、チロシンリン酸化ペプチドは同定されなかった。これは、有意に低濃度であることに起因するようである。
【００８１】
同定されたほとんどのタンパク質は、解糖系酵素（エノラーゼ、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセラートキナーゼ、およびピルビン酸キナーゼを含む）であることが見出された。タンパク質が単離された細胞は、グルコースを炭素源として利用するので、このサンプル中に主に存在する、主要な種である解糖系酵素のリン酸化部位の同定は、おそらく驚くべきことではない。また、他の高度に発現されたタンパク質（例えば、ピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイム１、リボゾームタンパク質およびヒートショックタンパク質）由来のリンペプチドを同定した。興味深いことには、表１に列挙されたタンパク質のほとんどが、公知のリンペプチドであるとして、そのデータベースに記載されていなかった。しかし、我々のグループおよび他のグループからの以前の研究は、多重２Ｄゲルスポット（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ２Ｄ ｇｅｌ ｓｐｏｔ）（Ｇｙｇｉ，Ｓ．Ｐ．ら（１９９９）「Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｍＲＮＡ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｉｎ ｙｅｓｔ」Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９、１７２０〜１７３０；Ｆｕｔｃｈｅｒ Ｂ．ら（１９９９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９、７３５７〜６８）において、表１に列挙される多くのタンパク質を同定しており、同一のタンパク質の差示的にリン酸化された形態であることと一致する。従って、これらの２Ｄゲルデータは、本明細書中でなされた同定と一致し、このことは、これらのタンパク質が、インビボで実際にリン酸化されているという主張を支持する。少量の調節タンパク質由来のリンペプチドは、この実験では同定されなかったが、それでもなお、この方法自体は、ラージスケールのサンプル調製に適合するか、または目的の富化されたタンパク質の複合体の分析に適する。次の画分化（この単離の前かまたは後のいずれか）は、少量のタンパク質の同定を非常に容易にするはずである。
【００８２】
（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよびデータベース解析）
ＬＣＱイオントラップ質量分析装置（Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＭＡＴ，ＣＡ）を、ＨＰ１１００溶媒送達システム（Ａｇｉｌｅｎｔ，ＣＡ）と共に使用した。ペプチドをカラムに加圧下でロードし、次いで、以前に記載されたように（Ｇｙｇｉ，Ｓ．Ｐ．ら（１９９９）「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｕｓｉｎｇ ｉｓｏｔｏｐｅ−ｃｏｄｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇｓ」Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７、９９４〜９９９）、マイクロキャピラリーＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって溶出し、そして分析した。ＬＣＱについての衝突エネルギーは、３０％に設定した。ＳＥＱＵＥＳＴ（Ｅｎｇ，Ｊ．ら（１９９４）「Ａｎ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａｌ ｄａｔａ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ」Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．５、９７６〜９８９）をペプチド配列について酵母ＹＰＤデータベースを検索するため、およびリン酸化部位の同定のために使用した。検索パラメータは、リン酸化に起因するセリン、スレオニン、およびチロシンへの差示的な質量の改変、エタノールアミンタグに起因するアスパラギン酸、グルタミン酸およびＣ末端に対する定常的な質量の改変、ならびにヨードアセトアミドによるアルキル化に起因するシステインに対する定常的な質量の改変を含んだ。差示的な質量の改変は、改変されたかまたは改変されなかったアミノ酸残基の両方の可能性を、データベース検索において使用したことを意味し、一方定常的な質量の改変は、改変されたアミノ酸残基のみを使用したことを意味する。
【００８３】
上に概略された手順に類似の手順を使用して、Ｊｕｒｋａｔ細胞由来のリンペプチドを単離および同定した。これらの実験において同定されたリンペプチドのリストを、表２に示す。
【００８４】
当業者は、本明細書中に詳細に開示した以外の、保護基、標識、試薬、固相材料、酸処理（弱い酸または強酸）、同位体標識、精製および洗浄手順が、本発明の方法を実施するために使用され得ることを理解する。本明細書中に詳細に開示されたものに加えて、種々の機能的に等価な試薬、方法および技術が、当該分野で公知であり、そして本発明の実施に対して、高価な過度の実験なしに容易に使用され得るか、または適応され得る。本明細書で具体的に使用した物質および方法の、当該分野で公知の全ての機能的等価物および公知の変形が、本発明に包含されることが意図される。
【００８５】
本明細書中で引用された全ての参考文献は、本明細書と矛盾しない限りにおいて、本明細書中で参考として援用される。
【００８６】
【表１】
ｂ配列およびリン酸化部位を、ＳＥＱＵＥＳＴ１８によって、同定した（テキストを参照のこと）。
ｃアスタリスクの複数のマークは、正確なリン酸化部位のあいまいさを示す。全てのペプチドは、単独てリン酸化されている。
＊アスタリスクの左側のセリン残基またはチロシン残基でのリン酸化部位を示している。
【００８７】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のリンぺプチド／リンタンパク質の標識および精製の化学反応を示すスキームである。
【図２】図２は、２つの異なるサンプル中のリンペプチドおよびリンタンパク質の定量的比較を示すフローチャートである。
【図３】図３は、実施例１に記載の差示的に標識されたホスホアンギオテンシンサンプルの質量分析の結果を示す。
【図４】図４Ａ〜Ｄは、本発明のリンペプチド単離手段のリンタンパク質（β−カゼイン）への適用の結果を示す。βカゼインのトリプシン消化物を、本発明の手順に従ってリンペプチドを単離する前（図４Ａおよび４Ｃ）と後（図４Ｂおよび４Ｄ）の両方において、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。１０ｐｍｏｌの出発物質をリンペプチドの単離に使用した。図４Ａは、リンペプチドの単離前のβカゼイン消化物（１ｐｍｏｌ）のイオンクロマトグラムである。ｍ／ｚ＝１０３１．６のピークは、β−カゼインのトリプシン消化物の予測されるリンペプチドの二重荷電形態（ｄｏｕｂｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ ｆｏｒｍ）を示す。図４Ｂは、β−カゼインのトリプシン消化物の単離されたリンペプチドのイオンクロマトグラムである。ｍ／ｚ＝１１８２．５のピークは、β−カゼイン由来のトリプシン処理リンペプチド（これは図４Ａに示される）と同じだが、その７番目のカルボン酸基がエタノールアミンでさらに改変されているリンペプチドの二重荷電形態を示す。図４Ｃは、図４Ｂにおけるβ−カゼイン消化物のＣＩＤスペクトルである。ｍ／ｚ＝９３８．０のピークは、選択された親イオン（ｍ／ｚ＝１０３１．６）からＨ３ＰＯ４基を差し引いた二重荷電形態を示す。図４Ｄは、図４Ｃにおけるβ−カゼイン消化物の単離されたリンペプチドのＣＩＤスペクトルである。さらに、ｍ／ｚ＝１１３３．６のピークは、選択された親イオン（ｍ／ｚ＝１１８２．５）からＨ３ＰＯ４を差し引いた二重荷電形態を示し、そしてペプチドの同定に使用されるｙ−イオン系列が示されている。ｂ−イオン系列は、強度がずっと低く、明瞭化のために省略される。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、Ｌｃｋチロシン−ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）キナーゼ反応混合物からのリンペプチドの単離を示す。図５Ａは、インビトロでのＬｃｋとＭＢＰとの間のキナーゼ反応から生成されたタンパク質混合物のトリプシン消化物から単離されたリンペプチドののＬＣ−ＭＳイオンクロマトグラムである。図５Ｂは、最も強度の高いイオン（ｍ／ｚ＝６３０．１、２＋イオン）のＣＩＤマススペクトルである。このピークをＣＩＤ分析およびデータベース検索に供し、チロシン残基がリン酸化されている、ＭＢＰ由来のＴＨＹ＊ＧＳＬＰＱＫとしてこのペプチドを同定した。
【図６】図６Ａ〜Ｃは、酵母の細胞溶解物からのリンペプチドの単離の結果を示す。図６Ａは、全酵母細胞溶解物のトリプシン消化物から単離されたリンペプチドのＬＣ−ＭＳクロマトグラムである。図６Ｂは、図６Ａに示されるように、２４．７と２６．５分との間の保持時間で、ＬＣカラムから溶出するイオンの積分質量スペクトルである。ＣＩＤで９８Ｄａの損失をさらに示した主なイオンピークは、これらがリンペプチドであることを示しており、アスタリスク（＊）で示される。図６Ｃは、図６Ｂにおいて、ｍ／ｚ＝１０３２．７に示されるペプチドピークについて記録されたＣＩＤスペクトルである。このスペクトルは、このリンペプチドをエノラーゼ由来のＴＡＧＩＱＩＶＡＤＤＬＴ＊ＶＴ＊ＮＰＡＲとして同定するのに十分であった。しかし、スレオニンリン酸化の厳密な部位は、明確には規定されなかった。なぜなら、ｙ５イオンおよびｙ６イオンを割り当てることが困難であったためである。従って、リン酸について可能性のある両方の位置が、示された（＊）が、親イオンの質量は、１リン酸化種として、ペプチドを確認する。
Claims (67)
- カルボン酸基の存在下で、天然または合成のペプチドまたはタンパク質中のリン酸基を選択的に標識またはタグ化するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ．天然または合成のペプチドまたはタンパク質を保護基と反応させる工程であって、該保護基は、ホスホルアミド結合を形成することによって、リン酸基を保護し、そしてアミド結合を形成することによって、カルボン酸基を保護するように反応する、工程；
ｂ．アミド結合を実質的に切断することなしに、ホルホルアミド結合を実質的に選択的に切断する条件下で、該保護されたペプチドまたはタンパク質を処理し、該ペプチドまたはタンパク質中に遊離リン酸基を再生させる、工程；および
ｃ．該ペプチドまたはタンパク質中の遊離リン酸基を、リン酸と反応する官能基を含む標識またはタグと反応させる工程であって、該工程において、該カルボン酸基は保護されたままである、工程
を包含する、方法。 - 工程ａの前記保護基が、アミンである、請求項１に記載の方法。
- 請求項１に記載の方法であって、前記標識またはタグが、固相材料であり、そしてオリゴマーもしくはポリマーの遊離リン酸基が、リンカー部分を介して直接的または間接的に該固相材料に共有結合する、方法。
- 請求項１に記載の方法であって、前記アミノ基を、前記リン酸基と、カルボジイミドによって触媒される反応を使用して反応させる、方法。
- 請求項１に記載の方法であって、前記遊離リン酸基を、リン酸反応性基、および前記固相材料に共有結合を形成するために機能する第二の反応性基を有するリンカー基と反応させる、方法。
- 前記第二の反応性基が、スルフヒドリル反応性基である、請求項５に記載の方法。
- 前記アミン保護基が、エタノールアミンである、請求項１に記載の方法。
- 請求項７に記載の方法であって、工程ｂにおける前記保護されたペプチドまたはタンパク質を、トリフルオロ酢酸で処理して、遊離リン酸基を選択的に再生させる、方法。
- 請求項１に記載の方法であって、前記遊離リン酸基を、スルフヒドリル基、またはスルフヒドリル基へ転換され得る潜在的反応性基を含むリンカーと反応させる、方法。
- 前記遊離リン酸基を、シスタミンと反応させ、そして遊離スルフヒドリル基を、シスタミンの還元によって再生させる、請求項９に記載の方法。
- 前記還元剤がＤＴＴである、請求項１０に記載の方法。
- 工程ｃにおける前記ペプチドまたはタンパク質を、前記リンカーのスルフヒドリル基との反応によって、固体支持体材料に共有結合させる、請求項９に記載の方法。
- 前記固体支持体材料が、固定化されたヨードアセチル基を有するガラスビーズである、請求項１２に記載の方法。
- 前記天然または合成のペプチドまたはタンパク質が、トリプシン消化から得られる、請求項１に記載の方法。
- 前記標識またはタグが、放射性標識、蛍光標識、担色標識、または親和性標識である、請求項１に記載の方法。
- 前記標識またはタグが、親和性標識である、請求項１に記載の方法。
- 前記標識が、反応性標識である、請求項１に記載の方法。
- 選択的に標識されたリンペプチドを検出する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
- 前記リンペプチドが、前記標識の検出によって、検出される、請求項１８に記載の方法。
- 前記標識またはタグが、親和性標識であり、そして前記リンペプチドが、対応する捕捉試薬への結合によって検出される、請求項１８に記載の方法。
- 請求項１に記載の方法であって、該方法が、前記リンペプチドの固体支持体への結合または該リンペプチドの捕捉試薬への結合によって、標識されたリンペプチドを混合物から選択的に分離する工程をさらに包含する、方法。
- ペプチドの混合物を含む１以上のサンプル中の１以上のリンペプチドを検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ．該ペプチド中の任意のリン酸基が保護されないまま残るように、該１以上のサンプル中の該ペプチドのカルボン酸基を選択的に保護する工程；
ｂ．該サンプル中の該ペプチドにおける該保護されていないリン酸基を、リン酸と直接的または間接的に反応する官能基を有する標識で、選択的に標識する工程；および
ｃ．該サンプル中の該リンペプチドを検出するための該標識を保有する該ペプチドを検出する工程、
を包含する、方法。 - 請求項２２に記載の方法であって、前記ペプチドのカルボン酸基が、最初の反応によって、該ペプチド中のカルボン酸基およびリン酸基の両方を保護する保護基で選択的に保護され、次に、該ペプチド中の該リン酸基が、選択的に脱保護される、方法。
- 請求項２３に記載の方法であって、前記ペプチドの前記カルボン酸基およびリン酸基が、カルボン酸基とアミド結合を形成しかつリン酸とホスホルアミド結合形成するアミン基で最初に保護され、ここで該リン酸基が、ホスホルアミド結合の選択的切断によって、選択的に脱保護される、方法。
- 前記アミド結合およびホスホルアミド結合が、カルボジイミドによって触媒される縮合反応によって形成される、請求項２４に記載の方法。
- 前記リン酸基が、弱い酸での処理によってアミド結合を切断することなしに選択的に脱保護される、請求項２５に記載の方法。
- 前記標識が、放射性標識、蛍光標識、担色標識、または親和性標識である、請求項２２に記載の方法。
- 前記標識が、親和性標識であり、そして前記リンペプチドが、対応する捕捉試薬への結合によって検出される、請求項２２に記載の方法。
- 前記標識が、反応性標識である、請求項２８に記載の方法。
- 前記反応性標識が、固相材料に共有結合を形成し得る反応性基を保有する、請求項２９に記載の方法。
- 前記反応性標識が、潜在的な反応性基を保有する、請求項２９に記載の方法。
- 検出工程ｃの前に、選択的に標識されたペプチドを分離する工程をさらに包含する、請求項２２に記載の方法。
- 請求項２２に記載の方法であって、前記標識が、固相材料に共有結合を形成し得る反応性基を保有し、ここで、最初に該標識されたペプチドを該固相材料に共有結合させ、次に該固体支持体を洗浄し、該支持体に共有結合しなかったペプチドを除去し、その後該固相材料からペプチドを放出させることによって、前記選択的に標識されたペプチドが分離される、方法。
- 前記固相材料から放出されたペプチドが、質量分析技術を使用して検出される、請求項３３に記載の方法。
- タンデム質量分析が、前記ペプチドの検出のために使用される、請求項３４に記載の方法。
- 請求項３５に記載の方法であって、タンデム質量分析が、前記ペプチドのアミノ酸配列および該ペプチド配列内のリン酸化されたアミノ酸の正確な位置を決定するために、さらに使用される、方法。
- ２以上のサンプル中の１以上のリンペプチドを検出するための、請求項１に記載の方法であって、ここで、示差的に同位体標識されたカルボン酸保護基が、異なるサンプルと共に使用される、方法。
- ２以上のサンプル中の１以上のリンペプチドを検出するための、請求項３７に記載の方法であって、ここで、異なるサンプル中で使用される前記標識が、示差的に同位体標識される、方法。
- 請求項３７に記載の方法であって、タンデム質量分析が、前記１以上のリンペプチドを検出するために使用され、そして前記２以上のサンプル中のリンペプチドの相対量が、前記示差的に同位体標識された標識の存在する相対量を測定することによって決定される、方法。
- マイクロキャプラリー液体クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析の組み合わせが、前記ペプチドを検出するために使用される、請求項３９に記載の方法。
- 前記アミン基が、ヒドロキシアミンである、請求項１に記載の方法。
- 前記アミン基が、エタノールアミンである、請求項４１に記載の方法。
- 前記保護基が、示差的に同位体標識された保護基の組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記保護基が、ヒドロキシ酸である、請求項４３に記載の方法。
- 前記保護基が、重水素を使用して示差的に同位体標識される、請求項４３に記載の方法。
- ２以上のサンプル中の１以上のリンペプチドを検出するための、請求項２２に記載の方法であって、ここで、示差的に同位体標識されたエタノールアミンが、異なるサンプル中のペプチドのカルボン酸基を保護するための使用される、方法。
- 検出された１以上のリンペプチドの配列を決定する工程をさらに包含する、請求項２２に記載の方法。
- 前記リンペプチドの配列が、タンデム質量分析によって、決定される、請求項４７に記載の方法。
- 請求項４８に記載の方法であって、前記サンプルが、ペプチドを含むタンパク質消化物であり、そして前記検出されたリンペプチドの配列が、前記リンペプチドが由来するタンパク質を同定するために使用される、方法。
- 請求項２２に記載の方法であって、ここで、前記サンプル中の１以上のタンパク質の量はまた、質量分析によって決定され、そして該方法は、定量される該タンパク質の各々について、既知の量の１以上の内部標準をサンプルへ導入する工程をさらに包含する、方法。
- 請求項５０に記載の方法であって、ここで、異なるサンプルが、異なる環境条件もしくは栄養条件、異なる化学的刺激もしくは物理的刺激に対するか、または異なる時間に応じて、発現されたタンパク質を示す、方法。
- 異なるサンプルが、異なる蛍光標識で標識され、そして異なるサンプル中の標識されたペプチドの相対強度が、該異なる標識されたペプチドの蛍光発光の相対強度を測定することによって、測定され得る、請求項２２に記載の方法。
- ペプチドの混合物においてリンペプチドを選択的に標識するためのキットであって、該キットは以下：
（ａ）カルボン酸またはそのエステルと反応しかつリン酸基とも反応する、保護基；および
（ｂ）ホスホルアミド結合が実質的に切断され、アミド結合は実質的に切断されないような十分に弱い酸条件下で、保護されたペプチドを反応させることによって、該ペプチド中の任意の遊離リン酸基を選択的に再生させるための、弱い酸試薬、
を備える、キット。 - 前記保護基が、アミンである、請求項５３に記載のキット。
- 前記保護基が、示差的に同位体標識された保護基を含む、請求項５３に記載のキット。
- 放射性標識、蛍光標識、担色標識、または親和性標識をさらに含む、請求項５３に記載のキット。
- 前記標識が、親和性標識であり、そして前記リンペプチドが、対応する捕捉試薬に結合することによって検出される、請求項５６に記載のキット。
- 前記標識が、反応性標識である、請求項５６に記載のキット。
- 前記反応性標識が、固相材料に共有結合を形成し得る反応性基を保有する、請求項５６に記載のキット。
- 前記反応性標識が、潜在的な反応性基を保有する、請求項５６に記載のキット。
- ヨードアセチル化ガラスビーズをさらに備える、請求項５３に記載のキット。
- 請求項５３に記載のキットであって、前記標識が、固相材料に共有結合を形成し得る反応性基を保有し、ここで、前記選択的に標識されたペプチドは、最初に該固相材料に該標識されたペプチドを共有結合させ、次に該固体支持体を洗浄して、該支持体に共有結合していないペプチドを除去し、その後、該固相材料からペプチドを放出させることによって、分離される、キット。
- １以上の固体支持体材料をさらに備える、請求項５３に記載のキット。
- 共有結合したリンペプチドを固体支持体から除去するための試薬をさらに備える、請求項５３に記載のキット。
- ペプチド消化を実施するための１以上の酵素をさらに備える、請求項５３に記載のキット。
- 請求項５３に記載のキットであって、該キットは以下：
ペプチドの消化を実施するための１以上の酵素；
カルボン酸基またはカルボン酸エステル基およびリン酸基と反応する１以上の保護基；
アミド結合の存在下で、ホスホルアミド結合を選択的に切断し、遊離リン酸を再生するための１以上の試薬；ならびに
遊離リン酸基と選択的に反応させるための官能基を保有する１以上の標識、
を備える、キット。 - 請求項５３に記載のキットであって、該キットは、以下：
ペプチド消化を実施するための１以上の酵素；
カルボン酸基またはカルボン酸エステル基およびリン酸基と反応する１以上の保護基；
アミド結合の存在下で、ホスホルアミド結合を選択的に切断し、遊離リン酸を再生させるための１以上の試薬；
遊離リン酸基と選択的に反応するための官能基を保有し、そして固体支持体材料と反応させるための反応性基または潜在的な反応性基を保有する、１以上のリンカー；
該反応性基または該潜在的な反応性基が結合し得る、１以上の固体支持体材料；ならびに、
固体支持体材料からリンペプチドを切断するための１以上の試薬、
を備える、キット。
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