JP2010512515A - 固相及び触媒で可能な自動同位体希釈並びに種別同位体希釈質量分析 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図26
Description
本発明は、濃縮同位体種の固相固定化と、天然種及び標識同位体種の同位体の対象分析物種の平衡化(equilibration)とそれらの同時抽出(simultaneous extraction)、分離及び/又は選択とを用いて、濃縮同位体及び標識種及び天然同位体種の平衡化を改良する方法に関するもので、IDMS及びSIDMSの可搬性(portability)を改善し、効率、平衡化及び自動化を改善する他の方法に関する。
現在、試料の調製は、測定に先行して行われなければならない。IDMS及び/又はSIDMS(特定種同位体希釈質量分析計-SSIDMSを含む)のどれを使用する場合も、最初に、濃縮同位体種と被分析種の天然種との平衡化を達成することが必要である。もしこのステップに数日あるいは数時間かかり、機器分析及び自動化の時間がほんの数秒で済むのであれば、IDMS及び/又はSIDMSの自動化で使用することを妨げる時間差があるということである。もし試料を抽出、分離、あるいは操作をしなければならない場合、自動化可能な方法は、平衡化の速度を速めると共に抽出及び/又は分離を実行することが必要である。IDMS/SIDMSの平衡化及び自動化の促進により、効率の最適化、再現性及び時間節約がもたらされるが、前記の方法では、これまで具体的に達成されていない。本発明はこの課題に取り組んだ結果、毒性物質取扱いの安定性及び安全性を得ることができた。このことは、国土防衛、国土安全、環境及び環境科学捜査、生命科学並びに産業規則の遵守等の分野で適用する上で特に重要なことである。
質量分析を行なう前に、固相同位体比平衡と測定を用いて、濃縮同位体種と天然同位体種の触媒平衡化を行なう方法について開示する。本発明が基礎とするのは、対象とする分析物について確定的、定性的及び定量的な分析を行なうための試料の調製であり、該試料は、分子であり、元素であり、種分けされ、定性的及び定量的である。この方法は、液相や気相よりも多くの利点をもつ固相を利用することにより、同時平衡化を通じて平衡化を改善するもので、当該分野で公知のIDMS及びSIDMS分析の自動化を可能にする。特徴とする点は、固相と固定化された同位体試薬、同位体濃縮分子で作製された試薬を使用することであり、固相及び固定化相での平衡化プロセスである。質量分析データに適用される校正曲線は用いずに、アルゴリズムを用いて、濃度を数学的に決定し、種のシフト校正を行なうものである。固相で試料の調製を行なうので、被分析物を平衡化し分離するのに要する時間は、従来の液体/熱平衡及び分離プロトコルと比べて有意に短縮される。固相同位体のスパイキング及び平衡化のために作られた試薬と製品は、より長時間にわたって安定である。従って、現場で試料調製を行なうことが可能であり、また、保管又は輸送過程における試薬及び/又は試料の劣化に関連する一連の管理保証(storage and chain of custody)問題が改善される。現場でスパイキング及び平衡化を行なう場合、現場作業者や検査機関の分析者達にとっては、固相同位体のスパイキングおよび平衡化を行なうことにより、試料の調製および操作ステップの幾つかを排除できるので、大量の試薬溶液の場合よりも、反応性・毒性物質の取扱いをより安全に行なうことができる。分析用試料と同位体が濃縮および平衡化された標識試薬は、溶出されて液相および/又は気相で分析が行われるか、あるいは質量分析計内の表面イオン化により固相中で直接分析される。固相同位体のスパイキングおよび高速平衡化により、コスト効率が向上し、ハイスループットで高信頼性の試料調製並びに高レベルの自動化およびミニチュア化のサブシステムを含む分析システムを作製する能力が向上し、これにより可搬性に優れ、現場配置が可能で、精度が高く、エラー率の少ない、実証的な分析および検出システムの作製が可能となる。このように現場配置が可能であることは、環境科学捜査、国家防衛、産業規制の遵守、生物化学、臨床研究および臨床診断目的に極めて有用であろう。国家防衛および安全保障への適用例として、消失性物質について複数地点で飲料水をネットワーク監視することや、軍隊の保護のために、戦場で大気/水/表面を分析することが挙げられる。これらのシステムはまた、人間の疾病の危険性を環境や食物からの工業的毒性物質に対する曝露の関数として判断するのに有用であり、これは環境衛生の成長分野である。最終的に、このようなシステムは自閉症のような病気、幾種類かの癌、アルツハイマー、パーキンソン病および糖尿病などの免疫変性疾患の発病を予測し、あるいは進行速度を遅らせるツールになるものと考える。上記の両概念を利用した最終的な研究について、以下に記載する。
前記課題は、Luらの最近の文献の中に、酵母中のCr(VI)及びCr(III)に対する同位体平衡の時間が12時間以下であることが記載されている。このデータは、本発明の課題を直接解決することを示している。この文献は、同位体と天然種を平衡化するのにマイクロ波と標準熱方法を使用するときの差異が当業者には理解されていない、と記載している。この文献は、EPA方法6800の使用と成功を論じているが、発明者らはさらなる改善を加えるものである。
<SCFカラムに結合された濃縮種>
発明者の1人は、EPA3200法の調製において、国際原子力機関(IAEA-085)から入手した髪の毛の水銀種の認証基準物質の試料を添加する前に、スルフヒドリル化コットンファイバー(SCF)固相カラムに吸着又は化学的に付着された同位体濃縮水銀種に関する調査を行なった。この調査結果のデータは、固相にスパイキング及び平衡化する発明及び新規な方法の有効性を明らかにする。結果について、SCF固相が異なる水銀種及びスルフヒドリル基と共有結合する前に溶液中で平衡化が行われる従来のIDMS及びSIDMS法と比較した。試料は、両方とも、抽出され、マイクロ波エネルギーでスパイク平衡され、次に、予め吸着された固相種同位体スパイキングと比較した。両方とも正確なデータであることがわかった。ここに記載した供試例は、2組のIAEA-085基準物質のヒトの髪の毛を同一資料として処理することを含んでいる。表1は、従来のEPA6800法SIDMSを実施したときのデータであり、試料は、マイクロ波エネルギーで抽出する前に、同位体濃縮メチル水銀でスパイクした。表2は、同じ標準試料(IAEA-085)からのデータであり、EPAマイクロ波抽出法であるEPA3200法を使用し、スパイクされることなく、第1の新規な方法で処理してメチル水銀を抽出し、次に、SCFカラムに加えたものである。ここでは、スパイクは、現在の技術水準の化学的手順で行われているように、溶液中ではなく、カラム中の流入媒体層(flow-through medium)として装填された固相内で平衡化させた。
<現場IDMSでGC-MSによる固相安定同位体の例>
分析的プロセスの幾つかの態様は、現在利用可能な先進的検出技術への対応ができていない。それらの中でも主なものは、現場サンプリング(試料の収集)、流通過程の管理(検体の損失を最少にするか又はなくすことができる、試料の容器への格納、輸送及び保存)及び検査機関の分析(試料の調製)である。分析化学の進歩により、検出限界が水溶液標準の安定性よりもはるかに低い1兆分の1もの低さをもつ機器が開発されている。クロマトグラフ装置技術の多くは成熟し自動化されているが、試料の調製については、依然として、時間がかかり、大きな労働力を要し、検査機関のプロセスにおいて連続的に行われることもある。各々の分析のために、大量の試料を入手し処理することは、現在のやり方では、労力と時間を要し、費用が高く、迅速輸送及びハイスループット分析を実現することができない。濃縮スパイクを固相送達する本発明を適用すれば、工程数が低減され、水、空気、薬物、農産業試料、生物学的試料及び臨床試料の現場サンプリングを改善させることができる。
数種類の分子種について、予めスパイクされた安定同位体固相抽出(PSI-SPE)を行なった結果を示しており、その後のGC-MSの結果を図1に示している。PSI-SPEは、含酸素化合物、PAG-5化合物、モルヒネ化合物、1,4-ジオキサン化合物、1,2-ジクロロエタン化合物について行なった。これら化合物類は、環境法医学、環境健康及び毒物学における測定の典型的なものである。PSIを用いた全ての結果は、従来の実験室SPEを用いて得られた結果と統計的に区別ができないこと、及び、適用可能なEPA法仕様の許容範囲内にあることがわかった。
含酸素化合物は、蒸留物の燃焼プロセスを高めるためにアンチノック剤として添加され、ガソリンの中にしばしば含まれる小さな極性化合物のリストである。化合物のこのリストには、tert-ブタノール(TBA)、メチル-t-ブチルエーテル(MTBE)、エチル-t-ブチルエーテル(ETBE)、ジイソプロピルエーテル(DIIPE)及びt-アミルメチルエーテル(TAME)が挙げられる。MTBEは、環境的に健康問題を生じさせる可能性がある。これら化合物は、水と混和性であるため、特に問題である。精製ガソリン等の炭化水素が流出した場合、非極性石油蒸留ガソリンは水の表面に達するので除去可能であり、水に追随するのは殆どないので、大都市の川沿いにある飲料水ポンプ場は、ガソリンに汚染された水が通過するまで、一時的に操業停止することが行われている。これは、水に完全に可溶な含酸素化合物には当てはまらない。含酸素化合物は、地下水の中へ容易に進入するために、取り除くことは容易ではない。また、水試料について含酸素化合物の汚染濃度を分析しようとしても、水のサンプルを抽出することが困難であるという問題がある。極性の高い含酸素化合物は、従来の手段では、水のサンプルからの抽出が容易ではない。抽出効率を高めようとすると、サンプルはしばしば加熱される。これは、MTBEがTBAに分解することになり、SIDMSなしの結果は不正確なものとなる。MTBEはまた、輸送中、TBAに分解することもある。これは、抽出効率に悪影響を及ぼし、含酸素化合物の抽出中に分解する。この問題は、PSI-SPE法を用いて解消された。含酸素化合物でスパイクされた水試料の抽出結果は、図2に示されるように、良好であった。
モルヒネは、乱用薬物として一般的に知られている。前述した揮発性化合物とは異なり、モルヒネの含有量を求めるための試料マトリックスは、単純な水ではなく、非常に複雑な有機マトリックスである。GC-MSによる従来のモルヒネ量の抽出法は、非常に面倒である。抽出及び分析プロセスを迅速化する手段として、また、より日常的に再現可能な抽出法を提供する手段として、PSI-SPEが、同位体標識されたモルヒネに対して用いられている。図3に示されるように、SPEの結果は良好であった(SPEはAgilentのEvidexで、6ml, 0.5g、表示誤差は95%CL, n=4)。モルヒネはスパイクされた水及びウシ血清からうまく抽出された。
小さな極性分子の他の例は、1,4-ジオキサンである。この化合物は、一般的には、殺菌剤として用いられている。抽出又は分析中に分解することは示されなかったが、含酸素化合物と同様、従来の手段を用いて水から抽出することは極めて困難である。しかしながら、SPEは、含酸素化合物分析と同じ要領で用いられることができ、非常に良好な結果が得られた(図4:1,4-ジオキサン及び1,4-ジクロロエタン。試薬水は、1,4-ジオキサン2ppb及び1,4-ジクロロエタン20ppbでスパイクされた。誤差は、90%CL,n=3で表示されている)。
従来の環境分析では、揮発性有機被分析物(VOA)及び半揮発性有機被分析物の両方に対して、SVOA分析(EPA法8260及び8270)は、校正標準(calibration standard)から生成した応答因子に基づいて定量が行われる。標準は、内部標準を用いて作られた既知濃度の被分析物と、試験される被分析物を使用する。この標準の溶媒は、溶出溶媒と同じである。校正標準を利用する方法では、試料混合物中の対象被分析物に対する抽出効率が100%未満であるとき、定量誤差が生じ、これは内部標準では修正されることができない。校正標準そのものは抽出プロセスを経ていないため、被分析物が非効率的であると、抽出されていない校正標準よりも信号の低下を招く。PSI法では、カラムに予め吸着された(presorbed)内部標準は、(1)抽出媒体に対して、抽出される非分析物と同程度までしっかりと結合されていないので(breakthrough)、濃度が偽上昇するか、(2)抽出媒体に対して、抽出される化合物よりもしっかりと結合されているので(retainment)、濃度が偽低下するか、の何れかである。この両方の誤差は、校正カートリッジを用いることによって解消されることができる。校正カートリッジは、試料カートリッジと同じ要領にて調製されたSPEカートリッジであり、固相材料に予め吸着された内部標準を有している。校正カートリッジを作成するには、クリーンな試薬水が、定量された校正化合物でスパイクされる。これは、試料の抽出時に、分析者によって行われ、校正溶液が入れられた密封ガラスアンプルを破壊し、これがクリーンな試薬水の中に加えられる。この校正試料は、ここでは、試料と同じ要領にて、PSI-SPEを用いて抽出される。このカートリッジが溶出されると、抽出物は校正標準として供される。この種の校正標準は対象試料と同じ抽出手順を経ているので、それから生じる応答は、抽出効率が100%未満のものに対しても修正されるので、よりすぐれたデータが得られる。従来の校正標準と校正カートリッジを用いた定量化の比較結果を図6及び図7に示している。
応答因子は、化合物の領域(area)とその同位体標識類似物(analog)の領域の比であり、所与の濃度である。抽出及び分析プロセス中、これら分析の両方に対する応答が同一である場合、領域カウントは同じはずであり、それゆえ応答因子は1に等しい。しかしながら、実際上の応答は、化合物に応じて僅かに異なるので、同位体が変更された類似物は、実際には、主として、標準を作製するときの非完全さにより、その応答因子は1.0に非常に近い。化合物に対する応答因子が1つの場合、又は1.0の値に十分近いと仮定した場合、定量化だけでなく分析までもが極めて容易になる。実際、応答因子が常に1.0であると仮定することができる場合、もはや、校正標準を作製して使用する必要はない。その場合には、分析が行われる方法は一挙に変化する。応答因子を用いて定量化したスパイク水試料の値が、1つの半揮発性化合物ナフタレンと1つの揮発性化合物ベンゼンに対する応答因子が1.0と仮定した定量に対してどれほどの近さであるかの比較を図8に示している(RF比較。RF=1に対するRFの校正。SPEはSupelcoのスチレンジビニルベンゼン/100mg。薬剤水は20ppbのPAG-5でスパイクした。表示誤差は95%CL, n=5。ナフタレン=1.036。RFフェナトレン=0.999)。比較結果は非常に良好であり、さらなる調査を行なうべきであることが十分に示唆されている。
自動化可能な手段としてPSI-SPEを使用できるようにすることは、将来の機器システムの設計において、自動化特性の設計に影響を及ぼす。以下は幾つかの領域のサンプリングであり、ここでは、PSI-SPEを使用した1又は他の形態の自動化を用いられることができる。環境法医学及び環境健康モニタリングに対しては、この技術を適用するのに数多くの機会がある。汚染されていると判定された現場、又は定期的にサンプリングを行なって汚染を連続的にモニタリングする現場において、飲料水、新鮮水又は新鮮井戸をモニタリングすることは、これら固体相が予めスパイクされた材料の長期安定性によるサンプリングを自動化する全ての機会である。調製されたカートリッジが装填されたところでは、PSI-SPEが用いられることができ、及び/又は、マニホルドシステムで繰り返されることができる。ソレノイド、スイッチ弁及び標準自動化装置を用いることにより、サンプリングを予め定められた時間に定期的に行われることができる。試料採取したストリームからの流れは、適当な時間の間、カートリッジから方向転換され、次に試料の流れは、乾空気の流れと置換され、PSI-SPEが成分をサンプリングした後、残留水が除去される。抽出が完了すると、試料は長期間安定であり、直ちに取り除かれることができるので、試料カートリッジはサイトで分析され、輸送又は分析会社に郵送されることもできる。控え用試料は様々なMS分析のために分配されることができ、長期間の品質管理(QC)及び検証のために保管されることもできる。
食品医薬品局(FDA)及び幾つかの独立した機関は、数多くのソフトドリンク及びフルーツ飲料の中に低レベルのベンゼンが含まれることを確認している。研究結果では、低pHでは、保存剤として使用されるベンゼンイオンはアスコルビン酸(ビタミンCが添加されている)と反応してベンゼンが生成される。ベンゼンは、発癌性物質として知られており、EPAによって規制されている。廃水中のベンゼン濃度が5ppbを超えると有害と考えられている。既存生成品について発明者ら自らの調査では、多くの飲料のベンゼン濃度は5ppbを超えていた。生成の機構はまだ十分に知られていないが、熱、光、ある種の微量金属、さらにはアスコルビン酸が、安息香酸イオンからベンゼンへの転換に関与しているものと思われる。FDAは、ボトルに充填された飲料が販売店に到着してからの保管期間及び温度条件によるという見解を示している。これは、PSI-SPE及び重水素化された安息香酸濃縮同位体標準の濃度が低すぎて液体標準形態では安定であることができないが、固相に予め吸着されたものは安定である例である。FDA又は国土安全局による分析が行われる他の薬剤及び標準形態についても、濃縮された同位体形態では予め吸着されることができ、定性的及び定量的分析に対する有用な新分析ツールとなる。それゆえ、ベンゼンを用いたこの例と同様、製造、品質管理において、また、国土安全局及び国土防衛局のシナリオにおいて、水、飲料、食品、薬剤及び他の試料の流れについて、汚染物質及び毒素を調べるために、迅速で、安価で、定期的にモニタリングを行なう方法を見出すことは重要である。完全に一体化され、自動化された分析測定システムのスタンドアロン型装置又はフロントエンドモジュールとして、自動化されたマニホルドシステムを用いるので、PSI-SPEの使用は費用効果にすぐれることになる。
時間研究(time-study)を行ない、予めスパイクされた安定同位体固相抽出(PSI-SPE)を用いて実現することができる時間節約の例を提供する。この例では、決定方法としてEPA8270法、抽出方法としてEPA3510法を使用し、10の水試料について、半揮発性被分析物の分析を行なった。結果を表3に示している。
PSI-SPEを用いて実現することができる費用節約の基本的理解を得るための費用研究を行なった。この研究では、決定方法としてEPA8270法、抽出方法としてEPA3510法を使用し、10の水試料について、半揮発性被分析物の分析を行なった。結果を表4に示している。
実在の試料を入手し、外部の検査機関で分けて検査を行ない、その結果を比較した。4つの試料は、ガソリン汚染物質の処理プロセス中の汚染現場から採取したものである。試料は、民間の検査機関に送られて、公知の分析を行なった。また、オンサイトでPSI-SPEを用いて処理を行なった。結果を表5に示している。
予め吸着した安定同位体の固相抽出について実証したところ、試料の抽出及び平衡化の有効な方法であることが示された。PSI-SPEは、現在行われている検査の抽出方法に固有の誤差の多くの原因を取り除くことができるので、自動化の基礎として、新規で、効率的で、高信頼性で、迅速な試料調製装置及びシステムの設計が可能となる。
<ELISA:最も一般的な免疫学的検定>
哺乳類の免疫反応は、免疫系が、特定の特殊グループの細胞(B細胞)によって(抗原)認識することができない化合物を認識することによって開始する。次に、免疫系は、抗原特異性B細胞の産生を開始し、特異的特性を有する特殊蛋白質(抗体)を産生し、抗原に結合する。抗原に一旦結合されると、B細胞は、抗原をできるだけ早く排除することを目的とする一連の反応を促進する。免疫診断検定(免疫学的検定)はこの宿主防衛蛋白質(抗体)を利用して、ヒトの血液内に存在するウイルス抗原等の外来物質を直接検出する。免疫学的検定は、抗体の抗原識別特性が利用される高特異性蛋白質結合アッセイのグループである。今日用いられている最も一般的な免疫学的検定は、ELISA(酵素免疫測定法)である。全てのELISAシステムに対して重要なことは抗体の使用である。抗体は、動物内で、抗原刺激に応答して産生される。抗体は、それらの産生に用いられる特定抗原を検出するのに用いられる抗原に結合する特異的生化学である。このように結合が確認された抗体は、特定抗原を検出するのに用いられることができる。これとは逆に、特異性抗体は、確定抗原を用いて測定されることができ、これは、免疫化学研究及び診断生物学の分野において多くのアッセイの基礎をなすものである。
これは、次のステップの回収率と密接な関係がある。信号(ピーク面積として、ピーク面積又は強さとして表される)と希釈要因との関係をx−yチャート上にプロットしたとき、それは直線でなければならない。
これは、既知量の関係物質が評価反応に添加されたとき、評価後に観察される関係物質の割合である。回収率は、臨床的ルーチンワークの10%以内であるべきである。
同時再現性は、1つのELISAプレートにおける値を意味し、日差再現性は、通常は異なる日に実施される異なるプレート間の値を意味する。
基本的に、ELISAには、競争(C-ELISA)と阻害(I-ELISA)の2つの種類がある。「競争(competition)」及び「阻害(inhibition)」という語は、測定が、予め滴定して設定されたシステムとの干渉能力による物質の定量に関係する評価を表している。システムは、抗体又は抗原のどちらかの測定にも用いられることができる。
抗原が受動的吸着によって固相に付着される。洗浄後、酵素標識された抗体が加えられる。培養期間を経て洗浄した後、基質システムが加えられ、色を発現させることができる。
特定の生物学的種(biological species)由来の抗体は、固相に付着された抗原と反応する。どの結合性抗体も、酵素で標識された抗異種抗血清を加えることによって検出される。これは、臨床診断で広く用いられている。
このシステムは、抗体又は固相材料に付着された捕獲抗原を用いる。
システムが直接サンドイッチ法の場合、検出抗体は酵素で標識される。抗原は、該抗原に特異性の血清を用いて検出される。検出抗体は酵素で標識される。捕獲抗体及び検出抗体は、同じ種の同じ血清でもよいし、同じ種の異なる動物の血清でもよいし、異なる種の血清でもよい。直接サンドイッチ法における抗原は、2以上の抗原部位を有していなければならない。
システムが間接サンドイッチ法の場合、抗原は固相結合抗体によって捕獲される。抗原は、次に、他の種に由来する抗体を用いて検出される。これは、抗異種複合体(antispecies conjugate)によって結合される。このように、コート抗体(coating antibodies)及び検出抗体に対する血清の種は相違していなければならず、抗異種複合体はコート抗体とは反応することができない。
質量分析計及び同位体測定技術は、感受性が高く、干渉性が有意に低いという性質を具備しているため、免疫アッセイ検出システムへの適用は非常に好ましいけれども、ELISAの確定的定量検出器として使用するには多くの障害があって、これまでその適用は成功していない。その最も大きな理由は、質量分析計のコストが高いこと、質量分析計検出器信号の安定性が欠けること、生物分析分野における質量分析計の同位体分析及び比較的最近の評判に対する生物科学者の専門的知識が不足していることである。
臨床診断における分光分析の最近の適用例の1つに、SELDI(表面増強レーザ脱離イオン化)チップがあり、蛋白質の発現プロファイリングに用いられる蛋白質及びペプチドを固定化するために様々な異なる機能的表面を有している。これらのチップは、細胞試料源に由来する固定化バイオマーカーを利用しており、これらのバイオマーカーは、疾病の状態に反応して特異的に発現される。これまでの取組みは直接プロテオーム分析を利用してきたため、バイオマーカー分析及び蛋白質発現プロファイリングの全領域は、確定的直接定量化及び再現性の欠如によって妨げられており、それゆえ、確定的定量目的のためにどんな分子タグも用いられていない。濃縮同位体タグは、SELDI蛋白質チップ上で同位体標識されたバイオマーカー比を測定する手段を提供し、IDMS及び/又はSIDMS定量化を通じて定量化及び再現性を大いに向上させることにより、これらの制約を解消させるものである。図13、14及び図15を参照。
新規な分子プロファイリング技術は、低侵襲性バイオプシーによって得られた少数の病理学試料の分析に有用であり、予後診断、治療反応及び画期的な標的実証に関連する解剖病理学分析と相乗作用を有する重要なバイオマーカーの発見を可能にする。このように、健康及び病的状況における組織学的レベルでのプロテオーム解析は、臨床プロテオミクスの分野での主な問題である。直接の組織プロテオーム解析(DTPA)は、SELDI-MS技術の原適用であり、解剖病理学診断に対する補足として臨床プロテオミクスの使用を拡大することができる。DPTA法は、固有のハイスループット特性を提供し、大規模な患者集団におけるバイオマーカーに用いられることができる。
ヒト組織の水銀種で確認されているように、校正曲線は80%を超えるエラーを生じるので、定量化に用いることはできない。SIDMSの直接的濃縮計算だけが種転換の定量化と補正の両方を行なうことができる。IDMSとSIDMSは両方とも数学的アルゴリズムにより直接算出されなければならず、校正曲線は分析検査機関に共通のエラーを回避するために使用されるべきでなく、また、時間がかかり、環境鑑識学、環境衛生及び国土安全の測定等の重要な測定には受け入れられないことがわかった。
濃縮された安定同位体スパイク(単にスパイク)は、試料とは異なる同位体組成物を有しなければならないが、対象とする被分析物の化学的形態及び化学的性質は同じである。実際の試料及び正常な標準のマトリックス組成物は、同じものはめったになく、他の要素の組成物におけるどの違いも、ESI、ナノESI、ナノチップESI、MALDI、SELDI及びAPCI等のソフトイオン化法に発現される異なる同位体類似体に有用である。このように、どんな校正曲線も試料を正確に表すことはできない。アジ化ナトリウム及びシアン化カリウムについて供試例を示す。
Wx=試料の重量
Ws=同位体スパイクの重量
Cs=スパイク中の種の濃度(濃縮)
Cx=試料中の種の濃度(未知)
As=スパイク中の改変同位体(altered isotope)Aの原子分数(濃縮)
Ax=試料中の同位体Aの原子分数(天然)
Bs=スパイク中の改変同位体Bの原子分数(濃縮)
Bx=試料中の同位体Bの原子分数(天然)
Mx=試料中の種の平均原子質量
Ms=スパイク中の種の平均原子質量
Rm=同位体Aと同位体Bの同位体測定比(濃縮/天然)
<種に対する平衡時間効果、IDMS及びSIDMS法を使用:従来の熱、超音波抽出とマイクロ波印加平衡との比較>
この例では、IDMS及びSIDMS法による水銀の種分け(speciation)を行なうのに、NIST標準参考材料(川の堆積物SRM2704及び土壌SRM2711)とヨーロッパIAEA CRM(ヒトの髪の毛IAEA-085)を用いた。SRM2704及びSRM2711は両方とも、所定量の同位体濃縮無機水銀(199Hg2+)でスパイクされた。この研究で評価した試料調製法は、EPA3052法、EPAドラフト3200法(マイクロ波アシスト抽出、MAE)及びEPA3200法(超音波アシスト抽出、UAE)である。EPA3052法とEPA3200法(MAE)を用いた場合、試料をスパイクした後、直ちに、当該方法に基づいて抽出又は分解(digestion)を行なった。しかし、3200法(UAE)については、試料をスパイクした後、異なる時間(1,3,6,12,24及び48h)で平衡化し、次に、この方法に基づいて抽出を行なった。
本発明の抽出及び平衡化方法のロバスト性(robustness)を明らかにするために、複数種のトランスフォーメーションと複数種の変換(conversion)mを評価する必要がある。現時点では、3種類の水銀種に対して認証された組織試料はないので、以前に認証された参考材料(ヒトの髪の毛CRM,IAEA-085)を第3の水銀種であるエチル水銀でスパイクした。エチル水銀は、チメロサールからヒト代謝水銀種で、ワクチンの水銀保存剤であると文献に記載されているので、これは論理的選択である。これら3種が存在すると、6種類の変換が計算されなければならない。数学的アルゴリズムがこの具体的目的のために開発され、3種のSIDMS測定及び試料調製中におけるそれらの変換のために用いられている。表8において、エチル水銀の80%を超える変換は、主として、エチル水銀から無機水銀への変換と、エチル水銀からメチル水銀への変換によるものであることが示されている。メチル水銀はまた、有意に変換され、エチル水銀の変換に由来するメチル水銀から独立し、区別して測定される。この測定は、全ての水銀種の抽出と平衡化を一体的に同時に行わなければ不可能である。
暴力行為や食物の意図的汚染の可能性に対する脅威があるので、空気及び飲料水は、比較的稀であるが強毒性をもつ広範囲の化合物を最も正確な方法で調べるために、消失性物質を迅速に検出する必要がある。最も危険な製剤は非常に強力であるので、毒性物質検出器は、最も低い濃度レベルを正確にかつ高信頼性を以て検出できることが極めて望ましい。仕事のミッションクリティカル及び時間厳守の性質を考慮すると、サイクルタイム(試料の採取、試料の調製/操作及び分析)は、迅速になされなければならず、また、多くの異なる状況及び環境下でその精度及び感度を維持できる堅牢性(rugged)の現場展開可能(field-deployable)なシステムに従属的でなければならない。
Claims (14)
- 同位体希釈質量分析試料を平衡化する方法であって、
a)固相担持体及びマイクロ波可能な溶液からなる群から選択される媒体に、所定量又は所定濃度の同位体標識された被分析物類似体を添加するステップ、
b)前記媒体に、前記同位体標識された被分析物類似体に相当する対象被分析物を含むか又は含むと推測される試料を添加するステップ、
c)前記媒体との平衡化ステップを実行するステップであって、a)固相担持体及び試料を1秒〜24時間インキュベートすること、及びb)マイクロ波可能な溶液にマイクロ波を1秒〜1時間照射すること、からなる群から選択されるステップを実行して、同位体標識された被分析物類似体が含まれる平衡化された試料を作製し、
d)同位体標識された被分析物類似体が含まれる平衡化された試料を、直接イオン化し、分析を行なうために質量分析計へ移送するステップ、を含んでいる方法。 - 固相担持体は、表面改質及び/又は官能化されたイオン交換媒体、吸着媒体、固相抽出樹脂、樹脂結合固相、吸着剤、ソリッド及び/又は多孔質ビーズ、表面活性化ビーズ、混合ベッド媒体、フィルター、固定化液体抽出に用いられる2段液体、充填カラムにパッケージされたファイバー、マイクロタイタープレート、プレート、マイクロアレイ、ボトル、チューブ、キャップ、ELISAにおける隔膜及びピペットチップ、SELDI、マイクロアレイ及び液化可能な固相ゲル、並びに免疫測定固相媒体担持体からなる群からさらに選択される請求項1の方法。
- 同位体希釈質量分析試料は、種別同位体希釈質量分析試料である請求項1の方法。
- 同位体希釈質量分析試料は、種特異性同位体希釈質量分析試料である請求項1の方法。
- マイクロ波可能な溶液にマイクロ波を照射するステップは、1〜600秒の時間範囲で平衡を達成する請求項1の方法。
- 固相担持体及び試料をインキュベートするステップは、1〜600秒の時間範囲で平衡を達成する請求項1の方法。
- 被分析物は、同位体変化が自然界に起こるあらゆる要素を含む化合物又は組成物からなる群から選択される請求項1の方法。
- マイクロ波可能な溶液にマイクロ波を照射するステップは、1010〜1013ヘルツの範囲内で行われる請求項7の方法。
- マイクロ波可能な溶液にマイクロ波を照射するステップは、約2450メガヘルツで行われる請求項7の方法。
- 被分析物は、国土安全、国土防衛、環境優先毒性物質、環境鑑識種、環境保健及び工業化学物質用化合物又は組成物からなる群から選択される請求項7の方法。
- 被分析物は、水銀、tert-ブタノール、メチル-t-ブチルエーテル、エチル-t-ブチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、t-アミルメチルエーテル、モルヒネ、ジオキサン、ジクロロエタン、テトラクロロエタン、ナフタレン及びフェナントレンを含む化合物又は組成物からなる群から選択される請求項7の方法。
- 試料中の被分析物の濃度は、同位体標識された被分析物類似体に対する質量分析によって決定された被分析物全体の比に基づいて算出される請求項7の方法。
- 被分析物の濃度は、校正曲線を適用せず、種の同位体比に基づく濃度及び/又は分解調節の数学的計算を用いて直接算出される請求項7の方法。
- 固相及び/又はマイクロ波平衡は、IDMS及び/又はSIDMS質量分析を自動化するのに用いられる請求項7の方法。
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