KR101675303B1

KR101675303B1 - 마이크로 중공사막 효소 반응기-텐덤 질량분석법을 이용한 단세포군 항체 기반 온라인 인단백질 프로테오믹스 분석방법

Info

Publication number: KR101675303B1
Application number: KR1020140107564A
Authority: KR
Inventors: 강덕진; 이선영; 김숙경
Original assignee: 한국표준과학연구원
Priority date: 2014-08-19
Filing date: 2014-08-19
Publication date: 2016-11-11
Also published as: WO2016028075A1; KR20160022036A; US20170261513A1

Abstract

본 발명은 마이크로 중공사막 효소 반응기(microbore hollow fiber enzymatic reactor, mHFER) 기반 항원항체반응을 이용한 인단백체 추출법 및 질량분석 방법에 관한 것으로, 상세하게는 체내 존재하는 인단백질 또는 인펩타이드를 인세린-, 인트레오닌-, 및 인티로신-항체를 이용하여 추출하여 질량분석기로 측정함으로써, 질환의 진단을 위한 바이오마커 인단백질을 발굴하고, 이를 통하여 질환의 조기진단에 기여할 수 있는 추출방법 및 질량분석법에 관한 것이다. 본 발명의 항원항체반응 기반 추출법을 이용한 질량분석법은 낮은 추출율 및 복잡한 시료전처리를 통한 방법에서 발생하는 시간적ㅇ경제적 부담을 최소화할 수 있으며, 상당수의 인펩타이드(또는 인단백질)과 친화력이 강한 항체를 사용함으로써 추출효율을 높이며, 저농도의 인펩타이드 또는 인단백질 추출이 가능해짐에 따라 질병의 진단 단백질 마커 발굴 및 메커니즘 규명 연구에의 활용 가능성이 높을 것으로 기대된다.

Description

마이크로 중공사막 효소 반응기-텐덤 질량분석법을 이용한 단세포군 항체 기반 온라인 인단백질 프로테오믹스 분석방법{Monoclonal antibody-based phosphoproteomic method using online mHFER-tandem mass spectrometry}

본 발명은 단백질의 전사 후 수식들(post-translational modifications, PTMs)중 세린-인산기(serine-phosphate), 트레오닌-인산기(threonine-phosphate), 티로신-인산기(tyrosine-phosphate) 특이적 친화력을 갖고 있는 항체들을 이용한 mHFER 기반 온라인 인펩타이드 특이적 전처리법 개발에 관한 것이며, 상기 온라인 전처리 과정을 통해 회수된 인펩타이드들은 텐덤 질량분석기를 이용하여 생체 시료중 인산화 단백질의 정성 분석 및 단백질 내 인산화 위치까지 확인할 수 있는 분석기술에 관한 것이다.

질량분석기를 기반으로 한 단백체학(proteomics) 연구는 단백질의 구조 규명 및 정량분석에서 중요한 역할을 하고 있으며, 유전자의 기능을 이해하기 위한 수단으로써 사용되고 있다. 사람으로부터 얻을 수 있는 다양하고 복잡한 생체시료 내에 존재하는 단백질을 정성 및 정량분석 함으로써, 인간의 질병을 진단하는 목적으로 이용되고 있다. 일반적으로 단백질 PTMs은 화학적 변형으로써 단백질, 핵산, 지질 그리고 보조인자와 같은 다른 세포 분자들간의 상호작용 및 활성조절에 관여하므로, 단백체의 기능적인 측면에서 핵심적인 역할을 하고 있다. 특히, 인단백질(Phosphoprotein)은 세포간의 상호작용, 세포의 사멸과 생성 및 단백질 기능의 on/off에 영향을 준다고 알려져 있다. 또한, 대부분의 인산화는 단백질의 아미노산 배열 중 세린(serine)에 많이 분포하고 있으며, 트레오닌(threonine)과 타이로신(tyrosine)에도 인산화가 이루어진다고 알려져 있다. 인단백질은 인체 내 존재하는 다른 단백질들에 비해 상대적으로 적은 양으로 존재하며, 특히, 인산기가 가지는 음전하로 기인하여 양이온 모드(positive ion mode) 기반 전기분무 이온화-텐덤 질량분석기(electrospray ionization-tandem mass spectrometer, ESI-MS/MS)를 이용한 프로테오믹스 분석 시, 일반적인 효소 처리과정을 통해 생성된 펩타이드들에 비해 상대적으로 낮은 ESI 효율을 갖으며, 결과적으로 인펩타이드들에 대한 정성 및 정량 분석에 어려움을 갖고 있다. 상기 이유로 기존 인단백질체 또는 인펩타이드들에 대한 질량분석기 기반 정성 분석 효율을 높이기 위해 다양한 전처리방법들이 개발, 응용되고 있다. 기존 인단백질체 또는 인펩타이들에 대한 선택적 전처리법에는 hydrophilic interaction liquid chromatography(HILIC), strong anion-exchange chromatography (SAX) 및 strong cationic ion-exchange chromatography (SCX) 등을 사용하여 펩타이드들(Peptides)을 분리한 후, 금속 이온의 양전하와 인산기의 음전하 간에 화학적 결합을 이용한 immobilized metal affinity chromatography (IMAC)과 metal oxide affinity chromatography (MOAC) 등의 전처리를 거쳐 인단백질만을 추출한 후, 질량분석기에 도입한다. 면역학적 방법에 의한 분석으로는, 이차원 겔 전기영동법(2 dimensional gel electrophoresis, 2D GE), 면역탁본법(immunoblot) 및 면역침강법(immunoprecipitation, IP) 등을 사용하여 이루어지고 있다. 특히, 면역탁본법과 면역침강법은 항체(Antibody)와 항원(Antigen) 간의 결합 원리를 이용하여 겔 내에서 특정 단백질(targeted protein)을 확인할 수 있는 방법이며, 상기 방법을 사용할 경우 효과적으로 분석하고자 하는 단백질만을 추출할 수 있다는 장점이 있다. 하지만 상기 방법들에서 사용되는 탁본막(membrane) 또는 비즈(beads)의 실라놀기(silanol group)에 항체가 모두 도포되어 있는 것이 아니므로 원하지 않은 단백질이 함께 추출되어 추출재현성이 낮아지므로, 이를 방지하기 위해서는 항체가 도포되지 않은 실라놀기에 알부민을 처리하는 등 다른 전처리과정이 반드시 필요하다. 또한 상기 추출된 단백질을 질량분석기에 도입 시, 2차 전처리과정(추출 시 사용된 계면활성제의 제거 또는 단백질을 펩타이드화하는 단계)을 거쳐야 하므로 복잡한 전처리로 인한 시료손실이 발생하는 문제점이 있다.

국내등록특허공보 1298527(2013.08.14).

본 발명에서는 인펩타이드 또는 인단백질과 금속이온 간의 친화성을 이용한 방법의 낮은 추출효율과 복잡한 시료 전처리 과정을 개선할 수 있는 마이크로 중공사막 효소 반응기 기반 항원항체반응을 이용한 온라인 항체-특이적 인단백체 질량분석법을 제공하고자 하였다.

본 발명은 a) 세포에 존재하는 단백질 혼합물에 환원제를 첨가하여 변성시킨 후, 효소와 반응시켜 펩타이드 혼합물을 얻는 단계; b) a)단계의 펩타이드 혼합물을 인단백질 또는 인펩타이드 특이적 항체와 결합시키는 단계; 및 c) b)단계에서 얻은 반응물을 마이크로 중공사막 효소 반응기(mHFER)에 주입하고 효소처리하여 얻은 인펩타이드들을 추출하여 질량 스펙트럼을 얻는 단계; 를 포함하는 질량분석법에 관한 것이다.

상기 a)단계에서 사용되는 단백질 혼합물은 제한되지 않으나, 세포로부터 추출된 용출액(cell lysate)을 사용할 수 있다. 본 발명에서 상기 환원제는 제한되지 않으나 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT), 디티오에리트리톨, 트리스 2-카르복시에틸 포스핀 또는 트리부틸 포스핀 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 디티오트레이톨(DTT)을 사용하여 단백질의 변성을 진행할 수 있다.

상기 효소는 제한되지는 않으나 단백질분해효소(protease)라면 모두 사용할 수 있으며, 바람직하게는 트립신(trypsin)을 사용할 수 있다.

상기 변성 후, 단백질 내 시스테인(cysteine-cysteine) 간 이황결합(disulfide bond)의 재형성(refolding)을 막기 위하여 시스테인의 티올기(thiol group, -SH)를 요오드아세트아미드(iodoacetamide, IAA)를 첨가하여 알킬화시킴으로써 비가역적 형태로 변형시킨다. 잔류하는 IAA는 빛에 의한 변형 또는 부가적인 반응을 유도할 수 있으므로 L-시스테인을 첨가하여 제거해준다. 상기 용액을 트립신과 단백질 간의 중량비가 1:40 내지 1:60이 되도록 첨가하여 37 ℃에서 18시간 동안 온도교반기에서 반응시켜 효소처리를 할 수 있다.

상기 b)단계에서 인펩타이드 또는 인단백질 특이적 항체는 제한되지는 않지만, 분자량이 50 kDa 이상인 인세린(phosphoserine)-, 인트레오닌(phosphothreonine)- 및 인티로신(phosphotyrosine)-항체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 항체 또는 둘 이상의 항체 혼합물을 사용할 수 있다. 상기 인세리-항체는 세린-인산기(serine-phosphate)와, 인트레오닌-항체는 트레오닌-인산기(threonine -phosphate)와, 인티로신-항체는 티로신-인산기(tyrosine-phosphate)와 각각 친화성을 가지고 있다. 상기 인펩타이드 또는 인단백질과 항체의 혼합비는 제한되지는 않으나, 항체 또는 항체혼합물 100 중량부에 대하여 인단백질 또는 인단백질 혼합물은 10 내지 1000 중량부일 수 있으며, 상기 반응으로 세린-, 트레오닌- 및 티로신-인산기와 각 항체 간 결합이 형성된다.

상기 c)단계에서 사용되는 중공사막은 제한되지는 않으나, 바람직하게는 분자량 투과한계 값이 10 kDa, 내경 약 200 내지 600 μm, 외경 약 500 내지 1000μm인 중공사막이 좋으며, 그 재질은 폴리스티렌설포네이트, 폴리비닐클로라이드, 폴리아크릴나이트릴 또는 이들의 혼합물 등으로 이루어진 것이 좋다. 상기 추출은 제한되지는 않으나 4 내지 25 ℃ 범위에서 수행될 수 있으며, 본 발명의 일 실시예를 통해 상기 범위 내에서 추출시에 다수의 인펩타이드를 획득할 수 있었다. 상기 b)로부터 얻어진 항체 결합 펩타이드 혼합물을 중공사막 효소반응기(mHFER)에 주입하면, 10 kDa 이상의 크기를 가지는 항체 결합 펩타이드는 mHFER 안에 머무르게 되고, 항체와 결합하지 않은 분자량 10 kDa 미만의 펩타이드는 mHFER을 통해 빠져나와 용리되게 된다. 상기 반응은 트립신과 같은 단백질 분해효소를 주입해줌으로써 항체가 분해되면서 본 기능을 잃게 되고, 이를 통하여 항체와 결합하고 있던 펩타이드가 용리될 수 있다. 상기 펩타이드는 역상 트랩핑 컬럼(reverse trapping column)에 포집되어 소수성 정도에 따른 분리수단인 역상 C18 컬럼으로 분리 후, 전자분무이온화(electrospray ionization, ESI)를 거쳐 질량분석기로 도입되어 분석된다. 상기 c)단계의 질량분석기는 제한되지는 않지만, 예를 들면 나노유속 액체크로마토그래피(nLC, 1260 capillary LC system, Agilent Technologies, Germany)-전기분무 이온화-퓨리에 변환 오비트랩-텐덤 질량분석기(ESI-FT orbitrap-MS/MS, Q-Exactive, Thermo Scientific, Germany)를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 온라인 인펩타이드 또는 인단백질 추출법은 상대적으로 낮은 농도로 존재하는 인산화된 펩타이드 특이적 친화력을 갖는 항체를 사용함으로써 효소처리에 의해 생성된 펩타이드 혼합물에서 항체 특이적 인펩타이드들에 대한 효율적 추출과 더불어, mHFER 장치를 이용한 자동화된 시스템 구성을 통해 기존 복잡한 전처리과정에서 야기되는 문제점들을 최소화하는 장점을 가지고 있다.

또한, 상기 발명을 이용한 인단백질 추출법은 소량의 인단백질에 대한 정보획득이 가능함에 따라, 인간 질병에 따른 인단백질 관련 메카니즘 규명 연구 및 상기 연구와 관련된 바이오마커 발굴연구에 있어 통계적인 분석방법을 통하여 질병 특이적 단백질 바이오마커 개발에 큰 응용성이 있을 것으로 기대된다.

도 1은 상기 발명된 마이크로 중공사막 효소 반응기(mHFER) 기반 항원항체반응을 이용한 인단백체 추출법에 대한 모식도이다.
도 2는 세포 시료(MCF7)를 이용하여 얻어진 단백질을 효소처리한 후, 펩타이드 혼합물을 항체와 반응시켜 중공사막 효소반응기 기반 온-라인 nLC-ESI-FT orbitrap-MS/MS으로 측정한 base peak chromatogram과 질량스펙트럼이다.
도 3은 항체 결합 인펩타이드 또는 인단백질 추출 시, 10 μg 항체에 대한 단백질의 비율별 측정된 인펩타이드의 수이다.
도 4는 도 3과 같은 경우에 대해 인펩타이드 또는 인단백질과 항체 간의 반응온도에 따라 측정된 인펩타이드의 수이다.
도 5는 확립된 조건에 따라 인세린-항체, 인트레오닌-항체 및 인타이로신-항체를 인펩타이드와 각각 반응시켜 측정된 인펩타이드의 수이다.
도 6은 MCF7 세포 용해물로부터 얻어진 펩타이드 혼합물(10 μg) 중 발명된 추출법과 기존의 인단백체 추출법(FASP, IMAC, TiO₂)에 의하여 추출된 인펩타이드의 수이다.
도 7은 도 6으로부터 얻어진 결과로, 추출된 인펩타이드들 내 세린, 트레오닌 및 티로신에 존재하는 인산화 위치의 수이다.

이하 본 발명을 실시예와 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 그러나 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[시험예 1] 세포 용해물(cell lysate)에 존재하는 단백질로부터 생성된 인펩타이드의 추출

MCF7(한국세포주은행, 대한민국) 세포 (5 * 10⁶ /10 cm dish)를 포집하여 0.1 M PBS (phosphate buffered saline)에 넣고 tip sonicator를 이용하여 초음파 분쇄한 후, 10,000 rpm에서 10 분간 원심분리하였다. 상층액을 분리하여, 추출된 단백질 중 100 μg을 분취하여 50 mM 중탄산 암모늄 용액과 10 mM DTT가 첨가된 용액에 혼합한 후, 37 ℃에서 2시간동안 변성(denaturation)하였다. 상기 용액에 270 mM IAA용액을 32 μL 첨가하고 실온 암실에서 30분 동안 알킬화한 후, 400 mM의 L-시스테인을 47 μL 첨가하여 잔류 IAA를 제거한다. 그 후, 2 μg 트립신을 넣고 37 ℃에서 18시간동안 펩타이드화하였다. 상기 생성된 펩타이드들과 인세린-항체, 인트레오닌-항체 및 인티로신-항체 혼합물을 하기 표 1의 조성 및 온도 조건에서 혼합 반응시켜 항체결합 펩타이드 혼합물을 제조하였다.

[표 1]

[시험예 2] 인펩타이드 질량분석법

온-라인 중공사막 효소반응기(mHFER)에 항체 결합 펩타이드 또는 효소의 이동 및 주입을 위해 1 내지 10 μL/min 이하의 유속(flowrate)으로 조절 가능한 펌프와 온-라인으로 시료를 주입할 수 있는 시료주입기(또는 autosampler)가 중공사막의 주입구와 연결되는 구조를 가지고 있다. mHFER에 사용되는 마이크로 중공사막(mHF)은 한쪽은 에폭시(epoxy)를 사용하여 막음으로써 유로의 흐름경로가 내벽을 통해서만 이루어지도록 하며, 상기 mHF의 투과한계는 10 kDa의 것으로 약 5 μL의 부피를 갖도록 하였다.

상기 mHFER에 시험예 1에서 제조한 항체 결합 펩타이드 혼합물을 주입한 후, 0.1 M PBS를 1 내지 5 μL/min의 유속으로 30분 내지 한 시간 동안 흘려주었다. 이를 통해 혼합물 내 항체와 결합하지 않은 10 kDa 미만 크기의 펩타이드를 제거한 후, 중공사막의 배출구에 역상 트랩핑 컬럼(reverse trapping column)을 설치하였다. mHFER 내로 트립신을 주입하고 0.1 M PBS를 1 내지 5 μL/min의 유속으로 30분 내지 한 시간 동안 흘려주었다.

mHFER 내에 포집된 10 kDa 이상의 항체 결합 인펩타이드와 트립신의 반응으로 항체의 분해가 유발되어 항체와 결합하고 있던 인펩타이드들이 떨어지면서 용리된다. 상기 용리된 인펩타이드들은 mHFER의 배출구와 연결된 역상 트랩핑 컬럼에 포집되고, 직접적으로 nanoLC-ESI-FT orbitrap-MS/MS 기기의 유로에 연결이 되며, binary pump에 의한 역상 용매 기울기에 따라 C18이 충진된 컬럼을 통해 인펩타이드가 갖는 소수성 정도에 따라 용리되어 질량분석기로 도입되었다. 상기 일련의 과정을 도 1에 도식화하였고, 질량분석 결과의 예를 도 2에 도식화하였다.

실시예 1 내지 실시예 3은 단백질 또는 펩타이드와 항체 간의 중량비에 따른 추출된 인단백질 및 인펩타이드 수에 관한 내용으로, 도 3의 결과에 따라 펩타이드와 항체 간의 중량비가 1:10, 1:1 및 10:1일 때, 측정된 인펩타이드의 수는 각각 400개, 553개 및 229개로 나타났으며, 이를 통하여 중량비를 1:1로 사용하였을 때 추출된 인펩타이드 수가 가장 높게 나타나는 것을 확인하였다.

실시예 2 및 실시예 4의 조건으로 추출 효율을 측정한 결과, 도 4와 같이 반응온도가 25 ℃일 경우에 553개의 인펩타이드가 확인되었고, 4 ℃일 경우에는 296개의 인펩타이드가 확인되었다. 따라서 반응온도를 25 ℃로 하였을 때 추출된 인펩타이드의 수가 증가한 것을 확인하였다.

실시예 5 내지 실시예 7은 단백질 또는 펩타이드와 각각의 항체(인세린-항체, 인트레오닌-항체 및 인티로신-항체에 대하여 출처가 다른 항체를 2개씩 사용)를 반응시켜 비교한 결과로, 도 5에서 나타난 것과 같이 추출하기 전에 측정한 인펩타이드의 수는 272개이며, 인세린-항체 I과 II을 사용하여 측정한 인펩타이드의 수는 1,438개와 1,229개로 측정되었다. 또한 인트레오닌-항체 I과 II에서는 1,397개와 202개로 측정되었으며, 인티로신-항체 I과 II에 의하여 추출된 인펩타이드의 수는 713개와 76개인 것으로 확인되었다. 이 결과를 토대로 추출하지 않은 것에 비하여 각 항체를 사용하였을 때 측정된 인펩타이드의 수가 증가한 것을 확인하였고, 특히 인세린-펩타이드가 가장 많이 측정되었으며, 인트레오닌-펩타이드, 인티로신-펩타이드 순으로 많이 측정되는 것을 확인하였다.

[시험예 3] 인펩타이드 추출법에 따른 효율측정

MCF7 세포용해물로부터 얻어진 단백질을 효소처리한 후, 10 μg의 펩타이드 혼합물을 사용하여 기존에 보고된 인펩타이드의 추출방법[filter aided sample preparation (FASP), immobilized metal affinity chromatography (IMAC), titanium dioxide (TiO₂)]과 본 발명을 통하여 인단백질의 추출효율을 비교하였다.

FASP 추출방법

FASP는 10 μg의 펩타이드 혼합물과 항체 10 μg을 반응시켜 투과한계 10 kDa의 centrifugal filter (Millipore, Ireland)로 옮긴 후, 200 μL의 0.1 M PBS를 첨가하여 혼합한 다음 14,000 x g에서 10분간 원심분리하였다. 이 과정을 두 번 반복하여 항체와 결합하지 않은 펩타이드들을 제거하고, 0.2 μg의 트립신(항체:효소=50:1, w/w)을 넣어 37도에서 18 시간 동안 반응시켰다. 효소처리된 혼합물에 200 μL의 0.1 M PBS를 첨가하여 혼합한 후, 14,000 x g에서 10분 간 원심분리하여 항체로부터 분리된 인펩타이드를 수집하였다. 상기 과정을 1회 추가로 반복하여 인펩타이드를 수집하고, 수집된 용액은 진공농축기를 이용하여 농축시킨 후 질량분석기에 도입하여 측정하였다.

IMAC 추출방법

IMAC을 이용한 인펩타이드의 추출을 위하여, Ni-NTA spin column (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하였다. 상기 Ni-NTA beads는 한 쪽 끝이 3 mm의 다공성유리 재질의 sol-gel frits으로 막힌 capillary (내경 200 um, 길이 100 mm)에 충진하여 사용하였다. 시린지 펌프, 시료주입기 및 Ni-NTA beads가 충진된 capillary 순으로 연결하고, 1 내지 5 μL/min의 유속으로 용매를 흘려주어 시료가 도입될 수 있도록 장치하였다. 0.1 M NaCl용액에 녹인 50 mM EDTA 용액 100 μL를 흘려주어 Ni-NTA beads에 존재하는 Ni²⁺ 이온을 제거하고, 100 μL의 0.2 M FeCl₃ 용액을 흘려주어 NTA beads에 Fe³⁺를 첨가하여 활성화하였다. 시료 주입 전, 상기 capillary에 loading buffer (6 % 아세트산을 함유한 0.1 M NaOH 용액, pH 3.6)을 30분간 흘려주어 NTA beads를 평형화하였다. 시료주입기를 통하여 10 μg의 펩타이드 혼합물을 주입한 후, loading buffer로 20분 간 흘려줌으로써 Fe-NTA beads에 인단백질 또는 인펩타이드들이 킬레이트화할 수 있도록 하였다. 킬레이트화하지 않은 펩타이드들을 제거하기 위해서 상기 capillary에 wasing buffer (loading buffer/acetontrile, 75/25, v/v)를 흘려주어 상기 capillary에서 킬레이트화하지 않은 펩타이드들을 제거하였다. 킬레이트화된 인단백질을 용출하기 전, 100 μL의 로딩 버퍼(loading buffer)를 흘려주어 평형화시켜주고, pH 11의 4 % NH₄OH 용액을 흘려주어 킬레이트화된 펩타이드들을 용출시켜 수집하였다. 상기 수집된 용액은 진공농축기를 이용하여 건조한 후, 0.1% 포름산(formic acid) 용액에 재용해시킨 후 질량분석기에 도입하여 측정하였다.

TiO ₂ 추출방법

TiO₂를 이용한 인펩타이드 추출을 위하여, TiO₂ beads가 충진된 고체상추출(solid phase extration, SPE) 카트리지(GL Science, Japan, 50mg/3mL)를 이용하였다. 상기 카트리지는 원심분리기를 이용할 수 있도록 15 mL 튜브 속에 위치시켰다. 건조된 SPE 카트리지를 활성화하기 위하여 0.5% triflouroacetic acid를 함유한 buffer A (acetonitrile/water=80/20, v/v) 200 μL를 넣고, 200 x g에서 2분간 원심분리한 후, buffer B (lactic acid/buffer A=300mg/mL, w/v) 200 μL를 넣고 200 x g에서 2분간 원심분리하여 평형화하고, 튜브에 수집된 용액은 버렸다. 10 μg의 펩타이드 혼합물을 TiO₂ 카트리지에 넣고 시료 500 μL 당 1000 μL의 buffer B를 카트리지 안에서 혼합한 후, 200 x g에서 5분간 원심분리하였다. 튜브에 수집된 용액을 다시 TiO₂카트리지 안에 넣고 동일조건으로 원심분리하며, 상기 과정을 10회 반복하여 TiO₂ beads에 더 많은 인펩타이드들이 킬레이트화 되도록 하였다. TiO₂카트리지에 인펩타이드 외 다른 펩타이드들을 제거하기 위하여, 200 μL의 buffer B를 이용하여 200 x g에서 2분간 원심분리하고, 200 μL의 buffer A로 200 x g에서 2분간 원심분리하여 세척하였다. 인펩타이드들을 용출시키기 위하여 TiO₂카트리지를 새로운 15 mL 튜브로 옮기고, 5 % 암모늄(ammonium) 수용액 200 μL를 사용하여 200 x g에서 5분간 원심분리하고, 200 μL의 5 % pyrrolidine 수용액을 사용하여 동일조건에서 원심분리하여 인펩타이드를 용리한 후, 수집된 두 용액을 혼합하여 진공농축기로 건조시켰다. 상기 건조된 시료는 0.1% formic acid에 재용해시켜 질량분석기에 도입하여 측정하였다.

기존 3가지 추출방법과 mHFER를 이용한 방법의 비교 결과

도 6은 상기 언급된 3가지의 추출방법과 본 발명을 통하여 추출된 인펩타이드의 수를 나타낸 것으로, 동일한 10 μg의 펩타이드들을 사용하여 실험을 진행하였을 때, 항체혼합물(phospho-specific antibodies, pAbs)을 이용한 방법은 773개, FASP는 149개, IMAC은 18개, TiO₂는 2개의 인펩타이드를 각각 추출한 것으로 나타났으며, 기존 추출방법인 FASP를 사용할 때보다 항체혼합물을 사용할 때 놀랍게도 5배 이상의 인펩타이드들을 추출하는 것을 확인할 수 있었다.

도 7은 도 6의 실험을 통하여 인펩타이드 내 세린, 트레오닌 및 티로신 위치에 존재하는 인산화의 수를 나타낸 것이다. 항체혼합물을 이용한 방법은 인펩타이드 내 1,585개, FASP는 189개, IMAC은 24개, TiO₂는 2개의 인산화 위치를 나타내었다. 상기 결과로부터 기존 방법인 FASP에 비해 항체혼합물을 이용한 추출방법이 놀랍게도 8배 이상 더 많은 인산화위치를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 6의 인펩타이드수와 도 7의 인산화 수를 비교해보면 본발명의 항체혼합물 추출방법을 사용하였을 때 단일인펩타이드들 뿐만 아니라 종래에 확인할 수 없었던 이중 및 삼중인펩타이드를 포함하는 다중인펩타이드까지 추출할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

Claims

a) 세포에 존재하는 단백질 혼합물에 환원제를 첨가하여 변성시킨 후, 효소와 반응시켜 펩타이드 혼합물을 얻는 단계;
b) a)단계의 펩타이드 혼합물을 인단백질 또는 인펩타이드 특이적 항체로서 인세린(phosphoserine)-항체, 인트레오닌(phosphothreonine)-항체 및 인티로신(phosphotyrosine)-항체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 항체 또는 둘 이상의 항체 혼합물과 결합시키는 단계; 및
c) b)단계에서 얻은 반응물을 마이크로 중공사막 효소 반응기(mHFER)에 주입하고 효소처리하여 얻은 인펩타이드들을 추출하여 질량 스펙트럼을 얻는 단계; 를 포함하는 질량분석법.
제 1항에 있어서,
상기 환원제는 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT), 디티오에리트리톨, 트리스 2-카르복시에틸 포스핀 또는 트리부틸 포스핀인 것을 특징으로 하는 질량분석법.
제 1항에 있어서,
상기 효소는 단백질 분해효소(protease)인 것을 특징으로 하는 질량분석법.
제 3항에 있어서,
상기 단백질 분해효소는 트립신(trypsin)인 것을 특징으로 하는 질량분석법.
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제 1항에 있어서,
상기 항체 또는 항체 혼합물 100 중량부에 대하여 인단백질 또는 인단백질 혼합물은 10 내지 1000 중량부인 것을 특징으로 하는 질량분석법.
제 1항에 있어서,
상기 추출은 4 내지 25 ℃ 범위에서 수행되는 것을 특징으로 하는 질량분석법.