KR20040054609A - 유전자 발현 프로파일을 단백질 발현 프로파일과연관시키는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포에 있는 유전자 발현 프로파일을 단백질 발현 프로파일과 연관시키는 방법에 관한 것이다.

Description

유전자 발현 프로파일을 단백질 발현 프로파일과 연관시키는 방법{Method for correlating gene expression profiles with protein expression profiles}

유전체학(Genomics)은 종(species)의 유전자 집합체(genome)에 대한 학문일 뿐만 아니라, 시간적, 발생학적 및 다양한 환경 조건에 있는 다른 세포 및 동일한 세포에서의 상기 유전자의 기능 및 활성에 대한 학문이다. 다양한 유전자의 기능 및 활성은 체내에서 특성화된 활성을 가지게 하기 위한 세포의 발생 및 건강한 상태에서 병적인 상태로 세포를 전환시키는데 중요한 역할을 한다.

세포에서 유전자 정보의 발현은 매개분자인 mRNA의 전사를 통해 수행된다. 세포는 발현된 mRNA를 폴리펩타이드 또는 단백질로 번역한다. 단백질은 유전자에 의해 코딩되는 기능의 대부분을 수행한다. 한 종의 단백질들의 집합적인 세트(프로테옴)(proteom) 및 세포에 있는 이러한 단백질들의 기능 및 활성에 관한 연구는 "프로테오믹스(proteomics)"라고 일컫어지는 새로운 생물학 분야의 대상이다.

세포의 특성은 세포에 의해 발현되는 유전자에 의존하기 때문에, 유전자 발현 프로파일은 유전체학에서 중요한 방법이 되었다. 유전자 발현 프로파일은 어떤 유전자가 세포에서 발현되는가와 이의 발현 수준을 결정하는 것을 추구한다. 따라서, 세포의 유전자 발현 프로파일은 세포의 특징인 "지문(fingerprint)"을 제공하며, 세포의 본성(identity)과 활성을 모두 나타낸다. 다른 세포의 유전자 발현 프로파일을 비교하는 것은 "차별적인 유전자 발현"이라고 일컫어지는 과정이다. 이러한 방법은 세포의 차별적인 표현형을 나타내는데 필요한 유전자에 대한 정보를 제공해 준다. 건강한 및 병적(pathologic) 세포에서 다르게 발현되는 유전자는 진단 마커로서의 기능을 할 수 있고, 치료적 목적을 위한 후보 타겟(target)이 된다. 따라서, 다른 세포 유형에서의 유전자 발현의 정확한 프로파일을 획득하는 것이 중요한 목표이다.

현재 세포의 유전자 발현 프로파일을 유발하기 위해 사용되는 다양한 방법들이 있다. 이러한 방법들로는 노던 블랏, RT-PCR, 뉴클레아제 방어, 차별적인 발현(differential display), cDNA 지문 및 상쇄 혼성화와 같은 전통적인 방법 뿐만 아니라, 발현된 서열 태그(expressed sequence tag, EST) 라이브러리 및 cDNA 어레이, mRNA 어레이, 올리고뉴클레오타이드 어레이(arrary) 및 유전자 발현의 순차적 분석(SAGE)의 제조와 같은 신기술을 포함한다(Lockhar ＆ Winzeler,Nature, 405:827-836(2000); Velculescuet al.,Science, 270:484-487(1995)).

한 실시예에서, 올리고뉴클레오타이드 어레이와 같은 핵산 어레이가 발현 프로파일을 위하여 사용되었다. 이러한 어레이는 미리결정되고,주소화된(addressable) 위치에서 고체 지지대에 결합된 특별히 선택된 올리고뉴클레오타이드들의 집합이다. 어떤 실시예에서, 이러한 어레이는 게놈에서 공지된 각각의 유전자와 특별히 상동성이 있는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 세포로부터 유래되는 mRNA 또는 cDNA는 어레이에 적용된다. mRNA 또는 cDNA 각각은 전사된 특정 유전자에 대응하는 올리고뉴클레오타이드로 혼성화한다. 각각의 고정된 올리고뉴클레오타이드의 상동성 및 위치는 미리 결정되기 때문에, 특정 유전자가 세포에 의해 발현되는 것은 각각의 혼성화 반응을 통해 나타낼 수 있다. 상업화되어 사용되고 있는 올리고뉴클레오타이드 어레이중의 하나는 애피메트릭스사(Affymetrix)의 유전자칩^TM(GeneChip^TM)이다. 그러나, 상업화되어 있는 어레이 방법학 중 다른 하나의 실시예에서는 어레이로 코팅된 비드(bead) 또는 세포는 각각이 광학 센서 분자에 결합하였다. 주소(address)를 제공하기 위해, 비드는 웰로 전달되며, 섬유 렌즈 번들(fiber optic bundle)에 있는 섬유의 말단에 위치하게 한다(예, Bead Array^TM(Illumina) 참조). 다른 실시예에서, 어레이는 EST 라이브러리로부터 제조될 수 있다. EST 라이브러리는 세포에서 발현된 mRNA의 세트를 역전사함으로써 제조될 수 있다. 종종, 전체 mRNA가 역전사되지 않을 수도 있지만, 이의 충분한 부분은 mRNA가 발현되는 것으로부터 유전자를 단독으로 동정할 수 있다. EST는 게놈 데이터베이스에서 서열분석되고, 동정된다.

현재 존재하는 유전자 발현 기술의 힘에도 불구하고, mRNA 전사의 수준은 항상 단백질의 발현 수준과 직접적으로 관련되는 것은 아니었으며, 이는 하기의 여러가지 이유에 의한 것이었다: (1) 다른 mRNA는 다른 효율로 폴리펩타이드로 번역될 수 있다; (2) mRNA는 다른 세포에서 다른 단백질을 생산하기 위해 차별적으로 접합(splice)될 수 있다; (3) 발현된 폴리펩타이드는 다른 속도로 분해될 수 있다; 및 (4) 폴리펩타이드는 후-전사적 번역을 하기 위한 대상이 될 수 있기 때문에, 유사한 폴리펩타이드는 유사한 세포 및 다른 세포에서 다른 형태 또는 기능을 하는 것으로 볼 수 있다. 따라서, mRNA 발현을 단백질 발현과 연관시킬 필요가 있다(Hancocket al.,Anal. Chem. News ＆ Features, November 1, 1999, page 742A-748A; Melsonet al.,Electrophoresis, 21:1823-1831(2000)).

동시에, 질량 분광법, 2D 젤 전기영동 및 크로마토그래피와 같은 최근의 단백질 발현 프로파일 방법은 민감도(sensitivity)과 해상도(resolution)에 있어서 한계가 있다는 어려움이 있을 것이다(Pandey ＆Mann, Nature, 405:837-846(2000)). 따라서, 본 발명은 특정 세포 형태에 있는 흥미있는 단백질을 훨씬 더 빨리 그리고 정확히 동정하기 위해 유전자 발현 프로파일과 단백질 프로파일을 결합시키는 것을 목표로 한다. 유전자 발현 프로파일은 세포에서 발현된 전사체 또는 후보 전사체를 선별하기 위해 사용된다. 일반적으로 전사체는 서열분석되며, 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 추론하는데 사용된다. 그리고 나서 아미노산 서열은 전사에 의해 코딩된 단백질의 생리-화학적 특성, 예를 들어 분자량, 등전점, 소수성, 친수성, 글리코실레이션, 인산화, 에피토프 서열, 리간드 결합 서열, 특정 pH에서의 전하 또는 금속 킬레이트 결합을 예측하고 동정하는데 사용된다. 그리고 나서 생리-화학적 특성은 단백질 프로파일의 민감도와 해상도를 증가시키기 위해 이용되며, 이를 통해 특정 세포 형태에서 발현된 mRNA에 의해 코딩된 단백질의 정보를 향상시킬 수 있도록 제공된다. 본 발명은 이러한 관계를 만들기 위한 방법 및 다른 이점을 제공한다.

본 발명은 유전자 발현 프로파일을 단백질 발현 프로파일과 연관시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 유전자 발현을 단백질 발현과 연관시키기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 샘플에서 유전자 발현 프로파일을 수행하는 것, 추후의 연구를 위해 하나 또는 그이상의 발현된 유전자를 선택하는 것, 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 생리-화학적 특성을 결정하는 것 및 샘플의 단백질 발현 프로파일에서 생리-화학적 특성을 동정 수단으로 사용함으로써 샘플에서 단백질이 발현되는지 여부를 동정하는 것에 관한 것이다. 예를 들어, 어떤 실시예에서, 선택된 유전자는 두가지 세포 또는 흥미로운 샘플, 예를 들어 건강한 세포 및 병적 세포에서, 또는 다른 세포 주기, 성숙기 또는 다양화된 과정 또는 다른 환경 상태에 있는 두 개의 세포에서 다르게 발현된다. 바람직한 실시예에서, 단백질은 질량 분광기를 사용하여 분획되었다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 단백질은 SELDI(surface enhanced laser desorption ionization)를 사용하여 분획되었다.

따라서, 본 발명의 방법은 신약 개발 및 진단 마커를 동정하기 위한 표적 단백질을 동정하는데 유용하게 사용된다. 진단 마커의 동정은 예를 들어 전립선암, 유방암, 폐암, 방광암, 자궁암, 결장암, 뇌암 및 신장암과 같은 암; 암 전이; 소아 및 성인 당뇨병; 류마티스 관절염 및 다발성 경화증과 같은 자가면역 질환; 심근경색, 동맥경화 및 심근증과 같은 심장 질환; 뇌졸중과 같은 뇌혈관 질환; 안 질환; 폐기종과 같은 폐 질환; HIV, HCV, CMV, HPV, HBV와 같은 바이러스 감염; M.튜베르쿨로시스(M. tuberculosis), 독성 대장균, 스트렙토코커스 종(Sterptococcus sp.), 스타필로코커스 종(Staphylococcus sp.)과 같은 박테리아 감염; 곰팡이 감염; 말라리아, 주혈흡충병(schistosomiasis)과 같은 원생동물의 감염; 샤가스병(chagas disease)과 같은 질병 상태를 위한 것이다. 또한, 본 발명의 방법은 약리유전학적 적용을 위해 사용되는 다른 대립 유전자의 발현 산물을 동정하는데 유용하게 사용된다. 또한, 본 발명의 방법은 독성학 연구 및 방사능 조사, 예를 들어 UV 조사, 고온 및 저온과 같은 다양한 환경 조건에 세포가 노출되었을때의 영향을 동정하는데 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

도입

본 발명은 RNA 발현 프로파일과 단백질 발현 프로파일을 결합시키는 방법을 제공하며, 이는 다른 조건, 예를 들어 세포주기에 있는 다른 시간 아래, 다양한 환경 조건아래(이온 유입 또는 유출; 톡신에 노출; 약물; 리간드; 예로 호르몬, 사이토카인 또는 키모카인; 또는 바이러스, 박테리아, 원생동물 또는 곰팡이와 같은 병원균), 암과 같은 다양한 병적 조건 아래, 성숙 및 분화 동안의 다른 시간에서, 염증과 같은 반응 동안 생물체의 발생 동안의 다른 시간에서, 다른 조직 형태 또는 기관에서, 암 또는 자가면역 질환과 같은 다른 병적인 상태에서, 다른 표현형적 체질을 가진 개인 사이에서, 그 예로 특정 약학적 제제에 대해 반응하는 사람과 반응하지 않는 사람 사이에서, 세포에서 발현되는 유전자와 단백질을 동정하기 위해 제공한다. 본 발명의 방법은 예를 들어 당해 기술의 종사자가 세포 또는 생물학적 샘플에서 발현되는 후보 유전자의 리스트를 확인할 수 있게 하고, 더 나아가 본 발명의 방법을 사용하면 흥미있는 유전자에 의해 코딩되는 흥미있는 단백질의 부분집합을 확인할 수 있게 한다. 또한, 본 발명의 방법은 mRNA 발현에 관계된 정보를 mRNA에 의해 코딩되는 단백질의 발현과 기능에 결합시키는데 유용하다.

따라서, 본 발명은 하기 단계를 포함하여 세포에 있는 유전자와 단백질의 발현을 연관시키는 방법을 제공한다: 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 샘플의 유전자 발현 프로파일을 제작함으로써, 샘플에서 발현되는 하나 이상의 mRNA를 동정하는 단계; RNA에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 하나 이상의 생리-화학적 특성을 동정하고 예측하는 단계; 및 샘플에 있는 폴리펩타이드를 분획화함으로써 mRNA에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 하나 이상의 생리-화학적 특성을 동정하여 샘플에 있는 유전자 발현 및 단백질 발현을 연관시키는 단계, 폴리펩타이드는 샘플에 있는 생리-화학적 특성을 포함한다.

한 실시예에서, 유전자 발현 프로파일을 제작하는 단계는 EST 어레이, mRNA 어레이 또는 올리고뉴클레오타이드 어레이를 사용하여 발현된 mRNA를 동정하는 것을 포함한다.

다른 실시예에서, 폴리펩타이드를 동정하는 단계는 2-D 전기영동, 크로마토그래피, 질량 분광법 또는 SELDI를 사용하여 샘플에 있는 폴리펩타이드를 분획화하는 것을 포함한다.

다른 실시예에서, 물리화학적 특성은 아미노산 서열, 분자량, 등전점, 소수성, 친수성, 전하(예, 등전점), 글리코실레이션, 인산화, 에피토프 서열 또는 항체 결합, 리간드 결합, 염료 결합 및 금속 킬레이트 결합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시예에서, 물리화학적 특성을 확인하는 단계는 선택된 단백질 분해 제제에 의해 코딩된 폴리펩타이드를 분해시킴으로써 코딩된 폴리펩타이드에 의해 제조된 단백질 분해된 절편의 질량을 예측하는 것을 포함하며, 폴리펩타이드를 동정하는 단계는 제제에 의해 분해되게 하기 위해 샘플에 있는 폴리펩타이드를 주입하고, 예측된 절편의 질량에 상응하는 질량을 가지는 샘플에 있는 실제 단백질 분해된 절편을 동정하는 것을 포함한다.

다른 실시예에서, 샘플은 인간 세포를 포함한다. 다른 실시예에서, 샘플은 정상 또는 건강한 세포로부터의 세포 분해물(lysate)을 포함한다. 다른 실시예에서, 샘플은 병적 세포로부터의 세포 분해물 포함한다. 다른 실시예에서, 샘플은 독성 화합물에 접촉한 세포로부터의 세포 분해물을 포함한다. 다른 실시예에서, 생물학적 샘플은 약물 처리에 대해 반응 또는 반응하지 않는 대상의 세포로부터의 세포 분해물을 포함한다.

한 실시예에서, 샘플은 인간으로부터의 조직이다. 다른 실시예에서, mRNA는 두 개의 생물학적 샘플에서 다르게 발현되었다. 다른 실시예에서, 두 개의 생물학적 샘플은 정상 또는 건강한 세포 및 병적 세포, 예로 암 세포이다. 다른 실시예에서, 두 개의 생물학적 샘플은 건강한 세포 및 독성 화합물에 노출된 세포로부터유래된다.

다른 실시예에서, 샘플은 부검; 배양된 세포, 예로 형질전환된 세포, 세포주, 체외 이식 또는 일차 세포로부터의 세포; 혈액, 혈청, 객담, 변통 또는 소변을 포함한다.

본 발명의 바람직한 방면에서, 방법은 하기 단계를 포함한다: 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 핵산 어레이를 사용하여 세포의 유전자 발현 프로파일을 제작함으로써, 세포에서 발현되는 하나 이상의 mRNA를 동정하는 단계; RNA에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 하나 이상의 생리-화학적 특성을 확인하고 예측하는 단계; 및 질량 분광법을 사용하여 샘플에 있는 폴리펩타이드를 분획화함으로써 생리-화학적 특성을 포함하는 폴리펩타이드를 동정하는 단계; 이에 의해 세포에 있는 유전자 발현과 단백질 발현을 연관시킨다.

본 발명의 바람직한 방면에서, 방법은 하기 단계를 포함한다: 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 올리고뉴클레오타이드 어레이를 사용하여 세포의 유전자 발현 프로파일을 제작함으로써, 세포에서 발현되는 하나 이상의 mRNA를 동정하는 단계; mRNA에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 하나 이상의 생리-화학적 특성을 확인하고 예측하는 단계; 및 SELDI를 사용하여 샘플에 있는 폴리펩타이드를 분획화함으로써 생리-화학적 특성을 포함하는 폴리펩타이드를 동정하는 단계, 상기 SELDI는 기체상 이온 분광법에 의해 고체상으로부터 잔존하는 단백질을 분획화한 뒤에 고체상-결합된 흡착제에 친화적으로 보존시킴으로써 분획화하는 것을 포함; 이에 의해 세포에 있는 유전자 발현과 단백질 발현을 연관시킨다.

한 실시예에서, 본 발명의 방법은 샘플에 있는 mRNA 또는 단백질 발현을 동정하기 위해 하나 이상의 기술을 사용하는 것을 포함한다.

한 실시예에서, 게노믹 어레이는 하우스키핑 유전자의 발현을 다른 조직 특이적 유전자와 비교한다. 한 실시예에서, 게노믹 어레이는 유전자 발현의 다른 수준을 비교한다. 한 실시예에서, 게노믹 어레이는 유전자 발현의 유사 수준을 비교한다.

정의

정의된 다른 것을 제외하고 본원에서 사용된 모든 기술적, 과학적 단어는 본 발명이 속한 분야의 당업자에 의해 공통적으로 이해될 수 있는 의미를 가지고 있다. 하기의 참고문헌은 본 발명에서 사용된 많은 단어의 일반적인 정의를 포함한다; Singletonet al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed. 1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed;, 1998);The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Riegeret al.(eds.), Springer Verlag(1991); and Hale ＆ Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991). 본원에서 사용된 하기의 단어는 다르게 특정되지 않는한 상기의 의미를 가진다.

"생물학적 샘플(biological sample)"은 바이러스, 세포, 조직, 기관 또는 생물(진핵 또는 단핵), 세포, 조직 또는 조직의 분해물 또는 균질물을 포함하는 생물 또는 혈액, 소변, 객담 또는 뇌척수액과 같은 체액 샘플로부터 유래된 샘플을 일컫으며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 샘플은 인간으로부터 분리된 조직, 또는 체외이식, 상기에서 유래된 일차 및 형질전환된 세포 배양을 포함하며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 생물학적 샘플은 조직학적 목적을 위해 냉동 절단이 수행되는 것과 같은 조직의 절단을 포함할 것이다. 생물학적 샘플은 곰팡이, 식물, 곤충, 원생동물, 조류, 어류, 파충류와 같은 진행 생물로부터 수득할 수 있으며, 바람직하게는 쥐, 생쥐, 소, 개, 기니아 피그 또는 토끼와 같은 포유 동물로부터 수득하는 것이며, 가장 바람직하게는 침팬지 또는 인간과 같은 영장류로부터 수득하는 것이다.

"생폴리머(biopolymer)"는 생물학적 기원의 폴리머를 일컫으며, 그 예로 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 폴리사카라이드 또는 폴리글리세라이드(예, 디글리세라이드 또는 트리글리세라이드)이다.

"폴리펩타이드(polypeptide)"는 아미노산 잔기로 구성된 폴리머를 일컫으며, 아미노산 잔기는 자연적으로 형성되는 구조적 변이 및 합성적인 비-자연적으로 형성되어 펩타이드 결합으로 연결된 이의 아날로그와 관계하고, 자연적으로 형성되는 구조적 변이 및 합성적인 비-자연적으로 형성되는 이의 아날로그와 관계한다. 예를 들어, 합성 폴리펩타이드는 자동화된 폴리펩타이드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 일반적으로 "단백질"이라는 단어는 긴 폴리펩타이드를 일컫는다. 일반적으로, "펩타이드"라는 단어는 짧은 폴리펩타이드를 일컫는다.

"폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)" 또는 "핵산(nucleic acid)"은 뉴클레오타이드 단위로 구성된 폴리머를 일컫는다. 폴리뉴클레오타이드는 디옥시리보뉴클레익산(deoxyribonucleic acid, "DNA") 및 리보뉴클레익산(ribonucleic acid, "RNA") 뿐만 아니라 핵산 아날로그와 같이 자연적으로 형성되는 핵산을 포함한다. 핵산 아날로그는 비-자연적으로 유발된 염기, 자연적으로 형성되는 포스포디에스터 결합이 아닌 다른 뉴클레오타이드로 연결되는 뉴클레오타이드를 포함하거나 포스포디에스터 결합이 아닌 다른 연결을 통해 결합된 염기를 포함한다.

따라서, 뉴클레오타이드 아날로그는 예를 들어 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 포스포로디티오에이트(phosphorodithioate), 포스포로트리에스터(phosphorotriester), 포스포라미데이트(phosphoramidate), 보라노포스페이트(boranophosphate), 메틸포스포네이트(methylphosphonate), 키랄-메틸 포스포네이트(chiral-methyl phosphonate), 2-O-메틸리보뉴클레오타이드(methyl ribonucleotide), 펩타이드-핵산(PNA) 및 이의 유사체를 포함하며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 이러한 폴리뉴클레오타이드는 자동화된 DNA 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 일반적으로 "핵산"이라는 말은 긴 폴리뉴클레오타이드를 일컫는다. 일반적으로 "올리고뉴클레오타이드"라는 말은 짧은 폴리뉴클레오타이드, 일반적으로 50 뉴클레오타이드보다 크지 않은 것을 일컫는다. 뉴클레오타이드 서열이 DNA 서열(즉, A, T, G, C), 또한 RNA 서열(즉, A, U, G, C), 여기에서 "U"는 "T"를 대체한 서열에 의해 표현될때에 이해될 수 있다.

"검출가능한 모이어티(detectable moiety)" 또는 "표지(label)"는 분광, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 화합물을 일컫는다. 예를 들어, 유용한 표지는³²P,³⁵S, 형광 염료, 전기-농축 제제, 효소(예, ELISA에서 공통적으로 사용), 바이오틴-스트렙트아바딘(biotin-streptavadin), 디옥시게닌(dioxigenin), 합텐(hapten) 및 항혈청 또는 단일클론 항체와 같은 이용 가능한 단백질 또는 상보적인 서열을 가진 핵산 분자를 포함한다. 검출가능한 모이어티는 종종 동위원소 활성, 유색 또는 형광 신호와 같은 측정가능한 신호를 만들어내기 때문에 새믈에 있는 검출가능한 모이어티에 결합한 양을 정량하는데 사용된다. 검출가능한 모이어티는 공유결합 또는 반데르 발스력 또는 수소 결합과 같은 이온 결합을 통해 프라이머 또는 프로브에 결합하는데, 그 예로, 방사능 활성의 뉴클레오타이드 또는 스트렙트아바딘에 의해 인식될 수 있는 바이오티닐화된 뉴클레오타이드의 결합이 있다. 검출가능한 모이어티는 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능할 것이다. 간접적 검출은 이차 간접적인 검출가능한 모이어티 또는 간접적 검출가능한 모이어티가 검출가능한 모이어티에 결합하는데 관여할 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 모이어티는 스트렙트아바딘에 대한 결합 파트너인 바이오틴 또는 상보적 서열에 대한 결합 파트너인 뉴클레오타이드 서열과 같은 결합 파트너의 리간드가 될 수 있으며, 이는 특이적으로 혼성화될 수 있다. 결합 파트너 단독으로 직접적인 검출이 가능하며, 그 예로 항체 자체가 형광 분자로 표지될 수 있다. 또한, 결합 파트너는 간접적으로 검출가능하며, 그 예로 상보적 뉴클레오타이드 서열을 가진 핵산은 분지된 DNA 분자의 일부분이 될 수 있기 때문에, 이는 다른 표지된 핵산 분자로 혼성화를 함으로써 검출가능하다(Fahrlander ＆ Klausner,Biotechnology, 6:1165(1998)). 신호의 정량은 신틸레이션 계수기(scintillation counting), 농도 계측기(densitometry) 또는 유세포 계수기(flow cytometry)를 통해 수행할 수 있다.

"분리된(isolated)", "정제된(purified)", 또는 "생물학적으로 순수한(biologically pure)"이라는 말은 자연 상태에 존재하는 물질이 실질적으로 또는 필수적으로 존재하지 않는 상태의 물질을 일컫는다. 일반적으로 순도 및 균질도는 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 또는 고압 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography)와 같은 분석적 화학 기술을 사용하여 측정 가능하다. 준비하는 과정에서는 우수한 종류(species)의 단백질 또는 핵산이 실제적으로 정제된다. 구체적으로, 분리된 핵산은 플랭킹 유전자인 개방 판독틀(open reading frame)로부터 분리되며, 유전자에 의해 코딩되는 단백질보다는 다른 단백질을 코딩한다. "정제된"이라는 말은 핵산 또는 단백질이 전기 영동 상에서 필수적으로 하나의 밴드로 나타나는 것을 말한다. 구체적으로, 이는 핵산 또는 단백질이 최소한 85% 순수한 것을 의미하고, 최소한 95% 순수한 것이 더욱 바람직하며, 최소한 99% 순수한 것이 가장 바람직하다.

"정제하다(purify)" 또는 "정제(purification)"는 정제되어야 하는 조성물로부터 최소한 하나의 불순물을 제거하는 것을 의미한다. 정제는 정제된 화합물이 완전히 100% 순수한 것을 필요로 하는 것은 아니다.

기준이 되는 것, 예를 들어 세포, 또는 핵산, 단백질, 또는 벡터와 함께 사용된 "재조합(recombinant)"이라는 말은 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종의핵산 또는 단백질의 도입 또는 자연 상태의 핵산 또는 단백질의 선택에 의해 변형되거나 또는 매우 변형된 세포로부터 세포가 유래하는 것을 나타낸다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 자연적(재조합되지 않은)인 형태에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나 또는 발현되거나 완전히 발현되지 않은 상태에서 비정상적으로 다르게 발현된 자연상태의 유전자를 발현한다.

"재조합 폴리뉴클레오타이드(recombinant polynucleotide)"는 자연 상태에서는 서로 결합되지 않는 서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드를 일컫는다. 증폭되거나 조합된 재조합 폴리뉴클레오타이드는 적당한 벡터에 포함될 수 있으며, 이러한 벡터는 적당한 숙주 세포에 형질전환하기 위해 사용될 수 있다. 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포는 "재조합 숙주 세포"로 불린다. 그리고 나서, 유전자가 재조합 숙주 세포에서 발현되면 세포가 "재조합 폴리펩타이드"를 생산하게 한다. 재조합 폴리뉴클레오타이드는 비-코딩 작용(예, 프로모터, 복제의 기원, 리보좀-결합 부위, 등등)을 제공할 것이다. 적당한 단일세포의 숙주는 진핵세포 또는 포유동물의 폴리뉴클레오타이드를 발현하는데 사용되는 어느 것이든 포함하며, 예를 들어 E.coli와 같은 단핵세포 및 진핵세포를 포함하고, 곤충 세포(예, Sf9) 및 CHO, R1.1, B-W, l-M, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(예, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10)와 같은 동물 세포 및 배양된 인간 세포를 포함한다.

핵산의 일부분에 대한 참조로 사용될 때에 "이종(heterologous)"이라는 말은 자연 상태에서 서로간에 비슷한 관계가 발견되지 않는 둘 또는 그 이상의 계속적인 것을 포함하는 핵산을 나타낸다. 예를 들면, 일반적으로 핵산은 재조합적으로 생산되고, 관련없는 유전자로부터 두 개 또는 그 이상의 서열을 가지고 있으며, 이를 배열하여 새로운 기능의 핵산을 만들게 하는데, 그 예로 하나의 원천으로부터의 프로모터와 다른 원천으로부터의 코딩 부위가 있다. 유사하게, 이종 단백질은 단백질이 둘 또는 그 이상의 부분 서열을 포함하여 자연에 존재하는 서로간에 비슷한 관계가 발견되지 않는 것을 나타낸다(예, 융합 단백질).

"~에 선택적으로(또는 특이적으로) 혼성화하다"라는 문장은 분자 잔독으로 복합 혼합물(예, 전체 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 라이브러리 RNA)에 서열이 존재할 때, 엄격한 혼성화 조건 아래 특정 뉴클레오타이드 서열에 결합하고, 이중화(duplexing) 또는 혼성화하는 것을 일컫는다.

"엄격한 혼성화 조건(stringent hybridization condition)"은 프로브가 이의 표적 일부 서열, 일반적으로 핵산의 복합적 혼합물에 혼성화하지만 다른 서열에는 혼성화하지 않는 상태에 있는 것을 일컫는다. 엄격한 조건은 서열-의존적이며, 다른 환경(circumstance)에서는 다를 것이다. 긴 서열은 높은 온도에서 특이적으로 혼성화한다. 핵산의 혼성화에 대한 폭넓은 가이드는 Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecylar Biology--Hybridization with Nucleic Probes에 있는 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assay"(1993)에서 찾아볼 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 확인된 이온성 강도 pH에서는 특정 서열을 위한 녹는점 온도(Tm)보다 5-10℃ 정도 더 낮은 것으로 선택된다. Tm은 표적에 대해 상보적인 프로브의 50%가 표적 서열에 혼성화하여 평형 상태(표적 서열이 과량 존재할때의 Tm은 50%의 프로브가 평형 상태에 있다)에있게 하는 온도(정의된 이온성 강도, pH 및 핵산의 농도에서)를 말한다. 엄격한 조건은 염의 농도가 약 1.0 M 소듐 이온 농도보다 낮고, 일반적으로는 약 0.01 내지 1.0 M 소듐 이온 농도(또는 다른 염)이며, pH 7.0 내지 8.3에 있고, 온도는 짧은 프로브(예, 10 내지 50 뉴클레오타이드)를 위해서는 최소한 약 30℃이고, 긴 프로브(예, 50 뉴클레오타이드 이상)를 위해서는 최소한 약 60℃이다. 또한, 엄격한 조건은 포름아미드와 같은 불안정화 제제의 첨가에 의해 결정될 수 있을 것이다. 높은 엄격한 혼성화를 위해서, 양성 신호는 배경(background)의 혼성화 정도에 비해 최소한 두배 정도라야 하고, 바람직하게는 배경의 혼성화 정도에 비해 10배 정도라야 한다. 일례로 높은 엄격한 조건 또는 엄격한 혼성화 조건은 하기를 포함한다: 50% 포름아미드, 5X SSC 및 1% SDS로 42℃에서 반응 또는 5X SSC 및 1% SDS로 65℃에서 반응, 0.2X SSC 및 0.1% SDS로 65℃에서 세척. PCR을 하기 위해, 비교적 낮은 조건으로 증폭하는 PCR을 수행하기 위해서는 36℃의 온도가 적당하며, 프라이머 결합 온도는 프라이머의 길이에 의존하여 약 32℃ 및 48℃ 사이로 다양할 수 있다. 높은 조건의 PCR 증폭을 위한 온도는 약 62℃가 적당하며, 높은 조건의 프라이머 결합을 위한 온도는 프라이머의 길이와 특이성에 의존하여 약 50℃ 및 65℃ 사이의 범위가 될 수 있다. 높은 그리고 낮은 조건의 증폭을 모두 하기 위한 일반적인 사이클 조건은 90℃ 내지 95℃에서 30초 내지 2분의 변성 과정, 마지막 30초 내지 2분 동안 프라이머 결합 과정, 그리고 72℃에서 1 내지 2분 동안 길이연장 과정을 하는 것을 포함한다.

"복수(plurality)"는 최소한 두 개를 의미한다.

"리간드(ligand)"는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 화합물이다.

"수용체(receptor)"는 리간드에 특이적으로 결합하는 화합물이다.

"항체(antibody)"는 면역글로불린 유전자로 부터의 구조 부위 또는 이의 절편으로서 항원에 특이적으로 결합하고 인식하는 절편을 포함하는 폴리펩타이드를 일컫는다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파(kappa), 람다(lamda), 알파(alpha), 감마(gamma), 델타(delta), 엡실론(epsilon) 및 뮤(mu) 일정 부위 유전자 및 그 뿐만 아니라 미리아드(myriad) 면역글로불린 변이 부위 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다 둘 중의 하나로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되며, 상기 각각은 면역글로불린 단위인 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 표현된다. 또한, 이 단어는 예로 다클론, 단일클론, 단쇄, 인간화, 키메릭 항체 및 이의 절편을 포함한다.

대표적인 면역글로불린(항체)의 구조적 단위는 테트라머(tetramer)를 포함한다. 각각의 테트라머는 두 개의 유사한 폴리펩타이드 쇄(chaim)의 쌍으로 구성되어 있으며, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kD) 및 하나의 "중쇄"(약 50-70 kD)를 포함한다. 각 쇄의 N-말단은 항원 인식을 위해 일차적으로 필요한 약 100-110 또는 그 이상의 아미노산 변이 부위로 정의된다. 변이 경쇄(V_L) 및 변이 중쇄(V_H)라는 말은 이들 각각의 경쇄 및 중쇄를 일컫는다.

예를 들어, 항체는 완전한 면역글로불린의 상태 또는 다양한 펩티다제로 절단되어 생성된 잘-특징화된 절편의 개수로 존재한다. 따라서, 예를 들면, 펩신은항체의 경첩(hinge) 부위에 있는 이황 연결의 아래 부분을 절단하여 F(ab)'₂를 생성하며, Fab의 다이머 자체는 이황 결합에 의해 V_H-C_H1에 결합된 경쇄이다. F(ab)'₂는 경첩부위에 있는 이황 연결을 파괴하기 위해 온화한(mild) 조건 아래에서 감소될 수 있으며, 이에 의해 F(ab)'₂다이머가 Fab' 모노머로 전환된다. Fab' 모노머는 Fab가 경첩 부위의 일부와 함께 하는데 중요하다(Fundamental Immunology (Paul ed., 3d ed. 1993)). 반면 다양한 항체 절편은 완전한 항체의 절단이라는 의미로 정의될 수 있으며, 이러한 절편이 화학적 또는 재조합 DNA 방법학을 사용함으로써 새롭게(de novo) 합성될 수 있다는 것을 당업자들은 손쉽게 알 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 항체라는 말은 항체 절편이 전체 항체의 변형에 의해 생성되거나 또는 재조합 DNA 방법학(예, 단일 쇄 Fv)을 사용하여 새롭게 합성되거나 또는 파지 디스플레이 라이브러리(phage display libraris)를 사용하여 확인될 수 있는 것을 포함한다(예, McCaffertyet al.,Nature348:552-554(1990)).

단일클론 항체 또는 다클론항체의 제조를 위해 당해 기술에 공지된 다양한 방법이 사용될 수 있다(예, Kolher ＆ Milstein,Nature256:495-497(1975); Kozboret al.,Immunology Today4:72(1983); Coleet al., pp. 77-96 inMonoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc.(1985)). 단쇄 항체를 생산하기 위한 방법(미국 특허 제 4,946,778호)은 본 발명의 폴리펩타이드에 대한 항체를 생산하는데 적용될 수 있다. 따라서, 형질전환 생쥐 또는 다른 포유 동물과 같은 다른 생물은 인간화된 항체를 발현하는데 사용될 수 있다. 선택적으로, 파지 디스플레이 방법학은 항체 및 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 헤테로머릭(heteromeric) Fab 절편을 확인하는데 사용될 수 있다(예, McCaffertyet al.,Nature348:552-554(1990); Markset al.,Biotechnology10:779-783(1992)).

리간드 또는 수용체가 결합 반응 작용을 할때에, 리간드 또는 수용체(예, 항체)가 분석 화합물에 "특이적으로 결합한(specifically binds to)" 또는 분석 화합물과 "특이적으로 면역활성을 갖는(is specifically immunoreactive with)"이라는 것은 이종(heterogenous) 화합물 샘플의 분석 물질 존재 여부를 측정하는 것이다. 따라서, 지정된 분석(예, 면역분석) 조건 아래에서, 리간드 또는 수용체는 바람직하게 특정 분석 물질에 결합하며, 샘플에 상당량 존재하는 다른 화합물에는 결합하지 않는다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 혼성화 조건 아래에서 상보적 서열; 면역분석 조건 아래에서 항체가 증가하는데에 대항하는 에피토프를 포함하고 있는 항원 분석물질에 특이적으로 결합하는 항체; 및 적당한 용출 조건아래에서 분석물질에 특이적으로 결합하는 흡착제를 포함하는 분석물 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합한다.

"제제(agent)"는 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 결정되지 않은 조성물의 샘플, 혼합적 저분자 어레이, 생물학적 거대분자, 박테리오파지 펩타이드 디스플레이 라이브러리, 박테리오파지 항체(예, scFv) 디스플레이 라이브러리, 폴리좀(polysome) 펩타이드 디스플레이 라이브러리 또는 박테리아, 식물, 곰팡이 또는 동물 세포 또는 조직과 같은 생물학적 물질로부터 만들어진 추출물을 일컫는다. 파지 또는 유사 벡터에 있는 재조합 항체의 라이브러리의 선별에 관련된 적당한 방법이 있다(예, Huseet al.,Science246:1275-1281(1989); 및 Wardet al.,Nature341:544-546(1989)). 휴즈(Huse)에 의해 기술되는 프로토콜을 파지 디스플레이 방법학(예, WO 91/17271 및 WO 92/01047)과 결합함으로써 훨씬 효과적인 방법이 되었다.

"발현 조절 서열(expression control sequence)"은 폴리뉴클레오타이드에 조작적으로 연결된 뉴클레오타이드 서열의 발현(전사 및/또는 번역)을 조절하는 폴리뉴클레오타이드에 있는 뉴클레오타이드 서열을 일컫는다. "조작적으로 연결된(operatively linked)"이라는 말은 두가지 부분 사이에서 기능적으로 연관되는 것을 말하며, 이에 의해 하나의 부분에 대한 활성(예, 전사를 조절하는 능력)이 다른 부분에 작용(예, 서열의 전사)을 미치는 결과를 나타낸다. 발현 조절 서열로는 예를 들어 프로모터(예, 유도적, 억제적 또는 구조적), 인핸서(enhancer), 전사 터미네이터(transcription terminator), 개시 코돈(예, ATG), 인트론에 대한 접합 신호 및 중지 코돈의 서열이 있으며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

"발현 벡터(expression vector)"는 발현되고자 하는 뉴클레오타이드 서열에 조작적으로 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 일컫는다. 발현 벡터는 발현하기에 충분한 시스-작용(cis-acting) 요소; 발현을 위한 다른 요소를 포함하며, 숙주 세포 또는 실험실내 발현 시스템에 제공될 수 있다. 발현 벡터는 당업자에게 공지된 코스미드(cosmid), 플라스미드(예, 리포좀에 존재하지 않는 또는 포함된 플라스미드) 및 바이러스를 포함하며, 이는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

"코딩하는(encoding)"이라는 말은 유전자, cDNA, 또는 mRNA와 같이 폴리뉴클레오타이드에 있는 특정 서열에 대해 유전적 특성을 가진 뉴클레오타이드를 일컫으며, 이는 다른 폴리머를 합성하고 정의된 뉴클레오타이드 서열(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 정의된 아미노산 서열을 가진 생물학적 과정에 있는 거대 분자를 합성하기 위한 주형으로 제공되며, 그 결과 이의 생물학적 특성이 나타나도록 한다. 따라서, 유전자는 단백질을 코딩하며, 상기 유전자에 의해 생성되는 mRNA가 전사 및 번역되게 되면 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생산한다. 코딩 가닥 즉, 이의 뉴클레오타이드 서열이 mRNA 서열과 일치하며 종종 서열목록으로 제공되는 코딩 가닥과 전사를 위한 주형으로 사용되는 비-코딩 가닥 모두는 단백질 또는 유전자 또는 cDNA의 다른 생성물을 코딩하는 것으로 일컫어질 수 있다. 다르게 특정되지 않는다면, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열"은 서로 다른 것의 변형형이며, 유사 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 단백질과 RNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 인트론을 포함할 수도 있다.

"에너지 흡수 분자(energy absorbing molecule)"라는 말은 흡수 분광기에 있는 에너지 원천으로부터 에너지를 흡수하여 프로브 표면으로부터 분석물을 흡수 가능하게 하는 분자를 일컫는다. MALDI에 사용되는 에너지 흡수 분자는 종종 "매트릭스(matrix)"로 일컫어진다. 시나믹산(cinnamic acid) 유도체(알파-4-시아노-4-하이드록시-시나믹산(alpha-4-cyano-4-hydroxy-cinammic acid)와 같은), 시나피닉산(cinapinic acid) 및 디하이드록시벤조익산(dihydroxybenzoic acid)은 종종 생물유기화학적 분자의 레이저 흡수에서 에너지 흡수 분자로 사용된다.

"프로브(probe)"는 기체상 이온 분광계(예, 질량 분광계)로 제거적으로 삽입가능한 장치(device)를 일컫으며, 이는 분석물질의 검출을 시각화하기 위해 표면에 장착된 기질을 포함한다. 프로브는 분석 결과로 변형될 수 있으며, 일회용으로 사용될 수 있다.

"기체상 이온 분광기(gas phase ion spectrometer)"는 샘플이 휘발화되고 이온화될때에 이온의 질량:전하의 비로 형성되게 번역될 수 있는 매개변수를 측정하는 기기(apparatus)를 일컫는다. 일반적으로 레이저 흡수/이온화에 의해 형성되는 이온은 단일 전하를 가지고 있으며, 질량:전하의 비는 종종 간단하게 질량으로 일컫어진다. 예를 들어, 기체상 이온 분광기는 질량 분광기, 이온 유동성 분광기 및 전체 이온 흐름 측정 기기를 포함한다.

"질량 분광기(mass spectrometer)"는 흡입구 시스템, 이온화 원천, 이온 광학 부품, 질량 분석기 및 검출기를 포함하는 기체상 이온 분광기를 일컫는다. 질량 분광기의 예로는 흐름-시간(time-of-flight), 전자기적 섹터(magnetic sector), 쿼드라폴 필터(quadrapole filter), 이온 트랩(ion trap), 이온 사이클로트론 공명(ion cyclotron resonance) 및 이들의 혼합이 있다.

"레이저 흡수 질량 분광기(laser desorption mass spectrometer)"는 분석물질을 흡수, 휘발 및 이온화하게 하는 수단으로 레이저를 사용하는 질량 분광기를 일컫는다.

"질량 분광계(mass spectrometry)"는 질량 분광기를 사용하여 샘플을 분석하는 것을 일컫는다.

"쿼드라폴 흐름-시간 질량 분광기(quadrapole time-of-flight mass spectrometer)"는 이온이 쿼드라폴 Q에 들어가기 전에 에너지 원천에 의해 형성된 이온을 냉각시키는 충격 가습 영역(collisional damping interface)을 포함하는 질량 분광기를 일컫는다. 또한, 쿼드라폴 흐름-시간 질량 분광기는 충격 셀(cell)을 포함할 수 있다.

"분석물질(analyte)"은 필요에 의해 유지되고 검출된 샘플의 성분을 일컫는다. 상기 단어는 샘플에 있는 단일 성분 또는 성분의 집합을 일컫을 수 있다.

"흡착제(adsorbent)"는 분석물질을 흡착할 수 있는 어떠한 물질을 일컫는다. 본원에서 사용된 "흡착제"라는 말은 분석 물질이 노출되게 하는 단일 물질("단일 흡착제")(예, 화합물 또는 작용기) 및 샘플이 노출되게 하는 다른 복수 물질("복수 흡착제") 모두를 일컫는다. 복수 흡착제에 있는 흡착 물질은 "흡착제 종류(adsorbent species)"로 일컫어진다. 예를 들어 기질에 있는 주소화된 위치는 많은 다양한 흡착제 종류(예, 음이온 교환 물질, 금속 킬레이터 또는 항체)에 의해 특징화된 복수 흡착제를 포함할 수 있으며 다른 결합 특성을 가진다.

"흡착하다(adsorb)"는 용출액(선택적인 분계점 변형)으로 세척하고 난 뒤 또는 그 이전에 흡착제와 분석물질 사이에 있는 검출가능한 결합을 하는 것을 일컫는다.

"기질(substrate)"은 흡착제가 결합하거나 분리되게 하는 고체상을 일컫는다.

"결합하는 특성(binding characteristic)"은 분석물질을 위한 흡착제의 인력을 나타내는 화학적 및 생리적 현상을 일컫는다. 유사한 용출 조건 아래에서, 두 개의 흡착제가 다른 결합 특성을 가지고 있다면 흡착제는 다른 강도의 친화력으로 유사한 분석물질과 결합할 것이다. 예를 들어, 결합 특성은 염-조성된 상호 작용의 정도, 소수성 상호 작용의 정도, 친수성 상호 작용의 정도, 정전기적 상호작용의 정도 및 본원에서 기재된 다른 것을 포함한다.

"결합 조건(binding condition)"은 분석물질이 노출되게 하는 결합 특성을 일컫는다.

"용출액(eluant)"은 분석물질이 흡착제에 흡착되도록 유도하는데 사용하는 제제, 일반적으로 용액을 일컫는다. 또한, 용출액은 "선택적인 분계점 변형"으로 일컫어 진다.

"용출 특성(elution characteristic)"은 개별 용출액(선택적인 분계점 변형)이 분석물질과 흡착제간의 흡착을 유도하게 하는 능력을 말하는 특성을 일컫는다. 분석물질과 흡착제로 접촉될 때에 두 개의 용리액이 다른 용출 특성을 가지고 있다면 흡착제를 위한 분석물질의 친화력 정도는 달라질 것이다. 예를 들어 용출 특성은 pH, 이온 강도, 물 구조의 변형, 계면활성제의 강도, 소수성 상호작용의 변형 및 본원에서 기재된 다른 것이 있다.

"용출 조건(elution condition)"은 분석물질이 노출되게 하는 용출 특성을 일컫는다.

"선택적인 특성(selectivity characteristic)"은 각각의 결합 특성을 가진흡착제 및 각각의 용출 특성을 가진 용출액의 혼합적인 특성을 일컫으며, 용출액으로 세척하고 난 뒤에 흡착제에 잔존하는 분석물질로 특정화되는 것을 말한다.

"선택적인 조건(selectivity condition)"은 분석물질이 노출되게 하는 선택적인 특성을 일컫는다.

"인력의 기초(basis for attraction)"는 하나의 물질이 다른 물질에 이끌리게 하는 화학적 및/또는 생리-화학적 특성을 일컫는다.

"인력의 강도(strength of attraction)"는 하나의 물질이 다른 물질에 대해 갖게 되는 인력의 강도를 일컫는다(또한 친화력으로도 알려져 있다).

"분석하다(resolve)", "분석(resolution)" 또는 "분석물질의 분석(resolution of analyte)"는 샘플에 있는 적어도 하나 이상의 분석물질을 검출하는 것을 일컫는다. 분석은 분리 및 지속적인 다른 검출에 의해 샘플에 있는 다양한 분석물질을 검출하는 것을 포함한다. 분석은 혼합물에 있는 모든 다른 분석물질로부터 하나의 분석물질을 완전히 분리하는 것을 의미하는 것은 아니다. 게다가, 어떠한 분리이든지 간에 최소한 두 개의 분석물질 사이에서 구분가능하도록 허락한다.

"높은 정보 분석(high information resolution)"은 분석물질을 검출할 뿐만 아니라 최소한 하나의 생리-화학적 특성(예, 분자량)이 측정되도록 허락하는 방법으로 분석물질을 분석하는 것을 일컫는다.

"흡수 분광법(desorption spectrometry)"은 정지 상으로부터 기체 상으로 분석물질을 흡수하고, 이차 정지 상에 있는 분석물질을 포착하는 중간 단계 없이 흡수된 분석물질 또는 이의 판별 가능한 부분이 검출기에 의해 직접적으로 검출되는, 에너지에 노출된 분석 물질을 검출하는 방법을 일컫는다.

"검출하다(detect)"는 검출되고자 하는 대상의 양 또는 존재 유무를 확인하는 것을 일컫는다.

"정체(retention)"는 용출액으로 세척하고 난 뒤 흡착제에 분석물질이 흡착한 것을 일컫는다.

"정체 데이터(retention data)"는 각각의 선택적인 조건 아래에서, 잔존하는 분석물질의 검출(선택적으로는 검출 질량을 포함)을 나타내는 데이터를 일컫는다.

"정체 맵(retention map)"은 다양한 선택적 조건 아래에서, 잔존하는 분석물질을 위한 특이적인 정체 데이터의 가치를 정하는 것을 일컫는다.

"인식 프로파일(recognition profile)"은 다양한 선택적 조건아래에서, 잔존하는 분석물질을 위한 특이적인 상대적 정체의 가치를 정하는 것을 일컫는다.

"복합체(complex)"는 둘 또는 그 이상의 분석물질 단위에 의해 형성된 분석물질을 일컫는다.

"절편(fragment)"은 분석물질의 화학적, 효소적 또는 물리적인 파괴 산물을 일컫는다. 절편은 자연적 또는 이온적 상태에 있을 수 있다.

"다른 발현(differential expression)"은 분석물질의 정량적 또는 정성적 존재에 있어서 다르게 검출될 수 있다는 것을 일컫는다.

"유전자 발현 프로파일(gene expression profile)"은 생물학적 샘플에서 발현되는 최소한 하나의 mRNA의 동정을 일컫는다.

"생리-화학적 특성(physio-chemical property)"은 분자의 특성인 분자의 생리적 또는 화학적 특성을 일컫는다. 단백질의 생리-화학적 특성은 아미노산 서열, 분자량, 등전점, 소수성, 친수성, 글리코실레이션, 인산화, 에피토프 서열, 리간드 결합 서열, 특정 pH(등전점)에서의 전하, 염색제 결합 및 금속 킬레이트 결합을 포함하며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 물리화학적 특성은 예를 들어 단백질 프로파일에서 동정하거나, 분획화 또는 분리를 하는 수단으로 사용된다. 예를 들어 헥사-히스티딘 서열, 리간드 결합 모티프 또는 서열, 도메인, 프로테아제 절단 부위, 금속 킬레이트 결합 부위 또는 에피토프와 같은 특성을 가진 아미노산 서열은 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 분획화, 분리 또는 동정하는데 사용될 수 있다. 다른 실시예에서는, 인산화된 폴리펩타이드는 상응하는 키나제(kinase) 또는 포스포릴라제(phosphorylase)와의 상호 연관에 의해, 또는 색깔 형성 효소 반응에 의해, 또는 폴리펩타이드의 인산화된 부위에 결합하는 항체에 의해 분획화, 분리 또는 동정되었다. 유사하게는, 글리코실화된 폴리펩타이드는 결합파트너 또는 폴리펩타이드의 글리코실화된 부위에 결합하는 항체와의 상호 연관에 의해, 또는 카보하이드레이트를 인식하는 항체에 의해, 또는 렉틴 또는 효소적인 것에 의해 분획화, 분리 또는 동정될 수 있다. 다른 실시예에서, 다양한 pH를 가진 완충액과 용액, 또는 양이온성 또는 음이온성 레진은 주어진 pH에서의 이들의 전하 또는 이들의 pI 또는 등전점에 따라 폴리펩타이드를 분획화하고, 분리하거나 또는 동정하는데 사용될 수 있다. 다른 실시예에서, 완충액, 용액 및 다양한 친수성을 가진 레진은 이들의 소수성 또는 친수성에 기초하여 분획화하고, 분리하거나 또는 동정하는데 사용될 수 있다. 다른 실시예에서, 질량 또는 분자량, 또는 폴리펩타이드의 단백질 분해성 절편의 질량 또는 분자량은 폴리펩타이드를 분획화하고, 분리하거나 또는 동정하는데 사용될 수 있다.

"핵산 어레이(nucleic acid array)"는 주소화된 위치(즉, 개별적인, 질문가능한 주소에 의해 위치가 특정화된다)의 어레이를 일컫으며, 각각의 주소화된 위치는 이에 결합된 특징적인 핵산을 포함한다. 핵산은 본원에서 정의된 어떠한 핵산이든 될 수 있으며, 예로, 자연적으로 형성된 또는 합성 핵산이 있으며, 핵산의 예로는, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드가 있다. 올리고뉴클레오타이드 어레이에서, 핵산은 올리고뉴클레오타이드(예, 엑손, EST 또는 유전자의 부분, 전사체, 또는 cDNA)이고; EST 어레이에서 핵산은 EST 또는 이의 부분이며; mRNA 어레이에서 핵산은 mRNA 또는 이의 부분, 또는 상응하는 cDNA이다. 올리고뉴클레오타이드는 4, 6, 8, 10, 또는 12 이거나 더 긴 길이의 뉴클레오타이드가 될 수 있으며, 종종 10, 30, 40 또는 50 뉴클레오타이드 길이, 약 100 뉴클레오타이드까지의 길이가 될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

유전자 발현 프로파일하기

본 발명의 방법에 있어서 첫 번째 단계는 흥미있는 샘플의 유전자 발현 프로파일을 제작하는 것이다. 유전자 발현 프로파일하기는 세포에서 하나 또는 그 이상의 RNA, 바람직하게는 mRNA의 발현을 동정하는 것을 일컫는다. 종종 최소한의 또는 10, 100, 10,000까지의 또는 그 이상의 다른 mRNA는 하나의 실험에서 동정할 수 있다. 한 실시예에서, 다른 프로파일(다른 세포와 비교하여, 예, 다른 표현형을 가지거나 다른 시간적 단계 또는 발생 단계에 있거나, 또는 다른 환경 조건(예, 생리적 또는 화학적 조건 등등)에 노출)은 흥미있는 세포에 대한 유용한 정보를 제공하며, 그 예로, 유전자가 바람직하게 또는 선택적으로 주어진 세포 형태에서 발현된다. 종종, 흥미있는 유전자는 하나의 세포에서 강하게 발현되지만 다른 세포에서는 그렇지 않다. 다른 실시예에서, 흥미있는 유전자는 다른 세포에서 유사한 발현 형태를 가지고 있다. 다른 실시예에서, 흥미있는 유전자는 다른 세포에 비해 하나의 세포에서 낮은 발현 형태를 가진다.

종종 유전자 발현을 동정하기 위한 방법은 항상 혼성화를 기초로 두는 것은 아니지만 예를 들어 노던 블랏; 닷 블랏; 프라이머 연장; 뉴클레아제 방어; 상쇄 혼성화 및 예를 들어 하이드록시아파타이트(hyroxyapatite)를 사용한 비-이중화된 분자의 분리; 용액 혼성화; 필터 혼성화; RT-PCR 및 차별적인 발현(differential display), LCR, AFLP, RAP, 등과 같은 PCR에 관련된 다른 기술(미국 특허 제 4,683,195호 및 4,683,202호;PCR protocols:A Guide to Methods and Applications(Inniset al., eds. 22:5640-5648(1994); Peruchoet al.,MethodsEnzymol. 254:275-290(1995), 예를 들어 절단 엔도뉴클레아제를 사용한 지문(finger printing)(Ivanovaet al.,Nuc. Acids. Res. 23:2954-2958(1995); Kato,Nuc. Acids Res. 23:967-971(1992); Hubank ＆Schatz,Nuc. Acids Res. 23:2954-2958(1995); Kato,Nuc. Acids Res. 23:3685-3690(1995); 및 Shimketset al.,Nature Biotechnology17:798-803, 미국 특허 제 5,871,697호); 및 구조 특이적 엔도뉴클레아제의 용도(예로, De Francesco,The Scientist12:16(1998))를 포함한다. 또한, mRNA 발현은 질량 분광계 기술(예, MALDI 또는 SELDI), 액체 크로마토그래피, 및 하기에 기재된 캐필러리 젤 전기영동을 사용하여 분석될 수 있다.

상기 기술에 대한 일반적인 기술은 하기 문헌을 참고하면 된다: Sambrooket al.,Molecular Cloning, A Laaboratory Manual(2nd ed. 1989)에 있는 page 7.37-7.39, 7.53-7.54, 7.58-7.66 및 7.71-7.79를 참고; Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laaboratory Mannual(1990); 및Current Protocols in Molecular Biology(Ausubelet al., eds., 1994).

발현 분석을 예측하고(expedite), 큰 수의 핵산 샘플을 서열분석하는 기술이 개발되었다. 예를 들어, 핵산 어레이는 고농도 및 고효율의 발현 분석을 위해 개발되었다(Granjeuadet al.,BioEssays21:781-790(1999); Lockhart ＆ Winzeler,Nature405:827-836(2000)). 핵산 어레이는 나일론, 유리, 또는 실리콘 와퍼(silicon wafer)와 같은 고체 기질(Fodor et al., Science 251:767-773(1991); Brown ＆ Botstein,Nature Genet. 21:33-37(1999); Eberwine, Biotechniques 20:584-591(1996))에 결합한 많은 수(예, 백, 천, 만 또는 그이상)의 핵산 프로브를 일컫는다. 단일 어레이는 예를 들어 전체 게놈 또는 게놈에 의해 발현되는 모든 유전자에 상보적인 프로브를 포함할 수 있다. 어레이에 있는 프로브는 DNA 올리고뉴클레오타이드 어레이(예, GeneChip^TM, Lipshutzet al.,Nat. Genet. 21;20-24(1999)), mRNA 어레이, cDNA 어레이, EST 어레이, 또는 섬유 광학 번들에 있는 광학적으로 코딩된 어레이(예, BeadArray^TM)가 될 수 있다. 발현 분석을 하기 위해 어레이에 적용될 수 있는 샘플은 예를 들어 PCR 산물, cDNA, mRNA 등이 될 수 있다.

신속하게 유전자 서열을 분석하고 유전자의 발현을 분석하는 추가적인 방법은 예를 들어 SAGE(serial analysis of gene expression)를 포함한다. SAGE를 하기 위해 짧은 서열 태그(일반적으로 약 10-14 bp)는 단독으로도 전사체를 동정하기 위한 충분한 정보를 포함한다. 이러한 서열 태그는 긴 연속적 분자와 함께 연결될 수 있으며 클로닝되고 서열분석될 수 있다. 각각의 태그가 관찰되는 배수의 정량화는 상보적인 전사체의 발현 수준을 증명한다(예, Velculescuet al.,Science270:484-487(1995); Velculescuet al.,Cell88(1997); 및 de Waardet al., Gene226:1-8).

생리-화학적 특성

본원에서 언급한 바와 같이 상기 기술 각각이 사용될 수 있으며, 이를 단독 또는 혼합함으로써 후보 유전자 또는 세포에서 발현되는 흥미있는 후보 유전자의집합을 동정할 수 있다. 흥미 유전자의 전사체는 당업자에게 공지된 기술을 사용함으로써 동정하고 분리될 수 있다. 또한, 동정된 전사체는 코딩된 아미노산 서열 정보를 사용하여 서열분석될 수 있으며, 분자량, 등전점, 소수성, 친수성, 글리코실레이션, 특정 pH에서의 전하 및 금속 킬레이트 결합과 같은 물리화학적 특성을 위해 분석될 수 있다. 종종, 생물정보학(bioinformatics) 및 서열 데이터베이스는 전사체에 의해 코eld는 단백질의 기능을 확인하는데 사용될 수 있다. 흥미있는 유전자는 예를 들어 이온 채널, 수용체(예, G 단백질 커플된 수용체), 사이토카인, 키모카인(chemocine), 신호 전달 단백질, 하우스키핑 단백질, 세포 주기 조절 단백질, 전사 인자, 아연 핑커 단백질, 크로마틴 리모델링 단백질 등을 포함한다.

따라서, 확인된 생리-화학적 특성은 전사체의 발현 수준을 전사체에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준과 연관시키는 수단이다. 하기에 기재된 단백질 분석 수단을 사용하면, 흥미있는 단백질을 분획화하고, 배경(background)을 감소시키는 대신에 단백질의 검출 감도를 증가시키는데 단백질의 하나 또는 그 이상의 생리-화학적 특성이 사용될 수 있다. 추가로 이러한 방법은 흥미있는 전사체 또는 후보 전사체를 세포에 있는 코딩된 단백질의 발현 수준과 연관시키는 데에도 사용될 수 있다. 이러한 정보는 예를 들어 진단 및 치료적 용도로 사용하기 위한 전사체의 부분 집합 및 단백질을 선별하는데 사용될 수 있다.

샘플의 단백질 분획 분석

샘플에 있는 폴리펩타이드는 동정된 발현된 mRNA에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 적어도 하나 이상의 생리-화학적 특성에 기초하여 분획화될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드를 동정함으로써 수개의 예측된 폴리펩타이드의 생리-화학적 특성을 나타내어 줄 것이다. 아미노산 서열은 단백질의 예측된 분자량을 제공할 것이다. 또한, 아미노산 서열은 폴리펩타이드의 등전점을 예측하는데 사용될 수 있으며, 폴리펩타이드가 친수성 또는 소수성인지, 그리고 금속 킬레이트 결합 활성을 가지는지 예측하는데 사용될 수 있다. 또한, 아미노산 서열은 폴리펩타이드가 글리코실레이션 부위 또는 포스폴리레이션 부위를 포함하는지를 예측할 수 있다. 폴리펩타이드의 후-번역적 변형은 분자량에 변화를 줄 것이다. 또한, 아미노산 서열은 에피토프를 동정할 수 있으며, 이는 항체 결합의 표적이 된다. 물리화학적 특성을 정확히 측정하는 것이 반드시 필요한 것은 아니며; 특성에 기초하여 다양한 분배물로 분획화할 수 있고, 폴리펩타이드가 분배물 사이에서 바람직하게 분획화되는 것을 예상할 수 있을 정도면 충분하다.

그리고 나서, 샘플에 있는 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 생리-화학적 특성에 기초하여 분획화 될 수 있다. 분리(separation)를 하는 가장 유용한 방법은 분자량이며, 이러한 특성에 기초하여 단백질을 분해하기 위한 많은 방법이 있는데, 예로, SDS 젤 전기영동 및 기체상 이온 분광법(예, 질량 분광법)이 있다. 다른 유용한 물리화학적 특성은 등전점이다. 등전점, 친화 크로마토그래피 및 이온 교환 레진에서의 고체상 추출은 이러한 특성에 기초하여 샘플에 있는 단백질을 분획화 할 것이다.

단백질을 분획하는 방법은 세포에서 선택된 단백질의 발현 수준을 분석하는데 사용될 수 있다. 상기에 기재한 바와 같이, 하나 또는 그 이상의 선택된 물리화학적 특성을 사용하는 것은 분획의 감도를 증가시키고 배경(background)을 감소시킬 수 있다. 본원에 기재된 기술은 세포에서 발현된 하나 또는 그 이상, 10, 100, 1,000 또는 10,000개 까지의 단백질을 분석하는데 사용될 수 있다. 어느 하나의 기술 또는 기술의 혼합은 하나 또는 그 이상의 생리-화학적 특성에 기초하여 단백질을 분획하는데 사용될 수 있다. 분획하는 방법은 예를 들어, 이차면 젤 전기영동; 캐필러리 젤 전기영동; 질량 분광법(예, MALDI, SELDI); ICAT(isotope coded affinity tag)(Mann,Nature Biotechnology17:954-955(1999); Gygiet al.,Nature Biotechnology17:994-999(1999)); 크로마토그래피, 예로 젤-여과, 이온-교환, 친화, 면역 친화 및 금속 킬레이트 크로마토그래피, HPLC(예, 역상, 이온-교환 및 size exclusion HPLC); 웨스턴 블라팅; ELISA 및 항체를 사용한 조직내 스크리닝과 같은 면역조직학적 기법 등을 포함한다(Blackstock ＆ Weir,Trends in Biotech. 17:121-127(1999); Dutt ＆ Lee,Biochemical Engineering, page 176-179(April 2000); Pageet al.,Drug Discovery Today4:55-62(1999); Wang ＆Hewick,Drug Discovory Today4:129-133(1999); Regnieret al.,Trends in Biotech. 17:101-106(1999); Pandey ＆ Mann,Nature405:837-846(2000)). 흥미있는 단백질은 당업자에게 공지된 기술을 사용함으로써 동정되고 분리될 수 있다.

이러한 기술에 대한 일반적인 기술은 하기를 참고한다: Sambrooket al.,Molecular Cloning, A Laboratory Mannual(2nd ed. 1989);Current Protocols in Molecular Biology(Ausubelet al., eds., 1994)).

한 실시예에서, 이차면 전기영동은 본 발명의 단백질을 분획하는데 사용될 수 있다. 이러한 단백질 분획 기술은 pI 및 분자량과 같은 생리-화학적 특성에 기초한다. 2d 젤 전기영동 및 본원에 기재된 기술은 단독으로 사용되거나 또는 예를 들어 MALDI 및 SELDI와 같은 본원의 하기에 기재된 질량 분광법과 혼합하여 사용될 수 있다.

하기에 기재된 다른 실시예에서, MALDI는 질량에 기초하여 단백질을 분획하는 질량 분광법 기술이며, 분석능을 증가시키기 위해서는 종종 크기 및/또는 친화 크로마토그래피 기술과 혼합하여 사용할 수 있다.

하기에 기재된 다른 실시예에서, SELDI는 질량 분광법과 함께 친화 분획화를 할 수 있게 하는 질량 분광법 기술이다. 친화 매트릭스 또는 프로브는 예를 들어 pI(이온 교환 레진 및 세척), 항체 결합, 글리코실레이션, 인산화, 히스티딘 잔기 등에 기초하며, 높은 해상도, 정확성 및 민감성으로 단백질을 동정하기 위해 질량 분광법과 혼합할 수 있다. 이러한 기술을 사용할 때, 후보 폴리펩타이드를 위해 축적되는 친화 매트릭스는 전사체에 의해 코딩되는 생리-화학적 특성에 기초하여 측정될 수 있다.

샘플의 질량 분광법 분석

도입

본 발명의 폴리펩타이드 또는 이의 절편은 질량 분광법을 사용하여 분석될 수 있다. 상기 방법은 질량에 기초하여 폴리펩타이드를 분획한다. 한 실시예에서는, 기체상 이온 분광기가 사용되었다. 다른 실시예에서는, 기질-결합된 흡착제에 있는 샘플을 분석하기 위해 레이저-흡수/이온화 질량 분광법이 사용되었다.

현대 레이저 흡수/이온화 질량 분광법(Modern laser desorption/ionization mass spectrometry)("LDI-MS")은 두 개의 주요한 변형으로 실시될 수 있다: 매트릭스로 보조장치된 레이저 흡수/이온화("MALDI") 질량 분광법 및 표면-강화된 레이저 흡수/이온화("SELDI") 질량 분광법. 추가로, 레이저 흡수/이온화 질량 분광법을 사용하는 질량 분광법은 쿼드라폴 흐름-시간 질량 분광기로 연결될 수 있다. MALDI에서, 생물학적 분자를 포함할 수 있는 분석물질은 매트릭스를 포함하는 용액으로 혼합하였으며, 한 방울의 용액을 기질의 표면에 위치하게 하였다. 그리고 나서 매트릭스 용액을 생물학적 분자로 동시-결정화하였다. 기질을 질량 분광기에 삽입하였다. 레이저 에너지를 기질 표면에 직접 닿게 하여 심각하게 절편화되지 않고도 생물학적 분자를 흡수하고 이온화하도록 하였다. 그러나, MALDI는 분석적 기술로 사용하기에는 한계가 있었다. 이는 샘플을 분획하기 위한 수단을 제공하지 않으며, 매트릭스 물질은 특히 저분자량의 분석물질을 검출하는데 영향을 줄 수 있다. 예로, 미국 특허 제 5,118,937호(Hillenkampet al.,) 및 미국 특허 제 5,045,694호(Beavis ＆ Chait)를 참고한다.

SELDI에서, 기질 표면을 변형화하면 흡수과정에서 활성을 띄게 된다. 하나의 변형에서, 표면은 선택적으로 분석물질에 결합하는 친화제로 유도화되었다. 다른 변형에서, 표면은 레이저로 폐쇄될 때에는 흡수되지 않는 에너지 흡수 분자로 유도화되었다. 다른 변형에서, 표면은 분석물질을 결합하고 레이저를 적용시켰을때 파괴되는 포토라이틱(photolytic) 결합을 포함하고 있는 분자로 유도화되었다. 이러한 방법들 각각에서, 일반적으로 유도화 제제는 샘플이 적용되는 기질 표면에 있는 특정 위치에 위치하게 된다. 이에 대한 예는, 미국 특허 제 5,719,060호 및 제 5,6020208호(Hutchens ＆Yip) 및 국제 공개 제 98/59360호, 제 98/59361호 및 제 98/59362호(Hutchens ＆Yip)를 참조하면 된다. 예를 들어 두 개의 방법이 결합될 수 있는데, 이는 분석물질을 포획하기 위해 SELDI 친화 표면을 사용하고 에너지 흡수 물질을 제공하기 위해 포획 물질에 매트릭스-포함 용액을 첨가함으로써 수행된다.

한 실시예에서, 레이저 흡수/이온화 질량 분광기는 추가로 쿼드라폴 흐름-시간 질량 분광기 QqTOF MS(Krutchinskyet al., 국제 공개 제 99/38185호)에 연결된다. MALDI-QqTOF MS(Krutchinskyet al., 국제 공개 제 99/38185호; Shevchenkoet al., (2000)Anal. Chem. 72:2132-2141), ESI-QqTOF MS(Figeyset al., (1998)Rapid Comm'ns. Mass Spec. 12-1435-144) 및 칩 캐필러리 전기영동(chip-CE)-QqTOF MS(Liet al., (2000)Anal. Chem. 72:599-609)과 같은 방법은 상기에서 기술하였다.

한 실시예에서, 질량 분광기는 본 발명의 단백질 샘플을 분획화하는데 사용되었다. 일반적인 질량 분광기에서, 폴리펩타이드 분석물질을 포함하는 기질은 질량 분광기의 흡입구 시스템으로 전달되었다. 그리고 난 뒤 분석물질은 레이저, 빠른 원자 충돌, 고에너지 플라즘, 전기분사 이온화, 열분사 이온화, 액체 이차 이온 MS, 범위 흡수 등과 같은 흡수 에너지에 의해 흡수되었다. 발생된 흡수되고, 휘발된 종류는 미리 형성된 이온 또는 흡수가 일어나는 직접적인 과정 동안 이온화된 중성자로 구성된다. 형성된 이온은 이온 광학 기기에 의해 수집되었고, 질량 분석기가 통과하는 이온을 분산하고 분석한다. 질량 분석기에 남아있는 이온은 검출기에 의해 검출되었다.

그리고 난 후 검출기는 검출된 이온의 정보를 질량:전하 비로 전환한다. 일반적으로 마커 또는 다른 물질의 존재를 검출하는 것은 신호의 강도를 검출하는 것과 관련될 것이다. 이것은 기질에 결합한 폴리펩타이드의 양과 특성을 반영할 수 있다. 질량 분광기와 이에 관련된 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 당해 기술에 속한 사람이라면 질량 분광기의 구성(예, 흡수 원천, 질량 분석기, 검출 등등)이 본원에 기술되거나 또는 당해 기술에 알려진 다른 적당한 구성요소와 혼합될 수 있다는 것을 용이하게 알 수 있다. 질량 분광기에 대한 추가적인 정보는 예로Principles of Instrumental Analysis3rd ed., Skoog, Saunders College Publishing, Philadelphia, 1985; 및kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical technology, 4th ed. Vol. 15(John Wiley ＆ Sons, New York 1995), pp. 1071-1094를 참조하면 된다.

한 실시예에서, 레이저 흡수 흐름-시간 질량 분광기는 본 발명의 기질과 함께 사용되었다. 레이저 흡수 질량 분광법에서, 기질은 결합된 마커와 함게 흡입구 시스템으로 전달된다. 마커는 흡수되며 이온화 원천으로부터 레이저에 의해 기체상으로 이온화된다. 형성된 이온은 이온 광학 기기에 의해 수집되며, 그리고 난 후 흐름-시간 질량 분석기 안에서, 이온은 짧은 고압 영역을 통해 가속화되며 고압챔버로 추진하도록 한다. 고압 챔버의 멀리 떨어진 말단에서, 가속화된 이온은 다른 시간으로 감지 검출 표면을 치게(strike) 된다. 흐름-시간은 이온 질량의 특성이기 때문에, 이온이 형성되는 시간과 이온이 검출기에 충돌하는 시간 사이의 경과 시간은 특정 질량:전하비를 가진 분자의 존재 유무를 확인하는데 사용될 수 있다.

정체(retentate) 크로마토그래피는 샘플에 있는 분석물질을 복합면(multidimensional)에서 분석하기 위한 방법이다. 상기 방법은 (1) 기질을 복합적인 다른 흡착제/용리제 혼합의 상태로 만들기 위해 샘플로부터 선택적으로 분석물질을 흡착하는 것("선택적인 조건"), (2) 흡수 분광법에 의해 흡착된 분석물질이 잔존하는 것을 검출하는 것과 연관되어 있다. 각각의 선택적인 조건은 흡착되지 않는 것으로부터 흡착된 분석물질을 분리하는, 첫 번째 면에서의 분리를 제공한다. 흡수 질량 분광법은 질량에 따라 다른 물질로부터 흡착된 분석물질을 분리하는, 두 번째 면에서의 분리를 제공한다. 정체 크로마토그래피는 복합적인 다양한 선택적 조건을 사용하는 것과 관계되어 있기 때문에, 많은 면(dimension)에서의 분리가 수행되었다. 또한, 두 개의 선택적인 조건에서의 하나 또는 그 이상의 분석물질의 상대적 흡착이 측정될 수 있다. 이러한 복합면에서의 분리는 분석물질 및 이의 특성 모두의 분석을 제공한다.

게다가, 분리된 분석물질이 정체 맵(map)에 잔존하여 남아 있게 되면 구조 및/또는 기능을 분석하기 위한 추가적인 조작을 가능하게 한다. 또한, 남아 있는 분석물질은 기질에 노출된 다른 분석물질을 남아있게 하기 위한 흡착제로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 분석물질의 빠르고, 복합면적이며, 그리고높은(high) 정보의 분석을 제공한다.

본 발명의 방법은 여러개의 형태를 가질 수 있다. 한 실시예에서, 분석물질은 두 개의 물리적으로 다른 위치에서 두 개의 다른 흡착제에 흡착되었으며, 각각의 흡착제는 유사한 용출액(선택적인 분계점 변형)로 세척되었다. 다른 실시예에서, 분석물질은 두 개의 물리적으로 다른 위치에서 유사한 흡착제에 흡착되었으며, 두 개의 다른 용출액으로 세척되었다. 다른 실시예에서, 분석물질은 물리적으로 다른 위치에서 두 개의 다른 흡착제에 흡착되었며, 두 개의 다른 용출액으로 세척되었다. 다른 실시예에서, 분석물질은 하나의 흡착제에 흡착되며, 첫 번째 용출액으로 세척되어 잔존하는 것이 검출되었다; 그리고 나서, 흡착된 분석물질은 두 번째 다른 용출액으로 세척되었며, 지속적으로 잔존하는 것이 검출되었다.

정체 크로마토그래피를 수행하는 방법

구체적으로, 정체 크로마토그래피는 샘플에 있는 폴리펩타이드를 분획하는데 유용한 방법이다. 이 방법에 따르면, 폴리펩타이드는 개별적인 생리-화학적 특성에 기초하여 폴리펩타이드를 결합하고 있는 고체상 흡착제 상에서 분획화된다. 결합하지 않은 폴리펩타이드는 세척하여 제거된다. 그리고 난 후 잔존하는 폴리펩타이드는 추가적으로 질량 분광법에 의해 분획되며, 이에 의해 최소한 두 개의 생리-화학적 특성에 기초한 분획을 제공한다.

분석물질을 선택적인 조건에 노출하기

기질의 준비: 정체 크로마토그래피를 수행하는데 있어서, 흡착제에 의해 잔존하게 되는 분석물질은 기질에 있는 에너지 원천으로 나타내어진다. 분석물질을 포함하는 샘플은 흡착제가 기질에 고정되기 전 또는 그 이후에 흡착제에 접촉되며, 남아있는 분석물질을 흡착 수단으로 제공할 수도 있다. 접촉하기 위한 목적을 위해서, 흡착제는 액체 형태 또는 고체 형태(즉, 기질 또는 고체상에)을 띌 것이다. 구체적으로, 흡착제는 용액, 서스펜션, 분산(dispersion), 기름에 있는 물 에멀젼, 물에 있는 기름 에멀젼, 또는 마이크로에멀젼의 형태를 띌 수도 있다. 본 발명의 실시예에서, 샘플은 액체 샘플을 액체 흡착제로 첨가혼합함으로써 흡착제로 접촉될 수 있다. 선택적으로, 샘플은 고체 지지대상에 제공되고, 고체 지지대를 포함하는 샘플을 액체 흡착제에 완전히 담그고(bathing), 적시고(soaking) 또는 살짝 담금(dipping)으로써 접촉되게 할 수 있다. 게다가, 샘플은 액체 흡착제로 분사 또는 세척하는 것에 의해 고체 지지대상에 접촉될 수 있다. 본 발명의 실시예에서, 다른 흡착제는 다른 용기로 제공될 것이다.

한 실시예에서, 흡착제는 기질상에 제공되었다. 기질은 흡착제와 결합하고 흡착제를 붙들 수 있는 어떠한 물질이든 될 수 있다. 일반적으로, 기질은 유리; 세라믹; 전기적으로 전하된 폴리머(예, 카본화된 PEEK); TEFLON＠ 코팅된 물질; 유기 폴리머; 자연적 생폴리머; 금속(예, 니켈, 놋쇠, 철 또는 알루미늄); 필름; 교차 연결된 폴리머의 유공(porous) 및 비공(non-porous) 비드(예, 아가로즈, 셀룰로즈 또는 덱스트란); 다른 불용성 폴리머; 또는 이의 혼합을 포함한다.

한 실시예에서, 기질은 프로브의 형태 또는 흡착 검출기로 삽입되는 샘플 표시 수단을 가진다. 예를 들어, 기질은 직선의 형태를 가질 수 있다. 흡착제는 점의 직선 어레이 형태로 있는 기질에 접촉될 수 있으며, 이의 각각은 분석물질에 노출된다. 몇 개의 직선은 서로간에 결합될 수 있으며, 따라서 복수개의 흡착제는 정의된 줄에 있는 불연속의 점을 가진 어레이 30을 형성할 수 있다. 또한, 기질은 흡착제가 수평적 및 수직적인 선으로 존재하는 플레이트의 형태에 있을 수 있으며, 이는 정사각형, 직사각형 또는 원형과 같은 규칙적인 기하학적 형태를 형성한다.

프로브는 아래에 기재된 것으로 생성될 수 있다. 기질은 예를 들어 스테인레스 스틸, 알루미늄 또는 실리콘 와퍼와 같은 어떤 고체 물질이든 될 수 있다. 그리고 나서, 금속 기질은 물질로 코팅되어 표면이 변형되게 한다. 예를 들어 금속 표면은 실리콘 옥사이드, 티타늄 옥사이드 또는 금으로 코팅될 수 있다.

그리고 난 후 표면은 이중기능적 링커로 변형된다. 링커의 한쪽 끝부분은 작용기를 포함하고 있어서 표면에 있는 작용기와 공유결합 할 수 있다. 따라서 작용기는 비유기적 옥사이드(oxide) 또는 금을 위한 설피드릴(sulfhydryl) 기가 될 수 있다. 링커의 다른쪽 끝부분은 일반적으로 아미노 작용기를 가진다. 유용한 이중기능적 링커는 아미노프로필 트리에톡시실란(aminopropyl triethoxysilane) 또는 아미노에틸 디설파이드(aminoethyl disulfide)를 포함한다.

표면에 한번 결합하게 되면, 링커는 추가적으로 흡착제로 작용을 하는 기로 변형된다. 일반적으로 흡착제는 프로브 상에 있는 주소화된 위치로 첨가된다. 하나의 프로브 형태에서 직경 3 mm의 스팟은 직각의 어레이에 정렬한다. 흡착제는 이용가능한 아미노기와 반응하는 기 및 흡착제로 작용하는 작용기를 포함하는 이중기능적 분자의 부분이 될 수 있다. 예를 들어 작용기는 정상(실리콘 옥사이드), 역상(C18 알리파틱 하이드로카본), 퀀터너리 아민 및 설포네이트를 포함한다. 또한, 표면은 추가로 카보디이미드 및 N-하이드록시숙시니미드와 같은 다른 이중기능적 분자로 변형될 수 있으며, 전구-활성화된 블랭크(blank)를 만든다. 이러한 블랭크는 생물유기적 흡착제(예, 핵산, 항체 및 다른 단백질 리간드)로 기능화 될 수 있다. 생폴리머는 아민 잔기 또는 설피드릴 잔기를 통해 블랭크 상에 있는 작용기에 결합할 수 있다. 하나의 실시예에서, 흡착제는 이용가능한 작용기를 통해 프로브의 표면에 결합한 교차-연결된 폴리머(예, 필름)에 결합된다. 예를 들어, 이러한 폴리머는 셀룰로즈, 덱스트란, 카복시메틸 덱스트란, 폴리아크릴아미드 및 이의 혼합물을 포함한다. 부착된 흡착제를 가진 프로브는 사용하기 위해 준비된다.

다른 실시예에서, 흡착제는 폴리머릭 또는 유리 비드와 같은 고체상을 제공하기 위해 일차 기질에 부착되며, 이는 계속하여 샘플이 흡착 검출의 흡수 에너지를 나타내도록 하기 위한 수단으로 작용하는 이차 기질에 위치한다. 예를 들어, 이차 기질은 예측된 주소화된 위치에서 순차적인 웰을 가지는 플레이트를 형성하는데 있을 수 있다. 웰은 일차 기질이 흡착제로 변형화되게 하기 위한(예로 폴리머릭 비드가 흡착제로 변형화되게 하기 위한) 용기로 작용할 수 있다. 본 발명의 실시예의 하나의 이점은 분석물질이 하나의 물리적 환경에 있는 일차 기질에 흡착될 수 있으며, 흡수 분광법에 의해 분석하기 위해 기질을 가지는 샘플에 전달될 수 있다는 것이다.

일반적으로, 기질은 흡착물질에 결합하고 흡착물질에 의해 잔존하는 분석물질을 검출하기 위해 본 발명의 방법에 사용된 검출기를 이용하는 용도로 적용될 수 있다. 한 실시예에서, 기질은 흡수 검출기로 제거 가능하게 삽입되며, 흡수 검출기에서 에너지 원천은 스팟을 칠 수 있으며 분석물질을 흡수할 수 있다. 기질은 수직적 및/또는 수평적으로 전환가능한 운반체에 마운팅(mounting)하기에 적당하며, 상기 운반체는 에너지 원천에 의해 질문(interrogation)하고 이에 결합한 분석물질을 검출하기 위해 수직적 및/또는 수평적으로 기질을 움직임으로써, 흡착제의 각각의 예측된 주소화된 위치에 성공적으로 위치하게 한다. 기질은 일반적인 질량 분광법 프로브의 형태에 있을 수 있다.

스트립(strip), 플레이트 또는 기질의 프로브는 일반적인 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 그리고 난 후, 흡착제는 분석물질을 포함하는 샘플로 접촉되기 전에 기질에 직접적 또는 간접적으로 연결되고, 맞춰지며, 또는 위치할 수 있다. 흡착제는 어떤 적당한 접착 또는 변형화 수단을 사용함으로써 기질에 직접적 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 흡착제가 공유 또는 비공유 결합을 통해 기질에 직접적으로 결합하게 하기 위해 흡착제로 기질을 변형함으로써, 흡착제는 기질에 직접적으로 연결될 수 있다.

흡착제가 기질에 결합하는 것은 다양한 작용 기작을 통해 수행될 수 있다. 미리 준비된 흡착제 분자를 기질에 부착함으로써 기질은 완벽하게 준비된 흡착제 분자로 변형될 수 있다. 선택적으로, 흡착제는 전구 분자를 기질에 결합시키고, 그리고 난 후 첫 번째 전구 분자에 의해 추가적인 전구 분자를 기질에 결합한 자라나는 쇄(chain)에 첨가함으로써, 기질 상에 형성될 수 있다. 구체적으로, 기질상에 흡착제를 세우는(building) 이러한 기작은 흡착제가 폴리머, 구체적으로 DNA 또는 RNA 분자와 같은 생폴리머일 때에 유용하다. 생폴리머 흡착제는 기질에 부착된 첫 번째 염기에 염기를 성공적으로 추가함으로써 제조될 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드 칩 기술 분야에 알려진 방법을 사용함으로써 수행할 수 있다. 예로, 미국 특허 제 5,445,934호(Fodoret al.,)를 참고하면 된다.

두 개 정도의 소수 및 10, 100, 1,000, 10,000 또는 그 이상과 같은 많은 수의 흡착제는 하나의 기질에 연결될 수 있다. 흡착 부위의 크기는 실험 계획과 목적에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 집진(impinging) 에너지 원천의 직경(예, 레이저 스팟 직경)보다 클 필요는 없다. 스팟은 유사하거나 또는 다른 흡착제를 지속할 수 있다. 어떤 경우에 있어서, 이는 다양한 다른 용출액에 대항하여 측정되도록 하거나 기질상의 복합적 위치에 있는 유사한 흡착제를 제공하는 이점이 있으며 또는 결합한 분석물질이 이차적 공정에서 추후 사용하거나 또는 참조하기 위해 제공된되는 이점이 있다. 다양한 다른 흡착제를 가진 기질을 제공함으로써, 다른 흡착제를 각각의 단일 샘플로 결합시키는 것으로 제공되는 다양한 결합 특성을 이용하는 것이 가능하며, 이에 의해 광범위하고 다양한 다른 분석물질을 결합하고 검출할 수 있다. 단일 샘플을 측정하기 위해 기질에 존재하는 다양한 다른 흡착제를 사용하는 것은 각각이 다른 크로마토그래피 컬럼과 함께 있는 복합적 크로마토그래피 실험을 동시에 수행하는데 필수적이다. 그러나, 본 발명의 방법은 오직 하나의 시스템 만을 요구하는 이점이 있다.

구체적으로, 기질이 다양한 흡착제를 포함할 때에는, 예측된 주소화된 위치에 있는 흡착제를 제공하는데 유용하다. 예측된 주소화된 위치에 있는 흡착제를 제공함으로써, 첫 번째 용출액을 사용하여 첫 번째 예측된 주소화된 위치에 있는 흡착제를 세척하고, 두 번째 용출액을 사용하여 두 번째 예측된 주소화된 위치에 있는 흡착제를 세척하는 것이 가능하다. 이러한 방법에 있어서, 분석물질에 대한 단일 흡착제의 결합 특성은 복합 용출액의 존재 아래 측정될 수 있으며, 용출액 각각은 다른 방법으로 흡착제의 결합 특성을 선택적으로 변형한다. 주소화된 위치는 어떠한 형태로든 배열될 수 있지만, 선, 직각 어레이 또는 원과 같이 일정한 곡선과 같은 일정한 형태인 것이 바람직하다. 유사하게, 기질이 다양한 다른 흡착제를 포함할 때에는, 용출액의 존재하에서 주어진 흡착제의 결합 특성을 측정하기 위해 각각의 다른 흡착제에 대항하는 단일한 용출액을 측정하는 것이 가능하다. 또한, 다른 용출액의 존재하에서 다른 흡착제의 결합 특성을 측정하는 것이 가능하다.

증가적 또는 경사적 흡착제 표면: 다른 결합 특성을 가진 흡착제의 연속은 기질상에 있는 다양한 다른 폴리머릭 흡착제를 합성함으로써 제공될 수 있다. 다른 폴리머릭 흡착제는 전구 분자를 기질에 부착시키고, 폴리머화 반응을 시작하며, 각각의 흡착제에 대한 다양한 완성도 정도에서 폴리머화 반응을 중단시킴으로써 제공될 수 있다. 또한, 폴리머에 있는 말단의 작용기는 화학적으로 변형화하는 반응이 수행될 수 있으며, 이에 의해 다른 친화제(예, -NH₃또는 COO-)로 다양화된다. 폴리머화 반응 또는 변형화 반응을 중단시킴으로써, 다양한 수준의 폴리머화 또는 변형화된 흡착제가 생산된다. 다양한 수준의 폴리머화 또는 변형화는 각각의 다른폴리머릭 흡착제를 위한 다른 결합 특성을 제공한다. 구체적으로 본 실시예는 기질에 있는 다양한 다른 생폴리머 흡착제를 제공하는데 유용하다.

만약에 필요하다면, 폴리머화 반응은 기질 자체에서 보다는 반응 용기안에서 수행된다. 예를 들어, 다양한 결합 특성을 가진 폴리머릭 흡착제는 폴리머화/변형화 반응을 진행시킴으로써 반응 용기로부터의 분배된 생성물을 추출하여 제공될 수 있다. 폴리머화/변형화 반응 동안 다양한 시점에서 추출된 분배물은 다양한 다른 흡착제를 생산하기 위해 다양한 폴리머화/변형화 정도를 가질 것이다. 그리고 난 후 생성물의 다른 분배물은 다른 결합 특성을 가진 흡착제로 사용될 수 있다. 선택적으로, 반응을 중지하는 단계, 생성물의 분배물을 회수하는 단계, 폴리머화/변형화 반응을 다시 시작하는 단계를 반복함으로써 다양한 다른 흡착제가 제공될 수 있다. 각각의 중단 시점에서 추출된 산물은 다양한 폴리머화/변형화 정도를 가질 것이며, 그 결과 다른 결합 특성을 가진 다양한 흡착제를 제공할 것이다.

한 실시예에서, 기질은 흡착제로 코팅된 스트립 또는 플레이트의 형태로 제공되며, 하나 또는 그 이상의 결합 특성은 일차원적 또는 이차원적 경사에 따라 다양하다. 예를 들어, 스트립은 한쪽 끝에 약한 소수성을 띄고 다른쪽 끝에 강한 소수성을 띄는 흡착제를 가진 상태로 제공된다. 또는, 플레이트는 한쪽 코너에서 약한 소수성과 음이온성을 띄고 대각선 반대쪽 코너에서 강한 소수성과 음이온성을 띄도록 제공된다. 이러한 흡착 경사는 분석물질의 정량적 분석에 용이하게 사용된다. 흡착 경사는 조절된 분사 적용을 하거나 또는 시간-의존적 방법으로 물질을 표면을 가로질러 흐르게 하는 것을 통해 경사면을 통해 반응이 증가되게 함으로써형성될 수 있다. 이러한 과정은 직각에서, 다른 결합 특성을 가진 유사하거나 또는 다른 흡착제가 직각 경사를 갖도록 제공하기 위해 반복될 수 있다.

분석물질을 포함하는 샘플은 이는 분석물질과 흡착제 사이를 결합할 수 있게 하는 적당한 방법을 사용하여 기질상에 흡착제가 위치하기 전 또는 그 이후에 접촉될 수 있다. 흡착제는 간단하게 샘플과 첨가혼합되거나 결합될 수 있다. 샘플에 기질을 완전히 담그거나 또는 적시고, 또는 샘플에 기질을 살짝 담그거나, 또는 샘플을 기질에 분사하는 것에 의해, 또는 샘플에서 기질을 세척하는 것에 의해, 또는 흡착제와 접착한 것에서 샘플 또는 분석물질을 생성하는 것에 의해 샘플은 흡착제에 접촉될 수 있다. 게다가, 용출액에서 샘플을 녹이거나 용출액으로 샘플을 혼합하고, 상기에서 기재된 기술(즉, 담그기, 적시기, 살짝 담그기, 분사하기 또는 세척하기) 중의 어느 하나를 사용하여 용출액과 샘플을 접촉시킴으로써, 샘플은 흡착제에 접촉될 수 있다.

분석물질을 흡착제에 접촉시키기: 분석물질을 흡착제에 결합시키기 전에 샘플을 용출액에 노출시키는 것은 샘플을 동시에 흡착제에 결합시키는 동안 흡착제를 선택적으로 변형시키는데 효과적이다. 이러한 샘플의 성분은 흡착제에 결합할 것이며, 이에 의해 잔존하는 것은 흡착제의 선별성을 변형하여 용출 특성이 부재할 때에 흡착제에 결합하는 모든 성분이기보다는 샘플과 결합하는 각각의 용출액이 존재할 때에 흡착제에 결합하는 이런 단일의 성분 포함할 것이다.

샘플은 분석물질이 흡착제에 결합하도록 허락하는 충분한 시간 동안 흡착제에 접촉되어야 한다. 일반적으로, 샘플은 약 30초 내지 약 12시간 동안 분석물질과 접촉된다. 바람직하게는, 샘플은 약 30초 내지 약 15분 동안 분석물질과 접촉된다.

샘플이 흡착제에 접촉하는 온도는 선택된 특정 샘플 및 흡착제의 기능이다. 일반적으로, 샘플은 주변의 온도와 압력 조건 아래 흡착제에 접촉되지만, 어떠한 샘플을 위해서는 변형된 온도(일반적으로 4℃ 내지 37℃) 및 압력 조건이 바람직하며, 이는 당업자에 의해 손쉽게 선택될 수 있다.

일반적인 검출 기술을 능가할 수 있는 본 발명의 다른 이점으로는, 수많은 다른 실험 기법을 다양한 소량의 샘플에 적용할 수 있다는 것이다. 일반적으로, 약 1 ㎕ 내지 500 ㎕의 부피에 수 아톰몰(atommole) 내지 100 피코몰의 분석물질을 포함하는 샘플의 부피는 흡착제에 결합하는데 충분하다. 분석물질은 흡착제에 결합한 후에 추가의 실험을 수행하기 위해 보존될 수 있는데, 왜냐하면 잔존하는 분석물질 모두를 흡착하고 검출하는 단계로 주입되지 않는 어떠한 흡착제 위치는 이의 분석물질에 잔존할 것이기 때문이다. 따라서, 샘플의 오직 다양한 소량 분획이 분석을 위해 사용가능한 경우에 있어서, 본 발명은 다른 흡착제 및/또는 용출액을 이용하여 샘플의 낭비 없이 다른 시간에서도 다양한 실험을 수행할 수 있다는 이점을 제공한다.

용리액으로 흡착제를 세척하기: 샘플이 분석물질로 접촉되고 난 후, 분석물질은 흡착제에 결합되게 되며, 흡착제는 용리액으로 세척된다. 일반적으로, 복합면의 분석을 제공하기 위해, 각각의 흡착제 위치는 최소한 하나 및 두 개의 다른 용출액으로 세척된다. 용출액으로 세척하는 것은 특정화된 흡착제 상에 잔존하는분석물질 군을 변형한다. 흡착제의 결합 특성과 용출액의 용출 특성을 결합하는 것은 선택적인 조건을 제공하며, 이에 의해 세척하고 난 뒤 흡착제에 의해 잔존하는 분석물질을 조절한다. 따라서, 세척하는 단계는 흡착제로부터 샘플 성분을 선택적으로 제거한다.

세척 단계는 다양한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같이, 샘플은 흡착제에 접촉되기 전에 첫 번째 용출액에 용해되거나 또는 첫 번째 용출액으로 혼합될 수 있다. 샘플을 흡착제에 접촉하는 동시에 또는 접촉하기 전에 첫 번째 용출액에 샘플을 노출시키는 것은 분석물질을 흡착제에 결합하고 지속적으로 첫 번째 용출액으로 흡착제를 세척하는 유사한 효과를 가진다. 결합된 용액이 흡착제에 접촉되고 난 후 흡착제는 두 번째 또는 계속되는 용출액으로 세척될 수 있다.

결합한 분석물질을 가지고 있는 흡착제를 세척하는 것은 결합한 흡착제와 분석물질을 가지고 있는 기질을 용출액에 완전히 담그고, 적시거나 또는 살짝 담금으로써; 또는 기질을 용출액으로 헹구고, 분사하거나 또는 세척함으로써 수행될 수 있다. 용출액을 작은 직경의 스팟을 갖는 친화제로 도입하는 것은 마이크로플루이딕(microfluidic) 과정을 통해 수행하는 것이 가장 바람직하다.

분석물질이 오직 하나의 위치 및 다양한 다른 위치에서 흡착제에 결합할 때는, 용출액이 세척 단계에서 사용되며, 각각의 용출액이 존재하는 상태에서의 흡착제의 선택성을 판별하는 정보가 획득될 수 있다. 하나의 위치에서 흡착제에 결합한 분석물질은 첫 번째 용출액으로 세척하고, 흡착하며, 잔존하는 분석물질을 검출하며, 그리고 난 뒤 두 번째 용출액으로 세척하고, 흡착하며, 잔존하는 분석물질을 검출하는 패턴을 반복함으로써, 용출액을 이용한 각각의 세척 후에 측정될 수 있다. 세척하고, 그리고 난 뒤 흡착하고 검출하는 단계는 유사한 흡착제를 사용하는 다양한 다른 용출액을 위해 순차적으로 반복될 수 있다. 이런 방법에 있어서, 각각의 개별 세척후에 잔존하는 분석물질을 측정하는 정보의 집합을 제공하기 위해 단일 위치에 잔존하는 분석물질을 가진 흡착제는 다양한 다른 용출제로 재실험할 수 있다.

또한, 상기에 기재된 방법은 흡착제가 유사하거나 다르더라도 예측된 주소화된 위치의 다양성에서 흡착제가 제공될 때에 유용하다. 그러나, 분석물질이 다양한 위치에서 유사하거나 또는 다른 흡착제에 결합하면, 세척하는 단계는 유사한 과정에 관여하는 더욱 더 체계적이고 효율적인 시도를 사용해 선택적으로 수행될 수 있다. 다시 말해서, 세척하는 단계는 용출액을 사용하여 첫 번째 위치에서 흡착제를 세척하고, 그리고 나서 용출액으로 두 번째 흡착제를 세척하며, 그리고 나서 첫 번째 흡착제에 의해 잔존하는 분석물질을 흡착하고 검출하며, 이차 흡착제에 의해 잔존하는 분석물질을 흡착하고 검출함으로써 수행될 수 있다. 다르게 말하면, 모든 흡착제는 용출액으로 세척되며, 그리고 난 후 각각에 의해 잔존하는 분석물질은 흡착제의 각 위치에서 흡착되고 검출된다. 각각의 흡착제 위치에서 검출되고 난 뒤에는, 각각의 흡착제 위치에서의 세척하는 두 번째 단계는 그 이후에 수행하는 흡착하고 검출하는 두 번째 단계로 진행되는 것이 바람직하다. 모든 흡착제 위치를 세척하는 단계, 그 이후의 각각의 흡착제 위치에서의 흡착과 검출은 다양한 다른 용출액에 따라 반복될 것이다. 이러한 방법에 있어서, 전체 어레이는 샘플에 있는 분석물질의 특성을 효과적으로 확인하기 위해 사용될 수 있다. 이 방법은 첫 번째 세척 단계에서 모든 흡착제가 유사한 용출액으로 세척되거나 또는 첫 번째 세척 단계에서 다양한 흡착제가 다양한 다른 용출액으로 세척되든지 간에 유용하다.

검출

세척하고 난 뒤에 흡착제에 의해 잔존하는 분석물질은 기질에 흡착한다. 기질에 잔존하는 분석물질은 흡수 분광법: 흡착제로부터 분석물질을 흡수하고 직접적으로 흡수된 분석물질을 검출하는 방법에 의해 검출된다.

흡수 방법: 흡착제로부터 분석물질을 흡수하는 것은 분석물질을 적당한 에너지 원천에 노출시키는 것을 포함한다. 이것은 종종 방사능 에너지 또는 에너지 입자로 분석물질을 충돌시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 에너지는 레이저 에너지(예, UV 레이저)의 형태에 있는 빛 에너지 또는 플래시 램프로부터의 에너지가 될 수 있다. 선택적으로, 에너지는 고속 원자의 흐름이 될 수 있다.

직접적으로 분석하기 위한 분석물질의 흡수 및/또는 이온화 방법은 당해 기술에 잘 알려져 있다. 이러한 방법 중의 하나는 매트릭스로 보조장치된 레이저 흡수/이온화 또는 MALDI로 불린다. MALDI에서 분석물질 용액은 매트릭스 용액으로 혼합되며, 이 혼합액은 비활성의 프로브 포면에 위치한 후에 결정화하하고, 흡수 가능한 결정내부에서 분석물질을 트랩(trap)하게 한다. 매트릭스는 레이저 에너지를 흡수하기 위해 선택되며, 명백하게 이것을 분석물질에 전달하고, 그 결과 흡수및 이온화된다. 일반적으로 매트릭스는 UV 범위에서 흡수한다. 큰 단백질을 위한 MALDI는 예를 들어 미국 특허 제 5,118,937호(Hillenkampet al.,) 및 미국 특허 제 5,045,694호(Beavis and Chait)에 기재된 것을 참고하면 된다.

표면-강화된 레이저 흡수/이온화, 또는 SELDI는 특이적, 선택적 및 민감적인 개념에 있어서 MALDI를 넘어서는 상당한 이점을 가지는 것으로 나타내어진다. SELDI는 미국 특허 제 5,719,060호(Hutchens and Yip)에 기재되어 있다. SELDI는 분석물질이 표면상에 있는 에너지 흐름에 존재하여 분석물질의 포착 및/또는 흡수를 증진시키는 흡수하기 위한 고체상 방법이다. 대조적으로, MALDI는 분석물질이 액체 물질과 혼합되어 분석물질 주위에 결정화되는 액체상 방법이다.

SELDI의 하나의 버전은 SEAC(표면-증진된 친화도 포착)(Surface-Enhanced Affinity Capture)로 불리며, 이는 친화도 포착된 기기(즉, 흡착제)와 연관되어 있는 흡수 에너지에 분석물질을 나타나게 하는데 관여한다. 분석물질이 흡착될 때에는 표적 분석물질의 흡수를 가능하게 하기 위한 더 많은 기회를 가진 에너지 원천을 흡수하기 위해 존재함을 확인하였다. 에너지 흡수 물질은 흡수를 돕기 위해 프로브에 첨가된다. 그리고 나면 프로브는 분석물질을 흡수하기 위한 에너지 원천에 존재한다.

SELDI의 다른 버전은 SEND(표면-증진된 순수 흡수)(Surface-Enhanced Neat Desorption)로 불리며, 이는 위치하는 분석물질에 있는 에너지 흡수 물질의 사용에 관련되어 있다. 기질 표면은 표면에 화학적으로 결합하거나/또는 결정이 완전히 없는 에너지 흡수 분자의 레이어(layer)를 포함한다. 그리고 나서, 분석물질은 이와 실제적으로 혼합되지 않은 상태로, 레이어의 표면에 단독으로(즉, 순수하게) 적용된다. 매트릭스로 작용하는 에너지 흡수 분자는 흡수 에너지를 흡수하여 분석물질이 흡수되게 한다. 분석물질이 더 단순하고 더 균등한 방법에서 에너지 원천으로 존재할 수 있고, 용액 혼합물의 형성과 무작위적 결정화가 제거되기 때문에 이러한 향상은 실제적이다. 이는 훨씬 더 단일한 형태 및 예측가능한 형태를 제공하며, 공정의 자동화를 가능하게 한다. 에너지 흡수 물질은 통상적인 매트릭스 물질이 될 수 있으며 또는 이의 pH가 중성화되거나 염기성 범위로 유도되는 매트릭스 물질이 될 수 있다. 에너지 흡수 물질은 공유결합 또는 비공유결합을 통해 프로브에 결합될 수 있다.

SELDI의 다른 버전은 SEPAR(표면-증진된 광불안정성 부착 및 분비)(Surface-Enhanced Photolabile Attachment and Release)로 불리며, 이는 광불안정성 부착 분자의 사용과 관련되어 있다. 광불안정성 부착 분자는 고체상에 공유결합한 하나의 위치 및 친화제 또는 분석물질로 공유결합할 수 있는 두 번째 위치를 가지는 다중성(divalent) 분자이며, 상기 고체상은 하나의 위치가 평면의 프로브 표면 또는 프로브의 일부를 만들 수 있는 비드와 같은 다른 고체상이다. 또한, 광불안정성 부착 분자가 표면 및 분석물질 모두에 결합될 때에, 광불안정성 부착 분자는 광불안정성 결합을 포함하며, 흡착제 또는 분자를 분비함으로써 빛에 노출되게 한다. 광불안정성 결합은 부착한 분자내부에 있거나 분석물질(또는 친화제) 또는 프로브 표면에 부착하게 하는 위치에 있을 수 있다.

분석물질을 직접적으로 검출하는 방법: 흡수된 분석물질은 어떤 방법에 의해서도 검출될 수 있다. 분석물질이 레이저 흡수/이온화 질량 분광법에서와 같이 흡수 과정에서 이온화될 때에, 검출기는 이온 검출기가 될 수 있다. 일반적으로 질량 분광기는 흡수된 이온의 흐름-시간을 측정하기 위한 수단을 포함한다. 이러한 정보는 질량으로 전환된다. 그러나, 분해되고 검출되어야 하는 흡수된 이온의 질량을 측정할 필요는 없다: 이온화된 분석물질이 다른 시간에 검출기에 부딪히는 것이 이의 검출과 분해를 제공한다는 사실.

선택적으로, 분석물질은 예를 들어 형광 모이어티 또는 방사능 모이어티를 사용하여 표지됨으로써 검출가능하다. 이러한 경우에 있어서, 검출기는 형광 또는 방사능 검출기가 될 수 있다.

검출 수단의 다양성은 어레이에 있는 각각의 위치에서 정체(retentate)로 연결된 분석물질의 성분과 기능을 연속적으로 완전히 질문(interrogate)하기 위해 이행가능하도록 한다.

흡수 검출기: 흡수 검출기는 흡착제로부터 분석물질을 흡수하기 위한 수단 및 흡수된 분석물질을 직접적으로 검출하기 위한 수단을 포함한다. 즉, 흡수 검출기는 다른 고체상에서 분석물질을 포착하고 이를 연속적인 분석에 주입하는 중간 단계 없이 흡수된 분석물질을 검출한다. 정상적으로 분석물질을 검출하는 것은 신호 강도를 검출하는 것을 포함한다. 번갈아 이는 흡착제에 흡착된 분석물질의 양을 반영한다.

또한 이러한 두 개의 성분을 넘어서, 흡수 검출기는 다른 성분을 포함할 수 있다. 이런 하나의 성분은 흡수된 분석물질을 검출기 쪽으로 가속화하는 수단이다. 다른 성분은 검출기를 이용하여 검출하기 위해 흡수된 것으로부터 분석물질의 흐름-시간을 측정하기 위한 수단이다.

바람직한 흡수 검출기는 레이저 흡수/이온화 질량 분광기이며, 이는 당해 기술에 잘 알려져 있다. 질량 분광기는 흡착된 분석물질을 운반하는 기질로의 포트(port)를 포함하며, 예로, 삽입되는 프로브가 있다. 흡수는 레이저 에너지와 같은 에너지로 분석물질을 강타하게 함으로써 수행될 수 있다. 기기는 표면을 전환하기 위한 수단을 포함할 수 있으며, 이는 어레이 상에 있는 어떠한 스팟이든 레이저 빔을 사용하여 선형으로 바뀔 수 있다. 분석물질을 레이저로 강타하는 것은 접촉한 분석물질을 흡수하여 이를 흐름 튜브로 들어가게 하며, 이를 이온화하는 결과를 나타낸다. 일반적으로 흐름 튜브는 압력 공간으로 정의된다. 압력 튜브의 일부분에 있는 전기화된 플레이트는 전기적 전위를 형성하며, 이는 이온화된 분석물질을 검출기쪽으로 가속화하게 한다. 시계는 흐름-시간을 측정하고, 시스템 일렉트로닉스는 분석물질의 속도를 측정하여 이를 질량으로 전환시켜준다. 당업자라면 누구든지 이러한 구성성분이 본원에 기재된 흡수, 가속화, 검출, 시간의 측정 등과 같은 다양한 수단을 포함하는 흡수 검출기의 조립품에 있는 다른 구성 성분과 혼합될 수 있다는 것을 용이하게 이해할 수 있다.

선택적 조건

본 발명의 한가지 장점은 분석물질을 다양한 다른 결합 및 용출 조건에 노출시킬 수 있는 능력이며, 이에 의해 분석물질의 증가된 해상도 및 인식 프로파일의형태에서의 이에 대한 정보를 모두 제공한다. 통상적인 크로마토그래픽 방법에 있어서, 흡착제를 분석물질에 남아있게 하는 능력은, 흡착제에 대한 분석물질의 인력 또는 친화력을 용출액 또는 흡착물질을 위한 용출액에 대한 분석물질의 인력 또는 친화력과 비교하는 것과 직접적으로 관련되어 있다. 샘플의 어떤 성분은 흡착제에 대한 친화력을 가지고 있지 않을 것이며, 이에 의해 샘플이 흡착제에 접촉될 때에는 흡착제와 결합하지 않을 것이다. 흡착제에 대해 결합하지 않는 능력 때문에, 이러한 성분은 분석되고자 하는 분석물질로부터 직접 분리될 것이다. 그러나, 샘플 및 사용되는 개별적인 흡착제의 특성에 따라, 하나의 다른 성분은 흡착제에 먼저 결합할 수 있다.

흡착제

흡착제는 분석물질에 결합하는 물질이다. 흡착제의 다양성은 정체 크로마토그래피에 포함될 수 있다. 다른 흡착제는 전체적인 다른 결합 특성을 가질 수 있으며, 때때로 다른 결합 특성 또는 부분적으로 다른 결합 특성을 가질 수 있다. 일반적으로 전체적으로 다른 결합 특성을 가지는 흡착제는 이의 인력의 기초 또는 상호관계의 작용이 다르다. 일반적으로 인력의 기초는 화학적 또는 생물학적 분자 인식 기능을 한다. 흡착제 및 분석물질 사이의 인력의 기초는 예를 들어 하기를 포함한다. (1) 염-조성된 상호 작용, 예, 소수성 작용, 친황적(thiophilic) 작용 및 변형된 염료 작용; (2) 수소 결합 및/또는 반 데르 발스 상호 작용 및 친수성 작용의 경우에 있는 전하 전달 작용; (3) 이온 전하 작용과 같은 정전기적 작용,바람직하게는 양이온 또는 음이온 전하 작용; (4) 분석물질이 흡착제에 있는 금속 이온과 공유결합(즉, 상호적 복합 형성)을 형성할 수 있게 하는 능력; (5) 효소-활성 부위 결합; (6) 역상 공유 작용, 예로 이황 교환 작용; (7) 글리코단백질 작용; (8) 생특이적 작용; 또는 (9) 상기 기재된 작용의 두 개 또는 그 이상의 혼합. 즉, 흡착제는 두 개 또는 그 이상의 인력의 기초를 형성할 수 있으며, 따라서 "혼합된 작용" 흡착제로 잘 알려져 있다.

염-조성된 작용 흡착제: 흡착제는 소수성 작용 흡착제를 포함하는 염-조성된 작용을 관찰하는데 유용하다. 소수성 작용 흡착제의 예는 알리파틱 하이드로카본, 특히 C1-C18 알리파틱 하이드로카본을 가지는 매트릭스; 및 페닐기와 같은 아로마틱 하이드로카본 작용기를 가지는 매트릭스를 포함한다. 소수성 작용 흡착제는 아미노산 잔기에 노출된 비전하된 용매를 포함하는 분석물질과 결합하며, 구체적으로 아미노산 잔기는 통상적으로 페닐알라닌 및 트립토판과 같은 비극성, 아로마틱 및 소수성 아미노산 잔기로 불린다. 소수성 작용 흡착제로 결합되는 분석물질에 대한 특정 실시예는 라이소자임 및 DNA를 포함한다. 개별적 가설에 의해 결합되지 않는다면, DNA는 DNA에 있는 아로마틱 뉴클레오타이드, 특히 퓨린 및 피리미딘 그룹에 의해 소수성 작용 흡착제로 결합될 것이다.

다른 흡착제는 예를 들어 피어스사(Pierce, Rockford, Illinois)로부터 상업적으로 사용가능한 호황성 흡착제의 하나의 형태인 T-GEL^®과 같은 호황성 작용 흡착제를 포함하는 염-조성된 작용을 관찰하는데 유용하다. 예를 들어, 호황성 작용흡착제는 IgG와 같은 면역글로불린과 결합한다. IgG와 T-GEL^®사이에서의 작용 매커니즘은 완전히 알려지지 않았지만, 용매 노출된 트립토판 잔기가 작용을 할 것으로 예상된다.

세 번째 흡착제는 염-조성된 이온 작용을 포함하며, 또한, 소수성 작용은 고정된 염색 작용 흡착제를 포함한다. 고정된 염색 작용 흡착제는 예를 들어 파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey)로부터 상업적으로 이용가능한 CIBACHRONTM 블루와 같은 고정된 염색제의 매트릭스를 포함한다. 일반적으로 고정된 염색제 작용 흡착제는 단백질 및 DNA와 결합한다. 고정된 염색제 작용 흡착제에 결합하는 단백질의 한가지 특정 예는 송아지 혈청 알부민(BSA)이다.

친수성 작용 흡착제: 흡착제는 실리콘-옥사이드(즉, 유리)와 같은 정상(normal phase) 흡착제를 함유하는 표면을 포함하는 친수성 작용의 기초아래 수소 결합 및/또는 반 데르 발스력을 관찰하는데 유용하다. 정상 또는 실리콘-옥사이드 표면은 작용기로 작용한다. 추가로, 흡착제는 친수성 작용 흡착제로 작용할 수 있는 폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 아가로즈 또는 셀룰로즈와 같은 친수성 폴리머로 표면이 변형되는 것을 포함한다. 아미노산 잔기(즉, 친수성 아미노산 잔기)의 하나의 기(group) 또는 혼합은 수소 결합 또는 반 데르 발스력을 포함하는 친수성 작용을 통해 결합하기 때문에 대부분의 단백질은 친추성 작용 흡착제에 결합할 것이다. 단백질 샘플은 미오글로빈, 인슐린 및 사이토크롬 C를 포함하는 친수성 작용 흡착제와 결합할 것이다.

일반적으로, 극성 또는 전하를 띈 아미노산의 대부분의 부위를 가진 단백질은 친수성 표면에 잔존할 것이다. 선택적으로, 글리코단백질은 친수성 당 모이어티로 표면이 노출되며, 또한 친수성 흡착제를 위한 높은 친화력을 가지고 있다.

정전기적 작용 흡착제: 흡착제는 정전기 작용 또는 이온성 전하 작용을 관찰하는데 유용하며, 이온성 전하 작용은 예를 들어 설페이트 음이온(즉, SO^3-)의 매트릭스 및 카복실레이트 음이온(즉, COO^-) 또는 포스페이트 음이온(OPO^3-)의 매트릭스와 같은 음이온성 흡착제를 포함한다. 설페이트 음이온을 가지는 매트릭스는 영구적으로 음전하된다. 그러나, 카복실레이트 음이온을 가지는 매트릭스는 그의 pKa보다 높은 pH에서만 음전하된다. pKa보다 낮은 pH에서, 매트릭스는 실제적으로 중성전하가 된다. 또한, 적당한 음이온성 흡착제는 설페이트 및 카복실레이트 음이온 및 포스페이트 음이온이 혼합되어 포함된 매트릭스인 음이온성 흡착제를 포함한다. 상기 혼합되는 것은 음전하의 강도를 제공하며, 이는 pH의 기능으로써 지속적으로 달라질 수 있다. 이러한 흡착제는 리보뉴클레아제와 락토페린과 같은 양전하를 가진 단백질 및 분자와 결합하고 이에 이끌린다. 개별적 가설에 의해 결합되지 않는다면, 흡착제와 양전하된 아미노산 잔기 사이에서 정전기적 상호 작용이 발생할 것으로 추측되며, 상기 양전하된 아미노산 잔기는 결합 작용에 필수적인 라이신 잔기, 아르기닌 잔기 및 히스티딜 잔기를 포함한다.

다른 흡착제는 정전기적 작용 또는 양이온성 흡착제를 포함하는 이온성 전하 작용을 관찰하는데 유용하다. 특정한 양이온성 흡착제 샘플은 이차, 삼차 또는 사차 아민의 매트릭스를 포함한다. 사차 아민은 영구적으로 양전하된다. 그러나, 이차 및 삼차 아민은 pH 의존적인 전하를 가진다. pKa보다 낮은 pH에서, 이차 및 삼차 아민은 양전하되며, pKa보다 높은 pH에서, 상기 아민은 음전하된다. 또한, 적당한 양이온성 흡착제는 다른 이차, 삼차 및 사차 아민의 혼합을 포함하는 매트릭스인 양이온성 흡착제를 포함한다. 상기 아민의 혼합은 양전하의 강도를 제공하며, 이는 pH의 작용에 따라 지속적으로 달라질 수 있다. 양이온성 작용 흡착제는 단백질을 포함하는 분자의 음이온성 부위에 결합하며, 상기 단백질은 아스파틱산 및 글루타민산 잔기와 같은 아미노산 잔기에 노출된 용매를 가진다.

이온성 작용 흡착제(음이온성 및 양이온성 모두)의 경우에 있어서는, 종종 음이온 및 양이온 모두를 포함하는 혼합된 이온성 흡착제를 사용할 필요가 있다. 그러한 흡착제는 pH의 작용으로 계속적인 버퍼 작용을 제공한다. 계속적인 버퍼 작용은 분석물질의 혼합을 용출액으로 노출되게 하며, 용출액은 특히 2 내지 11까지의 pH 범위에서 다른 버퍼 성분을 포함한다. 이는 흡착제상에 있는 부분적 pH 환경을 제공하는 결과를 나타내며, 이는 고정된 적정가능한 양자 교환기에 의해 정의된다. 이러한 시스템은 크로마토포커싱(chromatofocusing)으로 알려져 있는 고체상 분리 기술과 동일하다. 난포 자극 호르몬 이성체는 크로마토포커싱 흡착제상에서 분리되는 전하된 카보하이드레이트 구성성분에서 주로 다르다.

여전히, 다른 흡착제는 쌍극-쌍극 작용 흡착제를 포함하는 정전기적 작용을 관찰하는데 유용하며, 상기 작용은 정적기력이 관련되지만 어떠한 형식적 전하 또는 적정가능한 단백질 공여자 또는 수여자도 관련되지 않는다.

배위(coordinate) 공유 작용 흡착제: 흡착제는 매트릭스 베어링을 포함하는 금속 이온, 예로 2가 및 3가 금속 이온으로 배위 공유 결합을 형성하기 위한 능력을 관찰하는데 용이하다. 고정된 금속 이온 킬레이터의 매트릭스는 하나 또는 그 이상의 전자 공여기를 가진 고정된 합성 유기 분자를 제공하며, 전위 금속 이온으로 배위 공유 결합하는 기초를 형성한다. 일차 전자 공여 기는 산소, 질소 및 황을 포함하는 고정된 금속 이온 킬레이터로서 작용을 한다. 금속 이온에 고정된 금속 이온 킬레이터가 결합하게 되면 분석물질에 있는 전자 공여기와 작용을 할 수 있는 수개의 잔여 부위를 가진 금속 이온 복합체를 형성하는 결과를 낳는다. 일반적으로 적당한 금속 이온은 구리, 니켈, 코발트, 아연, 철 및 다른 금속 이온(알루미늄 및 칼슘)과 같은 전이 금속 이온을 포함한다. 어떠한 개별적 가설에 의해 결합되지 않는다면, 금속 이온은 펩타이드, 단백질 또는 핵산에 있는 특정한 아미노산 잔기와 선택적으로 상호작용 할 수 있을 것이다. 일반적으로 이러한 상호 작용에 있어서, 아미노산 잔기는 히스티딘 잔기, 티로신 잔기, 트립토판 잔기, 시스테인 잔기 및 아스파틱산과 글루타믹산과 같은 산소기를 가진 아미노산 잔기를 포함한다. 예를 들어, 고정된 철 이온은 단백질에 있는 포스포세린, 포스포티로신 및 포스포트레오닌 잔기와 상호작용한다. 고정된 금속 이온에 의존하여, 상기에 기재된 아미노산 잔기의 적당한 부분 점도를 가진 단백질은 흡착제에 의해 잔존할 것이다. 금속 이온과 단백질 사이의 상호 작용은 매우 강할 수 있으며, 단백질은 통상적인 방법에 의한 복합체로부터 제공되지 않을 것이다. 인간 β 카제인은 매우 높게 인산화되어 있으며, 고정된 Fe(Ⅲ)에 강하게 결합한다. 6-히스티딘 태그로 발현된 재조합 단백질은 고정된 Cu(Ⅱ) 및 Ni(Ⅱ)에 매우 강하게 결합한다.

효소-활성 부위 작용 흡착제: 흡착제는 효소-활성 부위 결합 작용을 하는데 유용하며, 프로테아제(트립신), 포스파타제, 키나제 및 뉴클레아제를 포함한다. 상기 상호 작용은 분석물질(일반적으로 생폴리머) 상에 있는 효소 결합 부위와 효소에 있는 촉매 결합 부위 사이의 서열-특이적 상호 작용이다. 예를 들어 이러한 형태의 효소 결합 부위는 단백질 및 펩타이드로 상호 작용하는 트립신의 활성 부위를 포함하며, 상기 단백질 및 펩타이드는 이의 서열에 리신-리신 또는 리신-아르기닌 쌍을 가지고 있다. 더 구체적으로, 콩 트립신 저해제는 고정된 트립신의 흡착제와 상호작용하고, 이에 결합한다. 세린 프로테아제는 고정된 L-아르기닌 흡착제 상에 선택적으로 잔존한다.

역상 공유 결합 작용 흡착제: 흡착제는 역상 공유 결합 작용을 관찰하는데 유용하며, 이황 교환 작용 흡착제를 포함한다. 이황 교환 작용 흡착제는 고정된 설피드릴 기, 예로 머캅토에탄올 또는 고정된 디티오트리에톨을 포함하는 흡착제를 포함한다. 상기 작용은 분석물질상에 시스테인 잔기로 노출된 흡착제와 용매 사이에서 공유 이황 결합을 형성하는데 기초한다. 이러한 흡착제는 시스테인 잔기를 가진 단백질 또는 펩타이드 및 감소된 황 화합물을 포함하기 위해 변형된 염기를 포함하고 있는 핵산과 결합한다.

글리코단백질 작용 흡착제: 흡착제는 글리코단백질 작용을 관찰하는데 유용하고, 고정된 렉틴(즉, 올리고사카라이드를 포함하는 단백질)을 가지는 흡착제와 같은 글리코단백질 작용 흡착제를 포함하며, 이에 대한 예로 파마시아 바이오테크사(Piscataway, New Jersey)로부터 상업적으로 이용가능한 CONCONAVALINTM이 있다. 이러한 흡착제는 거대분자상에 있는 카보하이드레이트 모이어티의 분자적 인식에 관련된 상호작용의 기본으로 작용한다. 분석물질의 한 예는 글리코단백질, 구체적으로 히스티딘-풍부 글리코단백질, 전체 세포 및 분리된 부분세포 분획을 포함하는 글리코단백질 작용 흡착제에 결합하고, 이와 작용한다.

생물특이적 작용 흡착제: 생물특이적 작용을 관찰하는데 유용한 흡착제는 일반적으로 "생물특이적 친화 흡착제"로 불린다. 만약 흡착제가 선택적이며 친화도(equilibrium dissociation constant, Kd)가 최소한 10^-3M까지(예, 10^-5M, 10^-7M, 10^-9M)라면 생물특이적이라고 간주된다. 생물특이적 친화 흡착제의 한 예는 특정 생분자와 특이적으로 결합하고 상호 작용하는 어떠한 흡착제라도 포함한다. 생물특이적 친화 흡착제는 예를 들어 항원에 결합한 고정된 항체; DNA 결합 단백질, DNA 및 RNA에 결합한 고정된 DNA; 단백질 및 효소에 결합한 고정된 기질 또는 저해제; 약물 결합 단백질에 결합한 고정된 약물; 수용체에 결합한 고정된 리간드; 리간드에 결합한 고정된 수용체; DNA 및 RNA 결합 단백질에 결합한 고정된 RNA; 바이오틴과 바이오틴화된 분자에 결합한 고정된 아비딘 또는 스트렙타비딘; 지질 결합 단백질에 결합한 고정된 인지질 막 및 소낭을 포함한다. 효소는 이의 분석물질 흡착제를 변형할 수 있게 하는 유용한 흡착제이다. 세포는 흡착제로 유용하다. 이의 표면에는 복합 결합 특성이 존재한다. 세포로의 흡착은 예를 들어 리간드 또는 신호 분자가 표면 수용체에 결합하는지를 확인하는데 유용하다. 또한, 바이러스 또는 파지도 흡착제로 유용하다. 종종 바이러스는 세포 표면 수용체에 대한 리간드(예, CD4에 대한 gp120)를 가진다. 또한, 파지 디스플레이 라이브러리 형태에 있어서, 피지 코팅 단백질은 표적에 대해 결합하는지를 테스트하기 위한 제제로 작용한다. 생물특이적 작용 흡착제는 상기에 기재된 것과 같은 알려진 특이적 작용에 의존한다. 흡착제가 사용될 수 있는 생물특이적 작용의 다른 예는 당업자에 의해 손쉽게 수행될 수 있으며, 본 발명의 방법에 의해 계획될 수 있다.

한 실시예에서, 생물특이적 흡착제는 보조물 또는 "도움자"를 포함할 수 있으며, 분자는 직접적으로 표적 분석물질에 결합하지 않는다.

결합 특이성의 정도: 다른 정도의 작용을 가지는 흡착제에 노출함으로써, 샘플의 구성성분은 다른 흡착제와 상호 작용하는 것에 기초하여 전체적으로 분배될 수 있다. 따라서, 흡착제에 대한 분석물질의 인력은 다른 상호 작용 방식을 가지며 첫 번째 분리 매개 변수를 제공한다. 예를 들어, 분석물질을 포함하는 샘플을 소수성과 연관된 인력의 기본을 가진 첫 번째 흡착제 및 이온 전하와 연관된 인력으리 기본을 가진 두 번째 흡착제로 노출시킴으로써, 샘플로부터 소수성 흡착제에 결합하는 분석물질을 분리하고, 각각의 이온 전하를 가진 흡착제에 결합한 분석물질을 분리하는 것이 가능하다.

다른 인력의 기초를 가지는 흡착제는 낮은 수준의 특이성을 가진 분석물질의 분석을 제공하는데, 이는 흡착제가 분석물질 뿐만 아니라 유사한 인력의 기초에 의해 흡착제에 대해 인력을 가지는 샘플에 있는 다른 구성 성분과도 결합할 것이기 때문이다. 예를 들어, 소수성 흡착제는 소수성 분석물질에 결합할 뿐만 아니라,샘플에 있는 다른 소수성 구성 성분과도 결합할 것이고; 음전하된 흡착제는 양전하된 분석물질에 결합할 뿐만 아니라 샘플에 있는 다른 양전하된 구성성분에도 결합할 것이며; 기타 등등이 있다.

분석물질의 분석은 흡착제를 위한 분석물질의 인력의 기초에 기본을 두며, 추가로 상대적으로 중간적인 특이성의 결합 특성 또는 변형된 인력의 강도에 의해 재확인될 수 있다. 예를 들어, 중간적인 특이성의 결합 특성에 기초한 분석물질의 분석은 혼합된 기능적인 흡착제를 사용함으로써 수행 가능하다. 상대적으로 적은 특이성으로 분석물질이 한번 분석되면, 흥미있는 분석물질의 인력에 대한 결합 특성은 다양한 다른 결합 특성 및 여전히 남아있는 필요없는 성분을 제거하기 위한 용출 특성으로 혼합될 수 있으며, 이에 의해 분석물질을 분석하게 된다.

예를 들어, 만약 분석물질이 소수성 흡착제에 결합하면, 분석물질은 추후에 다른 소수성 샘플 구성성분으로부터 분석되며, 이는 하나의 인력 기초로써 소수성 작용을 나타내며 또한 두 번째 다른 인력 기초로 나타내어지는 혼합된 기능적 흡착제를 제공함으로써 수행된다. 혼합된 작용적 흡착제는 소수성 작용을 나타내고, 양전하된 소수성 분석물질에 결합하기 위해 음전하된 이온성 작용을 나타낼 수 있다. 선택적으로, 혼합된 작용적 분석물질은 소수성 작용을 나타낼 수 있으며, 소수성 분석물질에 결합하는 금속 이온으로 배위 공유 결합을 형성하는 능력이 있어서 흡착물질에 있는 금속 이온으로 배위 결합 복합체를 형성하는 능력을 가진다. 여전히 중간 특이성을 가진 결합 특성을 나타내는 다른 흡착제의 실시예는 본 명세서 및 상기에 기재된 예에 기초하여 당업자에 의해 손쉽게 수행될 수 있다.

중간적 특이성을 가진 결합 특성의 기초 아래에서의 분석물질의 분석은 상대적으로 높은 특이성을 가진 결합 특성을 나타내는 것에 의해 추후에 개선될 수 있다. 상대적으로 높은 특이성을 가진 결합 특성은 다른 강도의 인력이 아닌 유사한 인력의 기초를 나타내는 다양한 흡착제를 이용함으로써 수행될 수 있다. 다르게 말하면, 비록 인력의 기초가 유사하더라도, 추후에 다른 샘플 구성 성분으로부터 분석물질을 분석하는 것은 분석물질에 대해 다른 친화 정도를 가진 흡착제를 사용함으로써 수행될 수 있다.

예를 들어, 분석물질의 산성 조건에 기초하여 흡착제에 결합하는 분석물질은 특이적 산성 pH 범위에 있는 분석물질을 위한 친화력을 가진 흡착제를 이용함으로써 다른 산성 샘플 성분으로부터 추후에 분석될 수 있다. 따라서, 분석물질은 pH 1-2의 샘플 조성에 대해 인력을 갖는 하나의 흡착제, pH 3-4의 샘플 조성에 대해 인력을 갖는 다른 흡착제, 및 pH 5-6의 샘플 조성에 대해 인력을 갖는 세 번째 흡착제를 사용하여 분석될 수 있다. 이런 방법에 있어서, pH 5-6의 분석물질에 결합하는 흡착제에 대해 특이적 친화력을 가진 분석물질은 pH 1-4의 샘플 조성성분으로부터 분석될 것이다. 증가하는 특이성을 가진 흡착제는 인력의 간격, 즉 유사한 인력의 기초를 나타내는 흡착제의 결합 특성 사이에서의 차이를 감소시킴으로써 이용가능하다.

일차 흡착제에 흡착하는 일차 분석물질은 그 자체가 흡착 특성을 가진다. 이런 경우에 있어서, 기질에 흡착하는 일차 분석물질은 이차 분석물질을 분리하기 위한 이차 흡착제가 될 수 있다. 번갈아서, 잔존하는 이차 분석물질은 샘플로부터삼차 분석물질을 분리하기 위해 삼차 흡착제로 작용할 수 있다. 이러한 과정은 여러번의 반복을 통해 지속될 수 있다.

용출액

용출액 또는 세척 용액은 선택적으로 분석물질과 흡착제 사이의 흡착 분계점을 변형할 수 있다. 용출액이 결합한 분석물질을 흡수하여 용출하는 능력은 이의 용출 특성에 대한 기능이다. 다른 용출액은 매우 다른 용출 특성을 나타낼 수 있으며, 때때로 다른 용출 특성을 나타내거나 부분적으로 다른 용출 특성을 나타낸다.

용출액이 흡착제에 접촉하였을 때의 온도는 각각의 샘플과 선택된 흡착제의 기능이다. 일반적으로, 용출액은 0℃ 내지 100℃의 온도에서 흡착제에 접촉되며, 바람직하게는 4℃ 내지 37℃에서 접촉된다. 그러나, 어떤 용출액에 대해서는 변형된 온도가 적당할 수 있으며 이는 당업자에 의해서 손쉽게 결정될 수 있다.

흡착제의 경우에 있어서, 일반적으로 매우 다른 용출 특성을 나타내는 용출액은 이의 인력의 기초에 따라 달라진다. 예를 들어, 용출액과 분석물질 사이에는 다양한 인력의 기초가 있으며, 이는 전하 또는 pH, 이온성 강도, 물의 구조, 특정 경쟁적 결합 제제의 농도, 표면 장력, 유전체 상수 및 상기 기재된 것의 둘 또는 그 이상의 혼합을 포함한다.

pH를 기본으로 하는 용출액: 용출액은 알려진 pH 완충액, 산성 용액 및 염기성 용액을 포함하는 pH(즉, 전하)에 기초한 흡착제의 선택성을 변형한다. 주어진흡착제에 결합한 분석물질을 특정 pH 완충액으로 세척함으로써, 전하는 변형되며, 이에 의해 특정 pH 완충액의 존재아래에 있는 흡착제와 분석물질 사이의 결합의 강도는 변화될 것이다. 용출액의 pH에서 흡착제에 대한 것이 다른 것보다 훨씬 덜 경쟁적인 분석물질은 흡착제로부터 흡수되고 용출될 것이며, 용출액의 pH에서 흡착제에 훨씬 더 강하게 결합하는 오직 하나의 분석물질이 결합하도록 남겨둘 것이다.

이온 강도를 기본으로 하는 용출액: 이온성 강도에 대하여 흡착제의 선택성을 변형하는 용출액은 다양한 형태 및 농도의 염 용액을 포함한다. 용출용액에 용해되어 있는 염의 양은 용출액의 이온성 강도에 영향을 주며, 이에 상응하는 흡착제 결합 능력을 변형시킨다. 저농도의 염을 포함하는 용출액은 이온 강도에 대하여 흡착제 결합 능력의 근소한 변형을 제공한다. 고농도의 염을 포함하는 용출액은 이온성 강도에 대하여 흡착제 결합능력의 큰 변형을 제공한다.

물의 구조를 기본으로 하는 용출액: 용출액은 물의 구조 또는 유레아와 카오트로픽 염 용액을 포함하는 농도의 변형에 의해 흡착제의 선택성을 변형한다. 일반적으로, 유레아 용액은 예를 들어 0.1 내지 8 M의 농도 범위에 있는 용액을 포함한다. 카오트릭픽 염은 소듐 티오시아네이트(thiocyanate)를 포함하는 용출액을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 물의 구조를 기본으로 하는 용출액은 수화 또는 결합된 물의 구조에 있어서의 변형 때문에 흡착제가 분석물질에 결합하게 하는 능력을 변형한다. 이러한 형태의 용출액은 예를 들어 글리세롤, 에틸렌 글리콜 및 유기성 용매를 포함한다. 카오트로픽 음이온은 비극성 모이어티의 수용성을 증가시키며, 이에 의해 분석물질과 흡착제 사이의 소수성 작용을 감소시킨다.

계면활성제를 기본으로 하는 용출액: 용출액은 표면 장력 및 계면활성제와 표면활성제를 포함하는 분석물질의 구조에 대하여 흡착제의 선택성을 변형한다. 사용하기에 적당한 계면활성제는 CHAPS, TWEEN 및 NP-40과 같은 이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제를 포함한다. 계면활성제를 기본으로 하는 용출액은 계면활성제의 소수성 및 친수성 기가 도입될 때에 변형되고자 하는 소수성 작용으로서 분석물질에 결합하게 하기 위해 흡착제의 능력을 변형시킨다. 분석물질과 흡착제 사이 및 분석물질 내부에서의 소수성 작용은 변형되며, 전하 기(group)가 도입되는데 예를 들어, 단백질은 SDS와 같은 이온성 계면활성제에 의해 변성된다.

소수성을 기본으로 하는 용출액: 용출액이 유전체 상수에 대하여 흡착제의 선택성을 변형하는 것은 이러한 용출액이 소수성 작용에 대하여 흡착제의 선택성을 변형하는 것이다. 적당한 용출액의 예는 프로판올, 아세토니트릴, 에틸렌 글리콜 및 글리세롤과 같은 유레아(0.1 - 8 M) 유기적 용매 및 상기에 언급한 것과 같은 계면활성제를 포함하는 이러한 기능에서 작용을 한다. 아세토니트릴을 용출액으로 사용하는 용도는 역상 크로마토그래피에서 일반적이다. 용출액에 에틸렌 글리콜이 포함되는 것은 티오필릭 흡착제로 염-조성된 작용으로부터 면역글로불린을 용출하는데 효과적이다.

용출액의 혼합: 적당한 용출액은 상기에 기재된 어떠한 카테고리로부터 선택될 수 있으며 상기에 기재된 용출액의 두 개 또는 그 이상을 혼합할 수도 있다. 상기 기재된 용출액을 두 개 또는 그 이상 포함하는 용출액은 복합적인 용출 특성에 기초하여 분석하기 위해 흡착제의 선택성을 변형시킬 수 있다.

두 개 매개변수의 다양성

다른 흡착제의 선택에 의해 다른 결합 특성을 제공하는 능력 및 다른 용출액으로 세척함으로써 다른 용출 특성을 제공하는 능력은 두 개의 다른 매개변수의 변형을 가능하게 하며, 상기 각각은 분석물질이 흡착제에 결합하는 것을 통해 선택성에 개별적으로 영향을 줄 수 있다. 이러한 두 개의 매개변수가 매우 다양할 수 있다는 사실은 광범위한 결합 인력 및 용출 조건을 가능하게 하므로, 본 발명의 방법은 많은 다른 형태의 분석물질을 결합하고 검출하는데 유용할 것이다.

개별적인 샘플을 분석하는데 사용하기 위해 흡착제와 용출액을 선택하는 것은 샘플 및 특정 분석물질 또는 특성화되고자 하는 분석물질의 집합의 특성, 심지어는 알려지지 않는 분석물질의 특성에 의존한다. 일반적으로, 이것은 다양한 범위의 결합 특성 및 다양한 범위의 용출 특성을 나타내는 시스템을 제공하는 장점이 있으며, 특히 분석되고자 하는 샘플의 구성성분이 잘 알려져 있지 않을때에도 이점이 있다. 다양한 범위의 선택적인 특성을 나타내는 시스템을 제공하는 것을 통해, 하나 또는 그 이상의 흡착제에 의해 잔존하게 되는 흥미있는 분석물질은 기하급수적으로 증가할 것이다. 화학적 또는 생화학적 분석 기술 분야에 속한 당업자라면 잔존하는 개별 분석물질에 사용하기에 유용한 선택적인 조건을 결정하고, 다양한 범위의 결합 및 용출 특성을 타나내는 시스템을 제공하며, 분석물질의 가장 좋은 분석 결과를 제공하는 결합 특성 및 용출 특성을 용이하게 관찰할 수 있다. 본 발명은 광범위한 선택적 조건을 포함하는 시스템을 위해 제공되기 때문에, 주어진 분석물질에 대한 최적의 결합 및 용출 특성을 결정하는 것은 당해 기술에 속한 사람이라면 누구든지 다른 필요한 실험 없이 손쉽게 수행될 수 있다.

분석물질

본 발명은 적당한 선택적 조건을 사용하여 분석물질의 특성을 측정함으로써, 분석물질의 다양한 생물학적, 화학적 또는 생리-화학적 특성에 기초한 분석물질의 분석을 가능하게 한다. 적당한 선택적 조건을 사용하여 측정할 수 있는 분석물질의 많은 특성에는 소수성 지표(또는 분석물질에 있는 소수성 잔기의 측정), 등전점(즉, 분석물질이 전하를 띄지 않는 pH), 소수성 모멘트(또는 분석물질의 암피파티시티 측정 또는 극성 및 비극성 잔기의 분포에 있는 비대칭의 범위), 후극성 모멘트(또는 분석물질에 잇는 전하의 분포에서 비대칭의 측정), 분자 구조 인자(분자 골격을 따라 거대하게 분포하는 측쇄와 같이 분석물질 분자의 표면부위에 있는 다양성의 측정), 이차 구조 성분(예, 헬릭스, 평형 및 비평형의 쉬트), 이황 밴드, 용매-노출된 전자 공여 기(예, His), 아로마티시티(aromathicity)(또는 분석물질에 있는 아로마틱 잔기 사이에서 pi-pi 작용을 측정) 및 전하 원자 사이의 선형 거리가 있다.

본 발명의 방법에 있는 특징을 적당히 선택함으로써, 샘플로부터 주어진 분석물질을 분석하기 위해 특성의 형태를 나타낼 수 있는 예가 제공될 수 있다. 샘플로부터 특정 분석물질을 분석하기 위한 기초를 형성할 수 있는 분석물질의 다른 적당한 특성은 당업자에 의해 손쉽게 이해하고/또는 측정될 수 있으며, 본 발명에의해 계획될 수 있다.

발명의 방법은 분석하고자 하는 샘플의 형태에 제한되지 않는다. 샘플은 고체상, 액체상 또는 기체상이 될 수 있으며, 일반적으로 샘플은 액체상에 있을 수 있다. 바람직하게는 당해 분야에 알려진 기술의 범위에 따라 고체 또는 기체 샘플은 적당한 용매로 수용화된다. 샘플은 생물학적 조성, 비-생물학적 유기 조성 또는 비유기 조성이 될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 기술은 생물학적 샘플, 특히 생물학적 유동액 및 추출물에 있는 분석물질을 분석하는데 유용하며; 비-생물학적 유기 조성, 특히 적은 유기 및 비유기 분자의 조성에 있는 분석물질을 분석하는데 유용할 것이다.

분석물질은 분자, 다중결합 분자 복합체, 거대분자 집합, 세포, 부분세포적 기관, 바이러스, 분자 절편, 이온 또는 원자가 될 수 있다. 분석물질은 샘플의 단일 조성이거나 또는 공통적으로 하나 또는 그 이상의 특성(예, 분자량, 등전점, 이온 전하, 소수성/친수성 작용, 등)을 가지는 구조적으로, 화학적으로, 생물학적으로 또는 기능적으로 관계된 성분의 집합이 될 수 있다.

분석물질의 특정 예는 펩타이드, 단백질, 효소, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 핵산, 카보하이드레이트, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드와 같은 생물학적 거대분자; 핵산 절편, 펩타이드 절편 및 단백질 절편과 같은 상기에 기재된 생물학적 거대 분자 세트의 절편; 핵산 복합체, 단백질-DNA 복합체, 수용체-리간드 복합체, 효소-기질 복합체, 효소 저해제, 펩타이드 복합체, 단백질 복합체, 카보하이드레이트 복합체, 폴리사카라이드 복합체와 같은 상기에 기재된생물학적 거대 분자의 복합체; 아미노산, 뉴클레오타이드, 뉴클레오시드, 당, 스테로이드, 지질, 검속 이온, 약물, 호르몬, 아미드, 아민, 카르복시산, 비타민 및 조효소, 알코올, 알데하이드, 케톤, 지방산, 포피린(porphyrin), 카로티노이드, 식물 성장 조절제, 포스페이트 에스터 및 뉴클레오시드 디포스포-당과 같은 작은 생물학적 분자; 약학적 또는 치료학적으로 유효한 제제, 모노머, 펩타이드 아날로그, 스테로이드 아날로그, 저해제, 돌연변이원, 발암원, 항유사분열제, 항생제, 이오노포어, 항대사제, 아미노산 아날로그, 항박테리아제, 전달 저해제, 표면 활성 제제(서팩탄트), 미토콘드리아 및 엽록체 기능 저해제, 전자 공여자, 전달자 또는 수용체, 프로테아제에 대한 합성 기질, 포스파타제에 대한 기질, 에스터라제와 단백질에 대한 기질 및 단백질 변형제제와 같은 합성 저분자; 및 폴리알켄, 폴리아민, 폴리아클릴레이트(메스아크릴레이트), 폴리설폰, 폴리스티렌, 폴리에테르, 폴리비닐 에테르, 폴리카보네이트, 폴리비닐 할라이드, 폴리실론산, POMA, PEG 및 상기의 둘 또는 그 이상의 코폴리머와 같은 합성 폴리머, 올리고머 및 코폴리머를 포함하는 본 발명의 정체 크로마토그래피 방법을 사용하여 분석될 수 있다.

mRNA에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 동정하기

폴리펩타이드가 한번 분획되게 되면, 그 다음 단계는 분획된 폴리펩타이드 중에서 선택된 mRNA에 의해 코딩된 폴리펩타이드에 상보적인 폴리펩타이드를 동정하는 것이다. 샘플에 있는 폴리펩타이드는 코딩된 폴리펩타이드의 알려진 생리-화학적 특성에 기초하여 분획되었다. 이러한 정보는 분획된 폴리펩타이 사이에서 코딩된 폴리펩타이드를 찾아내는데 유용하다. 예를 들어, 누구든지 코딩된 폴리펩타이드가 pH 7에서 음전하를 띄고 약 18 kD의 질량을 가진다는 것을 알 수 있을 것이다. 음이온성 흡착제 스팟을 포함하는 단백질 바이오칩을 사용하면, 누구든지 단백질이 pH 7에서 음전하를 띈다는 것을 포착할 수 있다. 그리고, 질량 분광기를 사용하면, 포착된 단백질은 분자량에 기초하여 분획되며, 스펙트럼을 제공한다. 약 18 kD에서 스펙트럼을 얻게 되면 선택된 물리화학적 특성을 가진 하나 또는 그 이상의 후보 단백질을 제공할 수 있다. 이제, 그 후보 물질은 본원에 기재된 다양한 방법에 의해 그의 동일성을 측정하고 발현된 폴리펩타이드로 연관시키기 위해 추후에 실험될 것이다.

유사하게, 이차원면의 젤 전기영동은 pI와 분자량에 기초하여 단백질을 분리한다. 발현된 단백질의 예측된 질량과 pI를 아는 것은 단백질을 포함하는 것으로 예측되는 젤의 특정 부위를 실험자가 알 수 있도록 유도한다. 그리고 난 후 단백질 데이터베이스의 이용으로 연결된 직렬식 질량 분광 분석법을 사용함으로써 스팟에 있는 단백질을 발현된 단백질로 연관시킬 수 있다.

질량 분광법에 의해 분획된 단백질의 동정

프로그램된 디지털 컴퓨터로 알고리즘을 수행하여 MS 데이터를 데이터베이스에 있는 기록과 비교함으로써, 질량 분광법에 의한 결과는 샘플에 존재하는 단백질을 동정하는데 사용될 수 있다. 각각의 분자는 MS 방법에 의해 분석될 때에 특징적인 질량 분광법(MS) 데이터(또한 질량 스펙트럴 "신호" 또는 "지문"으로 불린다)를 제공한다. 이러한 데이터는 인터 알리아(inter alia), 실제적 또는 이론적 MS 데이터 또는 생폴리머 서열 정보를 포함하는 데이터베이스로 비교함으로써 분석될 수 있다. 추가적으로, MS 분석을 하기 위해 분자는 절편으로 절단될 것이다. 또한, 절편의 MS 분석으로부터 획득할 수 있는 정보는 분석물질에 있는 폴리펩타이드를 동정하기 위한 데이터베이스와 비교된다(Yates,J. Mass Spec. 33:1-19(1998); Yateset al., 미국 특허 제 5,538,897호; Yateset al., 미국 특허 제 6,017,693호).

SELDI에 의해 검출되는 단백질을 동정하기 위한 추가적인 방법은 예를 들어 미국 특허 제 6,225,047호; 국제특허 출원 제 PCT/US00/28163호 및 USSN 제 60/227,677호(2001년 3월 20일 출원)에 기재되어 있다.

폴리펩타이드의 흡수 및 검출에 의해 제공되는 데이터는 어떠한 적당한 방법을 사용하여 분석될 수 있다. 하나의 실시예에서 데이터는 프로그램된 디지털 컴퓨터를 사용함으로써 분석되었다. 일반적으로 컴퓨터 프로그램은 코드를 저장하는 판독가능한 매체를 포함한다. 어떤 코드는 기질상에 있는 어떤 형상의 위치를 포함하는 메모리, 상기 형상에서의 흡착제의 확인 및 흡착제를 세척하기 위해 사용되는 용출 조건을 제공하도록 한다. 이러한 정보를 사용하면, 프로그램은 정의된 어떠한 특성(예, 사용된 흡착제와 용출액의 형태)을 선택적으로 한정된 기질 상에 있는 형태의 집합을 확인할 수 있게 한다. 또한, 컴퓨터는 기질상의 개별적 주소화된 위치로부터 받은 다양한 분자 질량에서 신호의 강도에 있는 데이터를 입력 정보로 받는 코드를 포함한다. 이러한 데이터는 많은 수의 검출된 폴리펩타이드를 나타낼 수 있으며, 선택적으로 각각의 폴리펩타이드가 검출되게 하기 위한 측정된 분자 질량과 신호의 강도를 포함한다.

데이터 분석은 검출된 폴리펩타이드의 신호 강도(예, 피크의 높이)를 측정하는 단계 및 "분리물"(예측된 정적 분포로부터 벗어나는 데이터)을 제거하는 단게를 포함할 수 있다. 측정된 피크는 표준화될 수 있으며, 이는 어떠한 참조(reference)에 대한 상대적인 각각의 피크의 높이를 계산하는 과정을 통해 가능하다. 예를 들어, 참조는 기기나 화합물(예, 에너지 흡수 분자)에 의해 발생하는 배경 잡음이 될 수 있으며, 이는 스케일에 있어서 0으로 세팅한다. 그리고 난후 각각의 폴리펩타이드 또는 다른 기질을 위한 검출된 신호 강도는 원하는 스케일(예, 100)에 있는 상대적인 강도의 형성에서 나타내어 질 수 있다. 선택적으로, 표준은 샘플을 사용하여 수용될 것이며, 따라서 표준으로 부터의 피크는 검출된 각각의 폴리펩타이드 또는 다른 폴리펩타이드를 위해 관찰된 신호의 상대적 강도를 계산하기 위한 참조로 사용될 수 있다.

한 실시예에서, 데이터를 데이터베이스로 비교하여 얻어지는 MS 데이터 및 정보는 생폴리머와 연관된 데이터 및 정보로 구성된다. 데이터베이스는 발현된 서열 태그(ESTs)의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열로 구성될 것이다. 선택적으로, 데이터베이스는 뉴클레오타이드에 있는 유전자 서열 또는 아미노산 수준으로 구성될 것이다. 데이터베이스는 뉴클레오타이드 서열, 아미노산 서열 또는 어떠한 종의 게놈에 포함된 뉴클레오타이드 서열의 번역의 집합을 포함할 것이며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

생폴리머와 관련된 정보의 데이터베이스, 예를 들어 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 서열은 일반적으로 컴퓨터 프로그램 또는 컴퓨터에 의해 선택적으로 수행되는 조사 알고리즘에 의해 분석된다. 본 발명의 방법으로부터 얻을 수 있는 데이터와 정보를 사용하여 가장 우수하게 연관시키기 위해 서열 데이터베이스로부터의 정보가 조사된다(예, Yates(1998)J. Mass Spec. 33:1-19; Yateset al., 미국 특허 제 5,538,897호; Yateset al., 미국 특허 제 6,017,693호).

데이터베이스를 조사하기 위해 유용한 어떠한 적당한 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램이 사용될 수 있다. 조사 알고리즘 및 데이터베이스는 종종 업데이트되며, 이러한 업데이트 버전은 본 발명에 따라 적용될 것이다. 프로그램 또는 데이터베이스의 예는 월드와이드웹 상의 주소 http://base-peak.wiley.com/, http://mac-mann6.embl-heidelberg.de/MassSpec/Software.html, http://www.mann. embl-heidelberg.de/Services/PeptideSearch/PeptideSearchIntro.html, ftp://ftp. ebi.ac.uk/pub/databases/ 및 http://donatello.ucsf.edu에서 찾을 수 있다. 또한, 미국 특허 제 5,632,041호; 제 5,964,860호; 제 5,706,498호; 및 제 5,701,256호는 서열 비교를 위한 알고리즘과 방법을 기술하고 있다.

한 실시예에서, 단백질, 펩타이드 또는 뉴클레오타이드 서열의 데이터베이스는 데이터베이스의 혼합이다. 데이터베이스의 예는 UCSF 웹사이트(prospector.ucsf.edu)에 있는 ProteinProspector, Genpept 데이터베이스, GenBank 데이터베이스(Burkset al.(1990)Methods in Enzymology183:3-22), EMBL 데이터 라이브러리(Kahnet al.(1990)Methods in Enzymology183:23-31), 단백질서열 데이터베이스(Barkeret al.(1990)Methods in Enzymology183:31-49), SWISS-PROT(Bairochet al.(1993)Nucleic Acids Res., 21:3093-3096) 및 PIR-인터네셔널((1993)Protein Seq. Data Anal. 5:6-192)을 포함하며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

추가적인 실시예에서, 질량 분광적으로 측정된 MS 데이터, 그 예로 절단된 단백질과 펩타이드 절편의 질량 또는 질량 스펙트라에 비교하기 위해 신규한 데이터베이스가 제공되었다. 예를 들어, 모든 가능한 아미노산 서열과 특징되어야 하는 펩타이드 질량의 혼합에 대한 이론적인 데이터베이스가 제공되었다(예, Parekh et al., 국제 공개 제 98/53323호). 그리고 나서, 데이터베이스는 샘플에 있는 펩타이드의 아미노산 서열을 측정하기 위한 질량 분광법을 사용하여 실제 측정된 질량으로 비교된다.

한 실시예에서, 질량 분광으로부터 유래된 펩타이드의 질량은 단백질 또는 핵산 서열로부터의 예측된 단백질의 질량을 위한 데이터베이스에 쿼리(query) 위해 사용되며, 클로세스트(closest) 맞춤을 제공한다. 이러한 방법에 있어서, 미지의 단백질은 아미노산 서열 없이도 빠르게 동정될 수 있다. 본 발명의 다른 실시예에서, 키메릭 폴리펩타이드 절편으로부터 제공되는 질량은 단백질 데이터베이스의 예측된 질량 스펙트라 또는 핵산 서열로부터의 예측된 단백질에 비교될 수 있으며, 클로세스트 맞춤을 제공할 수 있다. 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램은 MS 방법에 의해 분석된 생폴리머를 절단하기 위해 사용되는 유사한 절단제를 사용하여 데이터베이스에 있는 서열의 이론적인 절단을 제공한다.

서열 데이터베이스로 부터의 서열 또는 닮은 절단 절편은 원래 또는 절편 분자의 MS 데이터로부터 형성되는 서열에 대한 원하는 범위에서의 유사한 서열 상동성으로 나타내어지고, 이는 "매치(match)" 또는 "히트(hit)"라고 표현된다. 이러한 방법에 있어서, 테스트 도메인 또는 이의 절편의 상동성은 신속하게 측정될 수 있다. 실험자는 각각의 특정 분석에 따라 허용가능한 범위의 서열 상동성 비교 값을 상용화하거나 다양화할 수 있다.

SELDI를 사용한 폴리펩타이드의 검출

특정한 용출 조건아래에서 흡착제에 흡착하는 분석물질을 검출하는 것은 샘플에 있는 분석물질의 정보 및 이의 화학적 특성을 제공한다. 부분적으로 흡착은 흡착물질의 결합 특성에 의존한다: 흡착물질에 결합하는 분석물질은 결합을 가능하게 하는 특성을 가진다. 예를 들어, 특정 pH에서 양이온성인 분자는 상기 pH를 포함하는 용출 조건아래에서 음이온성 흡착제에 결합할 것이다. 강한 양이온성 분자는 매우 강한 용출 조건아래에서, 흡착제로부터 단독으로 용출된다. 소수성 부위를 가진 분자는 소수성 흡착제에 결합할 것이며, 반대로 친수성 부위를 가진 분자는 친수성 흡착제에 결합할 것이다. 다시 말해 작용의 강도는 소수성 또는 친수성 부위를 포함하는 분석물질에 있는 성분에 의존한다. 따라서, 샘플에 있는 어떠한 분석물질이 어떠한 용출 조건아래에서 흡착제에 결합하는지를 측정하는 것은, 결합하기 위한 적당한 화학적 특성을 가지고 있지 않는 분석물질 및 각각으로부터 분석물질을 분리함으로써 혼합물에 있는 분석물질을 분석할 수 있을 뿐만 아니라, 분석물질 또는 개별적 화학적 특성을 가진 개별적 분석물질의 그룹을 동정할 수 있다. 다양한 용출조건 아래에서 하나 또는 그 이상의 개별적 흡착제에 정체하는 분석물질의 정보를 수집하는 것은 혼합물에 있는 분석물질의 자세한 분석을 할 수 있을 뿐만 아니라, 분석물질에 대한 화학적 정보를 제공하여, 그들의 상동성으로 유도될 수 있도록 한다. 이러한 데이터는 "정체 데이터(retention data)"로 일컫어진다.

정체 분석에서 생성되는 데이터는 프로그램 가능한 디지털 컴퓨터를 사용하여 가장 손쉽게 분석되었다. 일반적으로 컴퓨터 프로그램은 코드를 저장하는 판독가능한 미디어를 포함한다. 어떠한 코드는 기질 어레이에 있는 각각의 형상의 위치, 그러한 형상에 있는 흡착제의 상동성 및 흡착제를 세척하는데 사용되는 용출조건을 포함하는 메모리에 제공된다. 그리고 나서, 프로그램은 이러한 정보를 사용함으로써, 특정한 선택적 특성을 나타내는 어레이상의 형성의 세트를 확인할 수 있다. 또한 컴퓨터는 입력으로 받는 코드를 포함하며, 상기 입력으로 받는 코드는 프로브상에 있는 개별적 주소화한 위치로부터 받은 다양한 분자량에서 신호의 강도를 나타내는 데이터이다. 이러한 데이터는 검출된 분석물질의 수를 나타낼 수 있으며, 선택적으로는 신호의 강도가 검출된 분석물질과 측정된 분자량 각각을 포함한다.

또한, 컴퓨터는 데이터를 진행하는 코드를 포함한다. 본 발명은 데이터를 진행시키기 위해 다양한 방법을 계획한다. 하나의 실시예에서, 이것은 분석물질 인식 프로파일을 제작하는 것과 관계되어 있다. 예를 들어, 분자량에 의해 동정되는 각각의 분석물질의 정체 상에 있는 데이터는 개별적인 결합 특성, 예를 들어 음이온성 흡착제 또는 소수성 흡착제에 결합하는 특성에 따라 분류될 수 있다. 이렇게 수집된 데이터는 개별적 분석물질의 화학적 특성 프로파일을 제공한다. 정체 특성은 분석물질의 작용을 반영하며, 번갈아 구조를 반영한다. 예를 들어, 배위 공유 결합한 금속 킬레이터에 대한 정체는 폴리펩타이드 분석물질에 있는 히스티딘 잔기의 존재 여부를 반영한다. 다양한 pH 수준에서 용출하에 다양한 양이온성 및 음이온성 흡착제에 정체되는 수준의 데이터를 사용하면, 단백질의 등전점을 유도할 수 있다. 번갈아 이것은 단백질에 있는 증명가능한 수의 이온성 아미노산을 반영한다. 따라서, 컴퓨터는 결합 정보를 구조 정보로 전환시킬 수 있는 코드를 포함할 수 있다. 게다가, 분석물질의 이차 공정(예, 후-전사적 변형)을 거치면 변형된 인식 프로파일을 결합 또는 질량에 있어서의 차이에 의해 반영할 수 있는 결과를 나타낸다.

다른 실시예에서, 정체 분석은 두 개의 다른 세포 형태에 있는 선택적인 분계점의 유사 집합 아래 수행되었으며, 두 개 분석으로부터의 정체 데이터를 비교하였다. 정체 맵에서의 차이(예, 어떠한 형태에서 신호의 존재 또는 강도)는 분석물질이 두 개의 세포에서 다르게 발현된다는 것을 나타내어 준다. 예를 들어 이것은 두 개의 정체 분석 사이에서 신호 강도의 차이를 나타내어 주며, 이에 의해 분석물질이 두 개의 분석에 있는 흡착제에 의해 증가적으로 또는 감소적으로 정체한다는 것을 나타내어 준다.

또한, 컴퓨터 프로그램은 코드를 포함할 수 있으며, 이는 입력으로써 프로그래머로부터 지시를 받을 수 잇다. 어레이에 있는 특정화되고 예측된 위치로부터분석물질의 선택적인 흡수를 하기 위한 진보적이고 논리적인 과정은 기본적으로 예상되고 프로그램될 수 있다.

컴퓨터는 표현하기 이해 데이터를 다른 형태로 전환할 수 있다. 데이터 분석은 측정하는 단계, 예로 수집된 데이터로부터의 신호 강도를 형태 위치의 작용으로 여기는 단계, "분리물"을 제거하는 단계(미리 예측된 정적 분포로부터 데이터를 일탈시키는 단계), 및 남아있는 데이터로부터 분석물질의 상대적인 결합 친화력을 계산하는 단계를 포함할 수 있다.

결과로 나타나는 데이터는 다양한 형태로 표시될 수 있다. 하나의 형태에서, 신호의 강도는 분자량의 작용으로, 그래프 상에 나타내어 진다. 다른 형태에서, 신호의 강도는 어두운 정도를 직선 축으로 나타냄으로써 그 결과 젤 상의 밴드와 유사한 특성을 나타낼 수 있는데, 이는 "젤 형태"로 일컫어진다. 다른 형태에서, 어떤 분계점에 도달하는 신호는 수직선으로 표시되며 또는 수평 축 상의 바(bar)는 분자량을 표시한다. 따라서, 각각의 바는 검출된 분석물질을 나타낸다. 또한 데이터는 결합 특성 및/또는 용출 특성에 따라 분석물질 그룹에 대한 신호 강도의 그래프로 나타낼 수 있다.

본 원에 기재된 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 사용된 것이고, 이를 다양하게 변형하고 바꾸는 것은 당업자에게 있어서 손쉽게 수행할 수 있으며, 이는 적용 범위와 첨부된 청구항의 범위내에 포함된다. 본원에 기재된 발표논문, 특허 및 특허출원은 참고문헌으로 사용될 수 있다.

본 발명의 방법은 신약 개발 및 진단 마커를 동정하기 위한 표적 단백질을 동정하는데 유용하게 사용된다. 진단 마커의 동정은 예를 들어 암; 암 전이; 소아 및 성인 당뇨병; 자가면역 질환; 심장 질환; 뇌혈관 질환; 안 질환; 폐 질환; 바이러스 감염; 박테리아 감염; 곰팡이 감염; 원생동물의 감염; 샤가스병(chagas disease)과 같은 질병 상태를 위한 것이다. 또한, 본 발명의 방법은 약리유전학적 적용을 위해 사용되는 다른 대립 유전자의 발현 산물을 동정하는데 유용하게 사용된다. 또한, 본 발명의 방법은 독성학 연구 및 방사능 조사, 고온 및 저온과 같은 다양한 환경 조건에 세포가 노출되었을때의 영향을 동정하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (30)

1. a) 생물학적 샘플을 수득하는 단계;

   b) 샘플의 유전자 발현 프로파일을 제작하여, 샘플에서 발현되는 mRNA를 동정하는 단계;

   c) mRNA에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 생리-화학적 특성을 동정하는 단계;

   d) 생리-화학적 특성에 기초하여 샘플에 존재하는 폴리펩타이드를 분획화하는 단계; 및

   e) 분획화된 단백질로부터 mRNA에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 동정하며, 동정된 폴리펩타이드는 생리-화학적 특성을 포함하고, 이로부터 샘플에 존재하는 유전자와 단백질의 발현을 연관시키는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에 존재하는 유전자와 단백질의 발현을 연관시키는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 생물학적 샘플은 건강한 세포의 세포 분해물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1항에 있어서, 생물학적 샘플은 병적 세포의 세포 분해물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1항에 있어서, 생물학적 샘플은 독성 화합물에 의해 접촉된 세포의 세포 분해물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1항에 있어서, 생물학적 샘플은 약물 치료에 반응하는 대상 세포 또는 약물 치료에 반응하지 않는 대상 세포의 세포 분해물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1항에 있어서, 생물학적 샘플은 고온, 저온 또는 방사능에 노출된 세포의 세포 분해물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1항에 있어서, 생물학적 샘플은 인간 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1항에 있어서, 유전자 발현 프로파일을 제작하는 단계는 EST 어레이에 의해 발현된 mRNA를 동정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1항에 있어서, 유전자 발현 프로파일을 제작하는 단계는 올리고뉴클레오타이드 어레이에 의해 발현된 mRNA를 동정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1항에 있어서, 유전자 발현 프로파일을 제작하는 단계는 mRNA 어레이에 의해 발현된 mRNA를 동정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 1항에 있어서, mRNA는 두가지 생물학적 샘플에서 다르게 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 11항에 있어서, 두가지 생물학적 샘플은 정상 세포 및 병적 세포로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 12항에 있어서, 병적 세포는 암 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 11항에 있어서, 두가지 생물학적 샘플은 건강한 세포 및 독성 화합물에 노출된 세포로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 1항에 있어서, mRNA에 의해 코딩된 폴리펩타이드의 생리-화학적 특성을 동정하는 단계는 추가로 생리-화학적 특성의 다양성을 동정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 1항에 있어서, 생리-화학적 특성을 동정하는 단계는 선택된 단백질 분해제에 의해 폴리펩타이드를 분해시킴으로써 mRNA에 의해 코딩되는 폴리펩타이드에 의해 생성된 단백질 분해 절편의 질량을 예측하는 것을 포함하며, mRNA에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 동정하는 단계는 제제에 의해 샘플에 존재하는 폴리펩타이드를 분해하고, 예측된 질량의 절편에 대응하는 질량을 가지는 샘플에 존재하는 실제 단백질 분해 절편을 동정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 1항에 있어서, 생리-화학적 특성은 아미노산 서열, 분자량, 등전점, 소수성, 친수성, 글리코실레이션, 인산화, 에피토프 서열, 리간드 결합 서열, 특정 pH에서의 전하 및 금속 킬레이트 결합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제 1항에 있어서, 샘플에 존재하는 폴리펩타이드를 분획화하는 단계는 2D-젤 전기영동을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제 1항에 있어서, 샘플에 존재하는 폴리펩타이드를 분획화하는 단계는 질량 분광법을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제 1항에 있어서, 샘플에 존재하는 폴리펩타이드를 분획화하는 단계는 표면 강화된 레이저 질량 흡수 이온화를 포함하고, 표면 강화된 레이저 질량 흡수 이온화는 고체상-결합된 흡착제에서 친화 정체에 의해 분획화하고, 기체상 이온 분광법에 의해 고체상에 잔존하는 폴리펩타이드를 분획화하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제 20항에 있어서, 흡착제는 아미노산 서열, 분자량, 등전점, 소수성, 친수성, 글리코실레이션, 인산화, 에피토프 서열, 리간드 결합 서열, 특정 pH에서의 전하 및 금속 킬레이트 결합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 생리-화학적 특성을 가지는 폴리펩타이드에 친화력를 가지도록 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제 1항에 있어서, 폴리펩타이드를 동정하는 단계는 생리-화학적 특성을 포함하는 폴리펩타이드를 분획된 폴리펩타이드로부터 선별하고, 선별된 폴리펩타이드를 동정하고 선별된 폴리펩타이드의 본성(identify)을 mRNA에 의해 코딩되는 폴리펩타이드와 연관시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
23. a) 생물학적 샘플을 수득하는 단계;

    b) 핵산 어레이를 사용하여 샘플의 유전자 발현 프로파일을 제작하여, 샘플에서 발현되는 mRNA를 동정하는 단계;

    c) mRNA에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 생리-화학적 특성을 동정하는 단계;

    d) 질량 분광법을 사용해, 생리-화학적 특성에 기초하여 샘플에 존재하는 폴리펩타이드를 분획화하는 단계; 및

    e) 분획화된 단백질로부터 mRNA에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 동정하며, 동정된 폴리펩타이드는 생리-화학적 특징을 포함하고, 이로부터 샘플에 존재하는 유전자와 단백질의 발현을 연관시키는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에 존재하는 유전자와 단백질의 발현을 연관시키는 방법:
24. 제 23항에 있어서, 유전자 발현 프로파일을 제작하는 단계는 EST 어레이에 의해 발현된 mRNA를 동정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
25. 제 23항에 있어서, 유전자 발현 프로파일을 제작하는 단계는 올리고뉴클레오타이드 어레이에 의해 발현된 mRNA를 동정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
26. 제 23항에 있어서, 유전자 발현 프로파일을 제작하는 단계는 mRNA 어레이에 의해 발현된 mRNA를 동정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
27. 제 23항에 있어서, mRNA에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 동정하는 단계는 표면 강화된 레이저 흡수 이온화에 의해 샘플에 있는 폴리펩타이드를 분획화하는 것을 포함하고, 표면 강화된 레이저 흡수 이온화는 고체상-결합된 흡착제에서 친화 정체에 의해 분획화하고, 기체상 이온 분광법에 의해 고체상에서 잔존하는 폴리펩타이드를 분획화하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
28. a) 생물학적 샘플을 수득하는 단계;

    b) 올리고뉴클레오타이드 어레이를 사용하여 샘플의 유전자 발현 프로파일을 제작하여 샘플에서 발현되는 mRNA를 동정하는 단계;

    c) mRNA에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 생리-화학적 특성을 동정하는 단계;

    d) 표면 강화된 레이저 흡수 이온화를 사용하여 생리-화학적 특성에 기초하여 샘플에 존재하는 폴리펩타이드를 분획화하는 단계로서, 표면 강화된 레이저 흡수 이온화는 고체상-결합된 흡착제에서 친화 정체에 의해 분획화하고, 기체상 이온 분광법에 의해 고체상에서 잔존하는 폴리펩타이드를 분획화하는 것을 포함하는 단계; 및

    e) 분획화된 단백질로부터 mRNA에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 동정하며, 동정된 폴리펩타이드는 생리-화학적 특성을 포함하고, 이로부터 샘플에 존재하는유전자와 단백질의 발현을 연관시키는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에 존재하는 유전자와 단백질의 발현을 연관시키는 방법.
29. 제 28항에 있어서, 흡착제는 아미노산 서열, 분자량, 등전점, 소수성, 친수성, 글리코실레이션, 인산화, 에피토프 서열, 리간드 결합 서열, 특정 pH에서의 전하 및 금속 킬레이트 결합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 생리-화학적 특성을 가지는 폴리펩타이드에 친화력를 가지도록 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
30. 제 28항에 있어서, 생리-화학적 특성을 동정하는 단계는 선택된 단백질 분해제에 의해 폴리펩타이드를 분해시킴으로써 mRNA에 의해 코딩되는 폴리펩타이드에 의해 생성된 단백질 분해 절편의 질량을 예측하는 것을 포함하고, mRNA에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 동정하는 단계는 제제에 의해 샘플에 존재하는 폴리펩타이드를 분해하고, 예측된 질량의 절편에 대응하는 질량을 가지는 샘플에 존재하는 실제 단백질 분해 절편을 동정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.