CN110609078B - 一种检测蛋白磷酸化和乙酰氨基葡萄糖化关联作用的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测蛋白磷酸化和乙酰氨基葡萄糖化关联作用的方法，所述方法包括以下步骤：将胰蛋白酶处理得到的多肽样品平均分配成三等分，第一个等分用磷酸酶处理，用IBT‑10Plex116C标记；第二个等分用O‑乙酰葡萄糖胺水解酶处理，用IBT‑10Plex117N标记；第三等分无特殊处理，用IBT‑10Plex118N标记；样品混合，与氢氧化钡、一个含有生物素和巯基的双官能团化合物反应，通过链霉亲和素蛋白‑磁珠从混合物中被亲和富集；用紫外光光照除去含巯基化合物的其他结构，得到多肽衍生物用于质谱分析。本发明可以找出整个蛋白质组中同时具有磷酸化和O‑GlcNAcylation的Ser/Thr位点，为有氧糖酵解和信号转导通道之间的关系提供了具体数据，促进癌细胞特定生物标志物的发现，用于肿瘤的早期诊断以及治疗药物新靶点。

Description

一种检测蛋白磷酸化和乙酰氨基葡萄糖化关联作用的方法
技术领域
本发明涉及合成化学、质谱分析、生物技术领域，具体为一种检测蛋白磷酸化和乙酰氨基葡萄糖化关联作用的方法。
背景技术
癌细胞通常依靠有氧糖酵解(aerobic glycolysis)来提供能量和快速增长所需要的构件分子(氨基酸，核苷酸等)。每个葡萄糖分子所产生的三磷酸腺苷(ATP)在这种不寻常的代谢途径中比在正常细胞中的氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)要少得多。因此，为满足快速生长的需求，癌细胞的葡萄糖摄取率高，有氧糖酵解活跃。这种现象，称为瓦伯格效应(Warburg Effect)，是与肿瘤的进展密切相关的。因此，针对肿瘤的高葡萄糖需求是一种很有希望的诊断和治疗方法。例如，有氧糖酵解的一种抑制剂，2-脱氧葡萄糖，目前在临床试验中治疗前列腺癌。另一种葡萄糖相似物，18F-葡萄糖，在正电子发射断层扫描(PET)中广泛应用于肿瘤图像显示。
瓦伯格效应如何促进癌细胞的代谢和繁殖的具体机制仍然缺乏明确的理论。因为通常情况下，2-5％由细胞摄入的葡萄糖进入氨基己醣生物合成途径，产生了一种高能核苷糖分子，乙酰氨基葡萄糖尿苷二磷酸(uridine diphosphate N-acetylglucosamine,UDP-GlcNAc)。瓦伯格效应的一个后果是癌细胞中产生高水平的乙酰氨基葡萄糖尿苷二磷酸。这是一种非常常见的蛋白质翻译后修饰的前体分子，也就是在丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)上的N-乙酰氨基葡萄糖化(O-GlcNAcylation)。高浓度的葡萄糖通过瓦伯格效应进入癌细胞，从而调节细胞内O-GlcNAc的水平。
由于蛋白质中的Ser/Thr同时也是另外一种普遍的蛋白质翻译后修饰磷酸化的位点，O-GlcNAcylation必然会影响到相应位点上的磷酸化。众多的研究已经表明蛋白磷酸化是刺激肿瘤生长和转移的一个重要途径，因此，蛋白O-GlcNAcylation能够通过和磷酸化的关联作用，将有氧糖酵解与肿瘤进展相关的细胞信号通路联系起来(Comer and Hart2000；Hart et al.2011)。例如，内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)中的Ser1177就可以同时被磷酸化和O-GlcNAcylation。当O-GlcNAcylation增加时，Ser1177的磷酸化减少，内皮型一氧化氮合成酶的活性也相应减小。
发明内容
本项发明公开了一种新型定量蛋白质组学工具，用于探索癌细胞中蛋白磷酸化和O-GlcNAcylation之间的关联作用。本发明可以找出整个蛋白质组中同时具有磷酸化和O-GlcNAcylation的Ser/Thr位点，给理解有氧糖酵解和信号转导通道之间的关系提供了具体数据，从而可以促进癌细胞特定生物标志物的发现，用于肿瘤的早期诊断以及治疗药物新靶点。
为了达到以上目的，本发明提供如下技术方案：
一种用IBT(Isobaric Tag)技术确定蛋白磷酸化和O-GlcNAcylation的关联作用的定量蛋白质组学方法，所述方法包括以下步骤：
1)将胰蛋白酶处理得到的多肽样品平均分配成三等分，将三等分分别进行以下处理：第一个等分用磷酸酶处理；第二个等分用O-乙酰葡萄糖胺水解酶处理；第三等分无特殊处理；
2)第一等分用用IBT-10Plex116C标记；第二等分用IBT-10Plex117N标记；第三等分用IBT-10Plex118N标记；IBT试剂可以与多肽的N-端胺基和C-端赖氨酸侧链胺基反应。
3)将第二步处理后的三等分的样品混合，先与氢氧化钡或者其他合适的碱性溶液混合；然后与一个含有生物素和巯基的双官能团化合物反应，通过链霉亲和素蛋白-磁珠从混合物中被亲和富集；然后用365nm紫外光光照除去含巯基化合物的其他结构，得到多肽用于质谱分析。
进一步的，所述含有生物素和巯基的双官能团化合物为半胱氨酸衍生物Cys-Dev，所述Cys-Dev包括生物素(Biotin)、水溶性荧光基团(Water-soluable fluorecentgroup)、光可断裂链接键(light-cleavable linker)、半胱氨酸。半胱氨酸的结构提供了一个巯基，可以与脱氢丙氨酸中的碳-碳不饱和双键反应，同时一个胺基可以提高标记后的多肽在质谱中的离子化。生物素(Biotin)和链霉亲和素蛋白之间的作用力是自然界中存在的最强非共价作用力，因此在生物技术应用中常作为亲和富集基团。一个水溶性的磺酸基可以提高Cys-Dev在水溶液中的溶解度，同时这个基团具有荧光(water-soluablefluorescent group)，有助于整个实验过程中的监控。半胱氨酸部分与其他结构部分是通过一个可通过紫外光光照裂解的共价键链接的(light-cleavable linker)。
进一步的，步骤1)的样品进行预处理，预处理方法为：细胞保持在所提供的含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM溶液中，温控37℃，以及保持5％CO2。在无血清培养基中培养细胞48个小时。通过离心收获细胞，并且用PBS洗涤两次以除去培养基，加入缓冲液，同时加入磷酸酶抑制剂(phosphatase inhibitor cocktail)和O-GlcNAcase抑制剂(Thiamet G)。用超声打碎细胞后离心，收集上层清液后，加入5倍的丙酮沉淀蛋白。收集蛋白沉淀并用含有8M尿素的HEPES缓冲液(pH7.0)溶解，加入DTT溶液还原二硫键，然后加入2-碘乙酰胺烷基化所有的半胱氨酸。将溶液稀释10倍后，加入胰蛋白酶，在37℃下保持8个小时。在C18柱除盐，用1：1的水：乙腈收集后的多肽(～2mg)经冷冻干燥后在-20℃保存。
进一步的，所述步骤2)中，标记反应分别进行2小时后混合，加入氢氧化钡溶液，在室温下静置1小时，加入稀盐酸调节pH 7，然后加入Cys-Dev，反应进行2小时后，过量的Cys-Dev用表面由NHS活化的琼脂糖珠除去，剩余溶液继续用链霉亲和素蛋白-磁珠富集，磁珠经洗涤后，悬浮在4:1的水：乙腈中，保持磁珠均匀分布，用365nm的紫外光(10mW/cm2)照射15分钟，收集液体并旋干；处理后的样品直接用于LC-MS/MS。
通过一对多肽(TQpSFSLQER，TQgSFSLQER，其中p代表磷酸化，g代表O-GlcNAc)来具体描述本发明的流程。这一对多肽是eNOS蛋白经过胰蛋白酶水解后，含有Ser1177的多肽片段(1175-1183)。因为Ser1177在细胞中可以同时磷酸化和O-GlcNAcylation,经胰蛋白酶水解后的eNOS同时含有这一对多肽，其比例决定于磷酸化和O-GlcNAcylation之间的相对水平。这样的多肽样品可以被平均分配成三等分。第一个等分用磷酸酶(phosphatase)处理以去除TQpSFSLQER上的磷酸根，这样处理后的样品含有(TQSFSLQER，TQgSFSLQER)，加热对磷酸酶灭活后，用IBT-10Plex116C标记。第二等分用O-乙酰葡萄糖胺水解酶(O-GlcNAcase)处理以去除TQgSFSLQER上的O-GlcNAc。这样处理后的样品含有(TQpSFSLQER，TQSFSLQER)，加热对O-GlcNAcase灭活后，用IBT-10Plex117N标记。第三等分直接用IBT-10Plex118N标记。这三个等分的样品被混合在一起，用氢氧化钡处理。在这样的碱性条件下，含有磷酸根和O-GlcNAcylation的Ser可以通过β-消除反应形成脱氢丙氨酸。因为脱氢丙氨酸具有碳-碳不饱和双键，它可以与含巯基化合物(例如图3中的一种半胱氨酸衍生物Cys-Dev)通过迈克尔加成形成新的多肽。这样标记后的多肽可以通过链霉亲和素蛋白-磁珠从混合物中被亲和富集，然后用365nm紫外光光照除去多余的结构，得到多肽TQS*FSLQER,这里S*是Ser经过如上流程处理过形成的结构，可以直接用于二级质谱分析。
本发明的关键步骤是在碱性条件下去除Ser上的磷酸化或O-GlcNAc生成了含有碳-碳不饱和双键的脱氢丙氨酸，从而能够与含有巯基的分子形成TQS*FSLQER。对于多肽TQpSFSLQER，在用磷酸酶处理后，由于Ser上的磷酸根被去除，形成的TQSFSLQER是不能在碱性条件下形成脱氢丙氨酸的，也就是说是不能与含有巯基的分子反应。但是这个多肽用O-GlcNAcase或没有酶处理时，同样的处理方法会产生TQS*FSLQER。对于多肽TQgSFSLQER则正好相反，用O-GlcNAcase处理后，得到TQSFSLQER，而在用磷酸酶或没有酶处理时产生TQS*FSLQER。因为IBT技术提供了这些多肽的相对定量，因此，根据报告离子116，117，118的强度，就可以判断两个多肽TQpSFSLQER和TQgSFSLQER在混合物中的相对含量。例如，如果混合物中TQpSFSLQER>>TQgSFSLQER(比例>100:1)，那么，衍生后的多肽TQS*FSLQER的二级质谱中将只看到报告离子117，118，且两者强度基本相等(117＝118)。如果混合物中TQgSFSLQER>>TQpSFSLQER(比例>100:1)，那么，TQS*FSLQER的二级质谱中将只看到报告离子116，118，且两者强度基本相等(116＝118)。如果混合物中TQpSFSLQER和TQgSFSLQER比例相当，则在TQS*FSLQER的二级质谱中将同时看到报告离子116，117，118，且它们的强度满足116+117＝118。
综上所述，多肽在同一个Ser位点同时具有O-GlcNA和磷酸化，经过本发明的方法的步骤对衍生后的多肽进行富集并经光照处理后，可以产生相同序列的衍生多肽，但是由不同的IBT标记编码，可以对O-GlcNAc和磷酸化的相对水平进行定量分析。此方法对于同时具有O-GlcNA和磷酸化的Thr位点也同样适用。
本发明还公开了一种半胱氨酸衍生物(Cys-Dev)的固相合成方法，半胱氨酸衍生物Cys-Dev是通过固相合成法制备的。
Biotin树脂添加到反应容器中，加入20％的Piperidine/DMF溶液摇晃30分钟脱去Fmoc基团后，用DMF洗涤3次；加入含有Fmoc-Glu(EDANS)-OH,HBTU,HoBt,DIPEA/DMF(2M)的DMF溶液。摇晃2小时后，过滤出树脂，用DMF洗涤3次，加入20％Piperidine/DMF溶液摇晃30分钟脱去Fmoc基团，继续用DMF洗涤3次。加入含有Fmoc-aminoehtyl photolinker,HBTU,HOBt,DIPEA/DMF(2M)的DMF溶液。摇晃2小时后，过滤出树脂，用DMF洗涤3次，加入20％Piperidine/DMF溶液摇晃30分钟脱去Fmoc基团。继续用DMF洗涤3次。加入含有Fmoc-Cys(Mmt)-OH,HBTU,HOBt,DIPEA/DMF(2M)的DMF溶液。摇晃2小时后，过滤出树脂，用DMF洗涤3次，加入20％Piperidine/DMF溶液摇晃30分钟脱去Fmoc基团，过滤出树脂，用DMF洗涤3次，然后用DCM洗涤3次并干燥。加入鸡尾酒裂解液(88％TFA，5％Phenol,5％H2O,2％TIS)，摇晃1小时后，过滤并将滤液滴入乙醚溶液中。所得淡黄色沉淀用C18反相高效液相色谱法纯化并经冻干后得到淡黄色蓬松固体。分子量由MALDI-MS确认。
本发明具有如下有益效果：本发明可以对蛋白质Ser和Thr上的两种互相竞争的翻译后修饰，O-GlcNAc和磷酸化，的相对水平进行定量分析，给理解有氧糖酵解和信号转导通道之间的关系提供了具体数据，从而可以促进癌细胞特定生物标志物的发现，用于肿瘤的早期诊断以及治疗药物新靶点。
附图说明
图1为利用IBT技术研究蛋白磷酸化和O-GlcNAcylation的关联作用的定量蛋白质组学方法流程图。其中：1a)磷酸酶处理；1b)O-GlcNAcase处理；1c)无特殊处理；2a)用IBT-10Plex116C标记；2b)用IBT-10Plex117N标记；2c)用IBT-10Plex118N标记；3)先用氢氧化钡处理，然后与Cys-Dev反应，用链霉亲和素蛋白-磁珠亲和富集后，365nm紫外光光照去除Cys-Dev中的其他部分。S*代表Ser在经过该流程后剩余结构。116,117,118分别代表多肽被IBT-10Plex116C，IBT-10Plex117N，IBT-10Plex118N标记后的结构，其中星号代表该处原子为13C或者15N。
图2为IBT试剂结构示意图。
图3为Cys-Dev的化学结构示意图。半胱氨酸(cysteine)的结构提供了一个巯基，可以与脱氢丙氨酸中的碳-碳不饱和双键反应，同时一个胺基可以提高标记后的多肽在质谱中的离子化。生物素(Biotin)和链霉亲和素蛋白之间的作用力是自然界中存在的最强非共价作用力，因此在生物技术应用中常作为亲和富集基团。一个水溶性的磺酸基可以提高Cys-Dev在水溶液中的溶解度，同时这个基团具有荧光，有助于整个实验过程中的监控(water-soluable fluorescent group)。半胱氨酸部分与其他结构部分是通过一个可紫外光光照断裂的共价键(light-cleavable linker)链接的。
图4为Cys-Dev的固相合成法路线；
图5为半胱氨酸衍生物Cys-Dev的MAIDI-TOF图谱；
图6为多肽IBT-TQS*FSLQER的二级图谱。插图显示IBT报告离子在不同样品中的强度；
图7为两个合成多肽TQpSFSLQER和TQgSFSLQER的特定母离子/碎片离子对结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实例1：一种半胱氨酸衍生物(Cys-Dev)的固相合成法
如图3所示的一种含有生物素和巯基的双官能团化合物为半胱氨酸衍生物Cys-Dev，所述Cys-Dev包括生物素(Biotin)、水溶性荧光基团(Water-soluable fluorecentgroup)、光可断裂链接键(light-cleavable linker)、半胱氨酸。半胱氨酸的结构提供了一个巯基，可以与脱氢丙氨酸中的碳-碳不饱和双键反应，同时一个胺基可以提高标记后的多肽在质谱中的离子化。生物素(Biotin)和链霉亲和素蛋白之间的作用力是自然界中存在的最强非共价作用力，因此在生物技术应用中常作为亲和富集基团。一个水溶性的磺酸基可以提高Cys-Dev在水溶液中的溶解度，同时这个基团具有荧光(water-soluablefluorescent group)，有助于整个实验过程中的监控。半胱氨酸部分与其他结构部分是通过一个可通过紫外光光照裂解的共价键链接的(light-cleavable linker)。
如图4所示Cys-Dev的固相合成法途径，精确分子量为1046.366。
半胱氨酸衍生物Cys-Dev是通过固相合成法制备的(图4)。Biotin树脂(0.51mmol/g,200mg)添加到反应容器中，加入5mL 20％的Piperidine/DMF溶液摇晃30分钟脱去Fmoc基团后，用DMF洗涤3次。加入含有Fmoc-Glu(EDANS)-OH 123.6mg,HBTU 76mg,HoBt 27mg,250μL DIPEA/DMF(2M)的1.5mL DMF溶液。摇晃2小时后，过滤出树脂，用DMF洗涤3次，加入20％Piperidine/DMF溶液摇晃30分钟脱去Fmoc基团，继续用DMF洗涤3次。加入含有Fmoc-aminoehtyl photolinker 104mg,HBTU 76mg,HOBt 27mg,250μL DIPEA/DMF(2M)的1.5mLDMF溶液。摇晃2小时后，过滤出树脂，用DMF洗涤3次，加入20％Piperidine/DMF溶液摇晃30分钟脱去Fmoc基团。继续用DMF洗涤3次。加入含有Fmoc-Cys(Mmt)-OH 123mg,HBTU 76mg,HOBt 27mg,250μL DIPEA/DMF(2M)的1.5mL DMF溶液。摇晃2小时后，过滤出树脂，用DMF洗涤3次，加入20％Piperidine/DMF溶液摇晃30分钟脱去Fmoc基团，过滤出树脂，用DMF洗涤3次，然后用DCM洗涤3次并干燥。加入2mL鸡尾酒裂解液(88％TFA，5％Phenol,5％H2O,2％TIS)，摇晃1小时后，过滤并将滤液滴入10mL乙醚溶液中。所得淡黄色沉淀用C18反相高效液相色谱法纯化(Solvent A:0.1％TFA/H2O,Solvent B:0.1％TFA/CH3CN,0-5min 10％SolventB,5-45min,10％-90％Solvent B)并经冻干后得到淡黄色蓬松固体(86mg,41％收率)。分子量由MALDI-MS确认。
图5为半胱氨酸衍生物Cys-Dev的MAIDI-TOF图谱，理论[M+H]+＝1047.36,实测[M+H]+＝1047.46。
实例2：鉴定同时含有磷酸化和O-GlcNAcylation的蛋白Ser/Thr位点
本例中的实验步骤是本发明和图1所述步骤的具体体现。
步骤1，蛋白样品制备：从ATCC购买的产品HeLa细胞保持在所提供的含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM溶液中，温控37℃，以及保持5％CO2。在无血清培养基中培养细胞48个小时。通过离心收获细胞，并且用PBS洗涤两次以除去培养基。在300克HeLa细胞中加入缓冲液，同时加入磷酸酶抑制剂(phosphatase inhibitor cocktail)和O-GlcNAcase抑制剂(Thiamet G)。用超声打碎细胞后离心，收集上层清液后，加入5倍的丙酮沉淀蛋白。收集蛋白沉淀并用含有8M尿素的HEPES缓冲液(pH7.0)溶解，加入10mM DTT溶液还原二硫键，然后加入20mM 2-碘乙酰胺烷基化所有的半胱氨酸。将溶液稀释10倍后，加入胰蛋白酶，在37℃下保持8个小时。在C18柱除盐，用1：1的水：乙腈收集后的多肽(～2mg)经冷冻干燥后在-20℃保存。
步骤2，样品处理：取出步骤1中制备的多肽样品600μg，平均分成三份，每份200μg，第一等分用磷酸酶(phosphatase)处理，加热对磷酸酶灭活后，用IBT-10Plex116C标记。第二等分用O-GlcNAcase处理，加热对O-GlcNAcase灭活后，用IBT-10Plex117N标记。第三等分直接用IBT-10Plex118N标记。标记反应分别进行2小时后，混合在一起。加入0.2N的氢氧化钡溶液，在室温下静置1小时，加入稀盐酸调节pH 7，然后加入10mM Cys-Dev，反应进行2小时后，过量的Cys-Dev用表面由NHS活化的琼脂糖珠除去，剩余溶液继续用链霉亲和素蛋白-磁珠富集，磁珠经洗涤后，悬浮在5mL 4:1的水：乙腈中并加入到一个半径2cm的玻璃烧杯底部，保持磁珠均匀分布，用365nm的紫外光(10mW/cm2)照射15分钟，收集液体并旋干。这样处理后的样品直接用于LC-MS/MS。
步骤3，质谱分析与数据处理：在nanoLC-Orbitrap上运行2小时的梯度，一级MS1扫描范围为350到2000m/z，扫描分辨率70000,最低信号强度为20000。二级MS/MS扫描分辨率为35000.最低信噪比设为1.5。蛋白质鉴定和定量使用iQuant软件利用iPeak搜索(由三个搜索引擎集成MyriMatch v2.2.10165，X！Tandem v2017.2.1.2和MS-GF+v2017.01.13)。具体参数设置为蛋白和肽的鉴定错误率(FDR)设定为小于1％；选择胰蛋白酶作为特异性酶；每个肽最多含一个错误切割；固定修饰包括IBT-10Plex(N-term)，IBT-10Plex(K)，氨基甲酰基甲基化(C)，半胱氨酸胺化(S/T)，可变修饰包括IBT-10Plex(Y)；MS1质量误差值20ppm，MS2片段质量误差0.1Da。
结果分析：从10个蛋白中的12个Ser/Thr位点被识别同时含有相当水平的磷酸化和O-GlcNAcylation，包括eNOS的Ser1177，Thr58 in c-Myc，Ser70 and Ser171 in CRTC2。图6是具有代表性的TQS*FSLQER的二级图谱。其中，多肽序列识别得分为75，相当与8.4e-7的期望值，表示这个多肽序列是非常可靠的。同时，报告离子的强度116+117＝118，相对标准差小于15％，117的强度约为116的两倍，表明在eNOS的Ser1177上，磷酸化约为O-GlcNAcylation的两倍。
如图2所示，步骤2中的三个IBT试剂，在二级质谱中产生的报告离子的结构以及本发明中所用的三个IBT试剂，IBT-10Plex116C,IBT-10Plex117N,IBT-10Plex118N的化学结构。图中星号代表该处为13C或者15N。结构如下：
Figure BDA0002209495550000081
实例3：同时具有磷酸化和O-GlcNAcylation的Ser/Thr位点的确认
本发明的方法是一种间接手段来检测磷酸化和O-GlcNAcylation，一些潜在的副反应可能会影响所获位点的可信度(例如：IBT标记不完全，磷酸酶和O-GlcNAcase反应不完全等)，因此通过这个技术获得的Ser/Thr位点还需要进一步的验证。通常，使用基于SRM(Selective Reaction Monitoring)的靶向方法，可以用三重四级杆质谱仪(例如：ABSciex公司的Q-Trap4000质谱仪)在复杂的生物样本中确认特定的多肽。这是通过在质谱中寻找相对应的母离子/碎片离子对实现的。因此，为了确认某个多肽，首先要确定这个多肽若干特定的母离子/碎片离子对的质荷比(m/z)，然后在生物样本中寻找具有这些数值的多肽。合成了TQpSFSLQER和TQgSFSLQER，在明确知道这两个多肽的序列的情况下，用Q-Trap4000来研究它们的碎片峰(图7)。结果符合预期，两种肽丰度最高的离子对是由O-GlcNAc或磷酸根的中性损失(neutral loss)造成的，同时大多数碎片都不含有O-GlcNAc或者磷酸根。虽然强度较低，具有完整O-GlcNAc和磷酸化的片段依然有比较高的信噪比，可以用于检测这两个多肽的特定母离子/碎片离子对，这样就允许高可信度的识别携带这两个可逆的蛋白翻译后修饰基团的多肽。采用这几对从合成多肽上找到的离子对，从实例二步骤1准备的多肽样品中，确实识别出了TQpSFSLQER和TQgSFSLQER，表明这种靶向方法能够用于同时具有磷酸化和O-GlcNAcylation的Ser/Thr位点的确认。如果结合稳定同位素标记多肽(例如：TQpSFSLQER^，TQgSFSLQER^，R^＝15N4,13C6-Arg),O-GlcNAcylation和磷酸化的程度也能被准确定量。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述实施方式所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种检测蛋白磷酸化和乙酰氨基葡萄糖化关联作用的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
1)将胰蛋白酶处理得到的多肽样品平均分配成三等分，将三等分分别进行以下处理：第一个等分用磷酸酶处理；第二个等分用O-乙酰葡萄糖胺水解酶处理；第三等分无特殊处理；
2)第一等分用IBT-10Plex116C标记；第二等分用IBT-10Plex117N标记；第三等分用IBT-10Plex118N标记；可以与多肽的N-端胺基和C-端赖氨酸侧链胺基反应；
Figure FDA0003354970270000011
3)将第二步处理后的三等分的样品混合，先与碱性溶液混合；然后与一个含有生物素和巯基的双官能团化合物反应，其中生物素与巯基通过一个光可断裂链接键链接，通过链霉亲和素蛋白-磁珠从混合物中被亲和富集；然后用紫外光光照除去该化合物的其他结构，得到多肽衍生物用于质谱分析。
2.如权利要求1所述的一种检测蛋白磷酸化和乙酰氨基葡萄糖化关联作用的方法，其特征在于：所述含有生物素和巯基的双官能团化合物为半胱氨酸衍生物Cys-Dev，所述Cys-Dev包括生物素、水溶性磺酸基、光可断裂链接键、半胱氨酸。
3.如权利要求1所述的一种检测蛋白磷酸化和乙酰氨基葡萄糖化关联作用的方法，其特征在于：步骤1)的样品进行预处理，预处理方法为：细胞保持在所提供的含有10％胎牛血清的DMEM溶液中，温控37℃，以及保持5％CO2；在无血清培养基中培养细胞48个小时；通过离心收获细胞，并且用PBS洗涤两次以除去培养基，加入缓冲液，同时加入磷酸酶抑制剂和O-GlcNAcase抑制剂；用超声打碎细胞后离心，收集上层清液后，加入5倍的丙酮沉淀蛋白；收集蛋白沉淀并用含有8M尿素的HEPES缓冲液溶解，加入DTT溶液还原二硫键，然后加入2-碘乙酰胺烷基化所有的半胱氨酸；将溶液稀释10倍后，加入胰蛋白酶，在37℃下保持8个小时；在C18柱除盐，用1：1的水：乙腈收集后的多肽经冷冻干燥后在-20℃保存。
4.如权利要求1或3所述的一种检测蛋白磷酸化和乙酰氨基葡萄糖化关联作用的方法，其特征在于：所述步骤2)中，标记反应分别进行2小时后混合，加入氢氧化钡溶液，在室温下静置1小时，加入稀盐酸调节pH 7，然后加入Cys-Dev，反应进行2小时后，过量的Cys-Dev用表面由NHS活化的琼脂糖珠除去，剩余溶液继续用链霉亲和素蛋白-磁珠富集，磁珠经洗涤后，悬浮在4:1的水：乙腈中，保持磁珠均匀分布，用365nm的紫外光照射15分钟，收集液体并旋干；处理后的样品直接用于LC-MS/MS。
5.一种含有生物素和巯基的双官能团化合物，其特征在于：该化合物为半胱氨酸衍生物Cys-Dev，所述Cys-Dev包括生物素、水溶性荧光基团、光可断裂链接键、半胱氨酸，所其结构式如下：
Figure FDA0003354970270000021
6.一种半胱氨酸衍生物Cys-Dev的固相合成方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：Biotin树脂添加到反应容器中，加入20％的Piperidine/DMF溶液摇晃脱去Fmoc基团后；加入含有Fmoc-Glu(EDANS)-OH,HBTU,HoBt,DIPEA/DMF的DMF溶液；摇晃，过滤出树脂，加入20％Piperidine/DMF溶液摇晃脱去Fmoc基团，加入含有Fmoc氨基乙基光连接器,HBTU,HOBt,DIPEA/DMF的DMF溶液；摇晃后，过滤出树脂，加入20％Piperidine/DMF溶液摇晃脱去Fmoc基团；加入含有Fmoc-Cys(Mmt)-OH,HBTU,HOBt,DIPEA/DMF的DMF溶液；摇晃后，过滤出树脂，加入20％Piperidine/DMF溶液摇晃脱去Fmoc基团，过滤出树脂，干燥；加入鸡尾酒裂解液，摇晃1小时后，过滤并将滤液滴入乙醚溶液中得淡黄色沉淀；所得淡黄色沉淀纯化并经冻干后得到样品。
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