CN105378089A - 治疗心肌病的基因治疗载体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基因治疗载体，该基因治疗载体用于治疗或预防对其有需要的主体的肥厚型心肌病。本发明的基因治疗载体包括编码心脏肌节蛋白的核酸序列和与该核酸序列可操作地连接的心肌细胞特异性启动子。本发明还涉及一种包含基因治疗载体的细胞。还提供了包括上述基因治疗载体和/或含上述载体的细胞的药物组合物。另一个方面，本发明涉及一种通过将本发明的基因治疗载体引入需要治疗的主体中，来治疗或预防主体的肥厚型心肌病的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因治疗载体，该基因治疗载体用于治疗或预防对其有需要的主体的肥厚型心肌病。本发明的基因治疗载体包括编码心脏肌节蛋白的核酸序列和与所述核酸序列可操作地连接的心肌细胞特异性启动子。本发明还涉及一种包含上述基因治疗载体的细胞。本发明还提供了药物组合物，该药物组合物包括上述基因治疗载体和/或含上述载体的细胞。另一方面，本发明涉及一种通过将本发明的基因治疗载体引入需要治疗的主体体内，来治疗或预防主体的肥厚型心肌病的方法。
背景技术
虽然在由环境因素(诸如尼古丁、高胆固醇血症或糖尿病)引起的心脏疾病的预防以及在心脏病症的对症治疗中取得了相当大的进展，但仍然需要能改善对遗传性心肌病的治疗的方法。遗传因素造成的心肌病是肥厚型心肌病(HCM)、扩张型心肌病(DCM)和致心律失常型右室心肌病(ARVC)。
HCM是最普遍的心肌病，其特征是，在没有另一心脏病或全身性疾病(自身能在给定患者中明显产生一定程度的肥厚)的情况下，原因不明地出现左心室肥厚。HCM与收缩最初正常，但舒张功能受损相关(Elliottetal.,2008,EurHeartJ29:270-276；Gerschetal.,2011,JThoracCardiovascSurg142:e153-203)。HCM具有特别高的患病率，在普通人群中的患病率约为1:500(Maronetal.,1995,Circulation92:785-789)，并且是导致年轻人，尤其是运动员发生突发心脏死亡的首要原因。虽然HCM是一种危及生命的疾病，但迄今为止还不能进行治愈性治疗(Carrieretal.,2010,CardiovascRes85:330-338；Schlossareketal.,2011,JMolCellCardiol50:613-20)。
HCM是一种常染色体的显性疾病，已知由至少10种编码心脏肌节组分的基因的多于1000种不同的突变引起，其中该至少10种编码心脏肌节组分的基因编码诸如，心脏肌球蛋白结合蛋白C(MYBPC3)、β-肌球蛋白重链(MYH7)、心肌肌钙蛋白T(TNNT2)、心肌肌钙蛋白I(TNNI3)、室性肌球蛋白必需轻链1(MYL3)、室性肌球蛋白调节轻链2(MYL2)、心脏α-肌动蛋白(ACTC)、α-原肌球蛋白(TPM1)、肌联蛋白(TTN)、四加半LIM蛋白1(FHL1)(Richardetal.,2003,Circulation107:2227-2232；Schlossareketal.,2011,JMolCellCardiol50:613-20；Friedrichetal.,2012,HumMolGenet21:3237-54)。大多数突变是编码全长的突变多肽的错义突变。众所周知的例外是MYBPC3和FHL1，它们主要表现为产生C-端截短的蛋白的移码突变。
HCM中最常发生突变的基因是编码心脏肌球蛋白结合蛋白C(cMyBP-C)的MYBPC3(Bonneetal.,1995,NatureGenet11:438-440；Watkinsetal.,NEnglJMed.,2011,364:1643–56)。cMyBP-C是肌节A带的主要成分，它在肌节A带中与肌球蛋白、肌动蛋白和肌联蛋白相互作用(Schlossareketal.,2011,JMolCellCardiol50:613-20)。在人和小鼠中，仅在心脏中检测到(Fougerousseetal,1998,CircRes82:130-133)，并且cMyBP-C参与调节心肌的收缩和舒张(Pohlmannetal.,2007,CircResCircRes101,928-38；Schlossareketal.,2011,JMolCellCardiol50:613-20)。MYBPC3基因中约70％的突变会导致移码，从而产生C-端截短的蛋白(Carrieretal.,1997,CircRes80:427-434)。截短的蛋白是不稳定的，而且从来没有在患者的心肌组织中检测到(Marstonetal.,2009,CircRes105:219-222；vanDijketal.,2009,Circulation119:1473-1483；vanDijketal.,2012,CircHeartFail5:36-46)。
因此，cMyBP-C蛋白水平降低是，单倍不足(haploinsufficiency)可能是HCM的致病机理的一种论据。全长cMyBP-C的量不足可能会使粗肌丝成分的化学计量不平衡，并且改变肌节的结构和功能。在携带错义突变或移码突变的HCM的小鼠和猫模型中也涉及单倍不足(Meursetal.,2005,HumMolGenet14:3587-3593；Vignieretal.,2009,CircRes105:239-248)。此外，在猫和小鼠中，有证据表明存在cMyBP-C突变体(全长或截短的)(即使为低水平的)。因此，第二种可能的致病机理是，产生诱导显性负性作用的毒性多肽，这很可能是通过与野生型(WT)基因产物进行竞争来实现的。
目前HCM的药物类治疗仅仅是经验性的，能缓解症状但不能治疗引起致病的遗传原因。显然，基因类或RNA类治疗将是HCM的唯一根治性治疗。已经在与非遗传性心脏病相关的疾病中成功测试了基因治疗方法(Jessupetal.,2011,Circulation124:304-313)。
申请US2005/0276804和2007/0292438公开了cMyBP-C与遗传性心脏疾病有关。然而，US2005/0276804提出降低视黄醇结合蛋白或视黄醇来治疗这些疾病。US2007/0292438则局限于公开在多种基因中具有破裂的不同的小鼠模型。
申请US2004/0086876和US2002/0127548公开了对与HCM相关的人MYBPC3基因中突变的诊断。此外，这些申请提出通过将编码非突变的cMyBP-C的核酸给药到患者来治疗HCM。
Merkulov等人(2012,CircHeartFail,5:635-644)公开了将小鼠Mybpc3基因转移到cMyBP-C-缺陷型(cMyBP-C-/-)小鼠的心肌中。作者认为cMyBP-C的缺失导致功能障碍和肥厚。基因转移改善了收缩和舒张的收缩性功能，并使cMyBP-C-缺陷型(cMyBP-C-/-)小鼠的左心室壁的厚度减小。
Vignier等人(2009,CircRes105:239-248)开发了携带G>A点突变的Mybpc3-靶向敲入(KI)的小鼠模型，这产生了源自异常基因转录和剪接的不同的突变的mRNA和蛋白。该文件表明，外源性应激，诸如肾上腺素应激或衰老，导致KI小鼠中的泛素-蛋白酶体系统(UPS)饱和并最终出现损伤，潜在地随后积累cMyBP-C的突变多肽。
本发明人发现，在由于异等位基因的突变以显性负性方式作用于编码心脏肌节蛋白的基因而患有HCM的主体中，引入提供相应的非突变基因的基因转移载体，不仅恢复了肌节蛋白的正常水平，而且使毒性突变多肽的有害影响最小化，否则会通过突变体等位基因的转录产生毒性突变体多肽。
在心肌细胞特异性启动子的控制下，外源性野生型(WT)基因的载体诱导表达克服了携带突变的MYBPC3等位基因的主体中的突变蛋白的显性负性作用而且是没有毒性的，因为通过基因治疗载体表达正常等位基因出人意料地有效降低了内源性突变等位基因的表达。由于对动态平衡以及肌节蛋白更新(turnover)进行的严密的细胞内调控，这一效果被认为是心脏细胞自主现象(cardiaccell-autonomousphenomenon)的结果。
发明内容
本发明涉及用于治疗或预防HCM的新的治疗方法。已知，编码心脏肌节蛋白的许多基因的突变导致功能性全长肌节蛋白的水平降低。这是由于移码突变引起的，其中移码突变产生正常被泛素-蛋白酶体系统(UPS)降解的截短突变多肽。然而，在外源性应激条件下，UPS的功能可能会受到干扰，从而积累突变多肽，突变多肽因此可并入到肌节中，并且对野生型cMyBP-C起到显性负性的毒性肽的作用，促使HCM发病(Vignier等人，2009，见上文)。对四加半LIM蛋白1也进行了相似的观察(Friedrichetal.,2012,HumMolGenet21:3237-3254)。不产生任何cMyBP-C突变多肽的Mybpc3靶向敲除，在相同条件下没有显示出对UPS的任何损害(Schlossareketal.,2012,BasicResCardiol107:1-13；Schlossareketal.,2012,JMuscleResCellMotil33:5-15)。
本文中示出，通过基因治疗载体，将编码功能性心脏肌节蛋白(诸如cMyBP-C)的野生型cDNA基因转移到在该心脏肌节蛋白的基因中携带突变的主体中，不仅恢复了心肌(即，由心肌细胞构成的心脏的肌肉组织)中蛋白的正常水平，而且还防止产生毒性mRNA和/或毒性多肽，否则将通过所述主体的基因组中，编码心脏肌节蛋白的突变等位基因的表达而产生毒性mRNA和/或毒性多肽。还观察到，引入大量的基因治疗载体与待治疗的患者的高风险无关，因为在细胞内未发现过量的外源性野生型(WT)蛋白。出乎意料地是，心脏肌节蛋白的表达似乎在细胞中受到化学计量地严格调控，这意味着不能以对患者有害的量提供外源性蛋白。因此，本发明提供了一种用于治疗主体的HCM的简单且安全的方法。
提供充足水平的正常cDNA，以充分产生心脏肌节蛋白并且抑制毒性mRNA/多肽的组合作用，能有效治疗HCM。在不希望受到理论束缚的情况下，认为基因治疗载体进行的外源性基因表达，通过竞争肌节特异性转录因子来降低突变等位基因的内源性表达。
在第一方面，本发明提供了一种表达外源性核酸序列的基因治疗载体，该基因治疗载体包括：
(a)编码功能性心脏肌节蛋白的核酸序列，以及
(b)与所述核酸序列可操作地连接的心肌细胞特异性启动子。
上述基因治疗载体适用于治疗或预防需要治疗的哺乳动物主体，优选人主体的HCM。需要治疗的主体是在编码心脏肌节蛋白的相应基因中携带促使发生HCM的突变的主体。在给药到待治疗的主体后，上述载体在主体，优选在所述主体的心肌中表达所编码的心脏肌节蛋白。
要在主体中表达的心脏肌节蛋白已知与HCM有关，即，在编码心脏肌节蛋白的基因携带突变，这导致表达非功能性蛋白变体，例如全长或截短的变体或突变体，并最终引起HCM。迄今为止，已知在编码心脏肌节蛋白的至少10种不同基因中的突变会引起HCM。肌节是肌肉的基本单位，并且被定义为两个相邻Z盘之间的一段。根据本发明，待基因治疗载体表达的肌节蛋白是心脏肌节蛋白，这意味着该蛋白天然存在于心肌的肌节中。
要在主体中表达的心脏肌节蛋白可以是存在于心脏肌节中的结构蛋白或调节蛋白。该蛋白优选选自由β-肌球蛋白重链(由基因MYH7编码，RefSeqGeneNG_007884.1)、室性肌球蛋白必需轻链1(由基因MYL3编码，RefSeqGeneNG_007555.2)、室性肌球蛋白调节轻链2(由基因MYL2编码，RefSeqGeneNG_007554.1)、心脏α-肌动蛋白(由基因ACTC1编码，RefSeqGeneNG_007553.1)、α-原肌球蛋白(由基因TPM1编码，RefSeqGeneNG_007557.1)、心肌肌钙蛋白T(由基因TNNT2编码，RefSeqGeneNG_007556.1)、心肌肌钙蛋白I(由基因TNNI3编码，RefSeqGeneNG_007866.2)、心脏肌球蛋白结合蛋白C(由基因MYBPC3编码，RefSeqGeneNG_007667.1)、肌联蛋白(由基因TTN编码，RefSeqGeneNG_011618.1)和四加半LIM蛋白1(由基因FHL1编码，RefSeqGeneNG_015895.1)组成的组(Richardetal.,2003,Circulation107:2227-2232；Friedrichetal.,2012,HumMolGenet,21:3237-54)。
优选地，待本发明的基因治疗载体表达的心脏肌节蛋白是心脏肌球蛋白结合蛋白C(cMyBP-C)。该蛋白来自不同的物种，诸如小鼠、猫、猪或猴。在本发明的一个优选实施方式中，待表达的cMyBP-C蛋白是小鼠cMyBP-C，优选是具有所附序列表中SEQIDNO:4(NCBI登录号：NP_032679.2)所示的氨基酸序列或者与其具有至少80％序列同一性的序列的小鼠cMyBP-C。编码SEQIDNO:4的小鼠cMyBP-C的核苷酸序列示于SEQIDNO:3(NCBI登录号：NM_008653.2)中。
本发明特别设想治疗患有HCM的人患者。因此，在本发明的另一优选实施方式中，插入载体中的编码人cMyBP-C蛋白的核酸是人来源的。优选地，人cMyBP-C蛋白具有SEQIDNO:2(NCBI登录号：NP_000247.2)所示的氨基酸序列或具有与其至少80％序列同一性的序列。编码人cMyBP-C蛋白的核苷酸序列示于SEQIDNO:1(NM_000256.2)中。
待表达的蛋白也可以是上述蛋白之一的功能性变体，它与原始蛋白相比表现出显著的氨基酸序列同一性。优选地，氨基酸同一性达到至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。优选地，该变体的氨基酸同一性为至少70％、80％或90％。在上下文中，术语“功能性变体”指肌节蛋白的变体能实现天然存在的心脏肌节蛋白的功能，例如，提供结构支撑/功能支撑。
心脏肌节蛋白的功能性变体可包括，例如，通过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而与其天然存在的对应体不同的蛋白。例如，相对于SEQIDNO:2，SEQIDNO:2所示的人cMyBP-C蛋白的变体蛋白可具有其中2、3、4、5、6或至多10、20、30或更多位置被另一氨基酸取代的氨基酸序列。例如，功能性变体可例如选自由缺少外显子5和6的天然存在的MYBPC3剪接变体(被称为变体4，如SEQIDNO:28所示)组成的组。
氨基酸取代可以是保守取代或非保守取代。优选地，该取代是保守取代，即，氨基酸残基被起到功能等同物的作用且具有类似极性的氨基酸取代。优选地，用作取代基的氨基酸选自与待取代的氨基酸残基相同的氨基酸组。例如，疏水性残基可被另一疏水性残基取代，或者极性残基可被具有相同电荷的另一极性残基取代。可用于保守取代的功能性同源氨基酸包括，例如，非极性氨基酸，诸如甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。不带电荷的极性氨基酸的实例包括丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、酪氨酸和半胱氨酸。带电荷的极性(碱性)氨基酸的实例包括组氨酸、精氨酸和赖氨酸。带电荷的极性(酸性)氨基酸的实例包括天门冬氨酸和谷氨酸。
与其天然存在的对应体相比，相差一个或多个(例如，2、3、4、5、10或15个)额外的氨基酸的蛋白也被认为是变体。这些额外的氨基酸可存在于原始肌节蛋白的氨基酸序列内(即，作为插入)，或者它们可被添加到该蛋白的一端或两端。基本上，如果氨基酸的添加不损害多肽实现天然存在的心脏肌节蛋白的功能和/或补救治疗主体中单倍不足的能力，则插入可发生在任意位置。此外，肌节蛋白的变体还包括相对于原始多肽，缺失一个或多个氨基酸的蛋白。只要不损害实现心脏肌节蛋白的正常功能和/或补救单倍不足的能力，则这种缺失可影响任意氨基酸位置。
最后，心脏肌节蛋白的变体也指通过结构修饰(诸如修饰的氨基酸)而与天然存在的蛋白不同的蛋白。根据本发明，修饰的氨基酸是通过天然过程(诸如加工或翻译后修饰)，或通过本领域中已知的化学修饰方法进行修饰的氨基酸。典型的氨基酸修饰包括：磷酸化、糖基化、乙酰化、O-连接的N-乙酰氨基葡萄糖化、谷胱甘肽化、酰化、分枝化、ADP核糖基化、交联、二硫桥键的形成、甲酰化、羟基化、羧化、甲基化、脱甲基化、酰胺化、环化，和/或与磷脂酰肌醇共价或非共价键合、黄素衍生物、脂磷壁酸、脂肪酸或脂质。这样的修饰已经广泛描述在文献中，例如，在Proteins:StructureandMolecularProperties,T.Creighton,2ndedition,W.H.FreemanandCompany,NewYork(1993)(《蛋白质：结构和分子性质》，作者T.Creighton，第二版，出版社W.H.FreemanandCompany，纽约(1993年))中。在本发明的一个优选实施方式中，核酸序列编码人的cMyBP-C的经组成性磷酸化的同种型(isoform)。已经示出，这些同种型尤其是心脏保护性的(Sadayappanetal.(2005),CircRes97:1156-1163；Sadayappanetal.,2006；ProcNatlAcadSciUSA103:16918-16923)。
基因治疗载体优选用于治疗或预防对其有需要的主体的HCM。待载体治疗的主体可以是已被诊断患HCM的主体、发展出HCM的风险增加的主体或有发展出HCM倾向的主体。在本发明的优选方面中，主体是被诊断为，由于编码已知与HCM相关的心脏肌节蛋白的基因的至少一个等位基因中存在突变，而患HCM的人主体。
在本发明的另一个优选方面中，用本发明的载体治疗的主体携带损害所述心脏肌节蛋白功能的基因突变，并且由于该突变，产生源自心脏肌节蛋白的一种或多种功能障碍性蛋白。
在本发明的另一个优选方面中，心脏肌节蛋白中的突变在所述主体中造成单倍不足。单倍不足表示二倍体生物的一种状态，其特征是一个功能障碍性等位基因，其中，剩余的有功能的等位基因未产生足够水平的基因产物以生成野生型表型。
本发明是基于令人惊讶的认识，即，可通过给药基因治疗载体，以提供完整的外源性野生型基因，补偿待治疗的主体的基因组中突变的等位基因，从而有效改善或根除HCM的表型。意外地发现，可有效防止毒性mRNA和/或多肽(两者均源自突变的等位基因)的积累。因此，在一个实施方式中，所描述的基因治疗载体用于治疗或预防哺乳动物主体的肥厚型心肌病的方法中，其中，所述主体产生源自心脏肌节蛋白的一种或多种功能障碍性蛋白，并且可选地，其中，所述治疗的施用导致一种或多种功能障碍性蛋白的降低。“降低”是指一种或多种功能障碍性蛋白的水平，相比给药前的水平降低大于20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在优选的实施方式中，一种或多种功能障碍性蛋白的水平相比给药前的水平降低大于20％。
优选地，“一种或多种功能障碍性蛋白的水平”是组合的肌节蛋白的所有功能障碍性种类的水平，即，肌节蛋白的功能障碍性种类的整体水平。
HCM描述了导致完整性降低的心脏肌肉的恶化。这可能导致心脏节律失调，并最终导致心脏衰竭。HCM是肌节的遗传和临床异质性疾病，其特征尤其是，在没有另一种心脏病或全身性疾病(自身能在给定患者中明显产生一定程度的肥厚)的情况下，心室间隔和左心室中肌肉壁增厚。由于壁增厚，左心室的流出道可能变窄。HCM的特征是肌细胞肥厚、肌细胞混乱、间质纤维化、小冠状血管疾病和/或左心室流出阻塞。HCM与最初地正常收缩相关，但在大多数情况下，与受损的舒张功能相关。因此，在本发明的优选实施方式中，基因治疗载体用于治疗或预防对其有需要的主体的HCM，其中，HCM的特征是心室间隔和/或左心室中肌肉壁增厚和舒张功能障碍。
当在已给药治疗载体的主体中外源性表达心脏肌节蛋白(例如，上述蛋白之一)时，结果可能是不需要表达全长蛋白来补偿由突变的等位基因表达的功能障碍性突变蛋白。相反，只表达全长的肌节蛋白或其如上所述的变体的功能性片段就是足够的。因此，本发明还包括心脏肌节蛋白或其变体的功能性片段在治疗或预防对其有需要的主体的HCM中的应用。如本文所用的，本发明的心脏肌节蛋白的片段是在N-端和/或C-端缺失一个或多个氨基酸而与天然存在的蛋白不同的蛋白，其中，保留了实现天然存在的心脏肌节蛋白的正常功能的能力的至少一部分。
以基因治疗载体的形式将编码心脏肌节蛋白的核酸序列给药至待治疗的主体，该基因治疗载体即如下核酸构建体，该核酸构建体包括编码序列(包括翻译和终止密码子)，紧挨着外源性核酸表达所需的其它序列，诸如启动子、科扎比(Kozak)序列、多聚腺苷酸(polyA)信号等。在主体中表达外源性核酸序列的基因治疗载体是本领域众所周知的。
例如，基因治疗载体可以是哺乳动物表达系统的一部分。现有技术中已经描述了有用的哺乳动物表达系统和表达构建体。此外，不同的制造商分售了几种哺乳动物表达系统并能用于本发明中，诸如基于质粒或病毒载体的系统，例如LENTI-SmartTM(InvivoGen)、GenScriptTM表达载体、pAdVAntageTM(Promega)、ViraPowerTM慢病毒、腺病毒表达系统(Invitrogen)和腺相关病毒表达系统(CellBiolabs)。
例如，本发明的基因治疗载体可以是适用于将外源性核酸引入到细胞中，用于随后表达由该核酸编码的蛋白的病毒表达载体或非病毒表达载体。该载体应特别适于在心肌细胞中表达编码的肌节蛋白。在优选的实施方式中，上述载体提供编码的肌节蛋白在心肌细胞中的特异性表达。当表达比在其它非心脏细胞类型或不是心肌细胞的心脏细胞中的表达高至少2倍时，该表达是“特异性”的。
表达载体可以是：游离型载体，即，能在宿主细胞内自主地进行自我复制的载体；或整合型载体，即，能稳定并入到细胞基因组内的载体。在宿主细胞中的表达可以是组成型或受到调节的(例如，诱导型)。优选地，功能性外源心脏肌节蛋白位于细胞内，优选位于宿主细胞中的肌节中。
本发明的基因治疗载体通常包括与编码肌节蛋白的核酸功能性连接的启动子。启动子序列必须是紧凑并且保证强表达。优选地，启动子使肌节蛋白在经基因治疗载体治疗的患者的心肌中表达。更优选地，启动子使肌节蛋白在患者的心肌中特异性表达。当表达比在不属于心肌的细胞中的表达高至少2倍时，该表达是“特异性”的。进一步优选地，在不属于心肌的细胞中，基本上不表达肌节蛋白。在此上下文中，“基本上不”是指由载体表达的肌节蛋白在不属于心肌的细胞中，表达小于10％、小于5％、小于1％。
合适的启动子包括，例如，肌肉肌酸激酶(MCK)、巨细胞病毒增强子+肌球蛋白轻链2启动子(CMV-MLC2或CMV-MLC1.5、CMV-MLC260)、磷酸甘油酸激酶(PGK)和心肌肌钙蛋白T启动子(TNNT2)，以及任何其它肌节特异性启动子。优选地，这些启动子源自人的基因。
在特别优选的实施方式中，基因治疗载体包括与编码心脏肌节蛋白的核酸序列可操作地连接的心脏特异性启动子。如本文所用的，“心脏特异性启动子”指其在心脏细胞中的活性比在任意其它非心脏细胞类型中高至少2倍的启动子。优选地，适用在本发明载体中的心脏特异性启动子在心脏细胞中的活性，比其在非心脏细胞类型中的活性高至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍或至少50倍。
在进一步优选的实施方式中，基因治疗载体包括与编码心脏肌节蛋白的核酸序列可操作地连接的心肌细胞特异性启动子。如本文所用的，“心肌细胞特异性启动子”指其在心肌细胞中的活性比在任何其它非心脏细胞类型或不是心肌细胞的心脏细胞中高至少2倍的启动子。优选地，适用在本发明载体中的心肌细胞特异性启动子在心肌细胞中的活性，比其在非心脏细胞类型或不是心肌细胞的心脏细胞中的活性高至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍或至少50倍。
优选地，心脏特异性启动子或心肌细胞特异性启动子是人的启动子。由所附实例可以看出，证明对本发明的载体有用的启动子是心肌肌钙蛋白T启动子(TNNT2)，诸如SEQIDNO:5所示出的人TNNT2启动子。相应地，本发明的心肌细胞特异性启动子优选包括SEQIDNO:5的序列或与SEQIDNO:5具有80％，更优选90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的功能等价序列。在优选的实施方式中，基因治疗载体包括与编码心脏肌节蛋白的核酸序列可操作地连接的TNNT2启动子。在进一步优选的实施方式中，基因治疗载体包括与编码心脏肌节蛋白的核酸序列可操作地连接的SEQIDNO:5的人TNNT2启动子。其它心脏特异性启动子包括α-肌球蛋白重链启动子、肌球蛋白轻链2v启动子、α-肌球蛋白重链启动子、α-心脏肌动蛋白启动子、α-原肌球蛋白启动子、心肌肌钙蛋白C启动子、心肌肌钙蛋白I启动子、心脏肌球蛋白结合蛋白C启动子和肌质网/内质网Ca2+-ATPase(SERCA)启动子(例如，这种启动子(SERCA2)的同种型2)。
心肌组织是具有重复肌节的横纹肌组织。因此，在进一步的实施方式中，基因治疗载体包括横纹肌启动子，诸如结蛋白启动子。
心脏特异性启动子或心肌细胞特异性启动子与编码心脏肌节蛋白的核酸序列可操作地连接到，这意味着启动子与编码核酸结合，使得当整合到细胞的基因组中或者在细胞中作为基因组外核酸构建体存在时，能在启动子的控制下在心肌细胞中表达所述编码核酸。
作为可选的成分，基因治疗载体可包括增加肌节蛋白表达水平的增强子元件。实例包括SV40早期基因增强子和劳斯氏肉瘤病毒(RousSarcomaVirus)的长末端重复序列(LTR)的增强子(Gormanetal.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.79:6777)。载体还任选包括用于改进人和/或非人抗原的表达的转录终止序列和多聚腺苷酸序列。例如，合适的转录终止子和多聚腺苷酸信号可源自SV40(Sambrooketal(1989),MolecularCloning:ALaboratoryManual)。优选地，在本发明的载体中使用含有SEQIDNO:6的序列或由SEQIDNO:6的序列组成的SV40多聚腺苷酸信号。本领域已知的支持表达效率或特异性的任何其它元件都可添加到表达载体中，诸如土拨鼠肝炎转录后调控元件(wPRE)。为了提高心脏特异性，可引入其它元件以使基因在其它组织中的表达失活，诸如编码miRNA(诸如miR122)的序列(Geisleretal.,2011,GeneTherapy18:199-209)。为了使外源性基因在心脏中的表达可视化，可引入其它可选元件，诸如标签序列(myc、FLAG、HA、His等)，或诸如GFP、YFP、RFP的荧色物。
为了进一步提高基因表达水平，可在本发明的基因治疗载体中引入嵌合内含子。如本文所用的“嵌合内含子”指如下的内含子，该内含子包括源自两个不同基因的至少两个不同内含子的部分。在本发明的基因治疗载体中使用的特别优选的嵌合内含子包括，例如，来自人β-球蛋白基因和人免疫球蛋白G(IgG)的内含子序列。示例性内含子示于SEQIDNO:7中。优选地，嵌合内含子被插入到紧邻启动子的下游。例如，已示出在紧邻PGK启动子的下游插入β-球蛋白/Ig内含子使基因表达提高约37倍(Dominguezetal.,2011,HumMolGenet20:681-693)。
基因治疗载体可以通过本领域已知的标准方法，诸如DNA重组技术或化学合成进行构建和克隆。标准克隆方法描述在Sambrooketal.,1989,分子克隆:实验指南(MolecularCloning:ALaboratoryManual),冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarbourLabPress)中。
在特别优选的方面中，基因治疗载体是病毒表达载体。本发明使用的病毒载体通常包括其中缺失了一部分天然序列，以引入异种多核苷酸而不破坏病毒感染性的病毒基因组。由于病毒成分和宿主细胞受体之间发生特异的相互作用，病毒载体非常适于将基因高效地转移到靶细胞中。有助于基因转移到哺乳动物细胞中的合适的病毒载体是本领域众所周知的，并且可源自不同类型的病毒，例如，源自逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、正粘病毒、副粘病毒、乳多空病毒、细小核糖核酸病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒或甲病毒。对于不同病毒载体系统的概述，参见Nienhuisetal.,Hematology,Vol.16:VirusesandBoneMarrow,N.S.Young(ed.),353-414(1993)。
例如，可使用逆转录病毒载体。逆转录病毒载体通常通过将所选择的多核苷酸转导并整合到靶细胞的基因组中而起作用。逆转录病毒载体可源自任意亚科。例如，可使用源自鼠肉瘤病毒、牛白血病、病毒劳斯肉瘤病毒、鼠白血病病毒、水貂细胞聚焦诱导病毒(Mink-CellFocus-InducingVirus)、网状内皮组织增殖病毒或禽白血病病毒的载体。本领域技术人员能组合源自不同逆转录病毒的多个部分(诸如LTR、tRNA结合位点)和包装信号起来，以提供重组的逆转录病毒载体。然后，这些逆转录病毒载体通常用于产生转导能力的逆转录病毒载体颗粒。为了这个目的，将载体引入到合适的包装细胞系中，诸如US专利5591624中描述的那些细胞系。也可构建逆转录病毒载体，以通过将嵌合整合酶并入到逆转录病毒粒子中，位点特异性地整合到宿主细胞的DNA中。例如参见WO96/37626。
根据本发明，特别优选的是，基因治疗载体是腺相关病毒(AVV)载体，诸如选自由血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，或其衍生的嵌合AAV组成的组中的AAV载体，这能更好地适于在感兴趣的组织中进行高效率的转导(Wuetal.,2006,MolTherapy14:316-27；Bowlesetal.,2012,MolTherapy20:443-455)。在转染时，AAV只在宿主中引起轻微的免疫反应(如果有的话)。此外，相对于其它载体系统，AAV载体还能有效地经过血液进入到最终分化的心肌细胞中。在这方面，AAV系统优于例如使用慢病毒。因此，AAV非常适用于基因治疗方法。对小鼠中的转导，AAV血清型6和AAV血清型9是特别合适的。对于基因转移到人中，AAV血清1、6、8和9是优选的。因此，在本发明的优选实施方式中，基因治疗载体是AAV血清型6载体。在进一步优选的实施方式中，基因治疗载体是AAV血清型8载体。最后，基因治疗载体最优选是AAV血清型9载体。AAV血清型9载体特别适用于诱导在心肌的细胞/心肌细胞中的表达。
现有技术中认为，AAV包装治疗性基因的能力限制为约4.9kbp，而较长序列会导致AAV颗粒的截断(Wuetal.,2010,MolTher18:80-86)。然而，本文中表明，5.4kbp的超大DNA序列(包括两个反向末端重复序列(ITR)，在人TNNT2启动子控制下的带FLAG标签的Mybpc3cDNA，嵌合内含子和SV40多聚腺苷酸信号)的包装，不影响AAV血清型6或AAV血清型9的产生。实现每毫升1～7×1012个载体基因组的滴度，并且载体诱导FLAG-Mybpc3在分离的小鼠心肌细胞中和在体内小鼠心脏中的显著表达。因此，在优选实施方式中，基因治疗载体包括大小为至少4.0kbp、至少4.5kbp、至少5kbp、至少5.1kbp、至少5.2kbp、至少5.3kbp、至少5.4kbp、至少5.5kbp或至少5.6kbp的多核苷酸序列。在一个实施方式中，基因治疗载体包括大小为至少4.5kbp的多核苷酸序列。特别优选的是，基因治疗载体包括大小为至少5kbp的多核苷酸序列。在又一实施方式中，基因治疗载体包括大小为至少5.3kbp的多核苷酸序列。
此外，本发明的基因治疗载体优选结合了以下优点：高效且药学上可接受的转染载体(诸如AAV)，以及编码的心脏肌节蛋白通过心脏特异性启动子进行的心肌细胞/心肌特异性表达。因此，优选的是，基因治疗载体是，包括与编码心脏肌节蛋白的核酸序列可操作地连接的心脏特异性启动子的AAV载体。在第一优选实施方式中，AAV载体是AAV血清型6。在第二优选实施方式中，AAV载体是AAV血清型8。在第三优选实施方式中，AAV载体是AAV血清型9。特别优选的是，这些实施方式的任一个中，心脏特异性启动子是SEQIDNO:5的人TNNT2，或与其具有至少80％、更优选90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的功能等价序列。例如，基因治疗载体是，包括与编码心脏肌节蛋白的核酸序列可操作地连接的心脏特异性启动子的AAV9载体，其中，这些实施方式的任一个中，心脏特异性启动子是SEQIDNO:5的人TNNT2，或与其具有至少80％、更优选90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的功能等价序列。
如上所述，由基因治疗载体编码的心脏肌节蛋白优选为心脏肌球蛋白结合蛋白C(cMyBP-C)。如下面实施例所示，结合了心脏肌球蛋白结合蛋白C的表达、AAV载体和心肌细胞特异性启动子的优点的基因治疗载体，高效治疗患HCM的患者。
因此，在优选实施方式中，基因治疗载体是AAV血清型9载体，该AAV血清型9载体包括SEQIDNO:5的人TNNT2启动子或与其具有至少80％、更优选90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的功能等价序列，其中，启动子与编码cMyBP-C的核酸序列可操作地连接，该cMyBP-C优选是具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的鼠cMyBP-C或与其具有至少80％的序列同一性的序列，或者具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的人cMyBP-C蛋白或与其具有至少80％的序列同一性的序列。在更优选的实施方式中，基因治疗载体是AAV血清型9载体，该AAV血清型9载体包括SEQIDNO:5的人TNNT2启动子或与其具有至少80％、更优选90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的功能等价序列，其中，启动子与编码以下序列的核酸序列可操作地连接：具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的人cMyBP-C蛋白或与其具有至少80％序列同一性的序列。
因此，在另一个实施方式中，基因治疗载体是AAV血清型6载体，该AAV血清型6载体包括SEQIDNO:5的人TNNT2启动子或与其具有至少80％、更优选90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的功能等价序列，其中，启动子与编码cMyBP-C的核酸序列可操作地连接，该cMyBP-C优选是具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的鼠cMyBP-C或与其具有至少80％的序列同一性的序列，或者具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的人cMyBP-C蛋白或与其具有至少80％的序列同一性的序列。在更优选的实施方式中，基因治疗载体是AAV血清型6载体，该AAV血清型6载体包括SEQIDNO:5的人TNNT2启动子或与其具有至少80％、更优选90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的功能等价序列，其中，启动子与编码以下序列的核酸序列可操作地连接：具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的人cMyBP-C蛋白或与其具有至少80％序列同一性的序列。
因此，在另一个实施方式中，基因治疗载体是AAV血清型8载体，该AAV血清型8载体包括SEQIDNO:5的人TNNT2启动子或与其具有至少80％、更优选90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的功能等价序列，其中，启动子与编码cMyBP-C的核酸序列可操作地连接，该cMyBP-C优选是具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的鼠cMyBP-C或与其具有至少80％的序列同一性的序列，或者具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的人cMyBP-C蛋白或与其具有至少80％的序列同一性的序列。在更优选的实施方式中，基因治疗载体是AAV血清型8载体，该AAV血清型8载体包括SEQIDNO:5的人TNNT2启动子或与其具有至少80％、更优选90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的功能等价序列，其中，启动子与编码以下序列的核酸序列可操作地连接：具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的人cMyBP-C蛋白或与其具有至少80％序列同一性的序列。
可根据标准技术产生重组病毒载体。例如，重组腺病毒或腺相关病毒载体能在人293细胞(其提供反式E1A和E1B特性)中传播，以达到在107～1013个病毒颗粒/mL范围内的滴度。在体内应用之前，病毒载体可通过凝胶过滤方法(诸如琼脂糖柱)进行脱盐，并通过随后的过滤进行纯化。纯化降低给药载体的主体中潜在的有害作用。所给药的病毒基本上不含野生型病毒和可复制型病毒。能通过合适的方法，诸如十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，随后进行银染，来证明病毒的纯度。这同时适用于AAV载体和腺病毒载体。
如下面实施例所述，与动物模型中已示出的类似，通过全身应用，例如通过载体的静脉内、动脉内或腹膜内递送，能实现本发明的基因治疗载体转导到待治疗的主体中(Katzetal.,2012,GeneTher19:659-669)。在优选的实施方式中，基因治疗载体用于上述治疗或预防肥厚型心肌病的方法中，其中，基因治疗载体是全身给药的。
或者，通过直接给药到心脏组织，例如通过冠状动脉内给药，能够递送本发明的基因治疗载体。在优选的实施方式中，在使用标准5F或6F引导导管或诊断导管进行血管造影(经皮冠状动脉内递送，且没有脉管气囊闭塞)后，通过在心脏导管插入实验室中，在10分钟期间内进行顺行心外膜冠状动脉输注，以单一剂量给药基因治疗载体(Jaskietal.,2009,JCardFail15:171-181)。
在另一个优选的实施方式中，通过导管介导的心肌内递送，来实现心肌的组织转导(Gaoetal.,2011,HumGeneTher22:979-84)。重要的是，这种导管介导的心肌内递送也可用于将不含载体的cDNA(与增强转导的载剂联接或不联接)转移到心肌中。具有心脏趋向性的细胞来源的外来体或微粒也可用于输送本发明的载体(Leeetal.,2012,HumMolGenet21:R125-134)。用于人的AAV的合适剂量在约1×1010～1×1014个病毒颗粒的范围内，特别是约1×1012个病毒颗粒。
除病毒载体外，非病毒表达构建体也可用于将编码功能性心脏肌节蛋白或其功能变体或片段的基因导入细胞或人主体中。允许在靶细胞中体内表达蛋白的非病毒表达载体包括例如，诸如质粒pBK-CMV、pcDNA3.1和pZeoSV(Invitrogen,Stratagene)的载体。非病毒载体转入靶细胞的合适方法是例如脂质体转染法、磷酸-钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖法和使用微玻璃管等的直接DNA导入法。在引入载体之前，可用透化剂，诸如磷脂酰胆碱、链球菌溶血素、癸酸钠、癸酰基肉碱、酒石酸、溶血卵磷脂、TritonX-100等对心脏肌细胞进行处理。
或者，可在离体程序中，用载体转染例如通过活检程序已从主体取出的分离细胞。然后，可将细胞重新植入主体内或给药到主体，优选进入从其获得该细胞的主体内。在另一个方面，本发明因此涉及已用本发明的基因治疗载体转导的分离细胞，诸如肌细胞或干细胞。在载体转导后，细胞表达由载体编码的心脏肌节蛋白。上述细胞优选是心脏细胞(诸如心肌细胞)或源自诱导多能干细胞(iPSC)的心肌细胞。上述细胞还可以是干细胞，优选胚胎或成体多能干细胞(pluripotentadultstemcell)，更优选内源性心脏干细胞(eCSC)或者源自成纤维细胞(Okitaetal.,2007,Nature448:313-7；Yuetal.,207,Science318:1917-20；Maekawaetal.,2011,Nature474:225-229)、角化细胞(Aasenetal.,2008,NatBiotech11:1276-1284；Aasen&Belmonte,2010,NatProtocol5:371-382)或血细胞(Staerketal.,2010,StemCellStem7:20-24；Sekietal.,2012,NatProtocol7:718-728)的iPSC。
上述细胞进一步优选是人的细胞。当移出细胞的主体在基因上类似于给药细胞的主体时，对移植细胞的排斥可能性降低。因此，本发明的细胞优选是，经本发明的基因治疗载体离体转导的自体细胞。自体细胞经转导后，通过适当的给药方式，诸如移植或输注，将该细胞重新引入到主体内。
上述细胞优选用于治疗或预防主体的HCM的方法中，其中，在编码所述心脏肌节蛋白的基因中的突变与HCM相关，并且该主体携带损害所述心脏肌节蛋白功能的基因突变。
本发明进一步涉及一种包括本发明的基因治疗载体的药物组合物。在优选的实施方式中，该组合物用于治疗或预防具有功能障碍性心脏肌节蛋白的主体的HCM的方法中。
包括基因治疗载体的药物组合物的制备方法对制药领域的技术人员来说是众所周知的。通常情况下，将这样的组合物制备成液体溶液或悬浮液。本发明的药物组合物可包括通常使用的药学上可接受的赋形剂，诸如稀释剂和载剂。特别是，该组合物包括药学上可接受的载剂，例如，水、盐水、林格氏溶液或葡萄糖溶液。合适的载剂的其它实例描述在标准教科书中，例如，在“雷明顿药学大全(Remington’sPharmaceuticalSciences)”MackPub.Co.,NewJersey(1991)中。除载剂外，该组合物还可含有乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、染料等。
上述药物组合物将包括治疗有效的基因剂量。治疗有效的基因剂量是能预防或治疗主体的心肌病，而对主体没有毒性的基因剂量。可以与心肌病相关的表型特征变化来评估心肌病的预防或治疗，这样的变化对预防或治疗心肌病是有效的。与心肌病相关的表型特征是例如左心室(LV)肥厚、降低的短轴缩短率(fractionalshortening)、间质纤维化以及舒张和收缩功能障碍。治疗有效的基因剂量通常引起HCM表型的积极变化，即，大致从患HCM的主体的表型到不携带HCM基因突变的健康主体的表型的变化。因此，治疗有效的基因剂量通常是，当以生理上可耐受的组合物给药时，足以改善或预防经治疗的主体的病原性心脏表型的基因剂量。
另一个方面，本发明涉及通过引入基因治疗载体，以在主体中表达外源性核酸序列来治疗或预防主体的HCM的方法，所述载体包括：
(a)编码如在本文其它部分定义的心脏肌节蛋白的核酸序列，以及
(b)与上述核酸序列可操作地连接的心肌细胞特异性启动子，
其中，在编码上述心脏肌节蛋白的基因中的突变与HCM相关，并且上述主体携带损害上述心脏肌节蛋白功能的基因突变。
附图说明
图1：Mybpc3靶向敲入(KI)小鼠和野生型(WT)小鼠中的心脏分子分析。(A)使用Cre/lox系统获得Mybpc3基因中的G>A转换，并且在KI小鼠中产生三种不同的突变体mRNA。(B)WT和纯合KI小鼠心室组织中的总Mybpc3mRNA水平。(C)由使用特异性抗体的蛋白(Western)印迹确定的，在WT和KI心室组织中的cMyBP-C蛋白水平。小鼠的数量示于条棒中。
图2：在人心肌肌钙蛋白T启动子(hTNNT2)的控制下，表达带FLAG标签的小鼠Mybpc3的pGG2载体的线性(上图)示意图和环形(下图)示意图。
图3：在从Mybpc3靶向敲入(KI)的新生小鼠分离出的心肌细胞中，使用腺相关病毒血清型6进行的AAV6介导的FLAG-Mybpc3基因转移。(A)在KI心室RNA中进行的FLAG-Mybpc3(外源性Mybpc3mRNA)、总Mybpc3(内源性和外源性Mybpc3mRNA)和Myh6(编码α-肌球蛋白重链)mRNA的RT-PCR。“-RT”表示在cDNA反应期间没有逆转录酶。(B)从野生型(WT)和KI新生小鼠分离出的心肌细胞中，评估总Mybpc3的RT-qPCR，其中KI新生小鼠经AAV6-FLAG-Mybpc3转导(KIFLAG-Mybpc3)或未经转导(KIuntr)。(C)检测不同突变体Mybpc3的mRNA的RT-qPCR。(D)使用抗cMyBP-C抗体对从WT心肌细胞、KI心肌细胞或从HEK293(HEK)细胞提取的蛋白裂解物进行的Western印迹，其中这些细胞经GFP(GFP)转导或经FLAG-Mybpc3(Mybpc3)转导或未经转导(untr)。(E)经FLAG-Mybpc3转导的KI新生小鼠心肌细胞(NMCM)的免疫荧光分析。心肌细胞在转导(MOI3000)后7天进行固定，并且经抗FLAG(FLAG)抗体和抗cMyBP-C(cMyBP-C)抗体进行双染色。细胞核用DRAQ5TM进行染色。包括其更高放大倍率的合并图片示于右图上。比例尺被示出。
图4：源自Mybpc3靶向敲入(KI)心脏细胞的改造的心脏组织(EHT)中，AAV6介导的FLAG-Mybpc3基因转移。(A)使用特异性引物对来自EHT的RNA的RT-PCR，只检测到FLAG-Mybpc3的mRNA。(B)总Mybpc3的mRNA的RT-PCR。(C)在培养的第7天、第9天、第14天和第19天测定EHT的自发收缩活动。数据表示为平均值±SEM。*P<0.05和**P<0.01对GFP；#P<0.05和##P<0.01对对照(Ctrl)。
图5：在新生Mybpc3靶向敲入小鼠中，AAV9介导的FLAG-Mybpc3基因转移。(A)通过RT-PCR，评估心室、肝脏和骨骼肌中带FLAG标签的mRNA和总Mybpc3mRNA的RT-PCR。对照组：PBS给药。(B)在从心室、肝脏和骨骼肌提取的蛋白的Western印迹中，cMyBP-C蛋白的测定。(C)经AAV9-FLAG-Mybpc3转导的KI小鼠的心肌切片的免疫荧光分析。AAV9-FLAG-Mybpc3被给药到1日龄KI小鼠的颞脉中，持续7周。使用针对FLAG和cMyBP-C的抗体对冷冻切片(10μm厚)进行染色。包括其更高放大倍率的合并图片示于右图上。通过具有40×-油物镜的共聚焦显微镜进行免疫荧光分析。比例尺被示出。(D)通过对野生型(WT)小鼠、PBS治疗的敲入(KI-)小鼠和注射AAV9-FLAG-Mybpc3的KI(KI+)小鼠进行超声心动描记术，测定面积短轴缩短率(FAS)以及左心室质量与体重(LVM/BW)的比率。在3周龄、5周龄、6周龄和7周龄时进行评估。数据表示为平均值±SEM。*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001对WT小鼠。
图6：外源性人myc-MYBPC3在人心肌细胞中的表达。人心肌细胞源自人诱导多能干细胞(iPSC)并且经编码带myc-标签的人MYBPC3的腺病毒(10或30的MOI)转导。(A)iPSC来源的人心肌细胞中，外源性myc-MYBPC3的RT-PCR。用特异性引物扩增外源性MYBPC3的mRNA；用同时识别外源性和内源性MYBPC3的引物扩增总MYBPC3的mRNA。(B)源自iPSC的人心肌细胞中的外源性myc-cMyBP-C蛋白水平。使用针对myc标签序列(＝外源性myc-cMyBP-C)或针对cMyBP-C的CO-C1结构域(＝总cMyBP-C)的抗体，进行Western印迹分析。阳性对照(+)对应于经相同的腺病毒转导的小鼠心肌细胞的样品。(C)通过免疫荧光分析，定位源自iPSC的人心肌细胞中的外源性人myc-cMyBP-C；cMyBP-C：抗cMyBP-C抗体；myc：抗myc抗体，即，外源性cMyBP-C。比例尺被示于图中。缩写：NT即经未转导；MOI即感染复数；-RT，没有逆转录酶。
图7(图7.1示出图形/印迹A～C；图7.2示出图形/印迹D～E)：Mybpc3靶向敲入小鼠中的长期Mybpc3基因治疗。在心脏疾病表型出现之前，将不同剂量的腺相关病毒血清型9(AAV9)-Mybpc3(1×1011、3×1011、1×1012和3×1012载体基因组(vg)/小鼠)或PBS给药到1日龄的Mybpc3靶向敲入(KI)小鼠中。所有数据都是在34周后获得的。(A)对34周龄的WT小鼠、经PBS治疗的KI小鼠和以3×1012vg的最高剂量治疗的KI小鼠，分析收缩功能(＝dP/dtmax)和舒张功能(＝dP/dtmin)，并且测定心脏重量与体重的比率(HW/BW)。(B)RT-PCR用于评估外源性带FLAG标签的Mybpc3(上图)和总Mybpc3(下图)的mRNA水平。从心室组织中提取RNA，并且汇集各组(n＝5～10/组)的RNA。PCR扩增条带的大小示于左侧。(C)通过对34周龄的WT、经PBS治疗的KI和以3×1012vg最高剂量治疗的KI小鼠进行RT-qPCR，来测定总Mybpc3的mRNA水平。(D)Western印迹用于评估外源性带FLAG标签的cMyBP-C(上图)和总cMyBP-C(下图)的蛋白水平。汇集来自各组的心室蛋白提取物，以用于分析。使用针对FLAG表位或总cMyBP-C(在各种条件的上部)的抗体，对印迹进行染色。针对GAPDH的抗体用作上样对照(在各种条件的下部)。(E)cMyBP-C蛋白水平的量化相对于GAPDH进行标准化，并且显示与WT的关系。
具体实施方式
实施例
实施例1：在纯合Mybpc3靶向敲入小鼠中G>A转换的结果
对于离体和体内研究，通过使用Cre/lox系统的基因打靶，开发出了在Mybpc3基因(Mybpc3靶向敲入；KI)中携带G>A转换的敲入小鼠(Vignieretal.,2009,CircRes105:239-248)。简单地说，通过长片段PCR或从源自129/Svj小鼠品系的FIXII基因组库中进行克隆，获得含有小鼠Mybpc3基因的5’部分的8105bp的片段(覆盖了外显子1上游1747bp至外显子15)，然后将这一片段克隆到IIKS+载体(Stratagene)中。通过对258bp的PCR片段进行定点诱变(Stratagene)，使外显子6的最后一个核苷酸发生G>A转换，然后将其克隆到Eco47RI/NsiI位点中。
KI小鼠的表型表现正常，并且它们能活长达两年(Vignieretal.,2009,CircRes,105:239-248)。使用Vevo2100系统(VisualSonics，多伦多，加拿大)，对野生型(WT)小鼠和纯合KI小鼠进行超声心动描记术。用异氟烷(1～2％)麻醉小鼠，并以仰卧位将其固定在温暖的平台上。通过对成年小鼠使用MS400转导器并对新生小鼠使用MS550转导器，来获得B模式图像。在胸骨旁短轴和长轴视图中获得图像，并且在舒张和收缩时在短轴视图中测量左心室的尺寸。在出生后3～4个月，与WT小鼠相比，KI小鼠表现出左心室肥厚、短轴缩短率降低和间质纤维化(Vignieretal.,2009,CircRes,105:239-248)。
G>A转换产生了三种不同的突变体mRNA(参见图1A)。突变体1(错义)含有G>A转换，并且产生约150kDa的E264K突变体蛋白。突变体2(无义)是遗漏了外显子6的结果，这导致移码并且在外显子9中出现提前终止密码子(PTC)。预期的蛋白为32kDa。突变体3也是遗漏了外显子6且保留了部分内含子8的结果，这恢复阅读框。在这种情况下，产生了147kDa的突变体蛋白。这些突变体都不编码功能性蛋白。
从纯合KI小鼠和WT小鼠的心室组织中提取RNA或蛋白。根据制造商的说明书，使用SV总RNA分离系统试剂盒(SVTotalRNAIsolationSystemKit，Promega)，从心室组织(30mg)中分离总RNA。使用ND-1000分光光度计(ThermoScientific)，测定RNA的浓度、纯度和质量。使用寡脱氧胸苷酸(oligo-dT)引物(试剂盒,LifeTechnologies)，从150～200ngRNA进行逆转录(RT)。使用引物#1(正向：5’-GGATTACAAGGATGACGACGA-3’；SEQIDNO:9)和引物#2(反向：5’-TCCAGAGTCCCAGCATCTTC-3’；SEQIDNO:10)和SYBR绿，进行定量聚合酶链反应(qPCR)。总Mybpc3的mRNA的水平在纯合KI小鼠中比在野生WT小鼠中低80％(图1B)。
在4℃下，在5％SDS、pH7.5的50mMTris-HCl、250mM蔗糖、75mM尿素、1mMDTT中使约15mg的心室组织均质化，并且在13000rpm下离心2分钟，从而获得粗蛋白提取物。收集上清液，并且使用BCA蛋白测定试剂盒(BCAProteinAssayKit，Pierce)测定其浓度。将蛋白加载在10％丙烯酰胺/双丙烯酰胺(29:1)凝胶上，并且电转移至0.45μm孔径的硝酸纤维素膜(Invitrogen)上。用针对cMyBP-C的多克隆抗体(C0-C11:1,000)对膜进行染色。第二抗体与HRP偶联(Sigma)。用WestPico化学发光底物(Pierce)显示信号，并且用ChemiImagerTM5500(AlphaInnotech)获取信号。使用NIH图像(NIHImage)1.63软件对信号进行量化。纯合Mybpc3靶向敲入小鼠仅表达低水平的突变体蛋白(图1C)。
结果表明，存在低水平的包括突变体多肽(＝有毒多肽)的cMyBP-C蛋白(＝单倍不足)，导致左心室肥厚和功能障碍，这是肥厚型心肌病的标志。
实施例2：含有FLAG-Mybpc3的载体的生成
首先，使用含有XhoI限制性酶切位点和FLAG序列的正向引物#3(5’-TTCGACCTCGAGATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGCCTGGTGTGACTGTTCTCAA-3’；SEQIDNO:11)和含有BamHI限制性酶切位点的反向引物#4(5’-TTCGACGGATCCCTGGTCACTGAGGAACTCG-3’；SEQIDNO:12)，对小鼠心室RNA进行RT-PCR，以扩增包括外显子1～34的带FLAG标签的小鼠Mybpc3的全长cDNA(GenBank登录号NM_008653.2)，来构建载体pGG2-hTNNT2-WT-Mybpc3。使用正向引物#5(5’-AAAAAAACGCGTCTCAGTCCATTAGGAGCCAGTAGC-3’；SEQIDNO:13)和反向引物#6(5’-CCCTGGCCCCAAGCTTCTGCCGACAGATCCAGGCG-3’；SEQIDNO:14)进行PCR，从人cDNA库中初始扩增出从碱基-502至碱基+42(GenBank登录号NG_007556.1；SEQIDNO:5)的人心肌肌钙蛋白T(TNNT2)的5’区域，这已被证明能提高基因表达(Dominguezetal.,2011,HumMolGenet20,681-93)，其中上述引物能用MluI/HindIII限制性内切酶克隆在含有海肾荧光素酶报告基因(pdsTNNT2(-502+42)-Rluc)和嵌合(□-球蛋白/Ig)内含子的质粒中。对于pGG2-hTNNT2-WT-Mybpc3质粒的生成，使用限制性内切酶EcoRI和NheI剪切hTNNT2启动子和嵌合内含子(SEQIDNO:7；图2)，并连接到含有SVpolyA信号(SEQIDNO:6)的pGG2质粒载体中。总之，载体大小为9027bp(图2)，在两个ITR之间插入了5.4kbp(图2)，这超过了腺相关病毒的包装能力(AAV；Wuetal.,2010,MolTher18:80-86)。
用两种(AAV6；Mulleretal.,2006,CardiovascRes70:70-78)或三种(AAV9；Kayaetal.,2011,CardiovascRes91:116-123)质粒的转染方法，产生AAV6和AAV9假型载体。使用pGG2-hTNNT2-WT-Mybpc3转移质粒和AAV包装质粒pDP6rs(提供AAV2rep和AAV6cap基因，以及腺病毒辅助功能)对HEK293T细胞进行共转染，来产生AAV6假型载体(Grimmetal.,2003,MolTher,7:839-850)。通过pGG2-hTNNT2-WT-Mybpc3转移质粒与编码腺病毒辅助功能的p5E18-VD2-9和pDGdeltaVP进行三重转染，产生AAV9假型载体(Kayaetal.,2011,CardiovascRes91:116-23)。如前所述(Griegeretal.,2006,NatProtoc1:1412-1428)，并进行了一些修改，来产生重组的AAV6和AAV9颗粒。如前所述(Hauswirthetal.,2000,MethodsEnzymol316:743-761)，使用聚乙烯亚胺(PEI)将质粒转染到在直径为15cm的细胞培养器(cellstack)或板中的293THEK细胞中。在补充有10％(v/v)热灭活的胎牛血清、0.1mMMEM非必需氨基酸、2mML-谷氨酰胺、100UI/ml青霉素和100μg/ml链霉素的高葡萄糖DMEM中，培养HEK293T-AAV细胞。组织培养试剂从Lifetechnologies公司购得。72小时后收获细胞，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤三次。在三次冻融循环后，在37℃下添加核酸酶(benzonase，Merck；250U/ml)，并保持1小时。使细胞碎片成块状，并且用碘克沙醇分级梯度纯化含载体的裂解物(Hauswirthetal.,2000,MethodsEnzymol316:743-761)。
如先前报道的(Veldwijketal.,2002,MolTher6:272-278)，使用SYBRGreenqPCRMasterMIX2(Fermentas)和ABI7900HTcycler(循环仪)(AppliedBiosystem)进行qPCR，来测定抗DNase的AAV颗粒的基因组效价。使用对TNNT2启动子序列特异性的引物#7(正向：5’-CTCAGTCCATTAGGAGCCAGT-3’；SEQIDNO:15)和引物#8(反向：5’-AAGAAGGCAACCTCCACA的CT-3’；SEQIDNO:16)对载体进行量化。以每种引物为0.3μM且总体积为10μl的方式进行实时PCR。pdsAAV-TNNT2-eGFP质粒用作拷贝数标准。通过各质粒DNA的连续稀释，生成定量的标准曲线。循环条件如下：50℃/2分钟，95℃/10分钟，接着是95℃/15秒和60℃/60秒的35个循环。使用SDS2.4软件(AppliedBiosystem)进行计算。
实施例3：在基因转移到由Mybpc3靶向新生KI小鼠分离的心肌细胞中之后，Mybpc3mRNA和cMyBP-C蛋白水平的评估和定位
如前所述(Vignieretal.,2009,CircRes105:239-248)，从新生小鼠心脏中分离出新生小鼠心肌细胞。在铺板前(4.4×105个细胞/孔)，在37℃下在悬浮液中，立即用在hTNNT2控制下的AAV6-FLAG-Mybpc3以3000的感染复数(MOI)转导心肌细胞30分钟。在37℃和10％CO2下培养心肌细胞7天，然后收获心肌细胞。
将HEK293细胞以2×105个细胞的密度铺在12孔培养皿中，并且在DMEM(10％FCS，1％青霉素-链霉素)中，在37℃下、7％CO2下进行孵育，直到达到推荐的50～70％的融合。根据制造商的方案，使用TurboFect转染试剂(Fermentas)将FLAG-Mybpc3质粒瞬时转染到贴壁的HEK293细胞中。
根据制造商的说明书，使用SVTotalRNAIsolationSystemKit(SV总RNA分离系统试剂盒，Promega)从培养的心肌细胞中分离总RNA。使用ND-1000分光光度计(ThermoScientific)测定RNA的浓度、纯度和质量。使用oligo-dT引物(试剂盒,LifeTechnologies)对150～200ngRNA进行RT。作为基因组污染的对照，进行没有RT的反应。使用以下不同的引物对，在20μl的总体积中，使用GoldPolymerase(金聚合酶)(AppliedBiosystems)进行降落PCR扩增(65℃～60℃)，进行35个循环：使用正向引物#9(5’-GGATTACAAGGATGACGACGA-3’；SEQIDNO:17)和反向引物#10(5’-TCCAGAGTCCCAGCATCTTC-3’；SEQIDNO:18)扩增FLAG-Mybpc3mRNA；使用正向引物#11(5’-CCTGGTGTGACTGTTCTCAA-3’；SEQIDNO:19)和反向引物#12(5’-TCCAGAGTCCCAGCATCTTC-3’；SEQIDNO:20)扩增总Mybpc3mRNA；使用正向引物#13(5’-CTCAAGCTCATGGCTACACTCTTCTC-3’；SEQIDNO:21)和反向引物#14(5’-AGAGCAGACACTGTTTGGAAGGA-3’；SEQIDNO:22)扩增Myh6mRNA(编码α-肌球蛋白重链)。在1.5％琼脂糖凝胶上使PCR产物可视化(图3A)。在未经转导的细胞(Untr.)中，仅检测到突变体mRNA(总Mybpc3图)。相比之下，在AAV6-FLAG-Mybpc3基因转移到KI心肌细胞中之后，检测到FLAG-Mybpc3mRNA(FLAG-Mybpc3图)，并且与突变体mRNA的水平降低相关(总Mybpc3图)。Myh6的水平在各组之间没有差异(Myh6图)。使用正向引物#15(5’-GATGCGAGCCCTGATGAC-3’；SEQIDNO:23)和反向引物#16(5’-GACAGATTGCACTTTCTTCC-3’；SEQIDNO:24)和SYBR绿的定量PCR进一步表明，在用AAV6-FLAG-Mybpc3转导的KI心肌细胞中的总Mybpc3mRNA水平达到在WT心肌细胞中发现的水平(图3B)。此外，使用特异性水解的Taqman探针进行定量PCR，以确定不同突变体mRNA的水平：用探针#1(5’-VIC-CTCACTGTCCATAAGG-MGB-3’；SEQIDNO:25)显示突变体1；用探针#2(5’-FAM-CCAGCAAGAGGCCA-MGB-3’；SEQIDNO:26)显示突变体2+3；并且用探针#3(5’-FAM-TCGGAGAACCAGCCCCTGCTAGCTC-TAMRA-3’；SEQIDNO:27)显示突变体-3。这表明，突变体1和突变体3的mRNA完全不存在，而突变体2的mRNA水平在来自经AAV6-FLAG-Mybpc3转导的KI的KI心肌细胞中显著降低(图3C)。
从裂解缓冲液(30mMpH8.8的Tris碱、5mMEDTA、30mMNaF、3％SDS、10％甘油)中，提取来自培养的转导心肌细胞或转染的HEK293细胞的粗蛋白，并且通过Bradford蛋白检测(BioRad)测定蛋白浓度。将总蛋白(心肌细胞30μg/泳道，HEK2932.5μg/泳道)在10％SDS聚丙烯酰胺(29:1)微凝胶(BioRad)上进行分离，并且通过电印迹转移到PVDF膜上。用针对cMyBP-C的MyBP-C基序的第一抗体对膜(1:1000)进行染色，过夜。在与抗兔(1:6000，Sigma)的过氧化物酶共轭的第二抗体孵育后，使用SuperWestDura检测试剂(ThermoScientific)使蛋白可视化，并且用ChemiGenius2BioImagingSystem(生物成像系统)检测信号。Western印迹分析示出在所有泳道中均有特异性的cMyBP-C条带。此外，在AAV6-FLAG-Mybpc3转导的KI心肌细胞中的cMyBP-C水平达到在未转导的WT心肌细胞中发现的水平(图3D)。
进行免疫荧光分析，以检查转基因的带FLAG标签的cMyBP-C蛋白的定位(图4D)。在固定细胞，并且用针对FLAG表位和总全长cMyBP-C蛋白的抗体染色后，通过共聚焦显微镜分析经AAV6-TNNT2-FLAG-WT-Mybpc3(MOI3000)转导的KI心肌细胞。使用抗cMyBP-C抗体对转导的心肌细胞的免疫荧光示出，总cMyBP-C蛋白的经典条纹图案位于肌节A带的二联管中(图4D，cMyBP-C)。此外，FLAG阳性信号(图4D；FLAG)与cMyBP-C蛋白条纹共定位，从而证实了转基因的带FLAG标签的cMyBP-C蛋白的正确并入肌节中。
这些数据表明，Mybpc3基因转移到KI心肌细胞中补救了cMyBP-C单倍不足，同时防止了突变体等位基因的转录，以及毒性突变体cMyBP-C蛋白的积累。
实施例4：将基因转移到源自Mybpc3靶向KI新生心脏的改造的心脏组织中之后，内源性突变体和外源性野生型Mybpc3的表达
取得源自野生型(WT)和MYBPC3靶向敲入(KI)新生小鼠(0～1日龄)的心脏，用于使用胰蛋白酶/胶原酶进行过夜消化以使细胞分离(Laugwitzetal.,2005,Nature433:647-653；Morettietal.,2006,Cell127:1151-65)。为了生成改造的心脏组织(EHT)，如下在冰上制备重建混合物(终浓度)：未纯化的6.8×106个细胞/ml、5mg/ml牛纤维蛋白原(原液：在0.9％NaCl中的200mg/ml加抑肽酶、0.5μg/ml纤维蛋白原，SigmaF4753)，100μl/ml基质胶(Matrigel，BDBioscience356235)。添加2×DMEM，以匹配纤维蛋白原和凝血酶原液(100U/ml，SigmaAldrichT7513)的体积，以确保等渗条件。如前所述制备铸模(Hansenetal.,2010,CircRes107:35-44)。
在铸型前，以1000或3000的MOI将AAV6-FLAG-Mybpc3或AAV6-FLAG-GFP，或无病毒的对照直接添加到EHT主混合物(mastermix)中。使2×DMEM的体积适于病毒的体积，以保持等渗条件。对于各EHT，将97μl重建混合物与3μl凝血酶简单混合，并移液到琼脂糖槽中。对于纤维蛋白原聚合，将构建体放置在37℃、7％CO2加湿的细胞培养箱中，保持2小时。将架子(rack)转移至填充有培养基的24孔板。使EHT保持在37℃、7％CO2加湿的细胞培养箱中。细胞培养基在48小时后发生变化，并且由DMEM(BiochromF0415)、10％马血清(Gibco26050)、2％鸡胚提取物、1％青霉素/链霉素(Gibco15140)、胰岛素(10μg/ml，Sigma-AldrichI9278)和抑肽酶(33μg/ml，SigmaAldrichA1153)组成。在EHT培养的第5天，将胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(25μg/ml，Sigma-AldrichC1768)添加到培养基中，保持48小时。通过视频光记录，监测第7～19天的EHT的自发收缩活动(Hansen,etal.,2010,CircRes107,35-44)。自动记录并评估收缩图。如最近出版的，CTMV软件(普福尔茨海姆(Pforzheim)，德国)用于测量小鼠EHT的自发收缩(Hansenetal.,2010,CircRes107:35-44；etal.,2013,JMolCellCardiol63:189-98)。为了这个目的，，将24孔平板放置在CO2、湿度和温度受控的细胞培养箱装置中，该细胞培养箱具有玻璃顶盖以用于监测。以PC控制的方式，将巴斯勒(Basler)相机(A602f-2型)放置在细胞培养装置的上方。在测量时间的过程中，在收缩期间记录肌条端部之间的距离。根据最近出版的基于后几何、Sylgard(硅橡胶)184(DowCorning)的弹性模量和后距离(后偏转)的δ的公式(Vandenburghetal.,2008,MuscleNerve,37:438-47)，来计算力。在记录的收缩图中的方块表示所识别的峰，采集这些峰用于频率、平均力、收缩和舒张时间(分别为T1、T2)的计算。在峰最大值的10％处确定T1和T2。在实验结束时，从柱子上除去EHT，并提取总RNA。
如实施例3中描述的扩增FLAG-Mybpc3mRNA，仅在转导的EHT中检测到FLAG-Mybpc3mRNA，并且其水平随着MOI增加而增加(图4A)。此外，对所有类型的Mybpc3mRNA(总Mybpc3，如实施例3中描述的)的PCR扩增表明(图4B)：i)在未经转导的KI-EHT中和在经AAV6-GFP转导的EHT中，都检测到相似水平的不同突变体的mRNA；ii)在KIEHT中转移有FLAG-Mybpc3基因产生单一类型的mRNA。该mRNA的水平与在WT-EHT中检测到的水平相同。这表明，在源自KI新生心脏细胞的EHT中，FLAG-Mybpc3的基因转移修复了mRNA的单倍不足并且降低了突变体mRNA的含量。
通过视频光记录，监测EHT在培养的第7～19天的自发收缩活动(图4C)。在所有组中，在14天达到最大的力。所显现的力在KI(约65μN)中比在WTEHT(约40μN，数据未示出)中高，这表明超收缩性。KIEHT在Mybpc3基因转移后所显现的力显著低于其它组(图4C)，到达先前在WTEHT中发现的水平。
总之，这些数据显示，在源自KI新生心脏细胞的EHT中的FLAG-Mybpc3的基因转移补救分子表型(没有单倍不足并且没有突变体mRNA)和功能(不存在超收缩性)。
实施例5：在Mybpc3靶向KI新生小鼠中的基因转移后，内源性突变体和外源性野生型Mybpc3的表达
所有体内的实验研究均依照NIH出版的《实验动物护理和使用指南》(公开号85-23，1985年修订)以及保护动物的德国法律(GermanLawfortheProtectionofAnimals)，并且得到了德国汉堡市州的科学和公共卫生部(Nr.69/10)的认可。
如前所述(Dominguezetal.,2011,HumMolGenet20:681-693)，使用30-G针进行颞脉注射(SandsandBarker,1999,LabAnimSci,49:328-330)，将AAV9-FLAG-Mybpc3(5×1012个载体基因组(vg))或PBS(作为对照)给药到3日龄小鼠中。所有小鼠在注射后迅速恢复。通过超声心动描记术(见实施例1中的详细说明)，从3周龄开始每周进行心脏表型的评估。杀死7周龄的小鼠并提取不同器官。提取RNA和蛋白。通过如实施例3中描述的RT-PCR，评估心室、肝脏和骨骼肌中的FLAG-Mybpc3mRNA和总Mybpc3mRNA(图5A)。
FLAG-Mybpc3mRNA在心室中的水平比在其它器官中高得多(图5A，FLAG-Mybpc3上图)。在心室中，在对照KI小鼠中扩增出不同的突变体Mybpc3mRNA(图5A，总Mybpc3下图)，而在野生型对照小鼠和用AAV9-FLAG-Mybpc3转导的KI小鼠中检测到主要的单一条带(图5A，总Mybpc3图)。在FLAG-Mybpc3基因转移后，在肝脏和骨骼肌中也检测到条带，但比心室中的水平低。
使用针对cMyBP-C的抗体以如实施例3中所述的方式进行Western印迹分析，并且揭示了：在AAV9-FLAG-Mybpc3基因转移后，cMyBP-C蛋白水平比注射PBS或AAV9-GFP的KI小鼠高，并且达到WT小鼠中发现的水平(图5B)。由于载体的心脏特异性，在Mybpc3基因转移后，在肝脏和骨骼肌中未检测到cMyBP-C蛋白(图5B)。
为了检查外源性表达的带FLAG标签的cMyBP-C蛋白的定位，使用针对FLAG表位和总cMyBP-C蛋白的抗体，对注射AAV9-FLAG-Mybpc3达7周的KI小鼠的心室冷冻切片进行免疫荧光分析。该染色显示出，cMyBP-C蛋白的经典条纹图案位于肌节A带的二联管中(图5C；cMyBP-C)，并且与FLAG信号完全共染色(图5C；FLAG)。用DRAQ5TM对细胞核进行染色。总之，过表达的cMyBP-C蛋白被正确地并入肌节内，并且大部分FLAG阳性的横纹心肌细胞与总cMyBP-C蛋白共染色，这表明外源性cMyBP-C蛋白取代了内源性cMyBP-C蛋白突变体。
如在上述实施例1中所述，进行超声心动描记术分析。在3、5、6和7周龄的野生型(WT)、注射PBS的敲入(KI-)小鼠和注射AAV9-FLAG-Mybpc3(KI+)的KI小鼠中，测定面积短轴缩短率(FAS)以及左心室质量与体重(LVM/BW)的比率。通过超声心动描记术对心脏功能的评估示出，在FLAG-Mybpc3基因转移后，面积短轴缩短率(FAS)得到补救并且左心室质量与体重(LVM/BW)的比率降低(图5D)。
总之，这些数据表明，在新生KI小鼠中AAV9-FLAG-Mybpc3的单一给药补救了分子表型(没有cMyBP-C单倍不足也没有突变体多肽)和功能表型(没有左心室肥厚和功能障碍)。
实施例6：在源自诱导多能干细胞的人心肌细胞中，外源性野生型myc-MYBPC3的表达。
通过对来自人对照个体的皮肤活检扩增的成纤维细胞进行重编程，来生成诱导多能干细胞(iPSC)。根据GordonKeller组的方案(YangLetal.,2008,Nature22:524-8)，对心肌细胞分化进行了适应性改变。
在分化后，将人心肌细胞以2×105个细胞/孔的密度铺在12孔板中，用于RNA和蛋白分析，或者以2.5×104个细胞/室的密度铺在四室平皿(35mm直径)中，用于免疫荧光分析。用编码人myc-cMyBP-C(DNA序列：SEQIDNO:29接着SEQIDNO:1)的带myc标签的MYBPC3腺病毒，以不同的MOI对心肌细胞进行转导，保持8天。
带myc标签的人MYBPC3质粒的构建如前所述(FlavignyJetal.,1999,JMolBiol294,443-456；Sarikasetal.,2005,CardiovascRes66:33–44)。简要地说，将ATG加编码myc表位(SEQIDNO:30)的30个核苷酸的序列(SEQIDNO:29)插入在CMV启动子(SEQIDNO:31)的后面并且在人MYBPC3cDNA(SEQIDNO:1)的前面。插入序列编码带myc标签的人cMyBP-C(SEQIDNO:32)。如前所述，通过将插入序列(带myc标签的人MYBPC3cDNA)克隆到穿梭载体pAdTrack-CMV中，随后将该质粒与pAdEasy-1共转化大肠杆菌，以产生重组腺病毒(HeTetal.,1998ProcNatlAcadSciUSA95,2509-2514)。通过组成型活性的CMV启动子(SEQIDNO:31)驱动cMyBP-C的表达。
如前所述，通过RT-PCR，评估在人心肌细胞中不同MYBPC3mRNA(外源性myc-MYBPC3和总MYBPC3)的转录(图6A)。用特异性引物(在myc序列中的正向引物5’-GCAAAAGCTTATTAGCGAGGAA-3’(SEQIDNO:33)和在外显子2中的反向引物5’-CAGGCCGTACTTGTTGCTG-3’(SEQIDNO:34))扩增外源性MYBPC3mRNA；并且用同时识别内源性MYBPC3和外源性MYBPC3的引物(在外显子1中的正向引物5’-GGGGAAGAAGCCAGTCTCAG-3’(SEQIDNO:35)和在外显子2中的反向引物5’-CAGGCCGTACTTGTTGCTG-3’(SEQIDNO:34))扩增总MYBPC3mRNA。Myc-MYBPC3mRNA的水平随着病毒剂量的增加而增加(图6A，左图)。在非转导的细胞(NT)和缺乏逆转录酶(-RT)的阴性对照中，未检测到Myc-MYBPC3mRNA。
如前所述，使用针对cMyBP-C的CO-C1结构域的抗体(图6B，总cMyBP-C，由合作者友情提供)或针对myc标签的抗体(图6B，外源性myc-cMyBP-C(兔多克隆Sigma；目录号#C3956))进行Western印迹分析。阳性对照(+)是经相同病毒转导的小鼠心肌细胞的样品。在腺病毒基因转移后，总cMyBP-C的水平略有增加，而在非转导(NT)的样品中不存在带myc标签的cMyBP-C蛋白，并且带myc标签的cMyBP-C蛋白的水平随着MOI的增加而增加(图6B)。
通过免疫荧光，分析外源性myc-cMyBP-C在源自iPSC的人心肌细胞中的定位。用抗cMyBP-C的抗体对人心肌细胞进行染色(图6C，cMyBP-C)，示出预期的肌节横纹。用抗myc的抗体对外源性cMyBP-C进行染色(图6C，myc)。抗myc的抗体与位于蛋白N末端的myc标签结合。观察到，外源性带myc标签的cMyBP-C被正确地并入到源自人iPSC的心脏细胞的肌节中，作为A带中的二联管。
这些数据首次示出，外源性人myc-MYBPC3在源自iPSC的人心肌细胞中的表达。外源性人myc-MYBPC3的表达产生并入肌节中的稳定的人cMyBP-C蛋白。因此，MYBPC3cDNA的过表达可用于人肥厚型心肌病的基因治疗中。
实施例7：长期Mybpc3基因治疗恢复了Mybpc3mRNA的水平，并且部分预防了在Mybpc3靶向敲入小鼠中的心肌肥厚和功能障碍。
在心脏疾病表型出现之前，将不同剂量的腺相关病毒血清型9(AAV9)-Mybpc3(1×1011、3×1011、1×1012和3×1012载体基因组(vg)/小鼠)或PBS给药到1日龄Mybpc3靶向敲入(KI)小鼠的颞脉中。在34周后，对小鼠进行体内血流动力学和组织分析。WT小鼠作为对照。
对34周龄的WT小鼠、经PBS治疗的KI小鼠和以3×1012vg最高剂量治疗的KI小鼠，分析收缩功能(＝dP/dtmax)和舒张功能(＝dP/dtmin)，并且测定心脏重量与体重(HW/BW)的比率(图7.1A)。与WT相比，在KI小鼠中，通过Mybpc3基因治疗预防了收缩功能轻微降低、舒张功能显著降低和HW/BW比率的显著增加。
此外，进行了RT-PCR，来评估外源性带FLAG标签的Mybpc3mRNA(图7.1B，上图)和总Mybpc3mRNA(下图)的水平。从心室组织中提取RNA，并且将其汇集到各组(n＝5～10/组)中。PCR扩增条带的大小示于图7.1B的左侧。这示出了Mybpc3(包括仅外源性Mybpc3和总Mybpc3)的表达以AAV9-Mybpc3剂量依赖的方式增加。重要而又相反的是，突变体mRNA的表达(由突变体-1、突变体-2和突变体-3的扩增子来表示)以AAV9-Mybpc3剂量依赖的方式降低。
此外，通过对34周龄的WT、经PBS治疗的KI和以3×1012vg最高剂量治疗的KI小鼠进行的RT-qPCR，测定总Mybpc3mRNA的水平(图7.1C)。与WT相比，通过Mybpc3基因疗法在KI小鼠中完全防止了Mybpc3mRNA水平显著降低。
进行Western印迹分析，来评估外源性带FLAG标签的cMyBP-C(图7.2D，上图)和总cMyBP-C(下图)的蛋白水平。汇集来自每组的心室蛋白提取物以进行分析。使用针对FLAG表位或总cMyBP-C的抗体对印迹进行染色(各种条件的上部)。针对GAPDH的抗体用作上样对照(各种条件的下部)。对于Mybpc3mRNA，示出MyBP-C(包括仅外源性MyBP-C和总MyBP-C)的蛋白水平以AAV9-Mybpc3剂量依赖的方式增加。
对cMyBP-C蛋白水平进行量化，相对于GAPDH进行标准化并且显示与WT的关系(图7.2E)。与WT相比，通过Mybpc3基因疗法在KI小鼠中显著防止了cMyBP-C水平的显著降低。
总之，这些数据表明，长期Mybpc3基因治疗不仅恢复了在KI小鼠中的Mybpc3WT的水平，而且还防止了突变体Mybpc3mRNA的转录。这两者部分地显著防止了左心室肥厚的发展和舒张功能障碍，(即肥厚型心肌病的关键特征)。
Claims (16)
1.一种表达外源性核酸序列的基因治疗载体，包括：
(a)编码功能性心脏肌节蛋白的核酸序列，以及
(b)与所述核酸序列可操作地连接的心肌细胞特异性启动子，
所述基因治疗载体用于治疗或预防哺乳动物主体的肥厚型心肌病的方法中，其中，所述主体在编码所述心脏肌节蛋白的基因中携带促使发生肥厚型心肌病的突变。
2.根据权利要求1所述的用于所述方法的基因治疗载体，其中，所述心脏肌节蛋白选自由β-肌球蛋白重链、室性肌球蛋白必需轻链1、室性肌球蛋白调节轻链2、心脏α-肌动蛋白、α-原肌球蛋白、心肌肌钙蛋白T、心肌肌钙蛋白I、心脏肌球蛋白结合蛋白C、四加半LIM蛋白1和肌联蛋白组成的组。
3.根据权利要求1或2所述的用于所述方法的基因治疗载体，其中，所述心肌细胞特异性启动子是人心肌肌钙蛋白T的启动子(hTNNT2)。
4.根据权利要求3所述的用于所述方法的基因治疗载体，其中，所述hTNNT2启动子包括SEQIDNO:5的序列或者与SEQIDNO:5的序列具有80％序列同一性的序列。
5.根据权利要求1～4所述的用于所述方法的基因治疗载体，其中，所述心脏肌节蛋白是心脏肌球蛋白结合蛋白C(cMyBP-C)。
6.根据权利要求5所述的用于所述方法的基因治疗载体，其中，所述cMyBP-C蛋白包括SEQIDNO:2的序列或者与SEQIDNO:2的序列具有80％序列同一性的变体。
7.根据权利要求1～6所述的用于所述方法的基因治疗载体，其中，所述载体是质粒或病毒载体。
8.根据权利要求7所述的用于所述方法的基因治疗载体，其中，所述病毒载体选自由腺相关病毒、腺病毒、逆转录病毒、正粘病毒、副粘病毒、乳多空病毒、细小核糖核酸病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒和甲病毒组成的组。
9.根据权利要求1～8所述的用于所述方法的基因治疗载体，其中，所述主体是人。
10.根据权利要求1～9所述的用于所述方法的基因治疗载体，其中，所述载体被配制用于通过静脉内注射或心内注射，或通过输注给药到心肌内。
11.根据权利要求1～10所述的用于所述方法的基因治疗载体，其中，所述外源性核酸序列的表达在所述主体中提供正常水平的所述心脏肌节蛋白，并且降低该蛋白的非功能性突变体形式的水平。
12.一种经根据权利要求1～11所述的载体转导的分离细胞。
13.根据权利要求11所述的分离细胞，所述分离细胞是人的细胞。
14.根据权利要求11或12所述的分离细胞，所述分离细胞是心脏细胞。
15.根据权利要求11或12所述的分离细胞，所述分离细胞是成体多能干细胞。
16.一种药物组合物，包括根据权利要求1～11所述的基因治疗载体或根据权利要求12～15所述的细胞。
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Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108815535A (zh) * | 2018-08-08 | 2018-11-16 | 哈尔滨医科大学 | 一种抗心肌肌钙蛋白抗体修饰并载有miR-21的脂质体及其制备方法和应用 |
| CN110609078A (zh) * | 2019-09-20 | 2019-12-24 | 南京谱利健生物技术有限公司 | 一种检测蛋白磷酸化和乙酰氨基葡萄糖化关联作用的方法 |
| CN110714025A (zh) * | 2018-07-13 | 2020-01-21 | 中国农业大学 | 一种靶向猪ttn基因的打靶载体及其应用 |
| CN111107880A (zh) * | 2017-09-20 | 2020-05-05 | 加利福尼亚大学董事会 | 用于恢复致心律失常性右室心肌病中的电性和心脏功能以及心脏结构的基因疗法策略 |
| CN112011501A (zh) * | 2020-08-26 | 2020-12-01 | 福建省医学科学研究院 | 一种携带c.3369-3370 insC突变的HCM特异性诱导多能干细胞系 |
| CN116096394A (zh) * | 2020-02-13 | 2023-05-09 | 特纳亚治疗股份有限公司 | 用于治疗心脏病的基因疗法载体 |
Families Citing this family (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| EP3230441A4 (en) | 2014-12-12 | 2018-10-03 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the production of scaav |
| CN105483092A (zh) * | 2015-10-10 | 2016-04-13 | 和元生物技术（上海）股份有限公司 | 一种中试化生产重组腺相关病毒的新技术 |
| US11299751B2 (en) | 2016-04-29 | 2022-04-12 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions for the treatment of disease |
| KR102392236B1 (ko) | 2016-05-18 | 2022-05-03 | 보이저 테라퓨틱스, 인크. | 조절성 폴리뉴클레오티드 |
| SG11201809643UA (en) | 2016-05-18 | 2018-12-28 | Voyager Therapeutics Inc | Compositions and methods of treating huntington's disease |
| AU2017313844B2 (en) | 2016-08-19 | 2023-10-12 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Methods and compositions for treating conditions using recombinant self-complementary adeno-associated virus |
| EP3831281A1 (en) | 2016-08-30 | 2021-06-09 | The Regents of The University of California | Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same |
| US11958886B2 (en) | 2016-12-07 | 2024-04-16 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | IL-1RA cDNAs |
| CA3061652A1 (en) | 2017-05-05 | 2018-11-08 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als) |
| EP3619308A4 (en) | 2017-05-05 | 2021-01-27 | Voyager Therapeutics, Inc. | COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT FOR HUNTINGTON'S MORBUS |
| IT201700062176A1 (it) * | 2017-06-07 | 2018-12-07 | Univ Degli Studi Milano | Metodo per l’isolamento di sottopopolazioni di progenitori cellulari cardiaci e relativi usi in campo medico |
| JOP20190269A1 (ar) | 2017-06-15 | 2019-11-20 | Voyager Therapeutics Inc | بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون |
| JP7229989B2 (ja) | 2017-07-17 | 2023-02-28 | ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド | 軌道アレイガイドシステム |
| KR20200044793A (ko) | 2017-08-03 | 2020-04-29 | 보이저 테라퓨틱스, 인크. | Aav의 전달을 위한 조성물 및 방법 |
| JP7502991B2 (ja) | 2017-10-16 | 2024-06-19 | ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド | 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）の治療 |
| WO2019079242A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | Voyager Therapeutics, Inc. | TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS) |
| US20220184232A1 (en) * | 2019-03-25 | 2022-06-16 | The Regents Of The University Of California | Methods of treating tnni3-mediated cardiomyopathy |
| TW202129002A (zh) * | 2019-12-09 | 2021-08-01 | 英商Ｕｃｌ商業有限責任公司 | 用於myh7關聯之心肌病之基因療法組合物及治療 |
| WO2021163357A2 (en) * | 2020-02-13 | 2021-08-19 | Tenaya Therapeutics, Inc. | Gene therapy vectors for treating heart disease |
| KR20230038508A (ko) * | 2020-07-08 | 2023-03-20 | 칠드런'즈 메디컬 센터 코포레이션 | Mybpc3 폴리펩티드 및 그의 용도 |
| MX2023001615A (es) * | 2020-08-07 | 2023-03-08 | Spacecraft Seven Llc | Genoterapia con placofilina-2 (pkp2) mediante el uso de vector de aav. |
| JP2023548067A (ja) | 2020-11-02 | 2023-11-15 | バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド | アデノ随伴ウイルスを濃縮するためのプロセス |
| WO2023178339A2 (en) * | 2022-03-18 | 2023-09-21 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Methods and compositions for treating tnnt2 related cardiomyopathy with a viral vector |
| TW202417631A (zh) * | 2022-09-22 | 2024-05-01 | 美商拜奧馬林製藥公司 | 用ａａｖ基因治療載體治療心肌病 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130072549A1 (en) * | 2011-09-21 | 2013-03-21 | Case Western Reserve University | Methods of treating cardiomyopathy |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5591624A (en) | 1988-03-21 | 1997-01-07 | Chiron Viagene, Inc. | Retroviral packaging cell lines |
| US20020127548A1 (en) | 1992-12-11 | 2002-09-12 | Christine Siedman | Methods for detecting mutations associated with hypertrophic cardiomyopathy |
| AU5741996A (en) | 1995-05-22 | 1996-12-11 | Chiron Corporation | Position-specific integration of vector constructs into eukaryotic genomes mediated by a chimeric integrase protein |
| AU2002254529A1 (en) * | 2001-04-04 | 2002-10-21 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of | Nucleic acids for transgene expression |
| JP2007518404A (ja) | 2003-12-16 | 2007-07-12 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 新規な遺伝子破壊、これに関する組成物と方法 |
| US7838561B2 (en) | 2004-06-14 | 2010-11-23 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method for preventing or treating cardiac hypertrophy |
| WO2008093323A2 (en) * | 2007-01-29 | 2008-08-07 | Compugen Ltd. | Novel nucleotide and amino acid sequences, and methods of use thereof for diagnosis |
| DE102011018586A1 (de) * | 2011-04-26 | 2012-10-31 | Oliver Müller | Vektorsystem zur spezifischen Genexpression im Herzmuskel |
| JP6162104B2 (ja) * | 2011-05-26 | 2017-07-12 | ユニヴァーシティ オブ ワシントン | 細胞及び遺伝子に基づく心臓機能改善方法 |
| US20130040302A1 (en) * | 2011-07-11 | 2013-02-14 | Thomas J. Burke | Methods for cell reprogramming and genome engineering |
| EP2792742A1 (en) | 2013-04-17 | 2014-10-22 | Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf (UKE) | Gene-therapy vectors for treating cardiomyopathy |
-
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130072549A1 (en) * | 2011-09-21 | 2013-03-21 | Case Western Reserve University | Methods of treating cardiomyopathy |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| DOREEN KHAJETOORIANS ET AL: "Replacement of mybpc3 mutaiton by 5"-trans-splicing in a knockin mouse model: a step towards causal therapy of hypertrophic cardiomyopathy", 《CIRCULATION RESEARCH》 * |
| K-M R PRASAD ET AL: "Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV:in vivo gene delivery follows a poisson distribution", 《GENE THERAPY》 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111107880A (zh) * | 2017-09-20 | 2020-05-05 | 加利福尼亚大学董事会 | 用于恢复致心律失常性右室心肌病中的电性和心脏功能以及心脏结构的基因疗法策略 |
| CN110714025A (zh) * | 2018-07-13 | 2020-01-21 | 中国农业大学 | 一种靶向猪ttn基因的打靶载体及其应用 |
| CN108815535A (zh) * | 2018-08-08 | 2018-11-16 | 哈尔滨医科大学 | 一种抗心肌肌钙蛋白抗体修饰并载有miR-21的脂质体及其制备方法和应用 |
| CN110609078A (zh) * | 2019-09-20 | 2019-12-24 | 南京谱利健生物技术有限公司 | 一种检测蛋白磷酸化和乙酰氨基葡萄糖化关联作用的方法 |
| CN110609078B (zh) * | 2019-09-20 | 2022-03-11 | 南京谱利健生物技术有限公司 | 一种检测蛋白磷酸化和乙酰氨基葡萄糖化关联作用的方法 |
| CN116096394A (zh) * | 2020-02-13 | 2023-05-09 | 特纳亚治疗股份有限公司 | 用于治疗心脏病的基因疗法载体 |
| CN112011501A (zh) * | 2020-08-26 | 2020-12-01 | 福建省医学科学研究院 | 一种携带c.3369-3370 insC突变的HCM特异性诱导多能干细胞系 |
| CN112011501B (zh) * | 2020-08-26 | 2022-11-08 | 福建省医学科学研究院 | 一种携带c.3369-3370 insC突变的HCM特异性诱导多能干细胞系 |
Also Published As
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