TW202129002A - 用於myh7關聯之心肌病之基因療法組合物及治療 - Google Patents

Abstract

本發明揭示一種治療或預防人類個體之心肌病的組合物及方法。在一個實施例中，一種方法包含將基因療法藥物遞送至該人類個體之心臟組織。該基因療法藥物包含：第一載體，其包含編碼醫療性蛋白質之聚核苷酸序列的第一部分；及第二載體，其包含編碼該醫療性蛋白質之該聚核苷酸序列的第二部分。

Description

用於MYH7關聯之心肌病之基因療法組合物及治療

本發明係關於心臟疾病(例如心肌病)之治療，且更特定言之，係關於用於治療肥厚型心肌病之基因療法方法及醫藥組合物。

儘管藥理學在治療各種諸如心臟衰竭之心臟病狀中進展，但死亡率及發病率仍然高得令人無法接受。此外，某些治療方法不適用於許多患者(例如，患有與其他併發病相關之晚期心臟衰竭病狀的患者)。替代方法，諸如基因療法及細胞療法，由於其可能經獨特定製及有效解決多種心臟病之根本原因發病機制而引起關注增加。

本發明之某些實施例的目標為提供將治療性聚核苷酸序列遞送至人類個體之心肌細胞的方法。

本發明之某些實施例之另一目標為利用用於治療MYH7關聯之心肌病之基因療法方法。

本發明之某些實施例之另一目標為向量化編碼MYH7之聚核苷酸序列。

某些實施例之另一目標為將基因分成針對基因尺寸超過載體之封裝容量之情形遞送至患者之心臟組織的兩個或更多個載體。

本發明滿足以上目標及其他目標，在某些實施例中，該等目標係針對一種治療或預防人類個體之心肌病的方法。在一個態樣中，方法包含將基因療法藥物遞送至人類個體之心臟組織。該基因療法藥物包含：第一載體，其包含編碼醫療性蛋白質之聚核苷酸序列的第一部分；及第二載體，其包含編碼醫療性蛋白質之聚核苷酸序列的第二部分。

在一些實施例中，聚核苷酸序列之第一部分及第二部分自其5'端至其3'端共同限定整個聚核苷酸序列。第一部分可包含始於5'端且終止於3'端上游的第一連續序列，且第二部分可包含始於5'端下游且終止於3'端的第二連續序列。在一些實施例中，第一連續序列包含第一重疊部分，第二連續序列包含第二重疊部分，第一重疊部分與第二重疊部分重疊，且第一重疊部分及第二重疊部分為單股的且彼此不互補。

在一些實施例中，醫療性蛋白質包含功能性MYH7蛋白質，且其中聚核苷酸序列編碼功能性MYH7蛋白質。在一些實施例中，聚核苷酸序列之第一部分包含始於5'端之少於約一半之聚核苷酸序列，且聚核苷酸序列之第二部分包含聚核苷酸序列之剩餘部分。在一些實施例中，聚核苷酸序列之第一部分包含始於5'端之超過約一半之聚核苷酸序列，且聚核苷酸序列之第二部分包含聚核苷酸序列之剩餘部分。在一些實施例中，聚核苷酸序列之第一部分及第二部分集體限定聚核苷酸序列，第一部分包含始於5'端且終止於3'端上游的第一連續序列，第二部分包含始於5'端下游且終止於3'端的第二連續序列，且第一連續序列及第二連續序列皆為單股的且彼此不互補。

在一些實施例中，第一連續序列包含第一重疊部分，第二連續序列包含第二重疊部分，且第一重疊部分與第二重疊部分重疊。在一些實施例中，第一重疊部分及第二重疊部分各自大於10個鹼基且小於4,800個鹼基。在一些實施例中，第一重疊部分及第二重疊部分編碼聚核苷酸序列之內含子20。在一些實施例中，第一連續序列包含聚核苷酸序列之外顯子1至27，第二連續序列包含聚核苷酸序列之外顯子19至40，且第一重疊部分及第二重疊部分各自包含聚核苷酸序列之外顯子19至27。

在一些實施例中，第一載體進一步包含心肌特異性啟動子。在一些實施例中，第一載體進一步包含嵌合內含子。在一些實施例中，第一載體及第二載體中之各者包含病毒載體。在一些實施例中，第一載體或第二載體中之一或多者包含一或多個腺相關病毒(AAV)載體。在一些實施例中，第一載體或第二載體中之一或多者包含rAAV2/9。

在另一態樣中，病毒載體包含小於編碼功能性MYH7蛋白質之聚核苷酸序列的完整序列。

在另一態樣中，治療或預防人類個體之肥厚型心肌病之方法包含將基因療法藥物遞送至人類個體之心臟組織。基因療法藥物包含：第一rAAV2/9載體，其包含始於5'端且終止於3'端上游的少於編碼功能性MYH7蛋白之全部聚核苷酸序列的連續第一部分；以及第二rAAV2/9載體，其包含始於5'端下游且終止於3'端的少於全部聚核苷酸序列的連續第二部分。

在另一態樣中，治療或預防人類個體之肥厚型心肌病之方法包含遞送第一rAAV2/9載體，該載體包含始於5'端且終止於3'端上游的少於編碼功能性MYH7蛋白之全部聚核苷酸序列的連續第一部分。在一些實施例中，該方法進一步包含遞送第二rAAV2/9載體，該載體包含始於5'端下游且終止於3'端的少於全部聚核苷酸序列的連續第二部分。

相關申請之交叉參考

本申請案主張2019年12月9日申請之美國臨時申請案第62/945,518號之優先權，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。定義

除非上下文另外明確指出，否則如本文所用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個參照案。因此，舉例而言，提及「藥物」包括單一藥物以及兩種或更多種不同藥物之混合物；且提及「病毒載體」包括單一病毒載體以及兩種或更多種不同病毒載體之混合物及其類似者。

亦如本文中所使用，當用於與測定量一起使用時，「約」係指彼測定量之如一般熟習此項技術者所預期使量測及操作與量測之目標及量測設備之精確度在所關心之水準上相匹配的正常變化。在某些實施例中，術語「約」包括所述數值±10%，使得「約10」將包括9至11。

亦如本文所用，「聚核苷酸」具有其在此項技術中之普通及慣用含義且包括任何聚合核酸，諸如DNA或RNA分子，以及熟習此項技術者已知之化學衍生物。聚核苷酸不僅包括編碼醫療性蛋白質之彼等聚核苷酸，且亦包括可用於使用此項技術中已知之技術降低目標核酸序列之表現的序列(例如反義、干擾或較小干擾核酸)。聚核苷酸亦可用於起始或增加目標核酸序列之表現或在心血管系統之細胞內之標靶蛋白質的產生。目標核酸及蛋白質包括但不限於通常發現於目標組織中之核酸及蛋白質、此類天然存在之核酸或蛋白質的衍生物、非通常發現於目標組織中之天然存在之核酸或蛋白質、或合成核酸或蛋白質。一或多種聚核苷酸可組合使用，同時及/或依次投與，以增加及/或減少一或多種目標核酸序列或蛋白質。

亦如本文中所使用，「外源性」核酸或基因為自然界中不存在於用於核酸轉移之載體中的核酸；例如非天然存在於病毒載體中的核酸，但該術語不意欲排除編碼天然存在於患者或宿主中之蛋白質或多肽的核酸。

亦如本文所用，「心肌細胞」包括參與維持結構或提供心臟功能之任何心臟細胞，心臟細胞諸如心肌細胞、心肌血管細胞或存在於心肌閥中之細胞。心肌細胞包括心臟肌細胞(具有正常及異常電學特性兩者)、上皮細胞、內皮細胞、纖維母細胞、傳導組織之細胞、心臟起搏細胞及神經元。

亦如本文中所使用，「腺相關病毒」或「AAV」涵蓋所有亞型、血清型及假型，以及天然存在及重組形式。多種AAV血清型及菌株為此項技術中已知的且公開購自來源，諸如ATCC，及學術或商業來源。或者，可使用已知技術合成公開及/或購自多種資料庫的來自AAV血清型及菌株之序列。

亦如本文中所使用，「血清型」係指基於與所定義抗血清之衣殼蛋白質反應性，由其他AAV鑑別且區別於其他AAV的AAV。存在至少十二個已知血清型之人類AAV，包括AAV1至AAV12，然而，繼續發現額外血清型，且涵蓋使用新發現之血清型。

亦如本文中所使用，「假型」AAV係指含有來自一種血清型之衣殼蛋白質及病毒基因體的AAV，該病毒基因體包括不同或異源血清型之5'及3'反向末端重複序列(ITR)。將預期假型重組AAV(rAAV)具有衣殼血清型之細胞表面結合特性及與ITR血清型一致之遺傳特性。假型rAAV可包含AAV衣殼蛋白，包括VP1、VP2及VP3衣殼蛋白，及來自任何血清型AAV之ITR，包括來自AAV1至AAV12之任何靈長類AAV血清型，只要衣殼蛋白具有與ITR之血清型異源的血清型即可。在假型rAAV中，5'及3' ITR可相同或異源。假型rAAV係使用此項技術中描述之標準技術產生。

亦如本文中所使用，「嵌合」rAAV載體涵蓋包含異源衣殼蛋白之AAV載體；亦即rAAV載體可相對於其衣殼蛋白VP1、VP2及VP3為嵌合的，使得VP1、VP2及VP3並非所有相同血清型AAV。如本文所用之嵌合AAV涵蓋其中衣殼蛋白VP1、VP2及VP3在血清型方面不同之AAV，包括例如但不限於來自AAV1及AAV2之衣殼蛋白；為其他細小病毒衣殼蛋白之混合物或包含其他病毒蛋白或其他蛋白，諸如靶向將AAV遞送至所需細胞或組織之蛋白。如本文所用之嵌合rAAV亦涵蓋包含嵌合5'及3' ITR之rAAV。

亦如本文中所使用，「醫藥學上可接受之賦形劑或載劑」係指組合物中與調配物中之活性劑組合的任何惰性成分。醫藥學上可接受之賦形劑可包括但不限於碳水化合物(諸如葡萄糖、蔗糖或聚葡萄糖)、抗氧化劑(諸如抗壞血酸或麩胱甘肽)、螯合劑、低分子量蛋白質、高分子量聚合物、膠凝劑或其他穩定劑及添加劑。其他醫藥學上可接受之載劑的實例包括潤濕劑、乳化劑、分散劑或尤其適用於防止微生物生長或活動之防腐劑。各種防腐劑為熟知的且包括例如酚及抗壞血酸。載劑、穩定劑或佐劑之實例可見於Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa.,第17版. (1985)。

亦如本文所用，「患者」係指已表現出一或多種表明需要治療之特定症狀之臨床表現、經治療以防治病狀、或已診斷患有待治療之病狀的個體，特定言之人類(但亦可涵蓋非人類)。

亦如本文所用，「個體」涵蓋術語「患者」之定義且不排除在其他方面健康之個體。

亦如本文中所使用，「治療(treatment of)」及「治療(treating)」包括投與意欲減輕例如心臟病之病狀的嚴重程度或預防該病狀的藥物。

亦如本文中所使用，「預防(prevention of)」及「預防(preventing)」包括避免例如心臟病之病狀發作。

亦如本文中所使用，「病狀(condition)」或「病狀(conditions)」係指可藉由向個體投與有效量之藥物來治療、緩解或預防之彼等醫學病狀，諸如心臟病。

亦如本文中所使用，「有效量」係指足以在可容易地藉由常用於偵測此效果之方法偵測的水準下產生有益或所需效果的藥物之量。在一些實施例中，此類效果使得自未投與藥物之基礎水準之值改變至少10%。在其他實施例中，改變為自基礎水準至少20%、50%、80%或甚至更高的百分比。如下文將描述，藥物之有效量可隨各個體而變化，視年齡、個體之一般狀況、所治療之病狀之嚴重程度、所投與之特定藥物及其類似因素而定。在任何個別情況下之適合之「有效」量可由一般熟習此項技術者參考相關文本及文獻及/或藉由使用常規實驗來確定。

亦如本文中所使用，「活性劑」係指任何意欲產生治療、預防或其他預期效果之物質，無論其是否經政府機構批准用於彼目的。

除非另外指示，否則本文中值範圍之列舉僅意欲充當單獨提及屬於該範圍內之各獨立值的簡寫方法，且各獨立值併入至本說明書中，如同在本文中單獨列舉一般。除非本文中另外指示或另外與上下文明顯矛盾，否則本文中所描述之所有方法可以任何適合之次序進行。本文所提供之任何及所有實例或例示性語言(例如「諸如」)之使用僅意欲說明某些物質及方法且不對範疇造成限制。本說明書之語言均不應解釋為指示任何非主張之要素對於所揭示之物質及方法之實踐為必不可少的。

肥厚型心肌病(HMC)為最常見遺傳性心血管疾病，其中成人之發病率為500分之1，且其特徵為左心室之壁厚增加。HMC在其臨床變體中為高度複雜且非均質疾病，在無症狀狀態至心臟衰竭範圍內。

HMC公認為肌節之疾病，該肌節負責藉由轉化ATP水解之化學能而產生心肌細胞收縮之分子力。百分之七十遺傳HCM案例攜帶8個肌節蛋白基因中之1個突變，主要為MYBPC3及MYH7變體，且MYH7突變產生大約40%之遺傳HCM病例。重要的是，患有嚴重HCM或HCM及擴張型心肌病之組合之兒童案例不常見。儘管已提出針對MYBPC3之治療策略，但儘管此基因中突變之存在與不良預後相關，但並未進行關於MYH7之工作。

本發明係關於一種治療MYH7相關之心肌病之基於AAV的方法。MYH7 基因位於染色體14上且編碼緩慢1型肌纖維以及心臟肌肉中表現之II類肌凝蛋白。心肌及骨骼肌病症皆可由MYH7 中之突變引起，但心肌疾病更頻繁，其中已鑑別出超過320個突變。MYH7 為23千鹼基(kb)長基因，由40個外顯子構成，形成一個6087個鹼基之轉錄物(NCBI基因ID: 4625)，其編碼1935個胺基酸MYH7蛋白質(SEQ ID NO:1)。蛋白質由兩個區域構成：頭部及尾部。稱作運動域之球狀頭部區域結合至肌動蛋白及ATP且位於N端部分中。長尾區域(亦稱為ROD域或輕肌球蛋白域-LMM)位於C端部分中且對蛋白質二聚作用及與其他蛋白質(包括肌聯蛋白、肌凝蛋白-結合蛋白C3、肌球蛋白-1等)之相互作用至關重要。導致心肌或骨骼肌病症之突變聚集在蛋白質的不同部分中。大部分心肌病相關突變位於球狀頭部域中，潛在地影響肌動蛋白之結合位點，而連接至骨骼肌病之突變通常位於ROD域之末端區域中。

目前，對於所有遺傳性疾病及心臟衰竭，唯一治癒性治療為心臟移植。基於AAV之載體之心肌基因療法具有治療MYH7關聯之HCM的巨大前景。AAV載體為非病原性的，不能單獨複製，以染色體外形式保持在宿主核中，且可藉由心肌內或冠狀動脈內或全身注射遞送。具有約5 kb之有限封裝容量的AAV載體已藉由將對應的聚核苷酸序列分裂成2種組分成功地用於超過5 kb之轉殖基因，由此5'組分及3'組分顯著重疊，通常超過約1000個鹼基，以允許在經由兩個AAV載體遞送之後進行的cDNA串聯。AAV載體先前已用於活體內使用靶向Mybpc3之基因嵌入(KI)小鼠模型治療HCM。

本發明之某些實施例係關於涉及在心肌細胞(例如hiPSC衍生之心肌細胞)中兩個或更多個AAV與AAV介導之MYH7基因表現之組合的不同方法。

在一個實施例中，第一載體(例如5'卡匣)包含心肌特異性啟動子(諸如TNNT2)，及編碼MYH7之聚核苷酸序列的第一部分(例如大約一半)。第一載體亦可包括嵌合內含子以增強聚核苷酸序列之第一部分之轉錄。兩個載體中之各者可為單股聚核苷酸序列。

在另一實施例中，聚核苷酸序列之第一部分具有與聚核苷酸序列之第二部分之子部分重疊的子部分。舉例而言，第一載體之聚核苷酸序列可包括起始於MYH7序列之5'端的連續序列，其包括至多且包括MYH7聚核苷酸序列之內含子23。第二載體之聚核苷酸序列可以自內含子23之5'端起始且連續地繼續至MYH7聚核苷酸序列之3'端。此特定實例產生來自兩個卡匣之序列的183個鹼基重疊，其中各自為單股且非互補的。在其他實施例中，重疊可基於不同內含子，諸如內含子20。

在另一個實施例中，第一載體中之第一部分對應於MYH7聚核苷酸序列之外顯子1至27，且第二載體中之第二部分對應於MYH7聚核苷酸序列之外顯子19至40，由此展現1682個鹼基之重疊。

應注意，此等實施例為例示性的，且亦涵蓋其他重疊。舉例而言，預期外顯子之其他範圍可跨越穿過兩種載體分裂之內MYH7聚核苷酸序列之各部分。舉例而言，第一載體可含有外顯子1至35、外顯子1至34、外顯子1至33等，且類似地，第二載體可含有外顯子15至40、16至40、17至40等。各載體可含有任何範圍之外顯子，其限制條件為聚核苷酸序列之每個部分鹼基之數目具有能夠封裝至其病毒顆粒中的尺寸(例如AAV小於約5 kb)。

在一些實施例中，第一重疊部分及第二重疊部分各自大於10個鹼基且小於4,800個鹼基。在一些實施例中，重疊部分可為10個鹼基、4,800個鹼基或其間的任何整數(例如，100個鹼基、200個鹼基等)。亦涵蓋10至4,800個鹼基內之適合子範圍(例如100至4,800、200至4,800、100至4,500等)。此外，涵蓋利用超過兩種載體之實施例(例如MYH7聚核苷酸序列可拆分成三個單獨載體)。

「內含肽」為蛋白質之區段，其能夠在稱為蛋白質剪接之過程中切除自身且用肽鍵連接剩餘部分(稱為「外顯肽」)。內含肽亦稱為「蛋白質內含子」。在一些實施例中，第一載體包含編碼第一蛋白質片段之聚核苷酸序列，且第二載體包含編碼第二蛋白質片段之第二聚核苷酸序列。第一蛋白質片段包含在其C端處具有N-內含肽序列之N端MYH7片段，且第二蛋白質片段包含在其N端處具有C-內含肽序列之C端MYH7片段。在聚核苷酸序列表現為其相應蛋白質片段之後，N-內含肽及C-內含肽識別彼此且自催化反應，該反應接合其各別側接MYH7片段，產生完全形成之及功能性MYH7蛋白質。

在一些實施例中，各卡匣封裝至適合之AAV中。舉例而言，卡匣各自可封裝於rAAV2/9中，其為用於心肌細胞轉導之尤其高效的血清型。

儘管本文中之許多實施例係關於MYH7蛋白質描述，但應理解，涵蓋額外蛋白質(例如，肌原纖維蛋白)之表現。例示性蛋白質除MYH7以外亦包括但不限於PKP2、SERCA2、MYBPC3、MYL3、MYL2、ACTC1、TPM1、TNNT2、TNNI3、TTN、FHL1、ALPK3、肌縮蛋白、FKRP、其變體中之一或多者或其組合。所用一或多種蛋白質亦可為本文中所提及之蛋白質之功能變體且與原始蛋白質相比可展現顯著胺基酸序列一致性。舉例而言，胺基酸一致性可合計為至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%。在此情形下，術語「功能性變體」意謂蛋白質之變體能夠部分或完全滿足天然存在之相應蛋白質之功能。蛋白質之功能變體可包括例如藉由一或多種胺基酸取代、缺失或添加而與其天然存在之對應物不同的蛋白質。

胺基酸取代可為保守性或非保守性的。較佳地，取代為保守取代，亦即胺基酸殘基經充當功能等效物之具有類似極性之胺基酸取代。較佳地，用作替代物之胺基酸殘基選自與待取代之胺基酸殘基相同的胺基酸群。舉例而言，疏水性殘基可經另一疏水性殘基取代，或極性殘基可經具有相同電荷之另一極性殘基取代。可用於保守取代之功能上同源之胺基酸包含例如非極性胺基酸，諸如甘胺酸、纈胺酸、丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸及色胺酸。不帶電極性胺基酸之實例包含絲胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、酪胺酸及半胱胺酸。帶電極性(鹼性)胺基酸之實例包含組胺酸、精胺酸及離胺酸。帶電極性(酸性)胺基酸之實例包含天冬胺酸及麩胺酸。

亦視為變體之蛋白質為與其天然存在之對應物相差一或多個(例如2、3、4、5、10或15個)額外胺基酸的蛋白質。此等額外胺基酸可存在於原始蛋白質之胺基酸序列內(亦即，作為插入)，或其可添加至蛋白質之一或兩個末端中。基本上，若添加胺基酸不削弱多肽實現所治療之個體中天然存在之蛋白質之功能的能力，則插入可在任何位置進行。此外，蛋白質之變體亦包含與原始多肽相比缺乏一或多個胺基酸之蛋白質。此類缺失可影響任何胺基酸位置，其限制條件為其不削弱實現蛋白質之正常功能的能力。

最後，心肌肌原纖維蛋白之變體(例如MYH7)亦指藉由諸如經修飾之胺基酸之結構修飾而與天然存在之蛋白質不同的蛋白質。經修飾之胺基酸為已藉由天然方法，諸如處理或轉譯後修飾或藉由此項技術中已知之化學修飾方法修飾之胺基酸。典型胺基酸修飾包含磷酸化；糖基化；乙醯化；O關聯之N-乙醯基葡萄糖苷化；麩胱甘肽化；醯化；分支化；ADP核糖化；交聯；二硫橋鍵形成；甲醯化；羥基化；羧化；甲基化；去甲基化；醯胺化；環化及/或與磷脂醯肌醇、黃素衍生物、脂壁酸、脂肪酸或脂質共價或非共價鍵結。

編碼標靶蛋白質之治療性聚核苷酸序列可呈基因療法載體，亦即核酸構築體形式投與待治療之個體，該核酸構築體包含編碼序列(包括轉譯及終止密碼子)，其緊鄰提供外源核酸之表現所需之其他序列，諸如啟動子、Kozak序列、polyA信號及其類似物。

舉例而言，基因療法載體可為哺乳動物表現系統之一部分。有用的哺乳動物表現系統及表現構築體可自商品購得。另外，若干哺乳動物表現系統由不同製造商供應，且可用於本發明中，諸如基於質體或病毒載體之系統，例如LENTI-Smart™ (InvivoGen)、GenScript™表現載體、pAdVAntage™ (Promega)、ViraPower™慢病毒、腺病毒表現系統(Invitrogen)及腺相關病毒表現系統(Cell Biolabs)。

用於表現本發明之外源性治療性聚核苷酸序列的基因療法載體可為例如病毒或非病毒表現載體，其適用於將外源性治療性聚核苷酸序列引入至細胞中，以供後續表現由該核酸編碼之蛋白質。表現載體可為游離型載體，亦即能夠自主地在宿主細胞內自我複製之載體；或整合載體，亦即穩定併入細胞基因體中之載體。宿主細胞中之表現可為組成型或調節型(例如誘導型)。

在某一實施例中，基因療法載體為病毒表現載體。用於本發明之病毒載體可包含病毒基因體，其中已缺失天然序列之一部分，以便引入異質聚核苷酸而不破壞病毒之感染性。歸因於病毒組分與宿主細胞受體之間的特異性相互作用，病毒載體高度適用於將基因有效轉移至目標細胞中。適用於促進基因轉移至哺乳動物細胞中之病毒載體可來源於不同類型之病毒，例如AAV、腺病毒、反轉錄病毒、單純疱疹病毒、牛乳頭狀瘤病毒、慢病毒、牛痘病毒、多瘤病毒、仙台病毒(sendai virus)、正黏液病毒、副黏液病毒、乳頭狀病毒、小RNA病毒、痘病毒、α病毒或適用於基因療法之任何其他穿梭病毒、其變體及其組合。

「腺病毒表現載體」或「腺病毒」意謂包括含有腺病毒序列之彼等構築體，該等腺病毒序列足以(a)支撐治療性聚核苷酸序列構築體之封裝，及/或(b)最終表現已在其中選殖之組織及/或細胞特異性構築體。在本發明之一個實施例中，表現載體包含腺病毒之基因工程改造形式。瞭解腺病毒之遺傳組織，36千鹼基(kb)線性雙股DNA病毒實現用至多7 kb外源序列取代大片段腺病毒DNA。

腺病毒生長及操作為熟習此項技術者已知，且在活體外及活體內展現較寬宿主範圍。此組病毒可以高效價，例如10⁹ 至10¹¹ 個溶菌斑形成單位/毫升獲得，且其具有高度感染性。腺病毒之生命週期不需要整合至宿主細胞基因體中。藉由腺病毒載體傳遞之外源基因為游離型且因此對宿主細胞具有較低基因毒性。在用野生型腺病毒疫苗接種之研究中未報導副作用，表明其作為活體內基因轉移載體之安全及/或治療潛能。

反轉錄病毒(亦稱作「反轉錄病毒載體」)可由於其將其基因整合至宿主基因體中、轉移大量外源遺傳物質、感染廣泛範圍之物種及細胞類型及用於封裝於特殊細胞株中之能力而經選擇作為基因遞送載體。

反轉錄病毒基因體含有分別編碼衣殼蛋白、聚合酶及包膜組分之三種基因gag、pol及env。在gag基因上游發現之序列含有用於將基因體封裝至病毒粒子中之信號。兩個長末端重複序列(LTR)序列存在於病毒基因體之5'及3'端。此等含有強啟動子及強化子序列且亦為整合於宿主細胞基因體中所需。

為了構築反轉錄病毒載體，將編碼所關注基因之核酸代替某些病毒序列插入至病毒基因體中，以產生可複製缺陷之病毒。為了產生病毒粒子，構建含有gag、pol及/或env基因但無LTR及/或封裝組分之封裝細胞株。當將含有cDNA之重組質體以及反轉錄病毒LTR及封裝序列引入此細胞株中(例如藉由磷酸鈣沈澱)時，封裝序列使得重組質體之RNA轉錄物封裝於病毒顆粒中，該等病毒顆粒隨後分泌於培養基中。隨後收集含有重組反轉錄病毒之培養基，視情況濃縮且用於基因轉移。反轉錄病毒載體能夠感染廣泛多種細胞類型。然而，整合及穩定表現需要分裂宿主細胞。

反轉錄病毒可衍生自亞家族中之任一者。舉例而言，可使用來自鼠類肉瘤病毒、牛白血病、病毒勞氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)、鼠類白血病病毒、貂細胞病灶引發病毒、網狀內皮細胞增生病病毒或禽類白血病性病毒之載體。熟習此項技術者將能夠組合來源於不同反轉錄病毒之部分，諸如LTR、tRNA結合位點及封裝信號以提供重組反轉錄病毒。此等反轉錄病毒接著通常用於產生轉導勝任反轉錄病毒載體顆粒。出於此目的，將載體引入適合之封裝細胞株中。亦可構築反轉錄病毒以便藉由將嵌合整合酶併入反轉錄病毒顆粒中來將位點特異性整合至宿主細胞之DNA中。

因為單純疱疹病毒(HSV)係神經性的，其已在治療神經系統病症中產生大量關注。此外，HSV在未分裂神經元細胞中建立潛在感染而不整合至宿主細胞染色體中或以其他方式改變宿主細胞之代謝之能力，以及在潛伏期期間具有活性之啟動子的存在使得HSV成為有吸引力的載體。且儘管許多注意力集中於HSV之神經病學應用，但考慮到其寬宿主範圍，此載體亦可用於其他組織。

使HSV成為有吸引力的載體之另一因素為基因體之尺寸及組織。因為HSV很大，所以與在其他較小病毒系統中相比，併入多個基因或表現卡匣更不成問題。另外，與在其他系統中相比，具有不同效能(時間、強度等)之不同病毒控制序列之可用性使得有可能更大程度上控制表現。亦具有以下優勢：病毒具有相對較少之剪接訊息，進一步便於進行遺傳操作。

HSV亦相對易於操控且可生長至高效價。因此，遞送在獲得足夠感染倍率(MOI)所需之體積方面及在重複給藥之減少需求方面皆不成問題。已研發出HSV之無毒變體且該等變體可易於用於基因療法情形中。

慢病毒為複合反轉錄病毒，除常見反轉錄病毒基因gag、pol及env以外，該等慢病毒含有其他具有調節或結構性功能之基因。較高的複雜度使得病毒能夠調節其生命週期，如在潛伏感染過程中。慢病毒之一些實例包括人類免疫缺陷病毒(HIV-1、HIV-2)及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。慢病毒載體已藉由多次緩解HIV毒性基因產生，例如基因env、vif、vpr、vpu及nef缺失使得載體生物安全。

慢病毒載體係基於質體或基於病毒，且經組態以攜帶用於併入外來核酸、用於選擇及用於將核酸轉移至宿主細胞中之必需序列。所關注之載體之gag、pol及env基因亦為此項技術中已知。因此，將相關基因選殖至所選載體中且隨後用於轉化所關注之目標細胞。

已廣泛使用痘瘡病毒載體，因為其構築容易、所獲得之相對較高表現量、較寬宿主範圍及用於攜帶DNA之大容量。痘瘡含有約186 kb之線性雙股DNA基因體，其展現顯著之「A-T」偏好。約10.5 kb之反向末端重複序列側接基因體。大部分必需基因似乎在中心區域內定位，其在痘病毒中為最高度保守的。估計痘瘡病毒之開放閱讀框架數目為150至200。儘管編碼兩個股，但閱讀框架之廣泛重疊並不常見。

可以將至少25 kb插入痘瘡病毒基因體中。原型痘瘡載體含有經由同源重組插入至病毒胸苷激酶基因中之轉殖基因。載體係基於tk表現型選擇。包括腦心肌炎病毒之未經轉譯之前導序列產生比習知載體高之表現量，其中轉殖基因在24小時內以經感染細胞之蛋白質之10%或更多積聚。

諸如小鼠多瘤病毒之乳頭狀病毒的空衣殼已作為可能的載體受到注意以用於基因轉移。當在游離細胞系統中培育多瘤病毒DNA及經純化空衣殼時，首先描述多瘤病毒之用途。新顆粒之DNA受到保護免於胰腺DNA酶之作用。將經復原顆粒用於將轉型多瘤病毒DNA片段轉移至大鼠FIII細胞。空衣殼及經復原顆粒由所有三種多瘤病毒衣殼抗原VP1、VP2及VP3組成。

AAV為屬於依賴病毒屬之細小病毒。其為小型非包膜單股DNA病毒，其需要輔助病毒以便複製。需要用輔助病毒(例如腺病毒、疱疹病毒或痘瘡病毒)共感染以形成功能上完整之AAV病毒粒子。活體外，在不存在與輔助病毒共感染的情況下，AAV建立其中病毒基因體以游離型形式存在，但不產生感染性病毒粒子之潛伏狀態。隨後藉由輔助病毒之感染「拯救」基因體，允許其複製且封裝於病毒衣殼中，藉此復原感染性病毒粒子。最新資料指示活體內野生型AAV及重組AAV皆主要以大型游離型串聯體形式存在。在一個實施例中，本文中所用之基因療法載體為AAV載體。AAV載體可為經純化複製非勝任型假型rAAV顆粒。

AAV不與任何已知人類疾病相關，一般不視為病原性的，且在整合時似乎不會改變宿主細胞之生理學特性。AAV可感染廣泛範圍之宿主細胞，包括非分裂細胞，且可感染來自不同物種之細胞。相比於藉由細胞及體液反應兩者快速清除或失活之一些載體，已展示AAV載體在活體內誘導各種組織中之持久性轉殖基因表現。重組AAV介導之轉殖基因在非潛水性細胞在活體內之持久性可歸因於缺乏天然AAV病毒基因及載體形成游離型串聯體之ITR關聯之能力。

AAV為適用於本發明之細胞轉導的有吸引力之載體系統，因為其具有高頻持久性作為游離型串聯體且其可感染非分裂細胞，包括心肌細胞，因此使得其適用於將基因遞送至哺乳動物細胞中，例如在組織培養物中及在活體內。

通常，rAAV係藉由共轉染含有所關注基因之側接有兩個AAV末端重複序列之質體及/或含有野生型AAV編碼序列而無末端重複序列，例如pIM45之表現質體來製造。細胞亦經腺病毒及/或攜帶AAV輔助功能所需之腺病毒基因之質體感染及/或轉染。以此類方式製造之rAAV之儲備液混雜有腺病毒，其必須與rAAV顆粒物理分離(例如藉由氯化銫密度離心或管柱層析)。或者，可使用含有AAV編碼區之腺病毒載體及/或含有AAV編碼區之細胞株及/或一些或全部腺病毒輔助基因。亦可使用攜帶rAAV DNA作為經整合之原病毒的細胞株。

多種AAV血清型存在於自然界中，具有至少十二種血清型(AAV1-AAV12)。儘管具有高度同源性，但不同血清型對不同組織具有趨向性。在轉染後，AAV僅引發宿主中之次要免疫反應(若存在)。因此，AAV高度適合於基因療法方法。

在一些實施例中，本發明可針對一種藥物，其包含AAV載體，該AAV載體為以下中之一或多者：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、ANC AAV、來源於其之嵌合AAV、其變體及其組合，其將甚至更佳適用於在所關注之組織中之高效轉導。在某些實施例中，基因療法載體為AAV血清型1載體。在某些實施例中，基因療法載體為AAV血清型2載體。在某些實施例中，基因療法載體為AAV血清型3載體。在某些實施例中，基因療法載體為AAV血清型4載體。在某些實施例中，基因療法載體為AAV血清型5載體。在某些實施例中，基因療法載體為AAV血清型6載體。在某些實施例中，基因療法載體為AAV血清型7載體。在某些實施例中，基因療法載體為AAV血清型8載體。在某些實施例中，基因療法載體為AAV血清型9載體。在某些實施例中，基因療法載體為AAV血清型10載體。在某些實施例中，基因療法載體為AAV血清型11載體。在某些實施例中，基因療法載體為AAV血清型12載體。

在一些實施例中，基因療法載體可為具有揭示於美國專利第7,198,951號及第7,906,111號中之一或多種衣殼蛋白的AAV血清型，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，基因療法載體為AAV血清型9載體。AAV血清型9載體之一或多種衣殼蛋白可選自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或其部分中之至少一者之胺基酸序列(例如，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中之任一者之胺基酸138至736或胺基酸203至736)。

衣殼蛋白中之一或多者可由例如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或其部分(諸如SEQ ID NO:5之核苷酸411至2211或核苷酸609至2211)之核酸序列編碼。

適用於人類之AAV之劑量可在以下範圍內：約1x10⁸ vg/kg至約3x10¹⁴ vg/kg、約1x10⁸ vg/kg、約1x10⁹ vg/kg、約1x10¹⁰ vg/kg、約1x10¹¹ vg/kg、約1x10¹² vg/kg、約1x10¹³ vg/kg或約1x10¹⁴ vg/kg。病毒顆粒或DRP之總量為、為約、為至少、為至少約、不超過或不超過約5×10¹⁵ vg/kg、4×10¹⁵ vg/kg、3×10¹⁵ vg/kg、2×10¹⁵ vg/kg、1×10¹⁵ vg/kg、9×10¹⁴ vg/kg、8×10¹⁴ vg/kg、7×10¹⁴ vg/kg、6×10¹⁴ vg/kg、5×10¹⁴ vg/kg、4×10¹⁴ vg/kg、3×10¹⁴ vg/kg、2×10¹⁴ vg/kg、1×10¹⁴ vg/kg、9×10¹³ vg/kg、8×10¹³ vg/kg、7×10¹³ vg/kg、6×10¹³ vg/kg、5×10¹³ vg/kg、4×10¹³ vg/kg、3×10¹³ vg/kg、2×10¹³ vg/kg、1×10¹³ vg/kg、9×10¹² vg/kg、8×10¹² vg/kg、7×10¹² vg/kg、6×10¹² vg/kg、5×10¹² vg/kg、4×10¹² vg/kg、3×10¹² vg/kg、2×10¹² vg/kg、1×10¹² vg/kg、9×10¹¹ vg/kg、8×10¹¹ vg/kg、7×10¹¹ vg/kg、6×10¹¹ vg/kg、5×10¹¹ vg/kg、4×10¹¹ vg/kg、3×10¹¹ vg/kg、2×10¹¹ vg/kg、1×10¹¹ vg/kg、9×10¹⁰ vg/kg、8×10¹⁰ vg/kg、7×10¹⁰ vg/kg、6×10¹⁰ vg/kg、5×10¹⁰ vg/kg、4×10¹⁰ vg/kg、3×10¹⁰ vg/kg、2×10¹⁰ vg/kg、1×10¹⁰ vg/kg、9×10⁹ vg/kg、8×10⁹ vg/kg、7×10⁹ vg/kg、6×10⁹ vg/kg、5×10⁹ vg/kg、4×10⁹ vg/kg、3×10⁹ vg/kg、2×10⁹ vg/kg、1×10⁹ vg/kg、9×10⁸ vg/kg、8×10⁸ vg/kg、7×10⁸ vg/kg、6×10⁸ vg/kg、5×10⁸ vg/kg、4×10⁸ vg/kg、3×10⁸ vg/kg、2×10⁸ vg/kg或1×10⁸ vg/kg，或屬於由此等值中之任兩者定義之範圍內。上文所列之劑量以vg/kg心臟組織為單位。

除病毒載體之外，非病毒表現構築體亦可用於將編碼標靶蛋白質或充當其功能變體或片段之基因引入患者細胞中。允許目標細胞中之蛋白質之活體內表現之非病毒表現載體包括例如質體、經修飾之RNA、cDNA、反義寡聚物、DNA-脂質複合物、奈米顆料、核外體、適用於基因療法之任何其他非病毒梭子、其變體及其組合。

除病毒載體及非病毒表現載體之外，亦可結合載體及/或電穿孔系統使用核酸酶系統以進入患者之細胞中且在其中引入編碼標靶蛋白質或充當其功能變體或片段之基因。例示性核酸酶系統可包括但不限於成簇規律間隔短回文重複序列(CRISPR)、DNA切割酶(例如Cas9)、大範圍核酸酶、TALEN、鋅指核酸酶、適於基因療法之任何其他核酸酶系統、其變體及其組合。舉例而言，在一個實施例中，一個病毒載體(例如，AAV)可用於核酸酶(例如，CRISPR)且另一病毒載體(例如，AAV)可用於DNA切割酶(例如，Cas9)，以將(核酸酶及DNA切割酶)兩者引入至目標細胞中。

可用於將編碼治療基因之治療性聚核苷酸序列遞送至細胞中的其他載體遞送系統為受體介導之遞送媒劑。此等利用藉由受體介導之內飲作用在幾乎所有真核細胞中選擇性吸收大分子。由於各種受體之細胞類型特異性分佈，遞送可具有高度特異性。受體介導之基因靶向媒劑可包括兩種組分：細胞受體特異性配位體及DNA結合劑。

適用於將非病毒載體轉移至目標細胞中之方法為例如脂質體轉染法、磷酸鈣共沈澱法、DEAE-聚葡萄糖法及使用玻璃套管、超音波、電穿孔及其類似方法之直接DNA引入法。在引入載體之前，可用滲透劑處理心肌細胞，該滲透劑諸如磷脂醯膽鹼、鏈球菌溶血素、癸酸鈉、癸醯肉鹼、酒石酸、溶血卵磷脂、Triton X-100及其類似物。核外體亦可用於轉移裸DNA或AAV衣殼化DNA。

本發明之基因療法載體可包含在功能上與編碼標靶蛋白質之核酸序列連接的啟動子。啟動子序列必須為緊密的且確保較強表現。較佳地，啟動子提供已經基因療法載體治療之患者之心肌中之標靶蛋白質之表現。在一些實施例中，基因療法載體包含可操作地連接至編碼標靶蛋白質之核酸序列的心肌特異性啟動子。如本文中所使用，「心肌特異性啟動子」係指在心肌細胞中之活性比在任何其他非心肌細胞類型中之活性高至少2倍之啟動子。較佳地，適用於本發明之載體中之心肌特異性啟動子在心肌細胞中具有與在非心肌細胞類型中之活性相比高至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍或至少50倍之活性。

心肌特異性啟動子可為所選人類啟動子，或包含與所選人類啟動子具有至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之功能上等效序列的啟動子。可使用之例示性非限制性啟動子為肌鈣蛋白T啟動子(TNNT2)。啟動子之其他非限制性實例包括α肌凝蛋白重鏈啟動子、肌凝蛋白輕鏈2v啟動子、α肌凝蛋白重鏈啟動子、α-心肌肌動蛋白啟動子、α-肌旋蛋白啟動子、肌鈣蛋白C啟動子、肌鈣蛋白I啟動子、心肌肌凝蛋白-結合蛋白C啟動子及肌質網/內質網Ca^{2 +} -ATP酶(SERCA)啟動子(例如此啟動子之同功異型物2(SERCA2))。

適用於本發明之載體可具有不同轉導效率。因此，病毒載體或非病毒載體轉導超過、等於或至少約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%之目標血管部位之細胞。可同時或依序使用超過一種載體(病毒或非病毒或其組合)。此可用於轉移超過一種聚核苷酸，及/或靶向超過一種細胞類型。當使用多種載體或多種試劑時，可產生超過一種轉導/轉染效率。

含有基因療法載體之醫藥組合物可製備為液體溶液或懸浮液。本發明之醫藥組合物可包括常用的醫藥學上可接受之賦形劑，諸如稀釋劑及載劑。特定言之，組合物包含醫藥學上可接受之載劑，例如水、生理食鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液。除載劑以外，醫藥組合物亦可含有乳化劑、pH緩衝劑、穩定劑、染料及其類似物。

在某些實施例中，醫藥組合物將包含治療有效之基因劑量，其為能夠預防或治療個體之心肌病而對個體無毒之劑量。預防或治療心肌病可評定為與心肌病相關聯之表型特徵之變化，其中此類變化可有效預防或治療心肌病。因此，治療有效的基因劑量通常為在生理學上可耐受之組合物中投與時足以改良或預防所治療個體之病原性心臟表型的基因劑量。

在某些實施例中，可經由若干不同方法將基因療法載體轉導至個體中，該等方法包括靜脈內遞送、動脈內遞送或腹膜內遞送。在一些實施例中，可例如藉由冠狀動脈內投與向心臟組織直接投與基因療法載體。在一些實施例中，心肌之組織轉導可藉由導管介導之心肌內遞送實現，其可用於將偶合至或未偶合至轉導增強載劑之無載體cDNA轉移至心肌中。

在某些實施例中，藥物將包含治療有效之基因劑量。治療有效之基因劑量為能夠在患者中預防或治療特定心臟病狀而對患者無毒之基因劑量。

可藉由本文所揭示之方法治療的心臟病狀可包括但不限於以下中之一或多者：遺傳性測定心臟病(例如，遺傳性測定心肌病)、心律不齊心臟病、心臟衰竭、缺血、心律不齊、心肌梗塞、充血性心臟衰竭、移植排斥反應、異常心臟收縮、非缺血性心肌病、二尖瓣回流、主動脈狹窄或逆流、異常Ca^{2 +} 代謝、先天性心臟病、原發性或繼發性心肌腫瘤及其組合。例示性預示性實例

闡述以下實例以幫助理解本發明，且其當然不應視為專門限制本文中所描述及主張之實施例。實施例之此類變化包括替換目前已知或後續研發之所有等效物，其將介於熟習此項技術者之範圍內，且調配物之變化或實驗設計之微小變化將視為屬於併入本文中之實施例的範疇。

一般而言，活體外轉導效率可藉由qPCR評估，且可使用特異性引子及探針重疊外顯子連接分析多聚化剪接事件之定量。實例 1 ：同源重疊序列

在此實例中，將轉殖基因分裂成共用同源重疊序列之兩個AAV載體，使得MYH7之復原依賴於同源重組。如貫穿本發明所論述，可調整重疊長度。在此等實例構築體中，如圖1A-1D中所說明，兩個ITR序列之間的尺寸為第一AAV載體之4712個鹼基(圖1B)及第二AAV載體之4351個鹼基(圖1C)。重疊之長度為1055個鹼基(圖1D)。

SEQ ID NO:6對應於具有經移除之博來黴素(Zeomycin)抗性(ZeoR)基因之圖1B的第一AAV載體，且SEQ ID NO:7對應於圖1C之第二AAV載體。實例 2 ：內含肽

在此實例中，蛋白質剪接基於所編碼之內含肽序列發生。剪接事件為自催化製程，其中內含肽自原發性/前驅蛋白切除自身且隨後催化斷裂端之接合，形成兩種蛋白產物：成熟蛋白及內含肽自身。

在此等實例構築體中，如圖2A-2C中所說明，第一AAV載體編碼第一N端946個胺基酸(圖2B，未按比例繪製)，且第二AAV載體編碼C端胺基酸947-1935(圖2C，未按比例繪製)，但預期序列範圍之其他組合為可能的。兩個ITR序列之間的尺寸為第一AAV載體之4923個鹼基(圖2B，SEQ ID NO:8)及第二AAV載體之4819個鹼基(圖2C，SEQ ID NO:9)。MYH7表現處於TNNT2啟動子之控制下。使用Flag、ZeoR及殺稻瘟菌素選擇經轉導之細胞。實例 3 ：混合同源重組及 RNA 剪接

此實例組合兩種方法：同源重組及RNA剪接。將高度重組的外源序列用於觸發同源重組。此序列在轉錄之後剪接出，因為其將識別為mRNA前體中之內含子。此序列置放於外顯子20與21之間，但可存在且涵蓋其他可能的插入位置。此序列來源於鹼性磷酸酶基因(SEAP)。

在此等實例構築體中，如圖3中所示，第一AAV載體(SEQ ID NO:10)含有驅動MYH7之第一20個外顯子之轉錄的TNNT2啟動子。在其他實例中，一般利用優化定序法改良蛋白質轉譯，但在此實例中，外顯子20及21之序列未經優化。外顯子20之後為內源性內含子20的前40個鹼基，隨後為SEAP基因的前272個鹼基。亦存在選擇基因、嵌合內含子及標記，以改良轉錄/轉譯功效及顯影。

第二AAV載體(SEQ ID NO:11)起始於來自SEAP之相同272個鹼基(對於HR)，隨後為內源性內含子20之最後40個鹼基及MYH7之整個非優化外顯子21，隨後為編碼MYH7之優化外顯子22-40之序列。

在前述描述中，闡述諸如特定材料、尺寸、製程參數等之眾多特定細節，以提供對本發明之透徹理解。在一或多個實施例中，特定特點、結構、材料或特徵可依任何適合方式組合。本文所採用「實例」或「例示性」一詞意謂作為實例、例子或說明。本文中以「實例」或「例示性」描述之任何態樣或設計不一定構成比其他態樣或設計更佳或更有利。實際上，使用「實例」或「例示性」一詞僅單純意欲以具體方式呈現概念。如本申請案中所使用，術語「或」欲意謂包涵性的「或」而非排他性的「或」。亦即，除非另外規定，否則或根據上下文顯而易見，「X包括A或B」意欲意謂任何自然包涵性排列置換。亦即，若X包括A；X包括B；或X包括A及B二者，則在任何前述情況中均滿足「X包括A或B」。本說明書通篇提及「實施例」、「某些實施例」或「一個實施例」意謂結合實施例所描述之特定特點、結構或特徵包括於至少一個實施例中。因此，在貫穿本說明書各處出現片語「實施例」、「某些實施例」或「一個實施例」均不一定指同一實施例。

已參考本發明之特定例示性實施例描述本發明。因此，應以說明性意義而非限制性意義來看待說明書及圖式。除了本文所示及所描述以外，本發明之各種修改均係彼等熟習此項技術者咸了解者，且其均屬於附錄之申請專利範圍之範疇內。

以下SEQ ID NO:1為編碼MYH7之胺基酸序列：

以下SEQ ID NO:2為編碼AAV血清型9衣殼蛋白之胺基酸序列。

以下SEQ ID NO:3為編碼AAV血清型9衣殼蛋白之另一胺基酸序列：

以下SEQ ID NO:4為編碼AAV血清型衣殼蛋白之核酸序列：

以下SEQ ID NO:5為編碼AAV血清型衣殼蛋白之另一核酸序列：

以下SEQ ID NO:6為編碼包括同源重疊序列之MYH7之第一部分的AAV載體：

以下SEQ ID NO:7為編碼包括同源重疊序列之MYH7之第二部分的AAV載體：

以下SEQ ID NO:8為編碼MYH7之第一部分及N-內含肽序列的AAV載體：

以下SEQ ID NO:9為編碼MYH7之第二部分及C-內含肽序列的AAV載體：

以下SEQ ID NO:10為編碼MHY7之第一部分且包括重組外源序列之AAV載體：

以下SEQ ID NO:11為編碼MHY7之第二部分且包括重組外源序列之AAV載體：

在結合隨附圖式考慮以下實施方式後，本發明之以上及其他特徵、其性質及各種優勢將變得更顯而易見，其中：

圖1A為說明根據至少一個實施例之共有同源重疊序列之兩個載體的示意圖；

圖1B為說明根據至少一個實施例之編碼MYH7編碼區域之第一部分之載體的載體圖；

圖1C為說明根據至少一個實施例之編碼MYH7編碼區域之第二部分之載體的載體圖；

圖1D為說明根據至少一個實施例之編碼MYH7之部分的載體之重疊區域的示意圖；

圖2A為說明根據至少一個實施例之基於所編碼內含肽序列之蛋白質剪接的示意圖；

圖2B為說明根據至少一個實施例之編碼MYH7編碼區域之第一部分及N-內含肽序列之載體的載體圖；

圖2C為說明根據至少一個實施例之編碼MYH7編碼區域之第二部分及C-內含肽序列之載體的載體圖；且

圖3為說明根據至少一個實施例之經由串聯或同源重組剪接兩個核酸編碼序列的示意圖。

Claims (37)

1. 一種以基因療法藥物在製造用於治療或預防人類個體之心肌病之藥劑中的用途，其中該藥劑係用於遞送至該人類個體之心臟組織，其中該基因療法藥物包含： 第一載體，其包含編碼醫療性蛋白質之聚核苷酸序列的第一部分；及 第二載體，其包含編碼該醫療性蛋白質之該聚核苷酸序列的第二部分。
2. 如請求項1之用途，其中該聚核苷酸序列之該第一部分及該第二部分自其5'端至其3'端集體限定完整聚核苷酸序列，其中該第一部分包含始於該5'端且終止於該3'端上游的第一連續序列，且其中該第二部分包含始於該5'端下游且終止於該3'端的第二連續序列。
3. 如請求項2之用途，其中該第一連續序列包含第一重疊部分，其中該第二連續序列包含第二重疊部分，其中該第一重疊部分與該第二重疊部分重疊，且其中該第一重疊部分及該第二重疊部分為單股且彼此不互補。
4. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該醫療性蛋白質包含功能性MYH7蛋白質或其功能性變體，且其中該聚核苷酸序列編碼該功能性MYH7蛋白質或其功能性變體。
5. 如請求項4之用途，其中該聚核苷酸序列之該第一部分包含始於該5'端之少於約一半之該聚核苷酸序列，且其中該聚核苷酸序列之該第二部分包含該聚核苷酸序列之剩餘部分。
6. 如請求項4之用途，其中該聚核苷酸序列之該第一部分包含始於該5'端之超過約一半之該聚核苷酸序列，且其中該聚核苷酸序列之該第二部分包含該聚核苷酸序列之剩餘部分。
7. 如請求項4之用途，其中該聚核苷酸序列之該第一部分及該第二部分集體限定該聚核苷酸序列，其中該第一部分包含始於該5'端且終止於該3'端上游的第一連續序列，其中該第二部分包含始於該5'端下游且終止於該3'端的第二連續序列，且其中該第一連續序列及該第二連續序列皆為單股且彼此不互補。
8. 如請求項7之用途，其中該第一連續序列包含第一重疊部分，其中該第二連續序列包含第二重疊部分，且其中該第一重疊部分與該第二重疊部分重疊。
9. 如請求項8之用途，其中該第一重疊部分及該第二重疊部分各自大於10個鹼基且小於4,800個鹼基。
10. 如請求項8之用途，其中該第一重疊部分及該第二重疊部分編碼該聚核苷酸序列之內含子20。
11. 如請求項8之用途，其中該第一連續序列包含該聚核苷酸序列之外顯子1至27，其中該第二連續序列包含該聚核苷酸序列之外顯子19至40，且其中該第一重疊部分及該第二重疊部分各自包含該聚核苷酸序列之外顯子19至27。
12. 如請求項1至11中任一項之用途，其中該第一載體進一步包含心肌特異性啟動子。
13. 如請求項1至12中任一項之用途，其中該第一載體進一步包含嵌合內含子。
14. 如請求項1至13中任一項之用途，其中該第一載體及該第二載體中之各者包含病毒載體。
15. 如請求項1至14中任一項之用途，其中該第一載體或該第二載體中之一或多者包含一或多個AAV載體。
16. 如請求項1至15中任一項之用途，其中該第一載體或該第二載體中之一或多者包含rAAV2/9。
17. 一種治療或預防人類個體之心肌病的基因療法藥物，該基因療法藥物包含： 第一載體，其包含編碼醫療性蛋白質之聚核苷酸序列的第一部分；及 第二載體，其包含編碼該醫療性蛋白質之該聚核苷酸序列的第二部分。
18. 如請求項17之基因療法藥物，其中該聚核苷酸序列之該第一部分及該第二部分自其5'端至其3'端集體限定完整聚核苷酸序列，其中該第一部分包含始於該5'端且終止於該3'端上游的第一連續序列，且其中該第二部分包含始於該5'端下游且終止於該3'端的第二連續序列。
19. 如請求項18之基因療法藥物，其中該第一連續序列包含第一重疊部分，其中該第二連續序列包含第二重疊部分，其中該第一重疊部分與該第二重疊部分重疊，且其中該第一重疊部分及該第二重疊部分為單股且彼此不互補。
20. 如請求項17至19中任一項之基因療法藥物，其中該醫療性蛋白質包含功能性MYH7蛋白質或其功能性變體，且其中該聚核苷酸序列為編碼該功能性MYH7蛋白質或其功能性變體之聚核苷酸序列。
21. 如請求項20之基因療法藥物，其中該聚核苷酸序列之該第一部分包含始於該5'端之少於約一半之該聚核苷酸序列，且其中該聚核苷酸序列之該第二部分包含該聚核苷酸序列之剩餘部分。
22. 如請求項20之基因療法藥物，其中該聚核苷酸序列之該第一部分包含始於該5'端之超過約一半之該聚核苷酸序列，且其中該聚核苷酸序列之該第二部分包含該聚核苷酸序列之剩餘部分。
23. 如請求項20之基因療法藥物，其中該聚核苷酸序列之該第一部分及該第二部分集體限定該聚核苷酸序列，其中該第一部分包含始於該5'端且終止於該3'端上游的第一連續序列，其中該第二部分包含始於該5'端下游且終止於該3'端的第二連續序列，且其中該第一連續序列及該第二連續序列皆為單股且彼此不互補。
24. 如請求項23之基因療法藥物，其中該第一連續序列包含第一重疊部分，其中該第二連續序列包含第二重疊部分，且其中該第一重疊部分與該第二重疊部分重疊。
25. 如請求項24之基因療法藥物，其中該第一重疊部分及該第二重疊部分各自大於10個鹼基且小於4,800個鹼基。
26. 如請求項24之基因療法藥物，其中該第一重疊部分及該第二重疊部分編碼該聚核苷酸序列之內含子20。
27. 如請求項24之基因療法藥物，其中該第一連續序列包含該聚核苷酸序列之外顯子1至27，其中該第二連續序列包含該聚核苷酸序列之外顯子19至40，且其中該第一重疊部分及該第二重疊部分各自包含該聚核苷酸序列之外顯子19至27。
28. 如請求項17至27中任一項之基因療法藥物，其中該第一載體進一步包含心肌特異性啟動子。
29. 如請求項17至28中任一項之基因療法藥物，其中該第一載體進一步包含嵌合內含子。
30. 如請求項17至30中任一項之基因療法藥物，其中該第一載體及該第二載體中之各者包含病毒載體。
31. 如請求項17至30中任一項之基因療法藥物，其中該第一載體或該第二載體中之一或多者包含一或多個AAV載體。
32. 如請求項31之基因療法藥物，其中該第一載體或該第二載體中之一或多者包含rAAV2/9。
33. 一種病毒載體，其包含少於編碼功能性MYH7蛋白質或其功能性變體之聚核苷酸序列的完整序列。
34. 一種以基因療法藥物在製造用於治療或預防人類個體之肥厚型心肌病之藥劑中的用途，其中該藥劑係用於遞送至該人類個體之心臟組織，其中該基因療法藥物包含： 第一rAAV2/9載體，其包含始於5'端且終止於3'端上游的少於編碼功能性MYH7蛋白或其功能性變體之全部聚核苷酸序列的連續第一部分；以及 第二rAAV2/9載體，其包含始於該5'端下游且終止於該3'端的少於該全部聚核苷酸序列的連續第二部分。
35. 一種以第一rAAV2/9載體在製造用於治療或預防人類個體之肥厚型心肌病之藥劑中的用途，其中該第一rAAV2/9載體包含始於5'端且終止於3'端上游的少於編碼功能性MYH7蛋白或其功能性變體之全部聚核苷酸序列的連續第一部分。
36. 如請求項35之用途，其中該藥劑進一步包含第二rAAV2/9載體或與該載體組合使用，該載體包含始於該5'端下游且終止於該3'端的少於該全部聚核苷酸序列的連續第二部分。
37. 一種治療或預防人類個體之心肌病的基因療法藥物，該基因療法藥物包含： 第一rAAV2/9載體，其包含始於5'端且終止於3'端上游的少於編碼功能性MYH7蛋白或其功能性變體之全部聚核苷酸序列的連續第一部分；以及 第二rAAV2/9載體，其包含始於該5'端下游且終止於該3'端的少於該全部聚核苷酸序列的連續第二部分。

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