KR20010029483A - 울혈성 심부전을 위한 유전자 치료 - Google Patents

Abstract

본 발명은 심근내에서 β-아드레날린작용성 반응성을 증가시키는 트랜스유전자를 삽입함으로써 포유동물 심장의 심장기능을 증강시키는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 따라서 본 발명은 심장병, 특히 울혈성 심부전의 치료에 사용될 수 있다.

Description

울혈성 심부전을 위한 유전자 치료{GENE THERAPY FOR CONGESTIVE HEART FAILURE}

미국에서는 3-4백만명의 성인이 울혈성 심부전(본문에서 “CHF”로 약기함)에 걸려 있으며, CHF의 발병률이 증가하고 있다고 보고되었다(예를 들면, Baughman, K., Cardiology Clinics 13:27-34, 1995). 매년 미국의 병원에서는, CHF가 500,000명의 환자에 대해 가장 빈번하게 정식 입원 및 퇴원 진단을 하게 하는 요인이다. 심부전의 증상이 알맞게 심하면, 그 예후는 그러한 환자의 50가 2년 내에 사망한다는 점에서 대개의 암보다 더 나쁘다(Braunwald, E.(ed), In:Heart Disease, W.B.Saunders, Philadelphia, page 471-485, 1988). 의학적 치료는 심부전의 증상(부종, 호흡곤란, 폐에 차는 유액)을 초기에는 경감시킬 수 있지만, 어떤 경우에는 의학적 치료에도 불구하고 이 질병에서의 예후인 삶의 연장이 불투명해진다(예를 들면, Baughman, K., Cardiology Clinics 13:27-34, 1995).

CHF는 대사요구에 대해 부적절한 심박출량이 얻어지는 비정상적인 심부전으로 정의된다(Braunwald, E.(ed), In:Heart Disease, W.B.Saunders, Philadelphia, page 426, 1988). 증상에는 호흡곤란, 피로, 약화, 다리종창 및 운동과민성이 있다. 신체검사에서, 심부전이 있는 환자는 심박동수 및 호흡률의 증가, 수포음(폐에 차는 유액을 나타냄), 부종, 경정맥 팽창, 및 일반적으로 확장된 심장이 있는 경향이다. 가장 통상적인 CHF의 원인은 심근으로 흐르는 혈액을 제공하는 혈관(관상동맥)이 차단되게 하는 아테롬성동맥경화증이다. 궁극적으로 그러한 차단은 심장기능의 후속적 쇠멸과 결과적으로 심부전이 되는 심근경색(심근 정지)을 초래할 수 있다. CHF의 다른 원인으로는 심장판막병, 고혈압, 심장의 바이러스 감염, 알콜 및 당뇨병을 들 수 있다. 몇몇 심부전의 경우는 확실한 병인이 없어 특발성이라고 불리워진다.

또한 CHF는 한가지 이상의 β-아드레날린작용성 신경호르몬 기능의 양태 변경에 의해 전형적으로 수행된다; 예를 들면, Bristow MR, et al., N Engl J Med 307:205-211, 1982; Bristow MR, et al., Circ Res 59:297-309, 1986; Ungerer M, et al., Circulation 87:454-461, 1993; Feldman AM, et al., J Clin Invest 82:189-197, 1988; Bristow MR, et al., J Clin Invest 92:2737-2745, 1993; Calderone A, et al., Circ Res 69:332-343, 1991; Marzo KP, et al., Circ Res 69:1546-1556, 1991; Liang C-S, et al., J Clin Invest 84:1267-1275, 1989; Roth DA, et al., J Clin Invest 91:939-949, 1993; Hadcock JR and Malbon CC:Proc Natl Acad Sci 85:5021-5025, 1988; Hadcock JR, et al., J Biol Chem 264:19928-19933, 1989; Mahan, et al., Proc Natl Acad Sci USA 82:129-133, 1985; Hammond HK, et al., Circulation 85:269-280, 1992; Neumann J, et al., Lancet 2:936-937, 1988; Urasawa K, et al., In:G Proteins:Signal Transduction and Disease, Academic Press, London. 44-85, 1992; Bohm M, Mol Cell Biochem, 147:147-160, 1995; Eschenhage T, et al., Z Kardiol, 81(Suppl 4):33-40, 1992; and Yamamoto J, et al., J Mol Cell, 26:617-626, 1994 참조. 다양한 아데닐일시클라제 효소에 관한 많은 다른 참고문헌은, 예를 들면 Fujita M et al., Circulation, 90:(No. 4 Part 2), 1994; Yoshimura M et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89:6716-6720, 1992; Krupinski J et al., J Biol Chem, 267:24858-24862, 1992; Ishikawa Y et al., J Biol Chem, 267:13553-13557, 1992; Ishikawa Y et al., J. Clin Invest, 93:2224-2229, 1994; Katsushika S et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89:8774-8778, 1992; Wallach J et al., FEBS Lett, 338:257-263, 1994; Watson PA et al., J Biol Chem, 269:28893-28898, 1994; Manolopoulos VG et al., Biochem Biophys Res Commun, 208:323-331, 1995; Yu HJ et al., FEBS Lett, 374:89-94, 1995; and Chen Z et al., J Biol Chem, 270:27525-27530, 1995를 참조한다.

이들의 연구결과로, CHF를 치료하기 위한 노력은 기능장애성 심장에서의 β-아드레날린작용성 반응을 자극하는 방법으로서 카테콜라민 및 β-아드레날린작용성 아고니스트와 같은 약리제를 투여하는 것에 집중되었다. 그러한 치료학적 접근법은 단지 일부에서만 성공을 거두었다. 더욱이, 카테콜라민에의 장기 노출은 해로울 수 있다. 특히, 심장은 β-아드레날린작용성 자극에 대한 반응이 적어지는 경향이 있고, 그러한 비반응성은 전형적으로 불량한 예후와 일반적으로 관련된 인자인 플라즈마에서 고 수준의 카테콜라민과 관련된다.

CHF의 현재 치료법에는 약리학적 치료법, 관상 재혈관화 방법(예를 들면, 관상동맥 바이패스 외과술 및 혈관형성술), 및 심장 이식술이 있다. 약리학적 치료법은 심장수축력의 증가(디지탈리스 및 β-아드레날린작용성 리셉터 아고니스트와 같은 수축력변동제를 사용), 폐 등에서의 유액 축적 감소(이뇨제 사용), 및 심장 작업 감소(앤지오텐신 전환 효소 저해제와 같은 전신혈관 내성을 감소시키는 작용제 사용)에 대해 지향되었다. 또한 β-아드레날린작용성 리셉터 길항제를 시험하였다. 그러한 약리제는 증상 및 잠재적으로 삶의 연장을 개선시킬 수 있으나, 대부분 경우에서의 예후는 좋지 않다.

관련된 관상동맥 질병으로 인한 심부전이 있는 일부 환자는 관상동맥 바이패스 외과수술 및 혈관형성술과 같은 재혈관화 방법에 의해 적어도 일시적으로 이로울 수 있다. 그러한 방법은 심근이 정지되지는 않으나 부적절한 혈류로 인해 기능장애일 수 있을 때 잠재적으로 이로울 수 있다. 정상적인 관상혈류가 회복되면, 생존가능한 기능장애성 심근이 더 정상적으로 수축할 수 있으며 심장 기능이 개선될 수 있다. 그러나, 재혈관화는 온화한 개선이 때로는 주목되더라도, CHF가 있는 환자에서 정상 또는 정상 근처로 심장기능을 거의 회복시키지 못한다.

최종적으로 심장이식술은 다른 합병이 없고 비교적 젊은 환자에게 적당한 옵션이 될 수 있으나, 이것은 심부전이 있는 단지 소수의 환자와 많은 비용에 대한 옵션이다. 요약하면, CHF는 매우 불량한 예후를 가지며 현재의 치료에 불량하게 반응한다.

CHF와 관련된 생리학적 상태를 더 복잡하게 하는 것은 기능장애성 심장이 있는 환자에서 일어나는 경향이 있는 각종 자연 적응이다. 이들 자연 반응이 초기에는 심부전을 개선시킬 수 있지만, 이들은 궁극적으로 CHF를 악화시키고 치료를 어렵게 하며 생존에 역효과를 갖게 하는 문제를 초래한다. CHF에서 통상적으로 관찰된 3가지 그러한 적응반응, 즉 (i) 혈장량을 팽창시키고 초기에 심박출량을 개선하는 나트륨 재흡수의 변화로 유발된 부피 보유, (ii) 비교적 정상적인 벽 장력을 유지하면서 일회박출량을 증가시킬 수 있는 심장 확장(확장법 및 비대) 및 (iii) 심장 β-아드레날린작용성 리셉터와 상호작용함으로써 심박동수 및 수축력을 증가시키는 경향이 있는 심장에 영향을 끼쳐 심박출량을 증가시키는 아드레날린작용성 신경말단으로부터의 증가된 노르에피네프린 방출이 있다. 그러나, 이들 3가지 자연 적응은 각각 각종 이유에 대해 궁극적으로 실패되는 경향이 있다. 특히, 유액 보유는 부종 및 호흡을 손상시키는 폐에 보유된 유액이 생기게 하며; 심장 확장은 후속의 심한 비대 및 증가된 벽 장력에 의해 개형하여 CHF를 악화시키는 결실성 좌심실이 되게 할 수 있고; 심장의 노르에피네프린에의 장기 노출은 아드레날린작용성 자극에 심장이 무반응성이게 하는 경향이 있고 불량한 예후와 관련된다.

β-아드레날린작용성 아고니스트 및 다른 조절 약제와 같은 약리제의 제어된 사용은 잠재적으로 생존에 대한 그 역효과를 포함하여 그 부족에도 불구하고 주요한 치료형태의 하나이다. 분석하고 어떤 경우에는 β-아드레날린작용성 리셉터 경로에 관련된 각 성분을 코딩하는 DNA 서열을 클로닝한 연구원은 CHF를 치료하는데 보다 유용하다고 입증된 약제의 새로운 부류를 동정하기 위해 그러한 성분을 사용하는 것을 제안하였다. 예를 들면, 이시카와 등은 포유동물 심장조직에서 우세하다고 알려진 아데닐일시클라제의 두 개의 상이한 이소형태(AC_V및 AC_VI)를 코딩하는 DNA를 클로닝하고, 아드레날린작용성 경로를 자극하는 약제의 새로운 부류를 동정하기 위한 DNA 및/또는 재조합형 단백질을 사용하는 것을 제안하였다(예를 들면, American Cyanamid, WO 93/05061, 1993. 3. 18, 및 EP 0 529 662, 1993. 3. 3; 및 1994년 8월 2일 발행된 이시카와의 미국특허 제5,334,521호 참조). 아드레날린작용성 자극 경로의 클로닝된 성분을 조사한 다른 보고에서, 저자는 일정한 성분(심장 β₂-아드레날린작용성 리셉터, Gsα 및 G-단백질 리셉터 키나제 저해제를 포함)을 과발현하는 유전자도입 마우스를 얻고 β-아드레날린작용성 자극이 유전자도입 마우스에서 증강될 수 있다는 것을 제시하는 몇몇 데이터를 얻었다(예를 들면, Gaudin C, et al., J Clin Invest 95:1676-1683, 1995; Koch W J, et al., Science 268:1350-1353, 1995; and Bond R A, et al., Nature 364:272-276, 1995 참조). 이들 보고는 심장 기능이 심부전이 있는 동물에서 효과적으로 회복될 수 있다는 것도 나타내지 않았으며, 또한 아드레날린작용성 반응성이 사람에서 CHF를 치료하기 위한 성공의 전조라고 생각되는 큰 동물 모델에서 증강될 수 있다는 것도 나타내지 않았다.

실제로, 관찰된 난점에 대한 재고는 β-아드레날린작용성 아고니스트(도파민 및 도부타민 등)의 임상적 사용과 관련되고, 최근의 보고는 β-아드레날린작용성 자극이 유해한 것으로 보인다는 것이고, 반대로 β-리셉터 “차단제” 또는 길항제는 질병률 및 사망률을 개선하는데 보다 유용할 수 있다는 것이다(예를 들면, Baughman, K., Cardiology Clinics 13:27-34, 1995 참조). 어떤 약제는 증상을 개선할 수 있으나, 그러한 약리제를 수용하는 환자에 대한 예후는 좋지 않다.

본문에 기재되고 청구된 본 발명은 심장기능이 β-아드레날린작용성 아고니스트 약제의 투여 없이 생체내에서 효과적으로 증강될 수 있는 기술을 제공함으로써 종래기술과 관련된 여러 문제들을 지양하고 해결한다.

본 발명은 포유동물 심장의 심장 기능을 증강시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이고, 보다 구체적으로 본 발명은 생체내에서 유전자 치료를 사용하여 심근의 β-아드레날린작용성 반응성을 증강시키기 위한 폴리누클레오티드 구조 및 기술에 관한 것이다.

정부 지원 연구에 관한 언급

본 발명은 내셔날 인스티튜츠 오브 헬스에 의해 주어진 인증번호 HL0281201 및 1P50HL53773-01의 미국정부 지지로 이루어졌다. 미국정부는 본 발명에 대해 일정한 권리를 가질 수 있다.

도 1A는 하기 실시예 5-1에 기재되는 바와 같이, 세포와 심장으로 유전자 전달에 유용한 예시적인 복제결손 재조합형 아데노바이러스 벡터의 개략적인 구조를 나타낸다.

도 1B는 하기 실시예 5-2에 기재되는 바와 같이, 세포와 심장으로 유전자 전달에 유용한 예시적인 복제결손 재조합형 아데노바이러스 벡터의 구조에 사용된 개략적인 클론을 나타낸다.

도 2는 개략적인 세포표면 β-아드레날린작용성-Gs-아데닐일시클라제 경로를 나타낸다. 이 경로를 통해서 β-아드레날린작용성 자극이 세포내의 cAMP를 증가시켜 심박동수 반응성 및 수축력에 영향을 끼친다. 경로는 하기에서 보다 상세하게 기재되는 바와 같이, β-아드레날린작용성 리셉터, cAMP 생성으로 점유된 자극성 GTP-결합 단백질(Gs) 연결 리셉터 및 아데닐일시클라제를 포함한다.

도 3은 실시예 3에 기재되는 바와 같이, 사람 임상학적 비대된 심부전에 대해 매우 높은 적합도를 갖는 심부전의 모델을 사용하여 정상 돼지 및 심한 심부전이 있는 돼지로부터 좌심실 멤브레인에서의 아데닐일시클라제의 기능을 평가하기 위해 포르스콜린-자극된 cAMP 생성을 사용하는 실험으로부터의 데이터를 나타낸다.

도 4는 실시예 8-1에 기재되는 바와 같이, AC 함량이 심장 근세포에서의 βAR-매개된 신호 형질도입시 한정을 세팅하는 것을 가리키는 데이터를 나타낸다.

도 5는 실시예 8-1에 기재되는 바와 같이, AC_VI트랜스유전자의 배양된 신생아 래트 심실 근세포로의 유전자 전달은 이소프로테레놀(10μM) 또는 포르스콜린(3μM)중 어느 한가지로 자극시킨 후에 얻어진 cAMP의 수준을 증가시킨 것을 가리키는 데이터를 나타낸다.

도 6은 실시예 8-2에 기재되는 바와 같이, 심장 근세포에서의 트랜스유전자 mRNA의 존재를 가리키는 노던 분석으로부터의 데이터를 나타낸다.

도 7은 실시예 8-2에 기재되는 바와 같이, 심장 근세포에서의 트랜스유전자 단백질의 존재를 가리키는 웨스턴 분석으로부터의 데이터를 나타낸다.

도 8A는 실시예 8-2에 기재되는 바와 같이, 순 GTPγ-자극된 포르스콜린 결합은 AC_VI유전자 전달후에 증가되는 것을 가리키는 포르스콜린 결합 연구로부터의 데이터(데이터는 3개의 실험으로부터의 평균값이다)를 나타낸다.

도 8B는 실시예 8-2에 기재되는 바와 같이, 심장 근세포를 발현하는 트랜스유전자 AC_VI는 AC의 증가량을 반영하는 포르스콜린 자극 뿐만 아니라 이소프로테레놀에 대한 증가된 아드레날린작용성 반응성을 갖는 것을 가리키고, 새로 합성된 AC는 β-AR 자극을 통해 기능적으로 커플링되고 보충할 수 있다는 것을 제안하는 cAMP 생성 연구로부터의 데이터를 나타낸다. 나타낸 것은 3개의 실험으로부터의 평균값이다.

도 8C는 실시예 8-2에 기재되는 바와 같이, AC_VI함량 및 cAMP 생성 사이의 관찰된 관계를 나타낸다. 그래프는 변경된 아드레날린작용성 신호화의 3개의 측정(포르스콜린 결합, 및 이소프로테레놀 및 포르스콜린 자극된 cAMP 생성)을 표시한다. 이들 데이터는 AC 함량 및 증강된 아드레날린작용성 신호화에서의 농도 증가가 일어난 것을 가리킨다.

도 9는 실시예 8-2에 기재되는 바와 같이 이소프로테레놀 자극 연구의 결과를 나타낸다. 신생아 래트 심장 근세포는 재조합형 아데노바이러스 발현 lacZ 또는 AC_VI를 사용하여 유전자 전달을 진행시켰다. AC_VI(대 lacZ)에 의한 유전자 전달 후에, 광범위한 이소프로테레놀 농도를 통해 생성된 cAMP가 분명하게 증가되어 있다. 이소프로테레놀-자극된 cAMP 생성에 대한 EC50은 변화되지 않았다.

도 10은 실시예 13에 기재되는 바와 같이, 돼지에서 AC_VI의 생체내에서의 유전자 전달의 심박동수에 대한 효과를 요약하는 데이터를 나타낸다. 이들 데이터는 먼저 생체내에서의 유전자 전달이 큰 포유동물 심장에서 아드레날린작용성 반응성을 효과적으로 증가시킬 수 있다는 것을 입증하고 있다.

도 11은 실시예 13에 기재되는 바와 같이, 정상 돼지에서 좌심실(LV) dP/dt에서 AC_VI의 생체내에서의 유전자 전달 결과를 나타낸다. 이들 데이터는 아드레날린작용성 신호화 요소(이 경우에는 AC_VI)의 생체내에서의 유전자 전달이 사람 심장기능의 매우 전조가 된다고 생각되는 큰 동물 모델에서 본래의 심장의 수축기능을 효과적으로 증강시킬 수 있다는 것을 더 입증하고 있다.

도 12A는 실시예 5-3에 기재되는 바와 같이 사람 AC_VI로부터의 누클레오티드 서열을 나타낸다. -X-는 나타낸 서열 내에서 약 0.5kb의 갭을 가리킨다.

도 12B는 실시예 5-3에 기재되는 바와 같이, 도 12A에 나타낸 누클레오티드 서열에 대응하는 아미노산 서열을 나타낸다.

발명의 개요

본 발명은 심근내의 β-아드레날린작용성 반응성을 증가시키는 트랜스유전자를 삽입함으로써 포유동물 심장의 심장기능을 증강시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 심장병, 특히 울혈성 심부전의 치료에 사용될 수 있다.

본 발명의 다양한 양태는 다음과 같다.

포유동물의 심장 기능을 증강시키는 방법은 벡터를 상기 포유동물의 심장으로 운반하는 것을 포함하고, 벡터는 프로모터에 작동가능하게 연결되는 β-아드레날린작용성 신호화 단백질(β-ASP)을 코딩하는 유전자로 이루어진다. 바람직하게는, 벡터는 심장의 심근으로 혈액을 공급하는 혈관에 도입되어 심장 근세포로 벡터를 운반하고; 보다 바람직하게는, 벡터는 관상동맥의 루멘, 복재정맥 그래프트, 또는 내유동맥 그래프트로 도입된다. 가장 바람직하게는, 벡터는 좌우 관상동맥의 루멘 둘다로 도입된다. 바람직하게는, 포유동물은 사람이다.

선행 구체예중 하나에 따라 심장 기능을 증강시키는 바람직한 방법에서, 벡터는 각각 프로모터에 작동가능하게 연결되는, β-아드레날린작용성 리셉터(β-AR), G-단백질 리셉터 키나제 저해제(GRK 저해제) 및 아데닐일시클라제(AC)로 이루어지는 군에서 선택된 β-ASP를 코딩하는 적어도 하나의 유전자로 이루어진다. 또한 방법은 각각 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 두 개의 다른 β-아드레날린작용성 신호화 단백질(β-ASP)을 코딩하는 벡터를 도입하는 것, 또는 프로모터에 작동가능하게 연결되는 제2의 β-ASP 유전자를 포함하는 제2의 벡터를 도입하는 것을 포함할 수 있다.

본문에 기재된 한 바람직한 구체예에서, 벡터는 아데닐일시클라제(AC), 바람직하게는 AC 이소형태 II, AC 이소형태 V 또는 AC 이소형태 VI와 같은 심장 AC, 보다 바람직하게는 AC 이소형태 VI를 코딩하는 유전자를 포함한다. 본문에 기재된 다른 바람직한 구체예에서, 벡터는 β-AR, 바람직하게는 β₁-아드레날린작용성 리셉터(β₁-AR) 또는 β₂-아드레날린작용성 리셉터(β₂-AR), 보다 바람직하게는 β₁-AR을 코딩하는 유전자를 포함한다. 본문에 기재된 다른 바람직한 구체예에서, 벡터는 GRK 저해제를 코딩하는 유전자를 포함하고, 이것은 바람직하게는 리셉터 결합활성을 제거하지 않은 키나제 활성을 손상시키는 돌연변이를 갖는 GRK 단백질을 코딩하는 유전자이고, 보다 바람직하게는 돌연변이는 키나제 도메인을 결실하는 절단이다.

선행 구체예의 하나에 따라 심장 기능을 증강시키는 바람직한 방법에서, 벡터는 이종 구성 프로모터 또는 이종 유발성 프로모터에 작동가능하게 연결되는 β-ASP를 코딩하는 유전자를 포함한다. 바람직한 이종 구성 프로모터는 증강제를 포함하는 CMV 프로모터이다. 본문에 기재된 다른 바람직한 구체예에서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터, 바람직하게는 심장 특이적 프로모터, 보다 바람직하게는 심실 근세포 특이적 프로모터이다. 심실 근세포 특이적 프로모터의 바람직한 예로는 심실 미오신 경쇄 2 프로모터 및 심실 미오신 중연쇄 프로모터를 들 수 있다. β-ASP를 코딩하는 유전자는 CMV 증강제와 같은 이종 증강제에 작동가능하게 연결될 수 있다. 바람직하게는, β-ASP를 코딩하는 유전자는 폴리아데닐화 신호에 작동가능하게 연결된다.

선행 구체예의 하나에 따라 심장 기능을 증강시키는 바람직한 방법에서, 벡터는 바이러스 벡터 또는 지질 기제 벡터, 바람직하게는 바이러스 벡터이다. 벡터는 표적화된 벡터, 특히 심실 근세포에 우선적으로 결합하는 표적화된 벡터일 수 있다. 현재 바람직한 바이러스 벡터는 아데노바이러스(Ad) 또는 아데노 관련 바이러스(AAV)에서 유래된다. 사람 및 비사람 바이러스 벡터 둘다가 사용될 수 있으나 바람직하게는 재조합형 바이러스 벡터가 사람에서 복제결손이다. 벡터가 아데노바이러스인 경우, 이것은 바람직하게는 β-ASP(β-AR, GRK 단백질 및/또는 아데닐일시클라제 등)를 코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 갖는 폴리누클레오티드로 이루어지고, 사람에서 복제결손이다. 현재 바람직한 복제결손 아데노바이러스 벡터는 E1A 및 E1B 유전자를 제거하는 결실, 또는 E1A, E1B 및 E4 유전자를 제거하는 결실을 갖는다. 바람직하게는 약 10⁷내지 10¹³개의 아데노바이러스 벡터 입자, 보다 바람직하게는 약 10⁹내지 10¹²개의 벡터 입자는 혈관, 바람직하게는 상기한 심근에 공급하는 혈관에 도입된다. AAV 벡터를 위해, 벡터는 바람직하게는 β-ASP(β-AR, GRK 저해제 및/또는 아데닐일시클라제 등)를 코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결된 폴리누클레오티드로 이루어지고, 바람직하게는 β-ASP를 코딩하는 유전자는 AAV 반전말단반복부(ITR)에 의해 접해 있다. 바람직하게는, AAV 벡터는 사람에서 복제결손이다. 현재 바람직한 복제결손 AAV 벡터는 한 개이상의 AAV 복제 또는 포막 서열에 영향을 끼치는 결실을 갖는다. 대안으로, 벡터는 본문에 기재된 바와 같이 β-ASP(β-AR, GRK 저해제 및/또는 아데닐일시클라제 등)를 코딩하는 유전자를 포함하는 지질 기제 벡터일 수 있다.

재조합형 복제결손 바이러스 입자는 프로모터에 작동가능하게 연결된 β-ASP(β-AR, GRK 저해제 및/또는 아데닐일시클라제 등)를 코딩하는 유전자를 포함한다. 바람직하게는, 프로모터는 이종 구성 또는 유발성 프로모터이다. 또한 벡터는 한 개보다 많은 β-ASP를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 바람직한 바이러스 벡터는 아데노바이러스(Ad) 또는 아데노 관련 바이러스(AAV)에서 유래된다. 사람 및 비사람 바이러스 벡터 둘다가 사용될 수 있으나 바람직하게는 재조합형 바이러스 벡터가 사람에서 복제결손이다. 벡터가 아데노바이러스인 경우, 이것은 바람직하게는 β-ASP(β-AR, GRK 저해제 및/또는 아데닐일시클라제 등)를 코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 갖는 폴리누클레오티드를 포함하고, 사람에서 복제결손이다. 현재 바람직한 복제결손 아데노바이러스 벡터는 E1A 및 E1B 유전자를 제거하는 결실, 또는 E1A, E1B 및 E4 유전자를 제거하는 결실을 갖는다. AAV 벡터를 위해, 벡터는 바람직하게는 β-ASP(β-AR, GRK 저해제 및/또는 아데닐일시클라제 등)를 코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 갖는 폴리누클레오티드를 포함하고, 바람직하게는 β-ASP를 코딩하는 유전자는 AAV 반전말단반복부 (ITR)에 의해 접해 있다. 바람직하게는, AAV 벡터는 사람에서 복제결손이다. 현재 바람직한 복제결손 AAV 벡터는 한 개이상의 AAV 복제 또는 포막 서열에 영향을 끼치는 결실을 갖는다. 본 발명의 다른 벡터는 본문에 기재된 바와 같이, β-ASP(β-AR, GRK 저해제 및/또는 아데닐일시클라제 등)를 코딩하는 한 개이상의 유전자로 이루어지는 지질 기제 벡터(리포좀 등)를 포함한다.

포유동물 세포는 선행 구체예의 하나에 따라 재조합형 복제결손 바이러스 입자 또는 다른 벡터로 트랜스펙션되었다.

여과된 주사가능한 아데노바이러스 입자 제제는 (i) 상기한 바와 같은 재조합형 복제결손 아데노바이러스 입자, 및 (ii) 담체로 이루어진다. 담체는 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 담체이다. 바람직하게는 아데노바이러스 벡터는 0.1-0.5 마이크론 필터를 통해 여과되었다.

상기한 바와 같은 재조합형 복제결손 바이러스 입자를 생성하는 방법은 나열된 순서대로 다음 단계를 포함한다:

(i) 제1 및 제2플라스미드를, 복제 수용능을 부여하는 복제가능한 포유동물세포 발현의 하나이상의 아데노바이러스 유전자로 도입하는 단계로서, 상기 제1플라스미드는 프로모터에 작동가능하게 연결된 β-ASP(β-AR, GRK 저해제 및/또는 아데닐일시클라제 등)를 코딩하는 유전자를 포함하고 복제결손 아데노바이러스 게놈을 더 포함하며, 상기 제2플라스미드는 복제숙달 아데노바이러스 게놈을 포함하고 제2플라스미드가 너무 커서 아데노바이러스 입자에 포막될 수 없게 하는 추가의 폴리누클레오티드 서열을 더 포함하고, 이로써 레스큐 재조합이 제1플라스미드와 제2플라스미드 사이에서 일어나서 β-ASP를 코딩하는 유전자를 포함하나 하나이상의 아데노바이러스 복제 유전자를 결핍시키는, 아데노바이러스 입자에 포막될 정도로 충분히 작은 재조합형 아데노바이러스 게놈을 생성하는 단계;

(ii) 성공한 재조합형 바이러스 벡터를 세포 배양물에서 동정하는 단계; 및

(iii) 얻어진 재조합형 바이러스 입자를 복제가능한 포유류 세포 발현의 결손 아데노바이러스 복제 유전자에서 증식시켜 재조합형 복제결손 바이러스 입자를 생성하는 단계.

도입 단계는 제1 및 제2플라스미드를 허용되는 포유동물 세포로 공동 트랜스펙션시켜 수행될 수 있다. 또한 이 방법은 상기 제1 및 제2플라스미드를 도입하는 단계 이전에, β-ASP를 코딩하는 유전자를, β-ASP를 코딩하는 유전자가 프로모터에 작동가능하게 연결되도록 복제결손 아데노바이러스 게놈 좌단의 부분 아데노바이러스 서열 및 프로모터를 함유하는 플라스미드로 클로닝하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는 이 방법은 상기 증식 단계 이후에, 증식된 바이러스 입자를 정제하는 단계를 더 포함하고, 바람직하게는 또한 0.1-0.5 마이크론 필터를 통해 정제된 바이러스 입자를 여과하는 단계를 포함한다. 상기한 바와 같은 예시적인 제1의 플라스미드는 플라스미드 pAC1 또는 β-ASP를 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드 ACCMVPLPA이다. 상기한 동정 단계는, 바람직하게는 (i) 트랜스펙션된 세포를 세포변성효과의 증거를 위해 모니터하는 단계; (ii) 바이러스 핵산을, 세포변성효과를 나타내는 트랜스펙션된 세포 배양물중 세포 상청액으로부터 분리하는 단계로서, 세포변성효과를 나타내는 세포 배양물로부터 세포 상청액을 프로테이나제(프로테이나제 K)로 처리하고 나서 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 하는 단계; (iii) 성공한 재조합체를, 아데노바이러스 서열에 상보적인 프라이머 및 β-ASP 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터에 상보적인 프라이머를 사용하여 PCR로 동정하는 단계; 및 (iv) 재조합형 바이러스 입자를 플라크 정제(바람직하게는 적어도 2회)로 정제하는 단계를 포함한다. 바이러스 핵산은 재조합형 바이러스 입자를 함유한다고 생각되는 세포 배양 상청액을 프로테이나제(프로테이나제 K)로 처리하고 나서 프로테이나제 처리된 상청액을 페놀/클로로포름으로 추출하여 단백질을 제거하고 최종적으로 세포 용해물을 에탄올로 침전시켜 바이러스 DNA를 얻어서 분리할 수 있다.

상기한 정제 단계는, 바람직하게는 (i) 복제 수용능을 부여하는 유전자로 형질전환된 세포에서 얻어진 재조합체를 10¹⁰-10¹²개의 바이러스 입자 범위의 역가로 증식시키는 단계; 및 (ii) 증식된 재조합체를 정제하는 단계(바람직하게는 이중의 CsCl 구배 한외여과에 의함).

재조합형 프로바이러스 플라스미드는 프로모터에 작동가능하게 연결된 β-ASP를 코딩하는 유전자를 포함하고 복제결손 바이러스 게놈을 더 포함한다. 바람직하게는, β-ASP는 β-AR, GRK 저해제 또는 아데닐일시클라제, 보다 바람직하게는 아데닐일시클라제 이소형태 VI이다. 예시적인 복제결손 바이러스 게놈은 아데노바이러스 게놈 및 AAV 게놈을 포함한다. 재조합형 복제결손 바이러스 게놈이 아데노바이러스 게놈인 경우, 아데노바이러스는 사람 또는 비사람 포유동물 아데노바이러스 (바람직하게는 비사람 포유동물)중 어느 한가지일 수 있으나, 어느 한가지 경우에서는 바람직하게는 사람에서 복제결손이다. 바람직하게는, 재조합형 복제결손 아데노바이러스 게놈은 E1A 및 E1B 유전자를 제거하는 결실, 또는 E1A, E1B 및 E4 유전자를 제거하는 결실을 갖는다. 재조합형 복제결손 바이러스 게놈이 AAV 게놈인 경우, AAV 게놈은 바람직하게는 한 개이상의 AAV 복제 또는 포막 서열에 영향을 끼치는 결실을 갖는다.

세포는 선행 구체예의 하나에 따라 재조합형 프로바이러스 플라스미드를 포함한다.

정의

“폴리누클레오티드”는 리보누클레오티드 또는 데옥시리보누클레오티드, 또는 그것의 유사체중 어느 한가지로 어떤 길이의 누클레오티드의 폴리머 형태로 언급된다. 이 용어는 분자의 1차 구조로 언급되고, 따라서 이중 및 단일 가닥의 DNA 뿐만 아니라 이중 및 단일 가닥의 RNA도 포함한다. 또한 메틸화 및/또는 캐핑된 폴리누클레오티드와 같은 변형된 폴리누클레오티드를 포함한다.

폴리누클레오티드에 적용되는 바와 같이, “재조합체”는 폴리누클레오티드가 클로닝, 제한 및/또는 라이게이션 단계, 및 천연에서 발견되는 폴리누클레오티드와는 다른 구조물이 얻어지는 다른 과정의 다양한 조합 생성물을 의미한다.

“유전자”는 단백질을 코딩하는 서열로 이루어지는 폴리누클레오티드 또는 폴리누클레오티드의 부분으로 언급된다. 대부분의 상황에서, 효과적으로 전사를 촉진하기 위해 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유전자가 소망된다. 증강제, 리프레서 및 다른 조절 서열은 본 기술분야에서 공지된 바와 같이(예를 들면, 하기 인용된 참고문헌 참조), 유전자의 활성을 조절하기 위해 포함될 수 있다.

용어 “폴리펩티드”, “펩티드” 및 “단백질”은 어떤 길이의 아미노산의 폴리머로 언급되도록 교환가능하게 사용된다. 이들 용어는 글리코실화, 아세틸화 및 포스포릴화를 포함하는 반응을 통해 후번역으로 변형되는 단백질을 포함한다.

“이종” 성분은 자연적으로 위치되는 상이한 실재물내에서 생성 또는 도입되는 성분으로 언급된다. 예를 들면, 한 유기물로부터 유래되고 유전자공학 기술에 의해 다른 유기물로 도입되는 폴리누클레오티드는 이종 폴리누클레오티드이고, 발현된다면 이종 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 유사하게, 원래의 코딩서열로부터 제거되고 다른 코딩서열에 작동가능하게 연결되는 프로모터 또는 증강제는 이종 프로모터 또는 증강제이다.

본문에 사용된 바와 같이 “프로모터”는 작동가능하게 연결되는 유전자 또는 코딩서열의 전사를 제어하는 폴리누클레오티드 서열로 언급된다. 각종 다른 공급원으로부터 구성, 유발성 및 제지성 프로모터를 포함하는 다수의 프로모터는 본 기술분야에서 공지되어 있고 클로닝된 폴리누클레오티드 서열로서 또는 그 내에서 구입가능하다(예를 들면, ATCC 뿐만 아니라 다른 시중 또는 개개의 공급원과 같은 기탁기관으로부터).

본문에 사용된 바와 같이 “증강제”는 작동가능하게 연결되는 유전자 또는 코딩서열의 전사를 증강시키는 폴리누클레오티드 서열로 언급된다. 각종 다른 공급원으로부터 다수의 증강제는 본 기술분야에서 공지되어 있고 클로닝된 폴리누클레오티드 서열로서 또는 그 내에서 구입가능하다(예를 들면, ATCC 뿐만 아니라 다른 시중 또는 개개의 공급원과 같은 기탁기관으로부터). 프로모터 서열(통상 사용되는 CMV 프로모터)을 포함하는 다수의 폴리누클레오티드는 증강제 서열로 이루어진다.

“작동가능하게 연결된”은 병렬위치로 언급되고, 기재된 성분은 그 의도된 방식으로 기능하기 위해 그러한 관계를 허용한다. 프로모터는 이 프로모터가 코딩서열의 전사를 제어한다면 코딩서열에 작동가능하게 연결된다. 작동가능하게 연결된 프로모터가 일반적으로 코딩서열의 상류에 위치되더라도, 그것과 접촉할 필요는 없다. 증강제는 이 증강제가 코딩서열의 전사를 증가시킨다면 코딩서열에 작동가능하게 연결된다. 작동가능하게 연결된 증강제는 코딩서열의 상류, 또는 하류내에서 위치될 수 있다. 폴리아데닐화 서열은 전사가 코딩서열을 통해 폴리아데닐화 서열로 진행되도록 코딩서열의 하류 말단에 위치된다면 코딩서열에 작동가능하게 연결된다.

“레플리콘”은 폴리누클레오티드가 적절한 숙주 세포에서 복제되게 하는 복제기원을 포함하는 폴리누클레오티드로 언급된다. 예로는 이종 핵산이 통합될 수 있는 표적세포의 레플리콘(예를 들면, 핵 및 미토콘드리아 염색체) 뿐만 아니라 염색체외의 레플리콘(복제 플라스미드 및 에피솜)을 들 수 있다.

본문에 사용된 바와 같이 “유전자 운반”, “유전자 전달” 등은, 도입에 사용된 방법과는 무관하게, 외생의 폴리누클레오티드(종종 “트랜스유전자”로 언급됨)의 숙주세포로의 도입으로 언급되는 용어이다. 그러한 방법은 벡터 매개된 유전자 전달과 같은 각종 공지된 기술(예를 들면, 바이러스 감염/트랜스펙션, 또는 다양한 다른 단백질 기제 또는 지질 기제 유전자 운반 착체) 뿐만 아니라 “네이키드” 폴리누클레오티드의 운반을 촉진하는 기술(폴리누클레오티드의 도입에 사용되는, 전기영동, “유전자 건” 운반 및 다양한 다른 기술 등)을 포함한다. 도입된 폴리누클레오티드는 숙주세포에서 안정하게 또는 일시적으로 유지될 수 있다. 안정한 유지는 전형적으로 도입된 폴리누클레오티드가 숙주세포와 적합한 복제기원을 함유하거나 염색체외 레플리콘(예를 들면, 플라스미드) 또는 핵 또는 미토콘드리아 염색체와 같은 숙주세포의 레플리콘으로 통합되는 것을 요구한다. 많은 벡터는 본 기술분야에서 공지되고 본문에 기재된 바와 같이, 유전자 전달을 포유동물 세포로 매개할 수 있는 것이 공지되어 있다.

본문에 사용되는 바와 같이 “생체내에서” 유전자 운반, 유전자 전달, 유전자 치료 등은 외생 폴리누클레오티드를 포함하는 벡터를 사람 또는 비사람 포유동물과 같은 유기체로 직접 도입하여 외생 폴리누클레오티드가 그러한 유기체의 생체내의 세포로 도입되는 것으로 언급되는 용어이다.

“벡터”(종종 유전자 운반 또는 유전자 전달 “비이클”로 언급됨)는 시험관내에서 또는 생체내에서 숙주세포로 운반될 폴리누클레오티드를 포함하는 거대분자 또는 분자착체로 언급된다. 운반될 폴리누클레오티드는 유전자 치료에서 관심있는 코딩서열로 이루어질 수 있다. 벡터는, 예를 들면 바이러스 벡터(아데노바이러스(“Ad”), 아데노 관련 바이러스(AAV), 및 레트로바이러스 등), 리포좀 및 다른 지질 함유 착체, 및 폴리누클레오티드의 운반을 숙주세포로 매개할 수 있는 다른 거대분자 착체를 포함한다. 또한 벡터는 유전자 운반 및/또는 유전자 발현을 더 조절하고, 또는 표적화된 세포에 이로운 성질을 제공하는 다른 성분 또는 기능성을 포함할 수 있다. 하기에서 보다 상세하게 기재되고 예시되는 바와 같이, 그러한 다른 성분은, 예를 들면 세포에 결합 또는 표적화하는데 영향을 끼치는 성분(세포 유형 또는 조직 특이적 결합을 매개하는 성분 포함); 세포에 의한 벡터 핵산의 흡수에 영향을 끼치는 성분; 흡수후에 세포내에서 폴리누클레오티드의 위치결정에 영향을 끼치는 성분(핵 위치결정을 매개하는 작용제 등); 및 폴리누클레오티드의 발현에 영향을 끼치는 성분을 포함한다. 또한 그러한 성분은 벡터에 의해 운반된 핵산을 발현하고 흡수한 세포에 대해 검출 또는 선택하는데 사용될 수 있는 검출가능한 및/또는 선택가능한 마커와 같은 마커를 포함할 수 있다. 그러한 성분은 벡터의 자연 특징으로서 제공될 수 있고(결합 및 흡수를 매개하는 성분 또는 기능성을 갖는 일정한 바이러스 벡터의 사용 등), 또는 벡터는 그러한 기능성을 제공하기 위해 변형될 수 있다. 각종 그러한 벡터는 본 기술분야에서 공지되어 있고 일반적으로 이용가능하다(예를 들면, 하기 인용되는 각종 참고문헌 참조).

“재조합형 바이러스 벡터”는 하나이상의 이종 유전자 또는 서열을 포함하는 바이러스 벡터로 언급된다. 많은 바이러스 벡터가 패키징과 관련되어 크기 제약을 받기 때문에, 이종 유전자 또는 서열은 전형적으로 바이러스 게놈의 하나이상의 부분을 치환함으로써 도입된다. 그러한 바이러스는 바이러스 복제 및 포막(예를 들면, 복제 및/또는 포막에 필요한 유전자를 갖는 패키징 세포주 또는 헬퍼 바이러스 사용) 동안에 트랜스 상태에서 제공될 결실된 기능(들)을 요구하는 복제결손이 될 수 있다(예를 들면, 하기 참고문헌 및 예시 참조). 운반될 폴리누클레오티드가 바이러스 입자의 외부로 운반되는 변형된 바이러스 벡터도 또한 기재되었다(예를 들면, Curiel, DT, et al. PNAS 88:8850-8854, 1991).

본문에 사용된 바와 같이 바이러스 “패키징”은 바이러스 벡터가 조립 및 합성되는 일련의 세포내 사건으로 언급된다. 패키징은 전형적으로 “프로바이러스 게놈”, 또는 “벡터 플라스미드”로 전형적으로 언급된 재조합형 프로벡터(전형적으로, 적절한 바이러스 “패키징 서열”에 의해 접해 있는 결과로, 이것은 바이러스 게놈과 유사한 방식으로 패키징될 수 있는 재조합형 폴리누클레오티드이다)의 복제를 포함하고, 다음에 핵산을 포막 또는 다르게 코팅한다. 따라서, 적당한 벡터 플라스미드가 적절한 조건하에서 패키징 세포주로 도입될 때, 이것은 바이러스 입자로 복제 및 조립될 수 있다. 많은 바이러스 게놈에서 발견된 바이러스 “rep” 및 “cap” 유전자는 각각 복제 및 포막 단백질을 코딩하는 유전자이다. “복제결손” 또는 “복제 인콤피턴트” 바이러스 벡터는 복제 및/또는 패키징에 필요한 하나이상의 기능이 결손 또는 변경되는 바이러스 벡터로 언급되고, 숙주세포에 의해 흡수를 수행하는 바이러스 복제를 개시할 수 없는 바이러스 벡터가 되게 한다. 그러한 복제결손 바이러스 벡터의 스톡을 생성하기 위해, 바이러스 또는 프로바이러스 핵산은 트랜스 상태에서 공급될 수 있는 결손 기능을 코딩하는 유전자를 함유하도록 변형된 “패키징 세포주”로 도입될 수 있다. 예를 들면, 그러한 패키징 유전자는 패키징 세포주의 레플리콘으로 안정하게 통합될 수 있고 또는 이것은 “패키징 플라스미드” 또는 결손 기능을 코딩하는 유전자를 갖는 헬퍼 바이러스에 의한 트랜스펙션으로 도입될 수 있다.

“검출가능한 마커 유전자”는 유전자를 갖는 세포가 구체적으로 검출되게 하는 유전자이다(예를 들면, 마커 유전자를 운반하지 않는 세포와는 구별된다). 각종 그러한 마커 유전자는 본 기술분야에서 공지되어 있다. 그것의 바람직한 실시예로는 세포 표면에 나타나는 단백질을 코딩하여 단순화 및 신속한 검출 및/또는 세포분류를 촉진하는 검출가능한 마커 유전자를 들 수 있다. 예시로서, 베타갈락토시다제를 코딩하는 lacZ 유전자를 검출가능한 마커로서 사용할 수 있으며, lacZ 유전자를 갖는 벡터로 형질도입된 세포를 하기하는 바와 같이 착색시킴으로써 검출되게 한다.

“선택가능한 마커 유전자”는 유전자를 갖는 세포가 대응하는 선택제의 존재하에서 또는 이에 대해 구체적으로 선택되게 하는 유전자이다. 예시로서, 항생물질 내성이 있는 유전자는 숙주세포를 대응하는 항생물질의 존재하에서 양성으로 선택하게 하는 양성 선택가능한 마커 유전자로서 사용될 수 있다. 선택가능한 마커는 양성, 음성 또는 두 기능을 가질 수 있다. 양성 선택가능한 마커는 마커를 갖는 세포를 선택하게 하고, 반면에 음성 선택가능한 마커는 마커를 갖는 세포를 선택적으로 제거하게 한다. 다양한 그러한 마커 유전자는 두 기능(즉, 양성/음성)을 가진 마커를 포함하여 기재하였다(예를 들면, WO 92/08796, 1992년 5월 29일 공개 및 WO 94/28143, 1994년 12월 8일 공개 참조). 그러한 마커 유전자는 유전자 치료 문맥에서 유리할 수 있는 콘트롤의 첨가된 측정을 제공할 수 있다.

본문에 사용된 바와 같이 “β-아드레날린작용성 신호화”는 세포표면에 존재하는 β-아드레날린작용성 리셉터(“β-AR”)를 통해 매개되는 β-아드레날린작용성 리셉터 매개된 신호화로 언급된다. 본 발명의 문맥에서 특히 관련있는 것은 포유동물 심장조직의 심근에서의 β-아드레날린작용성 자극된 세포의 표면에 존재하는 리셉터이다. 하기하는 바와 같이, 심근 조직내의 β-아드레날린작용성 신호화는 β-AR에 결합하는 아고니스트에 의해 먼저 매개되고, 그 다음에 G_s-매개된 신호가 아데닐일시클라제(AC)에 형질도입된다. 다음에 활성화된 AC는 환상 AMP(cAMP)의 합성을 촉매하고, cAMP의 증가된 세포내 농도는 심박동수 및 심장 수축력 둘다(각각 양성 심박수변동성 및 양성 수축력변동성으로 언급됨)를 증강시키는 증가된 세포질 칼슘 통과성을 매개한다. 다양한 β-아드레날린작용성 신호화 단백질 및 β-아드레날린작용성 신호화에 영향을 끼치는 다른 인자는 본 기술분야에 기재되어 있고 본문에 더 예시된다.

“β-아드레날린작용성 신호화 단백질”(종종 본문에서 “β-ASP”로 약기함) 또는 “β-아드레날린작용성 신호화 요소”는 포유동물 조직에서 발현될 때, 바람직하게는 (본 발명의 목적을 위해) 포유동물 심근조직에서 발현될 때 β-아드레날린작용성 리셉터 매개된 신호화를 증강시킬 수 있는 단백질로 언급된다. 따라서 β-아드레날린작용성 신호화 단백질은 바람직하게는 포유동물 심근 세포에서 β-아드레날린작용성 신호화를 매개 또는 형질도입하는 “β-아드레날린작용성 신호 트랜스듀서” 단백질 뿐만 아니라, 그러한 트랜스듀서 단백질을 자극할 수 있거나 그러한 트랜스듀서 단백질의 저해제를 불활성화 또는 이를 길항할 수 있는 단백질을 포함한다(이로써 신호 형질도입을 간접적으로 증강시킴). 포유동물 심장조직에서 β-아드레날린작용성 리셉터 매개된 신호화와 관련되는 다양한 그러한 단백질이 동정되고(예를 들면, 상기 인용된 β-아드레날린작용성 반응성에 관한 각종 참고문헌 참조) 본문에 예시된다. 본 발명에 사용하는데 바람직한 β-ASP는, 인용 기술에서와 본문에서 보다 상세하게 기재되는 바와 같이, β-아드레날린작용성 리셉터(“βAR”), G_s단백질 트랜스듀서 및 아데닐일시클라제(“AC”) 이펙터로 이루어지는, “βAR-Gs-AC” 경로와 관련된 다양한 단백질 뿐만 아니라, 그러한 βAR-Gs-AC 단백질의 활성을 증강시키는 단백질과 같은 포유동물 심장조직에서 β-아드레날린작용성 리셉터 매개된 신호 형질도입에 역할이 있는 것으로 공지되어 있는 것이다. 최근의 데이터는 G_s단백질이 βAR 또는 AC중 어느 한가지 보다 훨씬 높은 몰 농도에서 일반적으로 존재한다는 것을 입증하였다. 후자의 두 개의 단백질(βAR 및 AC) 뿐만 아니라 G-단백질 리셉터 키나제(βAR 활성에 영향을 끼침)의 저해제는 본 발명에 사용하기 위한 바람직한 β-아드레날린작용성 리셉터 매개된 신호화 성분이다. 따라서 본 발명에 사용하는데 바람직한 β-ASP의 예로는 β-아드레날린작용성 리셉터(β₁-아드레날린작용성 리셉터 또는 β₂-아드레날린작용성 리셉터, 보다 바람직하게는 β₁-아드레날린작용성 리셉터), 아데닐일시클라제(바람직하게는 AC_V또는 AC_VI, 보다 바람직하게는 AC_VI와 같은 심장 AC) 뿐만 아니라 G-단백질 리셉터 키나제의 기능의 저해제(일반적으로 “GRK” 저해제로 본문에서 언급됨)을 들 수 있다.

“β-아드레날린작용성 리셉터”(“β-AR” 또는 “βAR”로 약기함)는 βAR-Gs-AC 경로를 통해 β-아드레날린작용성 리셉터 매개된 신호화에 관련된 세포표면 리셉터이다. 포유동물 심장의 심근에서, βAR은 노르에피네프린(전신성 신경전달물질) 및 에피네프린(부신 호르몬)에 대한 주 리셉터이다. 사람 심근은 β₁-아드레날린작용성 리셉터 및 β₂-아드레날린작용성 리셉터 둘다를 함유하나, 하기하는 바와 같이 β₁-AR이 우세하고 심부전으로 관찰되는 변경된 β-아드레날린작용성 신호화와 밀접하게 관련된다.

“G_s단백질”은 본문에서와 본 기술분야에서 기재되는 바와 같이, 다양한 세포표면 리셉터(β-아드레날린작용성 리셉터 포함)의 활성을 아데닐일시클라제의 활성에 효과적으로 커플링하는 GTP-결합 조절 단백질이다.

“아데닐일시클라제”(EC 4.6.1.1, “아데닐시클라제”, “아데닐레이트시클라제”, 및 “cAMP 신테타제”로 언급됨)는 아데노신 트리포스페이트(ATP)를 3':5'-환상 아데노신 모노포스페이트(cAMP)로 전환시키는 것을 촉매하는 효소이다. 아데닐일시클라제(본문에서 “AC”로 약기함)는 대부분의 모든 포유동물 조직에서 다양한 수준에서 발견되는 많은 상이한 이소형태로 존재하는 것으로 공지되어 있다. 본 발명의 가장 바람직한 아데닐일시클라제는, 하기에서 보다 상세하게 기재하는 바와 같이, 포유동물 심장 조직, 특히 심장 근세포에서 우세하다고 발견된 이소형태인 “심장 아데닐일시클라제”이다.

“G-단백질 리셉터 키나제”(“GRK”로 약기하나, “β-아드레날린작용성 리셉터 키나제” 또는 “βARK”로도 본 기술분야에서 언급됨)는 β-아드레날린작용성 리셉터(“βAR”)를 포함하는 G-단백질 커플링된 리셉터 단백질의 포스포릴화를 촉매하는 키나제 단백질이다. GRK 단백질에 의한 βAR의 포스포릴화는 리셉터를 비커플링시키고 β-아드레날린작용성 신호화에 대한 반응성을 부수적으로 감소시킨다.

본문에서 사용된 바와 같이 “GRK”저해제는 G-단백질 리셉터 키나제의 기능을 저해하는 단백질로 언급된다. GRK의 그러한 저해제는 변형된 GRK 단백질을 포함하고 리셉터 결합 활성은 키나제 활성으로부터 비커플링되었다. 따라서 예시적인 GRK 저해제는 βAR과 같은 G-단백질 커플링된 리셉터 단백질에 결합하는 능력을 보유하면서 키나제 기능을 제거하기 위해 절단된(전형적으로 아미노 말단에서 시작되는 결실) 변형된 GRK를 포함한다. 그러한 절단된 GRK 단백질은 정상적인 GRK가 βAR에 결합하는 것을 효과적으로 길항하거나 방지하나 리셉터 활성의 후속 저해를 야기하지 않을 수 있다(키나제 활성을 결핍시키기 때문). 본 발명에 사용될 수 있는 GRK 저해제의 예는 하기한다.

“맥관 구조” 또는 “혈관”은 포유동물 몸체를 통해 혈액(뿐만 아니라 림프액)을 운반하는 관 시스템으로 언급되는 용어이다.

“혈관”은 동맥, 소동맥, 모세관, 소정맥, 정맥, 동, 및 맥관벽혈관을 포함하는 포유동물 혈관 시스템의 모든 관으로 언급된다.

“동맥”은 심장으로부터 나오는 혈액이 지나가는 혈관으로 언급된다. 관상동맥은 심장 자체의 조직에 공급하고, 반면 다른 동맥은 몸체의 나머지 기관에 공급한다. 동맥의 일반 구조는 다층화된 동맥벽에 의해 에워싸인 루멘으로 구성된다.

본문에서 사용된 바와 같이 “개체”는 큰 포유동물, 가장 바람직하게는 사람으로 언급된다.

본문에서 사용된 바와 같이 “치료” 또는 “치료법”은 개체에서 예방적이고 병에 잘 듣고 또는 다른 이로운 효과를 도출해낼 수 있는 작용제를 개개의 환자에게 투여하는 것으로 언급된다.

본문에서 사용된 바와 같이 “유전자 치료”는 치료적 유전자를 포함하는 벡터를 개개의 환자에게 투여하는 것으로 언급된다.

“치료적 폴리누클레오티드” 또는 “치료적 유전자”는 개체에게 전달되었을 때, 개체에서 예방적이고 병에 잘 듣고 또는 다른 이로운 효과를 도출해낼 수 있는 누클레오티드 서열로 언급된다.

참고문헌

본 발명의 실시는, 다르게 언급되지 않는 한, 본 기술분야의 기술내에 있는 분자생물학 등의 종래의 기술을 사용할 것이다. 그러한 기술은 문헌에서 충분히 설명된다. 예를 들면, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989); Current Protocols in Molecular Biology(F. Ausubel et al. eds., 1987 and updated); Essential Molecular Biology(T. Brown ed., IRL Press 1991); Gene Expression Technology(Goeddel ed., Academic Press 1991); Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes(A. Bothwell et al. eds., Bartlett Publ. 1990); Gene Transfer and Expression(M. Kriegler, Stockton Press 1990); Recombinant DNA Methodology(R. Wu et al. eds., Academic Press 1989); PCR: A Practical Approach(M. McPherson et al., IRL Press at Oxford University Press 1991); Cell Culture for Biochemists(R. Adams ed., Elsevier Science Publishers 1990); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J. Miller ＆ M. Calos eds., 1987); Mammalian Cell Biotechnology(M. Butler ed., 1991); Animal Cell Culture(J. Pollard et al. eds., Humana Press 1990); Culture of Animal Cells, 2nd Ed.(R. Freshney et al. eds., Alan R. Liss 1987); Flow Cytometry and Sorting(M. Melamed et al. eds., Wiley-Liss 1990); the series Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.); Techniques in Immunocytochemistry, (G. Bullock ＆ P. Petrusz eds., Academic Press 1982, 1983, 1985, 1989); Handbook of Experimental Immunology, (D. Weir ＆ C. Blackwell, eds.); Cellular and Molecular Immunology(A. Abbas et al., W.B.Saunders Co. 1991, 1994); Current Protocols in Immunology(J. Coligan et al. eds. 1991); the series Annual Review of Immunology; the series Advances in Immunology; Oligonucleotide Synthesis(M. Gait ed., 1984); and Animal Cell Culture(R. Freshney ed., IRL Press 1987) 참조.

본 발명 방법에 사용될 수 있는 외과술 및 운반을 기재하고 있는 다른 참고문헌으로는, Topol, EJ (ed.), The Textbook of Interventional Cardiology, 2nd Ed.(W.B.Saunders Co. 1994); Rutherford, RB, Vascular Surgery, 3rd Ed. (W.B.Saunders Co. 1989); Wyngaarden JB et al. (eds.), The Cecil Textbook of Medicine, 19th Ed.(W.B.Saunders, 1992); and Sabiston, D, The Textbook of Surgery, 14th Ed.(W.B.Saunders Co. 1991)을 들 수 있다.

본 발명 방법에 유용할 수 있는 맥관구조 및 혈관에서 발견된 세포 유형을 기재하고 있는 다른 참고문헌으로는 W.Bloom ＆ D.Fawcett, A Textbook of Histology, 10th Ed., (W.B.Saunders Co. 1975)를 들 수 있다.

다양한 공보가 심장병을 포함하여 질병의 치료 또는 예방에 대한 유전자 전달의 사용을 입증하였다. 예를 들면, Methods in Molecular Biology, Vol.7:Gene Transfer and Expression Protocols, Murray, E.(ed.), Humana Press, Clifton, N.J.(1991); Mazur et al., Molecular and Cellular Pharmacology, 21:104-111, 1994; French, Herz 18:222-229, 1993; Williams, American Journal of Medical Science 306:129-136, 1993; and Schneider and French, Circulation 88:1937-1942, 1993 참조.

본 발명에서 사용될 수 있는 다양한 β-아드레날린작용성 신호화 단백질 및 벡터의 구조적/기능적 특징 및 공급원은 본 명세서를 통해 인용된 각종 보고서에서 제공되며, 하기에서 보다 상세하게 기재된다.

참고로 포함

특허, 공개된 특허 출원 및 다른 공보를 포함하여 본 출원내에서 인용된 참고문헌은 참고로 여기에 포함된다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 다양한 바람직한 양태는 하기에서 요약되고 다음의 상세한 설명 및 실시예에서 더 기재되고 예시된다.

본 발명의 한 바람직한 양태는 심장병(특히 CHF)을 치료하는 방법을 제공하는 것이고, 여기서 하나 이상의 β-아드레날린작용성 신호화 요소는 β-아드레날린작용성 신호화 요소를 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터 구조로 심근을 표적화함으로써 환자의 생체내에서 합성된다. 바람직한 방법은 환자의 심근으로 비교적 제한되는 β-아드레날린작용성 신호화 요소의 발현이 국소화되게 하는 벡터 구조 및/또는 운반 방법이 채택된다. 현재 바람직한 β-아드레날린작용성 신호화 단백질은 아데닐일시클라제(“AC”)(바람직하게는 AC_II, AC_V또는 AC_VI와 같은 심장 AC, 보다 바람직하게는 AC_VI), β-아드레날린작용성 리셉터(β₁-아드레날린작용성 리셉터 또는 β₂-아드레날린작용성 리셉터, 바람직하게는 β₁-아드레날린작용성 리셉터), 및 G-단백질 리셉터 키나제 기능의 저해제(“GRK 저해제”)를 포함한다. 그러한 바람직한 β-ASP의 예는 하기에서 기재하고 예시한다.

본 발명에서 사용하는데 바람직한 벡터는 바이러스 벡터, 지질 기제 벡터 및 생체내에서 비분할 세포로 DNA를 운반할 수 있는 다른 벡터를 포함한다. 현재 바람직한 것은 바이러스 벡터, 특히 복제결손 바이러스 벡터(예를 들면, 복제결손 아데노바이러스 벡터 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터 포함)이다. 본 발명에서 용이하게 생성 및 사용하기 위해, 복제결손 아데노바이러스 벡터가 현재 가장 바람직하다.

현재 바람직한 생체내에서의 운반 방법(특히 심근으로 제한되는 운반 및/또는 발현에 대해 다르게 표적화되지 않은 벡터 구조에 대해)은 심근에 바로 공급하는 혈관으로의 벡터 주사, 바람직하게는 관상동맥으로의 주사에 의해서이다. 그러한 주사는 하나 또는 두 개의 관상동맥 또는 하나이상의 복재정맥 또는 내유동맥 그래프트 또는 심근으로 혈액을 운반하는 다른 도관의 소공내에서 실질적으로 도입된 카테테르(전형적으로 적어도 약 1cm)에 의해 바람직하게는 수행된다.

야생형이 아닌 바이러스를 함유하는 벡터 스톡을 바람직하게는 하나 또는 두 개의 관상동맥의 루멘(또는 그래프트 및 다른 혈관)으로, 바람직하게는 좌우 관상동맥(또는 그래프트 및 다른 혈관) 둘 다로, 및 바람직하게는 광학 농도계로 측정한 10⁷-10¹³개의 바이러스 입자량(보다 바람직하게는 10⁹-10¹¹개의 바이러스 입자)으로 주사함으로써, 원하는 수의 세포, 특히 심장 근세포를 침범된 심근에서의 β-아드레날린작용성 신호 형질도입을 증가시키는 단백질을 코딩하는 유전자로 국소적으로 트랜스펙션하여, 이로써 유전자 전달의 치료적 효율을 최대로 하고, 심장외 부위에서의 원하지 않는 효과 및 바이러스 단백질에 대한 염증반응의 가능성을 최소로 하는 것이 가능하다. 심근 특이적 결합 또는 흡수 성분을 포함하고 또는 심근 특이적 전사 조절 서열의 제어하에 있는 β-아드레날린작용성 신호화 트랜스유전자(예를 들면, 심실 근세포 특이적 프로모터)를 포함하는 벡터와 같은, 심근을 특정하게 표적화하는 벡터 구조는 심근, 특히 심실 근세포에 대한 발현을 더 제한하는 방법으로서 그러한 지향된 주사기술 대신에 또는 바람직하게는 그 외에 사용될 수 있다. 면역 반응을 도출해낼 수 있는 벡터에 대해, 심장외 발현에 대해 잠재적으로 제한하는 추가의 기술이 채택될 수 있지만, 상기한 심근에 공급하는 혈관으로 직접 벡터를 주사하는 것이 바람직하다.

하기에서 상세하게 기재하는 바와 같이, 본 발명자는 β-아드레날린작용성 신호화 요소 트랜스유전자를 갖는 벡터에 의한 그러한 기술의 사용으로, 비심장 조직에서 관찰된 모든 효과가 없고 모든 실질적 면역 반응을 발생하지 않는 내생의 β-아드레날린작용성 반응성 및 큰 포유동물 심장의 심근내의 기능을 효과적으로 증강시킬 수 있다는 것을 알았다.

다른 양태에서, 본 발명은 재조합형 아데노바이러스 벡터, 바람직하게는 10⁷-10¹⁴개의 바이러스 입자의 최종 바이러스 역가로 이루어지는 여과된 주사가능한 아데노바이러스 벡터 제제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 제공하고, 상기 벡터는 야생형이 아닌 바이러스를 함유하고 복제 수용능을 부여하는 하나이상의 요구되는 아데노바이러스 유전자, 예를 들면 E1A/E1B 유전자가 결실된 부분 아데노바이러스 서열, 및 이 부분 아데노바이러스 서열에 의해 접해 있는 프로모터에 의해 구동되는, AC_VI, AC_V, 다른 아데닐일시클라제, β₁-아드레날린작용성 리셉터, β₂-아드레날린작용성 리셉터 또는 G-단백질 리셉터 키나제 기능의 저해제와 같은 β-아드레날린작용성 신호화 요소에 대해 코딩하는 트랜스유전자로 이루어진다.

다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 심근에서 생체내에서 β-아드레날린작용성 신호화 요소의 발현에 영향을 미칠 수 있는 재조합형 바이러스 스톡의 생성방법을 제공하고, 이 방법은 β-아드레날린작용성 신호화 요소(AC_VI, AC_V, 다른 아데닐일시클라제, β₁-아드레날린작용성 리셉터, β₂-아드레날린작용성 리셉터 또는 G-단백질 리셉터 키나제 기능의 저해제)에 대해 코딩하는 트랜스유전자를, 사람 아데노바이러스 5 게놈의 E1A/E1B 유전자와 같은 복제 수용능을 요구하는 하나이상의 아데노바이러스 유전자(일반적으로 바이러스 복제 또는 “rep”유전자로 언급됨)가 결실된 아데노바이러스 게놈의 부분 아데노바이러스 서열에 의해 접해 있는 폴리링커 및 프로모터를 함유하는 플라스미드로 클로닝하는 단계; 상기 플라스미드는, 플라스미드가 너무 커서 포막될 수 없게 하는 추가의 삽입물 및 완전한 아데노바이러스 게놈을 함유하는 플라스미드와 함께 결손 복제유전자로 형질전환된 포유동물 세포로 공동 트랜스펙션하는 단계로서, 이로써 레스큐 재조합이 트랜스유전자 삽입된 플라스미드와 전체 아데노바이러스 게놈을 갖는 플라스미드 사이에서 일어나서 결실된 바이러스 복제 유전자가 없는 트랜스유전자를 함유하는, 포막되기에 충분히 작은 재조합형 게놈을 생성하는 단계; 성공한 재조합체를 세포 배양물에서 동정하는 단계; 얻어진 재조합체를 바이러스 복제유전자를 포함하는 또는 이것으로 형질전환된 포유동물 세포에서 증식하는 단계; 및 야생형 바이러스가 없는 재조합형 벡터를 함유하도록 증식된 재조합체를 정제하는 단계로서, 바람직하게는 정제된 벡터를 필터, 바람직하게는 0.1-0.5마이크론 필터, 보다 바람직하게는 0.3 마이크론 필터를 통과시켜 정제여과된 재조합형 바이러스 스톡을 얻는 단계로 이루어진다.

본 발명의 이러한 양태 및 다른 바람직한 양태는 하기에서 기재되고 예시된다.

β-아드레날린작용성 신호화 요소를 코딩하는 트랜스유전자

본 발명은 β-아드레날린작용성 신호화를 증가시키는 단백질 또는 펩티드 요소를 코딩하는 유전자를 채택하여 포유동물 심장의 기능장애성 영역내에서 내생의 β-아드레날린작용성 자극에 대한 반응성을 증강시킬 수 있다. 그러한 단백질은 본문에서 “β-아드레날린작용성 신호화 단백질”(또는 “β-ASP”)로 언급된다. 용어 β-ASP는 포유동물 조직에서 발현되었을 때, 바람직하게는 (본 발명의 목적을 위해) 포유동물 심근조직에서 발현되었을 때 β-아드레날린작용성 신호화를 증강시킬 수 있는 단백질로 언급된다.

β-아드레날린작용성 신호화 단백질은 바람직하게는 포유동물 심근세포에서 β-아드레날린작용성 신호화를 매개 또는 형질도입하는 β-아드레날린작용성 신호 트랜스듀서 단백질 뿐만 아니라, 그러한 트랜스듀서 단백질을 자극할 수 있거나 그러한 트랜스듀서 단백질의 저해제를 불활성화 또는 이를 길항(이로써 신호 형질도입을 간접적으로 증강)할 수 있는 단백질을 포함한다. 포유동물 심장조직에서 β-아드레날린작용성 신호화와 관련되는 각종 그러한 단백질이 동정되고(예를 들면, 상기 인용된 β-아드레날린작용성 반응성과 관련한 다양한 참고문헌 참조) 본문에서 예시된다.

본 발명에서 사용하는데 바람직한 β-ASP는 인용된 기술분야에서 그리고 본문에서 보다 상세하게 기재된 바와 같이, β-아드레날린작용성 리셉터(“βAR”), G_s단백질 트랜스듀서 및 아데닐일시클라제(“AC”) 이펙터로 이루어지는, “βAR-Gs-AC” 경로와 관련된 다양한 단백질과 같은 포유동물 심장조직에서 β-아드레날린작용성 신호 형질도입에 역할이 있는 것으로 공지되어 있는 것이다. 최근의 데이터는 G_s단백질이 βAR 또는 AC 보다 훨씬 높은 몰 농도에서 일반적으로 존재한다는 것을 입증하였다. 후자의 두 단백질(βAR 및 AC) 뿐만 아니라 G-단백질 리셉터 키나제의 저해제(βAR 활성에 영향을 끼침)가 본 발명에서 사용하는데 보다 바람직한 β-아드레날린작용성 신호화 성분이다.

심근 조직에서의 β-아드레날린작용성 신호화는 βAR에의 아고니스트 결합에 의해 초기 매개되고 나서 Gs-매개된 신호를 AC로 형질도입한다. 다음에 활성화된 AC는 환상 AMP의 합성을 촉매하고 cAMP의 증가된 세포내 농도는 심박동수 및 심장 수축력(각각 양성 “심박수변동성” 및 양성 “수축력변동성”으로 언급) 둘다를 증강시키는 증가된 세포질 칼슘 통과성을 매개한다.

따라서 본 발명에서 사용하는데 특히 바람직한 β-ASP의 예로는 β-아드레날린작용성 리셉터(β₁-아드레날린작용성 리셉터 또는 β₂-아드레날린작용성 리셉터, 바람직하게는 β₁-아드레날린작용성 리셉터), 아데닐일시클라제(바람직하게는 AC_V또는 AC_VI와 같은 심장 AC, 보다 바람직하게는 AC_VI) 뿐만 아니라 G-단백질 리셉터 키나제 기능의 저해제(일반적으로 본문에서“GRK” 저해제로 언급됨)를 들 수 있다.

β-아드레날린작용성 리셉터(“β-AR” 또는 “βAR”로 약기함)는 βAR-Gs-AC 경로를 통한 β-아드레날린작용성 신호화에 관련된 세포 표면 리셉터이다. 포유동물 심장의 심근에서, βAR은 노르에피네프린(전신성 신경전달물질) 및 에피네프린(부신 호르몬)에 대한 주 리셉터이다. 사람 심근은 β₁-아드레날린작용성 리셉터 및 β₂-아드레날린작용성 리셉터 둘다를 함유하나, β₁-A이 우세하고 심부전으로 관찰되는 변경된 β-아드레날린작용성 신호화와 매우 밀접하게 관련된다.

G_s단백질은 본 분야에서 그리고 본문에서 기재되는 바와 같이, 다양한 세포표면 리셉터(β-아드레날린작용성 리셉터 포함)의 활성화를 아데닐일시클라제의 활성화에 효과적으로 커플링시키는 GTP 결합 조절 단백질이다.

아데닐일시클라제(또한 “아데닐일시클라제”로 언급되고 “AC”로 약기함)는 아데노신 트리포스페이트(ATP)의 3':5'-환상 아데노신 모노포스페이트(cAMP)로의 전환을 촉매하는 효소이다. 아데닐일시클라제는 대부분의 모든 포유동물 조직에서 다양한 수준으로 발견되는 많은 상이한 이소형태로 존재하는 것이 공지되어 있다. 본 발명의 가장 바람직한 아데닐일시클라제는, 하기에서 보다 상세하게 기재하는 바와 같이, 포유동물 심장조직, 특히 심장 근세포에서 우세하다고 발견된 이소형태인 “심장 아데닐일시클라제”이다.

G-단백질 리셉터 키나제(“GRK”로 약기하나 본 분야에서 “β-아드레날린작용성 리셉터 키나제” 또는 “βARK”로 언급됨)는 β-아드레날린작용성 리셉터(“βAR”)를 포함하는 G-단백질 커플링된 리셉터 단백질의 포스포릴화를 촉매하는 키나제 단백질이다. GRK 단백질에 의한 βAR의 포스포릴화는 리셉터를 불활성화시키고 동시에 β-아드레날린작용성 신호화에 대한 반응성을 감소시킨다.

본문에서 사용된 바와 같이 GRK 저해제는 G-단백질 리셉터 키나제 기능의 펩티드 저해제로 언급된다. GRK의 펩티드 저해제는 변형된 GRK 단백질이고 리셉터 결합활성은 키나제 활성으로부터 비커플링되었다. GRK 저해제의 예로는 βAR과 같은 G-단백질 커플링된 리셉터 단백질에 결합하는 능력을 보유하면서 키나제 기능을 제거하기 위해 절단된(전형적으로 아미노 말단에서 시작하는 결실에 의함) 변형된 GRK를 들 수 있다. 따라서 그러한 절단된 GRK 단백질은 정상적인 GRK가 βAR에 결합하는 것을 효과적으로 길항 또는 방지할 수 있으나 리셉터 활성의 후속 저해를 일으키지 못한다.

βAR, AC 이소형태 및 GRK 단백질의 저해제를 코딩하는 바람직한 유전자를 포함하는 그러한 β-아드레날린작용성 신호화 단백질을 코딩하는 유전자가 본 분야에서 공지되어 있고 일반적으로 이용가능하다(예를 들면, β-아드레날린작용성 신호화 성분에 관해 상기 인용된 참고문헌 참조). 또한, 이들 성분이 비교적 높게 보존되는 경향이 있기 때문에 공지된 유전자의 새로운 호몰로그(또는 이소형태)는 일반적으로 본 분야에서 현재 잘 공지되어 있는 기술(예를 들면, 본문에서 인용된 분자생물학 참고문헌 참조)을 사용하여 관심있는 게놈 라이브러리(예를 들면, 조직-특이적 cDNA 라이브러리) 또는 cDNA를 스크리닝함으로써 용이하게 얻어질 수 있다.

본 발명 방법의 유용성을 먼저 입증하기 위해, 본 발명자는 β-아드레날린작용성 신호화 단백질의 예시적인 실시예로서 아데닐일시클라제 단백질을 코딩하는 트랜스유전자의 운반 및 발현을 시험하였다.

본 발명의 가장 바람직한 아데닐일시클라제는 포유동물 심장조직, 특히 심장 근세포에서 우세하다고 발견된 이소형태인 “심장 아데닐일시클라제”이다. 현재 바람직한 심장 AC로는 AC 이소형태 V(“AC_V”로 약기) 및 AC 이소형태 VI(“AC_VI”로 약기)를 들 수 있고, AC_VI가 본문에서 기재된 이유로 현재 가장 바람직하다. 다양한 AC 이소형태는 DNA 및 단백질 서열면에서 뚜렷하고 전형적으로 조직 특이적 방식으로 발현되지만, 일정한 이소형태는 서로 밀접한 호몰로그이고 포유동물 이소형태는 일반적으로 큰 세포질 루프와 관련되는 막을 통해서 걸쳐 있는 영역으로 이루어지는 통상의 지형적 특징을 갖는다. 또한, 세포질 루프의 아미노산 조성물은 이소형태 중에서 보존되는 경향이 있다. 전형적으로, 본 분야에서 기재된 바와 같이, 효소를 코딩하는 폴리누클레오티드는 중합효소연쇄반응(PCR) 방법을 사용하여 얻을 수 있지만, 그러한 아데닐일시클라제를 코딩하는 클로닝된 DNA는 이미 플라스미드로 이용가능하다(예를 들면, PCR:A Practical Approach(M. McPherson et al., IRL Press at Oxford University Press 1991) 참조). 주어진 세포유형에서 효과적인 새로운 아데닐일시클라제를 동정하고 특성화하기 위한 분석법을 포함하여 아데닐일시클라제의 검출, 정제, 및 특성화가 많은 공보에 기재되었다(예를 들면, AC 이소형태와 관련하여 이시카와 등 및 크루핀스키 등의 본문에서 인용된 참고문헌 참조).

하기에서 보다 상세하게 기재하고 예시하는 바와 같이, 본 발명자는 AC를 코딩하는 벡터(예로서 β-ASP)를, 사람의 심장기능의 전조가 된다고 결정된 큰 동물 모델의 심근으로 운반하기 위한 유전자 치료기술을 성공적으로 채택하였다. 또한 본 발명자는 β-ASP의 유전자 운반이 시험한 동물에서 심장기능을 증강시킨다는 것을 알았고, 본 발명 방법은 울혈성 심부전 치료를 하기 위한 효과적인 대안을 제공할 수 있는 것으로 보인다.

생체내에서 유전자 운반을 위한 벡터

일반적으로, 관심있는 유전자는 생체내에서 심장 근세포를 포함하여 심장으로 트랜스펙션되고 코딩된 단백질의 생성을 지향한다. 바람직하게는 그러한 생성은 비교적 본질적이다. 바이러스 뿐만 아니라 비바이러스 시스템을 포함하는 각종 상이한 유전자 전달 벡터는 본 발명에서 사용하기 위한 트랜스유전자를 운반하기 위해 채택할 수 있다(상기 인용된 참고문헌 참조). 하기에서 예시되는 바와 같이, 본 발명자는 헬퍼-비의존 복제결손 사람 아데노바이러스 5 시스템이 단일의 관상내 주사에 의해 생체내에서 큰 백분율의 심근세포를 효과적으로 트랜스펙션하는데 사용될 수 있다는 것을 알았다. 또한 본 발명자는 그러한 운반 기술이 큰 포유동물 심장의 심근으로 벡터를 효과적으로 표적화하는데 사용할 수 있다는 것도 알았다. 벡터를 특정 세포 또는 조직 유형으로 표적화하는 다른 방법은 본 분야에서 그리고 하기에서 기재한다.

하기에서 기재하는 다양한 예시에서, 본 발명자는 아데노바이러스 게놈(통상 E1A/E1B)으로부터 본질적 초기 유전자를 결손하여 트랜스 상태에서 결손 유전자 생성물을 제공하는 허용되는 세포주에서 성장하지 않는 한 복제될 수 없는 사람 아데노바이러스 5에 의거한 재조합형 아데노바이러스 벡터를 사용하였다(McGory WJ, et al., Virology 163:614-617, 1988에 기재됨). 결손 아데노바이러스 게놈 서열대신에, 관심있는 트랜스유전자를 복제결손 아데노바이러스로 감염된 조직/세포에서 클로닝하고 발현할 수 있다. 아데노바이러스 기제 유전자 전달은 일반적으로 트랜스유전자를 숙주게놈으로 안정하게 통합시키지 않지만(0.1아데노바이러스 매개된 트랜스펙션은 숙주 DNA로 트랜스유전자를 포함시킨다), 아데노바이러스 벡터는 고 역가에서 증식할 수 있고 비복제 세포를 트랜스펙션하고; 트랜스유전자가 딸세포를 통과하지 않지만, 이것은 적극적으로 분할되지 않는 성장한 심장 근세포로 유전자를 전달하는데 적당하다. 레트로바이러스 벡터는 안정한 유전자 전달을 제공하고, 고 역가는 레트로바이러스 의사형을 통해 현재 얻을 수 있으나(Burns, et al., Proc Natl Acad Sci (USA) 90:8033-8037, 1993), 현재의 레트로바이러스 벡터는 일반적으로 유효하게 비복제 세포를 형질도입할 수 없다.

근세포와 같은 비분할 세포와 관련되는 이점은 바이러스 벡터가 용이하게 숙주세포 분할에 의해 “분할”되지 않는다는 것이다. 그러나, 심장에서 트랜스유전자 발현의 경과를 더 증강시키기 위해, E1 및 E4 결실 둘다를 갖는 다양한 제 2 세대 아데노바이러스 벡터를 채택하는 것이 가능하며, 이것은 시클로포스파미드 투여와 관련되어 사용될 수 있다(예를 들면, Dai et al., Proc. Nat'l Acad Sci. (USA) 92:1401-1405, 1995 참조). 초기 유전자 전달 정도를 더 증가시키기 위해, 복수 주입 또는 분리된 관상 회로에서의 주입이 또한 채택될 수 있다.

아데노바이러스 E1A/E1B 유전자로 형질전환된 사람 미발달 신장세포인 사람 293세포는 그러한 복제결손 벡터의 생성에 유용한 허용되는 세포주를 대표한다. 그러나, 복제결손 아데노바이러스 벡터를 증식시키는 다른 세포주, 즉 HeLa 세포가 사용될 수 있다.

다양한 다른 유전자 운반 벡터를 기재하고 있는 참고문헌은 본 분야에서 공지되어 있고, 그중 일부는 본문에 인용되어 있다. 그러한 다른 벡터로는, 예를 들면 다른 바이러스 벡터(아데노 관련 바이러스(AAV) 등), 리포좀 및 다른 지질 함유 착체, 및 폴리누클레오티드의 숙주세포로의 운반을 매개할 수 있는 다른 거대분자 착체를 들 수 있다. 인용문헌에서 그리고 상기에서 기재한 바와 같이, 벡터는 유전자 운반 및/또는 유전자 발현을 더 조절하고, 또는 표적화된 세포에 이로운 성질을 제공하는 다른 성분 또는 기능성을 포함할 수 있다. 그러한 다른 성분으로는, 예를 들면 세포에의 결합 또는 표적화에 영향을 미치는 성분(세포 유형 또는 조직 특이적 결합을 매개하는 성분 포함); 세포에 의해 벡터 핵산의 흡수에 영향을 미치는 성분; 흡수후 세포내에서 폴리누클레오티드의 국소화에 영향을 미치는 성분(핵 국소화를 매개하는 작용제 등); 및 폴리누클레오티드의 발현에 영향을 미치는 성분을 들 수 있다. 또한 그러한 성분은 흡수된 세포에 대해 검출 또는 선택하는데 사용될 수 있고 벡터에 의해 운반된 핵산을 발현하는 검출가능한 및/또는 선택가능한 마커와 같은 마커를 들 수 있다. 그러한 성분은 벡터의 자연특징으로서 제공될 수 있고(결합 및 흡수를 매개하는 성분 또는 기능성을 갖는 일정한 바이러스 벡터의 사용 등), 또는 벡터는 그러한 기능성을 제공하기 위해 변형될 수 있다. 선택가능한 마커는 양성, 음성 또는 두 기능일 수 있다. 양성의 선택가능한 마커는 마커를 갖는 세포를 선택하게 하고, 반면에 음성의 선택가능한 마커는 마커를 갖는 세포를 선택적으로 제거되게 한다. 다양한 그러한 마커 유전자는 두 기능(즉, 양성/음성)의 마커를 포함하여 기재되었다(예를 들면, Lupton, S., WO 92/08796, 1992년 5월 29일 공개; 및 Lupton, S., WO 94/28143, 1994년 12월 8일 공개). 그러한 마커 유전자는 유전자 치료 문맥에서 유리할 수 있는 첨가된 콘트롤 측정을 제공할 수 있다. 매우 다양한 그러한 벡터는 본 분야에서 공지되어 있고 일반적으로 이용가능하다(예를 들면, 상기에서 인용된 다양한 참고문헌 참조).

본 발명 방법에 사용될 수 있는 아데노바이러스 벡터 및 다른 바이러스 벡터를 기재하고 있는 다른 참고문헌으로는 다음을 들 수 있다: Horwitz, M.S., Adenoviridae and Their Replication, in Fields, B., et al.(eds.) Virology, Vol. 2, Raven Press New York, pp. 1679-1721, 1990); Graham, F., et al., pp. 109-128 in Methods in Molecular Biology, Vol. 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray, E.(ed.), Humana Press, Clifton, N.J.(1991); Miller, N., et al., FASEB Journal 9:190-199, 1995; Schreier, H, Pharmaceutica Acta Helvetiae 68:145-159, 1994; Schneider and French, Circulation 88:1937-1942, 1993; Curiel D.T., et al., Human Gene Therapy 3:147-154, 1992; Graham, F.L., et al., WO 95/00655(1995.1.5); Falck-Pedersen, E.S., WO 95/16772(1995.6.22); Denefle, P. et al., WO 95/23867(1995.9.8); Haddada, H. et al., WO 94/26914(1994.11.24); Perricaudet, M. et al., WO 95/02697(1995.1.26); Zhang, W., et al., WO 95/25071(1995.10.12). 다양한 아데노바이러스 플라스미드는, 예를 들면 온타리오의 터론토에 있는 마이크로빅스 바이오시스템(예를 들면, Microbix Product Information Sheet: Plasmids for Adenovirus Vector Construction, 1996 참조)을 포함하여 시중 공급처로부터 구입가능하다.

본 발명 방법에 사용될 수 있는 AAV 벡터를 기재하고 있는 다른 참고문헌으로는 다음을 들 수 있다: Carter, B., Handbook of Parvoviruses, vol. I, pp. 169-228, 1990; Berns, Virology, pp. 1743-1764(Raven Press 1990); Carter, B., Curr. Opin. Biotechnol., 3:533-539, 1992; Muzyczka, N., Current Topics in Microbiology and Immunology, 158:92-129, 1992; Flotte, T.R., et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 7:349-356, 1992; Chatterjee et al., Ann. NY Acad. Sci., 770:79-90, 1995; Flotte, T.R., et al., WO 95/13365(1995.5.18); Trempe, J.P., et al., WO 95/13392(1995.5.18); Kotin, R., Human Gene Therapy, 5:793-801, 1994; Flotte, T.R., et al., Gene Therapy 2:357-362, 1995; Allen, J.M., WO 96/17947(1996.6.13); and Du et al., Gene Therapy 3:254-261, 1996.

본 발명 방법에 사용될 수 있는 비바이러스 벡터를 기재하고 있는 다른 참고문헌으로는 다음을 들 수 있다: Ledley, FD, Human Gene Therapy 6:1129-1144, 1995; Miller, N., et al., FASEB Journal 9:190-199, 1995; Chonn, A., et al., Curr. Opin. in Biotech. 6:698-708, 1995; Schofield, JP, et al., British Med. Bull. 51:56-71, 1995; Brigham, K.L., et al., J.Liposome Res. 3:31-49, 1993; Brigham, K.L., WO 91/06309(1991.5.16); Felgner, P.L., et al., WO 91/17424(1991.11.14); Solodin et al., Biochemistry 34:13537-13544, 1995; WO 93/19768(1993.10.14); Debs et al., WO 93/25673; Felgner, P.L., et al., 미국특허 제5,264,618호(1993.11.23); Epand, R.M., et al., 미국특허 제5,283,185호(1994.2.1); Gebeyehu et al., 미국특허 제5,334,761호(1994.8.2); Felgner, P.L., et al., 미국특허 제5,459,127호(1995.10.17); Overell, R.W., et al., WO 95/28494(1995.10.26); Jessee, WO 95/02698(1995.1.26); Haces and Ciccarone, WO 95/17373(1995.6.29); Lin et al., WO 96/01840(1996.1.25).

재조합형 바이러스 벡터의 구조

심근으로의 β-아드레날린작용성 신호화 단백질의 벡터 매개된 유전자 운반을 예시하기 위해, 본 발명자는 McGrory WJ, et al., Virology 163:614-617, 1988에 기재된 레스큐 재조합 기술에 의해 구성될 수 있는 기본(즉, “제 1 세대”) 아데노바이러스 벡터를 선택한다. 요약하면, 관심있는 트랜스유전자는 프로모터, 폴리링커 및 E1A/E1B 유전자가 결실된 일부 접해 있는 아데노바이러스 서열을 함유하는 셔틀 벡터로 클로닝된다.

셔틀 벡터의 예로는, 예를 들면 사람 아데노바이러스 5 게놈 좌단의 단백질을 코딩하나 바이러스 복제에 본질적인 E1A 및 E1B 서열로 이루어지는 초기 단백질 영역이 결핍된 플라스미드 “pAC1”(Virology 163:614-617, 1988)(또는 유사체); 및 폴리링커, CMV 프로모터 및 E1A/E1B 유전자가 결실된 부분 아데노바이러스 서열에 의해 접해 있는 SV40 폴리아데닐화 신호를 함유하는 플라스미드 “ACCMVPLPA”(J Biol Chem 267:25129-25134, 1992)를 들 수 있다. pAC1 또는 ACCMVPLA와 같은 플라스미드의 사용은 클로닝 공정을 촉진시킬 수 있다.

다음에 셔틀 벡터는 전체 사람 아데노바이러스 5 게놈(너무 커서 포막될 수 없는 길이)으로 이루어지는 플라스미드와 함께 사람 293 세포와 같은 적당한 숙주 세포로 공동 트랜스펙션될 수 있다. 공동 트랜스펙션은 칼슘포스페이트 침전 또는 리포펙션에 의해 수행될 수 있다(예를 들면, Biotechniques 15:868-872, 1993).

공동 트랜스펙션을 위한 플라스미드의 예로서, 플라스미드 “JM17”은 전체 사람 아데노바이러스 5 게놈 플러스 암피실린 내성을 위한 유전자를 포함하는 벡터 pBR322의 부분(4.3kb)을 코딩한다(Giordano, et al. Nature Medicine 2:534-539, 1996). JM17은 성숙한 바이러스 입자를 제조하는데 필요한 모든 아데노바이러스 단백질을 코딩하지만, 너무 커서 포막될 수 없다(야생형 36kb에 대해 40kb).

공동 트랜스펙션된 세포의 작은 서브셋에서, “레스큐 재조합”은 결실된 E1A/E1B 서열 대신에 관심있는 트랜스유전자를 함유하는 재조합형 게놈을 생성하는 전체 아데노바이러스 5 게놈을 갖는 플라스미드(플라스미드 pJM17)와 트랜스유전자 함유 셔틀 벡터(플라스미드 pAC1) 사이에서 일어나고, 재조합동안에 추가의 서열(pBR322 서열)이 두 번째로 감소되고, 이로써 포막되기에 충분할 정도로 작아진다(예를 들면, Giordano, et al. Nature Medicine 2:534-539, 1996). 그러한 벡터의 예는 도 1에 제시된다. 아데노바이러스 HCMVSP1lacZ에서 CMV 운전된 β-갈락토시다제 유전자(Nature Medicine 2:534-539, 1996)는 X-gal 처리를 사용하여 유전자 전달 효율을 평가하는데 사용될 수 있다.

그러한 벡터의 제조 및 사용을 나타내는 예가 하기된다. 아데노바이러스 벡터를 사용하는 이점은 고 효율의 유전자 전달을 수행하는 능력(생체내에서 트랜스펙션된 표적기관세포의 50만큼)을 포함하고, 분할되지 않는 심장 근세포와 같은 세포로 유전자 전달을 수행하는 이들 벡터의 능력 및 고 역가 바이러스 스톡을 얻기가 용이해진다.

생체내에서 유전자 치료에 적당한 다양한 다른 벡터는 본 발명에 따라 β-ASP 트랜스유전자를 갖는데 용이하게 채택될 수 있다. 그러한 다른 벡터는 예시로서 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터와 같은 다른 바이러스 벡터; 비바이러스 단백질 기제 운반 플랫폼; 뿐만 아니라 지질 기제 벡터(예를 들면, 양이온성 리포좀 및 유사한 유전자 운반 착체 포함)를 들 수 있다. 이러한 벡터의 제조 및 사용은 본 기술분야에서 기재되어 있다(예를 들면, 상기에서 인용된 유전자 운반 벡터에 관한 참고문헌 참조).

표적화된 β-ASP 벡터 구조

본 발명은 트랜스유전자의 관상동맥으로의 운반 뿐만 아니라 특정 숙주세포 또는 숙주세포 유형(심근 등)으로 유전자 운반 및/또는 유전자 발현을 표적화하는 경향이 있는 특징을 갖는 표적화된 벡터 구조의 사용을 표적화하는 세포의 사용이 기대된다. 그러한 표적화된 벡터 구조는 공개된 기술에서 그리고 하기에서 보다 상세하게 기재되는 바와 같이, 표적화된 운반 벡터 및/또는 표적화된 벡터를 포함하였다. 운반 및/또는 발현을 제한하는 것은 유전자 치료의 잠재효과에 더 집중하는 방법으로서 이로울 수 있다. 운반/발현을 더 제한하는 잠재적 유용성은 대부분 사용되는 벡터 유형 및 그러한 벡터의 도입 방법 및 위치에 의존한다. 본문에서 기재하는 바와 같이, 관상내 주사를 통한 바이러스 벡터의 심근으로의 운반은 본래 매우 표적화된 유전자 운반을 제공하는 것이 관찰되었다(하기 실시예 참조). 또한, 숙주세포의 레플리콘으로 트랜스유전자를 통합시키지 않는 벡터(아데노바이러스 및 많은 다른 벡터 등)를 사용하여, 심장 근세포는 세포가 신속한 턴오버를 진행시키기 않기 때문에 비교적 장기의 트랜스유전자 발현을 나타내는 것이 기대된다. 반대로, 보다 신속하게 세포를 분할하는 발현은 세포 분할 및 턴오버에 의해 감소되는 경향이 있다. 그러나, 운반 및/또는 발현을 제한하는 다른 방법은 본문에 기재된 바와 같이, 예시된 운반방법 대신에 또는 그 이외에 사용될 수 있다.

표적화된 운반 벡터는, 예를 들면 특정 숙주세포 또는 숙주세포 유형으로 유전자 운반 및/또는 우선적인 결합을 매개하는 다른 특징 또는 표면 성분(리간드-리셉터 쌍의 일원, 다른 반은 표적화되는 숙주세포에서 발견됨)을 갖는 벡터(바이러스, 비바이러스 단백질 기제 벡터 및 지질 기제 벡터)를 포함한다. 본 기술분야에서 공지되어 있는 바와 같이, 바이러스 및 비바이러스 둘다 기원인 많은 벡터는 그러한 우선적인 결합을 촉진하는 본래의 성질을 갖거나 우선적인 표적화를 수행하기 위해 변형되었다(예를 들면, Miller., et al., FASEB Journal 9:190-199, 1995; Chonn, A., et al., Curr. Opin. in Biotech. 6:698-708, 1995; Schofield, JP, et al., British Med. Bull. 51:56-71, 1995; Schreier, H, Pharmaceutica Acta Helvetiae 68:145-159, 1994; Ledley, FD, Human Gene Therapy 6:1129-1144, 1995; Conary, J.T., et al., WO 95/34647(1995.12.21); Overell, R.W., et al., WO 95/28494(1995.10.26); and Truong, V.L. et al., WO 96/00295(1996.1.4) 참조).

표적화된 벡터는 운반이 특정 숙주세포 또는 숙주세포 유형으로 비교적 제한되는 트랜스유전자 발현이 되게 하는 벡터(바이러스, 비바이러스 단백질 기제 벡터 및 지질 기제 벡터 등)를 포함한다. 예시로서, 본 발명에 따라 운반될 β-ASP 트랜스유전자는 이종 조직 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결되어 특정 조직에서 세포로의 발현을 제한할 수 있다.

예를 들면, 좌심실 미오신 경쇄-2(MLC_2V) 또는 미오신 중연쇄(MHC)를 코딩하는 유전자에서 유래된 조직 특이적 전사 콘트롤 서열은 상기한 아데노바이러스 구조와 같은 벡터내에서 β-ASP 트랜스유전자(AV_VI유전자 등)로 축합될 수 있다. 따라서 트랜스유전자의 발현은 심실 심장 근세포로 비교적 제한될 수 있다. lacZ를 갖는 MLC_2V및 MHC 프로모터에 의해 제공된 특이성 정도 및 유전자 발현 효율을 측정하고(본문에서 예시된 바와 같은 재조합형 아데노바이러스 시스템을 사용), 심장 특이적 발현이 보고되었다(예를 들면, Lee, et al., J Biol Chem 267: 15875-15885,1992).

MLC_2V프로모터는 단지 약 250bp로 이루어져 있기 때문에, 본문에서 예시된 아데노바이러스-5 패키징 시스템과 같은 크기 제한된 운반 벡터내에서 용이하게 고정될 것이다. 전사의 격렬한 프로모터로 공지된 미오신 중연쇄 프로모터는 다른 대안의 심장 특이적 프로모터를 제공하며 300bp미만으로 이루어져 있다. 매우 효율있고 충분히 작은 트로포닌-C 프로모터와 같은 다른 프로모터는 그러한 조직 특이성을 제공하지 않는다.

바이러스 벡터의 증식 및 정제

아데노바이러스 벡터와 같은 재조합형 바이러스 벡터는 표준 방법에 따라 정제된 플라크일 수 있다. 예시로서, 재조합형 아데노바이러스 바이러스 벡터는 약 10¹⁰-10¹²개의 바이러스 입자/ml의 바람직한 범위의 역가로 사람 293 세포(트랜스 상태에서 E1A 및 E1B 기능을 제공)에서 증식될 수 있다.

증식 및 정제 기술은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 각종 바이러스 벡터에 대해 기재되었다. 아데노바이러스 벡터가 본문에서 예시되나 AAV와 같은 다른 바이러스 벡터도 채택될 수 있다. 아데노바이러스에 대해, 세포는 약 80수용능에서 혼입되어 48시간 후에 수확될 수 있다. 3회의 동결-해동 사이클 후에 세포 이물질을 원심분리로 수집하고 바이러스를 CsCl 구배 초원심분리(이중의 CsCl 구배 초원심분리가 바람직하다)로 정제할 수 있다.

생체내에서 주사하기 전에, 바이러스 스톡을 G25 Sephadex와 같은 세파로스 칼럼을 통해 겔 여과로 탈염시킬 수 있다. 다음에 생성물을 30마이크론 필터를 통해 여과하고, 이로써 비여과된 바이러스의 관상내 주사와 관련된 유독 효과에 대한 잠재성을 감소시킬 수 있다. 얻어진 바이러스 스톡은 바람직하게는 적어도 약 10¹⁰-10¹²개의 바이러스 입자/ml인 최종 바이러스 역가를 갖는다.

바람직하게는, 재조합형 아데노바이러스에는 매우 정제되고 실질적인 야생형(잠재적으로 복제) 바이러스가 없다. 이들 이유로, 증식 및 정제는, 예를 들면 적절한 프라이머를 사용하는 PCR로 성공한 재조합체를 동정하고, 2회의 플라크 정제 및 이중의 CsCl 구배 초원심분리를 수행함으로써 야생형 바이러스 및 오염균을 배제하도록 수행할 수 있다. 따라서, 본 발명자는 환자에게 아데노바이러스 벡터 주사로 유발될 수 있는 심장부정맥과 관련된 문제가 관상내 주사 전에 적절하게 크기조절된 필터를 통해 재조합형 아데노바이러스의 여과로 본질적으로 피할 수 있다는 것을 발견하였다. 또한 이 전략은 실질적으로 유전자 전달 및 발현을 개선하는 것으로 보인다.

하나이상의 β-ASP 트랜스유전자를 갖는 벡터의 운반

β-ASP 트랜스유전자를 갖는 벡터를 운반하는데 사용되는 방법 및 조성물은 본 기술분야에서 공지되어 있는 바와 같이 채택된 특정 벡터에 의존하고 있다. 그러나, 전형적으로, 벡터는 예를 들면 식염수와 같은 약학적으로 허용가능한 담체/희석제를 함유하는 주사가능한 제제의 형태일 수 있다.

바이러스 벡터(아데노바이러스 등)에 대해, 주사가능한 제제중 바이러스의 최종 역가는 바람직하게는 효과적인 유전자 전달을 하게 하는 약 10⁷-10¹³개의 바이러스 입자의 범위내에 있다. 다른 약학적 담체, 조제물 및 사용량은 하기한다.

β-ASP 트랜스유전자를 갖는 벡터는 치료학적 이점을 제공하기 위해 그리고 발현될 트랜스유전자에 대해 충분한 양으로, 형광안내하에서 표준 피부관통 카테테르에 의거한 방법을 사용하여 직접 관상내(또는 그래프트 관) 주사에 의해 심근으로 운반할 수 있다. 그러한 주사는 바람직하게는 관상동맥의 루멘(또는 그래프트 관)으로 깊게(동맥 루멘내의 약 1cm) 행하고, 바람직하게는 두 관상동맥에서 행한다(모든 심장 영역에 대한 일반적인 분포를 제공하기 위해).

관상 카테테르에 의해 관상동맥의 루멘으로 직접 재료를 주사함으로써, 유전자를 보다 효과적으로 표적화하고, 주사동안에 대동맥에 인접해 있는 재조합형 벡터의 손실을 최소화하는 것이 가능하다. 본 발명자는 이러한 방식으로 운반되었을 때의 유전자 발현이 간세포에서는 일어나지 않고 바이러스 RNA가 관상내 주사후 어느때라도 소변에서 발견될 수 없다는 것을 알았다. 또한, PCR을 사용하여, 본 발명자는 관상내로 운반한지 2주가 지난 후에 눈, 간장 또는 골격근에서 심장외 유전자 발현의 증거를 찾지 못하였다. 각종 관상 카테테르를 본 발명에서 사용할 수 있다. 또한, 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 다른 기술은 심장으로의 유전자 전달에 사용될 수 있다.

울혈성 심부전의 동물 모델

사람에게 적용가능한 어떤 심장 유전자 치료기술을 개발시키는 중요한 필요조건은 (a) 임상학적 울혈성 심부전에 적용가능하고 심부전의 세팅에서 변경된 β-아드레날린작용성 신호화에 대한 메카니즘 관련 유용한 데이터를 제공할 수 있는 큰 동물모델의 구조, 및 (b) 유전자 전달 효과의 정확한 평가이다. 종래 기술에서 생체내에서의 유전자 치료를 사용하여 울혈성 심부전을 치료하기 위한 수단을 효과적으로 기재하고 또는 입증한 것은 없다.

본 발명에 대해서, 본 발명자는 β-아드레날린작용성 신호화와 관련된 임상학적 이상을 포함하여 많은 중요한 방법으로 사람 임상학적 울혈성 심부전을 의사하는 심부전의 돼지 모델을 채택하였다. 본 발명자의 돼지 모델에서, 이들 큰 포유동물에서 지속된 신속한 심실 페이스화(225비트/분)는, 사람에서 모든 임상학적 비대된 심부전을 의사하는 좌심실 확장, 저하된 수축기능, 및 혈행 역학 이상이 되게 한다(예를 들면, Roth DA, et al., J Clin Invest 91:939-949, 1993 참조). 더욱이, 돼지 모델 심장에서의 변경된 β-아드레날린작용성 신호화, 특히 혈장 및 심근 카테콜라민 수준, β-아드레날린작용성 리셉터 하향조절 및 비커플링, 및 아데닐일시클라제 기능의 변경 등의 상세한 분석은 사람에서의 심부전과 관련된 상태를 의사한다(Roth DA, et al., J Clin Invest 91:939-949, 1993).

본 발명과 비교하여 심부전이 있는 이들 동물모델로부터 심근에서 수행한 연구로부터의 기초적 발견은 다음을 포함한다. 첫째, β₁-아드레날린작용성 리셉터 mRNA에서 유사하게 감소하면서 좌심실 β₁-아드레날린작용성 리셉터 수의 75감소율; 반면에 β₂-아드레날린작용성 리셉터 수( 및 mRNA)는 변화되지 않는다. 이것은 사람 심부전에서 알 수 있는 것을 반영한다(예를 들면, Bristow MR, et al., J Clin Invest 92:2737-2745, 1993 참조). 둘째, 좌심실 β-아드레날린작용성 리셉터는 Gs로부터 비커플링되고, G-단백질 리셉터 키나제의 증가된 기능 및 발현이 있다. 이것은 이상이 있는 사람 심장에서 발견된다(예를 들면, Ungerer M, et al., Circulation, 87:454-461, 1993; Ungerer M, et al., Circ Res, 74:206-213, 1994 참조). 셋째, AC_VI에 대해서 mRNA와 관련된 좌심실 AC의 기능 감소가 있다(Roth DA, et al., J Clin Invest, 91:939-949, 1993; 또한 Ishikawa Y, et al., J Clin Invest, 93:2224-2229, 1994 참조).

또한 최근의 연구는 손상된 AC 기능을 제안하는 이상이 있는 좌심실의 호모게네이트에서 감소된 포르스콜린 자극된 cAMP 생성을 나타낸다(Bristow, M.R. et al., Mol. Pharm. 35, 295-303, 1989; Ishikawa, Y., et al., J. Clin. Invest. 93, 2224-2229, 1994; Kiuchi K., et al. J. Clin. Invest. 91, 907-914, 1993; Marzo, K.P., et al., Circ. Res. 69, 1546-1556, 1991; Roth, D.A., et al., J. Clin. Invest. 91, 939-949, 1993). AC의 촉매적 서브유닛의 평가에 의한 문제점은 그 농도 또는 기능을 평가하기 위한 현재의 방법에 단지 결함이 있다는 것이다. 디터펜 포르스콜린은 AC의 활성제이고, 따라서, 포르스콜린 자극된 cAMP 생성은 그 생물학적 활성을 분석하는데 가장 통상적으로 채택된 방법이었다. 그러나, 포르스콜린에 대한 충분한 반응은 Gs_I및 AC의 상호작용을 포함하기 때문에, 그리고 Gsα의 작용은 포르스콜린 반응을 저해하기 때문에(Darfler, F.J., et al., J.Biol.Chem.257, 11901-11907, 1982), 포르스콜린 자극은 AC 기능의 정확한 측정을 제공하지 못한다. AC는 그 통상의 세포환경에서 일반적으로 불안정하고 매우 변화를 일으키기 쉬운 경향이 있다는 것이 인식되어 있다. AC에 대한 항체는 폭넓게 이용가능하지 않고, 단백질은 저 존재비로 발현되고, 이 중요한 형질도입 요소의 기능적 평가 및 정량의 문제를 더욱 심화시킨다. 이들 문제 때문에, 병리생리학적 세팅에서 AC의 기능 및 정량의 정확한 변경에 대해 공지되어 있는 것은 거의 없다. AC에 의한 세포기능의 조절은 AC의 많은 이소형태가 존재한다는 최근의 증거에 의해 더욱 복잡해지고, 이들 중 적어도 두 개는 심장에서 발현되는 것이 입증되었다(Ishikawa, Y., et al., J. Clin. Invest. 93, 2224-2229, 1994; Iyengar R. FASEB J. 7, 768-775, 1993; Katsusshika, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 89, 8774-8778, 1992; Krupinski, J., et al., J. Biol. Chem. 267, 24858-24862, 1992; Tang, W. J. and A. G. Gilman. Cell 70, 869-872, 1992; Taussig, R., et al., J. Biol. Chem. 269, 6093-6100, 1994). 본 실험실로부터의 연구는 AC 발현에 관한 정량적 정보를 제공하기 위한 두가지 접근을 채택하였다. 첫째, 포르스콜린 결합은 AC 기능을 정량하는데 사용한다(Alousi A, et al. FASEB Journal 5:2300-2303, 1991). 둘째, RN아제 보호분석은 AC 이소형태에 대한 mRNA 수준의 정량적 평가를 제공하는데 사용한다(Ping P, et al., Circulation 90:I-I-580, 1994; Ping P and Hammond HK, Am J Physiol 267:H2079-H2085, 1994).

AC 이소형태에 대한 퇴화한 PCR 프라이머를 사용하여, 본 발명자는 28개의 양성 클론을 분리하였다. 후속 서열분석은 이미 보고된 AC 이소형태의 서열에 의거하고, 적어도 3개의 AC 이소형태가 돼지 좌심실에서 발현된다. 다양한 AC 이소형태를 발현하는 세포유형이 동정되지 않는다 하더라도, 전체 래트 심장 호모게네이트 및 PCR을 사용하여 포유동물 심장에서의 AC 이소형태 발현에 관한 상기의 보고는 8개의 AC 이소형태를 동정하였다(Katsusshika, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89, 8774-8778, 1992). 노던 블롯팅(폴리-(A)-선택)을 사용하는 후속의 연구는 단지 2개의 이소형태, 즉 개 심장에서 AC_V및 AC_VI를 동정할 수 있다(Ishikawa, Y., et al., J. Clin. Invest. 93, 2224-2229, 1994). 이시카와 등(Ishikawa, Y., et al., J. Clin. Invest. 93, 2224-2229, 1994)은 AC_V및 AC_VI이소형태가 분리된 심장 근세포로부터 추출된 RNA에서 동정될 수 있다는 것을 확인하였다.

본 발명자는 이미 채택된 돼지 모델에 대해, AC 이소형태 II, V, 및 VI이 전체 심장으로부터 추출한 RNA 뿐만 아니라 성숙한 돼지 좌심실 심장 근세포의 순수한 집단으로부터 추출한 RNA에서 존재한다는 것을 알았다.

상기의 연구는 심한 심부전이 AC 이소형태 V 및 VI mRNA의 하향조절과 관련된다는 것을 나타냈다(Ishikawa, Y., et al., J. Clin. Invest. 93, 2224-2229, 1994). 본 발명자는 심부전에서 AC 이소형태 mRNA 하향조절이 이소형태중에서 균일한지의 여부를 알기 위해 임상학적 CHF를 의사하는 동물 모델을 사용하였다. 심근 βAR의 초기 비커플링을 포함하여, 본 발명자의 발견이 상기 보고의 일부 양태와 일치하더라도(Ishikawa, Y., et al., J. Clin. Invest. 93, 2224-2229, 1994; Kiuchi K., et al. J. Clin. Invest. 91, 907-914, 1993), 차이는 있다. 첫째, 본 발명자는 심장 근세포 기원의 제3의 AC 이소형태(AC_II)를 동정하고, 정량적 측정을 통해 좌심실에서 이들 3개의 이소형태의 발현수준을 확립하였다. 둘째, 이시카와 등(Ishikawa, Y., et al., J. Clin. Invest. 93, 2224-2229, 1994)과 반대로, 본 발명자는 AC 이소형태 하향조절이 이소형태 특이적이라는 것을 알았다. 특히, 감소된 AC_VI발현은 CHF에서 손상된 β-아드레날린작용성 반응성과 관련되는 것으로 보인다.

요약하면, 정상적인 심장에서, AC의 양은 β-아드레날린작용성 반응성에서의 한정을 세팅하는 것으로 보인다. 심부전에서, AC 하향조절이 막을 통한 신호화를 더 손상시키는 경우, 이것은 막을 통한 β-아드레날린작용성 신호화에 영향을 끼치는 더욱 중요한 제한인 것으로 기대되었다.

하기에서 보다 상세하게 기재하고 예시하는 돼지에 의한 본 발명자의 연구는 심근으로의 생체내에서의 운반에 의해 β-ASP(AC 등)의 과발현은 큰 동물모델의 전조가 되는 사람에서 심장기능을 증강시킬 수 있다는 것을 입증하고 있다. 심부전의 치료에 사용하기 위한 그러한 기술을 기재하고 또는 입증하는 이전의 공보는 없다. 또한 본 발명자의 연구는 돼지 페이스화 모델에서의 CHF 표현형이 사람에서 임상학적 CHF에서 관찰된 바와 매우 유사하다는 확인을 더 제공하였다.

따라서 CHF의 돼지 페이스화 모델에서의 아드레날린작용성 반응성을 현저하게 증가시키기 위한 본 발명자의 입증된 능력(본 발명 방법을 사용)은 심장 아드레날린작용성 신호화의 분자 메카니즘에 대한 이해 뿐만 아니라 임상학적 상태를 실제로 치료하는 임상학적 진행을 제공한다.

하기 실시예에서 기재하는 바와 같이, 본 발명자는 본 발명자의 유전자 운반 기술의 효율을 초기에 검사하고 AC_VI를 발현하는 재조합형 아데노바이러스의 관상내 유전자 운반이 양성의 충격 심장기능일 수 있는 것을 나타내는 데이터를 제공하기 위해 정상 돼지를 사용하였다. 이들 초기 연구에서, lacZ를 발현하는 재조합형 아데노바이러스(성공한 유전자 전달 및 발현을 제공하는데 사용된 리셉터 유전자)를 5마리 돼지의 관상동맥으로 주사하였다(약 0.5×10¹¹개의 바이러스 입자 사용). 2주가 지난 후에, 동물을 치사시키고 조직샘플을 검사하였다.

PCR을 유전자 전달을 수용한 동물로부터 심근에서 아데노바이러스 DNA를 검출하는데 사용하였다. 효과적인 유전자 전달은 돼지의 심장에서 얻어지고, 다른 조직에서는 발견되지 않았다. 이들 기술의 성공을 더 확인하기 위해, lacZ-혼입된 동물로부터 심근 샘플은 역사적 검사에서 실질적인 β-갈락토시다제 활성을 나타내는 것을 발견하였다.

β-ASP 트랜스유전자를 사용하는 심장 유전자 치료를 예시하기 위해, 돼지를 생체내에서 AC_VI이소형태를 코딩하는 DNA의 유전자 운반에 노출시켰다. 3마리의 동물에서 시행한 연구에서, β-아드레날린작용성 반응성의 생리학적 측정은 β-ASP 트랜스유전자를 발현하는 재조합형 아데노바이러스(AC_VI코딩)의 관상내 주사전 그리고 주사한지 5-10일이 지난 후에 얻어졌다.

본 발명자의 결과는 β-아드레날린작용성 자극에 대한 심박동수 반응성은 본 발명에 따른 유전자 전달 후에 현저하게 증가되었음을 나타냈다.

또한, 돼지중 한 마리를 (유전자 전달 전후 둘다), 압력 발생상승률을 측정하고, 심장기능의 추가의 인디케이터인 좌심실 dP/dt에서의 잠재적 변화를 모니터하기 위해 더 검사하였다. 하기한 결과는 본 발명에 따른 심장 유전자 치료는 좌심실 dP/dt에서의 실질적 증가가 되게 하는 것을 나타내었다. 따라서 이들 데이터는 본 발명의 기술이 사람에서 CHF를 의사하는 큰 동물 모델에서의 심장 기능을 증강시키는데 사용할 수 있다는 확인을 더 제공하였다.

본 발명자의 데이터는 β-ASP, AC가 큰 동물 심장에 대해 생체내에서 유전자 치료에 의해 효과적으로 운반될 수 있고 β-아드레날린작용성 반응성 및 심장 기능은 그러한 방법을 사용하여 증가시킬 수 있다는 것을 입증하였다. 다른 바람직한 β-ASP는 유사한 방식으로 운반될 수 있다. 예시로서, 다음의 설명 및 실시예에서, 본 발명자는 β-아드레날린작용성 리셉터(β₁-AR) 및 GRK 저해제를 포함하여 β-ASP의 추가 유형을 기재한다. β₁-AR은 βAR-G_s-AC 경로에서 AC의 기능적으로 상류이고, AC와 유사하게 심부전과 관련하여 하향조절되는 것으로 발견되었다.

사람에서 임상학적 심부전에 대한 심부전의 페이스화 유발된 모델의 전조성과 더 관련하여, 두가지의 말단 상태가 동일한 방식으로 야기되지 않지만(즉 병인 및 발생률 면에서), 치료를 필요로 하는 심부전의 얻어지는 상태는 매우 밀접하게 관련된다. 따라서, 두 시스템은, 비대되고, 불량하게 수축하는 심장, 및 멀티 챔버 확장 뿐만 아니라 가장 중요하게 두 시스템이 β-아드레날린작용성 신호화와 관련된 매우 유사한 이상을 나타내는 것을 특징으로 한다(예를 들면, Bristow MR, et al., N Engl J Med, 307:205-211, 1982; Bristow MR, et al., Mol Pharm, 35:295-303, 1989; Bristow MR, et al., J Clin Invest, 92:2737-2745, 1993; Ishikawa Y, et al., J Clin Invest, 93:2224-2229, 1994; Kiuchi K, et al., J Clin Invest, 91:907-914, 1993; Marzo KP, et al., Circ Res, 69:1546-1556, 1991; Ping P, et al., Am J Physiol, 267:H2079-H2085, 1994; Ping P, et al., J Clin Invest, 95:1271-1280, 1995; Roth DA, et al., J Clin Invest, 91:939-949, 1993; Ungerer M, et al., Circulation, 87:454-461, 1993; Ungerer M, et al., Circ Res, 74:206-213, 1994 참조).

하기하는 데이터는 먼저 심근 GRK₅단백질 및 mRNA 함량이 온화한 그리고 심한 심부전에서 상향조절되기 쉽다는 것을 제공한다. 이 이론에 국한되지 않고, 본 발명자의 데이터는 GRK₅의 증가된 발현이 이들 임상학적 상태에서 관찰되는 증가된 GRK 활성에 대해 책임이 있을 수 있다는 생각을 지지한다. 어떤 경우에는, 현재의 데이터는 증가된 좌심실 GRK 발현이 심부전의 발생중 초기단계에서 감소된 아드레날린작용성 신호화에 기여한다는 가설을 강하게 지지한다. 심부전에서 GRK의 역할, 및 본 발명에 따른 유전자 운반에 대한 β-ASP로서 GRK 저해제의 사용은 하기에서 보다 상세하게 기재한다.

이 이론에 국한되지 않고, 본 발명자의 데이터는 증가된 GRK 단백질 발현이 AC 이소형태 발현에서의 변경보다 앞서고, βAR 비커플링과 관련된 AC의 손상된 호르몬 자극이 GRK에 의해 증가된 βAR 포스포릴화로부터 야기될 수 있어 증가된 GRK₅발현으로부터 야기되는 것이 가능하다는 심부전에서의 초기 변화라는 생각을 지지한다.

본 발명에 따른 β-아드레날린작용성 반응성의 증강은 많은 질병 상황중에서 심장기능을 증강시키는데 유익하다고 기대되고, 심부전은 β-아드레날린작용성 신호화의 감소와 관련된다. 이와 관련하여, 추정되는 중재의 관점에서, 특히 이와 같은 상황에서 병인을 구별하는 것이 중요하고, 분자 경로는 상류의 신호화 사건에서 하류의 이펙터 사건으로 되게 하고, 신호화 성분은 실제 제거되지 않으면서 감소(수 또는 활성)되는 경향이 있다(이로써 기능장애 및 잠재적 치료가 자연에서 보다 정량적이 되게 함). 따라서, 본문에서 기재한 바와 같은 개재적 치료는 주요 분자 영향부위 또는 제거하는 경향이 있는 잠재적으로 하류부위 또는 “바이패스” 주 제한에서 지향될 수 있다. 예시로서, β-아드레날린작용성 리셉터(β-AR) 수준의 효과적인 감소는 동일한 단백질의 수준을 증가시킴으로써 직접 치료될 수 있고, 바람직하게는 치료되더라도, 간접적으로 보상될 수 있는데, 예를 들면 잔류 β-AR 단백질의 활성을 증가시키고 또는 그러한 단백질의 저해를 경감시킴으로써(예를 들면, GRK 저해제 사용), 유사한 β-AR의 활성을 증가시키고 또는 하류의 신호 트랜스듀서(예, AC)의 이용가능성을 증가시킴으로써 초기의 신호화 사건이 하류의 자극이 되게 하는 것이 보다 용이해진다. 또한, 상기한 본 발명자의 분석이 β-AR 수 및/또는 활성이 심한 심부전에 현저하게 영향을 끼친다는 생각을 지지하고, 본 발명에 따른 생체내에서 유전자 치료를 포함하는 본 발명자의 결과는 (하기하는 바와 같이) AC와 같은 하류 성분을 증가시키기 위한 개재도 실질적으로 심장 기능을 증강시킬 수 있다는 것을 입증하고 있다. 또한 상류 결함에서 지향되는 이론은 (예를 들면, β-AR 및/또는 GRK 저해제의 운반을 채택) β-아드레날린작용성 신호화 및 심장기능 면에서 실질적으로 이점을 제공하는 것이 기대되었다. 하기하는 바와 같이, 울혈성 심부전의 문맥에서 심장 기능 및 β-아드레날린작용성 반응성을 증강시키는 방법으로서 본 발명에 따른 하나이상의 그러한 β-ASP 트랜스유전자를 공급하는 것이 가능하다.

치료학적 적용

본 발명자의 데이터는 β-아드레날린작용성 신호화 요소의 심근으로의 유전자 전달이 내생의 β-아드레날린작용성 자극에 대한 심장 반응성을 증강시키는데 사용될 수 있다는 것을 입증하고 있다. 본 발명자는 사람에서 임상학적 울혈성 심부전을 의사하는데 사용된 큰 포유동물 모델에서 성공적으로 적용가능하다는 것을 나타내는 본 발명자의 기술은 사람에서 CHF의 치료에 이롭다고 기대되고, 이로써 장기 생존을 제한하는 경향이 있는 외생의 β-아드레날린작용성 자극의 투여와 같은 치료를 제공하는 대안을 더 필요로 한다.

본문에서 기재하는 바와 같이, 많은 상이한 벡터가 본 발명에 따라 생체내에서 β-ASP 트랜스유전자를 운반하기 위해 채택될 수 있다. 예시로서, 예시된 복제결손 재조합형 아데노바이러스 벡터는 유전자 발현의 영역에서 감염 또는 세포변성효과가 없이 생체내에서 매우 효과적인 유전자 전달이 되게 한다.

본 발명의 조성물 또는 생성물은 혈류(예를 들면, 관상동맥내)로 투여하는데 적당한 조제물의 형태로 편리하게 제공될 수 있다. 적당한 투여 포맷은 표준 방법에 따라 각 환자 개개에 대해 의사가 결정하는 것이 가장 좋을 수 있다. 적당한 약학적으로 허용가능한 담체 및 그것의 조제물은 표준 조제물 처리, 예를 들면 이.더블유.마틴에 의한 레밍턴스 파마슈티컬즈 사이언스에 기재되어 있다. 또한 Wang, Y.J. and Hanson, M.A. “Parental Formulations of Proteins and Peptides:Stability and Stabilizers”, Journals of Parental Sciences and Technology, Technical Report No. 10, Supp. 42:2S(1988) 참조. 본 발명의 벡터는, 중성 pH, 예를 들면 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.5, 보다 바람직하게는 약 pH 7 내지 8의 용액으로 바람직하게는 조제되어야 하는데, 이 용액이 대략 등장이 되게 하는 부형제, 예를 들면 4.5만니톨 또는 0.9염화나트륨을 갖고, pH는 메타크레졸 0.1내지 0.75, 보다 바람직하게는 0.15내지 0.4메타크레졸과 같은 허용된 방부제와 함께 일반적으로 안전하다고 간주되는 인산나트륨과 같은 공지된 완충액으로 완충된다. 원하는 등장성을 얻는 것은 덱스트로스, 붕산, 타르타르산나트륨, 프로필렌글리콜, 폴리올(만니톨 및 소르비톨 등), 또는 다른 무기 또는 유기 용질과 같은 다른 약학적으로 허용가능한 작용제 또는 염화나트륨을 사용하여 수행될 수 있다. 염화나트륨은 나트륨이온을 함유하는 완충액에 대해 특히 바람직하다. 원한다면, 상기 조성물의 용액은 저장수명 및 안정성을 증가시키기 위해 제조될 수 있다. 본 발명의 치료학적으로 유용한 조성물은 일반적으로 허용된 방법을 수행하는 성분을 혼합함으로써 제조될 수 있다. 예를 들면, 선택된 성분은 농축된 혼합물을 제조하기 위해 혼합하고 다음에 긴장성을 제어하기 위해 추가의 용질 또는 pH를 제어하기 위해 물 및/또는 완충액의 첨가에 의해 점도 및 최종 농도로 조정할 수 있다.

의사가 사용하기 위해, 조성물은 원하는 수준에서 β-ASP 트랜스유전자 운반/발현을 유발하기 위해 일회 이상의 사용량으로 효과적인 본 발명의 벡터량을 함유하는 투여형태로 제공될 수 있다. 본 분야에서 인식되는 바와 같이, 치료제의 유효량은 환자의 나이 및 체중, 환자의 신체조건, 및 원하는 심장기능의 증강수준을 포함하는 많은 인자, 및 다른 인자로 다양해질 것이다.

바이러스 벡터에 대해, 본 발명 화합물의 유효 투여량은 전형적으로 적어도 약 10⁷개의 바이러스 입자, 바람직하게는 약 10⁹개의 바이러스 입자, 보다 바람직하게는 약 10¹¹개의 바이러스 입자 범위내에 있을 것이다. 바이러스 입자수는 바람직하게는 10¹⁴개를 초과할 수 없다. 지적한 바와 같이, 투여될 정확한 투여량은 간호중인 임상의에 의해 결정되나, 바람직하게는 인산염완충식염수 1ml이다.

심장병의 경우에서 현재 가장 바람직한 투여모드는 적절한 관상 카테테르를 사용하여 하나 또는 두 개의 관상동맥(또는 하나이상의 복재정맥 또는 내유동맥 그래프트 또는 다른 도관)으로 관상내 주사에 의한다. 다양한 카테테르 및 운반 루트는 본 기술분야에서 공지되어 있는 바와 같이 관상내 운반을 수행하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 다양한 일반 목적의 카테테르 뿐만 아니라 본 발명에 사용하는데 적당한 변형된 카테테르는 Advanced Cardiovascular Systems(ACS), Target Therapeutics and Cordis와 같은 시중 공급처로부터 구입가능하다. 또한, 심근으로의 운반이 관상동맥으로 직접 주사에 의해 수행되는 경우(현재 가장 바람직함), 많은 접근이 본 기술분야에서 공지되어 있는 바와 같이 관상동맥으로 카테테르를 도입하는 것이 사용될 수 있다. 예시로서, 카테테르는 대퇴부 동맥으로 편리하게 도입되고 장골동맥 및 복부 대동맥을 빠져나가 관상동맥으로 역행할 수 있다. 대안으로, 카테테르는 팔 또는 경동맥으로 먼저 도입되고 빠져나가 관상동맥으로 역행할 수 있다. 이러한 기술의 상세한 설명은 본 기술분야에서 찾을 수 있다(예를 들면, Topol, EJ (ed.), The Textbook of Interventional Cardiology, 2nd Ed. (W.B.Saunders Co. 1994); Rutherford, RB, Vascular Surgery, 3rd Ed. (W.B.Saunders Co. 1989); Wyngaarden JB et al.(eds.), The Cecil Textbook of Medicine, 19th Ed. (W.B.Saunders, 1992); and Sabiston, D, The Textbook of Surgery, 14th Ed.(W.B.Saunders Co. 1991)을 포함하여 상기 인용된 참고문헌 참조).

다음 실시예는 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자를 더욱 조력하도록 제공된다. 그러한 실시예는 예시되도록 의도되고 따라서 본 발명을 제한하도록 간주되지 않아야 한다. 많은 실시예 변형 및 변경이 본원에서 기재되고 나머지는 본 기술분야의 숙련자에게 명백할 것이다. 그러한 변경은 본문에서 기재되고 청구되는 바와 같이 본 발명의 범위내에 있도록 생각된다.

실시예 1: 일반 방법

실시예 1-1: 동물 및 외과적 방법

동물 사용은 NIH 가이드라인에 따라서 하였다. 42±5kg 체중의 16마리의 요크셔 피그(Sus scrofa)를 이 연구를 위해 사용하고 케타민(50mg/kg, 근육내) 및 아트로핀 술페이트(0.1mg/kg, 근육내) 다음에 나트륨 아미탈(100mg/kg, 정맥내)로 마취시켰다. 기관내 삽관법을 한 후에, 할로탄(0.5-1.5)을 이 방법을 통하여 압력 순환된 통풍장치로 운반하였다. 좌개흉에서, 카테테르를 대동맥, 폐동맥 및 좌심방에 넣었다. 코니그스베르크(Konigsberg) 마이크로혈압계를 좌심실 정점에 넣고 심외막 단극 리드를 좌심실의 측벽에 있는 방실홈 밑 1.0cm에 위치시켰다. 동력 발생기(Spectrax 5985; Medtronic Incorporated, Minneapolis, MN)를 복부에 있는 피하 주머니에 삽입하였다. 심낭에 가깝게 접근시키고 가슴을 폐쇄하였다.

개흉한지 10일이 지난 후에, 혈행 역학의 기준선 및 좌심실 기능이 생겼다. 다음에 심실 페이스화를 개시하였다(225bpm). 이들 동물중 5마리로 페이스화를 개시한지 96시간이 지난 후에 혈행 역학 및 심실 기능의 측정을 진행하고 그 다음에 치사시켰다. 6마리의 동물로 혈행 역학 및 심실 기능의 연구를 주간단위로 진행하고 페이스화를 개시한지 28일이 지난 후에 치사시켰다. 5마리의 남은 동물(콘트롤)은 페이스화하지 않고 기구사용한지 38일이 지난 후에 치사시켰다.

실시예 1-2: 혈행 역학 연구

혈행 역학 데이터는 페이스메이커를 1시간동안 불활성화시키고 동물들을 기본 상태에 있게 한 후에 의식이 있고, 안정되어 있지 않은 동물로부터 얻었다. 압력은 좌동맥 및 대동맥으로부터 얻었다. 좌심실 dP/dt는 고성능 좌심실 압력으로부터 얻었다.

실시예 1-3: 초음파 심장 진단법 연구

2차원 및 M-모드 영상을 휴렛 팩커드 소노스 1500 영상화 시스템을 사용하여 얻었다. 영상은 중간 유두근 수준에서 접근하여 오른쪽 흉골 근처에서 얻었고 VHS 테이프에 기록하였다. 어메리칸 소사이어티 오브 에코카디오그래피(Sahn DJ, et al., Circulation 58: 1072-1083, 1978)로부터 기준을 사용하여 측정하였다. 말단 확장 디멘젼(EDD) 및 말단 수축 디멘젼(ESD)을 적어도 5비트로 측정하고 평균하였다. 말단 확장 디멘젼은 QRS 착체 개시에서 얻었다. 말단 수축 디멘젼은 심실간 격벽의 최대 측면 위치에서 또는 말단 T파에서 취하였다. 좌심실 수축기능은 분획단축 [(EDD-ESD)/EDD]×100을 사용하여 평가하였다. 반복된 측정에서 말단 확장 디멘젼에 대한 편차율은 ＜5였다. 이들 모든 측정값은 불활성화된 페이스메이커로 얻었다.

실시예 1-4: 말단 개흉

연속 페이스화한지 4일(n=5) 또는 28일(n=6)(또는 5마리의 콘트롤 동물에 대한 페이스가 없이 유사한 수술후 경과)후에, 돼지를 마취시키고 중심선을 맞춰 흉골절개술을 하였다. 심장을 제거하고 멸균 식염수(4℃)로 세정하고 관상동맥을 멸균 식염수(4℃)로 관류하였다. 좌심실 없는 벽의 통벽성 샘플에 하강하는 관상동맥의 왼쪽 앞의 중간부분 근처에 있는 정점을 기준으로 중심선을 그었다. 다음에 심근 샘플을 동결시켰다(-80℃). 심장 제거로부터 액체 질소중에 샘플을 넣는데 까지 걸리는 시간은 5-10분이었다.

실시예 1-5: 멤브레인 평가 및 제조

동결시킨 통벽성 샘플(-80℃)을 스테인레스 강 막자사발과 막자로 분말화하고(-80℃), 트리스 완충액에 넣고, 유리-유리 균질화하고, 수축성 단백질을 추출하였다(0.5M KCl, 20분, 4℃). 45,000×g 원심분리 펠릿을 완충액에서 재현탁하였다. 단백질 농도를 브래드포드 방법(Bradford MM, Anal. Biochem, 72: 248-254, 1976)으로 측정하고; 단백질 수득량(mg 단백질/mg 습식중량)을 모든 제조에서 평가하였다. 본 발명자는 mg 미정제 멤브레인 호모게네이트에 대한 멤브레인 단백질 수득량을 평가하는데 사용되는 사르콜레마 멤브레인 관련 효소인 p-니트로페닐포스파타제 (Bers DM, Biochem Biophys Acta, 555: 131-146, 1979)는 이 모델(Roth DA, et al., J. Clin Invest, 91: 939-949, 1993)에서 변경되지 않는다는 것을 이미 알고 있었다.

실시예 1-6: 아데닐일시클라제 분석

AC 활성을 측정하는 방법은 이미 기록된 바와 같이(Hammond HK, et al., Circulation 85: 269-280, 1992; Hammond HK, et al., Circulation 8:, 666-679, 1992) 솔로몬(Salomon Y, et al., Anal Biochem, 58: 541-548, 1974)으로부터 변형되었다. 다음의 작용제를 cAMP 생성(최종농도)을 자극하는데 사용하였다: 이소프로테레놀(10μM), GTP(10μM), Gpp[NH]p(10μM), 포르스콜린(100μM). 본 발명자는 이들 조건하에서의 cAMP 생성이 시간 및 단백질 농도에 대해 선형화하고 3-이소부틸, 2-메틸크산틴(1.0mM), 아데노신 데아미나제(5U/ml) 또는 둘다는 기본 또는 최대로 자극된 cAMP 생성에 어떤 영향도 끼치지 않았음을 알았다. 이전의 실험은 AC 활성이 본 멤브레인 제조(Hammond HK, et al., Circulation 85: 269-280, 1992)에서 45,000×g 원심분리의 상청액에 분포되지 않는다는 것을 확립하였다.

실시예 1-7: β-아드레날린작용성의 리셉터 결합연구

상기한 바와 같이(Hammond HK, et al., Circulation 8:, 666-679, 1992) βAR을 방사성 리간드[¹²⁵I]-요도시아나핀돌올을 사용하여 동정하였다. 아고니스트 친화성은 (-)이소프로테레놀을 사용하는 길항적 결합분석을 수행하여 측정하였다(Hammond HK, et al., Circulation 8:, 666-679, 1992).

실시예 1-8: 면역블롯팅에 의한 Gsα 및 Giα₂함량 분석

각 Gs 및 Gi의 αs 및 αi 서브유닛의 분석은 표준 SDS-PAGE 및 상기한 면역블롯팅 기술(Roth DA, et al., FEBS Lett, 29: 46-50, 1992)을 사용하여 수행하였다. 요컨대, 적절한 통벽성 샘플로부터 유래된 미정제 심근 호모게네이트의 45,000×g 원심분리의 펠릿 분획 및 각 상청액으로부터의 단백질 100μg을 30mA에서 4시간동안 10변성겔에서 전기영동시켰다. 단백질을 14시간, 70볼트, 4℃에서 니트로셀룰로스 멤브레인(Amersham, U.K.)에서 전기블롯팅하였다. 전달 효율을 가역적 폰소(Ponceau) 염료로 염색된 멤브레인 및 쿠마시(Coomasie) 블루 염료로 체크한 겔 보유의 사진복사에 의해 기록하였다. 배경차단은 2비지방 건조 밀크, 2시간, 25℃에서 트리스완충식염수(TBS, pH 7.5)에서 멤브레인을 배양함으로써 수행하였다. 정제된 1차 다클론성 항체(NEN, Boston MA, rabbit Anti-G-proteins: RM/1 Gsα; AS/7, transducin, Giα₁, Giα₂)를 0.05Tween-20(TTBS, pH 7.5) 및 1비지방 건조밀크가 있는 TBS 15ml에서 1:600으로 희석하였다. 밴드의 방사선사진 검출은 2시간, 25℃에서 1비지방 건조밀크 및 15×10⁶cpm¹²⁵I-단백질 A(NEN, Boston, MA)가 있는 TTBS 75ml에서 멤브레인을 배양하고 나서 TTBS로 순차 세척하고 5일, -70℃에서 X-선 필름(Kodak X-OMAT AR)에 대해 위치시켜 수행하였다. Gsα 및 Gsα₂에 대한 45 및 40kDa 밴드를 감마 계수를 위해 배경 콘트롤로 멤브레인으로부터 제거하였다.

실시예 1-9: 면역블롯팅에 의한 GRK₂및 GRK₅함량 분석

좌심실 GRK₂및 GRK₅함량 분석은 표준 SDS-PAGE 및 상기한 면역블롯팅 기술(Ping P, et al., J. Clin Invest, 95: 1271-1280, 1995; Roth DA, et al., FEBS Lett, 29: 46-50, 1992)을 사용하여 수행하였다. 정제된 소 GRK₂및 정제된 소 GRK₅에 특이적인 항체는 Dr. Jeffrey L. Benovic에 의해 제공되었다. GRK₅에 특이적인 항체는 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz, CA)로부터 얻었다. 통벽성 좌심실 샘플을 20mM 트리스 HCl(pH 7.5), 2mM EDTA, 10μg/ml 벤즈아미딘, 10μg/ml 류펩틴, 100μg/ml PMSF 및 5μg/ml 펩스타틴 A를 함유하는 세포용해 완충액에 넣었다. 분말화된 샘플을 균질화한 다음에 원심분리하고 세포용해 완충액에서 초음파 처리로 재현탁하였다. 각 좌심실 샘플로부터 단백질 80μg을 Laemmli 완충액과 혼합하고 비등시키고 그 다음에 10변성 겔에서 전기영동시켰다. 단백질을 PVDF 페이퍼(Immobolin-P, Millipore)로 전달하고; 전달 효율을 폰소 염료로 측정하였다. 멤브레인을 0.1Tween-20 및 5비지방 건조밀크를 함유하는 트리스완충식염수에서 2시간동안 차단하고 GRK₂또는 GRK₅항혈청을 사용하여 종래의 방법으로 전개하고 나서 양고추냉이 퍼옥시다제계열의 항토끼 면역글로불린(TBS 중 1:1000)에 노출시켰다. 블롯을 ECL로 전개하고 밴드를 X선 필름에 블롯을 노출시킨 후에 가시화하였다. 정제된 소 GRK₂와 공동 이동한 밴드 밀도는 농도계 스캐닝에 의해 정량화하고; GRK₅에 대해서는, 본 발명자는 약 (68kD)에서 GRK₅-특이적 밴드 이동을 정량화하였다.

실시예 1-10: G-단백질 리셉터 키나제 활성

GRK 효소학적 활성은 본 발명자가 상기한 바와 같이(Ping P, et al., J. Clin Invest, 95: 1271-1280, 1995) 로돕신의 광의존 포스포릴화(Benovic JL, Methods Enzymology, 200:351-363, 1991)를 사용하여 측정하였다. GRK가 없는 아형 특이적 활성 분석은 로돕신의 포스포릴화가 GRK₂(βARK₁) 및 GRK₅의 활성을 반영하는데 유용하며, 우세한 GRK는 심장에서 이소형태로 존재한다(Inglese J, et al., J Biol Chem, 268: 23735-23738, 1993). 본 발명자는 암순응된 송아지 망막으로부터 얻은 간상체 바깥 절편으로부터 로돕신을 정제하였다. 정제된 로돕신의 광의존 포스포릴화는 먼저 재조합 GRK₂(Dr. J. Benovic이 제공)를 사용하여 시험하였다. 좌심실 1g을 세포용해 완충액(50mM 트리스-HCl, pH 7.5, 5mM EDTA, 10μg/ml 벤즈아민딘, 20μg/ml 류펩틴, 40μg/ml PMSF 및 5μg/ml 펩스틴 A) 9ml에서 균질화하고, 그 다음에 30분동안 45,000×g에서 원심분리하였다. 펠릿을 250mM NaCl(멤브레인 관련 GRK를 분리하는데 사용)이 있는 세포용해 완충액 4ml에서 재현탁하고 다시 분말 구동된 유리 회전기(4℃)에서 균질화하였다. 다음에 펠릿 현탁액을 다시 원심분리하고 이온교환 칼럼(Amicon)을 펠릿 현탁액의 상청액중 NaCl을 제거하는데 사용하였다. 상청액 및 펠릿 현탁액의 상청액 둘다를 DEAE-세파셀 칼럼 정제를 하여 GRK 의존 포스포릴화를 오염시킬 수 있는 내생적 키나제를 제거하였다(Ping P, et al., J Clin Invest 95: 1271-1280, 1995; Ungerer M, et al., Circulation, 87: 454-461, 1993). 상청액 및 펠릿 분획 둘다를 독립적으로 칼럼 정제하였다.

GRK 의존 포스포릴화는 18mM 트리스 HCl, 1.8mM EDTA, 4.8mM MgCl₂, 73μM ATP 및 2.9cpm/fmol[³²P]-ATP를 함유하는 완충액에서 250pmol 로돕신이 있는 분획으로부터 단백질 100μg을 배양하여 측정하였다. GRK 의존 포스포릴화 반응은 단백질 키나제 A 저해제(1μM) 및 헤파린(10μg/ml )을 반응물에 첨가하여 확인하였다. 펠릿 및 상청액 둘다에 대한 단백질 농도는 DEAE-세파셀 정제 전후에 측정하고 최종 효소활성을 조직 g에 대한 것 뿐만 아니라 단백질의 pmol 포스페이트/분/mg으로서 나타내었다. 본 발명자는 45,000×g 원심분리(30분)가 p-니트로페닐포스파타제(사르콜레마 멤브레인 관련 효소)의 전체 세포활성의 1미만을 함유하는 상청액을 제공하여 멤브레인 성분으로부터 세포질의 우수한 분리를 제안한다는 것을 이미 알고 있었다(Roth DA, et al., FEBS Lett, 29; 46-50, 1992).

실시예 1-11: RNA 추출

전체 RNA를 상기한 바와 같이(Ping P, et al., Am J Physiol, 267: H2079-H2085, 1994; Ping P, et al., J. Clin Invest, 95: 1271-1280, 1995) 산 구아니디늄 티오시아네이트-페놀-클로로포름 추출방법(Chomczynski P, et al., Anal Biochem, 162: 156-159, 1987)의 변형을 사용하여 좌심실로부터 추출하였다. 조직 샘플을 4.0M 구아니디늄 완충액에서 균질화하고, 산성 페놀-클로로포름으로 2회 추출하고 이소프로판올로 침전시켰다. 최종 펠릿을 70에탄올로 세척하고 디에틸피로카보네이트 처리된 물에 용해하고 -80℃에서 저장하였다. RNA의 완전함 및 순도를 겔 전기영동 및 자외선 흡광도비(260nm, 280nm)로 평가하고; 샘플은 이 비가 1.5 미만이면, 또는 겔 사진의 시각적 검사가 분해를 나타낸다면 폐기하였다.

실시예 1-12: 중합효소연쇄반응 클로닝

돼지의 좌심실에서의 AC 이소형태를 중합효소연쇄반응(PCR)으로 분리하였다. 돼지의 심장 RNA를 분리하고 AMV(새의 미엘로블라스토시스 바이러스) 역전사효소를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다(Life Science Incorporated, St. Petersburg, Florida). AC 유전자 부류(Krupinski J, et al., J Biol Chem, 267: 24858-24862, 1992)의 추정되는 누클레오티드 결합영역의 전체 207bp에 걸쳐 있는 퇴화 프라이머는 돼지 심장 cDNA AC 유전자를 증폭시키는데 사용하였다. 사용된 프라이머 서열은 다음을 포함한다:

(1) 5'-ACGTAGAATTCGG(AG)GA(CT)TGTTA(CT)TACTG-3'(센스)

(2) 5'-ACGTTAAGCTTCCA(GC)AC(AG)TC(AG)AA(CT)TGCCA-3'(안티센스)

전체 RNA 5μg으로부터 유래된 상보성 DNA를 10mM 트리스-HCl 및 50mM KCl 반응완충액(pH 8.3)중의 4μM PCR 프라이머로 증폭시켰다. 태크 DNA 중합효소(2.5유닛)를 사용하였다(Gibco BRL). 증폭반응은 95℃(2분), 52℃(2분) 및 72℃(2분)에서 30사이클동안 운전한 다음에 72℃에서 10분 더 연장하였다.

실시예 1-13: 돼지 리보프로브의 구조

상기 반응에서 얻어진 PCR 단편을 pGEM 4Z 벡터(Promega)로 서브클로닝하고 서열화하였다. 서열화한 28개의 클론중에서, VI형 16개, V형 11개 및 II형 1개의 AC 클론을 래트로부터의 공개된 서열을 바탕으로 하여 동정하였다(Krupinski J, et al., J Biol Chem, 267: 24858-24862, 1992). 돼지 및 래트 AC II형 및 VI형은 동일한 예기된 아미노산 서열을 가졌다. 돼지 AC V형은 단지 단일 아미노산에서 래트 AC V형과는 구별된다. 이들 3개의 돼지 AC 이소형태는 누클레오티드 수준에서 래트와 90상동성을 갖는다(Krupinski J, et al., J Biol Chem, 267: 24858-24862, 1992).

3개의 서열화된 AC 이소형태 플라스미드는 콘트롤 RNA를 생성하기 위한 HindIII 또는 AC II, V, 및 VI형에 대한 안티센스 리보프로브를 생성하기 위한 EcoR1중 어느 한가지로 선형화하였다. 시험관내에서 전사는 후속의 RN아제 보호분석을 위한 안티센스 리보프로브(219bp) 또는 콘트롤 RNA(214bp)를 생성하기 위한 T7 중합효소(Promega) 또는 SP6중 어느 한가지를 사용하여 수행하였다. 시험관내에서 합성된 리보프로브는 mRNA 및 pGEM 4Z 벡터 둘다의 상보적 서열을 함유하고, 따라서 돼지 RNA 샘플(mRNA 단독)로부터 보호된 밴드 단편보다 길다. 돼지 심장으로부터 보호된 밴드는 207bp의 크기를 갖는다. 콘트롤 RNA의 보다 긴 길이는 시험관내에서 보호되는 pGEM 4Z 벡터로부터의 여분의 서열로부터 유래되고 콘트롤 mRNA는 샘플 RNA에 의한 오염으로부터 합성하였다.

실시예 1-14: RN아제 보호분석

RN아제 보호분석 방법을 상기한 바와 같이 수행하였다(Ping P, et al., Am J Physiol, 267: H2079-H2085, 1994; Ping P, et al., J Clin Invest 95: 1271-1280, 1995). 시험관내에서 전사를 수행하여 상기한 유전자 구조물을 사용하여 1×10⁸내지 5×10⁹cpm/μg 범위의 특이적 활성을 갖는 [³²P]-표지된 리보프로브를 합성하였다. 시험관내에서 합성된 센스 가닥 콘트롤 RNA의 다양한 양 및 조직으로부터 전체 RNA(20μg)을 12-16시간(45℃)동안 80포름알데히드, 40mM 헤페스(pH 7.6), 400mM NaCl 및 1.0mM EDTA의 20 Tl에서의 2-8×10⁴cpm 프로브(예비실험에서 측정한 바와 같이 mRNA의 5-8배 초과)로 하이브리드형성하였다. 300mM NaCl, 10mM 트리스-HCl(pH 7.4), 5mM EDTA 및 RN아제 A 20μg 및 전체 RNA μg당 Tl RN아제의 3유닛을 함유하는 분해 완충액(300Tl)을 가하고 30분동안(37℃) 배양하였다. 단백질 가수분해 효소로 처리하고 페놀-클로로포름으로 추출한 후에, RN아제 내성이 있는 잡종을 침전시키고 6폴리아크릴아미드 우레아 겔에서 운전하였다. AC_II, AC_V및 AC_VImRNA 신호를 절개된 겔 밴드를 β-카운터로 계수함으로써 정량하였다. 계수후에, 콘트롤 RNA의 cpm은 콘트롤 RNA의 cpm/μg으로서 나타낼 수 있었다. 다음에 이들 데이터를 심근조직에서의 mRNA 수준(pmol 특이적 mRNA/g 전체 RNA)을 정량하는데 사용하였다. AC_II, AC_V및 AC_VImRNA의 심장에서의 함량을 동일한 하이브리드형성 반응에서 이들의 센스 가닥 콘트롤 RNA로부터의 신호에 대한 이들 신호의 비로부터 계산하였다. 포유동물 18S 리보프로브(400cpm; Ambion으로부터의 플라스미드 구조)를 하이브리드형성에서의 AC_II, AC_V및 AC_VI리보프로브와 함께 사용하여 각 조직 샘플에 대한 적재 및 하이브리드형성 조건을 평가하였다. 고 수율 및 매우 낮은 특이적 활성의 18S 리보프로브(5-8×10⁴cpm/μg; Megascript, Ambion)를 얻어 전체 RNA 20μg으로부터 18S 전사의 측정을 정확하게 하였다. RN아제 내성(＜1) 및 리보프로브 특이성은 단일가닥 안티센스 리보프로브 플러스 RN아제 A 및 Tl이 있는 전이 RNA(효모) 40μg의 완전분해에 의해 확인되었다.

실시예 1-15: GRK₂의 노던 블롯 분석

Dr. P.A Insel에 의해 제공된 마우스 GRK₂(βARK₁) cDNA 단편을 좌심실 샘플에서의 GRK₂mRNA 함량을 평가하는데 사용하였다. 전체 RNA 20μg을 겔 변성시키고 나일론 멤브레인으로 블롯팅하였다. 노던 블롯을 5×SSPE, 10×던하르트 용액, 100μg/ml 연어정자 DNA, 50포름아미드 및 2SDS를 함유하는 완충액중에서 42℃에서 24시간동안 [³²P]-표지된 랜덤한 프라이머 GRK₂cDNA 단편(bp 1134-1688)으로 하이브리드형성하였다. 블롯을 15분동안 27℃에서 2×SSC/0.1SDS로 세척하였다.

실시예 1-16: GRK₅의 노던 블롯 분석

Dr. J. Benovic에 의해 제공된 사람 GRK₅cDNA 프로브(Marzo KP, et al., Circ Res, 69: 1546-1556, 1991)를 좌심실 샘플에서의 GRK₅mRNA 함량을 평가하는데 사용하였다. 전체 RNA 20μg을 겔 변성시키고 나일론 멤브레인으로 블롯팅하였다. 노던 블롯을 5×SSPE, 10×던하르트 용액, 100μg/ml 연어정자 DNA, 50포름아미드 및 2SDS를 함유하는 완충액중에서 42℃에서 24시간동안 [³²P]-표지된 랜덤한 프라이머 GRK₅cDNA 단편(bp 383-1540)으로 하이브리드형성하였다. 블롯을 30분동안 27℃에서 2×SSC/0.1SDS로 세척하고 나서 30분동안 42℃에서 0.12×SSC/0.1SDS로 고 긴축성 세척을 하였다.

실시예 1-17: 분리된 심장 근세포

성장한 돼지 심장 근세포를 관상동맥의 콜라게나제 관류에 의해 얻고; 세포 생존력, 순도 및 수득량을 상기한 대로 확립되었다(Spinale FG, et al., Circ. Res. 69: 1058-1067, 1991). 다른 세포주 오염균이 없는 심장 근세포를 동결시키고 다음에 RNA 추출에 사용하였다. 상기한 AC 이소형태 프라이머를 사용하는 RT-PCR을 수행하였다. AC 이소형태를 특정 AC_II, AC_V및 AC_VI이소형태 프로브로 하이브리드형성(서던 블롯)에 의해 동정하였다. 이들 프로브를 클로닝하고 상기한 대로 돼지 심장 cDNA로부터 서열화하였다. 프로브 특이성을 시험하고 교차 하이브리드형성은 AC_II, AC_V및 AC_VI이소형태 프로브 사이에서 일어나지 않았다.

실시예 1-19: 통계학적 분석

통계학적 유의성의 지표를 위해, 데이터를 평균값±1SD로 일반적으로 나타낸다. 특정 측정값을 편차의 반복된 측정분석을 사용하여 비교하고; 따라서 시험을 그룹간의 평균값을 여러번 비교하는 본페로니(Bonferroni) 보정으로 학생의 t-시험을 사용하여 수행하였다. 영의 가설은 p＜0.05일 때 버렸다.

실시예 2: 울혈성 심부전의 큰 동물 모델

심장 근세포가 체내 환경으로부터의 생물학적 신호에 대해 반응하는 방법은 전략적으로 놓인 세포표면 리셉터를 통한 것이다. 이들 리셉터중에서 주요한 것은 β-아드레날린작용성 리셉터이다. 세포표면에서 β-아드레날린작용성 리셉터와 상호작용하는 호르몬 또는 신경전달물질이 세포내 행동을 변경시킨다는 형질도입 경로는 도 2에 나타낸 바와 같은 β-아드레날린작용성-Gs-아데닐일시클라제(또는 “βAR:Gs:AC”)로서 공지되어 있다. 이 경로를 통해서 β-아드레날린작용성 자극이 세포내 cAMP를 증가시켜 심박동수 반응성 및 수축력에 영향을 끼쳤다. 경로는 3가지 주요한 성분, 즉 β-아드레날린작용성 리셉터(βAR), 자극성 GTP-결합 단백질(Gs) 및 아데닐일시클라제(AC)를 포함한다. 래트 심실 근세포, 및 다른 포유동물의 심장 근세포에서 βAR:Gs:AC 경로내에서의 성분의 몰 화학양론은 각각 약 1:70:1이라고 생각된다(예를 들면, Alousi, et al., FASEB J 5:2300, 1991 참조). 심근조직내의 β-아드레날린작용성 신호화는 초기에는 βAR에의 아고니스트 결합에 의해 매개되고, 다음에 G_s-매개된 신호가 AC로 형질도입된다. 활성화된 AC는 환상 AMP의 합성을 촉매하고, cAMP의 증가된 세포내 농도는 박동수 및 심장수축력 둘다(각각 양성 “심박수변동성” 및 양성 “수축력변동성”으로 언급됨)를 강화하는 증가된 세포질 칼슘 통과성을 매개한다.

본 발명자는 βAR:Gs:AC 경로(도 2에 나타냄)중 한가지 이상의 성분이 심장 근세포에서 막을 통해서 β-아드레날린작용성 신호화를 효과적으로 제한하고 경로중 한 개이상의 단백질의 상승 발현은 증가된 내생적 β-아드레날린작용성 신호화에 대한 반응성을 증가시킨다는 가능성을 조사하기 위해 사람의 전조가 되는 큰 동물 모델을 사용하였다. β-ASP 예로서, 본 발명자는 초기에는 보다 상세하게 하기하는 바와 같이 AC, β-AR 및 GRK 저해제(간접적으로 β-AR 활성을 증가시킴)에 주의가 집중되었다.

실시예 2-1: 혈행 역학 및 좌심실 기능

표 1에 나타낸 바와 같이, 신속한 심실 페이스화로 초기 페이스화한지 4일이 지난 후에 평균 좌동맥압 및 증가된 기본 심박동수를 얻었다. 데이터는 16마리의 동물(불활성화된 페이스메이커)로부터 얻고 값은 평균±1SD를 나타낸다. 그룹에는 페이스화하지 않은 정상 동물(콘트롤, n=5), 페이스화한지 4일이 지나 유발되는 온화한 심부전을 가진 동물(4d; n=5) 및 페이스화한지 28일이 지나 유발되는 심한 심부전을 가진 동물(28d, n=6)이 있다. LAP, 평균 좌동맥압; MAP, 평균 동맥압; EDD, 말단 확장압; FS, 분획단축. 편차분석(반복된 측정값)은 페이스화 경과가 특이적 생존력에 영향을 끼치는지의 여부를 측정하는데 사용하였다.

4일이 지난 후에, 동물은 증가된 말단 확장 디멘젼, 감소된 분획단축 및 감소된 좌심실 피크 양성 dP/dt를 나타냈다. 이들 데이터는 연속적인 신속한 페이스화를 개시한 지 4일이 지난 후에 좌심실 기능의 온화한 퇴화를 나타낸다.

심장 상태는 전조되는 사람이라고 생각되는 큰 동물에서의 심부전에 대한 모델을 제공하는 페이스화를 한지 28일이 지난 후에 상당히 악화되었다(표 1). 사람에서의 CHF에 대한 이 돼지 심부전의 전조성을 확립하는 다른 증거는 본문 및 본 기술분야에 기재되어 있다(예를 들면, Roth DA et al., J Clin Invest 91:939-949, 1993 및 상기 인용된 관련 참고문헌 참조).

혈행 역학 및 좌심실 기능

	콘트롤	4d	28d	p(ANOVA)
심박동수(bpm)	100±6	131±2b	157±15c,e	0.0001
LAP(mmHg)	14±1	22±3a	36±6c,e	0.0001
MAP(mmHg)	106±5	97±13	102±14	0.48
EDD((mm)	42±2	49±3	58±6c,d	0.0002
FS()	41±6	32±2a	13±4c,f	0.0001
LV dP/dt(mmHg/초)	3043±387	2036±582b	1072±123c,d	0.0001
데이터는 16마리의 동물(불활성화된 페이스메이커)로부터 얻고 값은 평균±1SD를 나타낸다. 그룹에는 페이스화하지 않은 정상 동물(콘트롤, n=5), 페이스화한지 4일이 지나 유발되는 온화한 심부전을 가진 동물(4d; n=5) 및 페이스화한지 28일이 지나 유발되는 심한 심부전을 가진 동물(28d, n=6)이 있다. LAP, 평균 좌동맥압; MAP, 평균 동맥압; EDD, 말단 확장압; FS, 분획단축. 편차분석(반복된 측정값)은 페이스화 경과가 특이적 생존력에 영향을 끼치는지의 여부를 측정하는데 사용하였다. 따라서 시험은ap＜0.05;bp＜0.01;cp＜0.001(콘트롤);dp＜0.05;ep＜0.01;fp＜0.001(4d 대 28d)인 본페로니 보정에 의한 학생 t-시험을 사용하여 수행하였다.

실시예 2-2: 부검

4일동안 페이스화한 동물에서, 복수증이 생겼다(평균량: 150ml; 범위 0-500ml). 이미 보고된 중량 매칭된 콘트롤 돼지(Roth DA, et al., J. Clin Invest, 91:939-949, 1993)와 비교하여 체중에 대한 간장 비는 페이스화한지 4일이 지난 후에 증가되었다(콘트롤: 18±3g/kg, n=15; 4d: 25±2g/kg, n=5; p＜0.0001). 따라서, 4일의 페이스화는 전신성 출혈을 적당하게 증가시켰다. 이미 보고된 중량 매칭된 콘트롤(체중비에 대한 좌심실은 Roth DA, et al., J. Clin Invest, 91:939-949, 1993)와 비교하여 체중에 대한 좌심실 비는 증가하지 않았다(콘트롤: 2.7±0.5g/kg, n=15; 4d: 3.0±0.4g/kg, n=5; p=0.24).

페이스화한지 28일이 지난 후에, 체중에 대한 간장 비는 2배 증가되고(p＜0.0001) 체중에 대한 좌심실 비는 이미 보고된 바와 같이 변화되지 않았다(Roth DA, et al., J. Clin Invest, 91:939-949, 1993).

실시예 3: 울혈성 심부전의 큰 동물 모델에서의 β-아드레날린작용성 신호화로서의 아데닐일시클라제의 역할

다음 데이터는 예로서 β-ASP 아데닐일시클라제의 양은 사람의 심장 기능 및 기능장애의 매우 전조가 되는 것이 기대되는 큰 동물 모델에서 이 경로를 통해 β-아드레날린작용성 신호화에 대한 제한을 사실 부과하는 것을 나타낸다.

실시예 3-1: 돼지에서의 심장 페이스화후 아데닐일시클라제 활성(cAMP 생성)

본 발명자는 사람 임상학적 비대된 심부전에 대해 매우 높은 적합도를 갖는 심부전 모델을 사용하여 심한 심부전을 갖는 돼지 및 정상 돼지로부터 좌심실 멤브레인에서의 아데닐일시클라제의 기능을 평가하기 위한 cAMP 생성을 검사하였다 (Roth DA, et al., J Clin Invest 91:939-949, 1993에 기재됨).

페이스화한지 단지 4일이 지난 후에, 이소프로테레놀-자극된 cAMP 생성은 좌심실 멤브레인에서 약간 감소되었다(p＜0.05). β-AR 매개된 자극과는 독립적으로 AC 활성의 인디케이터인 포르스콜린 자극된 cAMP 생성은 이 때 현저하게 영향을 받지 않았다.

반대로, 페이스화의 28일은 모든 AC 활성의 측정에서 실질적으로 감소되었다. 도 3(포르스콜린-자극된 cAMP 생성을 나타냄)에 나타낸 본 발명자의 결과는 이들 동물에서 심한 심부전과 관련된 β-ASP 아데닐일시클라제의 활성이 실질적으로 감소된다는 것을 나타내었다.

실시예 3-2: 심장 근세포 샘플에서의 AC 이소형태의 동정

RT-PCR은 성장한 돼지로부터 얻은 심장 근세포 샘플로부터 기대되는 AC의 크기에 대응하는 DNA 단편을 증폭하는데 사용하였다. DNA 단편은 역전사효소가 반응에서 제거되었을 때 없었다.

다양한 AC 특이적 프로브로 하이브리드형성한 후에, 서던 블롯은 성장한 돼지 근세포가 AC 이소형태 II, V 및 VI를 나타낸다는 것이 입증되었다.

실시예 3-3: 돼지 모델에서의 AC mRNA 발현

본 발명자는 정상 돼지 및 심부전이 있는 돼지에서 AC 이소형태(II, V 및 VI)의 mRNA 수준의 변화를 조사하였다.

페이스화를 한지 단지 4일이 지난 후에, 3가지 AC 이소형태의 mRNA 함량의 현저한 변화는 없었다.

반대로, 도 3에 나타낸 바와 같이, 심부전 모델에서 페이스화를 한지 28일이 지난 후에, AC_VImRNA는 현저하게 하향조절되고(p=0.002), 반면에 AC_II및 AC_V는 상대적으로 변화되지 않았다. 후자의 AC 이소형태에서의 변화는 이들 이소형태에 대한 mRNA에서 실질적 변화가 없는 단백질에서 발생할 수 있다는 것을 가능하게 한다.

포르스콜린 자극된 cAMP 생성은 심한 심부전이 간접적으로 존재할 때까지 상대적으로 변화되지 않는다는 본 발명자의 관찰은 AC 단백질 발현이 심장 기능장애의 초기 단계동안에 비교적 정상이라는 생각을 지지한다. 그러나, 데이터는 모든 AC 활성의 측정에서 실질적 감소, 및 보다 심한 심부전의 개시와 관련하여 AC_VI단백질 및 mRNA의 하향조절을 분명하게 나타내고 있다.

실시예 4: 울혈성 심부전의 큰 동물 모델에서의 β-아드레날린작용성 신호화 단백질로서의 β-AR 및 GRK 저해제의 역할

다음 실시예에서 기재하는 바와 같이, 본 발명자는 돼지 심부전 모델에서의 β-아드레날린작용성 신호화의 GRK 활성 및 β-아드레날린작용성 리셉터 단백질의 역할을 조사하였다.

실시예 4-1: 좌심실 β-아드레날린작용성 리셉터 및 G-단백질 함량

좌심실 기능 및 순환성 출혈에서의 변경에도 불구하고, 페이스화의 4일은 좌심실 β-AR 수의 현저한 변화 또는 자극성(Gsα) 또는 저해성(Giα₂) GTP-결합 단백질에서의 변화와 관련되지 않았다. 그러나, 페이스화의 4일은 Gsα로부터의 β-AR의 비커플링을 제안하고 있는, 고 친화성 아고니스트 결합(p＜0.01)을 나타내는 좌심실 β-AR의 비율이 감소되게 하였다.

심부전 모델에서 페이스화한지 28일이 지난 후에, 본 발명자는 Gsα 및 Giα₂둘다가 하향조절되었을 때 좌심실 β-AR 수가 실질적으로 하향조절되는 것을 관찰하였다(Roth DA, et al., J. Clin Invest, 91:939-949, 1993).

실시예 4-2: G-단백질 리셉터 키나제 활성

좌심실 호모게네이트의 세포질 및 멤브레인 분획 둘다를 칼럼 정제하고 로돕신의 광의존 포스포릴화는 GRK 활성을 측정하는데 사용하였다.

페이스화한지 4일이 지난 후에, 나타낸 동물은 페이스화한지 24일이 더 지난 후에 더 증가되는 것으로 보이지 않는 좌심실 GRK 활성에서 증가된다(표 2). 심근의 GRK 활성의 실질적 부분(40)은 사르콜레마와 관련되고, 전체 GRK 활성은 좌심실 기능장애의 개시와 관련하여 증가되지만 GRK 활성의 세포분포는 변경되지 않았다.

좌심실 G-단백질 리셉터 키나제활성

	콘트롤	4d	28d	p(ANOVA)
세포질	21±4	30±8a	28±2a	0.04
멤브레인	15±2	18±2	21±3b	0.005
전체	35±5	48±9b	49±2b	0.01
세포질내	59±3	63±12	57±7	0.52
좌심실 멤브레인에서의 G-단백질 리셉터 키나제 활성. 16마리의 동물로부터의 데이터; 그룹에는 페이스화하지 않은 정상 동물(콘트롤, n=5), 페이스화한지 4일이 지나 유발되는 온화한 심부전을 가진 동물(4d; n=5) 및 페이스화한지 28일이 지나 유발되는 심한 심부전을 가진 동물(28d, n=6)이 있다. 값은 평균±1SD이고 포함된32P(fmol/mg/분)를 나타낸다. 편차의 분석(반복된 측정값)은 페이스화 경과가 특이적 생존력에 영향을 끼치는지의 여부를 측정하는데 사용하였다. 따라서 시험은ap≤0.05;bp＜0.01(콘트롤)의 본페로니 보정에 의한 학생 t-시험으로 수행하였다.

실시예 4-3: G-단백질 리셉터 키나제₂단백질 함량

정제된 소 GRK₂로 공동 이동하는 80kD로 측정된 밴드는 GRK₂항체로 동정되었다. LV 전체 GRK₂단백질 함량은 온화한 심부전(4d 페이스화)으로 변화되지 않으나 심한 심부전이 있는 동물로부터 LV에서 감소되는 경향이 있었다(콘트롤: 1.37±0.17du/μg; 4d: 1.58±0.34du/μg; 28d: 1.02±0.07du/μg; p＜0.02 ANOVA). 그러나, 이러한 분석은 통계학적으로 현저한 단일 그룹 평균 비교는 4d 대 28d (p＜0.03)인 것을 나타냈다. GRK₂농도는 상청액에서는 감소되었으나(p＜0.04) 심한 심부전에서의 LV 호모게네이트의 펠릿 분획에서는 감소되지 않았다.

실시예 4-4: G-단백질 리셉터 키나제₅단백질 함량

GRK₅를 동정하는 68kD에서 이동하는 밴드는 GRK₅항체를 사용하여 검출하였다. LV 전체 GRK₅단백질 함량은 온화한 심부전(4d 페이스화)에 의해 증가되고 심한 심부전에서 더 증가되었다(콘트롤: 0.62±0.16du/μg; 4d: 0.97±0.16du/μg; 28d: 1.33±0.25du/μg; p=0.0004 ANOVA; 콘트롤 대 4d, p＜0.04; 콘트롤 대 28d, p＜0.001).

실시예 4-5: G-단백질 리셉터 키나제₂mRNA 함량

3.8kb로 측정되는 mRNA 종을 GRK₂프로브로 동정하였다. 2.4kb의 다른 종도 또한 기록하였다. LV GRK₂mRNA 함량은 온화한 심부전(4d 페이스화)에 의해서는 변화되지 않았으나 심한 심부전이 있는 동물로부터 LV에서 감소되었다(콘트롤: 67±11du; 4d: 66±16du; 28d: 45±13du; p=0.02 ANOVA; 콘트롤 대 28d, p=0.02; 4d 대 28d, p＜0.03). 본 발명자는 PCR 또는 노던 블롯팅중 어느 한가지로 GRK₃(βARK₂) 발현을 검출할 수 없었다.

실시예 4-6: G-단백질 리셉터 키나제₅mRNA 함량

3.0kb로 측정된 mRNA를 GRK₅프로브로 동정하였다. LV GRK₅mRNA 함량을 페이스화 개시의 4d내에서, 28d에 대해 지속된 발견에서 상향조절되었다(콘트롤: 54±4du; 4d: 110±28du; 28d: 96±17du; p=0.001 ANOVA; 콘트롤 대 4d, p=0.003; 콘트롤 대 28d, p=0.01).

실시예 4-7: β-아드레날린작용성 신호화 단백질(β-ASP)로서의 β-AR 및 GRK 저해제

심부전의 큰 동물 모델에서 얻어진 결과는 심부전에서의 감소된 β-AR 반응성이 심근 β₁-AR 및 β₁-AR mRNA 수준의 선택적 하향조절과 관련되고; β₂-AR 발현 및 mRNA 함량이 변화되지 않고(예를 들면, Bristow MR et al., J Clin Invest 92:2737-2745, 1993; Ping P, et al., Am J Physiol, 267:H2079-H2085, 1994; Ungerer M, et al., Circulation, 87:454-461, 1993 참조); 잔존 β-AR이 고 친화성 아고니스트 결합에서의 감소에 의해 반영되는 바와 같이(예를 들면, Bristow MR, et al., Mol Pharm, 35:295-303, 1989; Bristow MR, et al., J Clin Invest, 92:2737-2745, 1993 참조), Gs(AC 자극에 의해 리셉터 활성에 관련하는 자극성 GTP-결합 단백질)로부터 비커플링되는 것을 확인하였다. CHF에서의 β-AR 비커플링에 대한 메카니즘은 확실하게 확립되지 않았다. β₂-AR로 세포에서 주로 연구된 GRK는 아드레날린작용성 활성 후에 β₂-AR을 포스포릴화하고(Hausdorff WP, et al., FASEB J, 4:2881-2889, 1990; Inglese J, et al., J Biol Chem, 268:23735-23738, 1993), CHF에서 발생하는 바와 같이 지속된 교감신경 활성의 세팅에서 β-AR 탈감에서 역할을 수행할 수 있다. 아고니스트에 의해 β₂-AR을 자극시킨 후에, GRK₂는 세포질로부터 사르콜레마로 전좌하고, β₂-AR을 포스포릴화하고, 이로써 β₂-AR 및 Gs를 비커플링하여 신호를 약화시킨다(Hausdorff WP, et al., FASEB J, 4:2881-2889, 1990; Inglese J, et al., J Biol Chem, 268:23735-23738, 1993). β₁-AR의 GRK 매개된 포스포릴화에 대한 역할은 GRK₂및 GRK₅둘다를 매개할 수 있는 포스포릴화에 대해 최근에 입증되었다(Freedman NJ, et al., J Biol Chem, 270:17953-17961, 1995; Koch WJ, et al., Science, 268:1350-1353, 1995). 또한, β₁-AR 활성(비소프롤올 처리)의 만성적인 감소는 GRK 활성이 하향조절되고 아드레날린작용성 신호화를 증가시키고 아드레날린작용성 활성정도는 GRK 발현에 영향을 끼칠 수 있다는 것이 제안되었다(Ping P, et al., J Clin Invest 95:1271-1280, 1995). 최근의 연구는 GRK 활성이 사람 심부전의 좌심실 호모게네이트의 가용성 분획에서 증가된다고 제안되었다(Salomon Y, et al., Anal Biochem, 58:541-548, 1974; Ungerer M, et al., Circ Res, 74:206-213, 1994).

돼지 심부전 모델에서의 GRK 활성에 대한 본 발명자의 발견은 운게러 등(Ungerer M, et al., Circulation, 87:454-461, 1993)에 의해 보고된 바와 좌심실 GRK 활성이 좌심실의 기능장애를 증가시킨다는 면에서 유사하다. 그러나, 심부전의 세팅중 GRK 발현에 대해 상당히 새로운 몇가지 양태의 데이터가 있다. 먼저, 이전의 보고와는 다르게, 본 발명자는 가용성 및 침전 분획 둘다에서 GRK 활성을 측정하였다. 심부전이 GRK 활성의 사르콜레마/세포질 분포에 영향을 끼치지 않는 반면, 심한 심부전은 두 분획에서 증가된 심근 GRK 활성과 관련되어 있다. 두 번째의 새로운 발견은 전체 GRK 활성 증가가 β-AR 수, G-단백질 함량, 또는 AC 이소형태 발현 또는 촉매 활성의 변경 전에 일어나는 심부전에서의 초기 사건이라는 것이다. 증가된 GRK 활성이 포스포릴화와 Gs 및 β-AR을 비커플링하는데 사용될 수 있는 정도로, 본 발명자는 증가된 GRK 활성의 잠재적인 생화학적 상호관계를 입증하였다. 고 친화성 아고니스트 결합을 나타내는 β-AR의 감소된 수와 관련하여, 본 발명자는 증가된 전체 GRK 활성과 일시적으로 상관되는 cAMP의 감소된 호르몬 자극을 발견하였다. 세 번째로, 전체 GRK₅단백질 및 mRNA 함량이 이 초기 시점에서 증가되고 이들 증가는 심한 심부전에서 지속되었다. 이들 데이터는 증가된 심근 GRK 발현이 심부전에서 아드레날린작용성 신호화의 다른 변화보다 먼저이므로 발병에서 중요한 초기 사건이라고 보이는 생각을 지지한다. 이전의 연구는 외식된 기능장애의 사람 좌심실에서의 증가된 GRK 활성 및 증가된 GRK₂mRNA(PCR을 사용)를 발견하였다(Ungerer M, et al., Circulation, 87:454-461, 1993). 그러나, 본 발명자는 노던 블롯팅에 의해 감소된 LV GRK₂mRNA 수준을 발견하였다. 사람 연구에 대한 현재의 연구에서 LV GRK₂mRNA 수준에 관한 모순은 mRNA, 사용된 다른 모델 또는 사람연구에서 참된 콘트롤 물질을 얻는데의 어려움을 평가하는데 채택된 다른 방법을 반영할 수 있다. 본 발명자는 GRK₅가 인용된 보고에서 조사되지 않은 것에 주의하고 있다. 본 발명자는 심한 심부전에서의 GRK₂에 대한 역할을 배제하지 못하는 한편, 이 데이터는 GRK₅가 보다 중요한 역할을 수행할 수 있다는 생각을 지지한다.

증가된 GRK 활성은 온화한 심부전이 있는 동물로부터 LV 멤브레인의 가용성 분획에서 검출하고, 반면에 GRK₂및 GRK₅단백질 함량은 가용성 분획에서 현저하게 증가되지 않았다. 이것은 효소학적 활성 및 단백질 함량 사이의 상이함을 나타내고, 또는 면역블롯팅 연구에 대한 효소학적 분석에 사용된 멤브레인 제조에서의 단백질 분포의 방법적 차이를 반영할 수 있다.

현재의 연구는 처음에 심근 GRK₅단백질 및 mRNA 함량이 온화한 및 심한 심부전에서 상향조절되기 쉽다는 것을 제공한다. 이 이론에 국한되는 것을 원하지 않으므로, 이 데이터는 GRK₅의 증가된 발현은 이들 임상학적 상태에서 관찰된 증가된 GRK 활성에 대해 책임이 있을 수 있다는 생각을 지지한다. 어떤 경우에든, 현재의 데이터는 증가된 좌심실 GRK 발현이 심부전 전개동안 초기단계에서 감소된 아드레날린작용성 신호화에 기여한다는 가설을 지지한다.

실시예 5: 전형적인 β-ASP의 예로서의 아데닐일시클라제의 유전자 운반을 위한 벡터의 구조화

본 발명에서 사용하기 위한 유전자 운반 벡터의 구성의 1예로서, 본 발명자들은 상기한 바와 같이 헬퍼에 영향을 받지 않는 복제결손 바이러스 벡터를 사용하여 구조물을 제조하였다. 구체적으로, 이 실시예에서, 본 발명자들은 사람 아데노바이러스-5 시스템에 근거한 복제결손 아데노바이러스 구조물의 생성을 예시한다(예를 들면, McGroy WJ, et al., Virology 163: 614-617, 1988 참조).

전형적인 β-아드레날린작용성 신호화 단백질(β-ASP)의 예로서, 아데닐일시클라제 단백질, 구체적으로는 아데닐일시클라제 이소형태 VI(AC_VI)를 초기에 선택하였다. 그러므로, AC_VI(β-ASP의 예로서) 또는 lacZ(β-갈락토시다제를 코딩하는 검출가능한 표지유전자의 예로서) 중 1가지를 포함하는 벡터를 구조화하였다. 재조합형 아데노바이러스(이들 "제 1 세대" 벡터에 근거한)를 생성하는데 사용된 시스템은 트랜스유전자의 크기가 약 5kb를 초과하면 증가한다고 여겨지는 패키징 제약조건을 부과한다. CMV 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 신호(함께 대략 1kb를 이루는)와 같은 제어요소의 경우에는, 트랜스유전자 자체(즉, 추가적인 제어요소가 없이)는, 따라서, 약 4kb 미만인 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명자들은, 비록 더 작은 트랜스유전자가 바람직하더라도, 이러한 "제 1 세대" 벡터에서 조차도, 실질적으로 더 큰 트랜스유전자가 사용될 수 있다는 것을 또한 보였다. 예를 들면, 실시예 5-1에 기술된, β-ASP의 첫 번째 전형적인 예에서, 본 발명자들은, 실질적으로, 이종 CMV 프로모터(대략 790bp) 및 SV40 폴리아데닐화 신호(대략 230bp)와 함께, 쥐의 아데닐일시클라제 유전자(대략 5748bp)로부터 전사된 영역 전체를 사용하였다. 아래에 상세히 기술하는 바와 같이, 이러한 트랜스유전자(제어요소에 대해 6.7kb를 초과하여 포함하는)는, 그럼에도 불구하고, 포함될 수 있고 이러한 제 1 세대 벡터와 함께 효과적으로 사용될 수 있다는 것을 보였다.

그러나, 이러한 특정한 벡터의 공지된 패키징 제약조건의 관점에서, 그리고 β-ASP의 다른 전형적인 예로서, 더 짧은 β-ASP 트랜스유전자를 생성하기 위해서 번역되지 않은 전사영역이 결실되고 변경된 아데닐일시클라제 유전자를 구조화하였다. 실시예 5-2에서 아래에 기술된 예시적인 실시예에서, AC_VI유전자로부터의 3'-비번역 영역을 제거하였고, 결과되는 구조물을, 여기에서 기술하는 바와 같이, 트랜스유전자를 심장으로 운반하기 위한 벡터 내에 포함시켰다. 명확히 알 수 있는 바와 같이, 트랜스유전자를 절단(Ad 또는 AAV와 같은 크기가 제약된 바이러스 벡터의 경우에)하는 것이 바람직한가는, 사용된 제어요소의 선택뿐만 아니라 원래의 유전자의 길이에 따라 부분적으로 달라진다. 총 삽입크기가 약 5kb를 초과하는 Ad의 경우에는, 트랜스유전자는 바람직하게는 3'-비번역 영역 내에서 절단되어 삽입이 더 짧아지도록 할 수 있다. 역시 명확히 알 수 있는 바와 같이, 절단의 바람직한 범위는 삽입크기에 따라 달라지지만, 전형적으로는 적어도 약 100bp, 더욱 바람직하게는 적어도 약 500bp, 더더욱 바람직하게는 적어도 약 1000bp(구체적으로는, 총 삽입크기가 약 5kb를 더욱 초과하는 경우에)이다. 본 발명자들은 전체 3'-비번역 영역은 AC_VI이소형태로부터 용이하게 결실되어, 실질적으로 더 짧은 트랜스유전자가 될 수 있다. 제 1 세대 AAV 벡터는 또한, 삽입이 약 5kb를 현저히 초과하면, 크기가 제약되고 효율이 감소한다. 그러나, 이러한 그리고 그러한 다른 벡터를 위해, "제 2 세대" 유도체는 트랜스유전자 패키징을 위한 추가적인 공간을 제공할 수 있다. 각종 비바이러스 벡터뿐만 아니라 다른 바이러스 벡터는 실질적으로 더 큰 삽입을 수용하는데 사용될 수 있다.

실시예 5-3은 사람 아데닐일시클라제 유전자를 코딩하는 서열의 동정을 기술한다. 여기에서 기술되는 바와 같이, 사람 DNA 라이브러리를 스크리닝(동종 포유동물의 유전자로부터의 프로브를 사용하여)함으로써 그러한 β-ASP 트랜스유전자가 얻어질 수 있고, 그러한 사람 β-ASP 트랜스유전자는 본 발명의 문맥 내에서 유용하게 사용될 수 있다. 구체적으로는, 치료 목표가 사람 심장일 경우에, 사람 β-ASP 트랜스유전자를 사용하여 추가적인 이점(사람이외의 단백질에 대한 숙주 반응의 가능성을 더욱 최소화하는 것뿐만 아니라, β-아드레날린작용성 신호화 경로의 다른 성분과 잠재적으로 긴밀히 협력하는 것을 포함하는)을 제공할 수 있다고 기대된다. 사람 β-ASP 트랜스유전자의 전형적인 예의 단리 및 서열화를 아래의 실시예 5-3에서 기술된다.

유전자 코딩 β₁-아드레날린작용성 수용체(β₁-AR) 및 GRK 저해제를 포함하는 기타 예시적인 β-ASP 트랜스유전자는 실시예 6 및 실시예 7에 기술되어 있다.

실시예 5-1: 전체길이 AC_VIcDNA를 사용하는 β-ASP 트랜스유전자의 생성

β-ASP 트랜스유전자의 제 1 트랜스유전자의 생성을 위해, 본 발명자들은 쥐 AC_VI(Yoshima M 및 Cooper DM, Proc Natl Aca Sci(USA) 89: 6716-6720, 1992에 의해 보고되어 있고, 이 논문에서 "pAC-VI"로 알려지지 않고 "pAC-V"로 불린, 쥐 NCB-20 세포로부터의 Ca(2+)-저해성 AC; 또한 Krupinski, J., et al., J. Biol. Chem. 267:24858-24862, 1992 참조)를 코딩하는 cDNA를 사용하였다. 전체길이 AC_VIcDNA를, 바이러스 복제를 위해 필수적인 E1A 및 E1B 유전자가 결실된 부분적인 아데노바이러스 서열에 의해 인접된 SV40 및 CMV 프로모터를 포함하는 플라스미드 ACCMVPLPA(J Biol Chem 267:25129-25134, 1992)의 폴리링커로 클로닝하였다. 결과되는 플라스미드를, 추가적인 4.3kb 삽입물뿐만 아니라 전체 사람 아데노바이러스 5 게놈을 포함하는 플라스미드 JM17(Giordano, et al. Nature Medicine 2: 534-539, 1996)을 갖는 사람 293 세포 내로(리포펙션에 의해) 공동트랜스펙팅하였다.

동종 레스큐 재조합으로 인해 E1A/E1B 서열이 없는 상태에서 트랜스유전자(AC_VI또는 lacZ)를 포함하는 재조합형 아데노바이러스 벡터가 생성된다(도 1에 예시됨). 이들 재조합체들은 정상 포유동물 세포 내에서 복제되지 않았지만, E1A/E1B로 형질전화된(그리고 그 결과로서 이 필수적인 복제 생성물을 트랜스 상태로 제공한) 사람 293 세포 내에서 증식될 수 있다.

트랜스펙팅된 사람 293 세포를, 대개 트랜스펙팅된지 10-14일 후에 발생하는 세포변성효과가 일어났는지를 판정하기 위해 모니터링하였다. 성공한 조합체를 동정하기 위해서, 세포변성효과를 보이는 평판으로부터의 세포 상청액을 56℃에서 60분 동안 프로테이나제 K(50mg/ml, 0.5나트륨도데실술페이트 및 20mM EDTA를 포함함)로 처리한 후, 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침강반응을 수행하였다. 그리고나서, 삽입물을 증폭시키기 위해 CMV 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 서열에 대해 상보적인 프라이머와, 부수적으로 아데노바이러스 서열을 증폭하도록 디자인된 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 성공한 재조합형 바이러스 벡터를 동정하였다(Biotechniques 15:868-872, 1993 참조).

그리고나서, 성공한 재조합형 바이러스 입자를 2회 플라크정제하였다. 바이러스 스톡을 10¹⁰내지 10¹²개의 바이러스 입자의 역가범위까지 사람 293 세포 내에서 더 증식시키고, 다음의 표준과정을 사용하기 전에 이중 CsCl 구배 원심분리법에 의해 정제하였다. 간단히 말하자면, 세포는 80합류점에서 감염되고, 36-48시간에서 수확하였고; 냉동-해동 사이클 후에, 표준원심분리법에 의해 세포 단편을 수거하고, 이중 CsCl 구배 초원심분리법(불연속 1.33/1.45 CsCl 구배; 5mM Tris, 1mM EDTA(pH 7.8); 90,000×g(2 시간), 105,000×g(18 시간) 중에서 제조된 세슘)에 의해 바이러스를 더 정제하였다.

생체 내에서 주사하기 이전에, G25 Sephdex와 같은 Sepharose 칼럼을 통해 겔여과함으로써 바이러스 스톡을 전형적으로 탈염하였다. 결과되는 바이러스 스톡은 10¹⁰내지 10¹²개의 바이러스 입자 범위의 최종 바이러스 역가를 가졌다. 바이러스 조제물은 고도로 정제되어 있었고, 근본적으로 복제성 바이러스가 전혀 존재하지 않았다(벡터가 사람 숙주 293 세포 내에 트랜스펙팅된 이후에 세포변성효과가 없음으로 인해 결정된 바와 같음).

실시예 5-2: 절단된 아데닐일시클라제 유전자를 사용하는 제 2 β-ASP의 생성

다른 예시적인 β-ASP 트랜스유전자로서, 내부에서 정상 전사의 비번역 영역이 제거되어 더 짧은 β-ASP 트랜스유전자가 생성된, 변경된 아데닐일시클라제 유전자를 구조화하였다. 구체적으로는, 근본적으로, AC_VI구조물로부터 3'-비번역 영역을 제거하고, 결과되는 절단된 트랜스유전자를 유전자 전달을 위한 바이러스 벡터 내에 포함시켰다.

플라스미드 구조화 및 재조합형 아데노바이러스 제조. 3'-비번역 영역을 갖지 않는 쥐 AC_VIcDNA를 다음과 같이 구조화하였다. 5'단부에 Xho I 부위를 갖는 AC_VI의 3'부분을 포함하는 부단편을 2종의 PCR 프라이머를 사용하여 생성하였다.: 즉, 염기 2500-2521에서 AC_VIcDNA로 어닐링되는 AC_VIPX; 그리고 AC_VI의 3'단부로부터의 서열 및 사람 인플루엔자 적혈구응집소로부터의 서열을 포함하는 ACVIp3'HA이다. 3'단부의 프라이머 내에서 디자인된 제한효소 Xho I 및 Xba I로 PCR 생성물을 소화시켰다. AC_VI단편(염기쌍 -92 내지 +2500)의 5'부분을 전체길이 cDNA의 Eco RI 및 Xho I 소화에 의해 얻고(상기한 바와 같음), 아가로스 겔 상에서 단리하였다. 그리고나서, 3개 분자의 라이게이션에 의해 2개의 AC_VI단편을 Eco RI-Xba I 소화된 아데노바이러스 벡터(pAd5CI, Dr.Swang Huang, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA에 의해 제공됨)로 서브클로닝하였다. pAd5/CI 벡터는, 시토메갈로바이러스 즉시-초기 증폭제/프로모터 영역(CMV 프로모터), 키메라 인트론 그리고 pCI 플라스미드 DNA(Promega, Madison, WI)로부터 유도되는 멀티클로닝 부위를 포함한다. 이것은 또한 소 성장호르몬 폴리아데닐화(폴리 A) 서열 및 부분적인 사람 아데노바이러스-5 서열을 포함한다. 상기한 바와 같이, EcoRI-XbaI 소화된 플라스미드 내로 2개의 AC_VI단편이 도입되면 도 1B에 도시된 플라스미드 pADV5/AC_VI이 생성된다(약기: AC VI--아데닐일시클라제 VI; CMVp--시토메갈로바이러스 즉시-초기 증폭제/프로모터; HA-태그--인플루엔자 바이러스의 적혈구응집소-태그; BGH-폴리A--소성장호르몬-폴리A; Adv5--아데노바이러스5).

상기한 바와 같이 다음의 과정에서, E1 영역을 제외한 아데노바이러스 게놈을 포함하는 pJM17로 AC_VI함유 벡터를 사람 태아의 신장세포라인(H293)으로 코트랜스펙팅시켰다. 재조합 후에, 플라크를 선택하고 H293 내에서 확장시켰다. H293 세포는 아데노바이러스 E1으로 형질변환되었고, 그러므로 이 바이러스 전사인자를 트랜스 상태로 제공한다. RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 AC_VI의 발현을 검사하였다. 바이러스를 염화세슘 초원심분리에 의해 정제하고, 상기한 바와 같이 PBS와 평형인 Sephadex G-25를 통한 칼럼여과에 의해 탈염하였다. OD₂₆₀에서 광학농도계에 의해 바이러스 농도를 측정하였다. 아가로스-DMEM 배지로 덮인 H293 세포를 사용하는 플라크 적정에 의해 플라크형성 단위(pfu)를 분석하였다.

AC_VI발현 클론의 동정. AC_VI를 발현한 아데노바이러스 클론을 동정하기 위해서, H293 세포 내의 내인성 AC_VI가 아닌 트랜스유전자 AC_VI로 하이브리드형성하는 1쌍의 특정한 프라이머(AC_VIPX 및 AC_VIp3'HA)를 사용하는 RT-PCR에 의해 16개의 클론을 스크리닝하였다. 312-bp 및 200-bp 단편을 생성하기 위한 제한효소 Apa I에 의한 소화에 의해 512-bpRT-PCR 생성물을 확인하였다. 16개의 클론 중 3개가 AC_VImRNA를 발현하였다. cAMP 생성에서의 배 증가로서 발현된 3개의 클론 모두는 이소프로테레놀에 의한 자극에 응답하여 증가된 cAMP를 보였다(클론 1, 22배 증가; 클론 2, 11배 증가; 클론 3, 13배 증가). 실시예 8-2에 기술된 바와 같이 심근세포를 사용하는 추가적인 분석을 위해 클론 1을 선택하였다.

실시예 5-3: 사람 아데닐일시클라제 유전자를 사용하는 β-ASP 트랜스유전자의 생성

상기한 바와 같이, β-ASP 유전자는 많은 포유동물의 조직 내에 존재하고, 서로 다른 이소형태는 전형적으로 특정한 조직형태 내에 주로 존재한다. 상기한 바와 같은 아데닐일시클라제의 경우에는, 심장 조직 내에 이소형태 II, V 및 VI가 주로 존재하는 경향이 있다. 그러한 유전자들은 또한 서로 다른 포유동물들 사이에서, 특히 심장과 같은 특정한 조직에서 발견되는 이소형태에 대해 상당히 현저한 서열보존도를 보이는 경향이 있다. 따라서, DNA 하이브리드형성 및 관련된 분자생물학적 기법은 본 발명의 문맥에서 사용하기 위한 추가적인 β-ASP 트랜스유전자를 동정하는데 사용할 수 있다.

예시에 의해, 사람 AC_VI유전자를 얻는 수단으로서 쥐 AC_VIcDNA 단편과 동종인 사람 심장 cDNA 라이브러리 내에서 클론을 동정하였다. 따라서, 사람 서열을 동정함으로써 여기에서 기술하는 방법에 따라서 해당 사람 β-ASP 트랜스유전자를 사용하는 것이 가능하다. 간단히 말하자면, 상기 참고문헌에 기술된 바와 같은 표준적인 분자생물학적 기법을 사용하여 쥐 AC_VIcDNA로부터 얻은 약 1.9kb의 SphI 단편으로 사람 심장 cDNA 라이브러리(상업적으로 입수가능한 Clontech제, #HL3026b)를 스크리닝하였다. 1차 스크린에서 6개의 포지티브 클론을 동정하였고, 2차 및 3차 스크린에서 확인하였다. 이 클론들 중 3개(1, 4 및 5로 표시된 클론)를 서열화를 위한 벡터로 서브클로닝하였다. 본 발명자들은 "블루스크립트" 벡터 pBS-SK(상업적으로 입수가능한 Stratagene제)를 사용하였다. T3 및 T7 프라이머를 사용하여 서열화의 제 1 회를 수행하고나서, 후속 서열화를 위해 내부 프라이머를 사용하였다. 3개의 클론 모두 마우수를 포함하는 다른 종의 AC_VI유전자와 매우 유사한 서열을 함유하였다. 잔류하는 서열을 함유하는 중복클론을 동정하기 위해 3개의 클론 및 그것의 부단편을 사용하였다. 중복클론으로부터 도 12A에 나타낸 누클레오티드 서열(SEQ ID NO:_)을 얻었고, 이것은 사람 AC_VI의 추정된 3.4kb 코딩 서열의 2kb 초과에 상당한다. -X-는 나타낸 서열 내의 약 0.5kb의 틈을 나타낸다. 도 12B는 도 12A에 나타낸 누클레오티드 서열에 상당하는 아미노산 서열(SEQ ID.NO:_)를 나타낸다. 표준적인 재조합형 DNA 방법론을 사용하여, 도 12A에 제공된 서열정보로부터, 전체길이 사람 AC_VI를 코딩하는 완전한 누클레오티드 서열 및 그것의 변이체를 용이하게 얻을 수 있다.

본 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 하이브리드형성과 같은 기법을 사용하여, 긴밀하게 연관된 서열들을 포함하는 폴리누클레오티드를 유사하게 얻을 수 있다. 그러한 서열들은, 예를 들면, 적어도 약 90의 전체 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 95의 전체 서열 동일성을, 더욱 바람직하게는 적어도 99의 전체 서열 동일성을 보이는 서열을 포함하고, 누클레오티드 서열은 도 12 A 내의 SEQ ID NO:_에 나타낸 서열을 포함한다. 따라서, 고긴축도에서 도 12A에 나타낸 SEQ ID NO:_의 누클레오티드 서열을 갖는 폴리누클레오티드로 하이브리드형성되는 단리된 폴리누클레오티드를 표준적인 분자생물학적 기법에 의거해 용이하게 얻을 수 있다. 또한, 폴리누클레오티드에 의해 코딩된 단리된 폴리펩티드를 얻기 위해, 이 폴리누클레오티드들을 사용할 수도 있다. 본 발명의 문맥에서 사용된 바와 같이, "단리된 폴리펩티드" 또는 단백질은, 생체 안에서의 단백질과 본래 관련이 있는 모든 세포 오염물질 및 성분으로부터 실질적으로 분리된 폴리펩티드 또는 단백질이다. 이 구절은 본래의 발생 환경으로부터 제거된 폴리펩티드를 포함하고, 재조합형 폴리펩티드 및 화학적으로 합성된 유사체 또는 이종 시스템에 의해 생물학적으로 합성된 유사체를 포함한다. "단리된 폴리누클레오티드"를 유사하게 정의한다. 변이체에는 대립 변이체가 포함될 것이다. 핵산 또는 유전자의 문맥 내에서 "대립 변이체"는 개체군 내에 1가지 형태 이상으로 존재하는 유전자의 다른 형태(대립유전자)이다. 폴리펩티드 수준에서, "대립 변이체"는 일반적으로 단지 1개, 또는 기껏해야, 몇 개의 아미노산 치환에 의해 서로 다르다. 또한, 재조합형 생물학적 기법에 의해 생성된 유전자의 합성 또는 "비천연" 변이체도 사용할 수 있다. 바람직하게는, 변이체 내에서 동일하지 않는 아미노산 잔류부는 보존성 이미노산 치환에 의해 달라지는 것이 좋다. "보존성 아미노산 치환"은 유사한 측쇄를 갖는 잔류물들의 상호가변성을 나타낸다. 예를 들면, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 글리신, 알라닌, 발린, 로이신 및 이소로이신이고; 지방족 히드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 세린 및 트레오닌이고; 아미드함유 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 리신, 아르기닌 및 히드티딘이고; 황함유 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 시스테인 및 메티오닌이다.

AC_VI폴리누클레오티드 코딩 변이체는 또한 침묵성 누클레오티드 치환을 포함한다. "침묵성" 치환은 치환된 누클레오티드는 단백질 수준에서의 아미노산 변화를 야기하지 않는다는 것을 의미한다. 코딩된 아데닐일시클라제 폴리펩티드의 효소 활성에 영향을 미치지 않는 영역 내로 더욱 실질적인 누클레오티드 변화를 도입할 수 있다. 그러한 많은 폴리누클레오티드는, 본 분야에 공지된 일상적인 방법에 의해 시험할 수 있는 아데닐일시클라제 효소 활성을 유지하는 폴리펩티드를 코딩할 것이다. 폴리누클레오티드 하이브리드형성을 위한 "고긴축성" 조건은, 예를 들면, J. Sambrook et al., supra에 개시되어 있고, 전형적으로 약 100 누클레오티드를 초과하는 신장도에 대해 실질적인 전체 서열 동일성(전형적으로 90를 초과하고, 더욱 바람직하게는 95를 초과함)을 갖는 서열만이 하이브리드형성된 상태를 유지하도록 염 농도 및 온도가 증가되는 조건을 나타낸다.

당업자들이 이해할 수 있는 바와 같이, 사람 AC_VI폴리누클레오티드 서열(약 15-50 누클레오티드의 차수로 단편을 포함함)을 본래의 폴리펩티드의 이소형태 및 변이체를 동정 및 단리하기 위한 프라이머 또는 프로브로 사용할 수 있다.

앞의 실시예의 폴리누클레오티드에 의해 코딩된 단리된 폴리펩티드는, 예를 들면, 적어도 300 아미노산 잔류물이 도 12B에 나타낸 SEQ ID NO:_ 내의 필적할 만한 길이의 서열과 적어도 95(바람직하게는 99를 초과하여) 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.

실시예 6: β-ASP의 제2형태로서의 β-아드레날린작용성 수용체 단백질(β₁-AR)의 유전자 운반을 위한 벡터의 구조화

상기한 바와 같이, 본 발명에서 사용하기 위한 다른 바람직한 β-아드레날린작용성 신호화 단백질로는 β-아드레날린작용성 수용체 단백질, 특히 β₁-아드레날린작용성 수용체(β₁-AR), 그리고 GRK 저해제(상기한 바와 같이 간접적으로 β-AR 활성을 증폭시킬 수 있는)를 들 수 있다.

유전자 운반 벡터는 앞의 실시예에서 기술된 것과 같은 기법을 사용하여 용이하게 생성할 수 있는 추가적인 β-ASP들을 코딩하는 트랜스유전자를 포함한다.

예시하기 위하여, 본 발명자들은 사람 β-아드레날린작용성 수용체를 발현하는 재조합형 복제결손 아데노바이러스 벡터를 구조화하였다. β-AR의 전형적인 예로서, Frielle, et al., PNAS(USA) 84: 7920-7942, 1987에 기술되고 서열화된 바와 같이 사람 β₁-AR(약 1.8kb)을 코딩하는 전체길이 cDNA를 사용하였다.

간단히 말하자면, 앞의 실시예에서 기술된 기법을 사용하여 β₁-AR cDNA 단편(pSP65의 EcoRI 부위로 클로닝된)을 E1이 결실된 재조합형 사람 아데노바이러스-5 벡터 내에 삽입하고, 이로써 바람직한 제 2 β-ASP(즉, β-아드레날린작용성 수용체 단백질)을 코딩하는 유전자의 운반을 위한 재조합형 벡터를 생성하였다.

실시예 7: β-ASP의 제 3 형태로서의 GRK 저해제의 유전자 운반용 벡터의 예시적인 구조화

본 발명에서 사용하기 위한 β-아드레날린작용성 신호화 단백질의 또다른 예시적인 예는 G단백질 수용체 키나제 저해제(GRK 저해제)이고, 이것은 β-AR 활성을 간접적으로 증폭하고, 따라서 β-아드레날린작용성 응답을 증폭하는데 사용할 수 있다.

다양한 GRK 단백질의 기능성 키나제 도메인을 동정하고(그리고 관련된 GRK 단백질 내의 해당 도메인을 상동관계에 의해 동정할 수 있음), 돌연변이는 단지 손상 키나제 기능성(표준적인 기법을 사용하여 시험할 수 있는)만을 필요로하기 때문에, 다양한 GRK 저해제를 용이하게 제조할 수 있다. 예시를 위하여, "β-ARK1-소형유전자(Koch, et al., Science 268:1350-1353, 1995)를 위해 기술된 바와 같이 구조화할 수 있거나, 또는 유사한 구조물(GRK를 돌연변이화하여 수용체 결합 활성을 저해시키지 않으면서 키나제 기능을 효과적으로 없애거나 손상시키는)을 사용할 수 있다.

간단히 말하자면, 앞의 실시예에 기술된 기법을 사용하거나, 또는 본 분야에 공지된 다른 벡터를 사용하여, GRK 저해제를 코딩하는 DNA 단편을 E1이 결실된 재조합형 사람 아데노바이러스-5 벡터 내에 삽입할 수 있다.

실시예 8: 세포배양물 내에서의 신생 쥐 심실근세포를 사용하는 β-ASP 유전자 전달 및 발현을 위한 벡터 구조물의 신속한 스크리닝

β-아드레날린작용성 신호화 단백질을 세포배양물 내에 유지된 심실세포로 운반하는 벡터의 능력을 조사함으로써 β-ASP 유전자 전달 벡터를 초기에 시험할 수 있다. 따라서, 그러한 세포배양물 조사는, 발현가능한 트랜스유전자를 여기에서 예시되는 것과 같은 특정 형태의 세포로 운반할 수 있는 능력에 대해 추정되는 유전자 전달 벡터(예를 들면, β-ASP 트랜스유전자 및 프로모터의 특정 조합을 가짐)를 스크리닝하는데 유용할 수 있다.

아래에 예시되는 바와 같이 유전자 운반 및 유전자 발현을 용이하게 그리고 신속하게 정량화할 수 있도록 표준적인 검출가능한 표지유전자(lacZ와 같은)를 사용하여, 그러한 스크리닝의 제 1 회를 편리하게 수행할 수 있다.

그리고나서, 제 1 회 "시험" 트랜스유전자(예를 들면, 검출가능한 표지유전자)를 효과적으로 운반하고, 발현시킨 벡터를, 본 발며에 따라서 β-ASP를 사용하여 제 2 회 스크리닝할 수 있다.

그러한 벡터 스크리닝 기법을 예시하기 위하여, 표준적인 방법에 따라서 콜라게나제함유 관류액으로 신생 쥐 심실근세포를 제조하였다. 라미닌 코팅된 판 상에서 봉형 세포를 배양하고, 48시간 후에 1:1(플라크형성단위:세포)의 감염의 다중도로 검출가능한 표지유전자(즉, 상기 실시예들에서 기술된 바와 같이 lacZ 유전자를 포함하는 아데노바이러스 벡터)를 포함하는 벡터로 감염시켰다. 추가적으로 36시간을 더 보낸 후에, 글루타르알데히드로 고정하고 X-gal로 배양하였다.

염색법으로 조사하여 근본적으로 모든 노출된 심근세포가 세포배양물 내의 재조합형 아데노바이러스로 감염된 후에 lacZ 트랜스유전자(즉, β-갈락토시다제)의 생성물을 발현한다는 것을 발견하였다.

실시예 8-1: 포유동물의 심실로부터 얻은 심근세포로의 β-ASP 트랜스유전자의 운반

그리고나서, 심실근세포 내에서 β-아드레날린작용성 신호화 단백질을 운반 및 발현하는 유전자 전달 벡터의 능력을 조사하기 위한 실험을 수행하였다. 배양 48시간 후에, β-ASP 유전자(AC_VI) 또는 검출가능한 표지유전자(lacZ) 중의 하나를 포함하는, 실시예 5에서와 같은, 재조합형 벡터로 근세포를 감염시켰다.

유전자 전달 24시간 후에, 3H-포르스콜린의 존재하에 이소프로테레놀(10μM)이 있는 상태 및 없는 상태에서 세포를 배양하여 AC 단백질 함량의 척도로서 포르스콜린의 정도를 평가하였다. 추가적인 조사에서, AC_VImRNA 함량을 노던 블롯으로 평가하였다.

도 4에 나타낸 바와 같이, β-ASP 트랜스유전자 AC_VI를 전달하는 벡터에 노출된 세포는 AC 단백질 함량 mRNA에 있어서 2배 증가되고, 바이러스 벡터를 사용하는 시험관 내의 심근세포에서 성공한 유전자 전달 및 발현을 확인하였다.

배양된 신생 쥐 심실근세포에 대한 추가적인 실험을 수행하여, β-ASP 트랜스유전자 AC_VI의 운반 이후에 근세포에서의 cAMP 생성을 조사하였다. 배양 48시간 후에, AC_VI또는 lacZ 중 하나를 발현하는 재조합형 아데노바이러스로 근세포를 감염시켰다. 유전자 전달 24시간 후에, 이소프로테레놀(10μM) 또는 포르스콜린 (3μM)로 세포를 배양하고, cAMP 함량을 측정하였다.

도 5에 나타낸 바와 같이, β-ASP 트랜스유전자 AC_VI를 전달하는 벡터에 노출된 세포는 이소프로테레놀 자극된 cAMP함량에 있어서 2배 증가를, 그리고 포르스콜린 자극된 cAMP 함량에 있어서 3배 증가를 보였다.

이 신속한 스크리닝 기법은 또한 여기에서 기술하는 바와 같이, 다른 벡터들(예를 들면, 지질계 벡터 및 다양한 비바이러스 운반 플랫폼을 포함하는 비바이러스 벡터뿐만 아니라 AAV와 같은 다른 바이러스 벡터)을 포함하는 다른 벡터들, 트랜스유전자가 서로 다른 전사 제어 서열(심실 특유의 프로모터와 같은)에 연결된 벡터, 그리고 여기에서 기술되고 예시된 바와 같이 다른 β-ASP 트랜스유전자를 코딩하는 벡터를 시험하는데 적용할 수 있다.

실시예 8-2.: 포유동물의 심실로부터 얻은 심근세포로의 절단된 β-ASP 트랜스유전자의 운반

추가적인 예시로서, 본 발명자들은 절단된 β-ASP 트랜스유전자(실시예 5-2에 기술된 바와 같이 구조화된)를 포유동물의 심장의 심실로부터 얻은 심근세포로 운반하고, 트랜스유전자의 발현 및 처리된 심장세포 내의 코딩된 단백질을 평가하였다.

또한, 본 발명자들은 심실근세포(포르스콜린 결합 및 cAMP 생성에 있어서의 변경에 의해 측정된)로의 트랜스유전자의 운반의 생리학적 효과를 분석하고, 세포 내에서의 β-아드레날린작용성 수용체 결합을 조사하였다(방사배위결합측정법을 사용하여).

심근세포 제조 및 유전자 전달. 생후 1일 내지 2일 경과된 Spague-Dawley 쥐로부터 심장을 제거하고, 시방 및 큰 혈관을 버리고, 심실을 3등분하였다. 콜라게나제 II(Worthington) 및 판크레아틴(GibcoBRL Life Technology, Gaithersburg, MD)로 심근을 소화시키고, 심근세포 현탁액을 Percoll 단계 구배를 통해 원심분리하여 심근세포를 다른 세포로부터 분리하였다. 그리고나서, 젤라틴으로 프리코팅된 평판 내에 세포를 플레이팅(4×10⁴세포/cm²)하고, 24시간 동안 배양하였다. 그리고나서, 혈청이 없는 배지로 세포를 세척하고, 2의 소 태아 혈청 중에서 24시간 동안 유지하였다(Knowlton, KU et al, J Biol Chem 266: 7759-7768, 1991). AC_VI또는 lacZ를 발현하는 재조합형 아데노바이러스를 첨가(10pfu/세포)하고, 20의 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM 중에서 20시간 동안 배양함으로써 최초 단리 3일 후에 아데노바이러스 매개된 유전자 전달을 수행하였다. 아데노바이러스를 제거하고, 세포를 24시간 동안 유지하고나서, 조사를 위해 사용하였다. lacZ에 의한 유전자 전달 후에 세포의 X-gal 염색에 의해 유전자 전달의 범위를 측정하였다. 1, 10 및 100 pfu/세포의 바이러스 역가에서, 95-100의 심근세포가 세포독성을 나타내지 않으면서 lacZ를 발현한다는 것이 예비조사에 의해 확인되었다. 조사를 위해 10 pfu/세포를 선택하였다. lacZ 및 AC_VI에 의한 유전자 전달 후에 평판당 단백질 함량은 유사하였다.

RT-PCR. AC_VImRNA를 동정하는데 RT-PCR을 사용하였다. 역전사 반응을 수행하였다(SuperScript II, GibcoBRL Life Technology). 간단히 말하자면, 1㎍의 mRNA를 11㎕ 중의 프라이머 AC_VI3'pHA의 100ng과 혼합하고, 가열(70℃, 10m)하고, 얼음 상에서 급속히 냉각하였다. 4 마이크로리터의 5×제 1 균주 완충액, 2㎕의 0.1M DTT 및 1㎕의 10mM dNTP을 첨가하고, 반응혼합물이 평형에 도달하도록 하였다(37℃, 2m). 최종적으로, 1㎕(200단위)의 SuperScript II Rnase 역전사효소를 첨가하였고; 반응시간은 1시간(37℃)이었다.

노던 블롯 분석. Trizon 시약(GIBCOBRL Life Technology)을 사용하여 유전자 전달 48시간 후에 전체 RNA를 심근세포로부터 단리하였다. 변성된 전체 RNA의 20 마이크로그램을 1.0아가로스 겔 상의 1×MOPS/EDTA 완충액 중에서 전기영동시켰다. 이 RNA를 20×SCC 용액 중의 나일론 멤브레인으로 옮겼다. RNA를 고정화(80℃, 2시간)하고; 임의로 분류된³²P-dCTP 쥐 AC_VIcDNA 프로브 또는 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로제나제(GADPH)로 멤브레인을 하이브리드형성하였다. 42℃에서 16시간 동안 Hood 완충액(50포름아미드, 5×SSC, 20mM NaHPO₄, pH 6.7, 7SDS, 1PEG 15,000-20,000, 그리고 0.5탈지우유) 중에서 하이브리드형성을 수행하였다. 멤브레인을 RT에서 30분 동안 2×SSC-0.5SDS로 1회 세척하고, 각각(60-65℃) 30분 동안 0.1×SSC-0.1SDS로 2-3회 세척하고, X선 필름에 노출시켰다.

결과되는 노던 블롯은, AC_VI유전자 전달을 받은 심근세포로부터 단리된 RNA 내의 AC_VImRNA와 혼화성인 밴드를 보였다(도 6). lacZ 유전자 전달을 받은 세포 내에서의 연장된 노출 후에 존재비가 낮은 내인성 쥐 AC_VImRNA를 검출할 수 있었다. 동일한 RNA 부하를 GADPH 제어에 의해 상세히 기록하였다. 이 데이터들은 유전자 전달 후의 강한 트랜스유전자 AC_VImRNA 발현을 입증한다.

웨스턴 블롯 분석. 얼음 상에서 10분 동안 NP-40 용균 완충액(20mM Hepes pH 7.0, 120mM HCl, 1mM DTT, 5mM 마그네슘아세테이트, 10글리세롤, 0.5NP-40, 및 프로테이나제 저해제: 로이펩틴, 아프로티닌 및 펩스타틴의 각각은 10㎍/ml, 그리고 1mg/ml의 페파블록)을 사용함으로써 바이러스 감염된 근세포로부터 세포 용해질을 제조하였다. 이 샘플들을 4℃에서 15분 동안 최고속도로 마이크로퓨지 내에서 원심분리하였다. 펠렛을 1×SDS 완충액 중에서 재현탁화하였다. 샘플들을 끓이고(5분), 세포 용해질을 7.5SDS-폴리아크릴아미드 겔(SDS-PAGE) 상에 적재하였다. 단백질을 전기영동하여 트리스-글리신 완충액(25mM 트리스-HCl pH 8.3, 150mM 글리신, 및 10메탄올) 중의 니트로셀루로스 멤브레인으로 옮겼다. 트리스-식염수 완충액(0.9NaCl 및 10mM 트리스-HCl, pH 7.5) 중의 5탈지 건조 우유로 이루어진 차단완충액으로 멤브레인을 처리하였다. AC_VI단백질을 검출하기 위해, 1시간 동안(RT) 차단완충액 중에 1:100로 희석된 항 ACV/VI 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)로 단백질 멤브레인을 배양하였다. Gsα 및 Giα₂를 검출하기 위해, 차단완충액 중의 염소 항 토끼IgG 양고추냉이 퍼옥시다제 콘쥬게이트(GIBCOBRL Life Technology)로 1차 항체를 검출하였다. 그리고나서, 화학발광 기질 A 및 B(Kirkegaard 및 Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)로 시각화하고, X선 필름에 노출시켰다.

결과되는 웨스턴 블롯에 의해 내인성 쥐 AC_VI단백질은 lacZ에 의한 유전자 전달 후에 세포 내에서 검출할 수 없다는 것을 발견하였다. 그러나, AC_VI유전자 전달을 받은 심근세포 내에서, 트랜스유전자 AC_VI단백질을 적절한 전기영동 가동성의 밴드로서 용이하게 검출할 수 있었다(도 7). 이 데이터들은 유전자 전달 후의 강한 트랜스유전자 AC_VI단백질 발현을 입증한다.

포르스콜린 결합. 발표된 방법(Post SR, Biochemical Journal 311: 75-80, 1995)의 변형을 사용하여 [³H]포르스콜린-결합 평가를 수행하였다. 간단히 말하자면, 근세포를 AC_VI를 발현하는 아데노바이러스 또는 lacZ를 발현하는 아데노바이러스로 감염시키고, 12웰 배양평판에서 48시간 도안 배양시켰다. 평가하기 전에, 배양배지를 흡기하고, 역완충액(100mM KCl, 20mM NaCl, 1mM NaH₂PO₄, 20mM HEPES, 및 1mM MgSO₄, pH 7.4)세포를 중에서 세포를 세척하였다. 사포닌(20㎍/ml 최종), 20nM [³H]포르스콜린, 1μM 1,9-디데옥시-포르스콜린(방사성표지의 비아데닐일시클라제 분자와의 결합을 감소시킴) 및 도면 범례 내에 표시된 첨가물의 첨가에 의해 결합평가를 개시하였다. 25℃에서 15분 동안 0.5ml의 최종부피 중에서 세포를 배양하였다. 배지의 흡기에 의해 반응을 종결하고, 세포를 빙냉 세척 완충액(50mM 트리스, 10mM MgCl₂, pH 7.4)로 2회 세척하였다. 0.2Triton X-100 중의 세포의 추출 및 가용성 세포 추출물의 섬광계수에 의해, 세포와 관련된 [³H]포르스콜린의 양을 측정하였다.

환상 AMP 측정. 세포의 처리 이전에, 성장배지를 제거하고, 세포를 혈청 및 중탄산나트륨이 없고 20mM HEPES pH 7.2가 공급된 DMEM 중에서 30분(RT) 동안 평형을 유지시켰다. 그 후에, 포스포디에스테라제 저해제로서 0.1mM 아스코르브산(산화를 방지하기 위한) 및 250μM IBMX의 존재 하에 10μM 이소프로테레놀, 또는 10μM 포르스콜린세포를 함유하는 신선한 DMEM 중에서 10분 동안(RT) 세포를 배양하였다. 배지의 흡기 및 7.5빙냉 트리클로로아세트산(TCA)의 첨가에 의해 반응을 종결하였다. TCA 추출물을 평가할 때까지 냉동(-20℃)하였다. 제조업자에 의해 제공되는 규약에 따르는 아세틸화 이후에 TCA 추출물의 방사면역측정법(Calbiochem, San Diego, CA)에 의해 세포내 cAMP 수준을 측정하였다. 이 측정법의 감도는 TCA 추출물이 크게 희석되는 것을 가능하게 하여 TCA의 에테르 추출이 불필요하였다. BioRad 단백질평가법에 의해 평가된 산불용성 단백질의 양에 대해 cAMP의 생성을 정규화하였다.

통계적 분석. 포르스콜린 결합 및 cAMP 생성 조사를 위해, 데이터를 평균값±1 SD로서 기록한다. Student's t-시험을 사용하여, 그리고 적당한 경우에는 분산분석을 사용하여 데이터를 비교하였다. p＜0.05인 경우에는 귀무가설을 버렸다.

포르스콜린 결합 및 cAMP 생성에 대한 조사의 결과.

포르스콜린 결합 조사는, 호르몬에 의해 자극된 신호화 도중의 활성화를 위해 사용할 수 있는 AC의 양을 구하는 수단을 제공하였다. 동일한 날에 유전자 전달을 받은 심근세포에 대해, 동이한 클론을 사용하여, 호르몬에 의해 자극된 cAMP 생성뿐만 아니라 포르스콜린 결합을 측정하도록 디자인된 병행조사를 행하였다. 이들 조사에 대한 근본적 이유는 트랜스유전자 단백질 발현과 cAMP 생성 사이의 관계의 정확한 평가치를 얻는 것이다. AC_VI유전자 전달(lacZ: 81±24 cpm; AC_VI: 447±113 cpm; p＜0.0001) 이후에, 순 GTPγS 자극된 포르스콜린 결합이 증가되었다. 이것들은 3번의 실험으로부터의 평균값이고, 트랜스유전자 AC_VI가 존재하고 Gs:AC 상호작용에 대해 응답성이라는 것을 입증한다(도 8A).

그리고나서, 본 발명자들은 AC_VI를 호르몬에 의한 자극에 대해 과발현하는 심근세포의 응답성을 측정하였다(도 8B). AC_VI유전자 전달은, 이소프로테레놀(lacZ: 26±3 pmoles/㎍; AC_VI: 136±7 pmoles/㎍; p＜0.0001)에 의해 그리고 포르스콜린(lacZ: 9±2 pmoles/㎍; AC_VI: 66±8 pmoles/㎍; p＜0.0001)에 의해 자극될 때 증가된 cAMP 생성과 관련되었다. 이것들은 3번의 실험으로부터의 평균값이고, 트랜스유전자 AC_VI를 발현하는 심근세포는, AC의 증가된 양을 반영하는 포르스콜린 자극에 대해서만이 아니라, 새롭게 합성된 AC는 βAR 자극을 통해 기능적으로 연결되고 보충가능하다는 것을 나타내는 이소프로테레놀에 대해, 증가된 아드레날린작용성 응다을 갖는다는 것을 입증한다.

도 8C는, 변경된 아드레날린작용성 신호화의 3개의 척도를 나타낸다(포르스콜린 결합, 그리고 이소프로테레놀 및 포르스콜린 자극된 cAMP 생성). 이 데이터들은 AC 함량에 있어서의 비례적인 증가 및 증폭된 아드레날린작용성 신호화가 발생했다는 것을 나타낸다.

도 9는, 심근세포가 이소프로테레놀 농도의 범위 만큼 자극될 때의 cAMP 생성을 나타낸다. AC_VI(vs. lacZ)에 의한 유전자 전달 이후에, 이소프로테레놀 농도의 넓은 범위를 통해 생성된 cAMP가 명백히 증가되었다. 이소프로테레놀 자극된 cAMP 생성을 위한 EC50은 변경되지 않았다(lacZ: 16±13 nM; AC_VI: 32±19 nM).

lacZ가 cAMP 생성에 대해 해로운 영향을 미치는 지의 여부를 결정하기 위해서, 본 발명자들은 또한 트랜스펙팅되지 않은 심근세포를 조사하였다. 이 조사에 의해 트랜스펙팅되지 않은 세포가cAMP 생성에 있어서 lacZ 감염된 세포와 구별되지 않는다는 것을 발견하였다.

β-아드레날린작용성 수용체 결합 조사. [¹²⁵I]-요도시아노핀돌올(ICYP; 30-240 pM)을 사용하여 방사배위결합실험에서 βARs를 동정하였고; 비특이 결합을 한정하는데 10^-4M 이소프로테레놀을 사용하였다. 트랜스펙팅된 세포(lacZ vs AC_VI)를 세포용해시키고, 방사배위결합을 위해 멤브레인(Ping et al., J. Clin. Invest. 95: 1271-1280, 1995)을 제조하고; 3중 샘플로 실험을 수행하였다. 데이터는 특이적으로 결합된 ICYP(fmole/mg)로서 기록된다.

증가된 AC 함량이 βAR 수에 영향을 미치는지의 여부를 결정하기 위해서, 방사배위결합측정법을 수행하였다. 이 방법으로, lacZ(Bmax: 26 fmol/mg; Kd: 43 pM) 또는 AC_VI(Bmax: 29 fmol/mg; Kd: 78 pM)를 발현하는 아데노바이러스로 감염된 심근세포의 평판에서의 멤브레인 단백질 mg 당 특이적으로 결합된 ICYP의 유사한 양을 동정하였다. 이 데이터는, βAR 수가 AC_VI의 유전자 전달에 의해 변경되지 않았다는 것을 나타낸다.

Gsα 및 Giα₂함량. 증가된 AC 함량이 G단백질 함량을 증가시켰는지의 여부를 결정하기 위해서, Gsα 및 Giα₂에 거슬러서 향한 항체로 면역블롯팅 조사를 수행하였다. 이 평가로 Gsα 및 Giα₂의 유사한 양을 동정하였다. 이 데이터는, Gsα 및 Giα₂의 함량이 AC_VI의 유전자 전달에 의해 변경되지 않았다는 것을 나타낸다.

β-ASP 트랜스유전자에 관련된 조사의 요약

상기 실험은, β-ASP 트랜스유전자(비번역 영역이 변경된 변이체 트랜스유전자를 포함하는)를 용이하게 구조화하고, β-ASP 유전자 생성물을 심장세포로 운반하는데 사용할 수 있다는 것을 입증하고, 또한 그러한 트랜스유전자를 심장세포의 기능적 응답을 변경하는데 사용할 수 있다는 것을 확인한다.

예시적인 β-ASP 구조물 내의 3'-비번역 영역을 결실하면, 심실근세포로의 운반 후에 트랜스유전자 발현 및 기능적 응답을 매개하는데 훨씬 더 효과적이라고 알려진 실질적으로 더 작은 트랜스유전자를 얻는다. 따라서, 비번역 영역이 트랜스유전자로부터 제거된 절단된 구조물(예를 들면, 3'-비번역 영역이 제거된 β-ASP 트랜스유전자)은, 본 발명에서 사용하기 위한 대체적이고 고도로 기능적인 구조물을 제공할 수 있다. 본래의 3'-비번역 영역이 유지된 "원형" 구조물과 비교하면, 변경된 β-ASP 트랜스유전자로 인해, 포르스콜린 자극된 cAMP 생성이 대략 4배 증가되고, 이소프로테레놀 자극된 cAMP 생성이 대략 9배 증가되었다. 따라서, 서로 다른 수준의 발현을 보이는 유전자를 사용할 수 있으면, 변하는 치료적인 필요(치료되어야 할 세포 및 조직 내의 원하는 발현 수준에 따라서)의 문맥 내에서 본 발명을 최적화하는데 사용될 수 있는 추가된 도구를 제공한다. 다르게는, 그러한 고발현 구조물을 사용함으로써, 동등한 효과를 얻기 위하여 상응하도록 더 적은 벡터를 사용하여 본 발명을 실시할 수 있다. 실제로, 이들 실험에서 세포 표면 수용체의 수가 변하지 않았음에도 불구하고, 상기 기술하고 예시한 바와 같이 β-ASP 트랜스유전자를 대략 2-100배 사용함으로써 βAR을 통해 cAMP 생성을 증폭시킬 수 있었다.

이론에 구애받는 것을 원치않는 상태에서, 변경된 트랜스유전자를 사용하여 효과적인 발현 수준이 증가된 것이 관찰된 것은, 벡터 패키징 효율의 증가 및/또는 메시지 안정성의 증가에 기인할 수 있다. 이 점에 있어서는, 트랜스유전자 구조물의 크기가 실질적으로 감소하여서 이 실험들에서 사용된 바이러스 벡터 내에 더 효율적으로 패키징할 수도 있다. 본 발명자들이 얻은 결과는, 또한, 결과되는 mRNA는 트랜스펙팅된 세포 내에 더 높은 존재비로 존재하고(원형 구조물과 비교하여 대략 25배 높음), 이것은 메시지 안정성이 증가한 결과일 수 있다는 것을 시사한다. 후자에 대해서는, 원래의 AC_VI구조물의 3'-비번역 영역에서의 잠재적인 mRNA 불안정화요소를 동정하였다.

따라서, 그러한 메시지 불안정화요소를 제거하여 그러한 요소들을 갖는 다른 β-ASP 트랜스유전자의 효과적인 발현을 증폭할 수 있다.

게다가, 본 발명자들이 AC_VI를 과발현하는 세포가 βAR 매개된 자극에 대한 증폭된 응답을 보였다는(포르스콜린 단독의 경우와 비교하여) 것을 관찰한 것은 새롭게 합성된 AC가 일반적으로 생체 내에 존재하는 아고니스에 의한 자극을 통해 기능적으로 연결되고 보충가능하다는 것을 시사한다.

실시예 9: 돼지 심부전 모델에서의 심근으로의 생체 내에서의 유전자 전달의 입증

사람 내의 CHF를 예언할 수 있는 대형 동물 모델에서의 생체 내의 유전자 전달을 조사하기 위해, 본 발명자들은 상기 실시예들에서 기술된 바와 같이 생성된 β갈락토시다제 코딩 벡터를 사용하여 돼지 심장의 심근에 대한 검출가능한 표지 트랜스유전자의 운반 및 발현을 최초로 입증하였다.

간단히 말하자면, 실시예 5의 과정에 의거하여, 아데노바이러스 벡터를 허용되는 사람 293 세포 내에서 증식하고, CsCl 구배 초원심분리에 의해 정제하였다 (1.5×10¹⁰개의 바이러스 입자의 최종 바이러스 역가로).

마취되고, 환기된 40kg짜리 돼지를 개흉하였다. 26게이지 버터플라이 니들을 중간 좌전하행(LAD) 관상동맥 내로 삽입하고, 벡터(1.5×10¹⁰개의 바이러스 입자)를 2ml 부피 내에 주사하였다. 그리고나서, 흉부를 폐쇄하고, 돼지가 회복되도록 하였다. 주사 후 제 4 일째에, 돼지를 치사하였다. 심장을 글루타르알데히드로 고정시키고나서, 절개하고, 16.5시간 동안 X-gal로 배양하였다. 삽입 및 절개 후에, 조직을 에오신으로 대조염색하였다.

조직 박편(LAD층의 통벽성 박편)을 현미경으로 분석한 바, LAD 관상동맥층의 세포 내에서 유전자 전달이 현저히 나타나고, 다수의 조직 박편이 β-갈락토시다제에 대해 양성으로 염색되는 세포의 50-60를 나타내었다. LAD 순환층으로부터 멀리 떨어진 심근의 영역은 X-gal 염색을 보이지 않았고, 네가티브 제어의 기능을 하였고, 유전자의 확산 발현이 근세포 내에서 그리고 내피세포 내에서 관찰되었다.

폐쇄흉부 동맥내 주사를 사용하는 추가적인 조사에서, 실질적인 활성은 유전자 전달 14일 후 존재하였다(n=8).

따라서, 본 발명자들은, 이 기법들을 사용하여, 유전자 발현의 영역에서 염증 또는 괴사의 흔적을 보이지 않으면서, 대형 포유동물의 심장 내에서 생체 내에서의 유전자 전달 및 발현이 효과적이라는 것을 입증하였다.

또한, 이 시스템의 효율을 입증한다는 관점에서, 돼지 심부전 모델에서의 트랜스유전자의 운반 및 발현을 모니터링하기 위한 생체 내에서의 과정을, 다른 생체 내의 유전자 운반 벡터를 본 발명에 따라서 시험하기 위해, 용이하게 사용할 수 있다.

또한, 아래의 실시예 10, 11 및 12에서 기술되는 바와 같이, 돼지 심부전 모델에서의 트랜스유전자의 운반 및 발현을 모니터링하기 위한 생체 내에서의 과정은, 예를 들면, 다른 생체 내의 운반 벡터(예를 들면, 지질게 벡터 및 다양한 비바이러스 운반 플랫폼을 포함하는 비바이러스 벡터뿐만 아니라 AAV와 같은 다른 바이러스 벡터), 트랜스유전자가 서로 다른 전사 제어 서열(심실 특유의 프로모터와 같은)에 연결된 벡터, 그리고 여기에서 기술되고 예시된 바와 같이 다른 β-ASP 트랜스유전자를 코딩하는 벡터를 포함하는 다른 생체 내의 운반 벡터를, 본 발명에 따라서, 시험하는데 용이하게 사용할 수 있다.

아래의 실시예 13에 기술되는 바와 같이, 본 발명자들은, 또한, 본 발명에 따라서, β-ASP 트랜스유전자의 심근으로의 운반을, 사람 심부전의 이 대형 동물 모델에서 심장의 기능을 현저하게 증진시키는데 사용할 수 있다는 것을 입증하였다.

실시예 10: 다른 바이러스 벡터(AAV)를 사용하는 돼지 심근으로의 예시적인 생체 내에서의 유전자 전달

다양한 바이러스 벡터들(아데노관련 바이러스(AAV)와 같은), 리포솜 및 다른 지질함유 유전자 운반 착체, 그리고 생체 내에서 포유동물 숙주 세포로의 폴리누클레오티드의 운반을 매개할 수 있는 다른 거대분자 착체(다기능적 유전자 운반 융합 단백질과 같은)를 포함하는 다른 벡터들을, 본 발명에 따라서 심근으로 β-ASP 트랜스유전자를 운반하는데 사용할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 생체 내에서 심근으로 하나 이상의 β-ASP 트랜스유전자를 운반하는데 AAV를 사용할 수 있다. 아데노관련 바이러스 벡터를 제조 및 사용하는 일반적인 원칙은 본 분야의 문헌에 기술되어 있다(예를 들면, Carter, B., Curr. Opin. Biotechnol., 3: 533-539, 1992; Kotin, R., Human Gene Therapy, 5: 793-801, 1994; 및 Flotte, T.R., et al., Gene Therapy 2:357-362, 1995; 그리고 위에서 언급된 기타 참고문헌 참조).

예시를 위하여, 여기에서 기술되는 바와 같이 하나 이상의 β-ASP 트랜스유전자(바람직하게는 약 5kb 미만을 포함하는)를, AAV 코딩 서열(즉, AAV rep 및 cap 유전자)의 일부(바람직하게는 전체)가 결실되었지만, 적어도 AAV 반전말단반복부(ITRs)에서 유지되는 재조합형 AAV 벡터로 클로닝하였다. AAV 반전말단반복부 사이에 β-ASP 트랜스유전자를 위치시키고, 제공 또는 변형할 수 있는 허용되는 패키징 세포 라인 내로 벡터를 도입하여, 없어진 AAV 패키징 기능(즉, Rep 및 Cap)을 트랜스 상태에서 제공하였다. 그리고나서, 본 분야의 문헌에 기술되어 있는 바와 같이, 일단 필요한 AAV 헬퍼 바이러스 기능이 제공되면, 재조합형 AAV 벡터를 감염성(그러나, 복제결손인) AAV 입자로 복제 및 포막하기 위하여 패키징 세포 라인을 사용할 수 있다. 다르게는, 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 바이러스 기능의 도입 이전에 또는 도입과 동시에, 재조합형 AAV 벡터를 도입할 수 있다. 본 분야에 공지된 바와 같이, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 그리고 우두와 같은 폭스바이러스를 포함하는, AAV에 대한 헬퍼 활성을 제공하기 위하여 다양한 헬퍼 바이러스(또는 그로부터 얻어진 유전적 기능)를 사용할 수 있다. 결실된 AAV 패키징 기능을 패키징 세포의 게놈 내에 안정하게 도입하거나 또는 일시적으로 제공할 수 있다(예를 들면, 헬퍼 플라스미드에 의한 트랜스펙션에 의해 또는 아데노바이러스와 같은 헬퍼 바이러스 내로의 봉입에 의해). 그리고나서, 본 분야의 문헌의 기술되어 있는 바와 같이, 재조합형 AAV 입자를 정제하였다(예를 들면, 등밀도 초원심분리법을 사용하여).

상기 실시예 5-7에서 기술된 바와 같이, 이 경우의 AAV에 있어서, 재조합형 벡터로 클로닝하기 위해 다양한 β-ASP 트랜스유전자를 생성한다. 제 1 세대 AAV 벡터에 대해서는, 트랜스유전자 또는 트랜스유전자들은 효과적으로 패키징되기 위해 약 5kb 미만을 포함하여야 한다. 물론, 또한, 서로 다른 β-ASP 트랜스유전자들을 개별 벡터 내에 위치시킬 수도 있다.

β-아드레날린작용성 신호화 단백질이 세포 배양물 내에 유지된 심실세포로 효과적으로 운반되는 것을 매개하는 벡터 구조물을 선택하기 위해 실시예 8에서 예시된 것과 같은 방법들을 사용할 수 있고; 트랜스유전자가 생체 내에서 심근으로 효과적으로 운반되는 것을 매개하는 벡터 구조물을 선택하기 위해, 실시예 9에서 예시한 바와 같이, 검출가능한 표지 유전자(lacZ와 같은)를 사용할 수 있다. 그리고나서, β-ASP 트랜스유전자를 생체 내에서 심근으로 운반하기 위하여 적합한 β-ASP 벡터 구조물을 사용할 수 있다(아래의 실시예 12-13에서 기술되는 바와 같은).

실시예 11: 비바이러스 벡터를 사용하는 돼지 심근세포로의 예시적인 생체 내에서의 유전자 전달

또한, 바이러스 벡터를 예시적인 유전자 운반 비이클을 사용하는, 여기에서 기술된 실시예들을, 리포솜 및 다른 지질함유 유전자 운반 착체와 같은 비바이러스 벡터, 그리고 폴리누클레오티드가 생체 내에서 포유동물 숙주 세포로 운반되는 것을 매개할 수 있는 다른 거대분자 착체(다기능적 유전자 운반 융합 단백질)을 사용하는데 용이하게 적용할 수 있다.

예시를 위하여, 하나 이상의 β-ASP 트랜스유전자를 운반하기 위해 리포솜 및 다른 지질함유 유전자 운반 착체를 사용할 수 있다. 유전자 운반을 위한 그러한 착체의 제조 및 사용의 원칙은 본 분야의 문헌에 기술되어 있다(예를 들면, Ledley, FD, Human Gene Therapy 6: 1129-1144, 1995; Miller, N., et al., FASEB Journal 9: 190-199, 1995; Chonn, A, et al., Curr. Opin. in Biotech. 6: 698-708, 1995; Scofield, JP, et al., British Med. Bull. 51: 56-71, 1995; Brigham, K.L., et al., J.Liposome Res. 3: 31-49, 1993; 그리고 위에서 언급된 기타 참고문헌 참조).

간단히 말하자면, 여기에서 기술된 바와 같은 하나 이상의 β-ASP 트랜스유전자를, 본 분야에 공지된 기법을 사용하여, 리포솜 또는 다른 지질함유 유전자 운반 착체 내에 도입한다. 다양한 β-ASP 트랜스유전자를 실시예 5-7에 기술된 바와 같이 생성하고나서, 리포솜 또는 다른 지질계 벡터 내에 도입할 수 있다. β-아드레날린작용성 신호화 단백질이 세포 배양물 내에 유지된 심실세포로 효과적으로 운반되는 것을 매개하는 벡터를 선택하기 위해 실시예 8에 예시된 것과 같은 방법들을 사용할 수 있고; 트랜스유전자가 생체 내에서 심근으로 효율적으로 운반되는 것을 매개하는 벡터를 선택하기 위해, 실시예 9에서 예시된 바와 같이, 검출가능한 표지 유전자(lacZ와 같은)를 사용할 수 있다. 그리고나서, β-ASP 트랜스유전자를 생체 내에서 심근으로 운반하기 위해, 적합한 β-ASP 벡터 구조물을 사용할 수 있다(아래의 실시예 12-13에 기술되는 바와 같이).

실시예 12: 사람의 심부전의 전조가 되는 큰 동물모델에서 생체내 β-ASP 트랜스유전자의 유전자 전달 효과

실시예 12-1: 생체내에서 아데닐일시클라제 β-ASP 트랜스유전자의 심근으로의 유전자 전달

상술한 관찰에서, 본 발명자는 본 발명의 큰 동물모델의 심근으로 β-ASP 트랜스유전자를 운반하기 위해 유전자 치료를 사용하여 생체내에서 β-아드레날린작용성 반응성을 증강시키는 능력을 연구하였다.

동물은 3마리의 집돼지(30-40kg 체중)로 하였다. 왼쪽 개흉술을 살균상태하에서 기구를 사용하여 수행하였다(Hammond, et al. J Clin Invest 92:2644-2652, and Roth, et al. J Clin Invest 91:939-949, 1993).

압력발생을 측정하고 압력을 모니터하는데 사용되는 좌심실 고 적합성의 압력 게이지를 측정하는 수단이 되는 카테테르를 좌심방 및 대동맥에 넣었다. 와이어로 좌심방을 봉합하여 ECG 기록 및 심방 페이스화를 하게 하였다.

수술에서 회복된 후에(10-14일), 돼지를 β-아드레날린작용성 반응성 및 기준선 좌심실 치수 및 혈행 역할을 측정하기 위해 검사하였다. 이들 연구에서 가장 중요한 요소는 이소프로테레놀 주입에 대한 심박동수 반응이다. 돼지중 한 마리로 하기하는 유전자 전달 전후에 생긴 좌심실 dP/dt 측정하였다.

상기한 예시적인 아데노바이러스 벡터 시스템을 생체내에서 유전자 운반에 의해 트랜스유전자를 운반하는데 사용하였다. 대표적인 β-ASP 트랜스유전자로서, 본 발명자는 상기 언급된 AC_VI이소형태를 사용하였다. 생체내에서 주사된 벡터물질은 많이 정제하고 야생형 (복제 콤피턴트) 아데노바이러스를 함유하지 않았다. 따라서 아데노바이러스 감염 및 심장에서의 염증성 침윤을 최소화하였다. 벡터 제제를 관상 카테테르에 의해 관상동맥의 루멘으로 주사하였다.

벡터 제제의 도입(약 1011개의 바이러스 입자를 함유하는 아데노바이러스 4.0ml)은 좌우 관상동맥 둘다로 2.0ml를 주사함으로써 행하였다. 동물을 마취시키고, 오른쪽 경동맥을 절개하여 동맥에 접근하고; 5F 코르디스 덮개를 하였다. 5F 멀티퍼포즈(A2) 관상 카테테르를 관상동맥에 넣는데 사용하였다. 다음에 카테테르 팁을 최소의 물질이 주사동안에 대동맥에 인접하지 않도록 동맥 루멘내로 1cm 넣었다. 이 과정은 각각의 돼지에서 시행하였다.

이들 기술을 사용하여, 본 발명자는 간세포에서 관찰된 트랜스유전자 발현이 없는 심근으로 매우 높은 효율로 유전자를 운반하였다. 더욱이, 바이러스 RNA는 관상내 주사후 어느 때라도 소변에서 검출될 수 없었다.

실시예 13에서 기재하는 바와 같이, β-ASP 트랜스유전자의 심근으로의 그러한 생체내 유전자 운반이 큰 포유동물 모델의 심장기능을 실질적으로 증강시킨다는 것을 알았다.

실시예 12-2: 생체내에서 다른 β-ASP의 심근으로의 유전자 전달

실시예 6 및 7에서 기재한 바와 같이 β-AR 또는 GRK 저해제를 코딩하는 벡터와 같은 다른 β-ASP로 이루어지는 벡터를 실시예 12-1에 기재한 기술을 사용하여 다른 바람직한 β-ASP 트랜스유전자를 운반하는데 사용하였다.

하기하는 바와 같이, 제1예인 β-ASP 트랜스유전자(AC)의 생체내 유전자 전달은 본 발명의 큰 동물모델의 심장기능에 끼치는 실질적이고 양성인 영향을 가졌다.

다른 β-ASP 트랜스유전자의 운반은 AC 트랜스유전자의 운반 대신에 또는 그 외에 사용될 수 있다. β-ASP 트랜스유전자의 조합이 공급되는 경우, 조합은 단일의 벡터(두개이상의 β-ASP 트랜스유전자 포함) 또는 별도의 벡터(각각 β-ASP 트랜스유전자 포함)에서 제공될 수 있다. 아데노바이러스와 같은 크기제약을 받는 벡터에서, 추가의 β-ASP 트랜스유전자(GRK 저해제)는 상기한 E4와 같은 추가의 복제 유전자를 결실함으로써 벡터에 수용될 수 있다. 더욱이, 그러한 바이러스 벡터의 더 새로운 발생은 다른 방법으로 크기 제약을 경감시키는데 사용된다. 또한, 많은 이용가능한 지질 기제 벡터와 같은 비바이러스 벡터(예를 들면, 양이온성 리포좀 착체 포함)는 바이러스 입자 벡터로 관찰되는 바와 같이 그러한 제한되는 크기 제약을 나타내지 않는다.

또한 그러한 추가의 β-ASP는 별도의 벡터를 사용하여 운반될 수 있다. 별도의 벡터가 사용되는 경우, 벡터는 단일 주사(상기 예시한 바와 같음) 또는 별도의 주사로 함께 도입될 수 있다. 상이한 트랜스유전자를 제공하는 그러한 별도의 벡터가 가장 편리하게 유사한 벡터인 경우(하나의 β-ASP 트랜스유전자는 효과적으로 다른 것으로 교체됨), 상이한 프로모터가 상이한 기본 벡터외에도 채택될 수 있다.

다음 실시예는 심부전의 본 발명의 돼지 모델의 심장기능에 대한 생체내에서 β-ASP 트랜스유전자 운반의 효과를 입증한다.

실시예 13: 사람의 CHF의 전조가 되는 큰 동물모델로의 생체내 유전자 전달 후에 증가된 심장 기능

상기 실시예 12-1에 기재한 생체내 유전자 치료를 통해 전형적인 β-아드레날린작용성 신호화 단백질을 수용한 돼지를 유전자 운반 전후 둘다에서 다른 기준 및 심장기능에 대해 검사하였다.

부적절한 분석으로 β-ASP 트랜스유전자(쥐의 AC_VI)가 유전자 전달을 수용한 동물의 심근에 존재한다는 것을 확인하였다.

심근기능의 많은 인디케이터를 유전자 전달 전후에 측정하였다. 요컨대, 의식이 있는 동물을 투석기에서 현탁하고 LV(n=1)로부터의 압력, LV 및 대동맥을 모니터하고 심전도를 디지털 포맷 온라인에서 기록하였다(150bpm에서 동맥 페이스화 동안 및 정지동안). 2차원 및 M-모드 영상을 휴렛 팩커드 초음파 영상화 시스템을 사용하여 얻었다. 영상은 중간 유두근 수준에서 오른쪽 흉골근처에 접근하여 얻고 VHS 테이프에 기록하였다. 영상을 기본 상태 및 다시 우동맥 페이스화(HR=150bpm) 동안에 있는 동물로 기록하였다. 이들 연구는 유전자 전달 하루전에 수행하고 전달 한지 7±3일이 지난 후에 반복하였다. 압력발생률 및 좌동맥압이 유전자 전달 전후와 유사하여 유사한 심근 산소요구량 및 적재 상태를 나타낸다는 것을 알았다. 초음파 심장검진 측정을 표준화된 기준을 사용하여 행하였다(Sahn, et al. Circulation 58:1072, 1978). 좌심실 말단확장 직경(EDD) 및 말단수축 직경(ESD)을 5회 연속비트로부터 측정하고 평균하였다.

좌심실 분획단축(FS)을 [(EDD-ESD)/EDD]×100으로 검사하였다. 이 측정은 유전자 전달에 의해 변화되지 않아 개재물의 결실 효과가 없고 이 과정의 안정성을 입증한다. 초음파 심장검진 측정의 재생을 입증하기 위해, 동물(n=5)을 이틀 연속해서 영상화하고, 이는 높은 상관성(r²=0.90; p=0.005)을 나타냈다.

좌심실 치수를 측정하고 기준선 혈행 역학을 기록한 후에, 글리코피롤레이트 (무스카린 콜린 작동성 길항제)를 심박동수 반응에 대한 부교감신경계의 효과를 차단하기 위해 사용하였다(0.14mg/kg, 정맥내). 다음에 이소프로테레놀을 심박동수 반응을 기록한 대로 폐동맥 카테테르로 환약 투여형태로 운반하였다. 이들 연구는 유전자 전달 하루전에 수행하고 개개의 돼지에서 유전자 전달한지 5-10일이 지난 후에 다시 수행하였다. 다음에 데이터를 유전자 전달 전후에 각 동물을 비교하는 한벌의 분석에 의해 검사하였다.

도 10 및 도 11에 나타낸 결과는 본 발명에 따라 단일의 β-ASP 트랜스유전자의 생체내 유전자 운반이 사람의 전조가 되는 큰 동물모델 심장에서 β-아드레날린작용성 반응성을 효과적으로 증가시켰음을 입증하였다.

도 10은 심박동수에 대한 AC_VI의 생체내 유전자 전달의 효과를 요약하는 데이터를 나타낸다. 동물은 아데노바이러스를 발현하는 AC_VI의 10¹¹개의 바이러스 입자의 관상내 운반 전과 운반한지 5-10일이 지난 후를 연구하였다. 글리코피롤레이트를 심박동수에 끼치는 부교감신경계의 영향을 제거하고, 이로써 심근 βAR 경로를 최적으로 분리하는데 사용하였다. 기본 심박동수는 변화되지 않았으나, 최대(이소프로테레놀 자극) 심박동수는 본 발명에 따라 β-ASP 트랜스유전자(즉 AC_VI)의 생체내 운반에 의해 현저하게 증가되었다. 이들 데이터는 먼저 β-ASP 트랜스유전자의 생체내 유전자 전달이 큰 포유동물 심장에서 β-아드레날린작용성 반응성을 효과적으로 증가시킬 수 있다는 것을 입증한다.

도 11은 정상 돼지에서 LV dP/dt에 대한 생체내 유전자 전달의 결과를 나타낸다. 동물을 β-ASP 트랜스유전자 AC_VI를 갖는 아데노바이러스 10¹²개의 입자를 관상내 운반전과 운반한지 7일이 지난 후를 연구하였다. 글리코피롤레이트는 수축기능에 끼치는 부교감신경계 영향을 제거하여 심근 βAR 경로를 최적으로 분리하는데 사용하였다.

도 11에 나타낸 바와 같이, 기본 LV dP/dt는 동일한 기본 심박동수에서 실질적으로 증가하였다. 이소프로테레놀에 대한 반응도 AC_VI유전자 전달후에 증가하였다. 이들 데이터는 예시적인 β-ASP 트랜스유전자의 생체내 유전자 전달이 사람의 심장기능의 전조라고 기대되는 큰 동물모델의 손상되지 않은 심장의 수축기능을 효과적으로 증가시킬 수 있다는 것을 입증한다.

요약하면, 앞의 연구는 본 발명에 따른 단일의 β-ASP 트랜스유전자를 운반하기 위한 생체내 유전자 치료가 사람에서 심장기능, 및 기능장애를 의사하는 것이 관찰된 포유동물 심장의 내생 β-아드레날린작용성 반응성 및 심장 기능을 효과적으로 증가시켰음을 입증하였다.

상기한 바와 같이, β-ASP 유전자 구조는 본 발명 내용에서 채택되는 생성 트랜스유전자의 효과적인 발현수준을 변경하기 위해 변형될 수 있다. 예를 들면, 상기한 바와 같이, β-ASP 트랜스유전자의 발현은 이종 프로모터(예를 들면, 다양한 구성 또는 유발성 프로모터 뿐만 아니라, 심장 특이적 프로모터와 같은 조직 특이적 프로모터를 포함)의 제어하에서 트랜스유전자를 위치시킴으로써 변경될 수 있다. 또한 상기한 바와 같이, 발현은 예를 들면 유전자의 비번역된 영역을 포함하여 유전자의 다른 영역을 변화시킴으로써 변경될 수 있다. 예시로서, 3'-비번역된 영역에서의 결실을 갖는 AC_VI구조가 생길 수 있고(실시예 5-3에 기재함), 심장세포에서의 발현 및 기능적 반응성에 영향을 끼치는 그 관련능력에 대해 시험할 수 있다. 발현의 상이한 수준을 나타내는 유전자를 채택하는 능력은 다양한 치료학적 요구량(예를 들면, 치료될 세포 및 조직에서 원하는 발현수준에 의존)의 문맥에서 본 발명을 용이하게 맞추고 최적화하는데 사용할 수 있으며, 또한 주어진 생리학적 효과를 발생하는데 필요한 벡터량을 감소시키는데 사용할 수 있는 첨가된 기구를 제공한다. 상기한 바와 같이, 실시예 5-3에 예시된 바와 같은 기술을 사용하는 β-ASP 트랜스유전자의 사람 이소형태를 얻는 것이 가능하다. 실시예 9-13에 제시된 예시는 본 발명 문맥에서 그러한 β-ASP 트랜스유전자를 시험하고 사용하기 위한 수단으로서 추가의 안내를 제공한다.

또한, βAR-G_s-AC 경로중 다양한 성분의 효과적인 커플링에 관한 본 발명자의 관찰 및 다른 것과 관련하여 이 입증된 효과를 고려하여, (상기한) 본 발명에 따라 그러한 β-ASP의 β-AR, GRK 저해제 또는 조합을 운반하는 능력은 그러한 기능장애가 있는 포유동물 심장에서 심장 기능 및 내생의 β-아드레날린작용성 반응성의 보다 큰 증강을 제공하는 것이 기대된다. 상기한 본 발명자의 데이터는 β-AR(GRK)에 영향을 끼치는 단백질 및 β-AR의 변경이 초기에 CHF과 관련하여 관찰되는 내생의 β-아드레날린작용성 아고니스트에 대한 반응이상에의 중요한 기여자라는 생각을 지지한다.

내생의 β-아드레날린작용성 아고니스트에 대한 반응성을 효과적으로 증강시키는 방법을 제공함으로써, 본 발명의 방법 및 조성물은 사람에서 울혈성 심부전을 치료하기 위한 외생의 약리학적 아고니스트 및 다른 방법의 사용에 대해 매우 요구되는 대안을 제공한다.

다양한 본 발명의 특히 바람직한 구체예는 상기 기재되고 일반적으로 하기에서 청구된다. 이제 본 발명은 본문에서 충분하게 기재되어 있으며, 많은 변경 및 변형이 현재 청구된 본 발명의 사상 또는 범위로부터 벗어나지 않게 본 발명을 작성할 수 있는 것이 통상의 기술을 가진 자에게 분명해질 것이다.

Claims (66)

1. 포유동물의 심장기능을 증강시키는 방법에 있어서, 벡터를 상기 포유동물의 심장으로 운반하는 것을 포함하고, 벡터는 프로모터에 작동가능하게 연결된 β-아드레날린작용성 신호화 단백질(β-ASP)을 코딩하는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 심장기능을 증강시키는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 벡터를 심장의 심근에 혈액을 공급하는 혈관으로 도입하는 것을 특징으로 하는 심장기능을 증강시키는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 벡터를 심장 근세포로 운반하는 것을 특징으로 하는 심장기능을 증강시키는 방법.
4. 제 2 항에 있어서, 상기 심장의 심근에 혈액을 공급하는 혈관은 관상동맥, 복재정맥 그래프트 또는 내유동맥 그래프트인 것을 특징으로 하는 심장기능을 증강시키는 방법.
5. 제 4 항에 있어서, 벡터를 좌우 관상동맥 둘다에 도입하는 것을 특징으로 하는 심장기능을 증강시키는 방법.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 포유동물은 사람인 것을 특징으로 하는 심장기능을 증강시키는 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 벡터는 β-아드레날린작용성 리셉터(β-AR), G-단백질 리셉터 키나제 저해제(GRK 저해제) 및 아데닐일시클라제(AC)로 이루어지는 군에서 선택된 β-ASP를 코딩하는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 심장기능을 증강시키는 방법.
8. 제 1 항에 있어서, 벡터는 프로모터에 작동가능하게 연결된 두 개의 상이한 β-아드레날린작용성 신호화 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 심장기능을 증강시키는 방법.
9. 제 1 항에 있어서, 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2의 β-ASP를 코딩하는 유전자를 포함하는 제2의 벡터를 도입하는 것을 더 포함하고, 상기 제2의 β-ASP는 상기 제1의 β-ASP와 상이한 것을 특징으로 하는 심장기능을 증강시키는 방법.
10. 제 7 항에 있어서, β-ASP는 β₁-아드레날린작용성 리셉터(β₁-AR) 및 β₂-아드레날린작용성 리셉터(β₂-AR)로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 심장기능을 증강시키는 방법.
11. 제 10 항에 있어서, β-ASP는 β₁-아드레날린작용성 리셉터(β₁-AR)인 것을 특징으로 하는 심장기능을 증강시키는 방법.
12. 제 10 항에 있어서, β-ASP를 코딩하는 유전자는 GRK 저해제를 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 심장기능을 증강시키는 방법.
13. 제 10 항에 있어서, β-ASP는 아데닐일시클라제(AC)인 것을 특징으로 하는 심장기능을 증강시키는 방법.
14. 제 13 항에 있어서, β-ASP는 AC 이소형태 VI인 것을 특징으로 하는 심장기능을 증강시키는 방법.
15. 제 13 항에 있어서, β-ASP는 사람 AC 이소형태 VI인 것을 특징으로 하는 심장기능을 증강시키는 방법.
16. 제 7 항에 있어서, β-ASP를 코딩하는 유전자는 이종 구성 프로모터 및 이종 유발성 프로모터로 이루어지는 군에서 선택된 이종 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 심장기능을 증강시키는 방법.
17. 제 16 항에 있어서, 프로모터는 심실 미오신 경쇄 2 프로모터 및 심실 미오신 중연쇄 프로모터로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 심장기능을 증강시키는 방법.
18. 제 16 항에 있어서, β-ASP를 코딩하는 유전자는 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된 AC 이소형태 VI을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 심장기능을 증강시키는 방법.
19. 제 1 항에 있어서, β-ASP를 코딩하는 유전자는 야생형 β-ASP 유전자의 변이체이고, 변이체는 상기 β-ASP 유전자의 하나이상의 비번역된 영역에서의 결실을 포함하는 것을 특징으로 하는 심장기능을 증강시키는 방법.
20. 제 19 항에 있어서, 상기 결실은 3'-비번역된 영역의 적어도 약 100bp를 제거하는 것을 특징으로 하는 심장기능을 증강시키는 방법.
21. 제 19 항에 있어서, β-ASP를 코딩하는 유전자는 3'-비번역된 영역에서의 결실을 갖는 변이체 AC 유전자인 것을 특징으로 하는 심장기능을 증강시키는 방법.
22. 제 19 항에 있어서, β-ASP를 코딩하는 유전자는 3'-비번역된 영역을 제거하는 결실을 갖는 절단된 AC_VI유전자인 것을 특징으로 하는 심장기능을 증강시키는 방법.
23. 제 1 항에 있어서, 벡터는 바이러스 벡터 및 지질 기제 벡터로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 심장기능을 증강시키는 방법.
24. 제 1 항에 있어서, 벡터는 바이러스 입자인 것을 특징으로 하는 심장기능을 증강시키는 방법.
25. 제 24 항에 있어서, 바이러스 입자는 아데노바이러스(Ad) 및 아데노 관련 바이러스(AAV)로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 심장기능을 증강시키는 방법.
26. 제 25 항에 있어서, 바이러스 입자는 β-ASP를 코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 갖는 폴리누클레오티드로 이루어지는 아데노바이러스이고, 상기 아데노바이러스는 사람에서 복제결손인 것을 특징으로 하는 심장기능을 증강시키는 방법.
27. 제 26 항에 있어서, 아데닐일시클라제는 AC 이소형태 VI인 것을 특징으로 하는 심장기능을 증강시키는 방법.
28. 프로모터에 작동가능하게 연결된 β-ASP를 코딩하는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합형 복제결손 바이러스 입자.
29. 제 28 항에 있어서, 상기 프로모터는 이종 프로모터인 것을 특징으로 하는 재조합형 복제결손 바이러스 입자.
30. 제 28 항에 있어서, 상기 β-ASP는 β-AR, GRK 저해제 및 아데닐일시클라제로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합형 복제결손 바이러스 입자.
31. 제 28 항에 있어서, 벡터는 두 개의 상이한 β-ASP를 코딩하는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합형 복제결손 바이러스 입자.
32. 제 28 항에 있어서, β-ASP는 β₁-아드레날린작용성 리셉터(β₁-AR)인 것을 특징으로 하는 재조합형 복제결손 바이러스 입자.
33. 제 28 항에 있어서, β-ASP는 AC 이소형태 II, AC 이소형태 V 및 AC 이소형태 VI으로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합형 복제결손 바이러스 입자.
34. 제 28 항에 있어서, β-ASP는 AC 이소형태 VI인 것을 특징으로 하는 재조합형 복제결손 바이러스 입자.
35. 제 28 항에 있어서, β-ASP는 사람 AC 이소형태 VI인 것을 특징으로 하는 재조합형 복제결손 바이러스 입자.
36. 제 28 항에 있어서, 야생형 β-ASP를 코딩하는 유전자는 β-ASP 유전자의 변이체이고, 변이체는 상기 β-ASP 유전자의 하나이상의 비번역된 영역에서의 결실을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합형 복제결손 바이러스 입자.
37. 제 36 항에 있어서, 상기 결실은 3'-비번역된 영역의 적어도 약 100bp를 제거하는 것을 특징으로 하는 재조합형 복제결손 바이러스 입자.
38. 제 36 항에 있어서, β-ASP를 코딩하는 유전자는 3'-비번역된 영역에서의 결실을 갖는 변이체 AC 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합형 복제결손 바이러스 입자.
39. 제 36 항에 있어서, β-ASP를 코딩하는 유전자는 3'-비번역된 영역을 제거하는 결실을 갖는 절단된 AC_VI유전자인 것을 특징으로 하는 재조합형 복제결손 바이러스 입자.
40. 제 28 항에 있어서, 상기 재조합형 복제결손 바이러스 입자는 사람에서 복제결손인 아데노바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합형 복제결손 바이러스 입자.
41. 제 28 항에 따른 재조합형 복제결손 바이러스 입자로 트랜스펙션된 것을 특징으로 하는 포유동물 세포.
42. (i) 제 28 항에 따른 재조합형 복제결손 바이러스 입자 및

    (ii) 담체

    로 이루어지는 것을 특징으로 하는 여과된 아데노바이러스 입자.
43. 제 42 항에 있어서, 상기 아데노바이러스 벡터는 0.1-0.5마이크론 필터를 통해 여과된 것을 특징으로 하는 여과된 주사가능한 아데노바이러스 입자 제제.
44. 제 28 항에 따른 재조합형 복제결손 바이러스 입자의 제조방법에 있어서,

    (i) 제1 및 제2플라스미드를 복제 수용능을 부여하는 복제가능한 포유동물 세포 발현의 하나이상의 아데노바이러스 유전자로 도입하는 단계로서, 상기 제1플라스미드는 프로모터에 작동가능하게 연결된 β-ASP를 코딩하는 유전자를 포함하고 복제결손 사람 아데노바이러스 게놈을 더 포함하며, 상기 제2플라스미드는 복제숙달 사람 아데노바이러스 게놈을 포함하고 제2플라스미드가 너무 커서 아데노바이러스 입자에 포막될 수 없게 하는 추가의 폴리누클레오티드 서열을 더 포함하고, 이로써 레스큐 재조합이 제1플라스미드와 제2플라스미드 사이에서 일어나서 β-ASP를 코딩하는 유전자를 포함하나 하나이상의 아데노바이러스 복제 유전자를 결핍시키는, 아데노바이러스 입자에 포막될 정도로 충분히 작은 재조합형 아데노바이러스 게놈을 생성하는 단계;

    (ii) 성공한 재조합형 바이러스 벡터를 세포 배양물에서 동정하는 단계; 및

    (iii) 얻어진 재조합형 바이러스 입자를 복제가능한 포유동물 세포 발현의 결손 아데노바이러스 복제 유전자에서 증식시켜 재조합형 복제결손 바이러스 입자를 생성하는 단계

    를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 입자의 제조방법.
45. 제 44 항에 있어서, 상기 동정단계는

    (i) 트랜스펙션된 세포를 세포변성효과의 증거를 위해 모니터하는 단계;

    (ii) 바이러스 핵산을, 세포변성효과를 나타내는 트랜스펙션된 세포의 배양물중 세포 상청액으로부터 분리하는 단계;

    (iii) 성공한 재조합형 바이러스 벡터를, 아데노바이러스 서열에 상보적인 프라이머 및 β-ASP 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터에 상보적인 프라이머를 사용하는 PCR로 동정하는 단계; 및

    (iv) 재조합형 바이러스 입자를 플라크 정제로 정제하는 단계

    를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 입자의 제조방법.
46. 프로모터에 작동가능하게 연결된 β-ASP를 코딩하는 유전자를 포함하고 복제결손 바이러스 게놈을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합형 프로바이러스 플라스미드.
47. 제 46 항에 있어서, 상기 β-ASP는 β-AR, GRK 저해제 및 아데닐일시클라제로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합형 프로바이러스 플라스미드.
48. 제 46 항에 있어서, 상기 β-ASP는 아데닐일시클라제 이소형태 VI인 것을 특징으로 하는 재조합형 프로바이러스 플라스미드.
49. 제 46 항에 있어서, 상기 β-ASP는 아데닐일시클라제 사람 이소형태 VI인 것을 특징으로 하는 재조합형 프로바이러스 플라스미드.
50. 제 46 항에 있어서, β-ASP를 코딩하는 유전자는 야생형 β-ASP 유전자의 변이체이고, 변이체는 상기 β-ASP 유전자의 하나이상의 비번역된 영역에서의 결실을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합형 프로바이러스 플라스미드.
51. 제 50 항에 있어서, 상기 결실은 3'-비번역된 영역의 적어도 약 100bp를 제거하는 것을 특징으로 하는 재조합형 프로바이러스 플라스미드.
52. 제 50 항에 있어서, β-ASP를 코딩하는 유전자는 3'-비번역된 영역에서의 결실을 갖는 변이체 AC 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합형 프로바이러스 플라스미드.
53. 제 50 항에 있어서, β-ASP를 코딩하는 유전자는 3'-비번역된 영역을 제거하는 결실을 갖는 절단된 AC_VI유전자인 것을 특징으로 하는 재조합형 프로바이러스 플라스미드.
54. 제 46 항에 있어서, 상기 복제결손 바이러스 게놈은 복제결손 아데노바이러스 게놈인 것을 특징으로 하는 재조합형 프로바이러스 플라스미드.
55. 제 46 항에 따른 재조합형 프로바이러스 플라스미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
56. 사람 아데닐일시클라제 VI(AC_VI) 폴리펩티드, 또는 아데닐일시클라제 활성을 갖는 그것의 변이체를 코딩하는 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리누클레오티드.
57. 도 12A에 나타낸 서열내에서 유사한 길이의 누클레오티드 서열과 적어도 95의 전체 서열 동일성을 갖는 적어도 100개의 누클레오티드의 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리누클레오티드.
58. 제 57 항에 있어서, 상기 전제 서열 동일성은 적어도 99인 것을 특징으로 하는 분리된 폴리누클레오티드.
59. 제 57 항에 있어서, 상기 폴리누클레오티드는 도 12A에 나타낸 서열내에서 유사한 길이의 누클레오티드 서열과 적어도 95의 전체 서열 동일성을 갖는 적어도 1000개의 누클레오티드의 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리누클레오티드.
60. 제 56 항에 있어서, 상기 폴리누클레오티드는 도 12A에 나타낸 누클레오티드 서열을 갖는 폴리누클레오티드로 고 긴축성에서 하이브리드형성하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리누클레오티드.
61. 제 56 항의 폴리누클레오티드에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
62. 제 61 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 도 12B에 나타낸 서열내에서 유사한 길이의 누클레오티드 서열과 적어도 95의 전체 아미노산 서열 동일성을 갖는 적어도 300개의 아미노산 잔기 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
63. 제 62 항에 있어서, 상기 전체 아미노산 서열 동일성은 적어도 99인 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
64. 제 56 항의 폴리누클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 벡터.
65. 제 64 항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터 및 지질 기제 벡터로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 벡터.
66. 제 64 항에 있어서, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터 및 아데노 관련 바이러스 벡터로 이루어지는 군에서 선택된 복제결손 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.