JP2003513942A - インビボ遺伝子送達による心血管疾患を処理するための技術および組成物 - Google Patents

インビボ遺伝子送達による心血管疾患を処理するための技術および組成物

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Abstract

(57)【要約】 心臓疾患および末梢血管疾患を含む心血管疾患を有する患者を処置するための方法が提供される。本発明の好ましい方法は、心臓に供給する血管へまたは末梢虚血組織へ遺伝子を含むベクターを導入することにより、心筋層または末梢虚血組織へ、脈管形成タンパク質または脈管形成ペプチドをコードする遺伝子のインビボ送達を含む。本発明は、以下の工程からなる心血管疾患処置についての方法および組成物に関する：冒された組織へ、脈管形成タンパク質またはペプチドをコードした導入遺伝子の送達する工程（これは、導入遺伝子を含むベクターを上述の組織に導入し、ここでこの導入遺伝子が発現し、疾患の症状が改善する）。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （政府支援研究に関する記述） 本明細書中に記述の業績であるものは、国立保健研究所の助成金番号がＶＡ−
ＨＬ０２８１２０１、ＨＬ１７６８２１８およびＩＰ５０ＨＬ５３７７３のもと
、米国の助成により支援されている。米国政府は本発明において特定の権利を持
ち得る。
【０００２】 （関連事例の関する相互参照） 本願は、米国出願番号０９／６０９，０８０（２０００年６月３０日出願）の
継続出願であり、これは米国出願番号０９／４３７，１５６（１９９９年１１月
５日出願）の継続出願であり、これは米国出願番号０８／７２２，２７１（１９
９６年２月２７日出願（発行手続き中））の継続出願であり、これは米国出願番
号０８／４８５，４７２（１９９５年６月７日出願）の継続出願であり、これは
米国出願番号０８／３６９，２０７（１９９５年２月２８日出願）の継続出願で
あり、およびこの出願は国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／０２７０２（１９９９
年２月９日出願）の継続出願であり、この出願は米国出願番号０９／０２１，７
７３（１９９８年２月１１日出願）の継続出願であり、これは米国出願番号０８
／４８５，４７２の継続出願（１９９５年６月７日出願）（現在、米国特許第５
，７９２，４５３号として発行）であり、およびこの出願は、米国出願番号０９
／０６８，１０２（１９９８年４月３０日出願）の継続出願であり、これは米国
出願番号０８／８５２，７７９（１９９７年５月６日出願）および米国出願番号
０９／１３２，１６７の継続出願（１９９８年８月１０日出願）である。上記の
特許出願の全ては、本明細書中で参考として援用される。
【０００３】 （発明の分野） 本発明は、心血管疾患を処置する方法と組成物に関連し、これはインビボ遺伝
子治療法による。さらに明確には、本発明は、脈管形成導入遺伝子のインビボ送
達による心臓疾患の処置および／または末梢血管疾患の処置についての、技術と
ポリヌクレオチド組成物に関連する。
【０００４】 （本発明の背景） アメリカ心臓協会（Ａｍｅｒｉｃａ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｃｏｃｉａｔｉｏｎ
）（１９９５年統計サプリメント）の報告によると、米国において約６０００万
人の成人が心血管疾患に苦しんでいる。米国において、年間約１００万人が心血
管疾患により死亡しており、これは全ての死亡者の４０％以上を表している。そ
れぞれの年で、米国では狭心症の約３５０，０００の新症例があり、胸部の痛み
につながる一過的な心筋虚血により特徴付けられる冠状動脈疾患の共通の状態が
ある。同様に、それぞれの年で約４００，０００人の患者が、うっ血心不全つま
り「ＣＨＦ」、心臓疾患の他の徴候と診断を受けている（米国において、これは
、必須理由で入院する最も頻繁に起こる原因となっている）。１９９６年には、
推定７２５，０００人が末梢血管疾患に苦しんでおり、このうち１００，０００
人以上が、四肢の切断を余儀なくされている。
【０００５】 心筋虚血は、心臓の筋肉（心筋）十分な血液供給を得ず、従って必要なレベル
の酸素と栄養素が奪われるときに起こる、心臓機能障害の一側面である。心筋虚
血は、例えば、狭心症、心臓発作および／またはうっ血性心不全を含む種々の心
臓疾患を招く。心筋虚血の最も一般的な原因は、アテローム性動脈硬化（または
、冠状動脈疾患つまり「ＣＡＤ」と称される）であり、これは冠状動脈、心筋へ
の血液供給を行う血管の閉塞を引き起こす。心筋虚血の現在の処置は、薬理学療
法、冠状動脈バイパス外科手術、および、バルーン血管形成のような技術を使用
する経皮的な血管再開通術である。標準的な薬理学療法は、以下に示すいずれか
を含む方策について言及される：心筋への血液供給を増加させること、または心
筋の酸素および栄養素についての要求量を減らすこと。例えば、心筋に対する血
液供給の増加は、カルシウムチャネルブロッカーまたはニトログリセリンのよう
な作用薬によって達成される。これらの作用薬は、減少した動脈の直径を、動脈
壁での平滑筋を緩和することによって拡張すると考えられている。酸素、栄養素
についての心筋での要求量の減少は、以下のいずれかによって達成される：心臓
における血行動態負荷（Ｈｅｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｌｏａｄ）を減少させる作用
薬（例えば、動脈血管拡張薬（ａｒｔｅｒｉａｌ ｖａｓｏｄｉｌａｔｏｒｓ）
）、または特定の血行動態に対する心臓の収縮性応答（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ
ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を減少させる作用薬（例えば、βアドレナリン作動性受容
のレセプターアンタゴニスト）。虚血性心臓疾患の外科的処置は、一般に、戦略
的におかれたバイパス移植片（通常は、伏在静脈または内乳動脈）による罹患し
た動脈セグメントのバイパス形成手術に基く。経皮的血管再開通術は、一般に、
罹患した冠状動脈が狭くなることを軽減するためのカテーテル使用に基く。全て
の方策は、虚血症状の数を減らすこと、および絶つために用いるが、全ての方策
には様々な限界が存在する。この限界のうちのいくつかについて、以下で議論す
る。
【０００６】 心臓疾患を持つ多くの患者（彼らの多くの重篤な心筋虚血は、心臓発作を招く
）が、うっ血性心不全を持っていると診断される。うっ血性心不全は、代謝的な
要求を満たす為に不適切な心拍出量を招く、異常な心機能であると定義される（
Ｂｒａｕｎｗａｌｄ、Ｅ．編、Ｈｅａｒｔ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎ
ｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，４２６頁、１９９８年）。米国で推定５
００万人がうっ血性心不全に苦しんでいる。一旦、ＣＨＦの症状が中程度に重篤
（ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ ｓｅｖｅｒｅ）となると、その進行は、以下の理由で
多くの癌に比べずっと悪くなる。つまり、このような患者の半数のみが、２年以
上生存できると予想されるからであるＢｒａｕｎｗａｌｄ、Ｅ．編、Ｈｅａｒｔ
Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，４
７１〜４８５頁、１９９８年）。薬物療法は、初めはＣＨＦの症状（例えば、水
腫、運動不耐性および息切れ）を和らげ、いくつかの症例においては、延命する
。しかし、薬物療法を適用したとしても、この疾患の予後は厳しく、ＣＨＦ発生
率は上昇し続けている（例えば、Ｂａｕｇｈｍａｎ、Ｋ．、Ｃａｒｄｉｏｌｏｇ
ｙ Ｃｌｉｎｉｃｓ １３：２７−３４、１９９５を参照のこと）。ＣＨＦの症
状は、息切れ、疲労、衰弱、脚の腫れおよび運動不耐性が挙げられる。理学的検
査で、心不全を持つ患者は、心拍数および呼吸数の上昇、水泡音（肺中の液体の
兆候である）、水腫、頚静脈怒張、および一般的には、拡張型心筋症の状態にあ
る。最も一般的な、ＣＨＦの原因は、アテローム性動脈硬化である。このアテロ
ーム性動脈硬化は、心筋へ血液を供給する冠状動脈に閉塞を引き起こす。したが
って、うっ血性心不全は一般に、冠状動脈疾患（これは、範囲（ｓｃｏｐｅ）ま
たは唐突性（ａｂｒｕｐｔｎｅｓｓ）において大変重篤であり、慢性または急性
心不全を招く）と関連する。このような患者において、一つ以上の冠状動脈の大
規模および／または突然の閉塞は、適切な心筋に対する血液の流れを不可能にし
、重篤な虚血、およびある場合には、心筋梗塞または心筋の死を招く。結果とし
て生じる心筋の壊死は、進行性の慢性心不全または急性低拍出状態（双方とも高
死亡率である）を伴う傾向がある。
【０００７】 うっ血性心不全患者のほとんどが、肥大化した、低収縮心臓に発展し、「拡張
型心筋症」（または、ＤＣＭと本明細書中では使用される）と称される状態にな
る。ＤＣＭは、典型的には、拡張化した、低収縮（ｈｙｐｏｃｏｎｔｒａｃｔｉ
ｌｅ）左心室および／または右心室との所見により診断される状態である。さら
に、大多数の症例においては、拡張化した心臓が関連するうっ血性心不全は、冠
状動脈疾患の結果である、しばしば重篤であるため一つ以上の心筋梗塞の原因と
なる。しかし、かなり多くの症例において、冠状動脈疾患の特徴（例えば、アテ
ローム性動脈硬化）の非存在下でＤＣＭは起こり得る。拡張型心筋症が伴わない
ＣＡＤである、多くの症例では、ＤＣＭの原因は、公知または疑われている。以
下を例として包含する：家族性心筋症（例えば、進行性の筋ジストロフィー、筋
緊張性筋ジストロフィー、フリートライヒ運動失調、および遺伝性拡張型心筋症
状を伴う）、心筋炎症を招く感染症（例えば、種々のウイルス、細菌、他の寄生
動物による感染症）、非感染性炎症（例えば、以下に起因する非感染性炎症：自
己免疫疾患、産辱性心筋症、超過敏反応または移植拒絶反応）、心筋炎を引き起
こす代謝障害（例えば、栄養異常、内分泌学的異常および電解質異常を含む）、
および心筋炎を引き起こす毒性作用薬（アルコール、ならびに特定の化学療法剤
およびカテコールアミン）への暴露。しかし、非ＣＤＣ性ＤＣＭの大部分の症例
において、疾患の原因は、依然として未知であり、従ってその状態は「特発性拡
張型心筋症」（または「ＩＤＣＭ」）と称される。内在的因果関係による潜在的
な差異にかかわらず、多くの患者は心筋虚血を提示する（これらのうち何人かは
、顕著なアテローム性動脈硬化を持ち得ない）。さらに、重篤な冠状動脈疾患を
持っていないにもかかわらず、ＤＣＭの患者は狭心症を経験し得る。
【０００８】 ＣＨＦの発生は、いくつかの以下を含む主要な治療的関心を提示する：進行性
心筋障害（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｊｕｒｙ）、拡張型心臓に伴う血行力学
的非効率（ｈｅｎｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｉｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）、全身的塞
栓の切迫（ｔｈｒｅａｔ）、およびの心室性不整脈の危険性。従来の血管再開通
術は、非ＣＡＤ性ＤＣＭの処置についての選択肢とはならない。なぜならば、閉
塞性冠状動脈疾患（ｏｃｃｌｕｓｉｖｅ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）
は主要な原因でないからである。ＣＤＭの原因が公知または、疑われている場合
の患者にとってさえ、ダメージは代表的には、容易に可逆的ではない。例えば、
アドリアマイシ性心臓毒性（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃａｒｄ
ｉｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）の症例において心筋症は一般に不可逆性であり、これに
苦しむ患者の６０％以上が死に至る。いくらかのＤＣＭ患者については、その原
因自体が、未知である。結果として、ＤＣＭに対して一般的に適用できる処置は
ない。内科医は、これまでＤＣＭの患者の表れる症状を軽減することに焦点をお
いてきた（例えば、利尿薬による体液鬱滞の軽減、および／または、アンギオテ
ンシン変換酵素阻害薬による酸素、栄養素に対する心筋の要求の減少）。結果と
して、約５０％のＤＣＭを示す患者が、診断から２年以内で死に至り、しばしば
その原因は心室性不整脈を伴う突然心臓停止である。「心室再構成（ｖｅｎｔｒ
ｉｃｕｌａｒ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）」は、心筋梗塞後に起こる心臓疾患の一
局面であり、多くの場合心室機能のさらなる減少を招く。多くの場合、心筋梗塞
の治癒後、回復した梗塞と正常組織のあいだの境界領域における継続的虚血と他
の因子が拡張および／または残りの心臓組織の再構成につながる。心臓全体の拡
張は、約５０％のこのような梗塞を持つ患者で起こり、再構成は、早ければ梗塞
後１〜２週間で起こり得るのだが、通例、心筋梗塞後数ヶ月間進行する。衰弱し
た残りの心室機能は、心筋梗塞に続く不利な結果を占う最良の預言者である。し
たがって、心筋梗塞後の心室再構成を予防することは、有益である。心室再構成
を防止を試みる一つのアプローチは、心筋梗塞に苦しむ患者を、アンギオテンシ
ン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬で処置することである（例えば、ＭｃＤｏｎａｌｄ
、Ｋ．Ｍ．、Ｔｒａｎｓ．Ａｓｓｏｃ．Ａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ １０３：
２２９−２３５、１９９０；Ｃｏｈｎ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１８（
Ｓｕｐｐｌ．ＩＶ）ＩＶ−４−ＩＶ−１２、１９９５）。しかし、これらの作用
薬は、有害な心室再構成の防止に幾分効果があるだけであり、新しい治療法が必
要とされている。
【０００９】 ＣＨＦに対する現在の処置は、以下を包含する：薬理学的療法、冠状動脈血管
再開通過程（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｒｅｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏ
ｃｅｄｕｒｅ）、および心臓移植。ＣＨＦに対する薬理学的療法は、以下に向け
られてきた：心臓の収縮力を減少（ジギタリスおよびβアドレナリン作動性受容
体アゴニストのような変力性作用薬を用いる）、肺およびその他場所における液
体貯留の減少、心臓の働きの減少（アンギオテンシン変換酵素阻害薬のような、
全身性体血管抵抗を減少する作用薬を用いる）。βアドレナリン作動性受容体ア
ゴニストは、また試験されてきた。薬理学的作用剤は症状を改善し、潜在的に延
命をする一方、ほとんど症例における予後は依然として暗い。
【００１０】 冠状動脈関連疾患に起因する、心不全患者のいくらかは、少なくとも一時的に
、血管再開通術（例えば、冠状動脈バイパス形成外科手術および血管形成術）に
より利益を得る。心筋が死んでおらず、不適切な血流による機能不全が原因であ
る場合には、このような処置は潜在的に有益である。正常な冠状動脈血流が回復
した場合、前述の機能障害を起こしていた心臓はより正常に収縮し得、心機能は
回復し得る。しかし、患者が不適切な微小血管床（ｂｅｄ）（より重篤なＣＨＦ
患者に見られ得る）を持っていた場合、軽微な改善が見とめられたとしても、血
管再開通術は心機能を、正常またはほぼ正常なレベルにまで回復することはほと
んどない。さらに、バイパス移植片の不成功および血管形成術後の再狭窄の発生
は、そのような処置を受けた患者にとって更なる危険をもたらす。心臓移植は、
交絡する他の疾患がなく比較的若いＣＨＦ患者には、適切な選択肢である。しか
し、この選択肢は、このようなごく少数の患者のみの選択肢であり、大変高額な
である。要するに、ＣＨＦは質の悪い予後となり、現状の治療法に対応していな
い。
【００１１】 さらに複雑なＣＨＦが関連する生理学的条件は、心臓疾患の患者に起こる傾向
がある種々の自然な適応である。これらの自然な応答は、初め心機能の完全をも
たらすが、これらは結果としてこの疾患を悪化させる他の問題、困惑させる処置
を招き、生存に対して不利な効果を与える。このようなＣＨＦ患者に観察される
一般的な適応応答は、以下のである：（ｉ）ナトリウムの再吸収に誘導される体
積維持（ｖｏｌｕｍｅ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）（これは、細胞質の体積を膨張さ
せ、はじめ心拍出量の改善をする）（ｉｉ）心拡大（ｃａｒｄｉａｃ ｅｎｌａ
ｒｇｅｍｎｅｔ）（拡張（ｄｉｌａｔｉｏｎ）および肥大（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐ
ｈｙ））（これは一回の拍出量は増加し得るが、相対的に通常の壁張力（ｗａｌ
ｌ ｔｅｎｓｉｏｎ）は維持する）おおよび（ｉｉｉ）心臓に影響を与えるアド
レナリン作用性神経末端からの副腎髄質ホルモン放出増大（これは、βアドレナ
リン作動性受容体との相互作用によって、心拍数および心収縮を増大し、それに
よって心拍出量を増大する）。しかし、これら３つ適応のそれぞれが、様々な理
由で完全に役に立たなくなる。とりわけ、体液鬱滞が浮腫および肺における体液
貯留（これは、呼吸を損なう）を招く傾向がある。心拡張は、重篤な拡張と壁張
力の減少が続いて起こる有害な左心室再構成に至り得、従ってＣＨＦを悪化させ
る。最後には、心臓の副腎髄質ホルモンへの長期間暴露は、心臓をアドレナリン
に対して非応答状態にし、暗い予後となる。
【００１２】 末梢血管の疾患は、心臓疾患のように、しばしば組織（例えば、骨格筋）への
制限された血流（これは（血管疾患のように）特に運動時などの代謝要求が増加
するときに、虚血に至る。）に起因する。従って、末梢血管に存在するアテロー
ム性動脈硬化は、冒された管により供給されいる組織に虚血を起こし得る。この
問題は、末梢動脈閉塞疾患（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ａｒｔｅｒｉａｌ ｏｃｃ
ｌｕｓｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＰＡＯＤ）として公知であり、大変頻繁に患
者の下肢を冒す。心血管疾患のほかの形態と同様に、この状態またはすくなくと
もこの症状のうちいくつかは、以下により処置し得る：薬物（例えば、アスピリ
ンまたは、血液粘性を降下させる他の作用薬）の使用、外科的な介入（例えば、
動脈移植片、脂肪性プラーク沈着物（ｆａｔｔｙ ｐｌａｑｕｅ ｄｅｐｏｓｉ
ｔｓ）の外科的除去）、または血管形成術などの内血管処置（ｅｎｄｏｖａｓｃ
ｕｌａｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）。症状が改善し得る一方、このような処置の有
効性は、上に記載した理由と類似の理由で、代表的には不適切である。
【００１３】 近年、心血管疾患の処置に対する研究は新脈管形成に向けられてきた。新脈管
形成は、一般に血管の発生と分化のことを呼ぶ。代表的には「脈管形成タンパク
質（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）」と呼ばれる多くのタンパク質が
、新脈管形成を促進することが公知である。このような脈管形成タンパク質は、
せい線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリー、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）
ファミリー、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）ファミリー、インシュリン様増殖
因子（ＩＧＦ）ファミリーおよびその他（より詳しくは以下および当該分野で記
載される）のメンバーを包含する。例えば、ＦＧＦおよびＶＥＧＦファミリーの
メンバーは、増殖および発生の間、新脈管形成の調節因子として認識される。成
体動物の新脈管形成でのこれらの役割は、近年研究されてきた（以下で議論する
）。ＦＧＦおよびＶＥＧＦファミリーの新脈管形成活性（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ
ａｃｔｉｖｉｔｙ）について研究されてきた。例えば，酸性ＦＧＦ（「ａＦＧ
Ｆ」）タンパク質は、コラーゲン被膜マトリックス（ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｃｏｔ
ａｅｄ ｍａｔｒｉｘ）の中で、成体ラットの腹膜腔に置かれたとき、十分な脈
管形成および正常な灌流構造（ｐｅｒｆｕｓｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）という
結果となった（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ、
８６：７９２８〜７９３２、１９８９年）。塩基性ＦＧＦ（「ｂＦＧＦ」）タン
パク質を冠状動脈閉塞である成体犬冠状動脈に注入した場合、心筋機能不全の減
少、心筋梗塞の軽減、および危険な状態にあった床（ｂｅｄ）における血管分布
像の増加に至ったと報告された（Ｙａｎａｇｉｓａｗａ−Ｍｉｗａら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ、２５７：１４０１〜１４０３、１９９２年）。同様の結果が、ｂＦＧＦ
タンパク質を使用した、心筋虚血のモデル動物において報告された（Ｈａｒａｄ
ａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９４：６２３〜６３０、１９９４年；Ｕ
ｎｇｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２６６：Ｈ１５８８〜Ｈ−１５９５
、１９９４年）。側枝血流の上昇は、ＶＥＧＦタンパク質で処置したイヌにおい
て示された（Ｂａｎａｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、８９：２１８３〜２１８
９、１９９４年）。
【００１４】 しかし、心臓の新脈管形成を促進するための、このようなタンパク質導入の潜
在的な使用に関連する困難は、以下を含む：十分な時間のより適切な局在化の達
成、およびタンパク質が取込と心筋細胞における新脈管形成効果の促進に必要と
される適切な形態と濃度であって、かつそれを維持していることの確認。初めは
高く（例えば、巨丸剤導入に続いて）しかし、その後（空だの浄化力により）急
速に降下するタンパク質の濃度は、毒性および無効果となる。さらなる困難は、
このタンパク質の反復導入および反復注入である。
【００１５】 いくつかの刊行物は、特定の心血管疾患を含む疾患の処置または予防のための
遺伝子導入使用を仮定してる。例えば、以下を参照のこと：Ｆｒｅｎｃｈ，”Ｇ
ｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏ
ｒｄｅｒｓ，”Ｈｅ １８：２２２−２２９，１９９３；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，”
Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｓｃｈｅｍ
ｉｃ Ｈｅａｒｔ Ｄｉｓｅａｓｅ，” ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆ
ＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ ３０６：１２９−１３６，１９９３；Ｓｃ
ｈｎｅｉｄｅｒ ａｎｄ Ｆｒｅｎｃｈ，”Ｔｈｅ Ａｄｖｅｎｔ ｏｆ Ａｄ
ｅｎｏｖｉｒｕｓ：Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ
ｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅ，” Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８８：１９３７−１
９４２，１９９３；ａｎｄ Ｍａｚｕｒ ｅｔ ａｌ．，”Ｃｏｒｏｎａｒｙ
Ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，” Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ ａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏａｙ，２１：１０４−
１１１，１９９４。 さらに、いくつかのグループは、プラスミド、レトロウイ
ルスベクター、アデノウイルスベクターおよび他のベクターを用いたインビボに
おける心筋への遺伝子導入を提案している（例えば、以下を参照のこと：Ｂａｒ
ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ＩＩ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８
４（４）：Ａｂｓｔｒａｃｔ １６７３，１９９１；Ｂａｒｒ ｅｔ ａｌ．，
ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，１：５１−５８，１９９４；Ｆｒｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．
，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９０（５）：２４０２−２４１３，１９９４；Ｆｒ
ｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９０（５）：２４１４−２
４２４，１９９４；Ｆｒｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９
０：１５１７ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ． ２７８５，１９９４；Ｌｅｉｄｅｎ
，ｅｔ ａｌ．，Ｗ０９４／１１５０６ （２６ Ｍａｙ １９９４）；Ｇｕｚ
ｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，７３（６）：１２０２−１２０７
，１９９３；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：１１４９８−１１５０２，１９９３；Ｍｕｈｌ
ｈａｕｓｅｒｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，６：１４５７−
１４６５，１９９５；Ｍｉｉｈｌｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｃｉｒｃ．Ｒｅ
ｓ．，７７（６）：１０７７−１０８６，１９９５；ａｎｄ Ｒｏｗｌａｎｄ
ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｗ．，６０（３）：７２ １−７２８
，１９９５）。 しかし、一般にこれらの報告は、潜在的な治療法についての提案また希望以上
のものをほとんど提供しない。これの動物データ提供する報告のうち、ほとんど
が現実ののインビボ条件に適切に則した疾患モデルを使用していない。さらに、
計画されたインビボでの方法は、一般に次の一つ以上の欠陥を含んでいる：不適
切な形質導入効率および不適切な導入遺伝子発現；炎症、組織壊死を含む使用し
たベクターに対する著しい免疫応答；および重大な、形質導入および導入遺伝子
発現の目的器官に対する標的化の相対的不能（例えば、心臓を標的化した遺伝子
導入が、試験動物の肝臓、腎臓、肺、脳、および精巣などの非心臓部位に導入遺
伝子が送達されるという結果に至る）。このような例で、速い分裂をしている細
胞への導入遺伝子の挿入は、潜在的に導入遺伝子発現の持続時間の減少を招く。
このような細胞の例は、以下を含む：内皮細胞（これは全ての血管の内層を形成
する）、線維芽細胞（心臓中に分散している）。所望の細胞のみその導入遺伝子
を受け取り発現するため、およびその導入遺伝子が全身に分布しないために、こ
の導入遺伝子を標的化することは、臨床的には重要な考慮すべきことがらである
。これが達成されなかった場合、導入遺伝子の全身での発現およびそれに付随す
る問題をも招く。例えば、炎症性浸潤（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｉｎｆｉｌ
ｔｒａｔｅ）は、肝臓でのアデノウイルス介在遺伝子導入後に立証されている（
Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：４４０７
、１９９４年）。さらに、炎症性浸潤は、心筋壁（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｗａ
ｌｌ）に挿入した針を通した直接心筋内注入後の心臓において立証されている（
Ｆｒｅｎｃｈら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、９０（５）、２４１４−２４２４、
１９９４年）。
【００１６】 βアドレナリン作動性シグナルに関連するうっ血性心不全の特定形態を標的化
する方法は、近年ＰＣＴ公開 ＷＯ９８／１００８５（１９９８年３月１２日）
でＨａｍｍｏｎｄらにより示された。この方法は、βアドレナリン作動性シグナ
ルの減少に関連する心血管疾患患者の心臓へ、βアドレナリン作動性シグナル経
路の要素をコードする遺伝子の送達を包含する。
【００１７】 （発明の要旨） 本発明は、以下の工程からなる心血管疾患処置についての方法および組成物に
関する：冒された組織へ、脈管形成タンパク質またはペプチドをコードした導入
遺伝子の送達する工程（これは、導入遺伝子を含むベクターを上述の組織に導入
し、ここでこの導入遺伝子が発現し、疾患の症状が改善する）。例えば、心臓で
の収縮機能おおよび／または血流は、導入遺伝子含有ベクターのすくなくとも一
つの患者の冠状動脈へ導入することで増大し得、ここでこの導入遺伝子は、心筋
に送達され、ここで発現される。方法は、末梢動脈閉塞疾患のような末梢血管疾
患における用途においても、また提供される。従って、本明細書中で記載し例示
したように、これらの方法は以下に対して処置に有用である：心血管疾患、末梢
血管疾患、および類似の障害。
【００１８】 本発明は、以下の工程を含む、患者の虚血組織における血流を増大する方法を
提供する：導入遺伝子を含むベクターをこの組織に導入することにより、脈管形
成タンパク質およびペプチドを、上述組織の虚血領域に送達する工程（このこと
により、この導入遺伝子はこの組織で発現し、血流は上昇する）。
【００１９】 ある局面においては、このベクター（脈管形成タンパク質またはペプチドコー
ドする導入遺伝子を含有する）は、虚血骨格筋に導入される、ここで脈管形成タ
ンパク質またはペプチドは発現され、血流の上昇を引き起こし、この組織のおけ
る虚血は減少する。代替の実施形態において、このベクターは、虚血組織に血液
を提供する血管に導入される（例えば、冠状動脈供給の心筋または末梢血管供給
の骨格筋）。本発明で用いられるベクターは、プラスミド、好ましくはウイルス
ベクター（例えば、複製欠損性（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ
）アデノウイルス）であり得る。本発明の様々な局面および治療的応用は、以下
に記載し、例示する。
【００２０】 一つの局面では、本発明は、患者の心臓における収縮機能の増大についての方
法を提供し、これは以下の工程からなる：導入遺伝子を含むベクターの心筋に導
入することより、患者の心筋へ、脈管形成タンパク質またはペプチドをコードす
る導入遺伝子を送達（好ましくは一つ以上冠状動脈への送達）する工程（ここで
、導入遺伝子は心筋に送達され、発現され、そして心臓の収縮機能は上昇する）
。導入遺伝子は、例えば、一つ以上の冠状動脈への冠状動脈内注入または、血液
を心筋に提供する伏在静脈または内乳動脈移植片に導入し得る。導入遺伝子は、
好ましくは、少なくとも一つの脈管形成タンパク質またはペプチドをコードして
いる。本発明で使用するベクターは、プラスミドまたは、好ましくはウイルスベ
クター（例示のように、複製欠損性アデノウイルス）であり得る。ウイルスベク
ター血統（好ましくは、相対的にほとんど、なたは全く野生型ウイルスを含んで
いない）を、深く（少なくとも約１ｃｍ）、一つまたは両方の冠状動脈または移
植片の内腔（好ましくは、右および左の双方の冠状動脈または移植片の中）に注
入し、および好ましくは１０7〜１０13の量のウイルス粒子（より好ましくは、
１０9〜１０11のウイルス粒子）を光学デンシトメトリーを用いて決定すること
によって、局所的に所望の数の細胞、特に心筋細胞をトランスフェクトすること
が可能であり、脈管形成タンパク質コード遺伝子または脈管形成ペプチドコード
遺伝子の効果を受けた心筋において、これにより遺伝導入効率の最大化を起こし
、心臓外部位での望まない脈管形成、およびウイルス性タンパク質に対する炎症
性応答の可能性を最小化する。心筋特異的なプロモーターが使用された場合、発
現は、心筋にさらに限定され、さらに潜在的に有害な、網膜のような非心臓組織
で起こる新脈管新生の効果を減少する。
【００２１】 この治療的技術に従って使用されるキットと組成物は、また提供され得る。
【００２２】 （好ましい実施形態の詳細な説明） （定義） 「心臓疾患」は、急性および／または慢性の心臓の機能不全をいう。心臓疾患
は、しばしば心臓収縮機能における疾患に関連し、そして心筋への血流の可観測
の減少（例えば、冠状動脈疾患の結果として）に関連する。心臓疾患の徴候は、
心筋虚血を含み、それは狭心症、心発作および／またはうっ血性心不全を生じ得
る。
【００２３】 「心筋虚血」は、心筋が十分なレベルの酸素および栄養を得ない状態であり、
これは典型的には心筋への不充分な血液の供給による（例えば、冠状動脈疾患の
結果として）。
【００２４】 「心不全」とは、心臓が、体へ代謝要求を満たすための適切な血流を与えない
状態として臨床的に定義される。症状としては、息切れ、疲労、虚弱、脚部腫脹
、および運動不耐が挙げられる。理学的検査において、心不全を有する患者は、
心拍数および呼吸速度の上昇、ラ音（肺における体液の指標）、浮腫、頚静脈拡
張、および一般的には心臓肥大を有する傾向がある。深刻な心不全を有する患者
は死亡率が高い；代表的には、患者の５０％が、この状態を発症してから２年以
内に死亡する。いくつかの場合においては、心不全は、重篤な冠状動脈疾患（「
ＣＡＤ」）と関連し、代表的には、本明細書中および当該分野で記載されるよう
に、心筋梗塞および進行性慢性心不全または急性低心拍出量性状態を生じる。他
の場合においては、心不全は、重篤な冠状動脈疾患とは関連することなく、拡張
型心筋症と関連する。
【００２５】 「末梢血管疾患」は、末梢血管（すなわち、心臓ではない）および／またはそ
れらに供給を受ける組織の急性または慢性疾患をいう。心臓疾患と同じく、末梢
血管疾患は、典型的には血管系から供給される組織への不充分な血流から生じ、
血液不足は、例えば虚血、あるいは深刻な場合には組織細胞の死を生じる。末梢
血管疾患の特徴は、末梢動脈潜在性疾患（ｐｅｒｉｆｅｒａｌ ａｒｔｅｒｉａ
ｌ ｏｃｃｕｌｕｓｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ（ＰＡＯＤ））および末梢筋虚血を
含むが、これらに限定しない。頻繁には、末梢血管疾患の症状は、患者の末端、
特に足に顕著である。
【００２６】 本明細書中で用いられるように、用語「治療効果を有する」および「成功した
治療」とは、本質的に同じ意味を有する。心臓疾患に罹患している患者は、この
患者が本発明の方法に従って脈管形成因子遺伝子導入を受けた後、心臓疾患の症
状の１つ以上の低減または消失が認められるおよび／または検出されることが示
された場合、この症状について首尾良く「処置され」る。これらの兆候または症
状の低減はまた、患者が感じ得る。従って、このような心不全状態の成功した処
置の指標としては、狭心症、疲労、虚弱、息切れ、脚部腫脹、ラ音、心拍数もし
くは呼吸速度、浮腫、または頚静脈拡張のいずれかの症状の低減を患者が示し、
そしてそれを感じることが挙げられる。患者はまた、より優れた運動耐性を示し
、心室機能および心機能の改善を伴ってより縮小した心臓を有し、そして一般的
には心臓状態に関連した必要な通院回数が少なくなる。心機能の改善は、患者の
代謝的必要性を満たすことが必要条件であり、そして患者は、軽度の労作中また
は安静時に症状を示さない。これらの兆候および症状の多くは、医師が精通して
いる日常的手順によって容易に目視でき、そして／または容易に測定可能である
。心機能の改善の指標は、処置した臓器における血流が増加および／または収縮
機能を含む。以下に記載されるように、患者における血流は、タリウム画像化（
Ｂｒａｕｎｗａｌｄ ，Ｈｅａｒｔ Ｄｉｓｅａｓｅ，第４版、２７６−３１１
頁（Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９２）に記載される）
によって、または超音波心臓検査（実施例１および５、ならびにＳａｈｎ，ＤＪ
．ら．，Ｃｉｃｕｌａｔｉｏｎ． ５８：１０７２−１０８３，１９７８におい
て記載される）によって測定され得る。脈管形成遺伝子導入前後の血流は、これ
らの方法を使用して比較され得る。心機能の改善は、上記のように、兆候および
症状の減少と関連する。超音波心臓検査に加えて、当該分野で公知のように核（
非侵襲性）技術による駆出率（ＬＶ）を測定し得る。血流および収縮機能を、本
発明にしたがって処置した末梢臓器において同様に測定し得る。
【００２７】 「脈管形成タンパク質またはペプチド」とは、脈管形成または脈管形成活性、
すなわち、血管発達を促進する任意のタンパク質またはペプチドをいう。
【００２８】 「ポリヌクレオチド」とは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチ
ドのいずれか、あるいはそれらのアナログの任意の長さのヌクレオチドのポリマ
ー形態をいう。この用語は、分子の一次構造をいい、従って二本および一本鎖の
ＤＮＡならびに二本および一本鎖のＲＮＡを含む。また、メチル化および／また
はあるいはキャップ化ポリヌクレオチドなどの修飾ポリヌクレオチドも含まれる
。
【００２９】 ポリヌクレオチドに適用される「組換え」とは、ポリヌクレオチドが、クロー
ニング、制限および／または連結工程の種々の組み合わせ、および自然界で見出
されるポリヌクレオチドと区別された構築物を生じる他の手順の産物であること
を意味する。
【００３０】 「遺伝子」または「導入遺伝子」とは、タンパク質をコードする配列を含むポ
リヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一部をいう。ほとんどの場合、その遺
伝子が転写を効果的に促進するために、コード配列と作動可能に連結されたプロ
モーターもまた含むことも望ましい。当該分野で周知のように、エンハンサー、
リプレッサー、およびその他の調節配列もまたその遺伝子の活性を調節するため
に含まれ得る（例えば、以下に引用される文献を参照のこと）。
【００３１】 用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」とは、任意の長さ
のアミノ酸ポリマーをいうために交換可能に使われる。これらの用語はまた、グ
リコシル化、アセチル化およびリン酸化を含む反応により翻訳後に修飾されたタ
ンパク質も含む。
【００３２】 「異種」成分は、天然に位置する実体から相違する実体の中に導入されるかま
たはその中で生産される成分をいう。例えば、ある生物由来であり、かつ別の生
物に遺伝子工学技術により導入されたポリヌクレオチドは、異種のポリヌクレオ
チドであり、発現された場合、異種ポリペプチドをコードし得る。同様に、天然
のコード配列から取り出され、かつ別のコード配列に作動可能に連結されたプロ
モーターまたはエンハンサーは、異種のプロモーターまたはエンハンサーである
。
【００３３】 本明細書中で用いられる「プロモーター」は、作動可能に連結された遺伝子あ
るいはコード配列の転写を制御するポリヌクレオチド配列をいう。種々の異なっ
た起源由来の多数のプロモーター（構造的、誘導的、および抑制的プロモーター
を含む）は、当該分野で周知であり（ＧｅｎＢａｎｋのようなデータベースにお
いて同定される）、クローン化ポリヌクレオチド配列としてまたはその範囲で入
手可能である（例えば、ＡＴＣＣなどの寄託機関および他の市販または個人の入
手源から）。
【００３４】 本明細書中で用いられる「エンハンサー」は、作動可能に連結された遺伝子ま
たはコード配列の転写を増強するポリヌクレオチド配列をいう。種々の異なる起
源由来の多数のエンハンサーは、当該分野で周知であり（ＧｅｎＢａｎｋのよう
なデータベースにおいて同定される）、クローン化ポリヌクレオチド配列として
またはその範囲内で入手可能である（例えば、ＡＴＣＣなどの寄託機関および他
の市販または個人の入手源から）。プロモーター配列（例えば、慣用のＣＭＶプ
ロモーター）を含む多くのポリヌクレオチドはまた、エンハンサー配列も含む。
【００３５】 「作動可能に連結された」とは、そのように記載された各成分が、それぞれ意
図したように作用できる関係にある、２つ以上の成分の併置をいう。プロモータ
ーは、遺伝子またはコード配列の転写を制御する場合、遺伝子またはコード配列
に作動可能に連結される。作動可能に連結されたプロモーターは、通常はコード
配列の上流に位置するが、必ずしもそれに隣接しているわけではない。エンハン
サーは、コード配列の転写を増加させる場合、コード配列に作動可能に連結され
る。作動可能に連結されたエンハンサーは、コード配列の上流、内部、または下
流に位置する。ポリアデニル化配列は、転写がコード配列からポリアデニル配列
へと進行するように、コード配列の下流末端に位置する場合、コード配列と作動
可能に連結される。
【００３６】 「レプリコン」とは、適切な宿主細胞でのそのポリヌクレオチドの複製を可能
にする複製起点を含むポリヌクレオチドをいう。例には、異種の核酸が組み込ま
れ得る標的細胞のレプリコン（例えば，核染色体およびミトコンドリア染色体）
、ならびに染色体外レプリコン（例えば、複製プラスミドおよびエピソーム）が
含まれる。
【００３７】 本明細書中で用いられる「遺伝子送達」、「遺伝子導入」などは、導入に用い
られた方法とは関係なく、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチド（時には「導入
遺伝子」とも言われる）の導入をいう用語である。このような方法には、ベクタ
ー仲介遺伝子導入（例えば、ウイルス感染／トランスフェクション、または種々
のその他のタンパク質に基づくあるいは脂質に基づく遺伝子送達複合体による）
、および「裸の」ポリヌクレオチドの送達を容易にする技術（例えば、電気穿孔
、「遺伝子銃」送達、およびポリヌクレオチドの導入に使用される種々の他の方
法）のような種々の周知の技術が含まれる。導入されたポリヌクレオチドは、宿
主細胞で安定にまたは一過的に維持され得る。安定な維持には、代表的には、導
入ポリヌクレオチドが宿主細胞に適合性の複製起点を含むか、あるいは染色体外
レプリコン（例えば、プラスミド）、または核もしくはミトコンドリア染色体の
ような宿主細胞のレプリコンに組み込むことのいずれかが必要である。当該分野
で公知であり、本明細書中において記載されるように、多数のベクターは、哺乳
動物細胞への遺伝子の導入を仲介し得ることが知られている。
【００３８】 本明細書中で用いられる「インビボ」の遺伝子送達、遺伝子導入、遺伝子治療
などは、外因性ポリヌクレオチドを含むベクターを、生物（例えば、ヒトまたは
ヒト以外の哺乳動物）の身体に直接導入し、これにより外因性ポリヌクレオチド
がこのような生物の細胞にインビボで導入されることをいう用語である。
【００３９】 「ベクター」（時には遺伝子送達または遺伝子導入の「ビヒクル」と呼ばれる
）は、インビトロまたはインビボのいずれの場合でも宿主細胞に送達されるポリ
ヌクレオチドを含む巨大分子あるいは分子複合体をいう。送達されるポリヌクレ
オチドは、遺伝子治療における目的のコード配列を含み得る。
【００４０】 「脈管系」または「血管の」は、哺乳動物の体内の血液（およびリンパ液）を
運ぶ血管系をいう用語である。
【００４１】 「血管」は、動脈、細動脈、毛細血管、細静脈、静脈、静脈洞および脈管の脈
管を含む哺乳動物血管系の任意の血管をいう。心臓疾患を処置することにおける
本発明の好ましい局面において、脈管形成の導入遺伝子を含むベクターは、心筋
に血液を供給する血管導管に直接導入される。このような血管導管は、冠状動脈
ならびに伏在静脈または内胸動脈移植片のような脈管を含む。
【００４２】 「動脈」は、血液が心臓から出ていく血管をいう。冠状動脈は、心臓それ自体
の組織に供給しているのに対し、その他の動脈は体の残りの器官に供給する。動
脈の一般構造は、多層の動脈壁により囲まれた内腔から構成されている。
【００４３】 「個体」または「患者」は、哺乳動物、好ましくは大型哺乳動物、最も好まし
くはヒトをいう。
【００４４】 本明細書中で用いられる「処置」または「治療」は、個々の患者に、個体にお
いて予防的、治療的または他の有益な作用を惹起し得る薬剤を投与することをい
う。
【００４５】 本明細書中で用いられる「遺伝子治療」は、個々の患者に治療用遺伝子（単数
または複数）を含むベクターを投与することをいう。
【００４６】 「治療用ポリヌクレオチド」または「治療用遺伝子」は、個体に導入した場合
、個体において予防的、治療あるいは他の有益な作用を惹起し得るヌクレオチド
配列をいう。
【００４７】 （参考文献） 特に示されない限りは、本発明を実施するに当たって、これらは、当該分野の
技術内である、従来の分子生物学的技術などを用いる。 このような手法は、参
考文献で説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８９）； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ． Ａｕｓｕｂｅ
ｌら編、１９８７および最新版）； Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｔ． Ｂｒｏｗｎ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９９１）；
Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｇｏｅｄｄｅｌ編、
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９１）； Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎ
ｅｓ（Ａ． Ｂｏｔｈｗｅｌｌら編、Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌ． １９９０
）； Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｍ．Ｋｒ
ｉｅｇｌｅｒ， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９０）； Ｒｅｃｏｍｂ
ｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（Ｒ．Ｗｕら編、Ａｃａｄｅｍｉ
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ｃｈ（Ｍ． ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９１）； Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｓ（Ｒ． Ａｄａｍｓ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ １９９０）； Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎ
ｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．
Ｍｉｌｌｅｒ ＆ Ｍ． Ｃａｌｏｓ編、１９８７）； Ｍａｍｍａｌｉａｎ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｍ． Ｂｕｔｌｅｒ編、１９９１）
； Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ． Ｐｏｌｌａｒｄら編、Ｈ
ｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９９０）； Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ
Ｃｅｌｌｓ、第２版（Ｒ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙら編、Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓ
ｓ １９８７）； Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｓｏｒｔｉｎｇ（
Ｍ． Ｍｅｌａｍｅｄら編、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ １９９０）； Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，
Ｉｎｃ．）； Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ（Ｇ． Ｂｕｌｌｏｃｋ および Ｐ． Ｐｅｔｒｕｓｚ編、Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８２，１９８３，１９８５，１９８９）； Ｈａ
ｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（Ｄ
． Ｗｅｉｒ および Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）； Ｃｅｌｌｕｌａｒ
ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ａ． Ａｂｂａｓら，
Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ． １９９１， １９９４）； Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ． Ｃｏｌｉｇａｎ
ら編、１９９１）； Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙシリーズ； Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙシリーズ； Ｏ
ｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ． Ｇａｉｔ編、１９
８４）； およびＡｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ． Ｆｒｅｓｈ
ｎｅｙ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８７）；Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉ
ｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙシリー
ズ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ ｐｕｂｌｉｓ
ｈｅｒｓ ｆｏｒ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）
；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎシリーズ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ
＆Ｗｉｌｋｉｎｓ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ ｆｏｒ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａ
ｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）；およびＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈシリーズ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ
ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ ｆｏｒ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉ
ａｔｉｏｎ）を参照のこと。
【００４８】 本発明の方法で用いられ得る送達および外科的理論を記載するさらなる参考文
献として、以下が挙げられる：Ｔｏｐｏｌ， ＥＪ（編）、Ｔｈｅ Ｔｅｘｔｂ
ｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ、第２版
（Ｗ．Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ． １９９４）； Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ
， ＲＢ， Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｕｒｇｅｒｙ、第３版（Ｗ．Ｂ． Ｓａｕｎ
ｄｅｒｓ Ｃｏ． １９８９）； Ｔｈｅ Ｃｅｃｉｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏ
ｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１９版 （Ｗ．Ｂ． １９９２）； およびＳａｂｉ
ｓｔｏｎ， Ｄ， Ｔｈｅ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｒｙ、 第１
４版（Ｗ．Ｂ． １９９１）。血管内に見出される細胞型、および本発明の方法
に有用であり得る血管系細胞型を記載するさらなる参考文献として、以下が挙げ
られる：Ｗ． Ｂｌｏｏｍ および Ｄ． Ｆａｗｃｅｔｔ、Ａ Ｔｅｘｔｂｏ
ｏｋ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ、（Ｖ．Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ． １
９７５）。
【００４９】 種々の刊行物では、心血管疾患を含む疾患の予防のための遺伝子導入の使用を
想定している。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第７巻：Ｇ
ｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ， Ｍｕｒｒａｙ， Ｅ．（編）、Ｗｅｉｓｓ， Ｃｌｉｆｔｏｎ， Ｎ．Ｊ
． ，１９９１； Ｍａｚｕｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２１：１０４−１１１， １９９４； Ｆｒｅｎｃｈ
， Ｈｅｒｚ １８：２２２−２２９， １９９３； Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ３０６： １２９−
１３６， １９９３； ならびにＳｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ
８８：１９３７−１９４２， １９９３を参照のこと。
【００５０】 上記の章で引用される参考文献は、これらの参考文献が本発明の実施に使用さ
れる技術を教示する程度に、本明細書において参考として援用される。
【００５１】 （参考として援用） 特許、特許出願、および他の刊行物を含む、本出願に引用される全ての参考文
献は、本明細書によって参考として援用される。
【００５２】 （種々の好ましい実施形態の詳細な説明） 本発明の種々の好ましい局面は、以下に要約され、そしてさらに以下の詳細な
説明および図面に記載および例示される。
【００５３】 本発明は、心筋虚血、心不全、および末梢血管疾患を含む循環器疾患を処置す
るための方法および組成物に関連する。
【００５４】 心臓疾患を処置するための本発明の方法において、脈管形成タンパク質または
ペプチドをコードする遺伝子を含むベクター構築物が、患者の心臓に対して標的
化され、ここで、心筋において外因性脈管形成タンパク質が発現し、改善された
血流および／または改善された心収縮機能によって心臓機能不全を回復する。改
善された心機能は、最終的には心臓疾患または心不全の一つ以上の症状の軽減ま
たは消失、および予測死亡率を超える延命へ導く。
【００５５】 同様に、本発明の方法による末梢血管疾患の処置において、少なくとも一つの
脈管形成タンパク質またはペプチドをコードする導入遺伝子を含むベクター構築
物を、罹患した組織（例えば虚血骨格筋）に標的化させ、外因性の脈管形成タン
パク質の合成は、末梢血管疾患の症状を、例えば罹患（例えば、虚血）した組織
の領域への血流の増大および／または筋肉において、罹患した筋肉の収縮機能を
改善することによって、回復および／または治癒する。
【００５６】 したがって好ましい特徴として本発明は、心筋虚血を有する患者における心臓
疾患の処置のための方法を提供し、冠状血管内部への注入により患者の心筋へ導
入遺伝子の挿入されたベクターを送達することを含む方法（好ましくは、一つま
たは二つの冠状動脈（または移植片）へ直接ベクターを注入することによって）
を提供する。導入遺伝子は発現され、そして血流および／または収縮機能が改善
される。図に示したように脈管形成タンパク質またはペプチド（例えばＦＧＦ−
５、ＦＧＦ−４、ａＦＧＦ，ｂＦＧＦおよび／またはＶＥＧＦ）をコードする導
入遺伝子を有するベクターを用いて、そのベクターを心臓へ送達しそこでタンパ
ク質またはペプチドが、心筋において持続した期間に連続的に治療的に有意な程
度産生し、脈管形成が心筋の罹患した領域で促進され得る。他の導入遺伝子（例
えば、β−アドレナリンシグナルタンパク質または他の心臓増強性タンパク質ま
たは筋肉増強性タンパク質をコードする導入遺伝子）もまた、以下に記載するよ
うに脈管形成導入遺伝子の使用と合わせて使用され得る。本発明に用いられるベ
クターは、プラスミドまたは好ましくはウイルスベクターであり、例えば複製能
欠損ウイルスもしくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。ウイルスベクター
のストック（これは、野生型のウイルスをほとんどまたは全く含まない）を一つ
または二つの冠状動脈の管腔（または移植片）に、好ましくは、左右両方の冠状
動脈（または移植片）に、そして好ましくは、光学密度測定によって決定される
ように１０7〜１０13のウイルス粒子の量（より好ましくは、１０9〜１０11のウ
イルス粒子）で深く注射することによって、罹患した心筋において脈管形成を促
進させるタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子で、所望される数の細胞
を局所的にトランスフェクトすることが可能である。これによって、遺伝子転移
の治療効力を最大にし、そして心臓外の部位での好ましくない脈管形成およびウ
イルスタンパク質に対する炎症性応答の可能性の両方を最小にする。
【００５７】 もう一つの好ましい局面として、本発明はまた、うっ血性心不全に罹患した患
者を処置するのに持ちいられ得、この患者の心臓に導入遺伝子挿入ベクター（こ
のベクターは脈管形成タンパク質またはペプチドをコードする導入遺伝子を含む
）を送達することによって、導入遺伝子が心筋において発現されて、心臓におい
て血流の増加および機能の増大を生じる。うっ血性心不全に罹患した患者には、
拡張型心筋症を呈しそして深刻な心筋梗塞を呈し、典型的には重症のまたは閉塞
性の冠状動脈疾患を有するものがいる。ベクターは、心筋へベクターを送達する
ために、好ましく血液を心臓の心筋へ供給する血管壁に導入される。好ましくは
、ベクターは冠状動脈、伏在静脈移植片または内胸動脈移植片の管腔に導入され
、もっとも好ましくはベクターは、左右両方の冠状動脈の管腔に導入される。冠
状動脈への注入は、好ましくは単回注入で、選択した動脈のそれぞれに比較的に
深く行う（例えば、好ましくは少なくとも血管腔内約１ｃｍ）。
【００５８】 本発明の技術は、心筋梗塞に罹患した（または罹患し得る）患者の有害な心室
再構成を予防または緩和するための方法である。またベクターは、遺伝子の発現
のためのプロモーターに作動可能に連結された脈管形成タンパク質またはペプチ
ドをコードする導入遺伝子を含み、患者の心臓へ送達され、そこで導入遺伝子が
発現され、そして有害な心室再構成を緩和する。
【００５９】 （脈管形成タンパク質およびペプチドをコードする導入遺伝子） 本発明において、血流および／または収縮機能を促進し得る脈管形成タンパク
質またはペプチド因子をコードする１つ以上の導入遺伝子が、使用され得る。本
明細書に記載される方法および当該分野における方法によって測定し得る脈管形
成活性を示す任意のタンパク質またはペプチドは、本発明と関連して潜在的に使
用され得る。多数のそのような脈管形成タンパク質が当該分野で公知であり、新
たな形が日常的に同定される。適切な脈管形成タンパク質またはペプチドは、線
維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長
因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、および他のファミリーの
メンバーによって例示される。ＦＧＦファミリーのメンバーはａＦＧＦ（ＦＧＦ
−１）、ｂＦＧＦ（ＦＧＦ−２）、ＦＧＦ−４（「ｈｓｔ／ＫＳ３」としても知
られる）、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６を含むが、これらに限定されない。ＶＥＧＦ
は、インビトロおよびインビボにおいて虚血に応じて心筋細胞によって発現され
ることが示された；これは、生理学的条件下の、および病理学的状態への適応応
答の間の脈管形成の調節因子である（Ｂａｎａｉら、 Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ
８９：２１８３−２１８９， １９９４）。ＶＥＧＦファミリーは、ＶＥＧＦ
−Ａサブファミリーのメンバー（例えば、ＶＥＧＦ−１２ｌ、ＶＥＧＦ−１４５
、ＶＥＧＦ−１６５、ＶＥＣＦ−１８９およびＶＥＧＦ−２０６）、およびＶＥ
ＧＦ−Ｂサブファミリー（例えば、ＶＥＧＦ−１６７およびＶＥＧＦ−ｌ８６）
およびＶＥＧＦ−Ｃサブファミリーのメンバーを含むが、これらに限定されない
。ＰＤＧＦは、例えばＰＤＧＦ ＡおよびＰＤＧＦ Ｂを含む。ＩＧＦは、例え
ばＩＧＦ−１を含む。他の脈管形成タンパク質およびペプチドは、当該分野で公
知であり新規なものは、日常的に同定される。これらのタンパク質および他のタ
ンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列、および対応するアミノ酸配列
は、同様に当該分野で公知である（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ配列データベースを
参照のこと）。
【００６０】 脈管形成タンパク質およびペプチドはペプチド前駆体を含有し、ペプチド前駆
体は活性化ペプチド、および脈管形成タンパク質またはペプチドの「誘導体」、
ならびに「機能的等価量」へと翻訳後に処理される。脈管形成タンパク質および
ペプチドの誘導体は、類似のアミノ酸配列を有するペプチドであり、そして関連
する脈管形成タンパク質またはペプチドの１つ以上の活性をある程度保持するペ
プチドである。当業者に周知のように、一般的に有用な誘導体は、脈管形成活性
に関係するタンパク質の部位または領域において実質的な配列の類似点（アミノ
酸レベルでの）を有する。類似的に、当業者が「機能的等価量」によってそれを
容易に理解するが、特有の脈管形成タンパク質またはペプチドの１つ以上の活性
の代用となり得る活性を有するタンパク質またはペプチドを意味する。好ましい
機能的等価量は、特有の脈管形成タンパク質またはペプチドの活性の全てを保持
する；しかし、定量的に測定される場合、機能的等価量は野生型ペプチドまたは
タンパク質よりも強いまたは弱い活性を有し得る。
【００６１】 ＦＧＦファミリーの詳細に関しては、例えば、Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ａｎｎ．Ｎ．
Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６３８：８９−９７，１９９１；Ｂｕｒｇｅｓｓら、Ａ
ｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：５７５−６０６，１９８９；Ｍｕｈｌ
ｈａｕｓｅｒら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：１４５７−１４６５，１９
９５；Ｚｈａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：３４８７，１９８８；
Ｓｅｄｄｏｎら、Ａｎｎ．．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６３８：９８−ｌ０８
，１９９１を参照のこと。ヒトｈｓｔ／ＫＳ３（すなわち、ＦＧＦ−４）に関し
ては、例えば、Ｔａｉｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８４：２９８０−２９８４，１９８７を参照のこと。ヒトＶＥＧＦ−Ａに関し
ては、Ｔｉｓｃｈｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０６：１１９４７−１１
９５４，１９９１，およびその中の参考文献；Ｍｕｈｌｈａｕｓｅｒら、Ｃｉｒ
ｃ．Ｒｅｓ．７７：１０７７−１０８６，１９９５；およびＮｅｕｆｅｉｄら、
ＷＯ９８／１００７１（１９９８年３月１２日）を参照のこと。他の種々の公知
な脈管形成タンパク質は同様に記載されている；例えば、種々のＶＥＧＦタンパ
ク質およびＶＥＧＦ関連タンパク質は例えば、Ｂａｉｅｄら、ＷＯ９９／４０１
９７（１９９９年８月１２日）；およびＢｏｈｌｅｎら、ＷＯ９８／４９３００
（１９９８年１１月１２日）を参照のこと。そのような結合をコードする脈管形
成タンパク質および遺伝子送達ベクターの結合は、Ｇａｏら、ＵＳＳＮ ０９／
６０７，７６６，（２０００年６月３０日にファイル）、表題「Ｄｕａｌ Ｒｅ
ｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ
ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｕｓｅ」を参照のこと。これによって、その全
体が参考として援用される。また当業者に理解されるように、脈管形成タンパク
質は他の脈管形成タンパク質の発現、安定性または機能性を向上させることで脈
管形成を促進し得る。そのような脈管形成タンパク質またはペプチドの例として
、例えば低酸素症（例えば、Ｈｉｆ−１、Ｈｉｆ−２などのような低酸素症誘導
性因子）との応答において誘導される制御因子が挙げられる（例えば、Ｗａｎｇ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（９）：４３０４−
８，１９９３；Ｆｏｒｓｙｔｈｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６（９）
：４６０４−１３，１９９６；Ｓｅｍｅｎｚａら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ，５１
（２）：５５３−５，１９９７；およびＯ’Ｒｏｕｒｋｅら、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅ
ｓ，９（６−７）：３２７−３２，１９９７９を参照のこと）；ならびに他の制
御因子、例えば、炎症（例えば誘導性酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）、および
構造的対応物（ｃＮＯＳ）（例えば、Ｙｏｓｈｉｚｕｍｉら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ
，７３（１）：２０５−９，１９９３；Ｃｈａｒｔｒａｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ，２６９（９）：６７６５−７２，１９９４；Ｐａｐａｐｅｔｒｏｐｏ
ｕｌｏｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ，１５０（５）：１８３５−４４，１９９
７；およびＰａｌｍｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，２７４（２ Ｐｔ １
）：Ｌ２１２−９，１９９８を参照のこと））のような心臓血管疾患と関係する
生理的状態によって誘導されるような制御因子を含む。そのような脈管形成タン
パク質のさらなる例として、特定のインシュリン様増殖因子（例えばＩＧＦ−１
）および脈管形成（Ａｎｇｓ）が挙げられ、これらはＶＥＧＦのような他の脈管
形成タンパク質の発現および／または活性化を促進および／または刺激すること
が報告されている（例えば、Ｇｏａｄら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３７
（６）：２２６２−６８（１９９６）；Ｗａｒｒｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ
．，２７１（４６）：２９４８３−８８（１９９６）；Ｐｕｎｇｌｉａら、Ｄｉ
ａｂｅｔｅｓ，４６（１０）：１６１９−２６（１９９７）；およびＡｓａｈａ
ｒａら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ，８３（３）：２３３−４０（１９９８）およびＢｅ
ｒｍｏｎｔら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ８５：１１７−１２３，２０００を参
照のこと）。類似的に、肝細胞増殖因子（散乱係数としてまた参照される）は、
インビボでの血管形成を誘導することが報告されているが（例えば、Ｇｒａｎｔ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１９３７−１９４
１，１９９３）、これはまた、ＶＥＧＦの発現を増加することが報告されている
（Ｗｏｊｔａら、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．７９：４２７−４３８，１９９９）。
脈管形成タンパク質のさらなる例として、内因性脈管形成遺伝子のプロモーター
として作用する天然制御因子ポリペプチドおよび合成制御因子ポリペプチド（脈
管形成タンパク質制御因子）が挙げられる。未変性の脈管形成ポリペプチド制御
因子は、内因性脈管形成遺伝子の誘導から引き起こされ得る。上記に記載される
Ｈｉｆは、そのような脈管形成遺伝子の１つの例示的な例であり、脈管形成遺伝
子は他の脈管形成遺伝子の発現を誘導することで脈管形成を促進することが報告
されている。合成脈管形成ポリペプチド制御因子は、例えば内因性脈管形成遺伝
子の上流コード領域の配列に特異的に結合するマルチフィンガー（ｍｕｌｔｉ−
ｆｉｎｇｅｒ）亜鉛結合タンパク質を調製することによって設計され得、そして
そのような内因性遺伝子の発現を誘導するために使用され得る。多数の遺伝子に
ついての研究は、そのようなマルチフィンガー（ｍｕｌｔｉ−ｆｉｎｇｅｒ）Ｄ
ＮＡ結合タンパク質を設計するための「法則」の進展を導く（例えば、Ｒｈｏｄ
ｅｓおよびＫｌｕｇ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ（１９９３年２
月），５６−６５項；ＣｈｏｏおよびＫｌｕｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１（２３）：１１１６３−７，１９９４；Ｒｅｂａｒおよ
びＰａｂｏ、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６３（５１４７）：６７１−３，１９９４；Ｃ
ｈｏｏら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２７３（３）：５２５−３２，１９９７；Ｐ
ｏｍｅｒａｎｔｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：９３−９６，１９９５；ならび
にＬｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：５５２５
−５５３０，１９９７を参照のこと）。当業者によって理解されるように、脈管
形成を直接的あるいは間接的に促進する能力を有するタンパク質またはペプチド
をコードする多数のさらなる遺伝子は一様に同定され、そして新規の遺伝子は公
知の脈管形成タンパク質あるいは遺伝子をコードするペプチドの類似性、または
脈管形成を促進するタンパク質あるいはペプチドをコードするそれらの遺伝子の
得られる能力に基づいて同定される。それらの遺伝子およびコードされるペプチ
ドについての配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋまたはＥＭＢＬのような配列データベ
ースから直ちに入手される。これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチド
はまた、遺伝子ライブラリー（例えば、当該分野のＰＣＲまたはハイブリダイゼ
ーション技術ルーチンを用いることで）より入手され得る。
【００６２】 好ましくは、脈管形成タンパク質コード導入遺伝子は、心臓細胞または骨格筋
細胞のような哺乳類の細胞における遺伝子の転写および発現を方向付けるプロモ
ーターと作動可能に連結される。１つの現在の好ましいプロモーターは、ＣＭＶ
プロモーターである。他の実施形態において、さらに下記に記載されるように、
そのプロモーターは、心臓性特異的プロモーター（例えば、心筋細胞特異的プロ
モーター）のような組織特異的プロモーターである。好ましくは，脈管形成因子
をコードする遺伝子はまた、ポリアデニル化シグナルと作動可能に連結される。
【００６３】 遺伝子転写アプローチの成功は、遺伝子産物の合成とトランスフェクトされる
細胞からの分泌との両方を必要とする。従って、好ましい脈管形成タンパク質ま
たはペプチドは、例えばシグナルペプチドに作動可能に連結されることによる、
自然に分泌されるまたは分泌を可能にするために変更される脈管形成タンパク質
またはペプチドを含む。この観点から、分泌される脈管形成タンパク質をコード
する遺伝子（例えばＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、またはＦＧＦ−６）は、これらの
タンパク質が機能的分泌性シグナル配列を含み、細胞から直ちに分泌されるため
に好まれる。多くの、そうでなければほとんどのヒトＶＥＧＦタンパク質（ＶＥ
ＧＦ−１２１およびＶＥＧＦ−１６５を含むがこれに限定されない）はまた、直
ちに分泌され、そして分泌後に拡散する。従って、発現の際に、これらの脈管形
成タンパク質は心臓間隙に直ちに接近し得、そして脈管形成を誘導し得る。脈管
形成において発達する血管は、直径約８ミクロンを有する最少の管腔直径血管、
および少なくとも直径約１０ミクロンを有する、より大きい管腔直径血管の毛細
管を含む。脈管形成活性は、当該分野で公知のまたは本明細書中に記載の手順を
用いて、処置される組織または存在する血管の機能において増加する血液流量を
測定することで決定され得る。例えば、毛細管数または密度は、視覚的にまたは
組織部位の顕微鏡分析より動物において定量化され得る（実施例５を参照）。
【００６４】 未変性の分泌性シグナル配列が欠如しているａＦＧＦ（ＦＧＦ−１）およびｂ
ＦＧＦ（ＦＧＦ−２）のような他の脈管形成タンパク質を用いて、分泌性シグナ
ル配列を有する融合タンパク質は、当業者に精通している標準組換えＤＮＡ方法
論を用いて組換え型に生成され得る。ａＦＧＦおよびｂＦＧＦのどちらも、ある
程度自然に分泌されると考えられる；しかし、分泌シグナル配列をさらに包含さ
せることは、タンパク質の分泌の増加のために使用され得る。分泌性シグナル配
列は、典型的に所望のタンパク質のＮ−末端に位置されるが、脈管形成因子の分
泌を許容する安定な任意の位置に配置され得る。例えば、安定なシグナル配列を
含むポリヌクレオチドは、選択される脈管形成タンパク質遺伝子の第１コドンに
対する５,に融合され得る。安定な分泌性シグナル配列はＦＧＦ−４遺伝子、Ｆ
ＧＦ−５遺伝子、ＦＧ遺伝子のシグナル配列Ｆ−６またはＩＬ−１−βのような
種々の分泌化タンパク質のシグナル配列を含む。下記の実施例７は、別のタンパ
ク質からのシグナル配列を含む脈管形成タンパク質の１つの型の変異の例示であ
り、その変異は、分泌化第２タンパク質の分泌を支配する残基を有する脈管形成
タンパク質において残基を置換することによって達成される。心筋細胞から正常
に分泌されたタンパク質から誘導されるシグナル配列が使用され得る。脈管形成
遺伝子はまた、例えば心臓細胞機能を改善し得る付加機能を提供し得る。例えば
、ＦＧＦは脈管形成を促進するそれらの能力に依存し得ない心臓強化および／ま
たは「虚血性保護剤効果」を提供し得る。従って、脈管形成遺伝子を用いて、１
ｓｅ当たりの脈管形成の促進のさらなるまたは代わりの機構によって心臓機能を
向上し得る。さらなる例において、脈管形成を促進し得るＩＧＦはまた、筋肉細
胞機能を向上し得る（例えばＭｕｓａｒｏら、Ｎａｔｕｒｅ４００：５８１−５
８５，１９９９を参照のこと）；および抗アポトーシス作用を示し得る（例えば
Ｌｅｅら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４０：４８３１−４８４０，１９９
９を参照のこと）。筋肉細胞機能を向上する他のタンパク質はまた、本発明の方
法に従って使用され得る。
【００６５】 上記に示すように、１つ以上の脈管形成タンパク質またはペプチドをコードす
る遺伝子は、本発明に関連して使用され得る。従って、遺伝子または脈管形成タ
ンパク質もしくはペプチドの結合をコードする遺伝子は、本明細書中に記載の方
法に従って１つ以上のベクターを用いて送達され得る。脈管形成遺伝子のファミ
リーは、本明細書中およびそのような遺伝子の多数の例を含む当該分野に記載さ
れる。好ましくは、そのような結合が用いられる場合、遺伝子は種々の脈管形成
因子のファミリー（例えば、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、およびＩＧＦからな
る２つ以上の種々の集団の一部から選択される結合）から誘導され得る。そのよ
うな結合の１つの例示を解釈するために、ＦＧＦ遺伝子およびＶＥＧＦ遺伝子を
含むベクターが使用され得る。例示となる例として、本発明者らはＦＧＦ遺伝子
（ＦＧＦ−４フラグメント１４０）（例えば、Ｂａｓｉｌｉｃｏら、米国特許第
５，４５９，２５０（１９９５年１１月１７日公開）および関連事項に記載され
るＦＧＦ−４遺伝子およびその変異体を参照のこと）ならびに種々のＶＥＧＦ遺
伝子（ＶＥＧＦ−１４５ムテイン２）（例えば、Ｎｅｕｆｅｌｄら、ＷＯ９８／
１００７１,（１９９８年３月１２日に公開）および関連事項に記載されるＶＥ
ＧＦ−１４５遺伝子およびその変異体を参照のこと）の結合を用いた。そのよう
な結合は、付加的効果および／または相乗的効果を示し得る。多数の他の結合は
、これらの技術に基づいて当業者に明らかである。脈管形成遺伝子または脈管形
成遺伝子の結合を含むベクターはまた、本発明に従って、組織血流および／また
は収縮性機能をさらに向上させるために使用され得る１つ以上の他の遺伝子を含
み得る。心臓において、例えばβ−ＡＳＰをコードする遺伝子（Ｈａｍｍｏｎｄ
ら、同時係属中の出願 ＷＯ９８／１００８５（１９９８年３月１２日公開）に
記載されるように）は、脈管形成タンパク質またはペプチドをコードする１つ以
上の遺伝子との結合において用いられ得る。タンパク質を増強する他の心臓細胞
または筋肉細胞は、本発明の組成物および方法に類似的に組み込まれ得る。
【００６６】 本発明に従って用いられ得る遺伝子の結合は、単一ベクター（例えば、プロモ
ーターのそれぞれの制御下で分離遺伝子のような、または単一転写性遺伝子もし
くは翻訳融合遺伝子のような）に供給され得る。遺伝子の結合はまた、ベクター
の結合（このベクターは同じもしくは異なるベクター（例えばアデノウイルスベ
クターの結合）、またはアデノウイルスベクターおよびＡＡＶベクターから誘導
され得る、）として供給され得る；このベクターは同時にまたは連続して患者に
導入され得る。アデノウイルス（Ａｄ）およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の
場合、Ａｄの存在のために（Ａｄは通常ＡＡＶについてのヘルパーウイルスであ
る）、遺伝子転移を媒介するためのＡＡＶの能力は向上され得る。従ってＡｄベ
クターは、本発明によるＡＡＶベクターの導入と同時または前に導入され得る。
さらなるトランスフェクション効率において、ベクターの選択はまた導入遺伝子
発現の所望の寿命によって影響される。例示の方法によって、多数の脈管形成遺
伝子は長期的な発現を必要とせずに、長期的な効果を引き起こし得るため（例え
ば、組織血管新生において増加を生じる脈管形成の工程を惹起するまたは促進す
ることによって）、脈管形成遺伝子はアデノウイルス（または通常宿主ＤＮＡに
組み込まれない他のベクター）を用いて導入され得る。アデノウイルスは、長期
的発現が所望される導入遺伝子（例えばβ−ＡＳＰ導入遺伝子）を運ぶＡＡＶベ
クターの導入前、または共同で使用され得る。導入遺伝子および／またはベクタ
ーの他の結合は、本発明の技術および例示に基づいて当業者に明らかである。
【００６７】 ヒトの処置に関して、ヒト由来の脈管形成タンパク質をコードする遺伝子が好
ましいが、雑種活性（つまり、ヒトにおける脈管形成活性を有する）他の哺乳類
由来の脈管形成タンパク質もまた使用され得る。
【００６８】 （インビボでの遺伝子伝達のためのベクター） 一般に、目的の遺伝子は、心臓または末梢血管系にインビボで導入され、そし
てコードされたタンパク質の産生を指向する。好ましくは、この産生は構成的で
ある（しかし、誘導可能な発現系もまた使用され得る）。
【００６９】 本発明において有用なベクターは、ウイルスベクター、脂質ベースベクター（
例えば、リポソーム）および他のベクター（これらは、インビボにおいてＤＮＡ
を非分裂細胞へ送達することが可能である）を含む。現在、ウイルスベクター、
特に、複製能欠損ウイルスベクター（例えば、複製能欠損アデノウイルスベクタ
ーおよびアデノ随伴ウイルスベクターを含む）が好ましい。本発明における産生
および使用の容易さのために、複製能欠損アデノウイルスベクターが現在最も好
ましい。アデノウイルスは、非分裂細胞に効率良く感染し、それゆえ、心筋細胞
の非複製の性質のために、心筋において組換え遺伝子を発現するために有用であ
る。
【００７０】 インビボ遺伝子治療のために適切な種々の他のベクターは、本発明の使用のた
めの脈管形成タンパク質導入遺伝子を送達するために、容易に使用され得る。こ
のような他のベクターは、他のウイルスベクター（例えばＡＡＶ）、非ウイルス
タンパク質ベース送達基本骨格（ｐｌａｔｆｏｒｍ）、および脂質ベースベクタ
ー（例えば、リポゾーム、ミセル、脂質含有エマルジョンおよび当該分野に記載
される他のもの）を含む。当該分野で公知のようにＡＡＶベクターに関して、好
ましくはＡＡＶベクターはヒトにおける複製能欠損であり、例えば除去されるｒ
ｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子（これらの配列は、それ故に、ＡＡＶベクターを
複製およびパッケージ化するために（代表的にはパッケージング細胞株）イント
ランスで供給されなければならない）を有し、そして挿入される導入遺伝子（例
えば、その上に作動可能に連結するプロモーターを含む）は好ましくはＡＡＶ逆
末端反復（ＩＴＲ）に隣接される。
【００７１】 組換えウイルスベクターは１つ以上の非相同的な遺伝子および配列を含む。多
数のウイルスベクターはパッケージングに関するサイズ制限を示すため、そして
複製能欠損ウイルスベクターは一般的にインビボでの送達に好ましいため、非相
同的な遺伝子および配列は代表的に１つ以上のウイルスゲノムの一部分を置換す
ることで導入される。その欠損の結果、そのようなウイルスは複製能欠損になり
得、それ故に、欠損する機能はウイルス複製およびキャプシド形成の間にイント
ランスで供給される必要がある（例えば、複製および／もしくはキャプシド形成
に必要な遺伝子を運ぶヘルパーウイルスまたはパッケージング細胞株を用いるこ
とによって）（例えば、参考文献および下記の例示を参照のこと）。上記で述べ
られるように、導入遺伝子がウイルスｒｅｐ遺伝子および／またはウイルスｃａ
ｐ遺伝子の代わりに挿入される改変ＡＡＶベクターは、同様に当該分野で周知で
ある。類似的に、送達されるべきポリヌクレオチドが、ウイルス粒子の外部に運
ばれる改変ウイルスベクターもまた記載されている（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｄ
Ｔら、ＰＮＡＳ：８８：８８５０−８８５４，１９９１を参照のこと）。これら
および他の遺伝子送達ベクターを記載する参考文献は、当該分野で公知であり、
そのいくつかは本明細書中に援用される。
【００７２】 上記および引用参考文献で記載されるように、ベクターはまた、他の成分また
は機能性を含み得、それらはさらに遺伝子送達および／または遺伝子発現を制御
し得るか、またはさもなければ標的化細胞に対して有益な特性を提供する。この
ような他の成分は、例えば、細胞への結合または標的化に影響する成分（細胞型
または組織特異的結合を媒介する成分を含む）；その細胞によるベクターの取り
込みに影響する成分；取り込み後の細胞内でのベクターおよび核酸のプロセシン
グならびに／または局在化に影響する成分（例えば、細胞内のプロセシングおよ
び／または核局在化を媒介する薬剤）；およびポリヌクレオチドの発現に影響を
与える成分を含む。このような成分はまた、マーカー（これらは、利用されそし
てベクターによって送達される核酸を発現する細胞について検出もしくは選択す
るために使用され得る検出可能および／または選択可能なマーカーである）を含
み得る。このような成分は、そのベクターの天然の特徴（例えば、結合および取
り込みを媒介する成分または機能性を有する特定のウイルスベクターの利用）と
して提供され得るか、あるいはベクターが、このような機能性を提供するように
改変され得る。検出可能なマーカー遺伝子は、遺伝子を保有する細胞が特異的に
検出されるのを可能にする（例えば、マーカー遺伝子を運ばない細胞と区別され
る）。そのような検出可能なマーカー遺伝子の１つの例は、β−ガラクトシダー
ゼをコードするｌａｃＺ遺伝子である。下記に記載されるように、ｌａｃＺ遺伝
子は、ｌａｃＺ遺伝子を保有するベクターに伝達される細胞が染色によって検出
されるのを可能にする。選択可能なマーカーは、ポジティブ、ネガティブまたは
二機能性であり得る。ポジティブ選択可能マーカーは、そのマーカーを保有する
細胞の選択を可能にするが、ネガティブ選択可能マーカーは、マーカーを保有す
る細胞が選択的に消去されるのを可能にする。種々のこのようなマーカー遺伝子
はすでに記載されており、これらは、二機能性（すなわち、ポジティブ／ネガテ
ィブ）マーカーを含んでいる（例えば、Ｌｕｐｔｏｎ，Ｓ．，ＷＯ ９２／０８
７９６，１９９２年５月２９日公開；およびＬｕｐｔｏｎ，Ｓ．；ＷＯ ９４／
２８１４３，１９９４年１２月８日に公開を参照のこと）。このようなマーカー
遺伝子は、遺伝子治療の状況において利点であり得るさらなる制御手段を提供し
得る。広範な種々のこのようなベクターが当該分野で公知であり、そして一般的
に利用可能である（例えば、上記で引用された種々の参考文献を参照のこと）。
【００７３】 本発明の方法において使用され得るアデノウイルスベクターおよび他のウイル
スベクターを記載する参考文献は以下を含む：Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｍ．Ｓ．，Ａｄ
ｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｆｉｅ
ｌｄｓ，Ｂ．ら（編）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２巻、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１６７９−１７２１頁（１９９０）；Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．ら
、１０９−１２８頁、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ、第７巻：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｕｒｒａｙ，Ｅ．（編）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、
Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．（１９９１）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎ．ら、ＦＡＳＥＢ
Ｊｏｕｒｎａｌ ９：１９０−１９９，１９９５；Ｓｃｈｒｅｉｅｒ，Ｈ．Ｐｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ａｃｔａ Ｈｅｌｖｅｔｉａｅ ６８：１４５−１５
９，１９９４；ＳｃｈｎｅｉｄｅｒおよびＦｒｅｎｃｈ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏ
ｎ ８８：１９３７−１９４２，１９９３；Ｃｕｒｉｅｌ Ｄ．Ｔ．ら、Ｈｕｍ
ａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１４７−１５４，１９９２；Ｇｒａｈａ
ｍ，Ｆ．Ｌ．ら、ＷＯ ９５／００６５５（１９９５年１月５日）；Ｆａｌｃｋ
−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｅ．Ｓ．，ＷＯ ９５／１６７７２（１９９５年６月２２
日）；Ｄｅｎｅｆｌｅ，Ｐ．ら，ＷＯ ９５／２３８６７（１９９５年９月８日
）；Ｈａｄｄａｄａ，Ｈ．ら、ＷＯ ９４／２６９１４（１９９４年１１月２４
日）；Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｍ．ら、ＷＯ ９５／０２６９７（１９９５年
１月２６日）；Ｚｈａｎｇ，Ｗ．ら、ＷＯ９５／２５０７１（１９９５年１０月
１２日）。種々のアデノウイルスプラスミドもまた、市販供給源により入手可能
である（例えば、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｏｆ Ｔｏｒｏｎ
ｔｏ、Ｏｎｔａｒｉｏ（例えば、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｉｎｆｏ
ｒｍａｔｉｏｎ Ｓｈｅｅｔ：Ｐｌａｓｍｉｄｓ ｆｏｒ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕ
ｓ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ， １９９６を参照のこと）を含
む）。種々のさらなるアデノウイルスベクターならびにそれらの産生物および精
製のための方法は一様に同定される。
【００７４】 本発明の方法において利用され得るＡＡＶベクターを記載するさらなる参考文
献は、以下を含む：Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏ
ｖｉｒｕｓｅｓ、第Ｉ巻、１６９−２２８頁、１９９０；Ｂｅｒｎｓ，Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ、１７４３−１７６４頁（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ １９９０）；Ｃａ
ｒｔｅｒ，Ｂ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３：５３３−
５３９，１９９２；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ
ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９
２−１２９，１９９２；Ｆｌｏｔｔｅ，Ｔ．Ｒ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．
Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９−３５６，１９９２；Ｃｈａｔｔｅｒ
ｊｅｅら、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７７０：７９−９０，１９９５
；Ｆｌｏｔｔｅ，Ｔ．Ｒ．ら、ＷＯ ９５／１３３６５（１９９５年５月１８日
）；Ｔｒｅｍｐｅ，Ｊ．Ｐ．ら、ＷＯ ９５／１３３９２（１９９５年５月１８
日）；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３
−８０１，１９９４；Ｋｏｔｉｎら、ＷＯ ９８／１１２４４（１９９８年３月
１９日）；Ｋｏｔｉｎら、ＷＯ ９９／６１６０１（１９９９年１２月２日）；
Ｆｌｏｔｔｅ，Ｔ．Ｒ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：３５７−３６２，
１９９５；Ａｌｌｅｎ，Ｊ．Ｍ．，ＷＯ ９６／１７９４７（１９９６年６月１
３日）；およびＤｕら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：２５４２６１，１９９
６。種々のさらなるＡＡＶベクターならびにそれらの産生物および精製のための
方法は一様に同定される。
【００７５】 上記および科学的な参考文献に記載されるように、多数のレトロウイルス誘導
系はまた、インビボでの遺伝子送達において用いられるために発達された。例示
としてレトロウイルスのレンチウイルス属（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、ネ
コ免疫不全ウイルスなど）は改変され得、その結果、代表的に非分裂である細胞
を変換することが可能である（例えば、Ｐｏｅｓｃｈｌａ．ら、ＰＮＡＳ ９６
：１１３９５−１１３９９，１９９６；Ｎａｌｄｉｎｉ．ら、ＰＮＡＳ ９６：
１１３８２−１１３８８，１９９６；Ｎａｌｄｉｎｉら．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
７２：２６３−２６７，１９９６；Ｓｒｉｎｉｖａｓａｋｕｍａｒ．ら、Ｊ．Ｖ
ｉｒｏｌ．７１：５８４１−５８４８，１９９７；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、Ｎａｔ
．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：８７１−８７５，１９９７；Ｋｉｍら、Ｊ．Ｖ
ｉｒｏｌ．７２：８１１−８１６，１９９８；Ｍｉｙｏｓｈｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．７２：８１５０−８１５７，１９９８を参照のこと）；また、Ｂｕｃｈｓｃ
ｈａｃｈｅｒら、Ｂｌｏｏｄ １５：２４９９−２５０４，２０００を参照のこ
と；また、Ｔｈｅ Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｗ０９７／１２６２２（１
９９７年８月１０日）を参照のこと。ＨＩＶ基準レンチウイルスベクター系は、
この点についてある程度の病巣を受け入れるが、他のレンチウイルス系は近年開
発された（例えば、ＨＩＶ基準系を超える潜在的優位を提供する、ネコ免疫不全
ウイルス基準レンチウイルスベクター系）（例えば、Ｐｏｅｓｃｈｌａら、Ｎａ
ｔ．Ｍｅｄ．４：３５４−３５７，１９９８；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ．ら、Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌ．７３：２４９１−２４９８，１９９９；およびＪｏｈｎｓｔｏｎ．ら、
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：４９９１−５０００，１９９９を参照のこと；また、Ｒ
ｏｍａｎｏ．ら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １８：１９−３９，２０００による総
説および本明細書に論評される参考文献も参照のこと）。
【００７６】 ウイルスベクターに加えて、遺伝子伝達手段として用いられ得る非ウイルスベ
クターは同様に公知であり、そして進展され続ける。例えば、非ウイルスタンパ
ク質基準伝達プラットフォーム（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質を含む高分子複
合体、および遺伝子伝達を媒介する能力のあるキャリアまたは一部分、ならびに
脂質基準ベクター（例えば、リポソーム、ミセル、脂質含有エマルジョンおよび
その他））は当該分野に記載される。本発明の方法において利用され得る非ウイ
ルスベクターを記載する参考文献は以下を含む：Ｌｅｄｌｅｙ，ＦＤ，Ｈｕｍａ
ｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１１２９−１１４４，１９９５；Ｍｉｌｌ
ｅｒ，Ｎ．ら、ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ ９：１９０−１９９，１９９５；
Ｃｈｏｎｎ，Ａ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．６：６９８
−７０８，１９９５；Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ，ＪＰ．ら、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄ
．Ｂｕｌｌ．５１：５６−７１，１９９５；Ｂｒｉｇｈａｍ，Ｋ．Ｌ．ら、Ｊ．
Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．３：３１ ４９，１９９３；Ｂｒｉｇｈａｍ，Ｋ．
Ｌ．，ＷＯ ９１／０６３０９（１９９１年５月１６日）；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ
．Ｌ．ら、ＷＯ ９１／１７４２４（１９９１年１１月１４日）；Ｓｏｌｏｄｉ
ｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１３５３７−１３５４４，１９９５；
ＷＯ ９３／１９７６８（１９９３年１０月１４日）；Ｄｅｂｓら、ＷＯ ９３
／１２５６７３；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ら、米国特許第５，２６４，６１８
号（１９９３年１１月２３日）；Ｅｐａｎｄ，Ｒ．Ｍ．ら、米国特許第５，２８
３，１８５号（１９９４年２月１日）；Ｇａｏら、ＷＯ ９６／２２７６５（１
９９６年８月１日）；Ｇｅｂｅｙｅｈｕら、米国特許第５，３３４，７６１号（
１９９４年８月２日）；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ら、米国特許第５，４５９，
１２７号（１９９５年１０月１７日）；Ｏｖｅｒｅｌｌ，Ｒ．Ｗ．ら、ＷＯ ９
５／２８４９４（１９９５年１０月２６日）；Ｊｅｓｓｅｅ，ＷＯ ９５／０２
６９８（１９９５年１月２６日）；ＨａｃｅｓおよびＣｉｃｃａｒｏｎｅ、ＷＯ
９５／１７３７３（１９９５年６月２９日）；Ｌｉｎら、ＷＯ ９６／０１８
４０（１９９６年１月２５日）。多数の添加される脂質媒介インビボ遺伝子伝達
ベクターおよびベクター伝達共通因子は同定される（例えば、Ｋｏｌｌｅｎ．ら
、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：６１５−２２，１９９９；Ｒｏｙら、Ｎ
ａｔ．Ｍｅｄ．５：３８７−３９１；Ｆａｊａｃら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ
ｒ．１０：３９５−４０６，１９９９；Ｏｃｈｉｙａら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：
７０７−７１０，１９９９を参照のこと）。さらに、ウイルス組成物および非ウ
イルス媒介遺伝子伝達系を連結する系の発達は本明細書中に記載され、そして本
明細書中で用いられ得る（例えば、Ｐｈｉｌｉｐら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．，１４：２４１１−２４１８，１９９４を参照のこと；また、Ｄｉ Ｎｉｃ
ｏｌａら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：１８７５−１８８４，１９９
９を参照のこと）。種々のさらなる非ウイルス遺伝子伝達ベクター、ならびにこ
れらの調製および精製のための方法は一様に同定される。
【００７７】 上記に記載のように、ウイルスベクターのようなベクターを用いての遺伝子伝
達の有効性は、血管（例えば、動脈）または血管作用性の薬剤を用いて前注入お
よび／もしくは共同注入される組織にベクターを送達することによって向上され
得る（例えば、本明細書に記載されるようなヒスタミンまたはヒスタミンアゴニ
スト、あるいは血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）タンパク質、そしてさらに同時係
属中のＰＣＴ出願 ＷＯ９９／４０９４５（１９９９年８月１９日公開）に例示
される）。遺伝子伝達の有効性を高めるために用いられ得る血管作用性薬剤の別
の例は、一酸化窒素ドナー（例えば、ニトロプルシドナトリウム）である。最も
好ましくは、血管作用性薬剤はベクターを導入する数分前および／もしくは数分
以内で血管または組織に同時に注入される。血管作用性薬剤は、本明細書で用い
られるように、増大された血管透過性を誘導する天然物質もしくは合成物質を適
応し、そして／または血管からの遺伝子伝達ベクター（例えば、毛細血管内皮を
越えて）のような高分子の転移を向上させる。高分子に対する血管透過性を増強
することによって、または同時に動脈によって灌流される毛細血管床中で高分子
の転移を促進することによって、血管作用性薬は標的の部位へのこれらのベクタ
ーの送達を向上し得、従って標的組織において導入遺伝子の全体の発現を効果的
に向上し得る。本発明者らは、ヒスタミンを血管作用性薬として用い、そしてそ
れらは心筋のような注入される部位に対してベクターの送達を実質的に向上させ
ることが見出された。用いられ得るヒスタミン誘導体およびヒスタミンアゴニス
ト（例えば、ヒスタミンのＨレセプターと相互作用する）は以下を含む。例えば
、２−メチルヒスタミン、２−ピリジルエチルアミン、βヒスタミン、および２
チアゾールエチルアミンである。これらおよびさらなるヒスタミンアゴニストは
以下に記載される（例えば、Ｇａｒｒｉｓｏｎ ＪＣ．，Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎ
ｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ
ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（８ｔｈ Ｅｄ：Ｇｉｌｍａｎ ＡＧ，Ｒａ
ｌｌ ＴＷ， Ｎｉｅｓ ＡＳ， Ｔａｙｌｏｒ Ｐ，編）Ｐｅｒｇａｍｏｎ
Ｐｒｅｓｓ，１９９０，５７５−５８２項、および他の薬理学の学術論文）。さ
らにヒスタミンおよびヒスタミンアゴニスト（これらは、血管作用性薬剤、血管
内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）およびＶＥＧＦアゴニスト（本明細書中および引用参
考文献に記載されるように）として用いられ得る）はまた、増大する血管透過性
を誘導し得、それ故に、本明細書中に記載の組成物および方法の面において遺伝
子伝達を向上するための血管作用性薬剤として使用され得る。ヒスタミンを用い
て、ＶＥＧＦは好ましくはベクターの注入数分を越える前に標的部位を供給する
血管内に注入される。一酸化窒素ドナー（例えば、ニトロプルシドナトリウム（
ＳＰＮ））はまた、血管作用性薬剤として用いられ得る。好ましくは、一酸化窒
素ドナー（例えば、ＳＰＮ）は、開始数分前に標的組織（または標的組織を供給
する血管）に前注入され、そしてベクター組成物の注入の時間まで続けられる。
投与はまた、ベクター組成物の注入の間も続けられ得る。
【００７８】 （ヒトにおいてヘルパー非依存的および複製欠損である例示的アデノウイルス
ベクター） 一般に、目的の遺伝子は、インビボにおいて心筋細胞または心臓に導入され、
そしてコードされたタンパク質の産生を指向する。いくつかの異なる遺伝子導入
アプローチは可能である。ヒトアデノウイルス５（Ａｄ５）に基づくヘルパー非
依存的複製欠損系が、現在好ましい。このような組換えＡｄ５基準系の単一皮質
内注入を用いて、本発明者らは、インビボでの心筋細胞の有意なトランスフェク
ションを証明した（ＧｉｏｒｄａｎｏおよびＨａｍｍｏｎｄ，Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ
．，４２：１２３Ａ，１９９４）。非複製組換えアデノウイルスベクターは、冠
内注射後に高い効率のトランスフェクションを生じる冠状動脈内皮および心筋細
胞へトランスフェクトすることにおいて、特に有用である。アデノウイルスベク
ターはまた、末梢脈管構造によって（例えば、動脈内注入または直接注入によっ
て）供給される組織をトランスフェクトするのに使用され得る。
【００７９】 本明細書中で証明されるように、ヘルパー非依存的複製能欠損ヒト５型アデノ
ウイルスは、単回冠状動脈注射によりインビボにおいて大きな割合の心筋細胞へ
効果的にトランスフェクトする際に使用され得る。本発明者らは、このような送
達技術が大きな哺乳動物心臓の心筋へのベクターの効率的な標的化に使用され得
ることもまた、示した。特定の細胞または組織型にベクターを標的するさらなる
手段が、本明細書中以下および当該分野で記載されている。
【００８０】 以下に示される種々の例示において、使用した組換えアデノウイルスベクター
は、アデノウイルスゲノム由来の必須の初期遺伝子（通常、Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂ）を
欠失しており、従って欠失している遺伝子産物をトランスで提供する許容細胞株
中で増殖しない限りは複製が不可能であるヒトアデノウイルス５（ＭｃＧｒｏｒ
ｙ ＷＪら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６３：６１４〜６１７，１９８８に記載）に
基づいている。欠失しているアデノウイルスゲノム配列の代わりに、目的の導入
遺伝子が、複製能欠損アデノウイルスに感染した組織／細胞上でクローン化およ
び発現され得る。アデノウイルスに基づく遺伝子導入は、一般的に、標的細胞ゲ
ノムへの安定な組み込みを生じない。しかし、アデノウイルスベクターは、高力
価で増殖され得、そして非複製細胞をトランスフェクトし得る；そして、導入遺
伝子は娘細胞には継代されないが、これは、成体心臓心筋細胞（活発には分裂し
ない）への遺伝子導入に適切である。レトロウイルスベクターは、安定な遺伝子
導入を提供し、そして現在のところ、高力価がレトロウイルスの擬型化によって
得ることができる（Ｂｕｒｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（
ＵＳＡ）９０：８０３３〜８０３７，１９９３）。しかし、近年のレトロウイル
スベクターは、一般的に、非複製細胞（例えば、心筋細胞）を効率的に形質導入
し得ない。さらに、宿主ＤＮＡへの導入遺伝子の組込みの潜在的な危険は、短期
遺伝子導入が十分である場合、保証されない。
【００８１】 実際に、本発明者らは、脈管形成タンパク質発現の限定された持続時間が、実
質的な血流および虚血性組織機能の改善に十分であることを実証した（実施例５
を参照のこと）。従って、一過性の遺伝子導入は、そのような心臓血管状態の処
置のために治療的に適切である。心筋内へのＦＧＦ−５の遺伝子導入後の１４日
以内に、虚血性の床の血流は、２倍に増加し、効果は少なくとも１２週間持続し
た（実施例５および図８）。増加した血流は、心臓の毛細血管の数の増加と相関
した（実施例５を参照のこと）。壁の肥厚はまた、遺伝子導入後２週間以内に増
加し、そして少なくとも１２週間持続した。従って、脈管形成因子遺伝子は、治
療的効果を生じるために、感染した細胞において、数週間を越えて存在すること
は必要ではない。一旦血管が発生すると、外来性の脈管形成タンパク質の継続す
る発現は、新規血管構造の維持および血流の増加に必要でないかもしれない。
【００８２】 筋細胞のような非分裂細胞に付随する利点は、ウイルスベクターが宿主細胞の
分裂によって容易に「希釈」されないということである。しかし、心臓における
導入遺伝子発現の持続時間をさらに増強することが必要か、または所望される場
合、Ｅ１およびＥ４の両方の欠損を有する種々の第２世代アデノウイルスベクタ
ー（これはシクロホスファミド投与と組み合わせて使用され得る）を使用するこ
ともまた可能である（例えば、Ｄａｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ９２：１４０１〜１４０５，１９９５を参照のこと）。
【００８３】 アデノウイルスＥ１Ａ／Ｅ１Ｂ遺伝子で形質転換されたヒト胎児腎臓細胞であ
るヒト２９３細胞（受託番号、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ
，ＭＤ）は、そのような複製欠損ベクターの生成についての有用な許容性細胞株
の代表である。しかし、複製欠損アデノウイルスベクターの細胞内での増殖を許
容する他の細胞株もまた、使用され得る（例えば、ＨｅＬａ細胞）。
【００８４】 （組換えアデノウイルスベクターの構築） 本発明において使用されるアデノウイルスベクターは、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ １６３：６１４〜６１７，１９８８に記載されるレスキュー組換
え技術により構築され得る。手短に言えば、目的の導入遺伝子は、プロモーター
、ポリリンカー、およびＥ１Ａ／Ｅ１Ｂ遺伝子が欠失し、部分的に片側に配列し
たアデノウイルス配列を含むシャトルベクター中にクローン化される。シャトル
ベクターとしては、プラスミドｐＡＣ１（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１６３：６１４〜
６１７，１９８８）（またはアナログ）（これは、ヒトアデノウイルス５型ゲノ
ムの左末端部分をコードするが（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６３：６１４〜６１７，
１９８８）、初期タンパク質をコードする、ウィルス複製に必須のＥ１Ａおよび
Ｅ１Ｂ配列が欠失している）、およびポリリンカーを含むプラスミドＡＣＣＭＶ
ＰＬＰＡ（Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：２５
１２９〜２５１３４，１９９２）、ＣＭＶプロモーター、およびＥ１Ａ／Ｅ１Ｂ
遺伝子の欠失した、部分的なアデノウィルス配列に並んだＳＶ４０ポリアデニル
化シグナルが例証となり得る。プラスミドｐＡＣ１またはＡＣＣＭＶＰＬＡの使
用は、クローニングプロセスを促進する。次いで、シャトルベクターは、キャプ
シド形成されるには大きすぎる長さを有するヒトアデノウイルス５型のゲノム全
体を含むプラスミドと共に、ヒト２９３細胞に同時トランスフェクトされ得る。
同時トランスフェクションは、リン酸カルシウム沈殿またはリポフェクションに
より実施され得る（Ｚｈａｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５：８６８
〜８７２，１９９３を参照のこと）。プラスミドＪＭ１７は、ヒトアデノウイル
ス５型のゲノム全体およびアンピシリン抵抗性遺伝子（４．３ｋｂ）を含むベク
ターｐＢＲ３２２の部分をコードする。ＪＭ１７は、成熟ウイルス粒子を生産す
るために必要なアデノウイルスタンパク質すべてをコードするが、大きすぎてキ
ャプシド形成されない（野生型について３６ｋｂ対４０ｋｂ）。同時トランスフ
ェクトされた細胞の小さなサブセットにおいて、シャトルベクター含有導入遺伝
子（例えば、プラスミドｐＡＣ１）とアデノウイルス５型のゲノム全体（例えば
、プラスミドｐＪＭ１７）を有するプラスミドとの間で起こるレスキュー組換え
は、Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂ配列を欠く組換えゲノム、および所望する導入遺伝子を含む
が、二次的に、組換えの間にｐＢＲ３２２配列のようなさらなる配列を欠失する
組換えゲノムを提供し、それにより、キャプシド形成するのに十分小さくなる（
図１を参照のこと）。上記の方法に関しては、本発明者らは成功例を報告する（
Ｇｉｏｒｄａｎｏら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８８：１〜１３９，１９９３；
ならびにＧｉｏｒｄａｎｏおよびＨａｍｍｏｎｄ，Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．４２：１
２３Ａ，１９９４）。アデノウイルスＨＣＭＶＳＰ１ｌａｃＺ（Ｃｌｉｎ．Ｒｅ
ｓ．４２：１２３Ａ，１９９４）をコードするβガラクトシダーゼ遺伝子に駆動
されたＣＭＶは、Ｘ−ｇａｌ処理を使用する遺伝子導入の効率を評価するために
使用され得る。
【００８５】 （標的化ベクター構築物） 脈管形成導入遺伝子の心臓、または心臓内の特定の細胞型（例えば、心筋細胞
）、または他の標的細胞（例えば末梢血管における標的細胞）に限定された発現
は、以下に記載される特定の利点を提供し得る。
【００８６】 本発明は、冠状動脈、または例えば、組織特異的な導管への導入遺伝子の送達
によるだけでなく、特定の宿主細胞または宿主細胞型（例えば、心筋細胞または
他の筋細胞）に対して遺伝子の送達および／または遺伝子の発現を標的化する傾
向がある特徴を有する標的化ベクター構築物の使用による、細胞標的化の使用を
意図する。従って、以下により詳細に記載し、そして当該分野の刊行物において
記載されるように、このような標的化ベクター構築物は、標的化送達ベクターお
よび／あるいは標的化ベクターを含む。送達および／あるいは発現を制限するこ
とは、遺伝子治療の潜在的な効果にさらに焦点を合わせる手段として有用であり
得る。送達／発現をさらに制限することの潜在的な有用性は、そのほとんどが、
用いられるベクターのタイプおよびこのようなベクターを導入する方法と位置に
依存する。本明細書中で示されるように、心筋層への冠状動脈内注射によるウイ
ルスベクターの送達は、本来、高度に標的化された遺伝子送達を提供することが
観察されている（以下の実施例を参照のこと）。さらに、通常宿主細胞のレプリ
コンへの導入遺伝子の組込みを生じないベクター（例えば、アデノウイルスおよ
び多数の他のベクター）を用いれば、心筋細胞は比較的長い間導入遺伝子発現を
示すことが予測される。なぜなら、この細胞は通常複製しないからである。対照
的に、内皮細胞のような、迅速に分裂する細胞における発現は、細胞の分裂およ
び代謝回転によって減少する傾向がある。しかし、本明細書に示したように、送
達および／あるいは発現を制限する他の手段はまた、例示された送達方法に付加
されるかその代替として使用され得る。
【００８７】 標的化送達ベクターは、例えば、表面成分（例えば、リガンド−レセプター対
のメンバー（この対の他方の半分は、標的化される宿主細胞に見いだされる））
、あるいは特定の宿主細胞もしくは宿主細胞型への優先的な結合および／または
遺伝子送達を媒介する他の特徴を有するベクター（例えば、ウイルス、非ウイル
スタンパク質ベースベクターおよび脂質ベースベクター）を含む。当該分野で公
知のように、ウイルスおよび非ウイルス起源の両方の多数のベクターには、その
ような優先的な結合を促進する固有の特性を有し、そして／または優先的な標的
化をもたらすように改変されている（例えば、Ｄｏｕｇｌａｓら、Ｎａｔ．Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ．１４：１５７４〜１５７８，１９９６；Ｋａｓａｈａｒａ，Ｎ．ら
、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１３７３〜１３７６，１９９４；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎ
．ら、ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ ９：１９０〜１９９，１９９５；Ｃｈｏｎ
ｎ，Ａ．ら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．６：６９８〜７０８
，１９９５；Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ，ＪＰら、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ
．５１：５６〜７１，１９９５；Ｓｃｈｒｅｉｅｒ Ｈ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃａ Ａｃｔａ Ｈｅｌｖｅｔｉａｅ ６８：１４５〜１５９，１９９４；Ｌ
ｅｄｌｅｙ，Ｆ．Ｄ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：１１２９〜１１４４
，１９９５；Ｃｏｎａｒｙ，Ｊ．Ｔ．ら，ＷＯ ９５／３４６４７（１９９５年
１２月２１日）；Ｏｖｅｒｅｌｌ，Ｒ．Ｗ．ら，ＷＯ ９５／２８４９４（１９
９５年１０月２６日）；およびＴｒｕｏｎｇ，Ｖ．Ｌ．ら、ＷＯ ９６／００２
９５（１９９６年１月４日）を参照のこと）。
【００８８】 標的化ベクターは、送達が特定の宿主細胞または宿主細胞型に比較的制限され
る導入遺伝子の発現を生じるベクター（例えば、ウイルス、非ウイルスタンパク
質ベースベクターおよび脂質ベースベクター）を含む。例えば、本発明により送
達される脈管形成導入遺伝子は、異種の組織特異的プロモーターに作動可能に連
結され得、それにより、その特定の組織における細胞に対する発現を制限する。
【００８９】 例えば、心筋特異的ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）またはミオシン重鎖（ＭＨＣ）プ
ロモーターをコードする遺伝子由来の組織特異的転写制御配列は、上記のアデノ
ウイルス構築物のようなベクター内の導入遺伝子（例えば、ＦＧＦ遺伝子）へと
融合され得る。それゆえ、その導入遺伝子の発現は、心筋細胞に比較的制限され
得る。ｌａｃＺを有する心筋特異的ＭＬＣおよびＭＨＣプロモーターにより提供
される遺伝子発現の効力および特異性の程度は、（本明細書中で例示したような
組換えアデノウイルス系を用いて）決定されている；そして、心臓特異的発現が
報告されている（例えば、Ｌｅｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７：１５８
７５〜１５８８５，１９９２を参照のこと）。
【００９０】 ＭＬＣプロモーターは約２５０ｂｐしか含まないため、本明細書中で例示され
たアデノウイルス５型パッケージング系のような、サイズで限定される送達ベク
ター内でさえ容易に適合する。強力な転写プロモーターして知られるミオシン重
鎖プロモーターは、別の代替の心臓特異的プロモーターを提供し、そして３００
ｂｐ未満を含む。トロポニン−Ｃプロモーターのような他のプロモーターは、
小さくかつ高度に有効だが、このような組織特異性を提供しない。 （標的化遺伝子発現） 本発明の予期されなかった知見は、組換えアデノウイルスは、組換えアデノウ
イルスが遭遇する第１の血管床において、非常に効率的に取り込まれるというこ
とである。実際、実施例４の動物モデルにおいて、冠状動脈内への注入後の、心
臓におけるウイルスの取込み効率は、９８％（すなわち、ウイルスの９８％は、
心筋血管床を通るウイルスの１回目の通過において除去された）であった。さら
に、注射の間の動物から取得された血清は、２００培希釈まで、ウイルスプラー
クの増殖ができず（Ｇｒａｈａｍ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １６３：６１４〜６
１７，１９８８）、このことは、ウイルス増殖を阻害する血清因子（または結合
タンパク質）の存在を示唆する。これら２つの因子（ウイルスの第１の流路への
効果的な付着および血清結合タンパク質の可能性）は、ともに、ウイルスの遭遇
する第１の血管床に対する遺伝子発現を制限するように作用する。
【００９１】 冠状動脈内への遺伝子導入に続く心臓への遺伝子導入が制限される程度をさら
に評価するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用し、２匹の処置した
動物において、遺伝子導入の２週間後ウイルスＤＮＡの心臓外での存在の証拠が
存在するか否か調べた（以下の実施例４）。動物は、その心臓において、ウイル
スＤＮＡの存在を示したが、網膜、骨格筋または肝臓においては示さなかった。
ＰＣＲの感度は、５，０００，０００細胞あたり単一のＤＮＡ配列が検出可能な
ほどである。従って、これらのデータは、遺伝子送達の２週間後心筋外の組織に
おいて、ウイルスＤＮＡは存在しないことを実証した。これらの結果は、さらに
、他の脈管形成タンパク質および誘導体を下記のように用いて確認された。これ
らの知見は、非常に重要である。なぜなら、これらは心臓導入遺伝子標的化（す
なわち、導入遺伝子の心臓における発現を提供するが、他の場所の発現は提供し
ない）のコンセプトを確認するからである。局在化した導入遺伝子送達および発
現は、安全性を提供し、患者の処置における本発明の方法の使用をさらに増強す
る。
【００９２】 （アデノウイルスベクターの増殖および精製） アデノウイルスベクターのような組換えウイルスベクターは、標準的方法によ
りプラーク精製され得る。例えば、得られる組換えアデノウイルスウイルスベク
ターは、力価が約１０10−１０12ウイルス粒子／ｍｌの好ましい範囲でヒト２９
３細胞（トランスにＥ１ＡおよびＥ１Ｂ機能を提供する）中で増殖され得る。増
殖および精製技術は、本発明と組み合わせて使用され得る種々のウイルスベクタ
ーについて記載されている。アデノウイルスベクターは、本明細書中で例示した
が、ＡＡＶのような別のウイルスベクターもまた使用され得る。アデノウイルス
について、細胞は８０％コンフルエンスで感染され４８時間後に採集され得る。
感染した細胞の３回の凍結−融解サイクル後、細胞細片を遠心分離によりペレッ
ト化し、そしてＣｓＣｌ勾配超遠心によりウイルスを精製した（２重のＣｓＣｌ
勾配超遠心が好ましい）。インビボの注射前に、ウイルスのストックは、（例え
ば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５のようなＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムを通したゲル
濾過により）脱塩され得る。脱塩したウイルスストックはまた、所望であれば、
０．３ミクロンのフィルターにより濾過され得る。本発明者らは、代表的には二
重のＣｓＣｌ超遠心分離、続くリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に平衡化した
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５でのカラムクロマトグラフィーによりウイルスストッ
クを濃縮および精製する。得られたウイルスストックは、代表的には、最終ウイ
ルス力価が少なくとも約１０10〜１０12ウイルス粒子／ｍｌである。
【００９３】 好ましくは、組換えアデノウイルスは高度に精製され、そして実質的に野生型
（潜在的に複製可能である）ウイルスを含まない。これらの理由から、増殖およ
び精製は、例えば、適切なプライマーを用いたＰＣＲにより首尾良い組換えウイ
ルスを同定すること、２回のプラーク精製を実施すること、および二重のＣｓＣ
ｌ勾配超遠心分離により夾雑物および野生型のウイルスを除去するために行われ
得る。
【００９４】 （脈管形成導入遺伝子保有ベクターの送達） 脈管形成タンパク質導入遺伝子保有ベクターを送達するのに用いられる手段お
よび組成物は、当該分野で周知のように使用される特定のベクターに依存する。
しかし、代表的には、ベクターは、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水のような薬
学的に受容可能なキャリア／希釈液を含有する注射可能な調製物の形態であり得
る。他の薬学的なキャリア、処方物および投薬量は以下に記載した。
【００９５】 心蔵疾患へのインビボ送達の現在好ましい手段（特に、そうでなければ心筋ま
たは他の標的細胞への制限される送達および／または発現について標的化されな
いベクター構築物について）は、ベクターの、血管または心筋に直接供給する血
管または組織への注入により、好ましくは、１つまたは両方の冠状動脈内または
他の組織特異的動脈への注入による（または末梢組織へのボーラス注射による）
。例えば心筋への送達に関して、このような注入は、好ましくは、１つまたは両
方の冠状動脈の管腔、あるいは１つ以上の伏在静脈の管腔、あるいは内部の乳房
動脈移植片の管腔、あるいは心筋へ血液を送達する他の導管の管腔の内部におい
て、実質的にカテーテルを導入（代表的には少なくとも約１ｃｍ）することによ
り達成される。好ましくは注入は、左右両方の冠状動脈においてなされ、心臓の
全ての部位に全体的に分配される（例えば、ＬＡＤ、ＬＣｘおよびＲｉｇｈｔ）
。本明細書に従って、アデノウィルスベクター調製物を、任意で本明細書に記載
されるような遺伝子送達を増強する血管作用性の薬剤と組み合わせて注射するこ
とによって、心臓血管疾患（例えば、臨床的心筋虚血、または好ましくない影響
が何もない末梢血管疾患）の治療に対する効果的なアデノウィルス介在脈管形成
遺伝子転移が達成し得る。
【００９６】 ベクターは、導入遺伝子が発現されるのに十分な量で送達され、治療的利点を
提供する。ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス）において、注入可能な
調製物におけるウイルスの最終的な力価は、好ましくは約１０7〜１０13ウイル
ス粒子の範囲であり、これは効果的な遺伝子導入を可能にする。好ましくは、野
生型ウイルスを含まないアデノウイルスベクターストックは、１つまたは両方の
冠状動脈（または、移植片）の管腔内深くに注入され得、好ましくは、右と左の
両冠状動脈（または、移植片）に注入され得、そして好ましくは、光学的密度測
定により決定される１０9〜１０13ウイルス粒子の量において注入され得る。好
ましくは、ベクターは、単回注入において、各導管内に（例えば、各冠状動脈内
に）送達される。
【００９７】 本発明に従う、遺伝子治療ベクターの局所送達をさらに増強するため、および
遺伝子送達効率を増加するため、血管作用性の薬剤、好ましくはヒスタミン、ま
たはヒスタミンアゴニスト、または血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）タンパク
質、または一酸化窒素ドナー（例えば、ニトロプルシドナトリウム）を治療する
組織中に、脈管形成遺伝子治療ベクターの導入と同時に、または好ましくは数分
前のいずれかに、注射し得る。
【００９８】 冠状動脈カテーテルにより冠状動脈の管腔内に、直接ベクター組成物を注入す
ることにより、より効率的に遺伝子を標的化し、そして注入の間に近位大動脈に
対する組換えベクターの損失を最小限にすることが可能である。このタイプの注
入は、罹患した心筋の所望の数の細胞（特に心筋細胞）に、脈管形成タンパク質
またはペプチドをコードする遺伝子の局所的トランスフェクションを可能にし、
これにより、遺伝子導入の治療的効果を最大限にし、そして心臓以外の部位での
所望されない脈管形成を最小限にする。末梢血管により供給される病的な組織に
送達するために、ベクターは１つ以上の、そのような組織に供給する動脈に導入
、またはそのような組織にボーラス注射として導入し得る。
【００９９】 心筋に特異的に標的化されるベクター構築物（例えば、心筋特異的結合または
取込み成分および／または心筋特異的転写調節配列（例えば、心室筋特異的プロ
モーター）の制御下の脈管形成タンパク質導入遺伝子を取り込むベクター）は、
発現を心筋（特に、心室筋細胞）にさらに制限する手段として、そのように指向
された注入技術の代わりに、または好ましくは組み合わせて、使用され得る。免
疫応答を誘発し得るベクターについて、ベクターを上記のように心筋に供給する
血管へ直接的注入するのが好ましいが、心臓外送達またはさもなくば免疫応答の
潜在性の減少を制限するためのさらなる技術もまた、使用され得る。末梢血管に
より供給される組織を標的化するベクター（例えば、骨格筋を標的化するベクタ
ーまたは骨格筋で特異的に発現する発現するプロモーター）も同様に使用され得
る。
【０１００】 以下に詳細に記載のとおり、脈管形成導入遺伝子を含むウイルスベクターのイ
ンビボ送達のための本発明の技術の使用は、導入遺伝子発現が肝細胞で生じず、
そしてウイルスＲＮＡは、冠状動脈注入の後のいずれの時点でも、尿中に見出さ
れないことが実証された。さらに、眼、肝臓、または骨格筋における心臓外の遺
伝子発現の証拠は、この様式の導入遺伝子の冠状動脈内への送達の２週間後に、
ＰＣＲによって検出され得なかった。
【０１０１】 種々のカテーテルおよび送達経路は、当該分野で公知のように、冠状動脈内へ
の送達を達成するために使用され得る。（例えば、Ｔｏｐｏｌ，ＥＪ（編）、Ｔ
ｈｅ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｃａｒｄｉｏ
ｌｏｇｙ、第２版（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．１９９４）；Ｒｕｔｈｅ
ｒｆｏｒｄ，ＲＢ，Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｕｒｇｅｒｙ、第３版（Ｗ．Ｂ． Ｓ
ａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．１９８９）；Ｗｙｎｇａａｒｄｅｎ ＪＢら（編）、Ｔ
ｈｅ Ｃｅｃｉｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１９版 （
Ｗ．Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ， １９９２）；およびＳａｂｉｓｔｏｎ，Ｄ，
Ｔｈｅ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｒｙ、第１４版（Ｗ．Ｂ． Ｓａ
ｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．１９９１）を含む上記で引用された参考文献を参照のこと
）。直接的な冠状動脈内（または移植片血管）注入は、蛍光透視のガイダンスの
もと、標準的な経皮的カテーテルに基づく方法を使用して実施され得る。任意の
種々の冠状動脈カテーテルまたは例えばＳｔａｃｋ灌流カテーテルは、本発明に
おいて使用され得る。例えば、種々の一般的目的のカテーテル、ならびに改変カ
テーテルは、本発明の使用に適切であり、例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃａｒｄ
ｉｏｖａｓｕｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＣＳ），Ｔａｒｇｅｔ Ｔｈｅｒ
ａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｂｏｓｔｏｎ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃおよびＣｏｒｄｉｓか
ら市販されている。また、心筋への送達が冠状動脈への直接的注入（これは、現
在最も好まれる）により達成される場合、多数のアプローチは、当該分野で公知
のように、冠状動脈にカテーテルを導入するために使用され得る。例えば、カテ
ーテルは、簡便に大腿の動脈内に導入され得、そして腸骨動脈および腹大動脈を
通って、冠状動脈に逆方向に通される。あるいは、カテーテルは、初めに上腕の
動脈または頸動脈に導入され、そして冠状動脈に逆方向に通される。心筋の毛細
血管床はまた、逆方向に還流することによって、例えば、冠状静脈洞に位置した
カテーテルから到達され得る。このようなカテーテルははまた、近位のバルーン
を、逆流を促進する目的で前方への血流を阻害、または減少するために使用し得
る。末梢血管によって供給される組織に送達するために、カテーテルをそのよう
な組織に供給する動脈（例えば、脚のケースにおける大腿動脈）に導入し得る、
または例えば、罹患組織へのボーラス注射もしくは注入として導入し得る。
【０１０２】 脈管形成遺伝子を含むベクターおよびカテーテル、または他のインビボでの送
達装置（例えば、一般的に緩衝化溶液中における薬学的組成物を、血管中または
筋肉中に導入し得る他の装置）の種々の組み合わせは、本発明に従って使用する
ためにキットに含まれ得る。このようなキットはまた、遺伝子送達を増強するた
めの１つ以上の血管作用性の薬剤が含まれ得、さらに本明細書中に記載される任
意の方法に従う、これらの使用方法が記載された説明書も含みうる。
【０１０３】 （動物モデル） 心臓血管の遺伝子治療において成功する研究のための重要な必要条件は、（１
）臨床的うっ血性心不全に適用可能であり、そして血流の増加および／または収
縮機能のメカニズムに関する有用なデータを提供し得る動物モデルの構成、およ
び（２）遺伝子導入の効果の正確な評価である。この観点から、先行技術はいず
れも満足できない。従って、本発明者らは、これらの必須条件を満たすブタモデ
ルを使用する。ブタは、そのヒト生理学との関連性のために、ヒトの心血管疾患
を研究するための特に適切なモデルである。ブタ心臓は、以下の方法においてヒ
ト心臓に似ている。ブタは、ネイティブな冠状側枝血管の非存在を含めて、ヒト
の冠状動脈循環と非常に似たネイティブな冠状動脈循環を有する。第二に、全体
重の割合としてのブタ心臓の大きさは、ヒト心臓のそれと類似している。さらに
、ブタは大型動物モデルである。そのため効果的なベクター投薬量、毒性などの
ような種々のパラメーターについてより正確な外挿を可能にする。対照的に、イ
ヌおよびマウス（ｍｕｒｉｎｅ）ファミリーのメンバーのような動物の心臓は、
多くの内因性側枝血管を有する。さらに、全体重と比較して、イヌ心臓の大きさ
は、ヒト心臓の大きさの２倍である。
【０１０４】 実施例５において本明細書に記載される動物モデルは、心筋虚血のモデルの例
である。（心筋虚血はまた、うっ血性心不全を生じるか、および／またはうっ血
性心血管疾患に関連して起こるので、この特定のモデルはさらにその状況に関連
がある。）このモデルを使用して、脈管形成タンパク質をコードする遺伝子のベ
クター媒介送達は、虚血領域において心筋虚血を緩和すること、血流を増強させ
ること、が証明された。側副枝血管の発達も、同様に増加した。例示のために、
本発明者らは、ネイティブな形態およびムテインの両方を含む、いくつかの異な
る脈管形成タンパク質を有するこれらの遺伝子導入技術を、（以下の実施例で詳
細に記載されるように）首尾良く証明した。
【０１０５】 このモデルにおいて（これは臨床的冠状動脈疾患の模倣である）、左回旋枝（
ＬＣｘ）冠状動脈周辺のアメロイド収縮器（ａｍｅｒｏｉｄ ｃｏｎｓｔｒｉｃ
ｔｏｒ）の配置は、最小の梗塞（左心室の１％、ＬＣｘ床の４±１％）を伴う、
徐々の完全な閉鎖（配置の７日以内に）を生じる（Ｒｏｔｈら、Ｃｉｒｃｕｌａ
ｔｉｏｎ，８２：１７７８，１９９０；Ｒｏｔｈら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ
．，２３５：１−１１２７９，１９８７；Ｗｈｉｔｅら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，
７１：１４９０，１９９２；Ｈａｍｍｏｎｄら、Ｃａｒｄｉｏｌ．，２３：４７
５，１９９４；およびＨａｍｍｏｎｄら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９２
：２６４４，１９９３）。心筋機能および血流は、閉塞した動脈によって以前灌
流された領域（虚血領域と呼ばれる）では、限定された内因性側枝血管発達に起
因して静止しているのが通常であるが、血流確保は、心筋酸素要求量が増加する
場合、虚血を予防するには不充分である。従って、ＬＣｘ床は、臨床的狭心症に
類似した偶発性虚血を受ける。側枝血管発達と流動機能との関係はアメロイド配
置の２１日以内では安定であり、そして４ヶ月間、未変化のままである（Ｒｏｔ
ｈら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８２：１７７８，１９９０；Ｒｏｔｈら、Ａｍ
．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２３５：Ｈ１２７９，１９８７；Ｗｈｉｔｅら、Ｃｉ
ｒｃ．Ｒｅｓ．，７１：１４９０，１９９２）。動物が、１日を通じて、摂食、
職員による中断などの間の心拍数の急激な増加に関連した危険な状態で、床にお
ける期間虚血機能障害を有することが、遠隔測定によって実証されている。従っ
て、このモデルは、安定であるが、不適当な側枝血管を有する床を有し、周期的
虚血を受ける。このモデルの別の異なる利点は、異常に灌流されそして異常に機
能する領域（ＬＣｘ床）に隣接して、正常に灌流されそして機能する領域（ＬＡ
Ｄ床）があり、それによって各動物内にコントロール床を提供することである。
【０１０６】 心筋超音波造影心臓図検査を、局所性心筋灌流を予測するために使用した。造
影材は、ガラクトースの微小凝集体から構成され、そして画像のエコー源性（白
さ）を増加させる。微小凝集体は、血流に比例する様式で、冠状動脈および心筋
壁に分布する（Ｓｋｙｂａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９０：１５１３〜１５
２１，１９９４）。コントラストのピーク強度が、微粒子によって測定されるよ
うに、心筋血流と密接に相関することが示されている（Ｓｋｙｂａら、Ｃｉｒｃ
ｕｌａｔｉｏｎ，９０：１５１３〜１５２１，１９９４）。本発明で使用される
超音波心臓検査画像がＬＣｘ床を正確に同定すること、および心筋超音波造影心
臓図検査が心筋血流を評価するために使用され得ることを実証するために、水圧
カッフオクルダー（ｃｕｆｆ ｏｃｃｌｕｄｅｒ）を、アメロイドに隣接する近
位のＬＣｘ周辺に設置した。
【０１０７】 本研究の特定の局面において、動物を屠殺した場合、顕微鏡によって毛細血管
成長を定量するために、心臓を（グルタルアルデヒド、生理学的圧力、インサイ
チュにおいて）灌流固定した。ＰＣＲを、遺伝子導入を受容した動物由来の心筋
において脈管形成タンパク質ＤＮＡおよびｍＲＮＡを検出するために使用した。
以下に記載されるように、遺伝子導入後２週間で、ｌａｃＺ形質導入された動物
由来の心筋サンプルは、組織学的検査において実質的なβガラクトシダーゼ活性
を示した。最後に、遺伝子導入を受容した動物由来の細胞および心筋における脈
管形成タンパク質発現は、脈管形成タンパク質に対するポリクローナル抗体を使
用して証明された。
【０１０８】 血流の改善を実証することに関して、種々の技術は、当業者に公知である。例
えば、心筋血流は、Ｒｏｔｈ，ＤＭ，ら．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５３
：Ｈ１２７９−Ｈ１２８８，１９８７またはＲｏｔｈ，ＤＭ，ら．，Ｃｉｒｃｕ
ｌａｔｉｏｎ ８２：１７７８−１７８９，１９９０に記載されるのように、放
射活性マイクロスフィア技術によって決定され得る。心筋血流はまた、例えば、
Ｂｒａｕｎｗａｌｄ ｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｄｉｓｅａｓｅ，第４版、２７６−３
１１頁（Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９２）により記載
されるような放射性核種タリウムを用いた心臓の灌流を含むタリウム画像化によ
って定量され得る。心臓における細胞は、タリウムに対するアビディティーを有
する。タリウムの取り込みは、血流と正に相関する。従って、取り込みの減少は
、灌流欠乏が存在する虚血性状態で生じるような血流の減少を示す。意識のある
個体において、脈管形成活性は、実施例１および５、ならびにＳａｈｎ，ＤＪ，
ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．５８：１０７２−１０８３，１９７８に記載され
るようなコントらスト超音波心臓検査によって容易に評価され得る。心筋機能の
改善は、壁の肥厚化、例えば、経胸腔超音波心臓検査法で測定されることによっ
て決定され得る。
【０１０９】 治療的研究のための戦略は、導入遺伝子送達の機会、導入遺伝子の投与経路、
および脈管形成遺伝子の選択を包含した。心筋虚血のアメロイドモデルにおいて
、遺伝子導入を、安定しているが不充分な側枝血管が発達した後に実施した。ア
メロイドモデルを使用する以前の研究は、虚血および側枝血管の発達前の、アメ
ロイドの閉鎖の間の脈管形成ペプチドの送達を含んだ。しかし、この戦略は、い
くつかの理由で使用されなかった。第一に、このような研究は、臨床的心筋虚血
の処置（ここで、遺伝子導入が、進行中の心筋虚血の設定において提供される）
に存在する状態を密接に重複するために適切でない；以前の研究は、虚血の予測
におけるペプチドの提供に類似し、そしてそれゆえほとんど関連しない。第二に
、細胞培養における以前の研究にもとづいて、脈管形成ペプチドと併用した虚血
刺激が、脈管形成の刺激のための最適な環境であることが推定された。脈管形成
は、心臓疾患がすでに存在する場合、同時の導入遺伝子送達によって最適に達成
され得る。これらの決定に関連したのは、導入遺伝子送達を達成する方法の選択
であった。冠状動脈疾患を有する患者の継続的な処置に適用可能であるべき技術
の制限は、いくつかの手段（冠状動脈へのペプチドの継続的な注入、心臓内への
直接的なプらスミド注射、長期間の緩徐放出を提供するペプチドを含むレジンで
の心臓コーティング）を受け入れ難くさせた。最終的に、ブタモデルは、遺伝子
送達前および後の局所性の血流および機能を伴う優れた手段を提供した。同じベ
クター（例えば、組換えアデノウイルス）であるがレポーター遺伝子を有するも
のを受容したコントロール動物の使用は、これらの研究についてのコントロール
を提供した。ブタは、ネイティブな冠状側枝血管の相対な欠損を含めて、ヒトの
冠状動脈循環と非常に類似するネイティブな冠状動脈循環を有する。ブタモデル
はまた、遺伝子送達前および後の局所性の血流および機能を伴う優れた手段を提
供した。同じ組換えアデノウイルス構築物であるがレポーター遺伝子を有するも
のを受容したコントロール動物の使用は、これらの研究についてのコントロール
を提供した。前述のおよび以前に公開された研究に基づいて、当業者は、ブタに
おける以下に記載される結果が、ヒトにおける結果を予測するために期待される
と理解する。
【０１１０】 末梢血管疾患に関して、本発明の遺伝子治療ベクターを使用する末梢血管系へ
の脈管形成遺伝子の送達は、例えば、末梢性虚血の後肢結紮モデルを使用して検
査され得る。例えば、Ｒ．Ｌ．Ｔｅｒｊｉｎｇおよび同僚により記載される大腿
部動脈結紮モデルを参照のこと（例えば、Ｙａｎｇら，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，７
９（１）：６２−９，１９９６を参照のこと）。虚血性心筋への脈管形成遺伝子
の送達を伴う場合、末梢血管系および／または関連した筋肉への本発明による脈
管形成遺伝子の送達は、末梢性血管疾患の作用を克服するために使用され得る。
【０１１１】 本明細書において実施例１に記載される別の動物モデルは、例えば、臨床的う
っ血性心不全が認められるような肥大した心筋症を誘導する。このモデルにおい
て、３〜４週間の期間にわたる連続的で迅速な心室ペーシングは、以下の臨床的
心不全の多くの特徴に類似点を示す心不全を誘導する：この心不全は、心不全（
重症冠状動脈疾患およびＩＤＣＭのような非ＣＡＤ ＤＣＭと関連する心不全を
含む）にみられる局所性機能的異常に類似の心臓収縮機能の障害を伴う左心室肥
大を含む。うっ血性心不全の他の動物モデルは、ミクロスフェアの冠内送達を経
る慢性心室機能障害の誘導を含む（例えば、Ｌｅｖｉｎｅら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌ
ｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１８：１７９４−１８０３（１９９１）；Ｂｌａｕｓｔｅ
ｉｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏ．Ｐａｔｈ．５：３２−４８（１９９４）；Ｓ
ａｂｂａｈら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６０：Ｈ１３７９−Ｈ１３８４（
１９９１）を参照のこと）。心室機能障害のさらなる例として、らットモデルに
おける左冠状動脈の閉塞は、梗塞を誘導し得、次いでこの動物は、継続的な数日
または数週にわたって研究および処置され得る（例えば、Ｐｆｅｆｆｅｒら，Ｃ
ｉｒｃ．Ｒｅｓ．４４：５０３−５１２，１９７９；Ｐｆｅｆｆｅｒら，Ａｍ．
Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６０：Ｈ１４０６−１４１４，１９９１を参照のこと）
。
【０１１２】 従って、このモデルは、脈管形成ペプチドまたはタンパク質をコードするベク
ター構築物の送達が、これらの状態と関連した心機能障害を緩和するために効果
的であるかどうかを決定するために使用され得る。このモデルは、うっ血性心不
全および心室再構成の処置のためのインビボ遺伝子治療の有効性を評価するいく
つかのパらメーターを提供することにおいて、特に有用である。
【０１１３】 （治療的適用） 本発明のベクター（例えば、複製欠損性組換えアデノウイルスベクター）は、
遺伝子発現の領域において細胞変性効果または炎症を伴うことなくインビボで極
めて効率の良い遺伝子導入を達成した。これらの結果（このいくつかは、以下の
実施例に詳細が記載される）に基づいて、インビボでの機能的変化に影響するイ
ンビボでの遺伝子導入の十分な程度が達成されることが見出される。脈管形成タ
ンパク質（単独または別の筋肉を増強するタンパク質もしくはペプチドとの組み
合せのいずれか）の遺伝子導入は、血流の改善し、処置された筋肉における筋肉
機能の増強する。さらに、所望の場合、血管作動性試薬は、本明細書において所
望の場合、標的部位にさらに遺伝子送達を向上させるために、これらの方法およ
び組成物とともに連結して使用され得る。血管作動性試薬（例えば、ヒスタミン
、ヒスタミンアゴニスト、一酸化窒素ドナー、またはＶＥＧＦタンパク質）用い
て、遺伝子ベクター投薬で遺伝子導入の効率を上昇し得、このような試薬の包含
は、所定の治療的効果のために投与される必要のあるベクターの量を制限して使
用され得る。
【０１１４】 別の局面において、本発明のベクターおよび方法は、拡張型心筋症（ＤＣＭ）
（拡張型の、低収縮性（ｈｙｐｏｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ）の左心室および／ま
たは右心室の所見により代表的に診断される心不全のタイプ）を処置するために
使用され得る。上述で議論されるように、ＤＣＭは、他の特徴的な心血管疾患の
形態（例えば、冠状動脈閉塞症）、または心筋梗塞の病歴の非存在下で生じる。
ＤＣＭは、乏しい心室の機能および心不全の症状に関連する。これらの患者にお
いて、室の拡張および壁肥厚は、一般的に高い左心室壁伸長という結果となる。
多くのこのような患者は、軽度の労作中または安静時ですらこれらの症状を示し
、そのため、重篤であると特徴付けられる（すなわち、それぞれＩＩＩ型または
ＩＶ型心不全）（それぞれ、例えば、心不全のＮＹＨＡ分類を参照のこと）。上
記のように、多くの冠状動脈疾患を有する患者は、しばしば１回以上の心臓発作
（心筋梗塞）の発生のような、拡張型心筋症を示すように進行する。
【０１１５】 本発明のさらなる適用は、有害な左心室再構成（また公知であるように、略し
て、有害再構成）の予防または少なくとも減少されることであり、これは、重症
の心不全に進行し得る心筋梗塞後の室の拡張をいう。心室再構成がすでに開始さ
れていたとしても、血流の増加を促進することがなお所望される。なぜなら、こ
れは、心室機能不全を相殺するために依然として有効であり得るからである。同
様に、脈管形成の促進は、有用であり得、なぜなら微小血管基盤の発生はまた、
心筋機能不全の相殺に有効であり得る。さらに、このような脈管形成タンパク質
またはペプチドはまた、他の増強効果を有し得る。心筋梗塞に罹患した患者にお
いて、有害な心室再構成は、患者に室の拡張がない場合、および心不全の症状が
発症しない場合に予防される。有害な心室再構成は、存在する心不全の症状にお
いて、任意の観察可能な低減または測定可能な低減が存在する場合に緩和される
。例えば、患者は、息切れが減少し、そして運動耐性の改善を示し得る。心機能
における改善および症状の低減を評価する方法は、本質的に、ＤＣＭについて上
記に記載される方法に類似する。側枝血流および心室機能の改善の結果としての
有害な心室再構成の予防または緩和は、本明細書中に記載の方法を用いて患者に
おけるインビボでの脈管形成遺伝子導入後、数週間以内に達成され得ることが予
測される。
【０１１６】 １つの例において、脈管形成タンパク質をコードする導入遺伝子のインビボで
の導入の本方法を用いて、脈管形成タンパク質またはペプチドを発現する組み換
えアデノウイルスの遺伝子導入が、心筋の虚血を継続的に低減するのに有効であ
ることを実証する。別の例において、脈管形成タンパク質をコードする導入遺伝
子のインビボでの導入の本方法を用いて、うっ血性心不全に関連する状態を処置
する。
【０１１７】 以下のデータが示すように、心筋における外来的に提供された脈管形成導入遺
伝子の発現は、増加した血流および／または心臓（または他の組織）における機
能を生じる。この増加した血流および／または機能は、標的組織を冒す循環器疾
患の１つ以上の症状を低減させる。
【０１１８】 本明細書中で記載されるように、多くの異なるベクターを用いて、本発明の方
法に関連するインビボでの脈管形成タンパク質導入遺伝子を送達し得る。例証の
方法により、本明細書において例示される複製欠損性組換えアデノウイルスベク
ターは、遺伝子発現の領域において細胞変性効果または炎症を伴うことなくイン
ビボで極めて効率の良い遺伝子導入を達成した。
【０１１９】 狭心症（ＣＡＤに関連する得るような）の処置において、脈管形成タンパク質
をコードする導入遺伝子の遺伝子導入は、任意の時点で処置され得るが、好まし
くは、重症の狭心症の発症後、比較的すぐに実施される。ほとんどのうっ血性心
不全の処置において、脈管形成タンパク質をコードする導入遺伝子の遺伝子導入
は、例えば、心不全の発症の見込みまたは心不全が診断された時に行われ得る。
心室再構成の処置について、遺伝子導入は、患者が梗塞を罹患した後の任意の時
点で、好ましくは３０日以内に、より好ましくは梗塞後７〜２０日以内に、行わ
れ得る。
【０１２０】 上記のように、β−アドレナリン作用性シグナル伝達タンパク質（β−ＡＳＰ
）（β−アドレナリン作用性レセプター（β−ＡＲ）、Ｇタンパク質レセプター
キナーゼインヒビター（ＧＲＫインヒビター）およびアデニルシクらゼ（ＡＣ）
を含む）はまた、心機能を向上するために用いられ、これは、米国特許出願番号
０８／９２４，７５７、１９９７年９月５日出願（１９９７年６月１６日に出願
された米国６０／０４８，９３３および１９９６年９月５日に出願された米国０
８／７０８，６６１に基づく）、ならびに１９９７年９月５日に出願されたＰＣ
Ｔ／米国９７／１５６１０および米国継続出願番号０９／００８，０９７、１９
９８年１月１６日出願、および米国継続出願番号０９／４７２，６６７、１９９
９年１２月２７日出願において詳細に記載および例証され、このそれぞれは、本
明細書において参考として援用される。
【０１２１】 本発明の組成物または生成物は、患者に血流への投与（例えば、動脈内注射に
よるかまたは骨格筋のような組織中への大量瞬時注入として）に適切な処方物の
形態で都合よく提供され得る。適切な投与フォーマットは、医学的な当業者によ
って最適に決定され得る。適切な薬学的に受容可能なキャリアおよびそれらの処
方物は、標準的な処方論文（例えば、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇ
ｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に記載され
る。Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｊ．およびＨａｎｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，「Ｐａｒｅｎｔａｌ
Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ
：Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌｓ
ｏｆ Ｐａｒｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｎｏ．１０、補遺４２：２Ｓ（１９８８
）もまた参照のこと。本発明のベクターは、好ましくは、中性のｐＨ（例えば、
約ｐＨ６．５〜約ｐＨ８．５、より好ましくは約ｐＨ７〜８）の溶液中で、溶液
をほぼ等張にする賦形剤（例えば、４．５％のマンニトールまたは０．９％の塩
化ナトリウム）とともに処方されるべきである。ｐＨは、認可された保存剤（例
えば、メタクレゾール０．１％〜０．７５％、より好ましくは０．１５％〜０．
４％メタクレゾール）と一緒に、一般に安全とみなされている公知の緩衝溶液（
例えば、リン酸ナトリウム）で緩衝化されるべきである。所望の等張性は、塩化
ナトリウム、または他の薬学的に受容可能な薬剤（例えば、デキストロース、ホ
ウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール、マンニトールおよびソルビト
ールのようなポリオールまたは他の無機溶質または有機溶質）を使用して達成さ
れ得る。塩化ナトリウムは、特にナトリウムイオンを含有する緩衝液に好ましい
。所望の場合、上記組成物の溶液はまた、保管寿命および安定性を増強するため
調製され得る。本発明の治療的に有用な組成物は、一般的に認められた手順の後
、成分を混合することによって調製される。例えば、選択された成分を混合して
、濃縮混合物を生成し、次いでこれは、ｐＨを調節するために水、および／もし
くは緩衝液添加するかまたは張度を調節するためにさらなる溶質を添加すること
によって最終的濃度および最終的粘性に調整され得る。
【０１２２】 医師による使用のために、組成物は、治療効果を提供するために１用量または
複数用量で有効である本発明のベクターの量を含む投薬形態で提供され得る。当
業者によって認識されるように、治療薬剤の有効量は、多くの因子（これは、患
者の年齢および体重、患者の身体的状態、ならびに得られる脈管形成のレベルお
よび／または他の作用、そして他の因子を含む）で変化する。
【０１２３】 本発明のウイルスベクターの効果的用量は、代表的には、約１０7〜１０13の
ウイルス粒子の範囲であり、好ましくは約１０9〜１０11のウイルス粒子である
。ウイルス粒子の数は、１０14であり得るが、好ましくは１０14を越えない。記
述されるように、投与されるための正確な用量は、携わる臨床医によって決定さ
れるが、好ましくは５ｍｌ以下の生理的緩衝化溶液（例えば、リン酸緩衝化生理
食塩水）中にあり、より好ましくは１〜３ｍｌ中である。
【０１２４】 好ましい投与様式は、適切なカテーテルまたは他のインビボでの送達装置を使
用して、１つ以上の局所部位（例えば、心臓疾患の場合、１つまたは両方の冠状
動脈）中への注射による。
【０１２５】 以下の実施例は、当業者をさらに助けるために提供される。このような実施例
は例示的であることが意図され、従って本発明を限定するようにみなされるべき
ではない。多くの例示的な改変および変更が本出願において記載され、そして他
の改変および変更は当業者に明らかである。このような変更は、本明細書中に記
載および請求される発明の範囲内にあると考えられる。
【０１２６】 （実施例） （実施例１：うっ血性心不全および付随する心筋虚血のブタモデル） （１−Ａ．動物および外科手術手順） 体重４０±６ｋｇのＹｏｒｋｓｈｉｒｅブタ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）９匹を
、ケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）および硫酸アトロピン（０．１ｍｇ／ｋｇ
、ＩＭ）、続いてアミタールナトリウム（１００ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）で麻酔した
。気管内挿管した後、この手順の間中、ハロタン（０．５〜１．５％）を圧力循
環式換気装置により送達した。左開胸時、カテーテルを大動脈、肺動脈および左
心房に配置した。Ｋｏｎｉｇｓｂｅｒｇミクロ圧力計を左心室尖に配置し、心外
膜単極リード線を左心室側壁の房室溝の１．０ｃｍ下に配置した。発電機（Ｓｐ
ｅｃｔｒａｘ ５９８５；Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ，Ｉｎｃ．）を腹部の皮下ポケッ
トに挿入した。４匹の動物の主肺大動脈の周囲に、フロープローブ（ｆｌｏｗ
ｐｒｏｂｅ）（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ，Ｉｎｃ．）を備えた。心膜をゆるく接合し
、胸部を閉じた。開胸後７〜１０日目に、血行力学、左心室機能、心筋血流のベ
ースらイン測定を作成した。次いで、心室ペーシングを開始した（２２０±９
ｂｐｍ（１分あたりの心拍数）２６±４日間）。刺激の振幅は、２．５Ｖであり
、パルスの持続時間は０．５ｍｓであった。さらなる９匹のブタ（４０±７ｋｇ
）をコントロールとして使用した；５頭の動物については、ペーシングを行わず
に、開胸術および機器使用を行い、最初の開胸術後、３０±７日後に屠殺した。
機器使用をしたか否かにかかわらず、右心室および左心室の重量に関するデータ
は、コントロール動物と類似していたので、それらのデータを、１つのコントロ
ール群としてプールした。
【０１２７】 （１−Ｂ．血行力学研究） ペースメーカーを少なくとも１時間非働化させた後の非鎮静化した意識のある
動物から血行力学的データを得、そして動物は、基底状態にあった。すべてのデ
ータを各動物において７日間隔で得た。左心房、肺動脈および大動脈の圧力を得
た。左心室ｄＰ／ｄｔを、高忠実度左心室圧から得た。肺動脈流を記録した。大
動脈および肺血サンプルを動静脈酸素含量の差異の計算のために得た。
【０１２８】 （１−Ｃ．心エコー研究） 心エコー図法は、局所的心筋血流を測定する方法であり、これは、造影剤を個
体または動物に注射する工程を包含する。造影剤（ガらクトースの微小凝集）は
、左心房への注射後に画像のエコー発生性（「ホワイトネス」）を増加する。微
小凝集は、血流と比例的な様式で、冠状動脈および心筋壁に分布する（Ｓｋｙｂ
ａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９０：１５１３−１５２１，１９９４）。コン
トらスト増強のピーク強度は、ミクロスフェアにより測定される心筋血流と相関
する（Ｓｋｙｂａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９０：１５１３−１５２１，１
９９４）。
【０１２９】 Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ Ｓｏｎｏｓ １５００画像化システムを使
用して、二次元およびＭモード画像を得た。中央乳頭筋レベルで、右胸骨傍アプ
ローチにより画像を得、ＶＨＳテープに記録した。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉ
ｅｔｙ ｏｆ Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ （Ｓａｈｎ，ＤＪら、Ｃｉ
ｒｃｕｌａｔｉｏｎ ５８： １０７２−１０８３， １９７８）の規準を使用
して測定を行った。ブタ心室中隔（ＩＶＳ）の正中線配向および右胸骨傍視点の
使用のため、短軸Ｍモード測定は、ＩＶＳおよび解剖学的な側壁を通して行った
。全てのパらメーター（拡張終期寸法（ＥＤＤ）、収縮末期寸法（ＥＳＤ）、お
よび壁肥厚化を含む）は、少なくとも５回の無作為な呼吸終期拍動で測定し、そ
して平均した。ＱＲＳ複合体の開始時に拡張終期寸法を得た。収縮末期寸法を、
ＩＶＳが最も外側に位置した瞬間またはＴ波の終わりに得た。左心室収縮機能を
、短縮率（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）ＦＳ＝［（ＥＤＤ−
ＥＳＤ）／ＥＤＤ］×１００を使用して評価した。パーセント壁の肥厚化（％Ｗ
Ｔｈ）は、％ＷＴｈ＝［（ＥＳＷＴｈ−ＥＤＷＴｈ）／ＥＤＷＴｈ］×１００と
して計算した。心エコー測定の再現性を実証するために、ペーシングプロトコー
ルを開始する前に、動物を２日連続で画像化した。異なる測定からのデータは、
高度に再現性であった（短縮率、Ｒ2＝０．９４， Ｐ＝０．００６； 側方壁
肥厚化、Ｒ2＝０．９０， Ｐ＝０．００５）。これら全ての測定は、ペースメ
ーカーを非働化して得られた。
【０１３０】 （１−Ｄ．心筋血流） 心筋血流を、以前に詳細に記載されたような放射性ミクロスフィア技術によっ
て測定した（Ｒｏｔｈ，ＤＭら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５３：Ｈ１２７
９−Ｈ１２８８，１９８７；Ｒｏｔｈ，ＤＭら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８２
：１７７８−１７８９，１９９０）。左心室側壁およびＩＶＳの経壁サンプルを
、心内膜、中壁（ｍｉｄｗａｌｌ）、および心外膜を分け、そして各３つへの血
流および経壁流（ｔｒａｎｓｍｕｒａｌ ｆｌｏｗ）を測定した。経壁部を、血
流および機能測定が各床（ｂｅｄ）内に対応するように、心エコー測定した領域
から取り出した。ミクロスフィアを、制御状態（ペーシングせず）で、心室ペー
シング（２２５ｂｐｍ）の開始時に注射し、次いで、２２５ｂｐｍの心室ペーシ
ングの間、７日間の間隔でまた注射した；ミクロスフィアを、１４日（ｎ＝４）
および２１〜２８日（ｎ＝３）で、ペースメーカーを非働化して注射した。１拍
あたりの心筋血流を、心筋血流を心拍数（ミクロスフィア注射の間記録した）で
割ることによって計算した（Ｉｎｄｏｌｆｉ， Ｃら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ
８０：９３３−９９３ （１９８９））。平均左心房および平均心房圧を、ミ
クロスフィア注射の間記録して、冠状血管抵抗の推定値を計算し得た；（冠状血
管抵抗指標）＝（平均心房圧）−（平均左心房圧／経壁冠状血流）。
【０１３１】 （１−Ｅ．収縮期壁応力） 外周収縮期壁応力（ｗａｌｌ ｓｔｒｅｓｓ）は、本発明者らが左心室の長軸
を評価するのに適切な見解を得られなかったので、測定し得なかった。それ故、
本発明者らは、経線収縮末期壁応力（Ｒｉｅｃｈｅｋ， Ｎ．ら、Ｃｉｒｃｕｌ
ａｔｉｏｎ ６５：９９−１０８ （１９８２））を、以下の式を用いて計算し
た：経線収縮末期壁応力（ｄｙｎｅ）＝（０．３３４×Ｐ×Ｄ）÷［ｈ（Ｉ−ｈ
／Ｄ）］、ここで、Ｐは左心室収縮末期圧（ｄｙｎｅ）であり、Ｄは左心室収縮
末期直径（ｃｍ）であり、そしてｈは収縮末期壁厚である。経線収縮末期壁応力
を、ペーシングの開始前、および引き続いて週毎の間隔（ペースメーカーオフ）
で、側壁およびＩＶＳの両方について計算した。
【０１３２】 （１−Ｆ．末期手術） ペーシングの継続の２６±２日後、動物を麻酔し、挿管し、そして正中線胸骨
切開を行った。まだ拍動している心臓を、生理食塩水（４℃）に浸し、冠状動脈
を即座に、生理食塩水（４℃）で灌流し、右心室および左心室（ＩＶＳを含む）
を秤量し、そして各領域の経壁サンプルを迅速に液体窒素で凍結し、そして−７
０℃の温度で保存した。
【０１３３】 （１−Ｇ．アデニンヌクレオチド） ＡＴＰおよびＡＤＰを、心不全を有する４匹の動物（２８日間ペーシング）お
よび４匹のコントロール動物のＩＶＳおよび側壁の経壁サンプルにおいて、測定
した。心不全を有する動物のサンプルを、動物を屠殺した日に、ペースメーカー
をオフして（６０分間）得た。サンプルを全ての動物で同様に得た。ＡＴＰおよ
びＡＤＰを、前記されたようなＷａｔｅｒｓ高速液体クロマトグらフィーで測定
した（Ｐｉｌｚ， Ｒ． Ｂ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５９：２
９２７−２９３５ （１９８４））。
【０１３４】 （１−Ｈ．統計学的分析） データを平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。コントロール（ペーシング前）
状態およびペーシング中の１週間の間隔で得られた特定の測定を、繰り返し測定
ＡＮＯＶＡ（Ｃｒｕｎｃｈ４， Ｃｒｕｎｃｈ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｃｏｒｐ．
）によって比較した。いくつかの比較（例えば、側壁対ＩＶＳ）において、二元
配置のＡＮＯＶＡを使用した。ポストホック（Ｐｏｓｔ ｈｏｃ）比較を、当該
分野において記載されるような「Ｔｕｋｅｙ法」を用いて行った。９匹の動物が
ペーシングの２１日間生存し；このうち６匹がペーシングの２８日間生存した。
２８日間生存した動物のデータは、２１日のみ生存した動物のデータと統計学的
に識別不能であった。それ故、ＡＮＯＶＡを、９匹の動物で、４つの時点で行っ
た：コントロール（ペーシング前）、７日目、１４日目、および２１〜２８日目
。帰無仮説を、Ｐ＜０．０５（両側（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ））の場合に棄却し
た。
【０１３５】 （結果） （１−Ｉ．血行力学的研究） 迅速な心室ペーシングは、ペーシングの７〜１４日後に顕著であった血行力学
における変化を生じた。７日目、動物は、平均左心房および肺動脈圧が上昇した
。これらの圧力は、さらに数週間のペーシングでますます異常になった（表１）
。循環系統のうっ血の徴候（頻呼吸、腹水、および頻脈）は、１４〜２１日目ま
でに明白であった。肺動脈流（心拍出量）は、ペーシングの２１日目までに減少
した（コントロール、３．３±０．１Ｌ／分；２１日目、１．９±０．４Ｌ／分
；Ｐ＜０．０５）。
【０１３６】 （表１．血行力学および左心室機能）
【０１３７】
【表１】 （測定を繰り返した）分散の分析を用いて、ペーシングの期間が特定の変数に
影響したか否かを決定した；ＡＮＯＶＡからのｐ値を右側の列に示す。ポストホ
ック試験をＴｕｋｅｙ法により行った；aｐ＜０．０５；bｐ＜０．０１；cｐ＜
０．００１（対同一の変数に対するコントロールの値）；dｐ＜０．０５；eｐ＜
０．０１；fｐ，０．００１（対前週）；gｐ＜０．０５；hｐ＜０．０１；iｐ＜
０．００１（対７日目の値）；Ｔｕｋｅｙ法によるポストホック試験。測定を、
非働化したペースメーカーを用いて行い、平均±ＳＤで表した。７ｄ：ペーシン
グの７日目；１４ｄ：ペーシングの１４日目；２１−２８ｄ：ペーシングの２１
〜２８日目。
【０１３８】 （１−Ｊ．全体的な左心室機能） 左心室機能を、ペースメーカーを非働化した後の心エコー検査および血行力学
的変数によって、評価した。断片的短縮（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｓｈｏｒｔｅ
ｎｉｎｇ）は、ペーシング期間とともに次第に減少していき（Ｐ＝０．０００１
；表１）、２１〜２８日目でその最低値に達した（コントロール、３９±３％；
２１〜２８日目、１３±４％；Ｐ＜０．０００２）。左心室拡張終期寸法は、ペ
ーシング（Ｐ＜０．０００１；表１）の間に次第に増大し、２１〜２８日目でそ
の最大値に達した（コントロール、３．９±０．４ｃｍ；２１〜２８日目、５．
８±０．６ｃｍ；Ｐ＝０．０００２）。左心室ピークポジティブｄＰ／ｄｔもま
た、この研究全体を通して減少した（Ｐ＝０．０００１；表１）。正常な前負荷
の増大は左心室ピークｄＰ／ｄｔを増大するので、ピークｄＰ／ｄｔにおける漸
進的な低下は、左心室拡張末期圧の増加が付随し、これは左心室収縮性の減少を
実証した。（Ｍａｈｌｅｒ， Ｆら、Ａｍ． Ｊ． Ｃａｒｄｉｏｌ． ３５：
６２６−６３４ （１９７５）） （１−Ｋ．左心室局所的機能） ペースメーカーが作動していない場合、局所的左心室機能を左心室側壁および
ＩＶＳの壁肥厚化のパーセントの測定により評価した。側壁からの心室ペーシン
グは、ＩＶＳと比較して側壁の機能において有意な悪化を生じた（Ｐ＝０．００
１；図１および表２）。この差異は７日目で有意であり、そして側壁機能が悪化
するにつれて、２１日目から２８日目でさらに増加した。ＩＶＳは、実験の経過
にわたって、壁肥厚化において問題にならない減少を示した。拡張終期の壁厚は
、実験の間、進行的に薄くなっていき、これは側壁においてより重篤であったこ
とを示した（表２）。
【０１３９】 （表２．経時的な左心室の壁肥厚化）
【０１４０】
【表２】 分散の二元分析（反復測定）を使用して、拡張終期の壁厚（ＥＤＴｈ）または
壁肥厚化％（ＷＴｈ）が、ペーシングの期間（時間）または領域（側壁、ＬＡＴ
；もしくは心室中隔、ＩＶＳ）により影響されているかどうか、あるいはＥＤＴ
ｈまたはＷＴｈ％における変化が２つの領域間で異なるかどうか（インター）を
決定した。各時点でのＥＤＴｈおよびＷＴｈ％に対する平均値を、Ｔｕｋｅｙ分
析によって２つの領域のポストホック間の差異について試験した。値は平均±Ｓ
Ｄを表す。７ｄ：ペーシング７日目；１４ｄ：ペーシング１４日目；２１〜２８
ｄ：ペーシング２１〜２８日目。ｎ＝９。
【０１４１】 （１−Ｌ．左心室局所的血流） ペーシングを開始した時点での、１分あたりの心内膜下血流は、ＩＶＳにおけ
るほうが側壁におけるよりも増加した（図２および表３）。ペーシングの間のこ
の局所的血流における差異は実験の間中持続し、そして血流における変化のパタ
ーンは２つの領域間で異なった（Ｐ＝０．００６）。ペーシング中の２つの領域
間での１分あたりの血流における変化のパターンは、心内膜（Ｐ＝０．００６）
、中壁（Ｐ＝０．００２）、心外膜（Ｐ＝０．０１６）または経壁性（Ｐ＝０．
００３）切片において測定されたもののいずれかと一致した（表３）。対照的に
、ペースメーカーが作動していない場合は、１４日目、または２１〜２８日目に
おけるコントロール状態で測定されたいずれにおいても、心内膜下血流は局所的
な差異を示さなかった（図２および表３）。
【０１４２】 （表３．経時的な心筋血流）
【０１４３】
【表３】 分散の二元分析（反復測定）を使用して、心内膜下血流（ＥＮＤＯ）または経
壁性（ＴＲＡＮＳ）血流が、ペーシングの期間（時間）または領域（側壁、ＬＡ
Ｔ；もしくは心室中隔、ＩＶＳ）により影響されているかどうか、あるいは血流
変化のパターンが２つの領域間で異なるかどうか（インター）を決定した。各時
点での血流についての平均値を、Ｔｕｋｅｙ分析によって２つの領域ポストホッ
ク間の差異について試験した。値は５匹の動物についての平均±ＳＤを表す。オ
ン：心室ペーシング（２２５ｂｐｍ）の間にミクロスフィアを注入した。オフ：
ペースメーカーは作動していない。０日目＝コントロール；１４日目；ペーシン
グの１４日目；２１〜２８日目：ペーシングの２１〜２８日目。
【０１４４】 心不全が進行するにつれて、心内膜対心外膜血流比は有意には変化しなかった
（Ｐ＝０．０５８）。しかし、ペーシングの開始に伴い、心内膜対心外膜比は側
壁において、ＩＶＳにおいてよりも、実質的により低かった（ＩＶＳ、１．３２
±０．２３；側壁、０．７７±０．１０；Ｐ＝０．０００２；表３）。両方の領
域における割合は実験の残りの間ずっと１．０より大きかった。
【０１４５】 拍動１回あたりの心内膜血流（図２および表４）はペーシングの開始前は両方
の領域において類似していた（ＩＶＳ，０．０１３±０．００３ｍＬ×分-1×ｇ -1 ×拍動-1；側壁、０．０１２±０．００４ｍＬ×分-1×ｇ-1×拍動-1；Ｐ＝Ｎ
Ｓ）。心室ペーシングの開始時（２２５ｂｐｍ）には、ＩＶＳではなく、側壁に
おける１拍動あたりの心内膜血流における局所的欠損が存在した（ＩＶＳ，０．
００９±０．００２ｍＬ×分-1×ｇ-1×拍動-1；側壁、０．００５±０．００１
ｍＬ×分-1×ｇ-1×拍動-1；Ｐ＝０．００１）。１４日目および２１〜２８日目
において、拍動１回あたりの心内膜流は、ペーシングの間、ＩＶＳにおいてより
も、側壁において低かった（図２および表４）。これらのデータは、側壁におけ
る心筋低灌流がペーシングの開始と共に始まることを示し、そしてこの相対的虚
血は持続した。しかし、拍動１回あたりの心内膜血流は、ペースメーカーオフの
場合、両方の領域において正常なままであった（図２および表４）。
【０１４６】 両方の領域における血流はペーシングの最終週において増加する傾向にあった
（図２および表３）。このパターンは、冠状血管抵抗指数における進行性の減少
に関連し（図３）、このことは心不全が進行するにつれて、冠状血管構造および
機能における変性が左心室再構成を伴い得ることを示唆した。冠状血管抵抗指数
は、ペーシングの開始時においてＩＶＳにおいてよりも側壁において有意に大き
く、そして冠状血管抵抗の変化のパターンは２つの領域において異なった（Ｐ＝
０．００１２）（図３）。これらの知見は、心筋灌流での変性した電気的活性化
の効果を示し得る。
【０１４７】 （表４．拍動１回あたりの心内膜血流）
【０１４８】
【表４】 アメロイド（ａｍｅｒｏｉｄ）虚血モデルからのデータは、我々の研究室から
以前に発表した（Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｈ．Ｋ．およびＭｃＫｉｍａｎ，Ｍ．Ｄ．，
Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，２３：４７５−８２（１９９４））。
値は平均±１ＳＤを表す。これらのデータは、アメロイドモデルの側副枝依存性
（虚血領域）のおよび左心室ペーシング誘導性心不全モデルの側壁が、正常に灌
流する心筋領域と比較して、拍動１回あたりの心内膜血流に同様の欠損を有する
ことを表す。
【０１４９】 （１−Ｍ．左心室収縮末期壁応力） ペーシング期間に関して、評価した経線（ｍｅｒｉｄｉｏｎａｌ）収縮末期壁
応力において有意な増加が存在した（Ｐ＜０．０００１）が、壁応力の変化のパ
ターンは側壁およびＩＶＳに対して類似し（Ｐ＝３３）、そしてポストホック試
験は、いずれの特定の時点においても収縮壁応力において局所的な差異を示さな
かった。心室収縮末期壁応力における増加は、側壁において（コントロール、１
６８±４０×１０3ｄｙｎｅ；２８日目、４１２±１４３×１０3ｄｙｎｅ；Ｐ＝
０．０００１）、およびＩＶＳ（コントロール、１５９±３５×１０3ｄｙｎｅ
；２８日目、４８０±２２５×１０3ｄｙｎｅ；Ｐ＝０．０００１）において、
およそ３倍である。
【０１５０】 （１−Ｎ．検死） 検死の時点において、心不全を有する動物は腹水症（平均量、１８０９ｍＬ；
範囲、３００〜３５００ｍＬ）および拡張型薄壁化心臓（４つの房は全てかなり
肥大していた）を有した。心室重量対体重の比は、右心室のみの肥大を示唆し、
このモデルを使用する以前の研究のデータを確証した（Ｒｏｔｈ，Ｄ．Ａ．ら、
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：９３９−９４９（１９９３））。重量の一
致するコントロール動物と比較して、心不全に関連する左心室質量は変化しなか
った（コントロール、１１２±１０ｇ；心不全、１１４±１７ｇ）；左心室重量
対体重の比もまた、両方のグループにおいて類似した（コントロール、２．８±
０．３ｇ／ｋｇ；心不全、２．９±０．３ｇ／ｋｇ）。対照的に、心不全は増加
した右心室重量（コントロール、３８±３ｇ；心不全、５２±１１ｇ；Ｐ＝０．
００３）、および右心室重量対体重の比（コントロール、０．０９±０．１ｇ／
ｋｇ；心不全、１．３±０．３ｇ／ｋｇ；Ｐ＜０．００３）に関連する。ペーシ
ングした動物は実験の経過の間に４ｋｇ体重が増え、この量は部分的には腹水の
蓄積が占める。初期体重が使用されて左心室重量対体重の比が算出される場合、
比は体重の一致するコントロール動物からの比よりもなお有意には高くない。こ
れらのデータは、実験の経過の間の左心室重量の実質的な増加が存在しないこと
を確証する。
【０１５１】 （１−Ｏ．アデニンヌクレオチド） コントロール動物は正常なＡＴＰ／ＡＤＰ比を示し、これはドリル生検により
回収し、続いてすぐに液体窒素中に漬けられたブタ心臓で報告されたものと類似
し（Ｗｈｉｔｅ，Ｆ．Ｃ．，およびＢｏｓｓ，Ｇ．、Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ
．Ｐａｔｈｏｌ．３：２２５−２３６（１９９０））、このことは使用したサン
プリング技術が適切であることを実証する。心不全を有する動物は、ＩＶＳから
採取したサンプル（コントロール、１４．８±１．１；心不全、２．４±０．３
；Ｐ＜０．０００１、ｎ＝４（両方の群））および側壁から採取したサンプル（
コントロール、１４．３±４．０；心不全、２．４±０．９；Ｐ＝０．００１２
、ｎ＝４（両方の群））において、ＡＴＰ／ＡＤＰ比における顕著な減少を示し
た。これによって、心筋での酸素の需要と供給の間の不均衡を確信した。
【０１５２】 （１−Ｐ．心筋血流） 心筋血流の局所的格差、迅速な心室ペーシングの即時の結果は、ペーシングに
誘発された心不全における局所的な、および全体的な機能障害の病原性に役割を
果たし得る。ペーシングの間、（刺激部位に隣接する）左心室側壁とＩＶＳの間
で、１分あたりの心筋血流に差異が見られた。減少した血流が、ペーシングを開
始するとすぐに側壁に現れ、そして２１〜２８日間持続した。左心室側壁（これ
はペーシングの間、ＩＶＳより少ない血流を受容する）は、ペーシングの２１日
〜２８日の間、壁肥厚化において漸進的な減少を示す（ペーシングオフ）。対照
的に、ＩＶＳ（これはペーシングの間より多い血流を受容する）は、ペーシング
の２１日〜２８日の間、比較的正常の壁肥厚化を維持する。
【０１５３】 １分あたりの心筋血流は、相対的な心筋虚血の評価を容易には可能にしないの
で、本発明者らはまた、１拍動あたりの心内膜性血流として冠状血流を表した。
そのような分析についての生理学的な基礎は先行の実験にあり、同実験は、１分
あたりの局所的心内膜下血流（経壁流の外壁よりむしろ）が漸進的な冠状動脈狭
窄症の状態下で局所的心筋収縮の主要な決定因子であること（Ｇａｌｌａｇｈｅ
ｒ，Ｋ．Ｐ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６：Ｈ７２７−Ｈ７３８（１９
８４））、および心拍数の増加が心内膜下血流の任意のレベルでより低い局所的
機能を伴って、この流れ−機能の関係を下にシフトさせることを示している（Ｄ
ｅｌｂａａｓ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ ４７７：４８１−４９６（１９９
０））。しかし、流れ−機能の関係が、心拍数効果を補正するために局所的機能
対１拍動あたりの内心膜血流としてプロットされると、異なる心拍数で単一の関
係が存在し、これは冠状血流が減少したとき、１拍動あたりの心内膜血流が壁機
能のレベルを主に決定することを示している（Ｉｎｄｏｌｆｉ，Ｃ．ら、Ｃｉｒ
ｃｕｌａｔｉｏｎ ８０：９３３−９９３（１９８９）；Ｒｏｓｓ，Ｊ．、Ｃｉ
ｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８３：１０７６−１０８３（１９９１））。ペーシングの
開始と共に、ＩＶＳと比較して、側壁における１拍動あたりの心内膜血流に＞５
０％の減少が存在した（Ｐ＜０．００１；表４）。
【０１５４】 意識のあるブタにおける先行の研究では、本発明者らは、心内膜血流における
５０％の減少は、局所的機能の５０％の減少を引き起こし、そして１拍動あたり
の心内膜下流と関連しており、これは本研究の側壁に見られたもの（表４）と類
似していることを実証した。ペーシングの間、側壁における血流の減少が、研究
の間ずっと続いた。これらのデータは、心室ペーシングの開始において、側壁に
おける心筋虚血の証拠を提供する。対照的に、ＩＶＳ機能および１拍動あたりの
内心膜流は、比較的正常のままであった。ペースメーカーを切ると、１拍動あた
りの内心膜下血流が、研究期間の間両方の領域で正常のままであったが、局所的
機能障害が側壁で続き、その領域での気絶心筋の発生と一貫している。従って、
本発明者らは側壁の持続性虚血がペーシングの間、および後で、全体的な機能に
有意な効果があることを想定する。
【０１５５】 （実施例２：例証となる遺伝子送達構築物の調製） （２−Ａ．例証となるアデノウイルス構築物の調製） ヘルパー非依存性複製欠損ヒトアデノウイルス−５系が使用された。ベクター
構築物の最初の説明のように、本発明者らは、β−ガラクトシダーゼおよびＦＧ
Ｆ−５をコードする遺伝子を使用した。β−ガラクトシダーゼまたはＦＧＦ−５
をコードする組み換えアデノウイルスは、全長ｃＤＮＡｓを使用して構築された
。組み換えアデノウイルスを生成するために使用された系は、導入遺伝子の挿入
について約５ｋｂのパッキング限界を課されている。それぞれのＣＭＶプロモー
ターおよびＳＶ−４０ポリアデニル化配列と作動可能に連結したβ−ｇａｌおよ
びＦＧＦ−５遺伝子の各々は、４ｋｂより少なく、十分にパッケージング構築の
範囲内である。
【０１５６】 ヒトＦＧＦ−５についての全長ｃＤＮＡは、プラスミドｐＬＴＲ１２２Ｅ（Ｚ
ｈａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：３４８７，１９８８）から１．
１ｋｂのＥＣＯＲ１フラグメントとして放出され、同フラグメントは、９８１ｂ
ｐのオープンリーディングフレームの遺伝子を含み、シャトルベクタープラスミ
ドＡＣＣＭＶｐＬｐＡのポリリンカーへクローニングされる。ＦＧＦ−５のヌク
レオチドおよびアミノ酸配列がＺｈａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８
：３４８７，１９８８の図１に開示される。ｐＡＣＣＭＶｐＬｐＡがＧｏｍｅｚ
−Ｆｏｉｘら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：２５１２９−２５１３４，
１９９２に記載されている。ｐＡＣＣＭＶｐＬｐＡは、アデノウイルス血清型５
ゲノムの５’末端を含み（マップ単位０〜１７）、ここでＥ１領域はヒトサイト
メガロウイルスエンハンサープロモーター（ＣＭＶプロモーター）で置換され、
ｐＵＣ１９（当該分野で周知のプラスミド）由来の複数クローニング部位（ポリ
リンカー）が続き、続いてＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが続く。ｌａｃＺを
コードするコントロールアデノウイルスは、マップ単位１〜９．８由来のＥｌＡ
／ＥｌＢ欠失に基づいている。ＦＧＦ−５をコードするアデノウイルス（Ａｄ．
ＦＧＦ−５）はマップ単位１．３〜９．３由来のＥＩＡ／ＥＩＢ欠失に基づいて
いる。これらのベクターの両方は、ＥｌＡコード配列の全体、およびＥｌＢコー
ド配列のほとんどを取り除く。これらのベクターの両方は、アデノウイルス配列
に対しアンチセンス方向にクローン化された導入遺伝子挿入を有する。それゆえ
、万一リードスルー（ｒｅａｄ ｔｈｒｏｕｇｈ）転写物が存在する場合、アデ
ノウイルス転写物はアンチセンスであり、そしてウイルス性タンパク質を発現し
ない。
【０１５７】 ＦＧＦ−５遺伝子含有プラスミドは、プラスミドＪＭ１７（ｐＪＭ１７）を用
いて２９３細胞へ（リン酸カルシウムの沈澱を使用して）同時トランスフェクト
されて同細胞は、さらなる４．３ｋｂ挿入を有するヒトアデノウイルス５ゲノム
全体を含み、これはｐＪＭ１７が非常に大きくするので、成熟アデノウイルスビ
リオンへキャプシド形成できない。次いで、細胞は栄養アガロース上にオーバー
レイされる。脈管形成遺伝子を含む感染性ウイルス性粒子が、２９３細胞の相同
レスキュー組み換えによって産生され、そして１０〜１２日後、単一のプラーク
として単離される。（成功した組み換えウイルスの同定はまた、リポフェクショ
ンによる同時トランスフェクション、および細胞変性効果の顕微鏡による直接的
調査によってなされ得る（Ｚｈａｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５（
５）：８６８−８７２，１９９３）に記載）。得られたアデノウイルスベクター
は導入遺伝子を含むが、Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂ配列を欠き、そしてそれゆえ、複製欠損
となる。ＦＧＦ−５遺伝子を保有するアデノウイルスベクターはまた、本明細書
中ではＡｄ．ＦＧＦ−５と呼ぶ。
【０１５８】 これらの組み換えアデノウイルスは、哺乳動物細胞では非複製的であるが、そ
れらはＥ１Ａ／Ｅ１Ｂで形質転換され、そしてこれらの必須の遺伝子産物をトラ
ンスで提供する２９３細胞で増殖する。個々のプラーク由来の組み換えウイルス
は、２９３細胞で増殖し、ウイルス性ＤＮＡは制限分析により特徴付けられる。
【０１５９】 次いで、成功した組み換えウイルスに、標準的な手順を使用して２つのラウン
ドのプラーク精製を行った。ウイルスのストックを２９３細胞中で、光学的濃度
測定により測定する場合、ミリリットル（ｍｌ）あたり１０10〜１０12ウイルス
粒子の範囲で力価まで増殖した。ヒト２９３細胞を８０％のコンフルーエンスで
感染し、そして培養上清を３６〜４８時間で収集した。ウイルス含有上清を凍結
融解サイクルにかけた後、細胞の破片を標準的な遠心分離によってペレット化し
、そしてウイルスは２つの塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配超遠心分離でさらに精
製された、（不連続の１．３３／１．４５ＣｓＣｌ勾配；５ｍＭ Ｔｒｉｓ中に
調製されたＣｓＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．８）；９０，０００×ｇ（２
ｈｒ）、１０５，０００×ｇ（１８ｈｒ））。インビボ注入に先だって、ウイル
スのストックが、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（例えば、ＰＢＳで平衡化されたＧ
２５Ｓｅｐｈａｄｅｘ）によるゲル濾過によって脱塩された。光学的濃度測定で
測定する場合、最終のウイルス濃度は１ミリリットル（ｍｌ）あたり約１０11ウ
イルス粒子であった。ウイルスのストックは、摂氏マイナス７０度で培地中の細
胞中で都合よく保存される。注入のために、精製されたウイルスは好ましくは生
理食塩水中に再懸濁される。アデノウイルスベクターの調製物は高純度であり、
野生型ウイルス（好ましくは１０6につき約１より少ない複製コンピテントアデ
ノウイルス（ＲＣＡ）粒子を、より好ましくは１０9につき１より少ないＲＣＡ
粒子を、および最も好ましくは１０12につき１より少ないＲＣＡ粒子を含む）は
存在しなかった。従って、心臓におけるアデノウイルスの感染および炎症性浸入
が最小化された。
【０１６０】 アデノウイルスベクターの構築物のさらなる説明は、以下に提供され、そして
本明細書中に提供される他の説明との組み合わせにおいて、本発明における使用
に適した他のアデノウイルスベクター構築物（改変型アデノウイルスベクターに
基づく構築物を含む）は、使用され得る。
【０１６１】 （２−Ｂ．さらなる例証となるベクターおよび導入遺伝子構築物） 上記のように、種々のウイルスベクターおよび非ウイルスベクターは、本発明
に従って、遺伝子の送達に使用され得る。別のベクターの例証となる実施例とし
て、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、上述されるように本発明の方法
に従ってインビボ送達のために産生される。本発明の脈絡において使用され得る
別の血管原性の遺伝子の例証となる実施例として、本発明者らは、アデノウイル
ス（Ａｄ）とＡＡＶベクター構築物の両方における、上記されたようなＩＧＦ遺
伝子を含む構築物を調製した。
【０１６２】 模範となる構築物は、異種のプロモーター（ＣＭＶプロモーターは、例証の目
的のために使用された）の制御下のＩＧＦ−１遺伝子を含み、そしてｒＡｄ／Ｉ
ＧＦまたはｒＡＡＶ／ＩＧＦとして設計される。これらに加えて、マーカー遺伝
子（例えば、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ））を含む構築物が、構築され
る。Ａｄ／ＩＧＦ構築物またはｒＡＡＶ／ＩＧＦ構築物はまた、マーカー遺伝子
（例えばＥＧＦＰ）を含むように構築される。ＥＧＦＰを含む構築物は、（例え
ば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから）市販
されている。
【０１６３】 ｒＡｄ／ＩＧＦを産生するために、ＩＧＦ−１遺伝子（ＡＴＣＣから入手可能
）は、（ｐＡｄｓｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ、ｐＡｄ５ＣＩ、および／またはｐＡｄ
ｔｒａｃｋ−ＣＭＶのような）アデノウイルスシャトルベクターにサブクローニ
ングされた。得られたＩＧＦ−１シャトルプラスミドは、使用されたシャトルベ
クターに依存する細菌または２９３細胞のどちらか一方において、ヘルパープラ
スミド、ｐＪＭ１７と共に組み換えプロセスを起こす。得られたｒＡｄ／ＩＧＦ
ウイルスは、ＲＴ−ＰＣＲおよび／またはウエスタンブロティングによる、ＩＧ
Ｆ−１タンパク質の発現の検証に有用である。
【０１６４】 実例として、本発明者らは前にＦＧＦ−５脈管由来遺伝子を含むアデノウイル
スベクターの生成に関して、上記において本質的に記載および実証したように、
２９３細胞中でシャトルベクターおよびｐＪＭ１７ヘルパープラスミドを用いて
模範的なｒＡｄ／ＩＧＦ構築物を調製した。ＥＧＦＰを含むアデノウイルスベク
ターを、アナログ技術を用いて、コントロールとして調製した。
【０１６５】 本発明者らは、当該分野で本質的に記述されるような組換えＡＡＶベクターの
生産のための技術を用いて、模範的なｒＡＡＶ／ＩＧＦ構築物を調製した（例え
ば、前述されたようなＡＡＶの生産に関する参考文献を参照のこと）。当該分野
で記載のように、ＡＡＶベクターは種々の異なる技術を用いて生成し得るが、本
発明者らは基本的な２重トランスフェクションの手順を用いた（本質的にＳａｍ
ｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８、１９８９に記載の
ような）。簡単には、ｒＡＡＶ／ＩＧＦを生成するために、ＩＧＦ−１遺伝子を
ｒＡＡＶプラスミドＤＮＡ中へサブクローン化し、（末端反復（ｔｅｒｍｉｎａ
ｌ ｒｅｐｅａｔｓ）またはＩＴＲが反転されたＡＡＶが、ＩＧＦ遺伝子の側面
に位置するように）そしてその後、このｒＡＡＶプラスミドを、ＡＡＶヘルパー
プラスミド（ＡＡＶ ｒｅｐおよびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をトランスで提供する
ため）と共に２９３細胞に同時トランスフェクションした。続いて、ヘルパーア
デノウイルスでトランスフェクションすることによって、ＡＡＶ生産を開始した
（本発明者らはｄ１３１２として知られるＥ１欠失アデノウイルスを用いた）。
アデノウイルスをインキュベートするため、一般的に、ウイルス溶解物を熱処理
し、そして、標準的な技術（例えばＳａｍｕｌｓｋｉら、前出）に従ってＤＮａ
ｓｅおよびＰｒｏｎａｓｅで処理した。
【０１６６】 ｒＡＡＶベクターの精製のために種々の技術が使用され得る。この実証の目的
のために、本質的に当該分野で記載されているように、本発明者らは、最初にｒ
ＡＡＶ粒子を汚染菌から分離するために、標準塩化セシウム（ＣｓＣｌ）超遠心
分離法（２回のＣｓＣｌ精製を使用して）を用いた。透析後、本発明者らはさら
に、その物質をＨＰＬＣによって精製した。この実施例において、本発明者らは
ヘパリン（ＰＯＲＯＳ ＨＥ、これはＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｆｏｓｔｅｒ
Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能である）でコーティングしたア
フィニティークロマトグラフィーカラムを使用し、食塩（１〜２Ｍ ＮａＣｌ）
を用いて溶出した。この実施例において、ＡＡＶのほとんどが約０．７Ｍ Ｎａ
Ｃｌで溶出された。ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）に対する透析に続き、ベクターを摂
氏５６℃で、６０分間熱処理し、残りのアデノウイルスを破壊した。アデノウイ
ルスと同様に、一般的に、生じたベクターのストックの、ＤＮａｓｅ耐性粒子（
ＤＲＰ）に関する力価を測定し、そして細胞変性の影響の欠如について試験した
。
【０１６７】 ｒＡｄ／ＩＧＦおよびｒＡＡＶ／ＩＧＦ中でのＩＧＦ−１の発現をウェスタン
ブロット分析によって確認した。さらに、それらを機能的なＩＧＦ−１タンパク
質の生産について、培養したＭＣＦ−７細胞上で増殖アッセイ（ｐｒｏｌｉｆｅ
ｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）を用いて試験した。簡単には、１日目にＨＥＫ（ヒ
ト胎児腎癌）２９３細胞を、ｒＡｄ／ＩＧＦまたはｒＡＡＶ／ＩＧＦを用いて形
質導入し、そして血清欠失培地で培養する。インキュベートの４８時間後、血清
欠失培地を回収し、そして血清欠失培地中で培養したＭＣＦ−７細胞の上に置く
。ＭＣＦ−７細胞の増殖を、本質的にＭｏｓｍａｎｎによって記載されたように
（例えば、Ｍｏｓｍａｎｎ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６：５５−６３
、１９８３を参照のこと）標準増殖アッセイ法（例えば、ＭＴＴアッセイ）を用
いて、次に７２時間モニターする。機能強化された緑色蛍光タンパク遺伝子、ｒ
Ａｄ／ＥＧＦＰまたはｒＡＡＶ／ＥＧＦＰを有するアデノウイルスあるいはＡＡ
Ｖベクターを、陰性コントロールとして用い、そして組換えヒトＩＧＦ−１タン
パク質を陽性コントロールとして用いた。このＭＴＴアッセイからの結果は、ｒ
Ａｄ／ＩＧＦベクター構築物およびｒＡＡＶ／ＩＧＦベクター構築物の両方がＩ
ＧＦ−１導入遺伝子をヒト標的細胞（ＨＥＫ ２９３）に送達することが可能で
あったこと、ならびに、次にそのような標的細胞の培地が、ＭＣＦ−７細胞の増
殖（ある意味では、精製されたＩＧＦ−１タンパク質に対するアナログ）を誘導
することが可能であったことを示した。陰性コントロールを用いてトランスフェ
クションした細胞からの培地を用いた場合、有意な増殖は観察されなかった（例
えばｒＡｄ／ＥＧＦＰまたはｒＡＡＶ／ＥＧＦＰ）。本発明者らはまた、直接的
にＭＣＦ−７細胞をトランスフェクションすることによってベクター構築物を試
験した。そして、細胞へのＩＧＦ−１タンパク質の投与（約３μｇ／ｍｌの濃度
で）に幾分匹敵する、トランスフェクションされた細胞における増殖を直接的に
誘導するために、ＩＧＦ構築物（ＡＡＶおよびアデノウイルスの両方において）
が用いられ得ることを実証した。
【０１６８】 さらなる試験はＩＧＦベクター構築物の機能性を確認するために、筋細胞を用
いて行われ得、その中ではＩＧＦが筋細胞の大きさおよび／または機能に及ぼす
影響が観察され得る。実例として、初期の新生児心筋細胞（ＮＣＭ）または成人
心筋細胞に及ぼすＩＧＦの影響を、様々なアッセイを用いて試験し得る。例えば
、ＩＧＦ−１はアデノウイルスまたはＡＡＶベクターによって送達され得、ＮＣ
Ｍにおける肥大および細胞のＤＮＡ合成を誘導する。ＮＣＭの形質導入後、適切
な感染の多重度（ＭＯＩ）（代表的に、約１００〜１０００の範囲内）で、心筋
細胞を輝きのあるスミレ色または自然な赤色に染色する。細胞を顕微鏡下で画像
化し、そして個々の細胞の大きさ（面積、長さ、および幅を含む）を自動的に測
定し得る（例えば、Ｉｍａｇｅ Ｐｌｕｓ ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して）。Ｉ
ＧＦ−１が細胞のＤＮＡ合成に及ぼす影響を、3Ｈ−チミジンの細胞取り込みに
よって定量し得、それにより、細胞由来ＤＮＡ合成を、細胞由来ＤＮＡのＴＣＡ
沈殿後における3Ｈ数によって、モニターし得る。
【０１６９】 脈管形成の導入遺伝子を含むベクターを、本明細書中に記載および実証されて
いるような冠状動脈内（ｉｎｔｒａｃｏｒｏｎａｒｙ）送達によって、心臓に送
達し得る。候補となるベクターの最初の試験として、ブタのような大きな動物モ
デルにおける送達より先に、本発明者らはまた、ラットモデルを使用した。その
中で、本発明者らはベクターの心筋層への間接的な冠状動脈内送達を使用する。
そのモデルにおいて、送達は、肺動脈および遠位大動脈（ｄｉｓｔａｌ ａｏｒ
ｔａ）の両方を圧迫した後、ベクターを含む溶液（例えば、リン酸緩衝化生理食
塩水（ＰＢＳ）またはＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水）を左心室（ｌｅｆｔ ｖｅ
ｎｔｒｉｃｌｅ）の室（ｃｈａｍｂｅｒ）へ導入することによって（例えば、心
室壁と向かい合うような室の内腔（ｌｕｍｅｎ）へ導入することによって）達成
される。従って、代わりの経路が一時的に塞がれているから、心室の室からの流
れは物質を運び、冠状動脈中へと送達させる。本発明者らは、交差クランプ法を
用いて、肺動脈および大動脈を圧迫した（例えば、Ｈａｊｊａｒら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：５２５１−５２５６、１９９８を
参照のこと）。本発明者らはまた、上記および上記で述べた類似の同時係属中の
出願において記載したように、冠状動脈内送達を経由する遺伝子の導入を促進す
るために、血管作用薬で前処理を行った。本発明者らは代表的にヒスタミンまた
はニトロプルッシドナトリウム（ＳＮＰ）のいずれかを血管作用薬として使用し
た。これらは約１〜７５ｍｇ／ｍｌの範囲で用いられ得る。代表的に、本発明者
らはベクターの送達より前に注入される約２５ｍｇ／ｍｌのヒスタミンを使用す
る。ＳＮＰの場合は、本発明者らは、代表的に約５０ｍｇ／ｍｌの血管作用薬を
使用し、ベクター導入の前に、数分間まで注入を開始し、そしてベクターが完全
に注射されるまで続く。これらの手順を用いて、本発明者らは、アデノウイルス
およびＡＡＶベクターの両方の、冠状動脈内送達を経て心筋に至る遺伝子導入の
非常に高いレベルを実証した。上記に記載したようにｒＡＡＶ／ＥＧＦＰを用い
て、例えば約１ｘ１０ｅ１１のＤＮａｓｅ耐性粒子の用量で送達する場合、本発
明者らは、細胞の約３０％のレベルで左心室（ＬＶ）の形質導入に達し得る（Ｌ
Ｖ切片をパラホルムアルデヒドの中で固定し、それからクリオスタットを用いて
８〜１０ミクロンの切片に切断し、そしてＩｍａｇｅＰｒｏ Ｐｌｕｓ ｓｏｆ
ｔｗａｒｅを用いて緑色領域の百分率を定量した後、蛍光顕微鏡検査によって測
定されるように）。心筋内における遺伝子発現は、心外膜内において最大であっ
たが、有意な発現は心外膜内でさえ観察されなかった。加えて、本発明者らは、
記載したような心筋へのＡＡＶベクターの送達に続き、比較的長命な遺伝子発現
（注射後３０日から１８０日までの間の発現レベルにおけるわずかな減少（もし
あるならば）を伴う）を実証した。さらに、組織学的分析および病理学的分析は
、心臓における炎症応答をほとんどあるいは全く示さず、そして、肝臓または肺
のいずれにおいても遺伝子発現を検出しなかった。
【０１７０】 （実施例３：ラット心筋中の遺伝子導入） （３−Ａ Ａｄ．β遺伝子導入および発現） 成体ラットの心筋細胞を、標準的な方法に従って、灌流液を含むコラゲナーゼ
を用いて、ランゲンドーフ灌流（Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）
によって調製した。杆状細胞をラミニンでコーティングされたプレート上で培養
し、そして２４時間後上記の実施例２で得られたβガラクトシダーゼをコードし
ているアデノウイルスを用いて、１：１の感染の多重度で、感染させた。さらに
３６時間後、その細胞をグルタルアルデヒドで固定し、そしてＸ−ｇａｌと共に
インキュベートした。一貫して、組換えアデノウイルスで感染させた後、７０％
〜９０％の成体筋細胞がβガラクトシダーゼ導入遺伝子を発現した。１〜２：１
の感染の多重度で、細胞毒性は観察されなかった。
【０１７１】 （３−Ｂ．ｒＡＡＶ／ＩＧＦ−１遺伝子の導入および発現） ラット新生児心筋細胞におけるＩＧＦ−１発現の影響をアッセイするため、２
ｘ１０ｅ６の細胞を１０ｃｍの細胞培養皿上にプレーティングし、ｒＡＡＶ／Ｉ
ＧＦ−１またはｒＡＡＶ／ＥＧＦＰの１ｘ１０ｅ１０のＤＮａｓｅ耐性粒子で感
染させた。細胞を最小培地中で、そして標準酸素レベル中で、摂氏３７℃におい
て血清の非存在下で培養した。組換えＩＧＦ−１タンパク質（５０ｎｇ／ｍｌ）
またはフェニレフリン（５０μＭ）を、陽性コントロールとして培地に加えた。
細胞を、処理後４８時間、視覚的にアッセイした。ｒＡＡＶ−ＩＧＦ−１で処理
された細胞は、形態的外見に基づき、未処理の細胞と比較して、有意な肥大（フ
ェニレフリンを使用して得られたものと比較できる程の）を示した。外来的に加
えられたＩＧＦ−１タンパク質は、ｒＡＡＶ／ＩＧＦ−１と比較して、ほんの少
しの肥大を誘導するように見えた。肥大のレベルを定量する目的で、立体学的プ
ログラム、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ５（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔ
ｉｃｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を利用した。簡単には、Ｉ
ｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ５プログラムが個々の細胞をトレーシングし、そ
して測定値が得られる。細胞はプログラムの中で輪郭を描かれ、そして細胞当り
の面積の総計が計算される。約５０〜１００個の細胞を条件ごとに計算し、そし
て統計的プログラムＰｒｉｚｍ中でグラフ化した。フェニレフリン処理細胞およ
びｒＡＡＶ／ＩＧＦ−１感染細胞が、未処理の細胞に比べて、有意な肥大を示す
ことが見出された。
【０１７２】 肥大の試験に加え、ｒＡＡＶ／ＩＧＦ−１の発現に続いて、培地へのＩＧＦ−
１分泌のレベルを、ＥＬＩＳＡアッセイを用いてＩＧＦ−１タンパク質について
測定した。簡単には、ｒＡＡＶ／ＩＧＦ−１感染培養物の培地においてタンパク
質の発現がみられ、４８時間後、約０．１〜１．０ｎｇ／ｍｌのレベルで回収さ
れ、コントロール集団（未処理またはｒＡＡＶ／ＥＧＦＰで感染させた）のＩＧ
Ｆ−１レベルを超える有意な増加が示された。
【０１７３】 （実施例４：ブタ心筋へのインビボでの遺伝子導入） （４−Ａ．Ａｄ．β−ｇａｌ遺伝子導入および発現） 実施例２で得たβ−ガラクトシダーゼをコードするアデノウイルスベクターを
、許容性２９３細胞において増殖させ、実施例２の手順に基づいて、１．５×１
０10ウイルス粒子の最終的ウイルス力価を用いてＣｓＣｌ勾配超遠心分離によっ
て精製した。４０ｋｇのブタを麻酔し、人工呼吸させ、そして開胸術を行った。
２６ゲージの蝶型注射針を、左冠状前室間動脈（ＬＡＤ）の中央部に挿入し、そ
してベクター（１．５×１０10ウイルス粒子）をリン酸緩衝化生理食塩水中、２
ｍｌ容量で注入した。胸部を閉鎖し、動物を回復させた。注入の４日後に、動物
を屠殺した。心臓をグルタルアルデヒドで固定し、切片にし、そしてｘ−ｇａｌ
とともに１６．５時間インキュベートした。包埋して切片化した後、組織をエオ
シンで対比染色した。
【０１７４】 組織切片（ｌａｃＺを含むアデノウイルスの冠状動脈内注入９６時間後のＬＡ
Ｄ床の経壁切片）の顕微鏡分析によって、β−ガラクトシダーゼについて陽性染
色される細胞の実質的な割合を実証する、多くの組織切片を用いたＬＡＤ冠状動
脈床において認められる遺伝子導入の有意な規模が明らかになった。ＬＡＤ循環
床から遠位にある心筋の領域は、ｘ−ｇａｌ染色を示さず、陰性コントロールと
して作用したが、一方で、遺伝子の散在性発現は、筋細胞および内皮細胞におい
て認+められた。筋細胞のかなりの割合が、β−ガラクトシダーゼ活性（青色染
色）を示し、そして閉鎖した胸部冠状動脈内注入を使用するさらなる研究におい
て、遺伝子導入（ｎ＝８）後１４日目に類似した活性が存在した。遺伝子発現の
領域において、炎症または壊死の証拠はなかった。
【０１７５】 （４−Ｂ．ｒＡＡＶ／ＥＧＦＰ遺伝子の導入および発現） 実施例２で前記したように、ＥＧＦＰをコードしているアデノ随伴ウイルスベ
クターを作製、増殖および精製した。４匹の飼育ブタ（それぞれ３０ｋｇ未満）
を麻酔し、人工呼吸させ、そして正中頸部静脈切開を行った。頚動脈を分離し、
５ Ｆｒｅｎｃｈ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｒ ｓｈｅａｔｈを挿入した。５ Ｆｒ
ｅｎｃｈ ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ ａｎｇｉｏｃａｔｈｅｔｅｒを左回旋動
脈（ＬＣＸ）内に配置し、カテーテルの先端を冠状動脈管腔内約１ｃｍに配置し
た。遺伝子の注射のために使用する注射器を最初にＰＢＳで流し、それから遺伝
子溶液を注射器の中に吸った。ウイルスを投与する前に、冠状動脈内ヒスタミン
（毎分２５μｇ）をＬＣＸ中に３分間注入し、続いてｒＡＡＶ／ＥＧＦＰ（ｎ＝
３）の２．３６ｘ１０13ウイルス粒子、またはｒＡＡＶ／ＥＧＦＰ（ｎ＝１）の
４．７２ｘ１０13ウイルス粒子のいずれかを注入した。１．５ｍｌの遺伝子溶液
の全量を、３０秒間に１ｍｌの注入速度で、各々のブタに注射した。次いで、血
管カテーテルおよびイントロデューサーシースを除去し、頚部切開を閉じた。動
物を麻酔から回復させ、そして研究が完結するまで収容檻に置いた。
【０１７６】 遺伝子の注射から６〜８週間後、ブタを犠牲にし、そして組織を収集した。心
臓を切除し、そして氷冷した生理食塩水の中に置いた。冠状動脈を低温灌流し、
そして組織を収集し、それから液体窒素の中で瞬間凍結した。他の組織も同様に
、可能な限り素早く収集し、そして液体窒素の中で瞬間凍結した。組織切片の蛍
光顕微鏡検査およびＲＴ−ＰＣＲの両方は、胸部を閉鎖したブタにおける送達の
直接的冠状動脈内注入法を用いて、ｒＡＡＶベクターによるＥＧＦＰ遺伝子の、
好結果な送達および発現を実証した。以下に示すように、特に、ＲＴ−ＰＣＲか
らの結果によって、左冠状前室間動脈（ＬＡＤ）による床と比較して、遺伝子が
、注射された動脈によって供給される床（例えば、ＬＣＸ床）までうまく送達さ
れ、そしてその中でうまく発現していることが確認された： ブタ番号１ ブタ番号２ ブタ番号３ ブタ番号４ ＬＣＸ切片１ ＋ ＋ ＋ ＋ ＬＣＸ切片２ ＋ − ＋ ＋ ＬＡＤ − − − − （実施例５：（ＦＧＦ−５導入遺伝子を使用する）新脈管形成媒介遺伝子治療
のブタモデル） この心筋虚血および心不全についてのブタモデルにおいて、動物を心房電気的
刺激（ペーシング）によるストレスにさらした。ストレスによって誘導される心
筋機能障害および不充分な局所的血流の程度を定量し、次いで、遺伝子導入をＦ
ＧＦ−５を発現する例示的な組換えアデノウイルスの冠状動脈内注入により行っ
た。安定であるが、制限された内因性新脈管形成が発達した後に、遺伝子導入を
行い、そして誘導性虚血（患者における狭心症に類似する）が存在した。この動
物は、安静時には虚血がなかったが、活動中または心房ペーシングの間には、虚
血が発症した。コントロール動物に、ｌａｃＺ（β−ｇａｌ）を発現する組換え
アデノウイルスを受けさせ、ＦＧＦ−５とは独立しているアデノウイルス自体が
新血管形成を刺激した可能性を排除した。このことはまた、遺伝子導入とは関係
なく、持続された側枝血管発生の可能性にとってのコントロールとなった。遺伝
子導入の２週間後、ストレス誘導性心臓機能障害および局所的な血流を再び測定
した。
【０１７７】 ｌａｃＺを受けるブタは、遺伝子導入前および遺伝子導入から２週間後の虚血
性領域において、ペーシング誘導性機能障害の類似した程度を示した。対照的に
、ＦＧＦ−５遺伝子を受けた２週間後では、動物は、ペーシングの期間中、虚血
性領域において、壁の肥厚化の増加および血流の改善を示した。この結果によっ
て、新脈管形成導入遺伝子（ＦＧＦ−５）の遺伝子導入が、新たに形成された血
管を通る局所的な血流の改善によって、局所的な心筋収縮機能障害を改善するた
めに有効であったことが実証された。
【０１７８】 （方法） （動物およびモデル） 体重４７±９ｋｇの家畜用ヨークシャー種ブタ（腺病の疑いのある、ｎ＝２７
）を使用した。２匹の動物にｌａｃＺを発現する組換えアデノウイルス（２．０
ｍｌの生理食塩水中、１０11ウイルス粒子）の冠状動脈内注入を受けさせた。そ
して注入の３日後または５日後に屠殺した。残りの２５匹の動物に、左心房、肺
動脈、および大動脈にカテーテルを配置して、局所的な血流を測定し、そして血
圧をモニターするための手段を提供した。ワイヤーを左心房に縫合して、ＥＣＧ
の記録および心房ペーシングを可能にした。アメロイド（ａｍｅｒｏｉｄ）収縮
剤を近位の左回旋冠状動脈の周辺に配置した。アメロイド物質は吸湿性でありか
つ徐々に膨張する。側副血管が発達するので、配置して１０日後には、最小の梗
塞（左心室について＜１％）を伴いながら徐々に完全な動脈の閉塞を導く。心筋
機能および血流は、動脈の閉塞によって以前に灌流された領域（虚血性領域）に
おいて、安静時には正常である。しかし、血流は、心筋の酸素要求が増加する場
合、虚血を予防するには不充分である。側副血管の発達は、アメロイド配置の２
１日以内で完全であり、そして少なくとも４ヶ月間変化しないままである（Ｒｏ
ｔｈら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５３：Ｈ１２７９−Ｈ１２８８，１９８
７）。液圧式カフもまた、動脈周辺（アメロイドの遠位ではなければ近位）に配
置した。これらの手順は、他に詳細に記載されている（Ｈａｍｍｏｎｄら、Ｊ．
Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２３：４７５−４８２，１９９４およびＨａ
ｍｍｏｎｄら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：２６４４−２６５２，１９
９３）。２匹の動物はアメロイド配置の５日後および７日後に死亡した。アメロ
イド配置の３８（±２）日後、限局的な側副循環が発達しかつ安定した場合、動
物を研究に使用し、ペーシング誘導性局所的機能および血流を規定し、次いで、
冠状動脈内注入によって送達した、ｌａｃＺ（ｎ＝７、コントロール動物）また
はＦＧＦ−５（ｎ＝１６、処置群）のいずれかを発現する組換えアデノウイルス
を受けさせた。次いで、１４±１日後に、ペーシング誘導性局所的機能および血
流を規定する研究を繰り返した。後日、ＡｄｌａｃＺ（ｎ＝７）およびＡｄＦＧ
Ｆ−５（ｎ＝１１）動物を屠殺し、組織を収集した。５匹のＡｄＦＧＦ−５動物
を、遺伝子導入後の１２週間研究し、次いで、屠殺した。
【０１７９】 （組換えアデノウイルスおよび導入遺伝子送達） ヘルパー非依存性複製欠損ヒトアデノウイルス５系を、上記の実施例２に記載
のように調製した。
【０１８０】 導入遺伝子の冠状動脈内送達のために、動物を麻酔し、そして５Ｆ動脈シース
を頸動脈中に配置した。５Ｆ多目的（Ａ２）冠状動脈カテーテルを、シースを通
して冠状動脈中に挿入した。アメロイド（ａｍｅｒｏｉｄ）の閉鎖を、全ての動
物において、左主冠状動脈中への造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ）の注射によって確
認した。次いで、カテーテルの先端部を、注入の間に近位の大動脈へ失われる材
料が最小になるように、動脈管腔内の深いところに置いた。組換えアデノウイル
スの２×１０11個のウイルス粒子を含有する４ミリリットルを、２．０ｍｌをゆ
っくりと左および右の冠状動脈中に注入することによって送達した。
【０１８１】 （アッセイ：） （ｉ）局所的収縮機能および灌流。２次元およびＭモード画像を、Ｈｅｗｌｅ
ｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ超音波画像化システム（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ
Ｓｏｎｏｓ １０００）を使用して、乳頭筋レベルで右胸骨アプローチから得
た。覚醒動物を、苦痛のない吊り包帯で吊り下げて、からだの動きを最小にして
研究した。画像を、基底状態にある動物を使用してＶＨＳテープ上に記録し、そ
して再び左心房ペーシングの間（心拍数＝２００拍／分）に記録した。これらの
研究を、遺伝子導入の１日前に行い、そして１４±１日後に繰り返した。５匹の
動物を、ＦＧＦ−５での遺伝子導入の１２週間後に再び試験して、改善された機
能に及ぼす効果が持続されるか否かを決定した。心拍数×血圧および左心房圧は
、両方の群において遺伝子導入の前および後で同様であり、同様な心筋酸素要求
量およびストレス状態条件を示した。超音波心臓図の測定を、標準化した基準を
使用して行った（Ｓａｈｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ５８：１０７２−１０
８３， １９７８）。超音波心臓図の測定の再現性を実証するために、動物（ｎ
＝５）を、連続する２日において画像化した。別々の測定からのデータは、高度
い再現性があった（側壁肥厚：ｒ2＝０．９０；Ｐ＝０．００５）。このモデル
において経胸壁超音波心臓図検査およびソノマイクロメトリーによって測定され
た機能の減少パーセントは、類似していた（Ｈａｍｍｏｎｄら、Ｊ．，Ａｍ．Ｃ
ｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２３：４７５−４８２，１９９４およびＨａｍｍｏｎ
ｄら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：２６４４−２６５２，１９９３）。
これは、虚血機能不全の評価についての超音波心臓検査の精度を記録する。分析
を、処置群に関する知識なしに行った。
【０１８２】 造影剤（Ｌｅｖｏｖｉｓｔ；ガラクトースの微小凝集物）は、左心房注入の後
の画像のエコー源性（白さ）を増大させる。微小凝集物は、冠状動脈および心筋
壁中に血流に比例する様式で分布する。コントラスト増強のピークの強度は、ミ
クロスフェアによって測定した心筋血流（Ｓｋｙｂａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏ
ｎ ５８：１０７２−１０８３，１９７８）と相関している。アメロイドを配置
した３８（±２）日後（アメロイドの閉鎖の十分後であるが、遺伝子導入の前）
に、造影超音波心臓検査の研究を、心房ペーシング（２００ｂｐｍ）の間に行っ
た。研究を、遺伝子導入の１４±１日後に繰り返し、そして５匹の動物において
、ＦＧＦ−５を用いる遺伝子導入の１２週後に繰り返した。ピークコントラスト
強度を、コンピュータベースのビデオ分析プログラム（Ｃｏｌｏｒ Ｖｕｅ Ｉ
Ｉ， Ｎｏｖａ Ｍｉｃｒｏｓｏｎｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ
ｉａｎａ）を用いてビデオ画像から測定し、これは、ビデオ強度の客観的尺度を
提供した。データを、心室中隔（ＩＶＳ、閉塞していない左冠状前室間動脈を通
して正常な血流を受ける領域）におけるピークビデオ強度で除算した虚血領域（
ＬＣｘ床）におけるピークビデオ強度の比として表した。造影超音波心臓検査に
よって測定された心房ペーシングの間の局所的な血流の差異は、本発明者らの研
究室でこの同じモデルでミクロスフェアによって測定された差異に類似していた
。これは、局所的心筋血流の評価についての超音波造影心臓検査の精度を記録す
る。コントラスト研究は、動物が受けたのはどの遺伝子かの知識なしで分析され
た。
【０１８３】 （ｉｉ）新脈管形成の評価 腕頭の動脈にカニューレを挿入し、そして他の大きな血管を結紮した。ヘパリ
ン（１０，０００ＩＵ）、パパベリン（６０ｍｇ）、次いで塩化カリウム（拡張
期心臓停止を誘導するため）を静脈内注射した後、大動脈を、交差クランプし、
そして冠状血管系を灌流した。グルタルアルデヒド溶液（６．２５％、０．１Ｍ
カコジル酸緩衝液）を、１２０ｍｍＨｇ圧で灌流した；心臓を取り出した；床を
、左前下行動脈、左回旋枝動脈、および右冠状動脈を通して順行的に注入された
色分けした色素を使用して同定した；そしてアメロイドを、閉鎖を確認するため
に検査した。正常に灌流した虚血領域（心内膜（１／３）および心外膜（１／３
））から採取したサンプルを、プラスチックに包埋し、そして毛細血管数の顕微
鏡分析のために調製した。四つの１μｍ厚の横断面を、以前に記載したように（
Ｍａｔｈｉｅｕ−Ｃｏｓｔｅｌｌｏ，Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３３：９８
−１１７，１９８７およびＰｏｏｌｅ＆Ｍａｔｈｉｅｕ−Ｃｏｓｔｅｌｌｏ，
Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５９：Ｈ２０４−Ｈ２１０，１９９０）、各サブ
サンプル（各領域の心内膜および心外膜）から採取した。各サブサンプルにおけ
る８つの視野（系統的サンプリングによってランダムに選択された）の各々にお
ける各線維の周りの毛細血管の数および線維の断面積を、画像分析機（Ｖｉｄｅ
ｏｍｅｔｒｉｃ １５０，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｎｏｖｉｓｉｏｎ）を×１４
００で用いて測定した。合計３２５±１８の線維の周りの毛細血管の数を測定し
た。毛細血管密度（線維の断面積あたりの数）を、サブサンプルあたり１５±１
視野をポイントカウンティングすることによって見積もった。線維の周りの毛細
血管数、線維の断面積、および毛細血管密度の相対的な標準誤差は、それぞれ１
．４、４．１および４．２％であった。毛細血管対線維の比は、毛細血管密度と
線維の断面積との積として計算した。いずれかの群からの心筋サンプルにおける
断面積に有意差はなかった。ブロモデオキシウリジン（５０ｍｇ／ｋｇ）を、５
匹の動物：コントロール動物（アメロイドなし）；２週間前にｌａｃＺ遺伝子導
入を受けたアメロイド閉塞を有する２匹の動物；および２週間前にＦＧＦ−５遺
伝子導入を受けたアメロイド閉塞を有する２匹の動物の腹膜腔に注入した。ＢＲ
ＤＵ注入の３６時間後、動物を屠殺し、そして組織を以前に記載した方法（Ｋａ
ｊｓｔｕｒａら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７４：３８３−４００，１９９４）を使用
して分析のために調製した。十二指腸の切片を、陽性コントロールとして使用し
た。
【０１８４】 （ｉｉｉ）ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびタンパク質発現 遺伝子導入の後、左心室ホモジネートは、導入遺伝子の存在および発現を記録
するための研究を受けた。ＣＭＶプロモーターに対するセンスプライマー（ＧＣ
ＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣ；配列番号１）および内部ＦＧＦ−５配
列に対するアンチセンスプライマー（ＧＡＡＡＡＴＧＧＧＴＡＧＡＧＡＴＡＴＧ
ＣＴ；配列番号２）を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、予想さ
れる５００ｂｐフラグメントが増幅された。ＦＧＦ−５配列の始めに対するセン
スプライマー（ＡＴＧＡＧＣＴＴＧＴＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣ；配列番号３）お
よび内部ＦＧＦ−５配列に対するアンチセンスプライマー（すなわち、配列番号
２）を使用して、ＲＴ−ＰＣＲは、予想される４００ｂｐのフラグメントを増幅
した。アデノウイルスＤＮＡ Ｅ２領域に対するプライマーを使用して、組織に
おける野生型または組換えウイルスＤＮＡを検出した（ＴＣＧＴＴＴＣＴＣＡＧ
ＣＡＧＣＴＧＴＴＧ；配列番号４）および（ＣＡＴＣＴＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＣ
ＧＴＧＧ；配列番号５）。予想される９００ｂｐのフラグメントを、組換えウイ
ルスから増幅した。これらの研究は、心筋および他の組織からの２００ｍｇの組
織サンプル上で行った。ＰＣＲ検出感度は、５百万細胞あたり１ウイルス配列で
あった。ＦＧＦ−５に対するポリクローナル抗体（Ｋｉｔａｏｋａら、Ｉｎｖｅ
ｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３５：３１８９−３１９８，１
９９４）を、ＦＧＦ−５またはｌａｃＺの遺伝子導入の４８時間後に、培養した
ラット心臓線維芽細胞の培地からのタンパク質の免疫ブロットにおいて使用した
。ＦＧＦ−５タンパク質を、ＦＧＦ−５の遺伝子導入後にコンディションドメデ
ィウムにおいて見出したが、ｌａｃＺの遺伝子導入後には見出さなかった。ＰＣ
Ｒおよびウエスタンブロットについての方法は、他のところで詳細に記載されて
いる（Ｈａｍｍｏｎｄら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：２６４４−２６
５２，１９９３，Ｒｏｔｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：９３９−９
４９，１９９３、およびＴｓａｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６７：Ｈ２
０７９−Ｈ２０８５，１９９４）。マイトジェン活性についてインビトロで導入
遺伝子を試験するために、成体ラット心臓線維芽細胞を、ＦＧＦ−５コードする
アデノウイルスまたはｌａｃＺコードするアデノウイルスで感染させたか、また
は感染させなかった。これらの細胞培養由来の培地を、ＮＩＨ ３Ｔ３マウス線
維芽細胞と共にインキュベートし、そしてトリチウム化チミジン取り込みを、測
定した（Ｔｓａｉら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６：３８３１−３８３
８，１９９５）。
【０１８５】 （ｉｖ）冠状動脈内送達の間のアデノウイルス放出 肺動脈血を、３匹の動物における組換えアデノウイルスの冠状動脈内注射の間
に連続的に取り出した。各サンプルからの血清を、標準的なプラークアッセイに
おいて使用した。希釈していない血清（０．５ｍｌ）を、コンフルエントに満た
ないＨ２９３細胞に添加した；１０日後、プラークは、形成されていなかった。
しかし、０．５ｍｌの血清をＤＭＥＭ（２％ＦＢＳ）で２００倍〜８０００倍に
希釈した場合、ウイルスプラークが９日目までに形成された。単一の血管床（心
筋）が、冠状動脈および肺動脈を分離する。冠状動脈への注入の後、この床にウ
イルスが付着しない場合、ウイルスの肺動脈濃度は、注射の時間にわたる全身静
脈血による冠状洞血の希釈を反映するはずである。本発明者らの研究室からの測
定は、冠状動脈流量が、肺動脈流量の５％を表すことを示す。この希釈因子（２
０倍）、冠状動脈注射の持続時間、および注入されたアデノウイルスの量を使用
して、本発明者らは、肺動脈に送達されたアデノウイルスの量を、アデノウイル
スの流出および付着がないと仮定して計算した。この見積もりを、測定した量と
比較し、差異を心筋血管床によってクリアランスされたウイルスの量の見積もり
として使用した。
【０１８６】 （ｖ 炎症の評価） ヘマトキシリン／エオシン染色およびマッソン三色染色を使用して、炎症性細
胞浸潤、細胞壊死、および線維症を検出した。マウス腹水、ブタ抗ＣＤ４および
抗ＣＤ８モノクローナル抗体（１．０ｍｇ／ｍｌ；ＶＭＲＤ， Ｉｎｃ．， Ｐ
ｕｌｌｍａｎ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を使用して、脾臓（陽性コントロール
）および心臓の凍結切片（６μｍ）におけるＴリンパ球上のＣＤ４およびＣＤ８
マーカーを検出した。これらの研究を、屠殺する５０日前にアメロイド閉塞を受
けた６匹の動物の心臓の経壁サンプル上で行った：２匹の動物は、遺伝子導入を
受けず、２匹は２週間前にＦＧＦ−５遺伝子導入を受け、そして２匹はｌａｃＺ
遺伝子導入を２週間前に受けた。分析を処置群の知識なしに行った。
【０１８７】 （ｖｉ 統計的解析） データは、平均値±１ｓ．ｅ．ｍで表現される。ＦＧＦ−５遺伝子およびｌａ
ｃＺ遺伝子の導入前後で行った測定は、分散の二元分析（ｔｗｏ ｗａｙ ａｎ
ａｌｙｓｉｓ）を用いて比較した（Ｃｒｕｎｃｈ４、Ｃｒｕｎｃｈ Ｓｏｆｔｗ
ａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｎｉａ）。新脈管形成研究によ
るデータは、また分散の二元分析を行った。帰無仮説はＰ＜０．０５の場合棄却
した。
【０１８８】 （ＦＧＦ−５遺伝子導入を使用した結果） ３つの測定を使用して、ＦＧＦ−５遺伝子導入が心筋虚血の処置において有効
であるか評価した：局所的収縮機能および血流（遺伝子導入の前後で評価した）
および毛細血管数。動物がどの遺伝子を受け取ったか（ＦＧＦ−５対ｌａｃＺ）
を知ることなく、全ての測定を行った。
【０１８９】 （局所的収縮機能および血流） アメロイド配置の３８日後、心房電気刺激（律調）の間に、動物は損なわれた
壁肥厚化を示した。ｌａｃＺを受けているブタは、遺伝子導入の２週間後は、虚
血領域における同適度の律調誘導機能不全を示した。その一方、ＦＧＦ−５遺伝
子導入の２週間後、律調の間の虚血領域の壁肥厚が２．７倍増加した（Ｐ＜０．
０００１；図６）。正常な灌流領域（心室中隔）における壁肥厚化は、律調の間
正常であり、その遺伝子導入による影響は見られなかった（％壁肥厚：ｌａｃＺ
：遺伝子導入前５３±８％、遺伝子導入後：５１±６％；ＦＧＦ−５：遺伝子導
入前５９±４％、遺伝子導入後５９±６％）。
【０１９０】 虚血領域における改善した機能に関連して、改善した局所血流が存在した。ｌ
ａｃＺ遺伝子導入の２週間後、律調の間、虚血領域における持続した流量欠乏が
存在した（図８）。しかし、ＦＧＦ−５遺伝子導入を受けた動物は、二週間後２
つの領域において均一なコントラスト増強を示した。これは、虚血領域における
改善した血流を示す（ｐ＝０．０００１）。虚血床における改善した機能および
灌流が長期間続くものか否かを決定するために、５匹の動物をＦＧＦ−５遺伝子
導入の１２週間後に再び試験した。各々の動物は、機能（Ｐ＝０．００５；図６
）および灌流（Ｐ＝０．００１；図８）における持続する改善を示した。
【０１９１】 （脈管形成） 感染していないアメロイド狭窄した動物（遺伝子導入は行われていない）は、
ｌａｃＺをコードするアデノウイルスを受けている動物と同一の生理学的応答を
有していた。これは、ｌａｃＺベクターが、天然の脈管形成に悪影響を与えなか
ったことを示す。脈管形成を評価するために、心筋毛細血管の数を、灌流固定心
臓の顕微鏡分析を使用して定量した（図９）。各心筋線維をとりまく毛細血管の
数は、ｌａｃＺでの遺伝子導入を受けた動物の心臓の同じ領域と比較した場合、
ＦＧＦ−５での遺伝子導入を受けた動物の虚血および非虚血の領域の心内膜にお
いて、より大きかった（Ｐ＝０．０３８）。従って、改善された局所的機能およ
び灌流は、ＦＧＦ−５遺伝子導入の２週間後の毛細血管脈管形成と関連していた
。各線維のまわりの増大した毛細血管の数は、ＦＧＦ−５遺伝子導入後の壁の心
外膜部分において増加する傾向にあった（Ｐ＝０．１３）。線維の横断面積あた
りの毛細血管の数および線維数あたりの毛細血管の数のような毛細血管の他の測
定は、心膜内または心外膜内において変化しなかった。
【０１９２】 （ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびタンパク質発現） ＦＧＦ−５遺伝子導入の、機能、灌流、および各線維のまわりの毛細血管数に
対する有利な効果を確立したならば、心臓における導入遺伝子の存在および発現
を実証することは不可避的であった。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびＰ
ＣＲと組み合わせた逆転写酵素（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、ＦＧＦ−５遺伝子
導入を受けた動物由来の心筋における導入遺伝子ＦＧＦ−５ ＤＮＡおよびｍＲ
ＮＡを検出した。
【０１９３】 遺伝子導入の後、左心室サンプルを、試験して、導入遺伝子取りこみおよび発
現を記録した。簡単には、ｌａｃＺの冠状動脈内遺伝子導入の３日後、心筋をＸ
−ｇａｌで処理し、次いでＥｏｓｉｎ Ｘ１２０で対比染色した。標準的な組織
学的技術を使用する試験は、ほとんどの筋細胞が、βガラクトシダーゼ活性（青
染色）を示したことを明らかにした。活性は、ｌａｃＺ遺伝子導入を受けた全て
の動物においてもまた遺伝子導入の１４±１日後に観察された。高倍率は、βガ
ラクトシダーゼ活性を含む細胞において交差した条線を示した。これは、筋細胞
中での遺伝子発現を確認した。ＣＭＶプロモーターに対するセンスプライマーお
よび内部ＦＧＦ−５配列に対するアンチセンスプライマーを使用するＰＣＲ分析
は、ＦＧＦ−５遺伝子導入を受けた３匹の動物の虚血領域（ＬＣｘ）および非虚
血領域（ＬＡＤ）においてＦＧＦ−５をコードする組換えアデノウイルスＤＮＡ
の存在を確認するために行った。図１０Ａに示す結果は、予想された５００ｂｐ
フラグメントの存在を確認した。次いで、ＦＧＦ−５ ｍＲＮＡ発現は、遺伝子
導入の１４日後に試験した。図１０Ｂに示されるように、ＲＴ−ＰＣＲ増幅４０
０ｂｐフラグメントは、２匹の動物の両方の領域に存在した。これに対し、コン
トロール動物は、シグナルを示さなかった。ＦＧＦ−５に対するポリクローナル
抗体は、ＦＧＦ−５またはｌａｃＺの遺伝子導入の４８時間後に、培養されたラ
ット心臓線維芽細胞の培地からのタンパク質の免疫ブロットにおいて使用された
。図１０Ｃに示されるように、ＦＧＦ−５タンパク質は、ＦＧＦ−５（Ｆ）の遺
伝子導入後に見出されたが、ｌａｃＺ（β）の遺伝子導入後には見出されなかっ
た。これは、ＦＧＦ−５遺伝子導入の後のタンパク質発現および細胞外分泌を示
す。最後に、ＰＣＲを、アデノウイルスＤＮＡ（Ｅ２領域）に対するプライマー
のセットを使用して実施し、アデノウイルスＤＮＡが、１４日前にアデノウイル
スの冠状動脈内注入を受けた２匹の動物の網膜、肝臓、または骨格筋に存在する
か否かを決定した。図１０Ｄに示されるように、予想された９００ｂｐの増幅さ
れたフラグメントは、組換えアデノウイルスを（陽性コントロールとして）含有
するコントロールレーン（＋）にのみ見出され、処置された動物の網膜（ｒ）、
肝臓（ｌ）、または骨格筋（ｍ）に由来するレーンには見出されなかった。
【０１９４】 首尾良い遺伝子導入を、虚血および非虚血領域の両方において記録した。免疫
ブロッティングは、ＦＧＦ−５遺伝子導入を受けた動物由来の心筋においてＦＧ
Ｆ−５タンパク質を示した。培養した線維芽細胞を使用するさらなる実験におい
て、本発明者らは、ＦＧＦ−５の遺伝子導入が、ＦＧＦ−５を合成し、そして細
胞外に分泌するこれらの細胞の能力を与えたことを記録した。ＦＧＦ−５を発現
する組換えアデノウイルスに感染した培養した細胞からの培地は、分裂促進応答
を示した（コントロールに対して１４倍の増加；Ｐ＝０．００５）。最後に、遺
伝子導入の２週間後、ｌａｃＺ感染動物からの心筋サンプル（肝臓サンプルでは
ない）は、組織学的検査においてβガラクトシダーゼ活性を示した。これらの研
究は、首尾良いインビボ遺伝子導入および発現を確認し、そして導入遺伝子産物
の生物学的活性を実証する。
【０１９５】 組換えアデノウイルスの冠状動脈内注入の２週間後、本発明者らは、ＰＣＲを
使用して、心筋におけるウイルスＤＮＡの存在にもかかわらず、肝臓、網膜、ま
たは骨格筋においてウイルスＤＮＡを検出し得なかった。さらに、ウイルスＤＮ
Ａは、冠状動脈内注射の２〜２４時間後、尿中で検出不可能であった。これらの
実験は、アデノウイルスベクターの冠状動脈内送達が、ウイルスの全身的動脈分
布をＰＣＲ法の検出限界より低いレベルまで最小化したことを示した。この技術
は、より小さい冠状動脈サイズを有する動物（例えば、ウサギ）において達成す
ることが困難であるかもしれない。
【０１９６】 アデノウイルスの心筋取りこみの効率を評価するために、本発明者らは、冠状
動脈内注射の間の肺動脈血のサンプリングによって心臓から放出されたアデノウ
イルスの量を測定した。驚くべきことにウイルスの９８．７％が、ファーストパ
ス（ｆｉｒｓｔ ｐａｓｓ）の際に心臓によって除去された。ウイルスの冠状動
脈内送達の間に肺動脈から得た希釈されていない血清は、適切な条件においてウ
イルスプラークを形成することが不可能であった。従って、本発明は、心臓特異
的遺伝子送達システムを効果的に提供する。
【０１９７】 （炎症の評価） 組換えアデノウイルスを受けた動物の心臓の経壁切片の顕微鏡検査は、炎症性
細胞浸潤、細胞壊死、または増大した線維症を示さなかった。アデノウイルス誘
導細胞変性効果についてのさらなる評価として、本発明者らは、細胞傷害性Ｔ細
胞の存在を示すＣＤ４およびＣＤ８抗原を検出するための免疫組織学的研究を行
った。これらの研究は、感染していない動物（ｎ＝２）または組換えアデノウイ
ルスを受けた動物（ｎ＝４）からの心臓の経壁切片上の極く稀な陽性細胞を示し
た。肝臓もまた炎症を有していなかった。
【０１９８】 （実施例６：ＦＧＦ−４導入遺伝子を用いた遺伝子媒介脈管形成） 本実施例は、異なる脈管形成タンパク質をコードする遺伝子であるＦＧＦ−４
を用いた、成功した遺伝子治療を示した。ＦＧＦ−４遺伝子治療のためのプロト
コルは、本質的に、ＦＧＦ−５について上記実施例５に記載した通りであった。
【０１９９】 ヒトＦＧＦ−４遺伝子を、カポジ肉腫ＤＮＡ形質転換ＮＩＨ３Ｔ３細胞のｍＲ
ＮＡから構築されたｃＤＮＡライブラリから単離した。このＦＧＦ−４ ｃＤＮ
Ａは、長さが約１．２ｋｂであり、そしてＮ−末端に３０アミノ酸シグナルペプ
チドを含む２０６アミノ酸のポリペプチドをコードする（Ｄｅｌｌ Ｂｏｖｉら
、Ｃｅｌｌ ５０：７２９−７３７，１９８７；Ｂｅｌｌｏｓｔａら、Ｊ．Ｃｅ
ｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２１：７０５−７１３，１９９３）。本発明者らは、本質的
に全長が１．２ｋｂのＥｃｏＲ１フラグメントとしてのＦＧＦ−４ ｃＤＮＡを
、アデノウイルスベクターｐＡＣＣＭＶｐＬｐＡＳＲ（単純化のため、ｐＡＣＳ
Ｒとする）中のＥｃｏＲ１部位にサブクローニングした。５’開始部位は、２４
３塩基対に存在し、そして３’末端は、８６３塩基対に存在した。ＦＧＦ−４を
コードする組換えアデノウイルス（本明細書中では、Ａｄ．ＦＧＦ−４とも呼ぶ
）を、ＦＧＦ−５アデノウイルスを作製するための実施例２に記載の通りに作製
した。
【０２００】 心臓組織におけるＦＧＦ−４の発現（ならびに肝臓、骨格筋、および眼を含む
他の組織における発現の欠失）を、検出のための抗ＦＧＦ−４抗体を用いるウエ
スタン−ブロット分析により確認した。インビトロでの内皮細胞の増殖に対する
ＦＧＦ−４の分裂促進効果もまた試験した。
【０２０１】 アメロイド（ａｍｅｒｏｉｄ）配置の４５日後、動物を、ストレスにより誘導
された局所的機能および血流を規定するための研究に供し、次いで、この動物は
、冠状動脈内注入により送達された、ＦＧＦ−４を発現する組換えアデノウイル
スを受容した（ｎ＝６動物）。１３日後、ストレスにより誘導された局所的機能
および血流を規定するための研究を繰り返した。翌日、動物を殺し、そして組織
を採集した。
【０２０２】 （導入遺伝子の送達） ＦＧＦ−５の場合と同様に、内因性の脈管形成が静止しそして誘導性心筋虚血
（患者における狭心症と同義）が現れた後に、遺伝子導入を実行した。導入遺伝
子の冠状動脈内送達のために、動物を麻酔し、そして５Ｆ動脈シースを頸動脈内
に配置した。５Ｆ多目的冠状動脈カテーテルを、シースを通して冠状動脈内に挿
入した。全ての動物において、左主冠状動脈への造影剤注入により、アメロイド
の閉鎖を確認した。次いで、カテーテル先端を、動脈管腔内１ｃｍに配置し、注
入の間に最少の物質が近位の大動脈へと損失するようにした。ＦＧＦ−４を発現
する組換えアデノウイルスの１．５×１０12ウイルス粒子を含む５ｍｌを、３．
０ｍｌを左冠状動脈に、そして２．０ｍｌを右冠状動脈にゆっくりと注入するこ
とにより、送達した。
【０２０３】 （ＦＧＦ−４導入遺伝子を用いた結果） （局所的機能および灌流） アメロイド配置の４５日後、動物は、心房律調の間に壁肥厚の減損を示した。
対照的に、ＦＧＦ−４遺伝子導入の２週間後、律調の間に、虚血領域内の壁肥厚
が２．７倍増加した（ｐ＜０．０００１、図１１および１２）。正常に灌流した
領域（心室中隔）における壁肥厚は、律調の間に正常であり、そして遺伝子導入
により影響を受けなかった。ＦＧＦ−４遺伝子導入後の機能の改善は、ＦＧＦ−
５またはＦＧＦ−２ＬＩ＋シグナルペプチド（「ｓｐ」）を用いて遺伝子導入し
た後に得られた改善とは、統計的に識別不可能であった（図１１）。虚血領域に
おける改善された機能は、改善された局所的灌流に関連した（図１２）。図１２
に示されるように、ＦＧＦ−４遺伝子導入の前に、律調の間に虚血領域における
血流欠乏が存在した。ＦＧＦ−４を用いた遺伝子導入の２週間後、均一なコント
ラスト増強が２つの領域で観察された。これは虚血領域における改善された血流
を示している（ｐ＝０．０００１）。ＦＧＦ−４を用いた結果は、ＦＧＦ−５お
よびＦＧＦ−２ＬＩ＋ｓｐを用いて得られた結果とは、統計的に識別不可能であ
った（図１３）。ＦＧＦ−２ＬＩ＋ｓｐは、実施例７に記載され、これはシグナ
ル配列を含むＦＧＦ−２を意味する。
【０２０４】 （導入遺伝子発現） 心臓におけるＦＧＦ−４の独占的な発現は、この導入遺伝子をコードする配列
に特異的なプライマーを用いるＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲを実行することにより
確認した。ＦＧＦ−４ ＤＮＡおよびｍＲＮＡは、心臓では見出されたが、眼、
肝臓、および骨格筋には見出されなかった。これらのデータは、Ａｄ．ＦＧＦ−
５（ｎ＝２）およびＡｄ．ＦＧＦ−２ＬＩ＋ｓｐ（ｎ＝１）を用いて導出された
データを確認する。したがって、心臓におけるこの導入遺伝子の独占的な発現は
、異なる脈管形成タンパク質をコードする遺伝子を含むアデノウイルスベクター
を受容した全ての４匹の動物において確認された。
【０２０５】 （心筋炎症の非存在） Ａｄ．ＦＧＦ−４を受容した３匹の連続的な（ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ）動物
からの経壁心筋生検を検査した。動物を、遺伝子導入の２週間後に屠殺した。ア
デノウイルスを受容しなかったコントロールのアメロイド動物と比較して、これ
らの切片には炎症細胞の浸潤、壊死、または線維症の増加の証拠は存在しなかっ
た。このことは、ＬＡＤおよびＬＣｘ床の両方において真実であった。これらの
スライドは、盲検サンプル評価をなした病理学者により再検討され、そしていか
なる切片においても心筋炎の証拠は存在しないことがコメントされた。
【０２０６】 （実施例７：ＦＧＦ−２ムテインを使用する遺伝子媒介性脈管形成） この実験例は、第３の脈管形成タンパク質コード遺伝子、ＦＧＦ−２を使用す
る、首尾良い遺伝子治療を実証した。この実験はまた、どのように脈管形成タン
パク質を改変して分泌を増加させ得、かつ心臓内の血流量および心機能を増強す
る脈管形成遺伝子治療の効力を潜在的に改善し得るかを実証する。ヒトＦＧＦ−
２遺伝子治療のために使用されるプロトコールは、上記のＦＧＦ−５およびＦＧ
Ｆ−４について使用されるものと実質的に同一である。
【０２０７】 酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ、ＦＧＦ−１）および塩基性ＦＧＦ（ＦＧＦ−２）は天
然の分泌シグナル配列を欠くが、いくらかのタンパク質分泌が生じ得る。代わり
の分泌経路（ゴルジ体を含まない）は、酸性ＦＧＦについて記載されている。２
つのＦＧＦ−２構築物（ＦＧＦ−２ＬＩ＋ｓｐおよびＦＧＦ−２ＬＩ−ｓｐ）が
作成された；追加のシグナルペプチドを有さない同一のタンパク質を超える、追
加のシグナルペプチドを有するＦＧＦ−２の改善された効力について試験するた
めに、１つは、古典的タンパク質分泌経路のためのシグナルペプチドをコードす
る配列を有し（ＦＧＦ−２ＬＩ＋ｓｐ）、そして１つはシグナルペプチドコード
配列を有さない（ＦＧＦ−２ＬＩ−ｓｐ）。
【０２０８】 以下に示されるように、ＦＧＦ−２は５残基のループ構造を有し、これは残基
１１８から残基１２２まで伸びる。ＦＧＦ−２ＬＩループ置換変異体を生成する
ためにこのループ構造はカセット指向変異誘発によりインターロイキン１β由来
の対応する５残基ループと置換される。簡単には、ヒトＧｌｕ3,5ＦＧＦ−２を
コードする遺伝子（Ｓｅｄｄｏｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６３
８：９８−１０８、１９９１）をＴ７発現ベクターｐＥＴ−３ａ（Ｍ１３）（ｐ
ＥＴ−３ａの誘導体（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｇｅｎｅ ５６：１２５−１３５
、１９８７））に、制限部位ＮｄｅｌおよびＢａｍＨＩの間に、クローニングし
た。独特の制限エンドヌクレアーゼ部位である、ＢｓｔＢＩおよびＳｐｌＩを、
コードされているアミノ酸には変化を生じないような方法（すなわち、サイレン
ト変異）で、ＦＧＦ−２のセグメントＳｅｒ１１７−Ｔｒｐ１２３をコードする
コドンに隣接する位置で、遺伝子中に導入した。 ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２およびＩＬ−１β中のβ９−β１０ループの構造型整列 1
【０２０９】
【化１】 1ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２についての番号付けは、１５５残基形態をコード
するｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸残基１からであり（Ｓｅｄｄｏｎら、
Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６３８：９８−１０８、１９９１）、そし
てＩＬ−１βの番号付けは成熟１５３残基ポリペプチドの残基１からである（同
上）。
【０２１０】 ＦＧＦ−２の残基Ａｒｇ１１８−Ｌｙｓ１１９−Ｔｙｒ１２０−Ｔｈｒ１２１
−Ｓｅｒ１２２の、構造的アナログＩＬ−１βの対応するループ由来のヒト配列
Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ（１１５−１１９）での置換は、本質
的に以下のように行われた： プラスミドＤＮＡ、ｐＥＴ−３ａ（Ｍ１３）をＢｓｔＢ１およびＳｐｌ１消化
に供し、そして得られた大きい方のＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳
動を使用して単離した。ＤＮＡフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用し
て、以下の２つの合成オリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより得られ
た二本鎖ＤＮＡと連結した：５’’−ＣＧＡＡＣＧＡＴＴＧ ＧＡＡＴＣＴＡＡ
ＴＡ ＡＣＴＡＣＡＡＴＡＣ ＧＴＡＣＣＧＧＴＣＴ ＧＣＧＣＡＧＴＴＴＣ
ＣＴＡＡＣＴＧＧＴＡ ＴＧＴＧＧＣＡＣＴＴ ＡＡＧＣ−３’（配列番号９）
および５’−ＧＴＡＣＧＣＴＴＡＡ ＧＴＧＣＣＡＣＡＴＡ ＣＣＡＧＴＴＡＧ
ＧＡ ＡＡＣＴＧＣＧＣＡＧ ＡＣＣＧＧＴＡＣＧＴ ＡＴＴＧＴＡＧＴＴＡ
ＴＴＡＧＡＴＴＣＣＡ ＡＴＣＧＴＴ−３’（配列番号１０）、これらはＢｓｔ
Ｂ１およびＳｐｌ１消化により生成される末端と適合性である末端を含む。ライ
ゲーション産物を使用してＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＤＨ５α株）細
胞へと導入する。所望の変異体プラスミド（ＦＧＦ−２ＬＩ）を、新規に導入し
たＡｆｌ２制限部位（上記の下線部分）での切断に対する感受性に基づき選択し
た。
【０２１１】 シグナルペプチドを有するおよび有さないＦＧＦ−２ＬＩを、ポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法を使用することにより構築した。ＦＧＦ−４シグ
ナルペプチド配列を、ＦＧＦ−２ＬＩの５’へ添加するため、そしてシグナルペ
プチドがＦＧＦ−２ＬＩタンパク質から切断されることを確実にするために、Ｆ
ｏｒｏｕｇｈ Ｒ．らにより使用される遺伝子カセットを分泌ＦＧＦ−１を得る
ために使用した。ＦＧＦ−４シグナルペプチドの５’部分と一致するプライマー
（ｐＦ１Ｂ：５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣ ＣＣＡＴＧＧＣＧＧＧ ＧＣＣＣＧ
ＧＧＡＣＧ ＧＣ−３’）（配列番号１１）、およびＦＧＦ−１の５’部分に対
する第２のプライマー（ｐＦ２Ｒ：５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＧ ＴＧＡＡＧＧ
ＴＧＧＴ ＧＡＴＴＴＣＣＣ−３’）（配列番号１２）を使用して、本発明者ら
は、ＰＣＲにより、ＦＧＦ−４シグナルペプチド配列の５’末端にＢａｍＨＩ部
位を、続いて３’末端にＦＧＦ−１の最初の１０アミノ酸およびＥｃｏＲＩ部位
を含むＤＮＡフラグメントを合成した。それぞれ、ＦＧＦ−２ＬＩの５’および
３’の配列に一致する、別の一対のプライマー（ｐＦ３Ｒ：５’−ＣＧＧＡＡＴ
ＴＣＡＴ ＧＧＣＴＧＡＡＧＧＧ ＧＡＡＡＴＣＡＣＣ−３’（配列番号１３）
およびｐＦ４ＨＡ：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴ ＡＧＧＣＧＴＡＧＴＣ ＴＧ
ＧＧＡＣＧＴＣＧ ＴＡＴＧＧＧＴＡＧＣ ＴＣＴＴＡＧＣＡＧＡ ＣＡＴＴＧ
ＧＡＡＧＡ ＡＡＡＡＧ−３’（配列番号１４））を使用して、本発明者らは第
２のＤＮＡフラグメントを得た。これは５’末端にＥｃｏＲＩ部位を、そしてイ
ンフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タグおよびＸｂａＩ部位をＦＧＦ−２ＬＩの
３’末端に有する。次いで、これらの２つのフラグメントを、３つの分子のライ
ゲーションによりＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ部位で、ｐｃＤＮＡ３ベクターへと
サブクローニングした。プラスミドｐＦＧＦ−２ＬＩ／ｃＤＮＡ３（これはシグ
ナルペプチドを有さないことを除いて、ｐＳＰＦＧＦ−２ＬＩ／ｃＤＮＡ３と類
似する）を類似の様式においてサブクローニングした。次いで、両方のプラスミ
ドを配列決定して挿入の修正（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）を確認した。次いで、両
方のＦＧＦ−２ＬＩフラグメントをＢａｍＨＩおよびＸｂａＩでの消化によって
ｐｃＤＮＡ３から遊離させ、そしてｐＡＣＣＭＶｐＬｐＡＳＲ（＋）（単純にす
るためｐＡＣＳＲ）（これは組換えウイルスを作成するためのシャトルベクター
である）にサブクローニングした。組換えウイルスおよび注射用ベクターを、本
質的には実施例２に記載されるように調製した。遺伝子導入を、実施例５に記載
のように行った（ＦＧＦ−２ＬＩｓｐ＋について８匹の動物、そしてＦＧＦ−２
ＬＩｓｐ−について６匹の動物を使用し、ｌａｃＺベクターをコントロールとし
て供し、全て１０11〜１０12ウイルス粒子を有する）。
【０２１２】 （ＦＧＦ−２ムテインを使用する結果） ＦＧＦ−２ＬＩ＋ｓｐでの遺伝子導入の２週間後、２００ｂｐｍでの律調スト
レスの間のピークコントラスト比（ＬＣｘ／ＬＶ）は、遺伝子導入前と比較して
有意に改善された。図１３は、比較のために、ｌａｃＺ、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−
２ＬＩ＋ｓｐ、ＦＧＦ−２ＬＩ−ｓｐおよびＦＧＦ−４を発現する組換えアデノ
ウイルスの冠状動脈内遺伝子導入を使用した結果を示す。図１３中の右側の黒い
棒グラフは、この方法を使用した場合の正常な流量比を示す。ＦＧＦ−２ＬＩ＋
ｓｐは、これらの動物におけるピークコントラスト流量比を正規化する。
【０２１３】 壁肥厚の割合もまた、ＦＧＦ−２ＬＩ＋ｓｐを発現する組換えアデノウイルス
の冠状動脈内送達の２週間後には改善された。図１１は、比較のためにｌａｃＺ
、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−２ＬＩ＋ｓｐ、ＦＧＦ−２ＬＩ−ｓｐおよびＦＧＦ−４
を発現する組換えアデノウイルスの冠状動脈内遺伝子導入を使用した結果を示す
。図１１の右側の黒い棒グラフは、律調誘導性ストレス前の、正常な割合の壁肥
厚を示す。ＦＧＦ−２ＬＩ＋ｓｐにより局所機能は、ＦＧＦ−５と統計的に区別
不可能な程度まで改善された。ＦＧＦ−２ＬＩ−ｓｐでの遺伝子導入の後に認識
される、いくらかの改善は存在するが、導入遺伝子を含むシグナルペプチドでの
改善の方が優れていた（図１３）。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、うっ血性心不全のブタモデルにおける律調の期間における、壁の肥厚
化のパーセントをグラフに示す。壁の肥厚化のパーセントは、心不全が進行した
場合、律調前（０日）および７日ごとに、心室中隔および側壁において、連続的
に評価した（実施例１に記載）。記号は、平均値を示す；エラーバーは、標準偏
差（１ＳＤ）を示す。Ｔｗｏ−Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ（測定の反復）によって、壁
の肥厚化のパーセントが律調の期間（Ｐ＜０．００１）および領域（Ｐ＝０．０
０１）によって影響を及ぼされることが示された。さらに、壁の肥厚化における
変化のパターンは、２つの領域の間では差異があった（Ｐ＜０．０００１）。各
時点における壁の肥厚化のパーセントについての平均値を、ｈｏｃ後の２つの領
域の間の差異についてＴｕｋｅｙ法によって検定した；これらの分析についての
Ｐ値を、エラーバーの下に示した。
【図２】 図２Ａおよび２Ｂは、実施例１に記載のように、うっ血性心不全のブタモデル
における律調の期間の心内膜下血流をグラフに示す。図２Ａについては、心室中
隔および側壁における心内膜下（内）血流を、Ｘ軸に沿って列挙された条件下で
連続的に評価した。日数は、測定値が得られた律調の持続した日数をいう（０日
、律調開始日；１４、１４日；２１−２８、２１〜２８日）。ＰＡＣＥとは、血
流の測定が作動（＋）または停止（０）したペースメーカーで得られたかどうか
をいう。ペースメーカーの速度は、２２５ｂｐｍであった（数値については本明
細書中の表３を参照のこと）。記号は、平均値を表す；エラーバーは、１ＳＤを
示す。 Ｔｗｏ−Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ（測定の反復）によって、心内膜下血流が
律調の期間（Ｐ＝０．０００１）および領域（Ｐ＝０．０１７）によって影響を
及ぼされたことが示された。さらに、心内膜下血流における変化のパターンは、
２つの領域の間で異なった（Ｐ＜０．００６）。各時点における心内膜下血流に
ついての平均値を、ｈｏｃ後の２つの領域の間での差異についてＴｕｒｋｅｙ分
析によって検定した；これらの分析についてのＰ値を、エラーバーの下に示す。
図２Ｂについては、心室中隔および側壁における１心拍あたりの心内膜下血流を
、Ｘ軸に沿って列挙された条件下で、連続的に評価した。記号および条件は、図
２Ａと同じである（数値については、本明細書中の表４を参照のこと）。 Ｔｗ
ｏ−Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ（測定の反復）によって、１心拍あたりの心内膜下血流
が、律調の期間（Ｐ＜０．０００１）および領域（Ｐ＝０．０１９８）によって
影響されることが示された。
【図３】 図３Ａは、心不全が進行した場合、律調前（０日）および７日ごとに心室中隔
および側壁において連続的に評価した際の経線（ｍｅｒｉｄｉｏｎａｌ）収縮末
期壁負荷をグラフに示す（実施例１に記載）。Ｔｗｏ−Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ（測
定の反復）によって、収縮の壁負荷が、律調の持続時間によって影響を及ぼされ
たことが示された（Ｐ＜０．０００１）。しかし、収縮の壁負荷のパターンは、
両方の領域において類似した。測定を停止したペースメーカーを使用して行った
。図３Ｂは、実施例１に記載のように、うっ血性心不全のブタモデルにおいて律
調期間中の冠状脈管耐性をグラフに示す。冠状脈管耐性の指標を、Ｘ軸に列挙さ
れる条件下で、心室中隔および側壁において連続的に評価した。記号および条件
は、図２と同じである。 Ｔｗｏ−Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ（測定の反復）によって
、冠状脈管耐性の指標が律調の期間（Ｐ＝０．０００１）および領域（Ｐ＝０．
０１３）によって影響を及ぼされたことが示された。さらに、冠状脈管耐性にお
ける変化のパターンは、２つの領域の間で差異があった（Ｐ＝０．００１２）。
各時点での冠状脈管耐性についての平均値を、ｈｏｃ後の２つの領域の間の差異
について、Ｔｕｋｅｙ分析によって検定した。この分析によって、冠状脈管耐性
は、律調開始直後で中隔における耐性よりも側壁における耐性のほうがより高い
ことを示した（Ｐ値をエラーバーの下に示す）。
【図４】 図４は、以下の実施例に記載のように、細胞および心臓への遺伝子導入に有用
な、例示的な複製欠損組換えアデノウイルスベクターの構築の模式図を示す。
【図５】 図５は、導入遺伝子コードアデノウイルスの組換え構築のレスキューを示す模
式図である。
【図６】 図６Ａおよび６Ｂは、実施例５に記載のように、処置動物の局所的収縮機能を
グラフに示す。図６Ａは、遺伝子導入の２週間後に試験した動物の結果を示す。
そして図６Ｂは、遺伝子導入の１２週間後の結果を示す。
【図７】 図７Ａ、７Ｂ、および７Ｃは、心筋のコントラスト超音波心臓検査に対応する
ダイアグラムを示す。白色領域はコントラスト増強（より多い血流）を示し、そ
して濃い領域は血流の減少を示す。図７Ａは、正常ブタにおける急性ＬＣｘ閉塞
を示す。図７Ｂは、ｌａｃＺを用いた遺伝子導入の１４日後のＩＶＳとＬＣｘ床
（ｂｅｄ）との間のコントラスト増強における差異を示す。これは、心房律調（
２００ｂｐｍ）の期間の２つの領域における異なる血流を示す。図７Ｃにおいて
、コントラスト増強は、ＦＧＦ−５を用いた遺伝子導入の１４日後のＩＶＳおよ
びＬＣｘ床が等価であるように思われる。このことは、心房律調期間に、２つの
領域において血流が類似したことを示す。これらの結果は、実施例５に記載され
る。
【図８】 図８は、心室中隔（ＩＶＳ）におけるピーク画像強度によって分けられる虚血
性領域（ＬＣｘ床）におけるピーク画像強度の割合として表されるピークコント
ラスト割合（血流との相関性）を示す。これは、５匹の動物においてｌａｃＺ（
コントロール遺伝子）を用いた遺伝子導入およびＦＧＦ−５を用いた遺伝子導入
の前およびその１４±１日後ならびにＦＧＦ−５遺伝子導入の１２週間後の、心
房律調（２００ｂｐｍ）の期間のコンピューターベースの画像分析プログラムを
使用して画像イメージから測定した（実施例５に記載）。虚血性床への血流は、
コントロール遺伝子を用いた遺伝子導入後に正常の５０％が残存したが、ＦＧＦ
−５を用いた遺伝子導入後には、正常の２倍を越えて増加した（Ｐ＝０．００１
８）。この効果は、少なくとも１２週間持続した。
【図９】 図９は、ＦＧＦ−５を用いた遺伝子導入およびｌａｃＺを用いた遺伝子導入後
の虚血性領域および非虚血性領域における顕微鏡分析によって定量されるような
脈管数を示す（実施例５に記載）。ｌａｃＺ遺伝子を受けた動物と比較して、Ｆ
ＧＦ−５遺伝子導入を受けた動物（Ｐ＜０．０３８）の虚血性領域および非虚血
性領域における各線維を取り囲む毛管数が増加した。
【図１０Ａ】 図１０Ａは、（実施例５に記載のように）本発明に従って心筋へ脈管形成導入
遺伝子の遺伝子導入した後のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびタンパク質発現を証明す
るゲルに由来する。
【図１０Ｂ】 １０Ｂは、（実施例５に記載のように）本発明に従って心筋へ脈管形成導入遺
伝子の遺伝子導入した後のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびタンパク質発現を証明する
ゲルに由来する。
【図１０Ｃ】 １０Ｃは、（実施例５に記載のように）本発明に従って心筋へ脈管形成導入遺
伝子の遺伝子導入した後のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびタンパク質発現を証明する
ゲルに由来する。
【図１０Ｄ】 図１０Ｄは、処置動物の網膜、肝臓、または骨格筋への任意の検出可能な遺伝
子導入が全くないことを証明するＰＣＲ増幅後のゲルに由来する（実施例５に記
載）。
【図１１】 図１１は、実施例６および７に記載されるように、異なる脈管形成遺伝子構築
物、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、およびＦＧＦ−２Ｌ１＋／−ｓｐ（すなわち、Ｆ
ＧＦ−２Ｌ１プラスまたはマイナス分泌シグナルペプチド）を使用してインビボ
での遺伝子導入で達成された壁の肥厚化の比較を示す。
【図１２】 図１２は、（壁の肥厚化に示されるように）ＦＧＦ−４遺伝子導入後の虚血性
領域における機能の改善が、領域性灌流の改善に関連したことを示す。
【図１３】 図１３は、実施例６および７に記載されるように、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、
またはＦＧＦ−２Ｌ１＋／−ｓｐ（＝ＦＧＦ−２Ｌ１プラスまたはマイナスシグ
ナルペプチド）の注入からもたらされる灌流（血流）の比較を示す。
【図１４】 図１４は、実施例７に記載されるように、ＦＧＦ−２プラス（ＦＧＦ−２Ｌ１
＋ｓｐ）またはＦＧＦ−２Ｌ１マイナス分泌シグナルペプチド（ＦＧＦ−２Ｌ１
−ｓｐ）を用いる遺伝子導入の結果としての壁の肥厚化の比較を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/27 Ａ６１Ｐ 9/10 45/00 １０１ Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｋ 37/24 9/10 37/36 １０１ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ジョルダノ， フランク ジェイ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 92014， デル マー， カミニト マー ビラ 13119 (72)発明者 ディルマン， ウォルフガング エイチ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 92075， ソラナ ビーチ， エス． ナード ア ベニュー 335 Ｆターム(参考） 4C084 AA01 AA02 AA13 AA16 BA01 DB52 DB54 DB55 DB57 DB58 DC50 MA02 MA65 NA05 NA13 ZA362 ZA452 4C086 AA01 AA02 BC38 MA02 MA05 MA65 NA05 ZA36 ZA45 4C087 AA01 AA02 BC83 MA02 MA65 NA13 ZA36 ZA45

Claims (156)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 患者の心臓における収縮機能を増強させる方法であって、該
    方法は、少なくとも１つの冠状動脈へ導入遺伝子を含むベクターを導入すること
    により、該患者の心筋層へ脈管形成タンパク質またはペプチドをコードする遺伝
    子を送達する工程を包含し、ここで、該導入遺伝子は、該心筋層へ送達されそし
    て発現され、そして該心臓における収縮機能が増強される、方法。
  2. 【請求項２】 前記ベクターが、１以上の冠状動脈の管腔へ通じるカテーテ
    ルから導入される、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記前記ベクターが、前記カテーテルの先端部から注射され
    る、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記ベクターの導入が、前記心筋層へ血液を供給する少なく
    とも２つの前記冠状動脈の管腔へ該ベクターを注射する工程を包含する、請求項
    １に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記ベクターが、少なくとも１つの右冠状動脈および少なく
    とも１つの左冠状動脈へ導入される、請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記ベクターが、前記動脈の管腔へ少なくとも約１ｃｍ通さ
    れたカテーテルからの注射により導入される、請求項３に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記ベクターが、少なくとも１つの右冠状動脈および少なく
    とも１つの左冠状動脈へ導入される、請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記ベクターがまた、心筋層へ血液を供給する伏在静脈移植
    片および／または内胸動脈移植片へ導入される、請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記ベクターが、前記心筋層から血液を受けているコンジッ
    トへ配置されたカテーテルからの逆行灌流により導入される、請求項１に記載の
    方法。
  10. 【請求項１０】 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１に記載
    の方法。
  11. 【請求項１１】 前記ベクターが、複製欠損ウイルスベクターである、請求
    項１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記ベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項
    １０に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記ベクターが、複製欠損アデノウイルスウイルスベクタ
    ーである、請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 約１０7〜約１０13のアデノウイルスベクター粒子がイン
    ビボで送達される、請求項１２に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 約１０9〜約１０12のアデノウイルスベクター粒子がイン
    ビボで送達される、請求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記導入遺伝子の発現が、前記ベクター中に含まれるＣＭ
    Ｖプロモーターにより駆動される、請求項１に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記導入遺伝子の発現が、前記ベクター中に含まれる組織
    特異的プロモーターにより駆動される、請求項１に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記導入遺伝子の発現が、前記ベクター中に含まれる心筋
    細胞特異的プロモーターにより駆動される、請求項１７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記心筋細胞特異的プロモーターが、心筋細胞特異的ミオ
    シン軽鎖プロモーターおよび心筋細胞特異的ミオシン重鎖プロモーターからなる
    群より選択される、請求項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記脈管形成タンパク質またはペプチドが、線維芽細胞増
    殖因子、血管内皮増殖因子、血小板由来増殖因子およびインスリン様増殖因子か
    らなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記脈管形成タンパク質またはペプチドが線維芽細胞増殖
    因子である、請求項１に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記脈管形成タンパク質またはペプチドが、ａＦＧＦ、ｂ
    ＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５およびＦＧＦ−６からなる群より選択される線
    維芽細胞増殖因子である、請求項２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記脈管形成タンパク質が血管内皮増殖因子である、請求
    項１に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記血管内皮増殖因子が、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂお
    よびＶＥＧＦ−Ｃからなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記脈管形成タンパク質またはペプチドがインスリン様増
    殖因子である、請求項１に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記脈管形成タンパク質またはペプチドが、インスリン様
    増殖因子１である、請求項２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記脈管形成タンパク質またはペプチドが、シグナルペプ
    チドを含む、請求項１に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記脈管形成タンパク質またはペプチドが、脈管形成ポリ
    ペプチド制御因子である、請求項１に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記ベクターが、脈管形成タンパク質またはペプチドをコ
    ードする第２の導入遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記ベクターが、少なくとも２つの脈管形成タンパク質ま
    たはペプチドをコードする単数または複数の導入遺伝子を含む、請求項１に記載
    の方法。
  31. 【請求項３１】 複数の前記脈管形成タンパク質またはペプチドが、線維芽
    細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、血小板由来増殖因子およびインスリン様増殖
    因子からなる群より各々独立して選択される、請求項３０に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 複数の前記脈管形成タンパク質またはペプチドが、線維芽
    細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、血小板由来増殖因子、インスリン様増殖因子
    、低酸素誘発因子および脈管形成ポリペプチド調節因子からなる群より各々独立
    して選択される、請求項３０に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 請求項３０に記載の方法であって、ここで第１の前記脈管
    形成タンパク質またはペプチドが、線維芽細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、血
    小板由来増殖因子、低酸素誘発因子、インスリン様増殖因子および脈管形成ポリ
    ペプチド調節因子からなる群より選択され、そしてここで、第２の該脈管形成タ
    ンパク質またはペプチドは、該群のうちの別のメンバーから選択される、方法。
  34. 【請求項３４】 第１の前記脈管形成タンパク質またはペプチドが線維芽細
    胞増殖因子であり、そして第２の該脈管形成タンパク質またはペプチドが血管内
    皮増殖因子である、請求項３０に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 第１の前記脈管形成タンパク質またはペプチドが線維芽細
    胞増殖因子または血管内皮増殖因子であり、そして第２の該脈管形成タンパク質
    またはペプチドがインスリン様増殖因子である、請求項３０に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記ベクターが、線維芽細胞増殖因子、血管内皮増殖因子
    およびインスリン様増殖因子をコードする導入遺伝子を含む、請求項３０に記載
    の方法。
  37. 【請求項３７】 前記ベクターが、強心性タンパク質またはペプチドをコー
    ドする導入遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 前記強心性タンパク質またはペプチドが、β−アドレナリ
    ン作用性シグナル伝達タンパク質またはペプチド（β−ＡＳＰ）である、請求項
    ３７に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記強心性タンパク質またはペプチドが、筋細胞の増殖ま
    たは機能を誘導し、これにより心臓における収縮機能を増強する、請求項３７に
    記載の方法。
  40. 【請求項４０】 前記脈管形成タンパク質またはペプチドが、心臓における
    側副血管発生を刺激し、これにより該心臓における血流を増強する、請求項１に
    記載の方法。
  41. 【請求項４１】 前記ベクターを使用する前記導入遺伝子の送達が、心臓へ
    主に局在化される、請求項１に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 前記ベクターが、心臓細胞を主にトランスフェクトする、
    請求項１に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 前記導入遺伝子の発現が、心筋層内で主に生じる、請求項
    １に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 前記導入遺伝子の発現が、心臓の筋細胞内で主に生じる、
    請求項４３に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 心臓における壁肥厚パーセントが増加する、請求項１に記
    載の方法。
  46. 【請求項４６】 少なくとも１つの冠状動脈にベクターを導入する工程が、
    血管作用因子を用いる該動脈の注入と同時またはその後に行なわれる、請求項１
    〜４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 【請求項４７】 前記血管作用因子が、前記ベクターの注射の少なくとも約
    ２分前に前記動脈へ注入される、請求項４６に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 前記血管作用因子が、ヒスタミンもしくはヒスタミンアゴ
    ニストまたは血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）タンパク質である、請求項４６に記
    載の方法。
  49. 【請求項４９】 前記血管作用因子が、ヒスタミンまたはヒスタミンアゴニ
    ストである、請求項４８に記載の方法。
  50. 【請求項５０】 前記血管作用因子が、約１〜７５マイクログラム／ｍｌの
    濃度のヒスタミンである、請求項４９に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 前記血管作用因子が、前記ベクターの注射の約３分前に約
    １ｍｌ／分の速度で前記動脈へ注入される、約２５マイクログラム／ｍｌの濃度
    のヒスタミンである、請求項５０に記載の方法。
  52. 【請求項５２】 前記患者が、心臓血管疾患を有する、請求項１に記載の方
    法。
  53. 【請求項５３】 前記患者が、アテローム性動脈硬化症を有する、請求項５
    ２に記載の方法。
  54. 【請求項５４】 前記患者が、心筋虚血を有する、請求項５２に記載の方法
    。
  55. 【請求項５５】 前記患者がヒトである、請求項１〜４５または５２〜５４
    のうちの１項に記載の方法。
  56. 【請求項５６】 心臓内の血流が増加される、請求項５５に記載の方法。
  57. 【請求項５７】 患者の虚血性組織中の血流を増加させるための方法であっ
    て、該方法は、該組織へ導入遺伝子を含むベクターを導入することにより、該組
    織の虚血性領域へ血管形成タンパク質またはペプチドをコードする該導入遺伝子
    を送達する工程を包含し、これにより、該導入遺伝子が該組織において発現され
    、そして該組織中の血流が増加される、方法。
  58. 【請求項５８】 前記ベクターが、前記組織へ血液を送達するコンジットへ
    配置されたカテーテルからの順方向灌流により組織へ導入される、請求項５７に
    記載の方法。
  59. 【請求項５９】 前記ベクターが、前記組織から血液を受けているコンジッ
    トへ配置されたカテーテルからの逆行灌流により組織へ導入される、請求項５７
    に記載の方法。
  60. 【請求項６０】 前記虚血性組織が、筋細胞を含み、そしてここで、該虚血
    性組織内の血流を増加させることが増強した収縮機能を引き起こす、請求項５７
    に記載の方法。
  61. 【請求項６１】 前記筋細胞が心臓の筋細胞である、請求項６０に記載の方
    法。
  62. 【請求項６２】 前記血管が、冠状動脈および大腿動脈からなる群より選択
    される、請求項５７に記載の方法。
  63. 【請求項６３】 請求項５７に記載の方法であって、ここで前記ベクターは
    、骨格筋へ該ベクターを含む溶液を注射することにより導入され、ここで前記脈
    管形成タンパク質またはペプチドは、血流の増加および前記組織における虚血の
    減少を引き起こす、方法。
  64. 【請求項６４】 前記溶液が、少なくとも約１ｍｌを含む、請求項６３に記
    載の方法。
  65. 【請求項６５】 前記患者が、心臓血管疾患を有する、請求項５７に記載の
    方法。
  66. 【請求項６６】 前記患者が、末梢血管疾患を有する、請求項６５に記載の
    方法。
  67. 【請求項６７】 前記ベクターが、１以上の冠状動脈の管腔へ通されたカテ
    ーテルから導入される、請求項５７に記載の方法。
  68. 【請求項６８】 前記ベクターの導入が、前記心筋層へ血液を供給する少な
    くとも２つの冠状動脈の管腔へ、該ベクターを注射する工程を包含する、請求項
    ５７に記載の方法。
  69. 【請求項６９】 前記ベクターが、少なくとも１つの右冠状動脈および少な
    くとも１つの左冠状動脈へ導入される、請求項６８に記載の方法。
  70. 【請求項７０】 前記ベクターが、前記動脈の管腔へ少なくとも約１ｃｍ通
    されたカテーテルからの注射により導入される、請求項６８に記載の方法。
  71. 【請求項７１】 前記ベクターが、少なくとも１つの右冠状動脈および少な
    くとも１つの左冠状動脈へ導入される、請求項７０に記載の方法。
  72. 【請求項７２】 前記ベクターがまた、心筋層へ血液を供給する伏在静脈移
    植片および／または内胸動脈移植片へ導入される、請求項６６に記載の方法。
  73. 【請求項７３】 前記ベクターが、前記心筋層から血液を受けているコンジ
    ットへ配置されたカテーテルからの逆行灌流により導入される、請求項５７に記
    載の方法。
  74. 【請求項７４】 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項５７に記
    載の方法。
  75. 【請求項７５】 前記ベクターが、複製欠損ウイルスベクターである、請求
    項７４に記載の方法。
  76. 【請求項７６】 前記ベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項
    ７４に記載の方法。
  77. 【請求項７７】 前記ベクターが、複製欠損アデノウイルスウイルスベクタ
    ーである、請求項７６に記載の方法。
  78. 【請求項７８】 約１０7〜約１０13のアデノウイルスベクター粒子がイン
    ビボで送達される、請求項７６に記載の方法。
  79. 【請求項７９】 約１０9〜約１０12のアデノウイルスベクター粒子がイン
    ビボで送達される、請求項７８に記載の方法。
  80. 【請求項８０】 前記導入遺伝子の発現が、前記ベクター中に含まれるＣＭ
    Ｖプロモーターにより駆動される、請求項５７に記載の方法。
  81. 【請求項８１】 前記導入遺伝子の発現が、前記ベクター中に含まれる組織
    特異的プロモーターにより駆動される、請求項５７に記載の方法。
  82. 【請求項８２】 前記導入遺伝子の発現が、前記ベクター中に含まれる心筋
    細胞特異的プロモーターにより駆動される、請求項８１に記載の方法。
  83. 【請求項８３】 前記心筋細胞特異的プロモーターが、心筋細胞特異的ミオ
    シン軽鎖プロモーターおよび心筋細胞特異的ミオシン重鎖プロモーターからなる
    群より選択される、請求項８２に記載の方法。
  84. 【請求項８４】 前記脈管形成タンパク質またはペプチドが、線維芽細胞増
    殖因子、血管内皮増殖因子、血小板由来増殖因子およびインスリン様増殖因子か
    らなる群より選択される、請求項５７に記載の方法。
  85. 【請求項８５】 前記脈管形成タンパク質またはペプチドが線維芽細胞増殖
    因子である、請求項５７に記載の方法。
  86. 【請求項８６】 前記脈管形成タンパク質またはペプチドが、ａＦＧＦ、ｂ
    ＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５およびＦＧＦ−６からなる群より選択される線
    維芽細胞増殖因子である、請求項８５に記載の方法。
  87. 【請求項８７】 前記脈管形成タンパク質が血管内皮増殖因子である、請求
    項５７に記載の方法。
  88. 【請求項８８】 前記血管内皮増殖因子が、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂお
    よびＶＥＧＦ−Ｃからなる群より選択される、請求項８７に記載の方法。
  89. 【請求項８９】 前記脈管形成タンパク質またはペプチドがインスリン様増
    殖因子である、請求項５７に記載の方法。
  90. 【請求項９０】 前記脈管形成タンパク質またはペプチドが、インスリン様
    増殖因子１である、請求項８９に記載の方法。
  91. 【請求項９１】 前記脈管形成タンパク質またはペプチドが、シグナルペプ
    チドを含む、請求項５７に記載の方法。
  92. 【請求項９２】 前記脈管形成タンパク質またはペプチドが、脈管形成ポリ
    ペプチド調節因子である、請求項５７に記載の方法。
  93. 【請求項９３】 前記ベクターが、脈管形成タンパク質またはペプチドをコ
    ードする第２の導入遺伝子をさらに含む、請求項５７に記載の方法。
  94. 【請求項９４】 前記ベクターが、少なくとも２つの脈管形成タンパク質ま
    たはペプチドをコードする単数または複数の導入遺伝子を含む、請求項５７に記
    載の方法。
  95. 【請求項９５】 複数の前記脈管形成タンパク質またはペプチドが、線維芽
    細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、血小板由来増殖因子およびインスリン様増殖
    因子からなる群より各々独立して選択される、請求項９４に記載の方法。
  96. 【請求項９６】 複数の前記脈管形成タンパク質またはペプチドが、線維芽
    細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、血小板由来増殖因子、インスリン様増殖因子
    、低酸素誘発因子および脈管形成ポリペプチド調節因子からなる群より各々独立
    して選択される、請求項９４に記載の方法。
  97. 【請求項９７】 請求項９４に記載の方法であって、ここで第１の前記脈管
    形成タンパク質またはペプチドが、線維芽細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、血
    小板由来増殖因子、低酸素誘発因子、インスリン様増殖因子および脈管形成ポリ
    ペプチド調節因子からなる群より選択され、そしてここで、第２の該脈管形成タ
    ンパク質またはペプチドは、該群のうちの別のメンバーから選択される、方法。
  98. 【請求項９８】 第１の前記脈管形成タンパク質またはペプチドが線維芽細
    胞増殖因子であり、そして第２の該脈管形成タンパク質またはペプチドが血管内
    皮増殖因子である、請求項９４に記載の方法。
  99. 【請求項９９】 第１の前記脈管形成タンパク質またはペプチドが線維芽細
    胞増殖因子または血管内皮増殖因子であり、そして第２の該脈管形成タンパク質
    またはペプチドがインスリン様増殖因子である、請求項９４に記載の方法。
  100. 【請求項１００】 前記ベクターが、線維芽細胞増殖因子、血管内皮増殖因
    子およびインスリン様増殖因子をコードする導入遺伝子を含む、請求項９４に記
    載の方法。
  101. 【請求項１０１】 前記ベクターが、強心性タンパク質またはペプチドをコ
    ードする導入遺伝子をさらに含む、請求項５７に記載の方法。
  102. 【請求項１０２】 前記強心性タンパク質またはペプチドが、β−アドレナ
    リン作用性シグナル伝達タンパク質またはペプチド（β−ＡＳＰ）である、請求
    項１０１に記載の方法。
  103. 【請求項１０３】 前記強心性タンパク質またはペプチドが、筋細胞の増殖
    または機能を誘導し、これにより心臓における収縮機能を増強する、請求項１０
    １に記載の方法。
  104. 【請求項１０４】 前記脈管形成タンパク質またはペプチドが、心臓におけ
    る側副血管発生を刺激し、これにより該心臓における血流を増強する、請求項５
    ７に記載の方法。
  105. 【請求項１０５】 前記ベクターを使用する前記導入遺伝子の送達が、心臓
    へ主に局在化される、請求項５７に記載の方法。
  106. 【請求項１０６】 前記ベクターが、心臓細胞を主にトランスフェクトする
    、請求項５７に記載の方法。
  107. 【請求項１０７】 前記導入遺伝子の発現が、心筋層内で主に生じる、請求
    項５７に記載の方法。
  108. 【請求項１０８】 前記導入遺伝子の発現が、心臓の筋細胞内で主に生じる
    、請求項１０７に記載の方法。
  109. 【請求項１０９】 心臓における壁肥厚パーセントが増加する、請求項５７
    に記載の方法。
  110. 【請求項１１０】 少なくとも１つの冠状動脈にベクターを導入する工程が
    、血管作用因子を用いる該動脈の注入と同時またはその後に行なわれる、請求項
    ５２〜５４または５７〜１０９のうちの１項に記載の方法。
  111. 【請求項１１１】 前記血管作用因子が、前記ベクターの注射の少なくとも
    約２分前に前記動脈へ注入される、請求項１１０に記載の方法。
  112. 【請求項１１２】 前記血管作用因子が、ヒスタミンもしくはヒスタミンア
    ゴニストまたは血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）タンパク質である、請求項１１０
    に記載の方法。
  113. 【請求項１１３】 前記血管作用因子が、ヒスタミンまたはヒスタミンアゴ
    ニストである、請求項１１２に記載の方法。
  114. 【請求項１１４】 前記血管作用因子が、約１〜７５マイクログラム／ｍｌ
    の濃度のヒスタミンである、請求項１１３に記載の方法。
  115. 【請求項１１５】 前記血管作用因子が、前記ベクターの注射の約３分前に
    約１ｍｌ／分の速度で前記動脈へ注入される、約２５マイクログラム／ｍｌの濃
    度のヒスタミンである、請求項１１４に記載の方法。
  116. 【請求項１１６】 前記患者が、心臓血管疾患を有する、請求項５７に記載
    の方法。
  117. 【請求項１１７】 前記患者が、アテローム性動脈硬化症を有する、請求項
    １１６に記載の方法。
  118. 【請求項１１８】 前記患者が、心筋虚血を有する、請求項１１６に記載の
    方法。
  119. 【請求項１１９】 前記患者がヒトである、請求項５７〜１０９または１１
    ６〜１１８のうちの１項に記載の方法。
  120. 【請求項１２０】 前記組織内の収縮機能が増強される、請求項１１９に記
    載の方法。
  121. 【請求項１２１】 脈管形成タンパク質またはペプチドをコードする導入遺
    伝子を含むベクターを含む、遺伝子治療組成物。
  122. 【請求項１２２】 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１２１
    に記載の組成物。
  123. 【請求項１２３】 前記ベクターが、複製欠損ウイルスベクターである、請
    求項１２２に記載の組成物。
  124. 【請求項１２４】 前記ベクターが、アデノウイルスベクターである、請求
    項１２２に記載の組成物。
  125. 【請求項１２５】 前記ベクターが、複製欠損アデノウイルスウイルスベク
    ターである、請求項１２４に記載の組成物。
  126. 【請求項１２６】 約１０7〜約１０13のアデノウイルスベクター粒子を含
    む、請求項１２４に記載の組成物。
  127. 【請求項１２７】 約１０9〜約１０12のアデノウイルスベクター粒子を含
    む、請求項１２６に記載の組成物。
  128. 【請求項１２８】 前記導入遺伝子の発現が、前記ベクター中に含まれるＣ
    ＭＶプロモーターにより駆動される、請求項１２１に記載の組成物。
  129. 【請求項１２９】 前記導入遺伝子の発現が、前記ベクター中に含まれる組
    織特異的プロモーターにより駆動される、請求項１２１に記載の組成物。
  130. 【請求項１３０】 前記導入遺伝子の発現が、前記ベクター中に含まれる心
    筋細胞特異的プロモーターにより駆動される、請求項１２９に記載の組成物。
  131. 【請求項１３１】 前記心筋細胞特異的プロモーターが、心筋細胞特異的ミ
    オシン軽鎖プロモーターおよび心筋細胞特異的ミオシン重鎖プロモーターからな
    る群より選択される、請求項１３０に記載の組成物。
  132. 【請求項１３２】 前記脈管形成タンパク質またはペプチドが、線維芽細胞
    増殖因子、血管内皮増殖因子、血小板由来増殖因子およびインスリン様増殖因子
    からなる群より選択される、請求項１２１に記載の組成物。
  133. 【請求項１３３】 前記脈管形成タンパク質またはペプチドが線維芽細胞増
    殖因子である、請求項１２１に記載の組成物。
  134. 【請求項１３４】 前記脈管形成タンパク質またはペプチドが、ａＦＧＦ、
    ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５およびＦＧＦ−６からなる群より選択される
    線維芽細胞増殖因子である、請求項１３３に記載の組成物。
  135. 【請求項１３５】 前記脈管形成タンパク質が血管内皮増殖因子である、請
    求項１２１に記載の組成物。
  136. 【請求項１３６】 前記血管内皮増殖因子が、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ
    およびＶＥＧＦ−Ｃからなる群より選択される、請求項１３５に記載の組成物。
  137. 【請求項１３７】 前記脈管形成タンパク質またはペプチドがインスリン様
    増殖因子である、請求項１２１に記載の組成物。
  138. 【請求項１３８】 前記脈管形成タンパク質またはペプチドが、インスリン
    様増殖因子１である、請求項１３７に記載の組成物。
  139. 【請求項１３９】 前記脈管形成タンパク質またはペプチドが、シグナルペ
    プチドを含む、請求項１２１に記載の組成物。
  140. 【請求項１４０】 前記脈管形成タンパク質またはペプチドが、脈管形成ポ
    リペプチド調節因子である、請求項１２１に記載の組成物。
  141. 【請求項１４１】 前記ベクターが、脈管形成タンパク質またはペプチドを
    コードする第２の導入遺伝子をさらに含む、請求項１２１に記載の組成物。
  142. 【請求項１４２】 前記ベクターが、少なくとも２つの脈管形成タンパク質
    またはペプチドをコードする単数または複数の導入遺伝子を含む、請求項１２１
    に記載の組成物。
  143. 【請求項１４３】 複数の前記脈管形成タンパク質またはペプチドが、線維
    芽細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、血小板由来増殖因子およびインスリン様増
    殖因子からなる群より各々独立して選択される、請求項１４２に記載の組成物。
  144. 【請求項１４４】 複数の前記脈管形成タンパク質またはペプチドが、線維
    芽細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、血小板由来増殖因子、インスリン様増殖因
    子、低酸素誘発因子および脈管形成ポリペプチド調節因子からなる群より各々独
    立して選択される、請求項１４２に記載の組成物。
  145. 【請求項１４５】 請求項１４２に記載の組成物であって、ここで第１の前
    記脈管形成タンパク質またはペプチドが、線維芽細胞増殖因子、血管内皮増殖因
    子、血小板由来増殖因子、低酸素誘発因子、インスリン様増殖因子および脈管形
    成ポリペプチド調節因子からなる群より選択され、そしてここで、第２の該脈管
    形成タンパク質またはペプチドは、該群のうちの別のメンバーから選択される、
    組成物。
  146. 【請求項１４６】 第１の前記脈管形成タンパク質またはペプチドが線維芽
    細胞増殖因子であり、そして第２の該脈管形成タンパク質またはペプチドが血管
    内皮増殖因子である、請求項１４２に記載の組成物。
  147. 【請求項１４７】 第１の前記脈管形成タンパク質またはペプチドが線維芽
    細胞増殖因子または血管内皮増殖因子であり、そして第２の該脈管形成タンパク
    質またはペプチドがインスリン様増殖因子である、請求項１４２に記載の組成物
    。
  148. 【請求項１４８】 前記ベクターが、線維芽細胞増殖因子、血管内皮増殖因
    子およびインスリン様増殖因子をコードする導入遺伝子を含む、請求項１４２に
    記載の組成物。
  149. 【請求項１４９】 前記ベクターが、強心性タンパク質またはペプチドをコ
    ードする導入遺伝子をさらに含む、請求項１２１に記載の組成物。
  150. 【請求項１５０】 前記強心性タンパク質またはペプチドが、β−アドレナ
    リン作用性シグナル伝達タンパク質またはペプチド（β−ＡＳＰ）である、請求
    項１４９に記載の組成物。
  151. 【請求項１５１】 薬学的賦形剤をさらに含む、請求項１２１に記載の組成
    物。
  152. 【請求項１５２】 請求項１２１〜１５１のうちの１項に記載の遺伝子治療
    組成物を含む、キット。
  153. 【請求項１５３】 前記組成物をインビボで血管または組織へ導入するため
    のデバイスをさらに備える、請求項１５２に記載のキット。
  154. 【請求項１５４】 前記デバイスがカテーテルである、請求項１５３に記載
    のキット。
  155. 【請求項１５５】 血管作用因子をさらに備える、請求項１５２に記載のキ
    ット。
  156. 【請求項１５６】 前記血管作用因子がヒスタミンである、請求項１５５に
    記載のキット。
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