EA008538B1

EA008538B1 - Способы и композиции для лечения сердечно-сосудистого заболевания доставкой генов in vivo

Info

Publication number: EA008538B1
Application number: EA200200533A
Authority: EA
Inventors: Х. Кирк Хэммонд; Франк Дж. Джиордано; Вольфганг Х. Диллманн
Original assignee: Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния
Priority date: 1999-11-05
Filing date: 2000-11-03
Publication date: 2007-06-29
Also published as: CN1433325A; EA200200533A1; HK1048593A1; JP2003513942A; AU784392B2; KR20020049031A; EP1225921A1; WO2001034208A1; NZ546670A; AU1460401A; CA2389524A1

Abstract

Обеспечены способы для лечения пациентов с сердечно-сосудистым заболеванием, в том числе заболеванием сердца и заболеванием периферических сосудов. Предпочтительные способы данного изобретения включают в себя доставку in vivo генов, кодирующих ангиогенные белки или пептиды, к миокарду или к периферической ишемической ткани введением вектора, содержащего такой ген, в кровеносный сосуд, снабжающий кровью сердце, или в периферическую ишемическую ткань.

Description

Заявление, касающееся финансируемого правительством исследования

Определенная часть описанного здесь исследования поддерживалась отчасти грантами от правительства Соединенных Штатов с номерами грантов УА-НЬ0281201, НЫ768218 и 1Р50НБ53773.01, присужденными Национальными институтами здравоохранения. Правительство Соединенных Штатов может иметь определенные права в отношении данного изобретения.

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Данная заявка является частичным продолжением заявки Соединенных Штатов с регистрационным номером 09/609080, поданной 30 июня 2000 г., которая является частичным продолжением заявки Соединенных Штатов с регистрационным номером 09/435156, поданной 5 ноября 1999 г., которая является частичным продолжением заявки Соединенных Штатов с регистрационным номером 08/722271, поданной 27 февраля 1996 г. (в настоящее время получает патент), которая является частичным продолжением заявки Соединенных Штатов с регистрационным номером 08/485472, поданной 7 июня 1995 г. (в настоящее время получила патент И8 Ра!еи! № 5792453), которая была частичным продолжением заявки Соединенных Штатов с регистрационным номером 08/396207, поданной 28 февраля 1995 г.; и эта заявка является частичным продолжением международной заявки РСТ/И899/02702, поданной 9 февраля 1999 г., которая является частичным продолжением заявки Соединенных Штатов с регистрационным номером 09/021773, поданной 11 февраля 1998 г., которая является частичным продолжением заявки Соединенных Штатов с регистрационным номером 08/485472, поданной 7 июня 1995 г. (в настоящее время получила патент И8 Ра!еи! № 5792453); и эта заявка является частичным продолжением заявки Соединенных Штатов с регистрационным номером 09/068102, поданной 30 апреля 1998 г., которая является частичным продолжением заявки Соединенных Штатов с регистрационным номером 08/852779, поданной 6 мая 1997 г. и является частичным продолжением заявки Соединенных Штатов с регистрационным номером 09/132167, поданной 10 августа 1998 г. Все приведенные выше патентные заявки включены здесь в качестве ссылки.

Область техники, к которой относится изобретения

Данное изобретение относится к способам и композициям для лечения сердечно-сосудистого заболевания генотерапией ίη νίνο. Более конкретно, данное изобретение относится к способам и полинуклеотидным конструкциям для лечения заболевания сердца и/или для лечения заболевания периферических сосудов доставкой ίη νίνο ангиогенных трансгенов.

Уровень техники

Американской кардиологической ассоциацией (статистическое приложение 1995 года) сообщалось, что около 60 миллионов взрослых людей в Соединенных Штатах страдают от сердечно-сосудистого заболевания. Сердечно-сосудистые заболевания ответственны за почти миллион смертей ежегодно в Соединенных Штатах, что составляет более 40% всех смертей. Каждый год в Соединенных Штатах, имеются около 350000 новых случаев стенокардии (грудной жабы, апдша ресЮгЕ). общего состояния коронарной артерии, характеризующегося временными периодами ишемии миокарда, приводящими к боли в груди. Подобным образом, каждый год, около 400000 пациентов диагностируются, как имеющие застойную сердечную недостаточность СНЕ, другое проявление заболевания сердца, которое представляет наиболее частую неизбирательную причину госпитализации в США. В 1996 г., согласно оценке, 725000 людей страдали от заболевания периферических сосудов, из которых более 100000 нуждались в ампутации конечностей.

Ишемия миокарда является аспектом дисфункции сердца, которая имеет место, когда сердечная мышца (миокард) не получает достаточного кровоснабжения и, следовательно, лишена необходимых уровней кислорода и питательных веществ. Ишемия миокарда может приводить к различным заболеваниям сердца, например, стенокардии, сердечному приступу и/или застойной сердечной недостаточности. Наиболее обычной причиной ишемии миокарда является атеросклероз (также называемый заболеванием коронарных сосудов (САО), (т.е. ишемической болезнью сердца или ИБС), которое вызывает блокады в коронарных артериях, кровеносных сосудах, которые обеспечивают кровоток к сердечной мышце. Существующие способы лечения для миокардиальной ишемии включают в себя фармакологические терапии, хирургическое шунтирование коронарных артерий и чрескожную реваскуляризацию (восстановление кровоснабжения конечности) с использованием таких способов, как баллонная ангиопластика. Стандартная фармакологическая терапия основана на стратегиях, которые включают в себя либо увеличение кровоснабжения сердечной мышцы, либо уменьшение потребности сердечной мышцы в отношении кислорода и питательных веществ. Например, увеличенное кровоснабжение миокарда может быть достигнуто с использованием таких агентов, как блокаторы кальциевых каналов или нитроглицерин. Считается, что эти агенты увеличивают диаметр подвергнутых заболеванию артерий посредством релаксации гладкой мышцы в стенках артерий. Уменьшение потребности сердечной мышцы в кислороде и питательных веществах может быть выполнено либо агентами, которые уменьшают гемодинамическую нагрузку на сердце, такими как артериальные вазодилататоры, или агентами, которые уменьшают контрактильную реакцию сердца на конкретную гемодинамическую нагрузку, такими как антагонисты бетаадренергического рецептора. Хирургическое лечение ишемической болезни сердца обычно основывается на шунтировании заболевших артериальных сегментов стратегически помещаемыми шунтирующими

- 1 008538 трансплантатами (обычно трансплантатами подкожной вены или внутренней артерии молочной железы). Чрескожная реваскуляризация обычно основывается на применении катетеров для уменьшения сужения в пораженных заболеванием коронарных артериях. Все эти стратегии используют для уменьшения числа, или для ликвидации ишемических приступов, но все они имеют различные недостатки, некоторые из которых обсуждаются ниже.

Многие пациенты с заболеванием сердца, в том числе многие из тех, тяжелая миокардиальная ишемия которых приводила к сердечному приступу, диагностируются как имеющие застойную сердечную недостаточность. Застойная сердечная недостаточность определяется как отклоняющаяся от нормы сердечная функция, приводящая к недостаточному минутному сердечному выбросу (минутному объему сердца) для удовлетворения метаболических потребностей (Втаип^а1б, Е. (еб.), Ιη: Неай Огосахс. ν.Β. Заипбегк, РЫ1абе1рЫа, раде 426, 1988). Согласно оценке, 5 млн людей в Соединенных Штатах страдают от застойной сердечной недостаточности. Как только симптомы СНЕ становятся умеренно тяжелыми, прогноз является худшим, чем в случае большинства раков, вследствие того, что только половина таких пациентов, как ожидается, проживут более 2 лет (Втаиита1б, Е. (еб.), Ιη: Неай О^еаке, ν.Β. Заипбегк, РЫ1абе1рЫа, раде 471-485, 1988). Лекарственная терапия может в начальной стадии ослабить симптомы СНЕ (например, отек, непереносимость физической нагрузки, одышку) и в некоторых случаях продлить жизнь. Однако прогноз этого заболевания, даже с лекарственным лечением, остается мрачным, и частота встречаемости СНЕ увеличивается (см., например, Ваидйтап, К., Сатбю1оду Οίπίοδ 13: 27-34, 1995). Симптомы СНЕ включают в себя одышку, усталость, слабость, опухание ног и непереносимость физической нагрузки. При физическом обследовании пациенты с сердечной недостаточностью имеют тенденцию повышения частоты сердечных сокращений и частоты дыхания (признака наличия жидкости в легких), отека, расширения яремных вен и, обычно, увеличенное сердце. Наиболее общей причиной СНЕ является атеросклероз, который, как обсуждалось выше, вызывает блокады в коронарных артериях, которые подают кровь к сердечной мышце. Таким образом, застойная сердечная недостаточность наиболее часто связана с заболеванием коронарных артерий, которое является таким тяжелым по его масштабу или внезапности, что оно приводит к развитию хронической или острой сердечной недостаточности. У таких пациентов обширная и/или внезапная окклюзия одной или нескольких коронарных артерий препятствует достаточному кровотоку к миокарду, приводя к тяжелой ишемии и, в некоторых случаях, инфаркту миокарда или гибели сердечной мышцы. Последующий некроз миокарда имеет тенденцию сопровождаться прогрессирующей хронической сердечной недостаточностью или острым состоянием низкого сердечного выброса - оба из которых связаны с высокой смертностью.

Большинство пациентов с застойной сердечной недостаточностью имеют тенденцию развития увеличенного, слабо сокращающегося сердца, состояния, называемого дилатированной кардиомиопатией (или ОСМ, как ее называют в данной заявке). ОСМ является состоянием сердца, обычно диагностируемым по обнаружению дилатированного гипоконтрактильного левого и/или правого желудочка. Опять в большинстве случаев застойная сердечная недостаточность, связанная с расширенным сердцем, является результатом заболевания коронарных артерий, часто настолько серьезным, что оно может вызывать один или несколько инфарктов миокарда. Однако, в очень небольшом числе случаев, ОСМ может встречаться в отсутствие характеристик заболевания коронарных артерий (например, атеросклероза). В ряде случаев, в которых дилатированная кардиомиопатия не ассоциирована с ИБС (атеросклерозом), причина ОСМ является известной или предполагаемой. Примеры включают в себя семейную кардиомиопатию (например, связанную с прогрессирующей мышечной дистрофией, миотонической мышечной дистрофией, атаксией Фридрайха и наследственной дилатированной кардиомиопатией), инфекции, приводящие к воспалению миокарда (например, инфекции различными вирусами, бактериями и другими паразитами), неинфекционные воспаления (например, обусловленные аутоиммунными заболеваниями, репрайиткардиомиопатией, аллергическими реакциями или отторжениями трансплантата), метаболические нарушения, вызывающие миокардит (в том числе связанные с питанием, эндокринологические и связанные с отклонениями от нормы электролитов) и подверженность действию токсических агентов, вызывающих миокардит (в том числе алкоголя, а также некоторых химиотерапевтических лекарственных средств и катехоламинов). Однако в большинстве случаев не связанной с атеросклерозом дилатированной кардиомиопатии (ОСМ) причина заболевания остается неизвестной, и это состояние, следовательно, называют «идиопатической дилатированной кардиомиопатией» (или ШСМ). Несмотря на потенциальные различия в лежащих в основе заболевания причин, большинство пациентов с тяжелой СНЕ имеют увеличенные, имеющие тонкую стенку сердца (т.е. ОСМ) и большинство этих пациентов обнаруживают миокардиальную ишемию (даже хотя некоторые из них могут не иметь видимого атеросклероза). Кроме того, пациенты с ОСМ могут испытывать приступы грудной жабы (стенокардии), хотя они могут не иметь тяжелого заболевания коронарных артерий.

Появление СНЕ выдвигает несколько главных терапевтических проблем, в том числе прогрессирующее миокардиальное повреждение, гемодинамические недостаточности, связанные с дилатированным сердцем, угрозу системных эмболов (кровяных сгустков) и риск желудочковых аритмий. Традиционная реваскуляризация не является предпочтительной для лечения не связанной с ишемической болезнью сердца (ИБС) ОСМ, так как окклюзивное (закупоривающее) коронарное заболевание не является

- 2 008538 первичной проблемой. Даже для пациентов, для которых причина ЭСМ известна или предполагается, повреждение обычно нелегко поддается реверсии. Например, в случае индуцированной адриамицином кардиотоксичности кардиомиопатия является обычно необратимой и приводит к смерти более чем 60%, пораженных пациентов. Для некоторых пациентов с ОСМ сама причина является неизвестной. В результате отсутствуют обычно применяемые способы лечения для ОСМ. Врачи традиционно фокусировали внимание на облегчении симптомов, присутствующих у пациента, проявляющего дилатированную кардиомиопатию (ОСМ) (например, ослаблением удерживания жидкости диуретическими средствами и/или снижением потребности сердечной мышцы в кислороде и питательных веществах ингибиторами ферментов, превращающими ангиотензин). В результате приблизительно 50% пациентов, обнаруживающих дилатированную кардиомиопатию (ОСМ), умирают в пределах двух лет диагноза, часто от неожиданной остановки сердца, связанной с вентрикулярными (желудочковыми) аритмиями. Вентрикулярное ремоделирование является аспектом сердечного заболевания, который часто имеет место после инфаркта миокарда и часто приводит к дальнейшему повреждению вентрикулярной функции. Во многих случаях после заживления инфаркта миокарда продолжающаяся ишемия в пограничном районе между заживленным инфарктом и нормальной тканью и другие факторы приводят к дилатации (расширению) и/или ремоделированию оставшейся ткани сердца. Эти дилатация или ремоделирование, хотя сначала адаптивного характера, часто ведут к дальнейшему нарушению вентрикулярной функции. Дилатация всего сердца имеет место у приблизительно 50% пациентов, которые имеют такие инфаркты, и ремоделирование обычно развивается в пределах нескольких месяцев после инфаркта миокарда, хотя оно может происходить также рано, в диапазоне 1-2 недель после инфаркта. Слабая функция левого желудочка является самым точным и единственным прогностическим фактором неблагоприятного исхода после инфаркта миокарда. Таким образом, предотвращение вентрикулярного ремоделирования после инфаркта миокарда было бы благоприятным фактором. Одним подходом в попытке предотвращения вентрикулярного ремоделирования является лечение пациента, страдающего от инфаркта миокарда, ингибитором фермента, превращающего ангиотензин (АСЕ) (см., например, МсЭопа1Д К.М., Тгаик. Аккос. Ат. Ρΐινκίααηκ 103:229-235, 1990; Соки, 1. Сйи. Сагйю1. 18 (8ирр1. IV) !У-4-ГУ-12, 1995). Однако эти агенты являются лишь незначительно эффективными в предупреждении вредного вентрикулярного ремоделирования, и требуются новые способы терапии.

Существующие в настоящее время способы лечения для СНЕ включают в себя фармакологические терапии, процедуры коронарной реваскуляризации и трансплантацию сердца. Фармакологические терапии для СНЕ были направлены на увеличение силы сокращения сердца (посредством использования инотропных агентов, таких как дигиталис (наперстянка) и агонисты бета-адренергических рецепторов), снижение накопления жидкости в легких и в других местах (применением диуретических средств) и уменьшение нагрузки на сердце (путем применения агентов, которые снижают системное сосудистое сопротивление, таких как ингибиторы ферментов, превращающих ангиотензин). Были также испытаны антагонисты бета-адренергических рецепторов. Хотя подобные фармакологические агенты могут улучшать симптомы и потенциально продлевают жизнь, прогноз в большинстве случаев остается мрачным.

Некоторые пациенты с сердечной недостаточностью вследствие связанного с ней заболевания коронарной артерии могут испытывать улучшение, по меньшей мере временное, в результате процедур реваскуляризации, таких как хирургическое шунтирование и ангиопластика коронарных артерий. Такие процедуры имеют потенциальную пользу, когда сердечная мышца не является погибшей, но может быть дисфункциональной вследствие недостаточного кровотока. Если нормальный коронарный кровоток восстанавливается, прежде дисфункциональный миокард может сокращаться более нормально, и функция сердца может улучшиться. Однако, если пациент имеет недостаточное микрососудистое (капиллярное) ложе (например, как это может быть обнаружено у более тяжелых пациентов с СНЕ), реваскуляризация будет редко восстанавливать сердечную функцию до нормального или почти нормального уровней, даже если иногда отмечаются слабые улучшения. Кроме того, встречаемость неудачных обходных сосудистов шунтов и рестеноза после ангиопластики выдвигает дополнительные риски для пациентов, подвергаемых лечению такими способами. Трансплантация сердца может быть предпочтительным выбором для пациентов с СНЕ, которые не имеют других сопутствующих заболеваний и являются относительно молодыми, но этот выбор пригоден только для малого числа таких пациентов и только при высокой стоимости. В целом, можно видеть, что СНЕ имеет очень слабый прогноз и слабо отвечает на существующие в настоящее время терапии.

Дальнейшим осложнением физиологических состояний, связанных с СНЕ, являются различные природные адаптации, которые имеют тенденцию появляться у пациентов с дисфункциональным сердцем. Хотя эти природные реакции могут первоначально улучшать функцию сердца, они часто приводят к другим проблемам, которые могут обострять заболевание, приводить в тупик лечение и имеют неблагоприятные влияния на выживание. Существуют три таких адаптивных реакции, обычно наблюдаемые у пациентов с застойной сердечной недостаточностью (СНЕ): (ί) ретенция (удержание) объема, индуцируемая изменениями в реабсорбции натрия, которая расширяет объем плазмы и первоначально улучшает минутный объем сердца; (ίί) увеличение сердца (вследствие дилатации и гипертрофии), которое может увеличивать ударный объем крови, выбрасываемой желудочком за одно сокращение, при поддержании

- 3 008538 нормального натяжения стенок; и (ίίί) увеличенное высвобождение норэпинефрина из адренергических нервных окончаний, сталкивающихся с сердцем, который, посредством взаимодействия с сердечными бета-адренергическими рецепторами, стремится увеличить частоту сердечных сокращений, увеличивая тем самым минутный сердечный выброс. Однако каждая из этих трех природных адаптаций имеет тенденцию приводить в конце концов к неудаче в силу разных причин. В частности, задержка жидкости имеет тенденцию приводить к отеку, к удержанию жидкости в легких, которая нарушает дыхание. Увеличение сердца может приводить к вредному ремоделированию левого желудочка с последующей тяжелой дилатацией и увеличенным натяжением стенок, обостряя тем самым СНР. Наконец, продолжительное воздействие на сердце норэпинефрина имеет тенденцию делать сердце нечувствительным к адренергической стимуляции и связано с плохим прогнозом.

Нарушения периферической сосудистой сети, подобно заболеванию сердца, часто возникают по причине уменьшенного кровотока к ткани (например, скелетной мышце), которая (подобно сердечному заболеванию) становится ишемической (малокровной), в частности, при увеличении метаболических потребностей (например, при физической нагрузке). Так, атеросклероз, присутствующий в периферическом сосуде, может вызвать ишемию в ткани, снабжаемой пораженным сосудом. Эта проблема, известная как артериосклеротическое окклюзионное заболевание периферических артерий (ΡΑΟΌ), наиболее часто поражает нижние конечности пациентов. Как и в случае других форм сердечно-сосудистого заболевания, это состояние или по меньшей мере некоторые из его симптомов могут лечиться с использованием лекарственных средств, таких как аспирин или другие агенты, которые снижают вязкость крови, или хирургическим вмешательством, например трансплантацией артерий, хирургическим удалением отложений жировых бляшек или эндоваскулярными способами лечения, например ангиопластикой. Хотя симптомы могут быть улучшены, эффективность таких способов лечения обычно является недостаточной, в силу причин, аналогичных описанным выше.

Недавно исследования способов лечения сердечно-сосудистого заболевания обратились к терапевтическим средствам, связанным с ангиогенезом. Ангиогенезом называют обычно развитие и дифференцировку кровеносных сосудов. Известно, что ряд белков, обычно называемых «ангиогенными белками», стимулируют ангиогенез. Такие ангиогенные белки включают в себя члены семейства фибробластного фактора роста (РОР), семейства васкулярного эндотелиального фактора роста (УБОР), тромбоцитарного фактора роста (РЭОР) и инсулиноподобного фактора роста (ЮР) и другие (как описано более подробно ниже и в литературе в данной области). Например, члены семейств РОР и УБОР были признаны в качестве регуляторов ангиогенеза во время роста и развития. Недавно была исследована их роль в стимуляции ангиогенеза во взрослых животных (как обсуждается ниже). Была исследована ангиогенная активность семейств РОР и УЕОР. Например, было показано, что кислый белок РОР (аРОР) в покрытом коллагеном матриксе, при помещении в брюшинную полость взрослых крыс, приводил к хорошо васкуляризованной и нормально перфузируемой структуре (Тйотркоп е! а1., Ргос. Иа!1. Асаб. 8εί. И8А, 86: 7928-7932, 1989). Инъекция основного белка РОР (ЬРОР) в коронарные артерии взрослых кроликов во время коронарной окклюзии приводила к уменьшенной миокардиальной дисфункции, меньшим повреждениям миокарда и увеличению кровеносных сосудов в находящемся при риске ложе (Уапащка\\'а-М|\га е! а1., 8с1епсе, 257: 1401-1403, 1992). Сходные результаты сообщались в моделях миокардиальной ишемии животных с использованием белка ЬРОР (Нагаба е! а1., 1. С11п. 1пуек1. 94: 623-630, 1994; Ипдег е! а1., Ат. 1. РЬукюБ, 266: Н1588-Н1595, 1994). Увеличение в коллатеральном кровотоке было показано у собак, обработанных белком УЕОР (Вапб е! а1., Спси1а1юп 89: 2183-2189, 1994).

Однако трудности, связанные с потенциальным применением инфузий таких белков для стимуляции сердечного ангиогенеза, включают в себя достижение правильной локализации в течение достаточного периода времени и гарантирование того, что этот белок находится и остается в правильной форме и концентрации, необходимых для поглощения и стимуляции ангиогенного действия в клетках миокарда. Концентрация белка, которая является первоначально высокой (например, после болюсной инъекции), но затем быстро падает (посредством клиренса организмом), может быть как токсичной, так и неэффективной. Другой трудностью является необходимость повторяемой инфузий или инъекции этого белка.

Некоторые публикации постулировали применение переноса генов для лечения или предупреждения заболевания, в том числе некоторых заболеваниий сердца. См., например, Ргепсй, Оепе ТгапкГег апб Сагбюуакси1аг Э1когбегк, Негх 18:222-229, 1993; №11йатк, Ргокрес! Гог Оепе Тйегару оГ 1кс11е1шс Неаг! Эгаеаке. Атепсап 1оита1 оГ Меб1са1 8аепсек 306:129-136, 1993; 8сйпе1бег апб Ргепсй, Тйе АбгеШ оГ Абепоуиик: Оепе Тйегару Гог Сагбюуакси1аг Эгаеаке. Сиси1а1юп 88:1937-1942, 1993; и Махиг е! а1., Согопагу Кек!епок1к апб Оепе Тйегару, Мо1еси1аг апб Се11и1аг Рйагтасо1оду, 21:104-111, 1994. Кроме того, некоторые группы предложили перенос генов ш у|уо в миокард с использованием плазмид, ретровируса, аденовируса и других векторов (см., например, Вагг е! а1., 8ирр1етеп1 II, Спси1а!юп, 84(4): АЬк1гас! 1673, 1991; Вагг е! а1., Оепе Тйег., 1: 51-58, 1994; Ргепсй е! а1., Сиси1а1юп, 90(5): 2402-2413, 1994; Ргепсй е! а1., С1гси1абоп, 90(5): 2414-2424, 1994; Ргепсй е! а1., С1гси1а!юп, 90: 1517 АЬк1гас! Ио. 2785, 1994; Бе1беп, е! а1., №094/11506 (26 Мау 1994); Сихтап е! а1., С1гс. Кек., 73(6): 1202-1207, 1993; Какк-Е1к1ег е! а1., Ргос. Ыаб. Асаб. 8сг И8А, 90: 11498-11502, 1993; МиЫйаикег е! а1., Нит. Оепе Тйег., 6: 1457-1465, 1995; МиЫйаикег е! а1., С1гс. Кек. 77(6): 1077-1086, 1995; и Комбапб е! а1., Ат. Тйогас. 8игд., 60(3): 721-728, 1995.

- 4 008538

Однако, в целом, эти сообщения дают немного более, чем предположения или пожелания в отношении потенциальных терапий. Из сообщений, обеспечивающих данные, полученные для животных, большинство не используют модели, достаточно сходные с действительными состояниями ίη νίνο. Кроме того, опробованные ίη νίνο способы обычно страдают одним или несколькими из следующих недостатков: недостаточной эффективностью трансдукции и экспрессии трансгенов; заметной иммунной реакцией на использованные векторы, в том числе воспаления и некроза ткани; и, что важно, относительной неспособностью к нацеленной трансдукции и экспрессии трансгенов для представляющего интерес органа (например, перенос генов, нацеленный на сердце, приводил к трансгену, доставляемому также в не относящиеся к сердцу участки, такие как печень, почки, легкие, головной мозг и яички испытуемых животных). В качестве примера, инсертирование трансгена в популяцию быстро делящихся клеток будет приводить к существенно уменьшенной продолжительности экспрессии трансгена. Примеры таких клеток включают в себя эндотелиальные клетки, которые создают внутренний слой всех кровеносных сосудов, и фибробласты, которые диспергированы по всему сердцу. Нацеливание трансгена таким образом, что только желательные клетки будут получать и экспрессировать этот трансген, и таким образом, что этот трансген не будет распределяться системно, является также критически важным соображением. Если это не достигается, результатом будут системная экспрессия трансгена и проблемы, связанные с этим. Например, были задокументированы воспалительные инфильтраты после опосредованного аденовирусом переноса гена в печень (Уапд е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8Л, 91: 4407, 1994). Кроме того, воспалительные инфильтраты были задокументированы в сердце после прямой инъекции в миокард через иглу, вставленную в стенку миокарда (Егепсй е! а1., С1гси1абоп, 90(5): 2414-2424, 1994).

Способ лечения ряда форм застойной сердечной недостаточности, связанный с бетаадренергической передачей сигнала, был недавно продемонстрирован Нашшопб е! а1., в РСТ-публикации \νϋ 98/10085, опубликованной 12 марта 1998 года. Этот способ включает в себя доставку генов, кодирующих элементы бета-адренергического пути передачи сигнала к сердцу пациента с заболеванием сердца, связанным с уменьшением бета-адренергической передачи сигнала.

Сущность изобретения

Данное изобретение относится к способам и композициям для лечения сердечно-сосудистого заболевания, предусматривающим доставку трансгена, кодирующего ангиогенный белок или пептид, к пораженной ткани введением вектора, содержащего этот трансген, в указанную ткань, где трансген экспрессируется, и симптомы заболевания ослабляются. Например, контрактильная (сократительная) функция и/или кровоток в средце могут быть увеличены введением содержащего трансген вектора в по меньшей мере одну коронарную артерию пациента, причем этот трансген доставляется к миокарду и экспрессируется в нем. Обеспечены также способы для применения в заболеваниях периферических сосудов, например, артериосклеротическом окклюзионном заболевании периферических артерий (ΡΑΟΌ). Как описано и иллстрируется здесь, эти способы, следовательно, применимы для лечения заболевания сердца, заболевания периферических сосудов и подобных нарушений.

Данное изобретение обеспечивает способ увеличения кровотока в ишемической (малокровной) ткани пациента, предусматривающий доставку ангиогенного белка или пептида к ишемическому району указанной ткани введением вектора, содержащего трансген, к этой ткани, в результате чего этот трансген экспрессируется в ткани и кровоток в этой ткани увеличивается. В одном аспекте вектор, содержащий трансген, кодирующий ангиогенный белок или пептид, вводят в ишемическую скелетную мышцу, где этот ангиогенный белок или пептид экспрессируется и вызывает увеличение в кровотоке и уменьшение ишемии в данной ткани. В альтернативном варианте вектор вводят в кровеносный сосуд, снабжающий кровью ишемическую ткань (например, введением в коронарную артерию, снабжающую миокард, или в периферическую артерию, например бедренную артерию, снабжающую кровью скелетную мышцу). Векторы, используемые в данном изобретении, могут быть плазмидой или предпочтительно вирусным вектором, например, дефектным в отношении репликации аденовирусом. Различные аспекты и терапевтические применения данного изобретения описаны и иллюстрируются ниже.

В одном аспекте данное изобретение обеспечивает способ увеличения контрактильной (сократительной) функции сердца пациента, предусматривающий доставку трансгена, кодирующего ангиогенный белок или пептид, к миокарду пациента введением вектора, содержащего этот трансген, к миокарду (предпочтительно доставку в одну или несколько коронарных артерий), где трансген доставляется в миокард и экспрессируется, и контрактильная функция сердца увеличивается. Трансген может быть введен, например, интракоронарной инъекцией в одну или более коронарных артерий или трансплантаты подкожной вены или внутренних артерий молочной железы, поставляющие кровь к миокарду. Трансген предпочтительно кодирует по меньшей мере один ангиогенный белок или пептид. Векторами, используемыми в данном изобретении, могут быть плазмида или предпочтительно вирусный вектор, в том числе, в качестве примера, дефектный в отношении репликации аденовирус. Инъекцией исходного раствора вирусного вектора (предпочтительно содержащего небольшое количество или не содержащего вируса дикого типа), глубоко (по меньшей мере около 1 см) в просвет одной или обеих коронарных артерий или трансплантатов (предпочтительно как в правую, так и в левую коронарные аретрии или трансплантаты) и предпочтительно в количестве 107-1013 вирусных частиц, как определено оптической денситометрией

- 5 008538 (более предпочтительно 109-1011 вирусных частиц), можно локально трансфецировать желаемое число клеток, в частности, миоцитов сердца, в пораженном миокарде кодирующими ангиогенный белок или пептид генами, максимизируя тем самым терапевтическую эффективность переноса гена и минимизируя нежелательный ангиогенез в экстракардиальных участках (участках вне сердца) и возможность воспалительной реакции на вирусные белки. При использовании кардиомиоцит-специфического промотора экспрессия может быть дополнительно ограничена миоцитами сердца таким образом, что дополнительно уменьшаются потенциально вредные действия ангиогенеза в тканях, не относящихся к сердцу, например, в сетчатке.

Обеспечены также наборы и композиции, которые могут быть использованы в соответствии с этими терапевтическими способами.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет графически процентное утолщение стенки во время (электро)кардиостимуляции в модели застойной сердечной недостаточности у свиньи. Процентное утолщение стенки оценивали последовательно в межжелудочковой перегородке и латеральной стенке перед кардиостимуляцией (день 0) и каждые 7 дней по мере прогрессирования сердечной недостаточности (как описано в примере 1). Символы представляют средние величины; столбики ошибок определяют одно стандартное отклонение (1 8Ό). Двухфакторный дисперсионный анализ ΑΝΟνΑ (повторяемые измерения) показал, что на процентное утолщение стенки влияет продолжительность кардиостимуляции (Р <0,001) и участок (Р=0,001). Кроме того, картина изменения утолщения стенки была различной между этими двумя районами (Р<0,0001). Средние величины для процентного утолщения стенки в каждой временной точке испытывали на различия между этими двумя районами ро81 кос (после этого) по способу Тьюки; величины Р для этих анализов показаны под столбиками ошибок.

Фиг. 2А и 2В представляют графически субэндокардиальный кровоток во время электрической кардиостимуляции в модели застойной сердечной недостаточности у свиньи, описанной в примере 1.

Для фиг. 2А субэндокардиальный (эндо) кровоток оценивали в межжелудочковой перегородке и латеральной стенке в условиях, перечисленных вдоль оси х. День относится к дню пролонгированной кардиостимуляции, в который получали эти измерения (0, начало кардиостимуляции; 14, 14 дней; 21-28, от дня 21 до дня 28). РАСЕ (электрическая кардиостимуляция) показывает, получали ли определения кровотока с активированным кардиостимулятором (+) или с неактивированным (0). Частота кардиостимулятора была равна 225 ударам в мин (Ьрт) (См. табл. 3 здесь в отношении цифровых величин). Символы обозначают средние величины; столбики ошибок определяют одно стандартное отклонение (1 8Ό). Двухфакторный дисперсионный анализ ΑΝΟνΑ (повторяемые измерения) показал, что на субэндокардиальный кровоток влияет продолжительность (Р=0,0001) и район (Р=0,017) кардиостимуляции. Кроме того, картина изменения в субэндокардиальном кровотоке была различной между этими двумя районами (Р <0,006). Средние величины для субэндокардиального кровотока в каждой временной точке испытывали на различия между этими двумя районами роЧ кос по способу Тьюки; величины Р для этих анализов показаны под столбиками ошибок.

Для фиг. 2В субэндокардиальный кровоток на один удар оценивали в межжелудочковой перегородке и латеральной стенке в условиях, перечисленных вдоль оси х. Символы и условия соответствуют описанным на фиг. 2А. (См. табл. 4 здесь в отношении цифровых величин). Двухфакторный дисперсионный анализ ΑΝΟνΑ (повторяемые измерения) показал, что на субэндокардиальный кровоток на один удар влияет продолжительность (Р=0,0001) и район кардиостимуляции (Р=0,0198).

Фиг. 3А представляет графически меридиальное натяжение стенки в конце систолы, оцениваемое последовательно в межжелудочковой перегородке и латеральной стенке перед кардиостимуляцией (день 0) и каждые 7 дней по мере прогрессирования сердечной недостаточности (как описано в примере 1). Двухфакторный дисперсионный анализ ΑΝΟνΑ (повторяемые измерения) показал, что на систолическое натяжение стенки влияет продолжительность кардиостимуляции (Р<0,0001). Однако картина систолического натяжения стенки была сходной в обоих районах. Измерения проводили с неактивированным кардиостимулятором.

Фиг. 3В представляет графически коронарное сосудистое сопротивление во время кардиостимуляции в модели застойной сердечной недостаточности у свиньи, описанной в примере 1. Индекс сопротивления коронарных сосудов оценивали последовательно в межжелудочковой перегородке и латеральной стенке в условиях, перечисленных вдоль оси х. Символы и условия являются такими же, какие описаны на фиг. 2. Двухфакторный дисперсионный анализ ΑΝΟνΑ (повторяемые измерения) показал, что на сопротивление коронарных сосудов влияет продолжительность (Р=0,0001) и район кардиостимуляции (Р=0,013). Кроме того, картина изменения в сопротивлении коронарных сосудов была различной между этими двумя районами (Р=0,0012). Средние величины для сопротивления коронарных сосудов в каждой временной точке испытывали на различия между этими двумя районами роЧ кос (после этого) по анализам Тьюки. Этот анализ показал, что сопротивление коронарных сосудов было более высоким в латеральной стенке, чем с перегородке непосредственно после начала кардиостимуляции (величина Р указана под столбиком ошибки).

- 6 008538

Фиг. 4 показывает схематически конструирование примерного дефектного по репликации рекомбинантного аденовирусного вектора, применимого для переноса генов, как описано в примерах ниже.

Фиг. 5 является схематическим изображением, которое показывает конструкцию рекомбинации спасения кодирующего трансген аденовируса.

Фиг. 6А и 6В представляют в виде диаграмм контрактильную функцию обработанных животных, описанную в примере 5. Фиг. 6 А показывает результаты на животных, исследованных спустя 2 недели после переноса гена, а фиг. 6В показывает результаты спустя 12 недель после переноса гена.

Фиг. 7А, 7В и 7С показывают диаграммы, соответствующие контрастным эхокардиографиям миокарда. Белые зоны обозначают контрастное усиление (больший кровоток), а темные зоны обозначают пониженный кровоток). Фиг. 7А иллюстрирует острую окклюзию ЬСх у нормальной свиньи. Фиг. 7В иллюстрирует различие в контрастном усилении между межжелудочковой перегородкой (1У8=МЖП) и ложем ЬСх спустя 14 дней после переноса гена с ΙαοΖ. что указывает на различные кровотоки в двух районах во время предсердной кардиостимуляции (200 ударов в мин (Ьрш)). На фиг. 7С, контрастное усиление кажется эквивалентным в ложе МЖП (1У8) и ложе ЬСх спустя 14 дней после переноса гена с РСР-5, что указывает на сходные кровотоки в этих двух районах во время предсердной кардиостимуляции. Эти результаты описаны в примере 5.

Фиг. 8 показывает максимальное отношение контрастности (коррелирующее с кровотоком), выраженное в виде отношения максимальной интенсивности видеоизображения в ишемическом районе (ложе ЬСх), деленного на максимальную интенсивность видеоизображения в межжелудочковой перегородке (1У8), измеренного из видеоизображений с использованием основанной на компьютере программы видеоанализа во время предсердной кардиостимуляции (200 ударов в мин) перед переносом гена и спустя 14±1дней после переноса гена с 1;·ιοΖ (контрольным геном) и с РСР-5, и в 5 животных, спустя 12 недель после переноса гена РСР-5 (описано в примере 5). Кровоток к ишемическому ложу оставался 50% от нормального после переноса гена с контрольным геном, но увеличивался в 2 раза выше нормального после переноса гена с РСР-5 (р=0,0018), причем этот эффект сохранялся в течение по меньшей мере 12 недель.

Фиг. 9 показывает число сосудов, количественно определенных микроскопическим анализом в ишемическом и неишемическом районах после переноса гена с РСР-5 и с 1;·ιοΖ (описано в примере 5). Наблюдали увеличенное число капилляров, окружающих каждое волокно, в ишемическом и неишемическом районах животных, которые получали перенесенный ген РСР-5 (р<0,038), в сравнении с животными, которые получали ген ΙαοΖ.

Фиг. 10А, 10В и 10С получены из гелей, документирующих экспрессию ДНК, мРНК и белка после генного переноса ангиогенного трансгена, к миокарду в соответствии с данным изобретением (как описано в примере 5). Фиг. 10Ό получена из геля после ПЦР-амплификации, показывающей отсутствие какого-либо переноса гена к сетчатке, печени или скелетной мышце обработанных животных (как описано в примере 5).

Фиг. 11 показывает сравнение утолщения стенки, достигаемого с переносом гена ίη νίνο с использованием конструкций ангиогенных генов, РСР-4, РСР-5 и РСР-2Ы +/- §р (т.е. РОР-2Ы плюс или минус секреторный сигнальный пептид), как описано в примерах 6 и 7.

Фиг. 12 показывает, что улучшенная функция в ишемическом районе после переноса гена РСР-4 (как показано утолщением стенки) была связана с улучшенной регионарной перфузией.

Фиг. 13 показывает сравнение перфузии (кровотока), получаемой от инъекции РСР-4, РСР-5 и РСР2Ы +/- §р (= РСР-2Ы плюс или минус секреторный сигнальный пептид), как описано в примерах 6 и 7.

Фиг. 14 показывает сравнение утолщения стенки в результате переноса генов с РСР-2 плюс (РСР2Ы +§р) или минус секреторный сигнальный пептид (РСР-2Ь1 -§р), описанное в примере 7.

Подробное описание предпочтительных вариантов Определения «Заболевание сердца» обозначает острые и/или хронические сердечные дисфункции. Заболевание сердца часто связано с уменьшением контрактильной (сократительной) функции сердца и может быть связано с наблюдаемым уменьшением кровотока к миокарду (например, в результате заболевания коронарной артерии). Манифестации заболевания сердца включают в себя миокардиальную ишемию (малокровие), которая может быть следствием стенокардии, сердечного приступа и/или застойной сердечной недостаточности.

«Миокардиальная ишемия» является состоянием, в котором сердечная мышца не получает достаточных уровней кислорода и питательных веществ, что обычно обусловлено недостаточным кровоснабжением миокарда (например, в результате заболевания коронарной артерии).

«Сердечная недостаточность» определяется клинически как состояние, в котором сердце не обеспечивает достаточного кровотока к телу для удовлетворения метаболических потребностей. Симптомы включают в себя одышку, усталость, слабость, опухание ног и непереносимость физической нагрузки. При физическом обследовании пациенты с сердечной недостаточностью имеют тенденцию к повышению частоты сердечных сокращений и частоты дыхания, хрипам (как признаку жидкости в легких), отеку, растяжимости яремных вен и, во многих случаях, увеличенному сердцу. Пациенты с тяжелой сердеч

- 7 008538 ной недостаточностью страдают от высокой смертности; обычно 50% пациентов умирают в пределах двух лет развития этого состояния. В некоторых случаях, сердечная недостаточность связана с тяжелым заболеванием коронарной артерии («ИБС». СЛЭ). обычно приводя к инфаркту миокарда и либо к прогрессирующей хронической сердечной недостаточности. либо к острому состоянию с низким минутным сердечным выбросом, как описано здесь и в литературе в данной области. В других случаях сердечная недостаточность связана с дилатированной кардиомиопатией без ассоциированного тяжелого заболевания коронарных артерий.

«Заболевание периферических сосудов» обозначает острую или хроническую дисфункцию периферической (т.е. не-сердечной) сосудистой сети и/или тканей. снабжаемых периферической сосудистой сетью. Как и в случае заболевания сердца. заболевание периферических сосудов обычно приводит к недостаточному кровотоку к тканям. снабжаемым кровью этой сосудистой сетью. причем эта недостаточность кровоснабжения может приводить. например. к ишемии или. в некоторых случаях. к гибели клеток ткани. Аспекты заболевания периферических сосудов включают в себя. без ограничения. артериосклеротическое окклюзионное заболевание периферических сосудов (ΡΑΟΌ) и ишемию периферических мышц. Часто симптомы заболевания периферических сосудов манифестируются в конечностях пациента. особенно в ногах.

В применении здесь. термины «имеющие терапевтическое действие» и «успешное лечение» имеют по существу одно и то же значение. В частности. пациент. страдающий от заболевания сердца по существу «успешно лечится» в отношении этого состояния. если этот пациент обнаруживает наблюдаемое и/или измеряемое уменьшение или отсутствие одного или нескольких симптомов заболевания сердца после получения трансгена ангиогенного фактора в соответствии со способами данного изобретения. Уменьшение этих признаков или симптомов может также ощущаться пациентом. Так. показатели успешного лечения состояний заболевания сердца включают в себя демонстрацию или ощущение пациентом уменьшения любого из симптомов стенокардии (грудной жабы). усталости. слабости. одышки. опухания ног. хрипов. частоты сердечных сокращений или частоты дыхания. отека или растяжимости яремных вен. Пациент может также обнаруживать более высокую переносимость физической нагрузки. иметь меньшее сердце с улучшенной функцией желудочков и сердечной функцией и обычно нуждаться в меньшем числе посещений больницы по поводу состояния сердца. Улучшения в сердечно-сосудистой функции могут быть достаточными для удовлетворения метаболических потребностей пациента. и пациент может не обнаруживать симптомов при легком физическом напряжении или в состоянии покоя. Многие из этих признаков и симптомов можно легко наблюдать невооруженным глазом и/или они могут быть измерены рутинными процедурами. известными врачу. Признаки улучшенной сердечно-сосудистой функции включают в себя увеличенный кровоток и/или улучшенную контрактильную функцию в подвергнутых лечению тканях. Как описано ниже. кровоток в пациенте может быть измерен визуализацией с таллием (как описано Вгаиита16 в Неаг! Э18еа8е. 41Н еб.. рр. 276-311 (Баиибегв. РЫ1а6е1рЫа. 1992)) или эхокардиографией (описанной в примерах 1 и 5 и в Байи. ΌΤ. е! а1.. Спси1а1юи. 58:1072-1083. 1978). Кровоток до и после переноса ангиогенного гена может сравниваться с использованием этих способов. Улучшенная функция сердца ассоциируется с уменьшенными признаками и симптомами. как отмечалось выше. Кроме эхокардиографии. можно измерять фракцию выброса (левого желудочка. ЬУ) ядерными (неинвазивными) способами. известными в данной области. Кровоток и контрактильная функция могут быть также измерены в периферических тканях. подвергнутых лечению в соответствии с данным изобретением.

«Ангиогенный белок или пептид» обозначает любой белок или пептид. способный стимулировать ангиогенез или ангиогенную активность. т. е. развитие кровеносных сосудов.

«Полинуклеотид» обозначает полимерную форму нуклеотидов любой длины. либо рибонуклеотидов. либо дезоксирибонуклеотидов. или их аналогов. Этот термин обозначает первичную структуру этой молекулы и. следовательно. включает в себя двухцепочечную и одноцепочечную ДНК. а также двухцепочечную и одноцепочечную РНК. Он включает в себя также модифицированные полинуклеотиды. например. метилированные и/или кэпированные полинуклеотиды.

Рекомбинантный. в применении к полинуклеотиду. обозначает. что этот полинуклеотид является продуктом различных комбинаций стадий клонирования. рестрикции и/или лигирования и других процедур. которые приводят к конструкции. которая отличается от полинуклеотида. обнаруживаемого в природе.

Ген или трансген обозначает полинуклеотид или часть полинуклеотида. содержащие последовательность. которая кодирует белок. В большинстве ситуаций. желательно. чтобы ген также содержал промотор. функционально связанный с кодирующей последовательностью для эффективного промотирования транскрипции. Могут быть также включены энхансеры. репрессоры и другие регуляторные последовательности для модуляции активности гена. как хорошо известно в данной области (см.. например. цитируемые ниже ссылки).

Термины полипептид. пептид и белок используются взаимозаменяемо для обозначения полимеров аминокислот любой длины. Эти термины включают в себя также белки. которые являются посттрансляционно модифицированными посредством реакций. которые включают в себя гликозилирова

- 8 008538 ние, ацетилирование и фосфорилирование.

Гетерологичный компонент обозначает компонент, который вводят в отличающийся объект (организм) или который продуцируется в отличающемся объекте (организме), чем тот, в котором он природно локализован. Например, полинуклеотид, полученный из одного организма и введенный способами генной инженерии в отличающийся организм, является гетерологичным полинуклеотидом, который при экспрессии может кодировать гетерологичный полипептид. Подобным образом, промотор или энхансер, который выделен из его нативной кодирующей последовательности и функционально связан с отличающейся кодирующей последовательностью, является гетерологичным промотором или энхансером.

Промотор, в применении здесь, обозначает полинуклеотидную последовательность, которая регулирует транскрипцию гена или кодирующей последовательности, с которыми он функционально связан. Большое число промоторов, в том числе конститутивных, индуцируемых и репрессируемых промоторов, из большого числа различных источников, хорошо известны в данной области (и идентифицированы в базах данных, например, в СепВапк) и доступны в виде или внутри клонированных полинуклеотидных последовательностей (например, из таких депозитариев, как АТСС, а также других коммерческих или индивидуальных источников).

Энхансер, в применении здесь, обозначает полинуклеотидную последовательность, которая усиливает транскрипцию гена или кодирующей последовательности, с которыми он функционально связан. Большое число энхансеров, из большого числа различных источников хорошо известны в данной области (и идентифицированы в базах данных, например, в СепВапк) и доступны в виде или внутри клонированных полинуклеотидных последовательностей (например, из таких депозитариев, как АТСС, а также других коммерческих или индивидуальных источников). Ряд полинуклеотидов, содержащих промоторные последовательности (например, общеизвестный промотор СМУ), содержат также энхансерные последовательности.

«Функционально (оперативно) связанные» обозначает непосредственное соседство двух или нескольких компонентов, где описанные таким образом компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать присущим им образом. Промотор является функционально связанным с геном или кодирующей последовательностью, если этот промотор регулирует транскрипцию этого гена или этой кодирующей последовательности. Хотя функционально связанный промотор обычно расположен против хода транскрипции (слева) от кодирующей последовательности, он необязательно является смежным с ней. Энхансер является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если этот энхансер усиливает транскрипцию кодирующей последовательности. Функционально связанные энхансеры могут быть расположены против хода транскрипции (слева) от кодирующих последовательностей, внутри или справа от кодирующих последовательностей. Последовательность полиаденилирования является функционально связанной с кодирующей последовательностью, если она расположена на правом конце (по ходу транскрипции) кодирующей последовательности, так что транскрипция проходит через кодирующую последовательность в последовательность полиаденилирования.

Репликон обозначает полинуклеотид, содержащий сайт начала репликации (ориджин), который делает возможной репликацию полинуклеотида в подходящей клетке-хозяине. Примеры включают в себя хромосомы клетки-мишени, в которые может быть интегрирована гетерологичная нуклеиновая кислота (например, ядерные и митохондриальные хромосомы), а также внехромосомные репликоны (например, реплицирующиеся плазмиды и эписомы).

Доставка гена, перенос гена и т.п., в применении здесь, относятся к введению экзогенного полинуклеотида (иногда называемого трансгеном) в клетку-хозяина, независимо от способа, используемого для введения. Такие способы включают в себя большое разнообразие хорошо известных способов, таких как опосредованный вектором перенос гена (например, вирусная инфекция/трансфекция или различные комплексы доставки генов на основе белка или на основе липидов), а также способы, способствующие доставке голых полинуклеотидов (например, электропорация, доставка генным ружьем и различные другие способы, используемые для введения полинуклеотидов). Введенный полинуклеотид может быть стабильным или может быть временно сохраняемым в клетке-хозяине. Стабильное сохранение обычно требует, чтобы вводимый полинуклеотид либо содержал начало репликации, совместимое с клеткой-хозяина, либо интегрировался в репликон клетки-хозяина, например, внехромосомный репликон (например, плазмиду) или ядерную или митохондриальную хромосому. Известны ряд векторов, способных опосредовать перенос генов в клетки млекопитающих, как известно в данной области и описано здесь.

Доставка генов ίη νίνο, перенос генов, генная терапия (генотерапия) и т.п., в применении здесь, обозначают введение вектора, содержащего экзогенный полинуклеотид, непосредственно в тело организма, например, человека или млекопитающих нечеловека, в результате чего этот экзогенный полинуклеотид вводится в клетку такого организма ίη νίνο.

Вектор (иногда называемый носителем доставки гена или переноса гена) обозначает макромолекулу или комплекс молекул, содержащих полинуклеотид, подлежащий доставке в клетку-хозяина, ίη νίΐτο или ίη νίνο. Подлежащий доставке полинуклеотид может содержать кодирующую последовательность, представляющую интерес в генотерапии.

- 9 008538

Сосудистая сеть или сосудистый являются терминами, относящимися к системе сосудов, несущих кровь (а также лимфатическую жидкость) через тело млекопитающих.

Кровеносный сосуд обозначает любой из сосудов сосудистой системы млекопитающих, в том числе артерии, артериолы, капилляры, венулы, вены, синусы и сосуды сосудов. В предпочтительных аспектах данного изобретения для лечения заболевания сердца векторы, содержащие ангиогенные трансгены, вводят непосредственно в сосудистый канал, поставляющий кровь к миокарду, такие сосудистые каналы включают в себя коронарные (венечные) артерии, а также такие сосуды, как трансплантаты подкожных вен или трансплантаты внутренних артерий молочной железы.

Артерия обозначает кровеносный сосуд, через который кровь проходит из сердца. Коронарные артерии снабжают кровью ткани самого сердца, тогда как другие артерии снабжают кровью остальные органы тела. Обычная структура артерии состоит из просвета, окруженного многослойной артериальной стенкой.

Индивидуум или пациент обозначает млекопитающего, предпочтительно крупного млекопитающего, наиболее предпочтительно человека.

Обработка (лечение) или терапия, в применении здесь, относится к введению индивидуальному пациенту агентов, которые способны вызывать профилактическое, лечебное или другое благоприятное действие на данного индивидуума.

Генотерапия, в применении здесь, обозначает введение индивидуальному пациенту векторов, содержащих терапевтические ген или гены.

Терапевтический полинуклеотид или терапевтический ген обозначает нуклеотидную последовательность, которая способна, при переносе в индивидуум, вызывать профилактическое, лечебное или другое благоприятное действие на данного индивидуума.

Ссылки

Практика данного изобретения будет применять, если нет иных указаний, общепринятые способы молекулярной биологии и т.п., которые находятся в пределах квалификации в данной области. Такие способы объясняются в литературе. См., например, Мо1еси1аг С1ошпд. А ЬаЬота!огу Мапиа1, (8атЬтоок е! а1., Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬота!огу, Со1б 8рппд НагЬог, Ν.Υ., 1989); Сиггеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду (Р. АикиЬе1 е! а1. ебк., 1987 апб ирба!еб); Еккепба1 Мо1еси1аг Вю1оду (Т. Вгсшп еб., 1КЬ Ргекк 1991); Оепе Ехртеккюп Тесбпо1оду (Ооеббе1 еб., Асабетю Ргекк 1991); Ме!бобк кот С1опшд апб Апа1ук1к ок Еисатуобс Сепек (А. Во!бете11 е! а1. еб., Ваг!1е!! РиЬ1. 1990); Оепе Тгапккег апб Ехртеккюп (М. Кпедег 8!оск!оп Ргекк 1990); КесотЫпап! ΩΝΛ Ме!1юбо1оду (К. Аи е! а1. еб., Асабетю Ргекк 1989); РСК.: А Ргасбса1 Арргоасб (М. МсРбегкоп е! а1., 1КЬ Ргекк а! Охкогб Ишуегкйу Ргекк 1991); Се11 Сибиге ког Вюсбеш1к!к (К. Абатк еб., Е1ке\тег 8с1епсе РиЬбкНегк 1990); Сепе Тгапккег Уес!огк ког Маттабап Се11к (1. Мб1ег апб М. Са1ок ебк., 1987); Маттабап Се11 Вю!есбпо1оду (М. Вибег еб., 1991); Ашта1 Се11 Сибиге (1. Ро11агб е! а1. еб., Нитапа Ргекк 1990); Сибиге ок Ашта1 Се11к, 2пб Еб. (К. Ргекбпеу е! а1. ебк., А1ап К. Ь1кк 1987); Е1о\\' Су!оте!гу апб 8отбпд (М. Ме1атеб е! а1. ебк., Абеу-Шк 1990); серия Мебюбк ш Епхуто1оду (Асабетю Ргекк, 1пс.); Тесбшдиек ш 1ттипосбет1к!гу, (С. Ви11оск апб Р. Ре!гикх ебк., Асабетю Ргекк 1982, 1983, 1985, 1989); НапбЬоок ок Ехрептеп!а1 1ттипо1оду, (Ό. Аеб апб С В1аскете11, ебк.); Се11и1аг апб Мо1еси1аг 1ттипо1оду (А. АЬЬак е! а1., А.В. 8аипбегк Со., 1991, 1994); Сштеп! Рго!осо1к ш 1ттипо1оду (1. Собдап е! а1. !бк. 1991); серия Аппиа1 Ке\те\у ок 1ттипо1оду; серия Абуапсек ш 1ттипо1оду; О11допис1еоббе 8уп!бек1к (М. Саб еб., 1984); Ашта1 Се11 Сибиге (К. Ргекбпеу еб., 1КЬ Ргекк 1987); серия Абегюкс1егок1к, ТбтотЬоык апб Уакси1аг Вю1оду (Ь1рршсо!!, Аббатк апб Абкшк риЬбкбегк ког !бе Атепсап Неаг! Аккошабоп); серия С1гси1абоп (Ь1рр1псо!!, Аббатк апб Абкшк риЬбкбегк ког !бе Атепсап Неаг! Аккоаа!юп); и серия Сбси1а!юп Кекеагсб (Ь1рртсо!!, Аббатк апб Абкшк риЬбкбегк ког !бе Атепсап Неаг! Аккошабоп).

Дополнительные ссылки, описывающие доставку и хирургическое обеспечение, которые могут быть использованы в способах данного изобретения, включают в себя следующие ссылки: Торо1, Е1 (еб.), Тбе Тех!Ьоок ок 1п!етуепбопа1 Сатбю1оду, 2пб Еб. (А.В. 8аипбетк Со. 1994); Ки!бегкогб, КВ, Уакси1аг 8итдегу, 3гб Еб. (А.В. 8аипбетк Со. 1989); Тбе Сесб Тех!Ьоок ок Мебюше, 19!б Еб. (А.В. 1992); и 8аЬ1к!оп, Ό, Тбе Тех!Ьоок ок 8итдегу, 14!б Еб. (А.В. 1991). Дополнительные ссылки, описывающие типы клеток, обнаруживаемые в кровеносных сосудах, и типы клеток сосудистой сети, которые могут быть использованы в способах данного изобретения, включают в себя следующую ссылку: А. В1оот апб Ό. Раетсеб, А Тех!Ьоок ок Н1к!о1оду (У.В. 8аипбетк Со. 1975).

Различные публикации сообщали об использовании переноса генов для предупреждения заболевания, в том числе заболевания сердца. См., например, Ме!бобк ш Убо1оду, Уо1. 7: Сепе Тгапккег апб Ехртеккюп Рго!осо1к, Миттау, Е. (еб.), Ае1кк, Сбйоп, Ν.Ι, 1991; Махиг е! а1., Мо1еси1аг апб Се11и1аг Вю1оду, 21:104-111, 1994; Ргепсб, Нет/ 18:222-229, 1993; Аббатк, 1оитпа1 ок Мебка1 8с1епсек 306:129-136, 1993; и 8сбпе1бет, Сбси1абоп 88:1937-1942, 1993.

Ссылки, цитированные в описанном выше разделе, включены тем самым в качестве ссылок здесь в той степени, в которой эти ссылки описывают способы, которые используются в применении на практике данного изобретения.

- 10 008538

Включение в качестве ссылки

Все документы, цитируемые в данной заявке, в том числе патенты, патентные заявки и другие публикации, включены тем самым в качестве ссылки.

Подробное описание различных предпочтительных вариантов

Различные предпочтительные аспекты данного изобретения суммируются ниже и дополнительно описываются и иллюстрируются в последующих подробных описаниях и фигурах.

Данное изобретение относится к способам и композициям для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе миокардиальной ишемии, сердечной недостаточности и заболевания периферических сосудов.

В способе для лечения сердечной недостаточности векторную конструкцию, содержащую ген, кодирующий ангиогенный белок или пептид, нацеливают на сердце пациента, в результате чего этот экзогенный ангиогенный белок экспрессируется в миокарде, облегчая таким образом сердечную дисфункцию посредством улучшения кровотока и/или улучшения контрактильной функции сердца. Улучшенная функция сердца в конечном счете приводит к уменьшению или исчезновению одного или нескольких симптомов заболевания сердца или сердечной недостаточности и продлевает жизнь за пределы ожидаемой смерти.

Подобным образом, в лечении заболевания периферических сосудов в соответствии с данным изобретением векторную конструкцию, содержащую трансген, кодирующий по меньшей мере один ангиогенный белок или пептид, нацеливают на пораженную ткань, например, ишемическую скелетную мышцу, в результате чего синтез экзогенного ангиогенного белка облегчает или излечивает симптомы заболевания периферических сосудов, например, посредством увеличения кровотока к пораженному (например, ишемическому) участку ткани, и/или в мышце, посредством улучшения контрактильной функции пораженной мышцы.

Таким образом, в предпочтительном аспекте, данное изобретение обеспечивает способ лечения заболевания сердца пациента, имеющего миокардиальную ишемию, предусматривающий доставку вектора с встроенным трансгеном к миокарду пациента интракоронарной инъекцией, предпочтительно инъекцией вектора непосредственно в одну или обе коронарные артерии (или трансплантаты), посредством чего трансген экспрессируется и кровоток и/или контрактильная функция улучшаются. В качестве иллюстрации, при использовании вектора, содержащего трансген, кодирующий ангиогенный белок или пептид, такой как, например, ЕСЕ-5, ЕСЕ-4, аЕСЕ, ЬЕСЕ и/или УЕСЕ, причем этот вектор доставляется к сердцу, где этот белок или пептид продуцируется до терапевтически значимой степени в миокарде непрерывно в течение продолжительных периодов времени, ангиогенез может быть стимулирован в пораженном участке (районе) миокарда. Другие трансгены, такие как трансгены, кодирующие белки бетаадренергической передачи сигнала или другие усиливающие сердце или сердечную мышцу белки, могут быть также использованы, как описано ниже, в сочетании с использованием ангиогенного трансгена. Векторами, используемыми в данном изобретении, могут быть плазмида или предпочтительно вирусный вектор, например, дефектный по репликации аденовирус или аденоассоциированный вирус (АЛУ). Инъекцией исходного раствора вирусного вектора, например, раствора, который содержит относительно небольшое количество вируса дикого типа или вообще не содержит вирус дикого типа, глубоко в просвет одной или обеих коронарных артерий (или трансплантатов), предпочтительно как в правую, так и в левую коронарные аретрии (или трансплантаты), и предпочтительно в количестве 10⁷-10¹³ вирусных частиц, как определено оптической денситометрией, (более предпочтительно 10⁹-10¹¹ вирусных частиц), можно локально трансфицировать желаемое число клеток в пораженном миокарде кодирующими ангиогенный белок или пептид генами, максимизируя тем самым терапевтическую эффективность переноса гена и минимизируя нежелательный ангиогенез в экстракардиальных районах (районах вне сердца) и возможность воспалительной реакции на вирусные белки.

В другом предпочтительном аспекте, данное изобретение может быть также использовано для лечения пациента, страдающего от застойной сердечной недостаточности, доставкой вектора с встроенным трансгеном к сердцу указанного пациента, причем этот вектор содержит трансген, кодирующий ангиогенный белок или пептид, посредством чего этот трансген экспрессируется в миокарде, приводя к увеличенному кровотоку и увеличенной функции в сердце. Среди таких пациентов, страдающих от застойной сердечной недостаточности, находятся пациенты, обнаруживающие дилатированную кардиомиопатию, и пациенты, которые проявляют тяжелые инфаркты миокарда, обычно связанные с тяжелым или окклюзионным заболеванием коронарных артерий. Вектор предпочтительно вводят в кровеносный сосуд, подающий кровь к миокарду сердца, так чтобы доставить вектор к миокарду. Предпочтительно вектор вводят в просвет коронарной артерии, трансплантат подкожной вены или трансплантат внутренней артерии молочной железы; наиболее предпочтительно вектор вводят в просвет как левой, так и правой коронарной артерии. Интракоронарную инъекцию предпочтительно производят в виде единственной инъекции, относительно глубоко в каждую выбранную артерию (артерии), (например, предпочтительно по меньшей мере на 1 см в просвет этого сосуда (сосудов)).

Способы данного изобретения применимы также для предупреждения или ослабления вредного желудочкового ремоделирования в пациенте, который страдает (или может страдать) от инфаркта мио

- 11 008538 карда. Опять вектор, содержащий трансген, кодирующий ангиогенный белок или пептид, предпочтительно функционально связанный с промотором для экспрессии этого гена, доставляют к сердцу пациента, где этот трансген экспрессируется и вредное желудочковое ремоделирование ослабляется.

Трансгены, кодирующие ангиогенные белки и пептиды

В данном изобретении могут использоваться один или несколько трансгенов, кодирующих ангиогенный белковый или пептидный фактор, который может усиливать кровоток и/или контрактильную функцию. Любой белок или пептид, проявляющий ангиогенную активность, измеримую способами, описанными здесь и в данной области, может потенциально использоваться в связи с данным изобретением. Ряд таких ангиогенных белков являются известными в данной области и новые формы идентифицируются рутинно. Примерами подходящих ангиогенных белков или пептидов являются члены семейства фибробластных факторов роста (РСР), васкулярные эндотелиальные факторы роста (УБОЕ), тромбоцитарные факторы роста (РОСЕ), инсулиноподобные факторы роста (1СР) и другие. Члены семейства РСР включают в себя, но не ограничиваются ими, аЕСЕ (РСР-1), ЬЕСЕ (РСР-2), РСР-4 (также известный как Й8!/К83), ЕСЕ-5, ЕСЕ-6. Было показано, что УЕСЕ экспрессируется миоцитами сердца в ответ на ишемию ίη νίίτο и ίη νίνο; он является регулятором ангиогенеза при физиологических условиях, а также во время адаптивной реакции к патологическим состояниям (Ваши е! а1. ΟΐΌΐι1ηΙίοη 89:2183-2189, 1994). Семейство УЕСЕ включает в себя, но не ограничивается ими, члены подсемейства УЕСЕ-А (например, УЕСЕ-121, УЕСЕ-145, УЕСЕ-165, УЕСЕ-189 и УЕСЕ-206), а также члены подсемейства УЕСЕ-В (например, УЕСЕ-167 и УЕСЕ-186) и подсемейства УЕСЕ-С. РОСЕ включает в себя, например, РОСЕ А и РОСЕ В, а 1СЕ включает в себя, например, 1СЕ-1. Другие ангиогенные белки и пептиды известны в данной области и регулярно идентифицируются новые. Нуклеотидные последовательности генов, кодирующих эти и другие белки, и соответствующие аминокислотные последовательности также известны в данной области (см., например, базу данных последовательностей СеηВаηк).

Ангиогенные белки и пептиды включают в себя предшественники пептидов, которые посттрансляционно процессируются в активные пептиды, и производные и функциональные эквиваленты ангиогенных белков и пептидов. Производные ангиогенного белка или пептида являются пептидами, имеющими сходную аминокислотную последовательность и сохраняющими, до некоторой степени, одну или несколько активностей родственного ангиогенного белка или пептида. Как хорошо известно специалистам с квалификацией в данной области, применимые производные обычно имеют значительное сходство последовательностей (на уровне аминокислот) в районах или доменах белка, связанных с ангиогенной активностью. Подобным образом, специалистам в данной области будет вполне понятно, что под функциональным эквивалентом подразумевается белок или пептид, который имеет активность, которая может заменять одну или несколько активностей конкретного ангиогенного белка или пептида. Предпочтительные функциональные эквиваленты сохраняют все активности конкретного ангиогенного белка или пептида; однако функциональный эквивалент может иметь активность, которая, при количественном измерении, является более сильной или более слабой, чем активность пептида или белка дикого типа.

В отношении подробностей, касающихся семейства ЕСЕ, см., например, Вигдезз, Αηη. Ν.Υ. Асаб. δα. 638: 89-97, 1991; Вигдезз е! а1. Аппи. Нет. Вюсйет. 58:575-606, 1989; МиЫйаизег е! а1., Нит. Сене ТКег. 6: 1457-1465, 1995; /Кап е! а1., Μο1. Се11. Вю1., 8: 3487, 1988; δοάάοη е! а1., Апп. Ν.Υ. Асаб. δα. 638: 98-108, 1991. В отношении йз1/К83 человека (т.е. ЕСЕ-4), см. Тапа е! а1., Ргос. №!1. Асаб. δα. И8А 84: 2980-2984, 1087. В отношении белка УЕСЕ-А человека, см., например, Т1зсйег е! а1. 1. Βίο1. СКет. 206: 11947-11954, 1991, и ссылки в ней; МиЫйаизег е! а1., Спс. Кез. 77: 1077-1086, 1995; и №и£е1б е! а1., АО 98/10071 (12 Магсй 1998). Другие варианты известных ангиогенных белков также были описаны; например, варианты белков УЕСЕ и белков, родственных УЕСЕ, см., например, Вапб е! а1., АО 99/40197, (12 Аидиз! 1999); и ΒοΙιΚη е! а1., АО 98/493300, (5 ШхешЬег 1998). Комбинации ангиогенных белков и векторы доставки генов, кодирующие такие комбинации, описаны в Саο е! а1. υδδΝ 09/607766, П1еб 30 Лше 2000, озаглавленном Эиа1 Не^тЬта! Семе ТКегару Сοтрοз^!^οηз аиб Мебюбз ο£ изе, включенном тем самым ссылкой в полном виде. Как также понятно специалистам в данной области, ангиогенные белки могут стимулировать ангиогенез усилением экспрессии, стабильности или функциональности других ангиогенных белков. Примеры таких ангиогенных белков и пептидов включают в себя, например, регуляторные факторы, которые индуцируют реакцию на гипоксию (например, индуцируемые гипоксией факторы, такие как Н1Е-1, Н1Е-2 и т.п.; см., например, Ашчд е! а1., Ргос. №!1. Асаб. δα. и8А 90(9): 4304-8, 1993; Еο^зуίйе е! а1., Мс1. Се11. Βίο1. 16(9): 4604-13, 1996; δαιιαι/а е! а1., К^еу Ιη!., 51(2): 553-5, 1997; и ΟΚουΤ^ е! а1., Οικο1. Кез., 9(6-7): 327-32, 1997; а также другие регуляторные факторы, такие как, например, факторы, которые индуцируются физиологическими состояниями, связанными с сердечнососудистым заболеванием, такими как воспаление (например, индуцируемая синтаза оксида азота (ίΝΟδ), а также ее конститутивная копия, сNΟδ; см., например, ΥοзЫζит^ е! а1., С1гс. Кез., 73(1): 205-9, 1993; СКабгат е! а1., I. Βίο1. СКет., 269(9): 6765-72, 1994; Рараре!^οрοи1οз е! а1., Ат. I. Ра!йο1., 150(5): 1835-44, 1997; и Ра1тег, е! а1., Ат. I. Рйузю1., 274(2 Р! 1): Б212-9, 1998). Дополнительные примеры таких ангиогенных белков включают в себя некоторые инсулиноподобные факторы роста (например, 1СЕ-1) и ангиопоэтины (Апд), которые, как сообщалось, промотируют и/или стимулируют экспрессию и/или активность других ангиогенных белков, таких как УЕСЕ (см., например, ^аб, е! а1., Еηбοс^^ηο1οду, 137(6):

- 12 008538

2262-68 (1996); Шггеи, е1 а1., 1. Вю1. Скет., 271(46):29483-88 (1996); Рии^а, е1 а1., П1аЬе1ек 46(10): 161926 (1997); и Акакага, е1 а1., С1гс. Кек., 83(3):233-40 (1998) и Вегтои! е1 а1., Ги!. 1. Саисег 85: 117-123, 2000). Подобным образом фактор роста гепатоцитов (также называемый фактором Скеттера), который, как сообщалось, индуцировал образование кровеносных сосудов ш νίνο (см., например, Стаи! е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 90: 1937-1941, 1993), увеличивал, как сообщалось, экспрессию νΕΟΕ (см., например, \¥о|1а е! а1., ЬаЬ. РкекР 79:427-438, 1999). Дополнительные примеры ангиогенных полипептидов включают в себя природные и синтетические регуляторные пептиды (ангиогенные полипептидные регуляторы), которые действуют в качестве промоторов эндогенных ангиогенных генов. Нативные ангиогенные полипептидные регуляторы могут быть получены из индукторов эндогенных ангиогенных генов. Ηί£, описанный выше, является одним из иллюстративных примеров такого ангиогенного гена, который, как сообщалось, промотировал ангиогенез индукцией экспрессии других ангиогенных генов. Синтетические ангиогенные полипептидные регуляторы могут быть сконструированы, например, получением белков, связывающих множественные белки «цинковые пальцы», которые специфически связываются с последовательностями, находящимися слева от кодирующих районов эндогенных ангиогенных генов, и которые могут быть использованы для индукции экспрессии таких эндогенных генов. Исследования многочисленных генов привело к разработке правил для конструирования таких связывающихся с ДНК белков, содержащих цинковые пальцы (см., например, Ккобек аиб К1ид, 8с1еи11Пс Атепсаи, ЕеЬгиагу 1993, рр 56-65; Скоо аиб К1ид, Ргос. №111. Асаб. δα. И8А, 91(23): 11163-7, 1994; КеЬаг аиб РаЬо, 8аеисе, 263(5147): 671-3, 1994; Скоо е! а1., 1. Мо1. Вю1., 273(3): 525-32, 1997; Ротегап/ е! а1., 8аеисе 267: 93-96, 1995; и Ьш е! а1., Ргос. №111. Асаб. δα. И8А, 94: 5525-5530, 1997. Как будет понятно специалисту с квалификацией в данной области, многочисленные дополнительные гены, кодирующие белки и пептиды, обладающие способностью прямо или косвенно промотировать ангиогенез, регулярно идентифицируются, и новые гены будут идентифицированы на основании сходства с известными кодирующими ангиогенный белок или пептид генами или с обнаруживаемой способностью таких генов кодировать белки или пептиды, которые промотируют ангиогенез. Информацию о последовательности для таких генов и кодируемых полипептидов легко получить из баз данных последовательностей, таких как СеиВаик или ЕМВЬ. Полинуклеотиды, кодирующие такие белки, могут быть также получены из библиотек генов, например, с использованием способов ПЦР или гибридизации, являющихся рутинными в данной области.

Предпочтительно, кодирующий ангиогенный белок трансген функционально связан с промотором, который регулирует транскрипцию и экспрессию этого гена в клетке млекопитающего, такой как клетка в сердце или в скелетной мышце. Одним предпочтительным в настоящее время промотором является промотор СМV. В другом предпочтительном варианте, обсуждаемом дополнительно ниже, этим промотором является тканеспецифический промотор, такой как специфический для сердца промотор (например, специфический для кардиомиоцитов промотор). Предпочтительно ген, кодирующий ангиогенный фактор, также функционально связан с сигналом полиаденилирования.

Успех подхода с использованием переноса генов требует как синтеза продукта гена, так и секреции из трансфицированной клетки. Таким образом, ангиогенные белки и пептиды включают в себя белки и пептиды, которые природно секретируются или были модифицированы таким образом, чтобы сделать возможной секрецию, например, посредством функционального связывания с сигнальным пептидом. С этой точки зрения, ген, кодирующий секретируемый ангиогенный белок, например, ЕСЕ-4, ЕСЕ-5 или ЕСЕ-6, является предпочтительным, так как эти белки содержат функциональные секреторные сигнальные последовательности и легко секретируются из клеток. Многие, если не все, белки νΈΌΕ человека (в том числе, но не только, νΈΌΕ-121 и νΈΌΕ-165) также легко секретируются и являются диффундируемыми после секреции. Таким образом, при экспрессии эти ангиогенные белки легко достигают сердечного интерстиция и индуцируют ангиогенез. Кровеносные сосуды, которые развиваются в ангиогенезе, включают в себя капилляры, которые являются кровеносными сосудами самого малого калибра, имеющими диаметр около 8 мкм, и кровеносные сосуды более крупного калибра, которые имеют диаметр по меньшей мере около 10 мкм. Ангиогенная активность может быть определена измерением кровотока, увеличения функции обработанной ткани или присутствием кровеносных сосудов, с использованием процедур, известных в данной области или описанных здесь. Например, число или плотность капилляров могут быть определены количественно в животном визуально или микроскопическим анализом участка ткани (см. пример 5).

В случае других ангиогенных белков, таких как аЕСЕ (ЕСЕ-1) и ЬЕСЕ (ЕСЕ-2), которые не имеют природной секреторной сигнальной последовательности, слитые белки, имеющие секреторные сигнальные последовательности, могут быть рекомбинантно получены с использованием стандартной методологии рекомбинантных ДНК, известной специалисту в данной области. Считается, что как аЕСЕ, так и ЬЕСЕ секретируются природно до некоторой степени; однако включение дополнительной сигнальной последовательности секреции может быть использовано для усиления секреции этого белка. Секреторная сигнальная последовательность обычно расположена при Ν-конце желаемого белка, но может быть помещена в любом положении, подходящем для обеспечения секреции ангиогенного фактора. Например, полинуклеотид, содержащий подходящую сигнальную последовательность, может быть слит 5' (слева) относительно первого кодона выбранного гена ангиогенного белка. Подходящие секреторные сигналь

- 13 008538 ные последовательности включают в себя сигнальные последовательности генов ЕСЕ-4, ЕСЕ-5, ЕСЕ-6 или сигнальную последовательность отличающегося секретируемого белка, например, 1Ь-1-бета. Пример 7 ниже приводит пример одного типа модификации ангиогенного белка для присоединения сигнальной последовательности из другого белка, модификации, достигаемой заменой остатков в ангиогенном белке остатками, которые управляют секрецией этого секретируемого второго белка. Можно использовать сигнальную последовательность, полученную из белка, который обычно секретируется из сердечных миоцитов. Ангиогенные гены могут также обеспечивать дополнительные функции, которые могут улучшать, например, функцию клеток сердца. Например, ЕСЕ может обеспечивать усиливающие сердце и/или защищающие от ишемии действия, которые могут быть независимыми от их способности стимулировать ангиогенез. Таким образом, ангиогенные гены могут быть использованы для усиления функции сердца посредством механизмов, которые являются дополнительными или заменяют стимуляцию ангиогенеза рег зе. В качестве дополнительного примера, 1СЕ, который может промотировать ангиогенез, может также усиливать функцию мышечных клеток (см., например, Мизаго е1 а1., №Щ.1ге 400: 581-585, 1999); а также проявлять антиапоптотические эффекты (см., например, Ьее е1 а1. Еп0осппо1оду 140: 4831-4840, 1999). Другие белки, которые усиливают функцию клеток мышц, могут также применяться в соответствии со способами данного изобретения.

Как отмечалось выше, гены, кодирующие один или несколько ангиогенных белков или пептидов, могут быть использованы в сочетании с данным изобретением. Таким образом, ген или гены, кодирующие комбинацию ангиогенных белков или пептидов, могут доставляться с использованием одного или нескольких векторов в соответствии со способами, описанными здесь. Семейства ангиогенных генов, описанных здесь и в литературе в данной области, содержат многочисленные примеры таких генов. Предпочтительно, при использовании такой комбинации, гены могут быть получены из различных семейств ангиогенных факторов (например, комбинации, выбранной из двух или нескольких различных членов группы, состоящей из ЕСЕ, VΕСЕ, РОСЕ и 1СЕ). Для отдельной иллюстрации такой комбинации можно использовать вектор, содержащий ген ЕСЕ и ген VΕСЕ. В качестве иллюстративного примера, авторы использовали комбинацию гена ЕСЕ (ЕСЕ-4-фрагмента 140) (см., например, ген ЕСЕ-4 и его варианты, описанные ВазШсо е1 а1., в патенте США с номером 5459250, выданном 17 октября 1995 г., и родственные случаи), и вариант гена VΕСЕ (мутеина 2 VΕСЕ-145) (см., например, ген VΕСЕ-145 и его варианты, описанные №и£еИ е1 а1., АО 98/10071, опубликованный 12 марта 1998 г., и родственные случаи). Такие комбинации могут проявлять аддитивные и/или синергические действия. Многочисленные другие комбинации будут очевидными для специалистов с квалификацией в данной области, на основании этих описаний. Векторы, содержащие ангиогенные гены или комбинации ангиогенных генов, в соответствии с данным изобретением, могут также включать в себя один или несколько других генов, которые могут быть использованы для дополнительного усиления кровотока ткани и/или контрактильной функции. В сердце, например, гены, кодирующие бета-ΑδΡ (описанные Наттоиб е1 а1., в ожидающих одновременного рассмотрения заявках АО 98/10085, опубликованных 12 марта 1998 г.), могут использоваться в комбинации с одним или несколькими генами, кодирующими ангиогенные белки или пептиды. Другие усиливающие сердечные или мышечные клетки белки могут быть подобным образом включены в композиции и способы данного изобретения.

Комбинации генов, которые могут быть использованы в соответствии с данным изобретением, могут быть обеспечены в едином векторе (например, в виде отдельных генов, каждый из которых находится под контролем промотора, или в виде единого транскрипционно или трансляционно слитого гена). Комбинации генов могут быть также обеспечены в виде комбинации векторов (которые могут быть произведены из одного и того же или различных векторов, такой как комбинация аденовирусных векторов или комбинация аденовирусного вектора и аденоассоциированного (ΑΑν) вектора); которые могут вводиться пациенту одновременно или последовательно. В случае аденовируса (Αά) и аденоассоциированного вируса (ΑΑν), присутствие Αά, который обычно является хелперным вирусом для ΑΑν, может усиливать способность ΑΑν опосредовать перенос гена. Таким образом, Αά-вектор может быть введен одновременно с введением ΑΑν-вектора или перед введением ΑΑν-вектора, в соответствии с данным изобретением. Кроме эффективности трансфекции на выбор вектора влияет также желаемая продолжительность экспрессии трансгена. В качестве иллюстрации, поскольку многие ангиогенные гены могут вызывать долгосрочные эффекты без необходимости долгосрочной экспрессии (например, инициированием или облегчением процесса ангиогенеза, который приводит к увеличению васкуляризации ткани), ангиогенные гены могут вводиться с использованием аденовируса (или иного вектора, который обычно не интегрируется в ДНК хозяина), который может использоваться перед введением ΑΑν-вектора, или в комбинации с введением ΑΑν-вектора, несущего трансген, для которого желательной является более долгосрочная экспрессия (например, трансген бета-ΑδΡ). Другие комбинации трансгенов и/или векторов будут очевидными специалистам в данной области на основании объяснений и иллюстраций данного изобретения.

Для лечения людей гены, кодирующие ангиогенные белки человеческого происхождения, являются предпочтительными, хотя могут также использоваться ангиогенные белки, происходящие из других млекопитающих, которые проявляет перекрестную межвидовую активность, т. е. имеют ангиогенную актив

- 14 008538 ность в людях.

Векторы для доставки генов ΐη νίνο

Обычно представляющий интерес ген переносят к сердцу или к периферической сосудистой сети ίη νίνο и он управляет продуцированием кодируемого белка. Предпочтительно такое продуцирование является конститутивным (хотя могут использоваться также индуцируемые системы экспрессии).

Векторы, применимые в данном изобретении, включают в себя вирусные векторы, векторы на основе липидов (например, липосомы) и другие векторы, которые способны доставлять ДНК к неделящимся клеткам ίη νίνο. Предпочтительными в настоящее время являются вирусные векторы, в частности, дефектные по репликации вирусные векторы, в том числе, например, дефектные по репликации аденовирусные векторы и аденоассоциированные вирусные векторы. В отношении легкости получения и применения в данном изобретении, дефектные по репликации аденовирусные векторы являются в настоящее время наиболее предпочтительными. Аденовирус эффективно инфицирует неделящиеся клетки и, следовательно, применим для экспрессии рекомбинантных генов в миокарде, вследствие нерепликативной природы сердечных миоцитов.

Различные другие векторы, пригодные для генотерапии ίη νίνο, могут легко применяться для доставки трансгенов ангиогенных белков для использования в данном изобретении. Такие другие векторы включают в себя другие вирусные векторы (такие как АЛУ), невирусные «платформы» доставки, а также векторы на основе липидов (такие как липосомы, мицеллы, липидсодержащие эмульсии и другие, которые были описаны в данной области). Что касается ААУ-векторов, как известно в данной области, они являются предпочтительно дефектными по репликации в людях, такие как, например, ААУ-векторы, имеющие удаленные гены гер и сар (последовательность которых должна, следовательно, поставляться ίη 1ган5 для репликации и упаковки ААУ-векторов, обычно в пакующей клеточной линии), и инсертированный трансген (включающий в себя, например, промотор, функционально связанный с ним) предпочтительно фланкирован инвертированными концевыми повторами (ΙΤΚ) ААУ.

Рекомбинантные вирусные векторы содержат один или несколько генов или последовательностей. Поскольку многие вирусные векторы проявляют связанные с размерами ограничения в связи с упаковкой и поскольку дефектные по репликации вирусные векторы являются обычно предпочтительными для доставки ίη νίνο, гетерологичные гены или последовательности обычно вводят путем замены одной или нескольких частей вирусного генома. Такие вирусы могут становиться дефектными по репликации вследствие делеций, что требует того, чтобы делетированная функция (функции) обеспечивались ίη 1ган5 во время репликации вируса и инкапсидации (с использованием, например, хелперного вируса или пакующей клеточной линии, несущей гены, необходимые для репликации и/или инкапсидации) (см., например, ссылки и иллюстрации ниже). Как утверждалось выше, модифицированные ААУ-векторы, в которых трансгены вставляют вместо вирусных генов гер и сар, также хорошо известны в данной области. Подобным образом, модифицированные вирусные векторы, в которых доставляемый полинуклеотид расположен снаружи вирусной частицы, также были описаны (см., например, Сипе1, ΌΤ, е! а1. ΡΝΆδ 88:88508854, 1991). Ссылки, описывающие эти и другие векторы доставки генов, известны в данной области, и ряд из них цитируются здесь.

Как описано выше и в цитируемых ссылках, векторы могут также содержать другие компоненты или функциональные группы, которые дополнительно модулируют доставку гена и/или экспрессию гена, или которые иным образом обеспечивают выгодные свойства клеткам-мишеням. Такие другие компоненты включают в себя, например, компоненты, которые влияют на связывание или на нацеливание на клетки (в том числе компоненты, которые опосредуют тип клеток или тканеспецифическое связывание); компоненты, которые влияют на поглощение вектора клеткой; компоненты, которые влияют на процессинг и/или локализацию вектора и его нуклеиновой кислоты в клетке после поглощения (такие как агенты, опосредующие внутриклеточный процессинг и/или ядерную локализацию); и компоненты, которые влияют на экспрессию полинуклеотида. Такие компоненты могут также включать в себя маркеры, например, детектируемые и/или селектируемые маркеры, которые могут быть использованы для детектирования или отбора клеток, которые поглотили и экспрессируют нуклеиновую кислоту, доставляемую данным вектором. Такие компоненты могут быть обеспечены в виде природного признака вектора (например, путем применения определенных вирусных векторов, которые имеют компоненты или функциональности, опосредующие связывание и поглощение), или векторы могут быть модифицированы для обеспечения таких функциональностей. Детектируемый маркерный ген позволяет специфически детектировать клетки, несущие ген, подлежащий специфическому детектированию (например, делает возможным отличение от клеток, которые не несут маркерный ген). Одним примером такого детектируемого маркерного гена является ген 1ас2, кодирующий бета-галактозидазу, который позволяет детектировать клетки, трансдуцированные вектором, несущим ген 1ас2, с использованием окрашивания, как описано ниже. Селектируемые маркеры могут быть позитивными, негативными или бифункциональными. Позитивные селектируемые маркеры делают возможным отбор на клетки, несущие маркер, тогда как негативные селектируемые маркеры позволяют селективно элиминировать клетки, несущие маркер. Было описано большое разнообразие таких маркерных генов, в том числе бифункциональные маркеры (т.е. позитивные/негативные) (см., например, БирШи. §., νΟ 92/08796, риЫ18Йеб 29 Мау 1992; и БирШи. §.,

- 15 008538 νθ 94/28143, рнЬНккеб 8 ЭесетЬег 1994). Такие маркерные гены могут обеспечивать дополнительную меру контроля, которая может быть выгодной в контекстах генотерапии. Большое разнообразие таких векторов известно в данной области, и они обычно являются доступными (см., например, различные цитированные выше ссылки).

Работы, описывающие аденовирусные векторы и другие вирусные векторы, которые могут быть использованы в способах данного изобретения, включают в себя следующие ссылки: ИппуИ/, М.З., Абепоушбае апб Ткей Керйсайоп, ш Е1е1бк, В., е! а1., (ебк.) УиЫоду, Уо1. 2, Кауеп Ргекк №еу Уогк, рр. 16791721, 1990); Сгакат, Е., е! а1., рр. 109-128 ш Ме!кобк ш Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 7: Сепе ТгапкГег апб Ехргеккюп Рго!осо1к, Миггау, Е. (еб.), Нитапа Ргекк, Сййоп, N.1. (1991); МШег, №., е! а1., ЕАЗЕВ 1оита1 9: 190-199, 1995; 8скге1ег, Н, Ркагтасеийса Ас!а НеКекае 68: 145-159, 1994; 8скпе1бег апб Егепск, Сйси1айоп 88:1937-1942, 1993; Сипе1 Ό.Τ., е! а1., Нитап Сепе Ткегару 3: 147-154, 1992; Сгакат, Е.Ь., е! а1., νθ 95/00655 (5 1апиагу 1995); Еа1ск-Ребегкеп, Е.З., νθ 95/16772 (22 ,1ипе 1995); Оепейе, Р. е! а1., νθ 95/23867 (8 8ер!етЬег 1995); Наббаба, Н. е! а1., νθ 94/26914 (24 №огетЬег 1994); Ретсаибе!, М. е! а1., νθ 95/02697 (26 1апиагу 1995); 2капд, ν., е! а1., νθ 95/25071 (12 Ос!оЬег 1995). Различные аденовирусные плазмиды также доступны из коммерческих источников, в том числе, например, МюгоЫх Вюкук!етк о£ Тогоп!о, ОгИапо (см., например, МюгоЫх Ргобис! ЫГогтакоп Зкее!: Р1акт1бк £ог Абепоу1гик Уес!ог Сопкйисйоп, 1996). Различные дополнительные аденовирусные векторы и способы для их получения и очистки регулярно идентифицируются.

Дополнительные ссылки, описывающие ААУ-векторы, которые могли бы использоваться в способах данного изобретения, включают в себя следующие: Сайег, В., НапбЬоок о£ Рагуоу1гикек, уо1. 1, рр. 169-228, 1990; Вегпк, Уйо1оду, рр. 1743-1764 (Кауеп Ргекк 1990); Сайег, В., Сигг. Орт. Вю!ескпо1., 3: 533539, 1992; Михусхка, №., Сиггеп! Торюк т М1сгоЫо1оду апб 1ттипо1оду, 158: 92-129; Е1о!!е, Т.К., е! а1., Ат. Ш. Кекр1г. Се11 Мо1. Вю1. 7: 349-356, 1992; Скайедее е! а1., Апп. ΝΥ Асаб. 8ск, 770: 79-90, 1995; Е1о!!е, Т.К., е! а1., νθ 95/13365 (18 Мау 1995); Тгетре, 1.Р., е! а1., νθ 95/13392 (18 Мау 1995); Койп, К., Нитап Сепе Ткегару, 5: 793-801, 1994; Койп е! а1., νθ 98/11244 (19 Магск 1998); Койп е! а1., νθ 99/61601 (2 ОесетЬег 1999); Е1о!!е, Т.К., е! а1., Сепе Ткегару 2:357-362, 1995; А11еп, 1.М., νθ 96/17947 (13 1ипе 1996); и Эи е! а1., Сепе Ткегар1е 3: 254261, 1996. Различные дополнительные ААУ-векторы и способы для их получения и очистки регулярно идентифицируются.

Как описано выше и в научной литературе, ряд произведенных из ретровируса систем также были разработаны для применения в доставке генов ш у1уо. В качестве иллюстрации род лентивирус ретровирусов (например, вирус иммунодефицита человека, вирус иммунодефицита кошачьих и т.п.) может быть модифицирован таким образом, что эти вирусы способны трансдуцировать клетки, которые обычно являются неделящимися (см., например, РоексЫа е! а1., РNА8 96:11395-11399, 1996; №а1бйи е! а1., РNА8 96:11382-11388, 1996; №а1бЫ1 е! а1., ЗЫепсе 272:263-267, 1996; Зйшуакакитаг е! а1., 1. Уйо1. 71:5841-5848, 1997; 2ийегеу е! а1., №11. Вю!ескпо1. 15: 871-875, 1997; К1т е! а1., 1. У1го1. 72: 811-816, 1998; М1уокк1 е! а1.,

1. У1го1. 72:8150-8157, 1998; см. также Висккскаскег е! а1., В1ооб 15:2499-2504, 2000; см. также Тке За1к 1пк!йи!е, ν097/12622 (10 Арп1 1997)). Хотя лентивирусные векторные системы на основе ВИЧ заставили в некоторой степени сфокусировать внимание в этом отношении, недавно были разработаны другие лентивирусные системы, такие как лентивирусные векторные системы на основе вируса иммунодефицита кошачьих, которые предоставляют потенциальные преимущества над системами на основе ВИЧ (см., например, РоексЫа е! а1., №а! Меб. 4:354-357, 1998; 1окпк!оп е! а1., 1. У1го1. 73: 2491-2498, 1999; и 1окпк!оп е! а1., 1. У1го1. 73: 4991-5000, 1999; см. также обзор Котапо е! а1., З!ет Се11к 18:19-39, 2000 и рассматриваемые в нем ссылки).

Кроме вирусных векторов, известны также и продолжают разрабатываться невирусные векторы, которые могут быть использованы в качестве средств доставки генов. Например, в данной области были описаны не-вирусные носители (платформы) доставки на основе белка, например, макромолекулярные комплексы, содержащие ДНК-связывающий белок и носитель или часть молекулы, способные опосредовать доставку генов, а также векторы на основе липидов (например, липосомы, мицеллы, липидсодержащие эмульсии и другие). Ссылки, описывающие не-вирусные векторы, которые могли бы быть использованы в способах данного изобретения, включают в себя следующие: Ьеб1еу, ЕО, Нитап Сепе Ткегару 6: 1129-1144, 1995; МШег, №., е! а1., ЕАЗЕВ 1оита1 9: 190-199, 1995; Скопп, А., е! а1., Сигг. Орт. т Вю!еск. 6: 698-708, 1995; 8скойе1б, кР., е! а1., ВгЫкк Меб. Ви11. 51: 56-71, 1995; Впдкат, К.Ь., е! а1., 1. Ырокоте Кек. 3: 31-49, 1993; Впдкат, К.Ь., VО 91/06309 (16 Мау 1991); Ее1дпег, Р.Ь., е! а1., VО 91/17424 (14 №оуетЬег 1991); 8о1обт е! а1., ВюскетЕйу 34: 13537-13544, 1995; VО 93/19768 (14 Ос!оЬег 1993); ЭеЬк е! а1., VО 93/125673; Ее1дпег, Р.Ь., е! а1., И.8. Ра!еп! 5264618 (№оуетЬег 23, 1993); Ерапб, К.М., е! а1., и.З. Ра!еп! 5283185 (ЕеЬгиагу 1, 1994); Сао е! а1., VО 96/22765 (1 Аидик! 1996); СеЬеуеки е! а1., И.8. Ра!еп! 5334761 (Аидик! 2, 1994); Ее1дпег, Р.Ь., е! а1., И.8. Ра!еп! 5459127 (Ос!оЬег 17, 1995); Оуеге11, Κ.ν., е! а1., VО 95/28494 (26 Ос!оЬег 1995); 1еккее, VО 95/02698 (26 1апиагу 1995); Насек апб Сюсагопе, VО 95/17373 (29 Ыпе 1995); Ьт е! а1., VО 96/01840 (25 1апиагу 1996). Были идентифицированы многочисленные дополнительные опосредованные липидами векторы доставки генов т у1уо и кофакторы векторной доставки (см., например, Ко11еп е! а1., Нит. Сепе Ткег. 10:615-22, 1999; Коу е! а1., №а!. Меб. 5:387-391; Еа)ас е! а1., Нит. Сепе Ткег. 10:395-406, 1999; ОсЫуа е! а1., №а!. Меб. 5:707-710, 1999). Дополнительно была опи

- 16 008538 сана разработка систем, которые комбинируют компоненты вирусных и невирусных систем доставки генов и могут быть использованы здесь (см., например, РБШр е! а1., Мо1. Се11 ΒίοΙ., 14: 2411-2418, 1994; см. также Ωί №со1а е! а1., Нит. Сепе ТНег. 10:1875-1884, 1999). Различные дополнительные не-вирусные векторы доставки генов и способы для их получения и очистки регулярно идентифицируются.

Как описано выше, эффективность доставки генов с использованием вектора, такого как вирусный вектор, может увеличиваться доставкой этого вектора в кровеносный сосуд, такой как артерия, или в ткань, которую пре-инфузируют и/или ко-инфузируют вазоактивным агентом, например, гистамином или агонистом гистамина, или белком васкулярного эндотелиального фактора роста (УЕСЕ), как описано здесь и дополнительно иллюстрируется в находящейся в процессе одновременного рассмотрения заявке РСТ \νϋ 99/40945, опубликованной 19 августа 1999 г. Другим примером вазоактивного агента, который может быть использован для увеличения эффективности доставки гена, является донор оксида азота, такой как нитропруссид натрия. Наиболее предпочтительно, вазоактивный агент инфузируют в кровеносный сосуд или ткань одновременно с введением вектора и/или за несколько минут перед введением вектора. Вазоактивный агент, в применении здесь, обозначает природное или синтетическое вещество, которое индуцирует увеличенную проницаемость сосудов и/или усиливает перенос макромолекул, таких как векторы доставки генов, из кровеносных сосудов, например, через эндотелий капилляров. Посредством увеличения проницаемости для макромолекул или иным образом облегчения переноса макромолекул в капиллярное ложе, перфузируемое артерией, вазоактивные агенты могут усиливать доставку этих векторов к районам-мишеням и, следовательно, усиливать общую экспрессию трансгена в тканимишени. Авторы данного изобретения использовали гистамин в качестве вазоактивного агента, и было обнаружено, что он существенно усиливает доставку вектора к инфузируемому району, такому как миокард. Производные и агонисты гистамина, такие, которые взаимодействуют с рецепторами гистамина Н, которые могут быть использованы, включают в себя, например, 2-метилгистамин, 2-пиридилэтиламин, бетагистин и 2-тиазолилэтиламин. Эти и другие агонисты гистамина описаны, например, в Саткоп 1С, Сообтап апб Сйтап'к Тйе Рйагтасо1одюа1 ΒοΟδ οί Тйегареибск (8'¹' Еб: Сбтап А.С., Кай Τ.ν., Мек А.8., Тау1ог Р., ебк) Регдатоп Ргекк, 1990, рр 575-582 и других фармакологических научных трудах. Кроме гистамина и агонистов гистамина, которые могут быть использованы в качестве вазоактивных агентов, васкулярные эндотелиальные факторы роста (УЕСЕ) и агонисты УЕСЕ (как описано здесь и в цитируемых ссылках) могут также индуцировать увеличенную проницаемость сосудов и, следовательно, могут быть использованы в качестве вазоактивного агента для усиления доставки генов в контексте описанных здесь композиций и способов. Как и в случае гистамина, УЕСЕ предпочтительно инфузируют в кровеносный сосуд, снабжающий кровью участок-мишень, на протяжении нескольких минут перед инфузией вектора. Доноры оксида азота, такие как нитропруссид натрия (8№), могут также использоваться в качестве вазоактивных агентов. Предпочтительно, донор оксида азота (например, 8№) преинфузируют в участокмишень (или в кровеносный сосуд, снабжающий ткань-мишень) за несколько минут перед моментом инфузии векторной композиции и продолжают инфузировать до момента инфузии векторной композици. Введение может также продолжаться во время инфузии векторной композиции.

Приводимый в качестве примера аденовирусный вектор, который является независимым от хелпера и дефектным по репликации в человеке

Обычно представляющий интерес ген переносится в сердце или в периферическую сосудистую сеть, ш у1уо, и регулирует продуцирование кодируемого белка. Возможны несколько различных подходов к переносу генов. В настоящее время предпочтительной является хелпер-независимая репликационно-дефектная система на основе аденовируса 5 человека (Аб5). С использованием единственной интракоронарной инъекции (инъекции в коронарные сосуды) такой системы на основе рекомбинантного Аб5 авторы данного изобретения показали значительную трансфекцию миокардиальных клеток ш у1уо (Сюгбаио апб Наштопб, С1ш. Кек., 42:123А, 1994). Нерепликативные рекомбинантные аденовирусные векторы являются особенно применимыми в трансфекции коронарного эндотелия и сердечных миоцитов, приводя к высокоэффективной трансфекции после интракоронарной инъекции. Аденовирусные векторы могут быть также использованы для трансфекции ткани, снабжаемой периферической сосудистой сетью, например, с использованием интраартериальной или прямой инъекции.

Как показано здесь, хелпер-независимая репликационно-дефектная система аденовируса 5 человека может быть использована для эффективной трансфекции большого процента миокардиальных клеток ш У1уо посредством единственной интракоронарной инъекции. Авторы также показали, что такой способ доставки может быть использован для эффективного нацеливания векторов на миокард крупного сердца млекопитающих. Дополнительные способы нацеливания векторов на конкретные клетки или типы тканей описаны ниже и в литературе в данной области.

В различных описанных ниже иллюстрациях используемые рекомбинантные аденовирусные векторы основаны на аденовирусе 5 человека (описанном МсСгогу ν.1. е! а1., Упо1оду 163:614-617, 1988), который лишен необходимых ранних генов из генома аденовируса (обычно Е1А/Е1В) и, следовательно, неспособен реплицироваться, если он не растет в пермиссивных клеточных линиях, которые обеспечивают продукты отсутствующих генов ш 1гаи8. Вместо отсутствующих аденовирусных геномных последовательностей, представляющий интерес трансген может быть клонирован и экспрессирован в тка

- 17 008538 ни/клетках, инфицированных репликационно-дефектным аденовирусом. Обычно, перенос генов на основе аденовируса не приводит к стабильной интеграции в геном клетки-мишени. Однако, аденовирусные векторы могут размножаться с высоким титром и трансфицировать нереплицирующиеся клетки; и, хотя трансген не передается дочерним клеткам, это является пригодным для переноса гена в дифференцированные (зрелые) сердечные миоциты, которые не делятся активно. Ретровирусные векторы обеспечивают стабильный перенос генов, и в настоящее время получены высокие титры посредством псевдотипирования ретровирусов (Витк, е! а1., Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8с1. И8А, 90: 8033-8037, 1993), но применяемые в настоящее время ретровирусные векторы обычно неспособны к эффективной трансдукции нереплицирующихся клеток (например, сердечных миоцитов). Кроме того, потенциальные опасности включения трансгена в ДНК хозяина являются неоправданными, если достаточным является кратковременный перенос гена.

Действительно, авторы изобретения показали, что ограниченная продолжительность в экспрессии ангиогенного белка является достаточной для существенного улучшения кровотока и функции ишемической ткани (см. примере 5). Таким образом, временный перенос гена является терапевтически достаточным для лечения таких сердечно-сосудистых заболеваниий. В пределах 14 дней после переноса гена РОР-5 в миокард кровоток к ишемическому ложу увеличивался в два раза и этот эффект сохранялся в течение по меньшей мере 12 недель (пример 5 и фиг. 8). Увеличенный кровоток коррелировал с увеличением числа капилляров в сердце (см. пример 5). Утолщение стенки также увеличивалось в пределах двух недель после переноса гена и сохранялось в течение по меньшей мере 12 недель. Таким образом, ген ангиогенного фактора не должен присутствовать в инфицированной клетке в течение более, чем нескольких недель, для получения терапевтического действия. Как только развивались кровеносные сосуды, продолжающаяся экспрессия экзогенного ангиогенного белка могла не требоваться для поддержания новой сосудистой структуры и увеличенного кровотока.

Преимущество, связанное с неделящимися клетками, такими как моноциты, заключается в том, что вирусный вектор не разбавляется легко делением клеток хозяина. Однако, если это необходимо или желательно для дополнительного увеличения продолжительности экспрессии трансгена в сердце, можно использовать различные аденовирусные векторы второй генерации, которые имеют делеции как Е1, так и Е4, которые могут быть использованы вместе с введением циклофосфамида (см., например, ϋαί е! а1., Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8а. И8А, 92: 1401-1405, 1995).

Клетки 293 человека (Ассеккюп Νο. АТСС СВЫ573; ВоскуШе, МО), которые являются клетками почек эмбриона человека, трансформированными генами Е1А/Е1В аденовируса, являются примером применимых пермиссивных клеточных линий для получения таких репликационно-дефектных векторов. Однако могут быть также использованы другие клеточные линии, которые позволяют репликационнодефектным аденовирусным векторам размножаться в них, например, клетки НеЬа.

Конструирование рекомбинантного аденовирусного вектора

Аденовирусные векторы, используемые в данном изобретении, могут быть сконструированы по способу рекомбинации «спасения», описанному в Отайат, Уйо1оду 163:614-617, 1988. Вкратце, представляющий интерес трансген клонируют в челночный вектор, который содержит промотор, полилинкер и частичные фланкирующие последовательности аденовируса, из которого были делетированы гены Е1А/Е1В. В качестве примера челночного вектора может быть приведена плазмида рАС1 (Упо1оду 163:614-617, 1988) (или ее аналог), которая кодирует части левой стороны генома аденовируса 5 человека (У1то1оду 163:614-617, 1988), минус последовательности Е1А и Е1В, кодирующие ранний белок, которые являются необходимыми для репликации вируса, и плазмида АССМУРЬРА (Сотех-Ешх е! а1., 1. Вю1. Сйет. 267: 25129-25134, 1992), которая содержит полилинкер, промотор СМУ и сигнал полиаденилирования 8У40, фланкированные частичными аденовирусными последовательностями, из которых были делетированы гены Е1А/Е1В. Применение плазмиды рАС1 или АССМУРЬА облегчает процесс клонирования. Затем этот челночный вектор котрансфицируют плазмидой, которая содержит полный геном аденовируса 5 человека с длиной, слишком большой для инкапсулирования, в клетки 293. Котрансфекция может проводиться осаждением фосфатом кальция или липофекцией (Ζ1ιηη§ е! а1., Вю1ес1шк|иек 15:868-872, 1993). Плазмида 1М17 кодирует полный геном аденовируса 5 человека плюс части вектора рВВ322, включающие в себя ген устойчивости к ампициллину (4,3 т.п.н.). Хотя 1М17 кодирует все аденовирусные белки, необходимые для получения зрелых вирусных частиц, она является слишком большой для инкасуляции (40 т.п.н. против 36 т.п.н. для дикого типа). В небольшой субпопуляции котрансфицированных клеток рекомбинация «спасения» между содержащим трансген челночным вектором, например, плазмидой рАС1, и плазмидой, имеющей полный геном аденовируса 5, например, плазмидой р1М17, обеспечивает рекомбинантный геном, который не имеет последовательностей Е1А/Е1В и который содержит представляющий интерес трансген, но вторично теряет дополнительную последовательность, например, последовательности рВВ322, во время рекомбинации, становясь тем самым достаточно малым для инкапсуляции (см. фиг. 1). Что касается описанного выше способа, авторы сообщили успешные результаты (Оютбапо е! а1., С1тси1айоп 88:1-139, 1993 и Сюгбапо апб Наттопб, С1ш. Век. 42:123А, 1994). Запускаемый СМУ кодирующий β-галактозидазу аденовирус НСΜУ8РΠасΖ (С1ш Век 42:123А, 1994) может быть использован для оценки эффективности переноса гена с использованием обработки X- 18 008538 §а1.

Нацеленные векторные конструкции

Ограниченная экспрессия ангиогенного трансгена только в сердце или конкретных типах клеток в сердце (например, сердечных миоцитах) или в других тканях-мишенях, таких как периферическая сосудистая сеть, может обеспечивать определенные преимущества, обсуждаемые ниже.

Данное изобретение рассматривает применение нацеливания не только доставкой трансгена, например, в коронарную артерию или другой тканеспецифический канал, но также с использованием нацеленных векторных конструкций, имеющих признаки, которые имеют тенденцию нацеленной доставки генов и/или экспрессии генов в конкретных клетках-хозяина или типах клеток-хозяина (например, сердечных или иных миоцитах). Таким образом, такие нацеленные векторные конструкции могли бы включать в себя векторы нацеленной доставки и/или нацеленные векторы, описанные более подробно ниже и в публикациях в данной области. Ограничение доставки и/или экспрессии может быть выгодным в качестве средства дополнительного фокусирования потенциальных эффектов генотерапии. Потенциальная применимость дополнительной рестрикции доставки/экспрессии зависит в большой мере от типа используемого вектора и способа и места введения такого вектора. Как описано здесь, наблюдали, что доставка вирусных векторов посредством интракоронарной инъекции к миокарду обеспечивает сама по себе высоконацеленную доставку генов (см. примеры ниже). Кроме того, при использовании векторов, которые обычно не приводят к интеграции трансгена в репликон клетки-хозяина (таких как аденовирусные и многочисленные другие векторы), ожидается, что сердечные миоциты будут проявлять относительно продолжительную экспрессию трансгена, так как эти клетки обычно не реплицируются. В противоположность этому экспрессия быстро делящихся клеток, таких как эндотелиальные клетки, склонна к уменьшению вследствие деления и обновления клеток. Однако, могут использоваться также другие средства ограничения доставки и/или экспрессии, в дополнение или вместо иллюстрированных способов доставки, как описано здесь.

Векторы нацеленной доставки включают в себя, например, векторы (такие как вирусы, невирусные векторы на основе белков и векторы на основе липидов), имеющие поверхностные компоненты (такие как член пары лиганд-рецептор, другая половина которой обнаруживается на клетке-хозяина для нацеливания) или другие признаки, которые опосредуют преимущественное связывание и/или преимущественную доставку гена к конкретным клеткам-хозяина или типам клеток-хозяина. Как известно в данной области, ряд векторов как вирусного, так и невирусного происхождения имеют присущие им свойства облегчения такого преимущественного связывания и/или были модифицированы для выполнения преимущественного нацеливания (см., например, Эондкта е! а1., Ν;·ιΙ. Вю!еск. 14:1574-1578, 1996; Какайага, N. е! а1., 8с1епсе 266:1373-1376, 1994; Мй1ег, Ν., е! а1., ЕА8ЕВ 1оигиа1 9: 190-199, 1995; Скопи, А., е! а1., Сигг. Ορίη. ίη Вю!еск. 6: 698-708, 1995; 8с1юПе1б. 1Р, е! а1., Βπΐίδΐι Меб. Ви11. 51: 56-71, 1995; 8скге1ег, Н, Ркагшасеибса Ас!а Некебае 68: 145-159, 1994; Беб1еу, Ε.Ό., Нит. Сепе Ткег. 6: 1129-1144, 1995; Сопагу, 1.Т., е! а1., АО 95/34647 (21 кесетЬег 1995); Оуеге11, В.А., е! а1., АО 95/28494 (26 Ос!оЬег 1995); и Тгиопд, У.Б. е! а1., АО 96/00295 (4 1апиагу 1996)).

Нацеленные векторы включают в себя векторы (такие как вирусы, невирусные векторы на основе белков и векторы на основе липидов), в случае которых доставка приводит к экспрессии трансгена, которая является относительно ограниченной конкретными клетками-хозяина или типами клеток-хозяина. В качестве иллюстрации, ангиогенные трансгены, доставляемые в соответствии с данным изобретением, могут быть функционально связаны с гетерологичными тканеспецифическими промоторами, с ограничением таким образом экспрессии только клетками в данной конкретной ткани.

Например, тканеспецифические последовательности регуляции транскрипции, полученные из гена, кодирующего специфический для кардиомиоцитов промотор легкой цепи миозина (МБС) или тяжелой цепи миозина, могут быть слиты с трансгеном, например, геном ЕОЕ, в векторе, таком как аденовирусные конструкции, описанные выше. Таким образом, экспрессия этого трансгена может быть относительно ограничена сердечными миоцитами (т.е. будет происходить только в сердечных миоцитах). Определяли эффективность экспрессии гена и степень специфичности, обеспечиваемые специфическими для кардиомиоцитов промоторами МЬС и МНС с 1;κΖ (с использованием рекомбинантной аденовирусной системы, такой как приведенная в качестве примера здесь); и сообщалась специфическая для сердца экспрессия (см., например, Бее е! а1., 1. Вю1. СНет. 267:15875-15885, 1992).

Поскольку промотор МБС может содержать всего лишь около 250 п.н., он легко подходит даже для векторов с ограниченным размером, таких как пакующая система аденовируса-5, приведенная в качестве примера здесь. Промотор тяжелой цепи миозина, который, как известно, является сильным промотором транскрипции, обеспечивает другой альтернативный специфический для сердца промотор, содержащий менее, чем приблизительно 300 п.н. Хотя другие промоторы, такие как промотор тропонина-С, не обеспечивают тканеспецифичности, они являются небольшими и высокоэффективными.

Нацеленная экспрессия генов

Неожиданным открытием данного изобретения является то, что рекомбинантный аденовирус очень эффективно поглощается в первом сосудистом ложе, с которым он встречается. Действительно, в модели животного примера 4 эффективность поглощения этого вируса в сердце после интракоронарной инъек

- 19 008538 ции составляла 98%, т.е. 98% этого вируса удалялась в первом прохождении вируса через миокардиальное сосудистое ложе. Кроме того, сыворотка, взятая из этих животных во время инъекции, была неспособна выращивать вирусные бляшки (бгайат, νίτοίο^γ, 163:614-617, 1988) до разведения в 200 раз, что предполагает присутствие сывороточного фактора (или связывающего белка) который ингибирует размножение вируса. Эти два фактора (эффективное прикрепление вируса первого прохождения и возможность присутствия сывороточного связывающего белка) могут действовать вместе, ограничивая экспрессию первым сосудистым ложем, встреченным вирусом.

Для дальнейшей оценки степени, до которой перенос гена лимитирован сердцем после интракоронарного переноса гена, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) использовали, чтобы наблюдать, было ли доказательство внекардиалыюго присутствия вирусной ДНК спустя две недели после переноса гена, в двух обработанных животных (пример 4 ниже). Животные показали присутствие вирусной ДНК в их сердцах, но не в их сетчатках, скелетных мышцах или печенях. Чувствительность ПЦР является такой, что может детектироваться одна последовательность ДНК на 5000000 клеток. Таким образом, эти данные показали, что вирусная ДНК не присутствовала во внекардиальных тканях спустя две недели после доставки гена. Эти результаты дополнительно подтверждали с использованием других ангиогенных белков и производных, как описано ниже. Эти открытия являются чрезвычайно важными, так как они подтверждают концепцию нацеливания трансгена на сердце (т.е. обеспечения экспрессии трансгена в сердце, а не где-либо в другом месте). Локализованная доставка и экспрессия трансгена обеспечивают преимущество безопасности, дополнительно повышая полезность применения данных способов в лечении пациентов.

Размножение и очистка аденовирусных векторов

Рекомбинантные вирусные векторы, такие как аденовирусные векторы, могут быть очищены из бляшек в соответствии со стандартными способами. В качестве иллюстрации, полученные рекомбинантные аденовирусные векторы могут быть размножены в клетках 293 человека (которые обеспечивают функции Е1А и Е1В ίη Ιηηδ) до титров в предпочтительном диапазоне около 10¹⁰-10¹² вирусных частиц/мл. Способы размножения и очистки были описаны для различных вирусных векторов, и они могут быть использованы вместе с данным изобретением. Здесь в качестве примеров описаны аденовирусные векторы, но могут также применяться другие вирусные векторы, такие как ААУ. Для аденовируса клетки могут быть инфицированы при 80% конфлюентности и собраны спустя 48 ч. После 3 циклов замораживания-оттаивания инфицированных клеток, остатки клеток (дебрис) осаждают центрифугированием и вирус очищают ультрацентрифугированием в градиенте ΟδΟΙ (предпочтительным является двукратное центрифугирование в градиенте ΟδΟΙ). Перед инъекцией ίη νίνο, исходные растворы вирусов могут быть обессолены (например, гель-фильтрацией через колонки Сефарозы, такие как Сефадекс 6-25). Обессоленный исходный раствор вируса может быть также отфильтрован через фильтр 0,3 мкм, если желательно. Авторы обычно концентрируют и очищают исходный раствор вируса двукратным ультрацентрифугированием в градиенте ΟδΟί с последующей хроматографией на Сефадексе 625, с уравновешиванием колонок забуференным фосфатом солевым раствором (ЗФР). Полученный исходный раствор вируса обычно имеет конечный титр вируса, равный по меньшей мере приблизительно 10¹⁰-10¹² вирусных частиц/мл.

Предпочтительно рекомбинантный вирус является высокоочищенным и по существу не содержащим вируса дикого типа (потенциально репликативного). По этим причинам размножение и очистку можно проводить для исключения примесей и вируса дикого типа, например идентификацией успешного рекомбинантного вируса при помощи ПЦР с использованием подходящих праймеров, проведением двух раундов очистки из бляшек и двукратного ультрацентрифугирования в градиенте ΟδΟί.

Доставка векторов, несущих ангиогенный трансген

Средства и композиции, которые используют для доставки векторов, несущих трансгены ангиогенных белков, зависят от конкретного используемого вектора, как хорошо известно в данной области. Однако обычно вектор может быть в форме инъекционного препарата, содержащего фармацевтически приемлемый носитель/разбавитель, такой как, например, забуференный фосфатом солевой раствор. Другие фармацевтические носители, препараты и дозы описаны ниже.

Предпочтительным в настоящее время способом доставки ίη νίνο для заболевания сердца (особенно для векторных конструкций, которые иным образом не нацелены для доставки и/или экспрессии, которая ограничивается миокардом или иной тканью-мишенью), является доставка инъекцией вектора в кровеносный сосуд или другой канал, непосредственно снабжающий кровью миокард или ткань, предпочтительно инъекцией в одну или обе коронарные артерии или другие тканеспецифические артерии (или болюсной инъекцией в периферическую ткань). В качестве примера для доставки к миокарду, такая инъекция достигается предпочтительно катетером, введенным до значительной степени (обычно на по меньшей мере приблизительно 1 см) в просвете одной или обеих коронарных артерий или одного или нескольких трансплантатов подкожных вен или внутренних артерий молочной железы или других каналов, доставляющих кровь к миокарду. Предпочтительно инъекцию выполняют как в левую, так и в правую коронарные артерии для обеспечения общего распределения ко всем районам сердца (например, левую переднюю нисходящую артерию (БАО), левую коронарную артерию (ΕΟχ) и правые). Инъекцией препа

- 20 008538 рата аденовирусного вектора в соответствии с этим. необязательно в комбинации с вазоактивным агентом для усиления доставки гена. как описано здесь. можно выполнять эффективный опосредованный аденовирусом перенос ангиогенного гена для лечения сердечно-сосудистого заболевания. например клинической миокардиальной ишемии или заболевания периферических сосудов. без каких-либо нежелательных эффектов.

Векторы доставляются в количестве. достаточном для того. чтобы данный трансген экспрессировался и обеспечивал терапевтическую пользу. Для вирусных векторов (таких как аденовирус). конечный титр вируса в инъекционном препарате находится предпочтительно в диапазоне около 10⁷-10¹³ вирусных частиц. что делает возможным эффективный перенос гена. Исходный раствор аденовируса. предпочтительно не содержащий вируса дикого типа. может инъецироваться глубоко в просвет одной или обеих коронарных артерий (или трансплантатов). предпочтительно как в правую. так и в левую коронарные артерии (или трансплантаты). и предпочтительно в количестве 10⁹-10³¹ вирусных частиц. как определено оптической денситометрией. Предпочтительно вектор доставляется в виде единственной инъекции в каждый канал (например. в каждую коронарную артерию).

Для дополнительного увеличения локализованной доставки вектора генотерапии и для повышения эффективности доставки гена. в соответствии с данным изобретением. можно инфузировать вазоактивный агент. предпочтительно гистамин или агонист гистамина или белок васкулярного эндотелиального фактора роста (УЕСЕ) или донор оксида азота (например. нитропруссид натрия). в подлежащую лечению ткань. либо одновременно с введением ангиогенного вектора генотерапии. либо за несколько минут до введения этого вектора.

Посредством инъекции векторной композиции непосредственно в просвет коронарной артерии при помощи коронарных катетеров. можно нацелить на ген довольно эффективно и минимизировать потерю рекомбинантных векторов в проксимальную аорту во время инъекции. Этот тип инъекции делает возможной локальную трансфекцию желаемого числа клеток. в частности. сердечных миоцитов. в пораженном миокарде кодирующими ангиогенный белок или пептид генами. максимизируя тем самым терапевтическую эффективность переноса генов и минимизируя нежелательный ангиогенез во внекардиальных районах. Для доставки к заболевшим тканям. снабжаемых кровью периферической сосудистой сетью. вектор может вводиться в одну или несколько артерий. снабжающих кровью такую ткань. или в виде болюсной инъекции в эту ткань.

Векторные конструкции. которые специфически нацелены на миокард. такие как векторы. включающие в себя компоненты миокард-специфического связывания или поглощения. и/или которые включают в себя трансгены ангиогенных белков. которые находятся под контролем миокард-специфических регуляторных последовательностей транскрипции (например. кардимиоцит-специфических промоторов). могут быть использованы вместо таких способов направленной инъекции или. предпочтительно. вместе с такими способами направленной инъекции. в качестве способа дополнительного ограничения экспрессии миокардом (например. желудочковыми миоцитами). Для векторов. которые могут вызывать иммунную реакцию. предпочтительно инъецировать вектор непосредственно в кровеносный сосуд. снабжающий кровью миокард. как описано выше. хотя могут быть использованы дополнительные способы для ограничения внекардиальной доставки или иным образом уменьшения потенциальной возможности иммунной реакции. Могут быть также использованы векторы. нацеленные на ткани. снабжаемые кровью периферической сосудистой сетью. такие как векторы. нацеленные на скелетную мышцу. или могут использоваться также промоторы. специфически экспрессируемые в скелетной мышце.

Как описано подробно ниже. было продемонстрировано. что с использованием способов данного изобретения для доставки ίη νίνο вирусного вектора. содержащего ангиогенный трансген. экспрессия этого трансгена не происходила в гепатоцитах. и вирусная РНК не могла быть обнаружена в моче в любое время после интракоронарной инъекции. Кроме того. не могло быть обнаружено доказательство внекардиальной экспрессии в глазу. печени или скелетной мышце при помощи ПЦР спустя две недели после интракоронарной доставки трансгенов таким образом.

Различные катетеры и пути доставки могут быть использованы для достижения интракоронарной доставки. как известно в данной области (см.. например. цитированные выше ссылки. в том числе: Τοροΐ. Е.Е (еб.). Тйе Тех(Ьоок о£ 1п(ег\^геп(юпа1 Сагбю1оду. 2пб Еб. (\У.В. Баипбегк Со. 1994); КиШейогб. К.В.. Уакси1аг Бигдегу. 3гб Еб. (\У.В. Баипбегк Со. 1989); Тйе Сес11 Тех(Ьоок о£ Мебкше. 19(11 Еб. (\У.В. 1992); и БаЫк!оп. Ό.. Тйе Тех(Ьоок о£ Бигдегу. 14(11 Еб. (\У.В. 1991)). Прямая интракоронарная (или в трансплантированный сосуд) инъекция может быть выполнена с использованием стандартного подкожного катетера на основе способов. проводимых при флуороскопическом контроле направления катетера. Любое разно образие коронарных катетеров или перфузионный катетер Стека. например. могут быть использованы в данном изобретении. Например. различные катетеры общего назначения. а также модифицированные катетеры. пригодные для применения в данном изобретении. доступны из коммерческих фирмпоставщиков. таких как Αбνаηсеб Сагб^акси1аг Бук(етк (АСБ). Тагде! Тйегареибск. Вок(оп БаепбПс и Согб18. В том случае. когда доставка в миокард достигается инъекцией непосредственно в коронарную артерию (что является в настоящее время наиболее предпочтительным). может быть также использован ряд подходов для введения катетера в коронарную артерию. как известно в данной области. В качестве

- 21 008538 примера, катетер может быть удобным образом введен в бедренную артерию и пройдет ретроградно (назад) через подвздошную артерию и брюшную аорту и в коронарную артерию. Альтернативно, катетер может быть сначала введен в плечевую артерию или сонную артерию и пройдет ретроградно в коронарную артерию. Капиллярное ложе миокарда может быть также достигнуто ретроградной перфузией, например, из катетера, помещенного в коронарный синус. Такой катетер может также использовать проксимальный баллон для предупреждения или уменьшения направленного вперед потока в качестве средства облегчения направленной назад перфузии. Для доставки к тканям, снабжаемым кровью периферической сосудистой сетью, катетеры могут вводиться в артерии, снабжающие кровью такие ткани (например, бедренные артерии в случае ноги), или могут вводиться, например, болюсной инъекцией или инфузией в пораженную ткань.

Различные комбинации векторов, содержащих ангиогенные гены, и катетеров или других приспособлений для доставки ίη νίνο (например, других приспособлений, способных вводить фармацевтическую композицию, обычно в забуференном растворе, в кровеносный сосуд или в мышцу) могут быть включены в наборы для применения в соответствии с данным изобретением. Такие наборы могут также содержать один или несколько вазоактивных агентов для усиления доставки генов и могут дополнительно включать в себя инструкции, описывающие их применение в соответствии с любым из способов, описанных здесь.

Модели животных

Важными предпосылками для успешных исследований сердечно-сосудистой генотерапии являются (1) генетическая конституция модели животного, которое применимо для клинического сердечнососудистого заболевания, которая может обеспечить полезные данные в отношении механизмов для увеличенного кровотока и/или контрактильной функции, и (2) точная оценка эффектов переноса генов. С этой точки зрения, ни один из более ранних способов не является удовлетворительным. Таким образом, авторы изобретения использовали свиные модели, которые удовлетворяют этим предпосылкам. Свинья является особенно подходящей моделью для исследования заболеваний сердца человека вследствие ее близости (релевантности) относительно физиологии человека. Сердце свиньи похоже на сердце человека по следующим признакам. Свинья имеет природное коронарное кровоснабжение, очень сходное с коронарным кровоснабжением человека, в том числе имеет относительное отсутствие коронарных коллатеральных сосудов. Во-вторых, размер сердца свиньи, в процентах от общего веса тела, является сходным с размером сердца человека. Кроме того, свинья является крупной моделью животного, что позволяет, следовательно, более точную экстраполяцию различных параметров, таких как эффективные дозы векторов, токсичность и т. д. В противоположность этому, сердца таких животных, как собаки и члены семейства мышиных, имеют большое количество эндогенных коллатеральных сосудов. Кроме того, относительно общего веса тела, размер сердца собаки в два раза больше сердца человека.

Модель животного, описанная здесь в примере 5, является примером миокардиальной ишемии. (Поскольку миокардиальная ишемия может также приводить к застойной сердечной недостаточности и/или встречается в связи с ней, эта конкретная модель дополнительно уместна для этой ситуации). С использованием этой модели, было продемонстрировано, что опосредованная вектором доставка гена, кодирующего ангиогенный белок, ослабляла миокардиальную ишемию и увеличивала кровоток в ишемическом районе. Развитие коллатеральных сосудов также увеличивалось. В качестве иллюстрации, авторы изобретения успешно продемонстрировали способы переноса гена с несколькими различными ангиогенными белками, в том числе как с природными формами, так и с мутеинами (как описано в примерах ниже).

В этой модели, которая имитирует клиническое заболевание коронарных артерий, помещение амероидного жгута вокруг левой огибающей артерии (ЬСх) приводит к постепенному полному закрытию (в пределах 7 дней положения) с минимальным повреждением (1% левого желудочка, 4 ± 1% ложа ЬСх) (Κο!Η, е! а1., С1гси1абоп 82:1778, 1990; ΚοίΗ, е! а1., Ат. 1. ΡΗγκίο1, 235:1-11279, 1987; АЫ!е, е! а1., С1гс. Кек., 71:1490, 1992; Наттοηά, е! а1., Сагбю1., 23:475, 1994; и Наттοηά, е! а1., 1. С1т. [пуек!., 92:2644, 1993). Миокардиальные функция и кровоток были нормальными в состоянии покоя в районе, предварительно перфузированном с помощью закупоренной артерии (называемом ишемическим районом), но резерв кровотока является недостаточным для предотвращения ишемии, когда потребности в миокардиальном кислороде увеличиваются, вследствие ограниченного развития эндогенных коллатеральных сосудов. Таким образом, ложе ЬСх является предметом эпизодической ишемии, аналогично клинической грудной жабе (стенокардии). Взаимоотношения развития коллатеральных сосудов и функции кровотока являются стабильными в пределах 21 дня наложения амероидного жгута и остаются стабильными в течение четырех месяцев (Κο!Η, е! а1., С1гси1а!юп, 82:1778, 1990; Κο!Η, е! а1., Ат. 1. ΡΗγκίο1, 235:Н1279, 1987; А1ше, е! а1., С1гс. Кек., 71:1490, 1992). Было показано телеметрией, что животные имеют периодическую ишемическую дисфункцию в подвергающемся опасности ложе, в течение дня, связанную с резкими увеличениями частоты сердечных сокращений, во время кормления, при помехах, доставляемых персоналом, и т.д. Таким образом, эта модель имела ложе со стабильными, но недостаточными коллатеральными сосудами, и является предметом для периодической ишемии. Другим явным преимуществом этой модели является то, что имеется нормально перфузируемый и функционирующий район (ложе ЬАО), смежный с

- 22 008538 ненормально перфузируемым и имеющим дисфункцию районом (ложем ЬСх), что предоставляет контрольное ложе в каждом животном.

Миокардиальную контрастную эхокардиографию использовали для приближенной оценки регионарной миокардиальной перфузии. Контрастное вещество состоит из микроагрегатов галактозы и увеличивает эхогенность (белизну) изображения. Микроагрегаты распределяются в коронарные артерии и миокардиальную стенку таким образом, что они пропорциональны кровотоку (БкуЬа, с1 а1., С1гси1айои, 90:1513-1521, 1994). Было показано, что максимальная интенсивность контраста близко коррелировала с миокардиальным кровотоком, как измерено при помощи микросфер (БкуЬа, с1 а1., С1гси1а1юп, 90:15131521, 1994). Для документирования, что эхографические изображения, применяемые в данном изобретении, точно идентифицировали ложе ЬСх и что миокардиальная контрастная эхокардиография может использоваться для оценки миокардиального кровотока, гидравлический манжетный блокатор помещали вокруг проксимальной ЬСх, смежной с амероидным жгутом.

В некоторых аспектах данного изобретения, при умерщвлении животных сердца перфузионно фиксировали (глутаровым альдегидом, физиологическими давлениями, ίη δίΐιι) для количественного определения роста капилляров при помощи микроскопии. ПЦР использовали для детектирования ДНК ангиогенного белка и мРНК в миокарде из животных, которым производили перенос гена. Как описано ниже, спустя две недели после переноса генов пробы миокарда из трансдуцированных 1ас2 животных обнаружили значительную бета-галактозидазную активность при гистологическом обследовании. Наконец, с использованием поликлональных антител к ангиогенному белку была продемонстрирована экспрессия ангиогенного белка в клетках и миокарде из животных, которые получали перенос гена.

Что касается демонстрации улучшенного кровотока, специалистам в данной области известны различные способы. Например, миокардиальный кровоток может быть определен способом с применением радиоактивных микросфер, как описано в Ро1й. е! а1., Ат. Ь Рйу81о1, 235:1-Н1279, 1987 или в Ро111. е! а1., С1гси1аБоп, 82:1778-1789, 1990. Миокардиальный кровоток может быть также количественно определен, например, получением изображений с использованием таллия, которое предусматривает перфузию сердца радиоактивным таллием, как описано ВгаиитаИ ίη Неай Бкеаке, 4(Н ей., рр. 276-311 (Баипйегк, Р1и1айе1рЫа, 1992). Клетки в сердце обладают авидностью в отношении таллия. Поглощение таллия позитивно коррелирует с кровотоком. Таким образом, пониженное поглощение является признаком пониженного кровотока, который происходит в ишемических условиях, в которых имеется дефицит перфузии. В находящемся в сознании индивидууме ангиогенную активность можно легко оценить контрастной эхокардиографией, как описано в примерах 1 и 5 и в Байп, Ό.Ρ, е! а1., С1гси1а1юп 58:1072-1083, 1978. Улучшенная миокардиальная функция может быть определена измерением утолщения стенки, например, трансторакальной эхокардиографией.

Стратегия для терапевтических исследований включала в себя тайминг доставки трансгена, способ и путь введения трансгена и выбор ангиогенного гена. В амероидной модели миокардиальной ишемии перенос гена выполняли после стабильного, но недостаточного развития коллатеральных сосудов. Более ранние исследования с использованием амероидной модели включали в себя доставку ангиогенных пептидов во время замыкания амероида, перед развитием ишемии и коллатеральных сосудов. Однако, этот подход не был использован по нескольким причинам. Во-первых, такие исследования не пригодны для близко дублирующихся состояний, которые могли бы присутствовать в лечении клинической миокардиальной ишемии, в котором перенос гена осуществляли бы в условиях имеющейся миокардиальной ишемии; предыдущие исследования аналогичны обеспечению пептида в рецидивировании ишемии и, следовательно, они менее уместны. Во-вторых, предполагалось, на основании предыдущих исследований в культуре клеток, что ишемический стимул вместе с ангиогенным пептидом был бы оптимальной средой для стимуляции ангиогенеза. Это могло бы оптимально достигаться доставкой трансгена в тот момент, когда заболевание сердца уже присутствует. Выбор способа для достижения доставки трансгена был связан с этими определениями. Ограничение, что этот способ должен был применимым для последующего лечения пациентов с заболеванием коронарных сосудов, делало некоторые подходы непригодными (непрерывную инфузию пептида в коронарную артерию, прямую инъекцию плазмиды в сердце, покрытие сердца смолой, содержащей пептид для обеспечения медленного долгосрочного высвобождения). Наконец, свиная модель обеспечивала превосходный способ для прослеживания регионарного кровотока и функции перед доставкой гена и после доставки гена. Применение контрольных животных, которые получали тот же самый вектор (например, рекомбинантный аденовирус), но с репортерным геном, обеспечивает контроль для этих исследований. Свинья имеет природную коронарную циркуляцию, очень сходную с коронарной циркуляцией людей, в том числе относительное отсутствие природных коронарных коллатеральных сосудов. Свиная модель обеспечивала также превосходное средство для прослеживания регионарного кровотока и функции перед доставкой гена и после доставки гена. Применение контрольных животных, которые получали ту же самую рекомбинантную аденовирусную конструкцию, но с репортерным геном, обеспечивало контроль для этих исследований. На основании вышесказанного и на основании предыдущих опубликованных исследований, специалистам в данной области будет понятно, что ожидается, что результаты, описанные ниже, полученные на свиньях, являются предсказательными для результатов, которые будут получены для человека.

- 23 008538

Что касается заболевания периферических сосудов, доставка ангиогенных генов в периферическую сосудистую сеть с использованием векторов генотерапии данного изобретения может быть испытана с использованием, например, модели периферической ишемии с лигированием кровеносных сосудов задних конечностей. См., например, модель лигирования бедренной артерии, описанную К.Ь. Тегщпд с1 а1. (см., например, Уапд. с1 а1., С1гс. Кек., 79(1):62-9, 1996). Как и в случае доставки ангиогенных генов к ишемическому миокарду, доставка ангиогенных генов, согласно данному изобретению, к периферической сосудистой сети и/или связанной с ней мышце может быть использована для преодоления эффектов заболевания периферических сосудов.

Другая модель животного, описанная здесь в примере 1, индуцирует дилатированную кардиомиопатию, такую какая наблюдается в клинической застойной сердечной недостаточности. В этой модели, непрерывная быстрая электрическая стимуляция желудочка на протяжении периода 3-4 недель индуцирует сердечную недостаточность, которая обнаруживает сходные признаки со многими признаками клинической сердечной недостаточности, в том числе дилатацию (расширение) левого желудочка с нарушенной систолической функцией, аналогичную регионарным функциональным отклонениям от нормы, наблюдаемым при сердечной недостаточности (в том числе отклонениях, связанных с тяжелым заболеванием коронарных артерий и с не-ИБС (не-САО)-ЭСМ (дилатированной кардиомиопатией), такой как ГОСМ (идиопатическая дилатированная кардиомиопатия)). Другие модели застойной сердечной недостаточности животных включают в себя индукцию хронической желудочковой дисфункции посредством интракоронарной доставки микросфер (см., например, Ьауте е1 а1., 1. Ат. Со11. Сагбю1. 18: 1794-1803 (1991); В1аи81ет е1 а1., Ат. 1. Сагбю. Ра1й. 5: 32-48 (1994); 8аЬЬай е1 а1., Ат. 1. РЬукю1. 260: Н1379-Н1384 (1991)). В качестве дополнительного примера желудочковой дисфункции, окклюзия левой коронарной аретрии в крысиной модели может индуцировать инфаркты, и затем эти животные могут исследоваться и лечиться на протяжении последующих дней или недель (см., например, РГеГГег е1 а1., С1гс. Кек. 44: 503512, 1979; РГеГГег е1 а1., Ат. 1. РЬукю1. 260: Н1406-1414, 1991).

Таким образом, эти модели могут быть использованы для определения, эффективна ли доставка векторной конструкции, кодирующей ангиогенный пептид или белок, для ослабления сердечных дисфункций, связанных с этими состояниями. Эти модели особенно применимы в обеспечении некоторых из параметров, при помощи которых можно оценивать эффективность генотерапии ίη νΐνο для лечения сердечной застойной недостаточности и вентрикулярного ремоделирования.

Терапевтические применения

Векторы данного изобретения (например, репликативно-дефектный аденовирус) делают возможным высокоэффективный перенос генов ίη νΐνο без значительного некроза или воспаления. На основании этих результатов, некоторые из которых описаны подробно в примерах ниже, видно, что достигается достаточная степень переноса генов ίη νΐνο для осуществления функциональных изменений ίη νΐνο. Перенос гена ангиогенного белка, одного или в комбинации с другим усиливающим мышцу белком или пептидом, будет улучшать кровоток и усиливать мышечную функцию в обработанной мышце. Кроме того, если желательно, вазоактивный агент может быть использован вместе с этими способами и композициями, как описано здесь, для дополнительного усиления доставки гена к району-мишени. Поскольку вазоактивный агент (такой как гистамин, агонист гистамина, донор оксида азота или белок УЕСТ) может быть использован для увеличения эффективности переноса гена при векторной дозе гена, включение такого агента может быть использовано для ограничения количества вектора, необходимого для введения для достижения конкретного терапевтического эффекта.

В одном аспекте векторы и способы данного изобретения могут быть использованы для лечения дилатированной кардиомиопатии (ОСМ), типа сердечной недостаточности, который обычно диагностируется обнаружением дилатированного, гипоконтрактильного левого и/или правого желудочка. Как обсуждалось выше, ОСМ может встречаться в отсутствие других характерных форм заболевания сердца, таких как коронарная окклюзия или инфаркт миокарда, в истории заболевания. Дилатированная кардиомиопатия (ОСМ) связана со слабой функцией желудочка и симптомами сердечной недостаточности. У этих пациентов расширение полостей сердца и утончение стенки обычно приводит к высокому напряжению стенки левого желудочка. Многие пациенты обнаруживают симптомы даже при слабом физическом усилии или при отдыхе и, следовательно, характеризуются как проявляющие тяжелую «типа-ΙΙΙ» или «типа-1У» сердечную недостаточность, соответственно (см., например, классификацию сердечной недостаточности Нью-Йоркской ассоциации кардиологов (НУНА)). Как отмечалось выше, многие пациенты с заболеванием коронарных артерий могут прогрессировать до проявления дилатированной кардиомиопатии, часто как результата одного или нескольких сердечных приступов (инфарктов миокарда).

Дополнительным применением данного изобретения является предупреждение или по меньшей мере ослабление разрушительного ремоделирования желудочков (также известного, как разрушительное ремоделирование, для краткости), которое означает расширение полостей после инфаркта миокарда, которое может прогрессировать до тяжелой сердечной недостаточности. Даже если ремоделирование желудочков уже началось, все еще желательно стимулировать увеличение в кровотоке, так как это может все еще быть эффективным для устранения желудочковой дисфункции. Подобным образом, стимуляция ангиогенеза может быть полезной, так как развитие микрососудистого (капиллярного) ложа может быть

- 24 008538 также эффективным для устранения желудочковой дисфункции. Далее, такие ангиогенные белки или пептиды могут также иметь другие усиливающие действия. В пациенте, который имел инфаркт миокарда, разрушительное ремоделирование желудочков предотвращается, если пациент не имеет расширения полостей сердца и если симптомы сердечной недостаточности не развиваются. Разрушительное ремоделирование желудочков ослабляется, если имеется какое-либо наблюдаемое или измеримое уменьшение в существующем симптоме сердечной недостаточности. Например, пациент может обнаруживать меньшую одышку и улучшенную переносимость физической нагрузки. Способы оценки улучшения функции сердца и уменьшения симптомов являются по существу аналогичными способам оценки, описанным выше для ИСМ. Ожидается, что предупреждение или ослабление разрушительного ремоделирования желудочков в результате улучшенных коллатерального кровотока и желудочковой функции и/или других механизмов будет достигаться в пределах недель после переноса ангиогенного гена в пациенте с использованием описанных здесь способов.

В одном примере данный способ переноса ίη νί\Ό трансгена, кодирующего ангиогенный белок, используется для демонстрации, что перенос гена рекомбинантным аденовирусом, экспрессирующим ангиогенный белок или пептид, является эффективным в значительном уменьшении миокардиальной ишемии. В другом примере данный способ переноса ίη νί\Ό трансгена, кодирующего ангиогенный белок, используют для лечения состояния, связанного с застойной сердечной недостаточностью.

Как показывают приведенные ниже данные, экспрессия экзогенно обеспеченного ангиогенного трансгена приводит к увеличенному кровотоку и/или улучшенной функции в сердце (или другой тканимишени). Этот увеличенный кровоток и/или улучшенная функция будут ослаблять один или несколько симптомов сердечно-сосудистого заболевания, поражающего ткани-мишени.

Как описано здесь, ряд различных векторов могут использоваться для доставки трансгенов ангиогенных белков ίη νί\Ό в соответствии со способами данного изобретения. В качестве иллюстрации, репликативно-дефектные рекомбинантные аденовирусные векторы, приведенные в качестве примера здесь, достигали высокоэффективного переноса генов ίη νί\Ό без цитопатического действия или воспаления в районах экспрессии генов.

В лечении стенокардии, которая может быть связана с ИБС (ΓΑΩ), перенос кодирующего ангиогенный белок трансгена может проводиться в любое время, но предпочтительно его проводят относительно скоро после появления тяжелой стенокардии. В лечении наиболее застойной сердечной недостаточности перенос кодирующего ангиогенный белок гена может проводиться, например, когда развитие сердечной недостаточности является вероятным или была диагностирована сердечная недостаточность. Для лечения желудочкового ремоделирования перенос гена может выполняться в любое время после перенесения пациентом инфаркта, предпочтительно в пределах 30 дней и даже более предпочтительно в пределах 7-20 дней после инфаркта.

Как отмечалось выше, белки бета-адренергической передачи сигнала (бета-ΑδΡ) (в том числе бетаадренергические рецепторы (бета-ΑΚ), ингибиторы рецепторной киназы С-белка (СКК-ингибиторы) и аденилилциклазы (АС)) могут также использоваться для усиления сердечной функции, как описано и иллюстрировано подробно в патентной заявке Соединенных Штатов с номером 08/924757, поданной 5 сентября 1997 г. (на основе заявки И8 60/048 933, поданной 16 июня 1997 г. и заявки И8 08/708 661, поданной 5 сентября 1996 г.), а также заявке РСТ/И897/15610, поданной 5 сентября 1997 г. и продолжении дела заявки И8 с регистрационным номером 09/008 097, поданной 16 января 1998 г., и продолжении дела заявки И8 с регистрационным номером 09/472667, поданной 27 декабря 1999 г., каждая из которых включена здесь в качестве ссылки.

Композиции или продукты данного изобретения могут быть легко обеспечены в форме композиций, пригодных для введения пациенту, в кровоток (например, внутриартериальной инъекцией или в виде болюсной инфузии в ткань, такую как скелетная мышца). Подходящая форма введения может быть наилучшим образом определена врачом-практиком. Подходящие фармацевтически приемлемые носители и их приготовление описаны в стандартных справочниках по приготовлению лекарственных средств, например, в Кет^идΐои'з Ркагтасеийса1 8с1епсез, Е.А. МагЦп. См. также Аанд. У.Е ηηά Наннов. Μ.Α., РагепШ ЕогтЫайопз о£ Рго1етз ηηά РерМез: 81аЬП11у ηηά 81аЬ111/егз, 1оита1з о£ Рагеп1а1 8с1епсез ηηά Тескпо1оду, Тесктсз1 Керой №. 10, 8ирр1. 42:28 (1988). Векторы данного изобретения должны быть предпочтительно приготовлены в растворе при нейтральном рН, например, около рН 6,5-8,5, более предпочтительно приблизительно от рН 7 до рН 8, с наполнителем для доведения раствора почти до изотоничности, например, 4,5% маннитом или 0,9% хлоридом натрия, рН, забуференным известными в данной области буферными растворами, такими как фосфат натрия, которые обычно считаются безопасными, вместе с общепринятым консервантом, таким как метакрезол (0,1-0,75%), более предпочтительно с 0,150,4% метакрезолом. Желательная изотоничность может достигаться с использованием хлорида натрия или других фармацевтически приемлемых агентов, таких как декстроза, борная кислота, тартрат натрия, пропиленгликоль, полиолы (такие как маннит или сорбит), или других неорганических или органических растворенных веществ. Хлорид натрия является предпочтительным, в частности, для буферов, содержащих ионы натрия. Если желательно, растворы вышеописанных композиций могут быть также приготовлены для увеличения срока годности и стабильности. Терапевтически полезные композиции данного

- 25 008538 изобретения готовят смешиванием ингредиентов согласно обычно принятым процедурам. Например, выбранные компоненты могут смешиваться для получения концентрированной смеси, которая может быть затем доведена до конечной концентрации и вязкости добавлением воды и/или буфера для контроля рН или дополнительного растворенного вещества для регуляции тоничности.

Для применения врачом композиции должны быть обеспечены в дозированной форме, содержащей количество вектора данного изобретения, которое будет эффективным, в виде одной дозы или множественных доз для обеспечения терапевтического действия. Как будет понятно специалистам в данной области, эффективное количество терапевтического агента будет варьировать в зависимости от многих факторов, в том числе от возраста и веса пациента, физического состояния пациента и уровня ангиогенеза и/или другого действия, которые должны быть получены, и других факторов.

Эффективная доза вирусных векторов данного изобретения будет обычно в диапазоне приблизительно 10⁷-10¹³ вирусных частиц. Как отмечалось, точная подлежащая введению доза определяется лечащим врачом, но предпочтительно она находится в 5 мл или меньшем количестве физиологически забуференного раствора (такого как забуференный фосфатом солевой раствор), более предпочтительно в 13 мл.

Предпочтительным вариантом введения является введение инъекцией в один или несколько локализованных районов (например, в одну или обе коронарные артерии, в случае заболеваний сердца) с использованием подходящего катетера или другого приспособления для доставки ΐπ у1уо.

Следующие примеры обеспечены для дополнительной помощи специалистам с обычной квалификацией в данной области. Эти примеры предназначены для иллюстрации и, следовательно, не должны рассматриваться как ограничивающие данное изобретение. Ряд примерных модификаций и вариаций описаны в данной заявке, и другие модификации и вариации будут очевидными специалистам в данной области. Считается, что такие вариации находятся в рамках данного изобретения, описанного и заявленного здесь.

Примеры

Пример 1. Свиная модель застойной сердечной недостаточности и связанной с ней миокардиальной ишемии

1-А. Животные и хирургическая процедура

Девять Йоркширских свиней (8ик ксгоГа) весом 40±6 кг анестезировали кетамином (50 мг/кг внутримышечно 1М) и сульфатом атропина (0,1 мг/кг внутримышечно 1М) с последующим введением натрий-амитала (100 мг/кг внутривенно 1У). После эндотрахеальной интубации галотан доставляли нагнетающим вентилятором на протяжении всей процедуры. При левой торакотомии катетеры помещали в аорту, легочную артерию и левое предсердие. Микроманометр Конигсберга помещали в верхушку левого желудочка и эпикардиальное монополярное отведение помещали на 1,0 см ниже атриовентрикулярной бороздки в латеральной стенке левого желудочка. Генератор мощности (8рес!гах 5985; МебБгошс, 1пс.) вставляли в подкожный карман в брюшной полости. Четырех животных оборудовали проточным зондом (Тгапкошс, 1пс.) около главной легочной артерии. Перикард рыхло сближали и грудную клетку закрывали. Спустя 7-10 дней после торакотомии производили измерения фона гемодинамики, функции левого желудочка и миокардиального кровотока. Затем инициировали вентрикулярную электростимуляцию (220±9 Ьрт (ударов в минуту) на протяжении 26±4 дней). Амплитуда стимула была

2,5 В, продолжительность импульса 0,5 мс. Девять дополнительных свиней (40±7 кг) использовали в качестве контролей; пять свиней подвергали торакотомии и оборудовали инструментарием без стимуляции и убивали спустя 30±7 дней после начальной торакотомии. Данные, касающиеся правой и левой вентрикулярной массы были сходными в контрольных животных, подвергались ли они торакотомии или нет, так что их результаты объединяли в единую контрольную группу.

1-В. Гемодинамические исследования

Гемодинамические результаты получали из находящихся в сознании неусыпленных животных после инактивации стимулятора в течение по меньшей мере 1 ч и животные были в фоновом состоянии. Все данные получали для каждого животного с интервалами 7 дней. Давления получали из левого предсердия, легочной артерии и аорты. Левое вентрикулярное бР/б! получали из левого вентрикулярного кровяного давления высокой точности. Регистрировали легочный артериальный кровоток. Брали пробы крови из аорты и легких получали для расчета содержания артериовенозного кислорода.

1-С. Эхокардиографические исследования

Эхокардиогоафия является способом измерения регионарного миокардиального кровотока, предусматривающим инъекцию контрастного вещества в индивидуума или животного. Контрастное вещество (микроагрегаты галактозы) увеличивают эхогенность («белизну») изображения после левой предсердной инъекции. Эти микроагрегаты распределяются в коронарные артерии и миокардиальные стенки пропорционально кровотоку (8куЬа, е! а1., Сиси1а!юп, 90:1513-1521, 1994). Максимальная интенсивность контрастного усиления коррелирует с миокардиальным кровотоком, как измерено с использованием микросфер (8куЬа, е! а1., Сиси1а!юп, 90:1513-1521, 1994).

Двумерные и М-модальные изображения получали системой визуализации НеМе!! Раскагб 8опок

- 26 008538

1500. Изображения получали из окологрудинного приближения на уровне средней сосочковой мышцы и регистрировали на имеющей очень высокую чувствительность УН 8-ленте. Измерения производили в соответствии с критериями Американского общества эхокардиографии (8а1т Ό.Ι. е! а1., Οι^ηΜοη, 58:1072-1083, 1978). Вследствие ориентации по средней линии межжелудочковой перегородки (1У8) свиньи и использования правого окологрудинного вида, М-модальные измерения короткой оси производили через 1У8 и анатомическую латеральную стенку. Все параметры, в том числе концевую диастолическую величину (ΕΌΌ), концевую систолическую величину (Ε8Ό) и толщину стенки измеряли на по меньшей мере пяти случайных концевых экспираторных ударах и определяли среднее. Концевую диастолическую величину получали при появлении комплекса ΟΚ8. Концевая систолическая величина берется в момент максимально латерального положения 1У8 или в конце Т-волны. Левую вентрикулярную систолическую функцию оценивали с использованием фракционного укорочения, Ε8-[(ΕΌΌΕ8Ό)/ΕΌΌ]χ100. Процентное утолщение стенки (% \νΤ1ι) рассчитывали в виде %\νΤ1ι=|(Ε8\νΤ1ιΕΟ\νΤ1ι)/ΕΌ\νΤ1ι|χ 100. Для демонстрации воспроизводимости эхокардиограцических измерений, животных визуализировали в 2 последовательных дня перед началом протокола электрической кардиостимуляции. Данные из отдельных демонстраций были высоковоспроизводимыми (фракционное укорочение, Κ2=0,94, Р=0,006; утолщение латеральной стенки, Κ2=0,90, Р= 0,005). Все эти измерения получали с инактивированными электростимуляторами.

1-Ό. Миокардиальный кровоток

Миокардиальный кровоток определяли способом с радиоактивными микросферами, как описано подробно ранее (Κοίΐι, Ό.Μ., е! а1., Ат. 1, РЬу8ю1. 253:Н1279-Н1288, 1987; Κοίΐι, Ό.Μ., е! а1., СйснШюп 82:1778-1789, 1990). Трансмуральные пробы из левой вентрикулярной латеральной стенки и межжелудочковой перегородки делили на эндокардиальную, среднестеночную и эпикардиальную трети, и кровоток к каждой трети трансмурального потока определяли. Трансмуральные срезы производили из районов, в которых делались эхокардиографические измерения, так что кровоток и функциональные измерения соответствовали в каждом ложе. Микросферы инъецировали в контрольном состоянии (не электростимулированном), при инициировании вентрикулярной электрической стимуляции (225 Ьрт (ударов в минуту)), а затем при 7-дневных интервалах во время вентрикулярной электрической стимуляции при 225 ударах в минуту; микросферы также инъецировали с инактивированными электростимуляторами при 14 днях (η=4) и 21-28 днях (η=3). Миокардиальный кровоток на один удар рассчитывали делением миокардиального кровотока на частоту сердечных сокращений (регистрируемую во время инъекции микросфер) (Ιη6ο1ίϊ, С., е! а1., ΟϊΌνιΕιΟοη 80:933-993, 1989). Среднее левое предсердное и среднее артериальное давления регистрировали во время инъекции микросфер, так что можно было рассчитать приближенную величину сопротивления коронарных сосудов; индекс сопротивления коронарных сосудов равен среднему артериальному давлению минус среднее левое предсердное давление, деленному на трансмуральный коронарный кровоток.

1-Е. Систолическое напряжение стенки

Периферическое систолическое напряжение стенки не могло быть определено, так как авторы не смогли получить подходящий вид для оценки длинной оси левого желудочка. Таким образом, авторы рассчитали меридиональное концевое систолическое напряжение стенки (Шескек, Ν., е! а1., Οίι^ι.ιΕιΙίοη 65:99-108, 1982) с использованием уравнения: меридиональное концевое систолическое напряжение стенки (дины) = (0,344χΡχΌ)-[Ε(Ι-Ε/ϋ)], где Р обозначает левое вентрикулярное концевое систолическое давление в динах, Ό обозначает левый вентрикулярный концевой систолический диаметр в см, а Е обозначает концевую систолическую толщину стенки. Меридиональное концевое систолическое напряжение стенки рассчитывали как для боковой стенки, так и для 1У8 перед инициацией электрической стимуляции и затем последовательно при недельных интервалах (с инактивированным электростимулятором).

1-Е. Терминальная хирургия

После 26±2 дней непрерывной электрической кардиостимуляции животных анестезировали и интубировали и проводили стернотомию по средней линии грудины. Все еще сокращающиеся сердца погружали в солевой раствор (4°С), коронарные артерии быстро перфузировали солевым раствором (4°С), правый желудочек и левый желудочек (в том числе межжелудочковую перегородку) взвешивали и трансмуральные пробы из каждого района быстро замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -70°С.

1-С. Адениннуклеотиды

АТФ и АДФ измеряли в трансмуральных пробах 1У8 и латеральной стенке в четырех животных с сердечной недостаточностью (электрически кардиостимулированных 28 дней) и четырех контрольных животных. Пробы из животных с сердечной недостаточностью получали с инактивированными электростимуляторами (60 мин) в день убивания животных. Пробы получали идентично во всех животных. АТФ и АДФ измеряли в жидкостном хроматографе ’^а!егз высокого разрешения, как описано ранее (Ρί1ζ, Κ.Β.,

1. Βίο1. СЕет. 259:2927-2935, 1984).

1-Н. Статистический анализ

Данные выражали в виде среднего ± стандартное отклонение (8Ό). Конкретные измерения, полу- 27 008538 ченные в контрольном (перед стимуляцией) состоянии и при 1-недельных интервалах во время электрической кардиостимуляции, сравнивали с повторяемыми измерениями с использованием ΑΝΟνΑ (СгиисМ, Стилей 8оП\\агс Согр.). В некоторых сравнениях (латеральной стенки против 1У8, например, использовали двухфакторный ΑΝΟνΑ. Рой 1юс сравнения выполняли с использованием «способа Тьюки», как описано в данной области. Девять животных выживали 21 день электрической кардиостимуляции; шесть из них выживали 28 дней электрической кардиостимуляции. Результаты, полученные для животных, выживших 28 дней, были статистически неотличимыми от результатов животных, выживших только 21 день. ΑΝΟνΑ проводили, следовательно, на девяти животных в четырех временных точках: контроль (перед стимуляцией), 7 дней, 14 дней и 21-28 дней. Нулевая гипотеза отклонялась, когда получали Р<0,05 (двусторонний критерий).

Результаты

1-1. Гемодинамические исследования

Быстрая вентрикулярная электростимуляция приводила к изменениям в гемодинамике, которые были значимыми после 7-14 дней электрической стимуляции. При 7 днях животные имели увеличенные левое предсердное и легочное артериальное давление. Это давление возрастало по отношению к норме при увеличении длительности электрической стимуляции (табл. 1). Признаки циркуляторного застоя (тахипноэ, асциты и тахикардия) были очевидными 14-21 день. Легочный артериальный кровоток (минутный сердечный выброс) уменьшался на 21 день стимуляции (контроль, 33±0,1 л/мин; 21 день, 1,9±0,4 л/мин; Р<0,05).

Таблица 1. Гемодинамика и левая вентрикулярная функция

	η	Контроль	7 д	14д	21-28 д	Р
НН (Ьрш)	9	122±16	136±15	149+136	157±15с,§	0,0004
МАР (мм Пд)	9	103±8	99+6	98+7	102±14	0,52
РА (мм Нд)	7	24±7	37+46	42+9с	48±8с,д, ΐ	0,0001
ЬА (мм Н§)	8	13±3	25+5с	30±7с	36±6с,е	0,0001
АУО2О(мл/дл)	7	3,6+1,1	3,5+0,9	5,2+1,5	6,2+1,56,6	0,0005
ЕОО (см)	9	3,9±0,4	4,4+0,5	4,9±0,6с	5,8±0,6с,£,1 0,0001
Р8 (%)	9	39+3	26±5с	18±6с,е	13±4с,1	0,0001
БУ άΡ/άΐ	4	2849±27	2408±46	847+381с,ед	1072±123с,е,1	0,0001
(мм Нд/с)
	8	0

Дисперсионный анализ (повторяемые измерения) использовали для определения, влияла ли продолжительность электрической стимуляции на конкретную переменную; р-величины из ΑΝΟνΑ перечислены в правом столбце. Рой 1юс испытание выполняли по способу Тьюки: ар<0,05; Ьр<0,01; ср<0,001 (против контрольной величины для той же самой переменной); с1р<0.05: ер<0,01; ίρΟΟ,ΟΟ 1 (в сравнении с предыдущей неделей); др<0,05; 1ιρ<0.01: ίρ<0,001 (в сравнении с величиной 7 д); рой Бос испытание по способу Тьюки. Измерения производили с инактивированными электростимуляторами (пейсмекерами), и измерения представляют среднее ± 8Э. 7 д: 7 дней стимуляции; 14 д: 14 дней стимуляции; 21-28 д: 21-28 дней стимуляции. 1-1. Глобальная функция левого желудочка

Левую вентрикулярную функцию оценивали при помощи эхокардиографии и гемодинамических переменных, после того как электрокардиостимуляторы были выключены. Фракционное укорочение (Р8) прогрессивно уменьшалось по мере увеличения продолжительности кардиостимуляции (Р=0,0001; табл. 1), достигая его самой низкой величины на 21-28 день (контроль, 39±3%; 21-28 дней 13±4%; Р<0,0001; табл. 1).

Величина левого вентрикулярного концевого диастолического давления (Εϋϋ) прогрессивно увеличивалась во время электрической кардиостимуляции *Р<0,0001; табл. 1), достигая ее максимальной величины на 21-28 день (контроль, 3,9±4 см; 21-28 дней, 5,8±0,6 см; Р=0,0002). Левое вентрикулярное максимальное положительное ЬУ άΡ/άΐ также уменьшалось на протяжении исследования (Р=0,0001; табл. 1). Прогрессирующее падение максимального άΡ/άΐ сопровождалось увеличением левого вентрикулярного концевого диастолического давления, подтверждая уменьшенную контрак-тильность левого желудочка, так как увеличенная предварительная нагрузка обычно увеличивает левое вентрикулярное максимальное άΡ/άΐ (МаЫег, Г., εΐ а1., Ат. 1. СапНо1. 35:626-634,1975).

1-К. Левая вентрикулярная регионарная функция

-28008538

С инактивированным кардиостимулятором, регионарную левую вентрикулярную функцию оценивали измерением процентного утолщения стенки, а именно левой вентрикулярной латеральной стенки и межжелудочковой перегородки (1У8). Электрическая кардиостимуляция от латеральной стенки вызывала значительное ухудшение функции латеральной стенки в сравнении с 1У8 (Р=0,001; фиг. 1 и табл. 2). Это различие было значимым на 7 день и увеличивалось дополнительно на 21-28 день, так как функция латеральной стенки ухудшалась. 1У8 показала незначимое уменьшение в утолщении стенки на протяжении хода этого исследования. Концевая диастолическая толщина стенки обнаружила прогрессирующее утончение во время исследования, которое было более тяжелым в латеральной стенке (табл. 2).

Таблица 2. Последовательное утолщение стенки левого желудочка

	Контроль	7 д	14 д	21-28 д	ρ(ΑΝθνΑ)
1У8 ЕОТЬ	0,8±0,1	0,7+0,1	0,7+0,1	0,6+0,]	время:0,0001
(см)
ЬАТ ΕϋΊΊι	0,8±0,1	0,7+0,1	0,6±0,1	0,5±0,1	район: 0,039
(см)
р(1У8 уз.	из	НЗ	нз	НЗ	меж.: 0,027
ЬАТ)
IV 8 Ψ11ι(%)	33+4	33±5	28±3	28±6	время:0,0001
ЬАТ Τνώ(%)	35±5	25+4	19+8	14+6	район: 0,001
р(1У8 уз.	нз	0,02	0,007	0,0001	меж.: 0,0001
ЬАТ

Двухфакторный дисперсионный анализ (повторяемые измерения) использовали для определения, влияет ли на концевое диастолическое утолщение стенки (ЕЭТ11) или % утолщения стенки (\УТН) продолжительность кардиостимуляции (время) или район (латеральная стенка, ЬАТ; или межжелудочковая перегородка, 1У8), или является ли изменение в ЕЭТ11 или \УТ11% различным между этими двумя районами (меж.). Средние величины для ЕЭТ11 или \УТ11% в каждой временной точке испытывали на различия между этими двумя районами ροδί 1юс с использованием анализов Тьюки. Величины представляют среднее ± 8Э (стандартное отклонение). 7 д: 7 дней стимуляции; 14 д: 14 дней стимуляции; 21-28 д: 21-28 дней стимуляции. и=9.

1-Ь. Левый вентрикулярный регионарный кровоток

Субэндокардиальный кровоток в минуту увеличивался больше в 1У8, чем в латеральной стенке, в начале электрической кардиостимуляции (фиг. 2 и табл. 3). Это различие в регионарном кровотоке во время стимуляции сохранялось в течение продолжительности данного исследования, и картина изменения в кровотоке была различной между этими двумя районами (Р=0,006). Картина изменения в кровотоке в минуту между этими двумя районами во время стимуляции согласовалась при измерении в эндокардиальном (Р=0,006), среднестеночном (Р=0,002), эпикардиальном (Р=0,016) или траснсмуральном (пристеночном) (Р=0,003) отделах (табл. 3). В противоположность этому, когда электрокардиостимулятор был инактивирован, субэндокардиальный кровоток не обнаруживал регионарных различий при измерении в контрольном состоянии, на 14 день или на 21-28 день (фиг. 2 и табл. 3).

-29008538

Таблица 3. Последовательный миокардиальный кровоток

День 0 День 14 День 21-28 ρ(ΑΝθνΑ)

ВЫКЛ. вкл.	ВЫКЛ.	ВКЛ.	выкл. вкл.
1У8 ΕΝΟΟ 1.41 ±.2	1.964.38	1.684.22	2.354.4	1.884.1 2.674.3 время .0001
(мл/мин/г) 6			6	^{8 9}
САТ 1.4ΟΓ.3	1.114.14	1.504.35	1.654.2	1.734.0 2.054.1 район .017
ΕΝΌΟ 3			5	5 6
(мл/мин/г)
р (IV 8 νϊ. №	.001	ПЗ	.002	из .006 между 006
ЬАТ)
Г/5МГО 1.564.2	2.114.33	1.844.29	2.484.3	2.044.0 2.984.4 время
(мл/иин/г) 0			1	9 6 .0001
ЬАТ ИГО 1.664.2	1.534.17	1.504.43	1.774.2	1.7б±.3 2.124.0 район „019
(мл/мин/г) 8			9	9 6
р (ГУ5 те. Νχ	.01	Π5		пз .001 между . .002
ЬАТ)
Β/8ΕΡΙ 1.134.2	1.5СИ.24	1.544.38	1.914.4	1.794.1 2.534.3 время
(мп/мш/г) 7			8	4 8 .0001
ΕΑΤΕΡΪ 1.37±.2	1.48±.31	].24±224	1.554.2	1.504.0 1.924.0 район :.17
(мл/мин/г) 2			5	4 8
Р (1У8 уз. N3	Π5	П5	Π5	.049 пз
ЬАТ)				между (кие
Г/8 1.36*.2	1.854.27	1.69±.3Ο	2.244.4	1.904.0 2.734.4 время
ΤΚΑΝ8 1			6	9 0 .0001
(мл/мин/г)
ЬАТ . 1.474.2	1.384:.22	1.414.33	1.654.2	1.664.0 2.034.0 район:.019
ΤΚΑΝ8 7			5	2 7
(мл/мин/г)
р (1У8 ν®. Ν®	.001	П8	Π8	пз .001 между .003
ЬАТ)
№ 1,зо±.з	1.32±.23	1.134.20	1.274.2	1.054.2 1.064.1 время·. .058
ΕΝΟΟ/			6	0 0
ΕΡΙ
ЬАТ 1.0)4.0	0.774.10	1.214.06	1.074.1	1.154.0 1.074.1 район .:.054
ΕΝϋΟ/ 7			1	2 0
ΕΡΙ
ρ (1У8 ν®. Νϊ	.0002	П5	Π3	пз пз
ЬАТ)				между.0008

Двухфакторный дисперсионный анализ (повторяемые измерения) использовали для определения, влияет ли на субэндокардиальный (ΕΝϋΟ) или трансмуральный (ΤΚΑΝ8) кровоток продолжительность кардиостимуляции (время) или район (латеральная стенка, ЬАТ; или межжелудочковая перегородка, 1У8), или является ли картина изменений в кровотоке различной между этими двумя районами (между). Средние величины для кровотока в каждой временной точке испытывали на различия между этими двумя районами рок! Бос с использованием анализов Тьюки. Величины представляют среднее ± δϋ (стандартное отклонение) из 5 животных. Вкл.: микросферы инъецировали во время электрической стимуляции желудочка (225 ударов в минуту). Выкл.: электический стимулятор выключен. День 0=Контроль; День 14: 14 дней стимуляции; День 21-28: 21-28 дней стимуляции.

Отношения эндокардиальный кровоток:эпикардиальный кровоток не изменялись значимо по мере прогрессирования сердечной недостаточности (Р=0,058). Однако с началом стимуляции сердца отношение эндокардиальный кровоток:эпикардиальный кровоток было существенно более низким в латераль-30008538 ной стенке, чем в межжелудочковой перегородке (1У8, 1,32±0,23; латеральная стенка, 0,77±0,10; Р=0,0002; табл. 3). Отношения в обоих районах были > 1,0 на протяжении остальной части исследования.

Эндокардиальный кровоток на удар (сокращение сердца) (фиг. 2 и табл. 4) был сходным в обоих районах перед началом стимуляции сердца (1У8, 0,013±0,003 мл-мин-1 г-1-удар-1; латеральная стенка, 0,012±0,004 мл-мин-1 г-1 удар-1; Р=НЗ). При инициации стимуляции желудочка (225 ударов в минуту) было регионарное уменьшение в эндокардиальном кровотоке на один удар (одно сокращение) в латеральной стенке, но не в 1У8 (1У8, 0,009±0,002 мл-мин-1 г-1-удар-1; латеральная стенка, 0,005±0,001 мл-мин-1 г-1 удар-1; Р=0,001). При 14 днях и 21-28 днях эндокардиальный кровоток на удар был меньше в латеральной стенке, чем в межжелудочковой перегородке (1У8), во время стимуляции (фиг. 2 и табл. 4). Эти данные показывают, что с началом стимуляции начиналась миокардиальная гипоперфузия в латеральной стенке, и эта относительная ишемия сохранялась. Однако эндокардиальные кровотоки на один удар оставались нормальными в обоих районах при выключенном кардиостимуляторе (фиг. 2 и табл. 4).

Кровоток в обоих районах имел тенденцию к увеличению во время последней недели стимуляции сердца (фиг. 2 и табл. 3). Эта картина была связана с прогрессирующим падением коэффициента сопротивления коронарных сосудов (фиг. 3), что предполагает, что изменения в структуре и функции коронарных сосудов могут сопровождать ремоделирование левого желудочка по мере прогрессирования сердечной недостаточности. Коэффициент сопротивления коронарных сосудов был значительно большим в латеральной стенке, чем в 1У8 в начале стимуляции, и картина изменения в сопротивлении коронарных сосудов была различной между этими двумя районами (Р=0,0012) (фиг. 3). Эти открытия могут указывать на действие измененной электрической активации на перфузию миокарда.

Таблица 4. Эндокардиальный кровоток на одно сокращение сердца (на один удар)

Модель	Эндокардиальный кровоток на удар (мл/мин/грамм/удар)
СВИНАЯ АМЕРОИДНАЯ ИШЕМИЯ (НК. 220 ударов в минуту; п-ч5)
Неишемическое ложе	0,012+0,004
Ишемическое ложе	0,006±0,002
	р< 0,001*
СВИНАЯ ИНДУЦИРОВАННАЯ	СТИМУЛЯЦИЕЙ ЛЕВОГО ЖЕЛУДОЧКА ЗА-

СТОЙНАЯ СЕРДЕЧНАЯ НЕДОСТАТОЧНОСТЬ (СНР) (НК 225 ударов в минуту; п=5)

Стимулятор

Стимулятор включен выключен

ДЕНЬО	1У8	0,009±0,002	0,013+0,003
			(НК 122 уд/мин)
	Латеральная стенка	0,005±0,001	0,012±0,004
		р=0,001	нз
ДЕНЬ 14	1У8	0,010+0,003	0,0 И ±0,002
			(НК 149 уд/мин)
	Латеральная стенка	0,007±0,001	0,010+0,003
		р=0,008	нз
ДНИ 21-28	1У8	0,012+0,002	0,013±0,003
			(НК 157 уд/мин)
	Латеральная стенка	0,009+0,001	0,012±0,002
		р=0,024	нз

Данные из амероидной модели ишемии были опубликованы ранее лабораторией авторов (Напшюпб, Н.К. апб МсКппап, Μ.ϋ., 1. Ат. Со11. Сагбю1., 23:475-82, 1994). Величины представляют среднее ± δϋ (стандартное отклонение). Эти данные показывают, что коллатерально-зависимый (ишемический) район амероидной модели и модели сердечной недостаточности, индуцированной стимуляцией левого желудочка, имеют сходные дефекты в эндокардиальном кровотоке на одно сокращение сердца (на один удар)

-31 008538 в сравнении с миокардиальными районами, которые имеют нормальную перфузию.

1-М. Концевое систолическое напряжение стенки левого желудочка

Имелось значимое увеличение в оцененном меридиональном концевом систолическом напряжении стенки в зависимости от продолжительности стимуляции (Р<0,0001), но характер изменения в напряжении стенки был сходным в латеральной стенке и межжелудочковой перегородке (1У8) (Р=33), и рοκ! 1юс испытание не смогло показать каких-либо регионарных различий в систолическом напряжении стенки в любой конкретной временной точке (фиг. 3). Увеличение в концевом систолическом напряжении стенки было приблизительно трехкратным в латеральной стенке (контроль, 168±40 х 103 дин; 28 дней, 412±143 х 103 дин; Р=0,0001) и в 1У8 (контроль, 159±35 х 103 дин; 28 дней, 480±225 х 103 дин; Р=0,0001).

1-Ν. Аутопсия

При аутопсии, животные с сердечной недостаточностью имели асциты (среднее количество, 1809 мл; диапазон, 300-3500 мл) и дилатированные, тонкостенные сердца, причем все четыре полости сердца представали сильно увеличенными. Отношения веса желудочков к весу тела предполагали гипертрофию только правого желудочка, что подтверждало результаты из более раннего исследования с использованием этой модели (Κο!1, Ό.Α., е! а1., 1. С11п. [пуек1. 91:939-949, 1993). В сравнении с имеющими соответствующий вес контрольными животными не было изменения в массе левого желудочка при сердечной недостаточности (контроль, 112±10 г; сердечная недостаточность, 114±17 г); отношения веса левого желудочка к весу тела были также сходными в обеих группах (контроль, 2,8±0,3 г/кг; сердечная недостаточность, 2,9±0,3 г/кг). В противоположность этому, сердечная недостаточность была связана с увеличенным весом правого желудочка (контроль, 38±3 г; сердечная недостаточность, 52±11 г, Р=0,003) и увеличенными отношениями веса правого желудочка к весу (контроль, 0,09±0,1 г/кг; сердечная недостаточность, 1,3±0,3 г/кг, Р<0,003). Стимулированные животные давали прибавку в весе 4 кг во время хода исследования, количество, связанное отчасти с накоплением асцита. Если начальный вес тела использовали для расчета отношения веса левого желудочка к весу тела, это отношение все еще не было значимо более высоким, чем отношение у имеющих соответствующий вес контрольных животных. Эти данные подтверждают, что не было значимого увеличения в массе левого желудочка в ходе данного исследования.

1-О. Адениннуклеотиды

Контрольные животные обнаружили нормальные отношения АТФ/АДФ, сходные отношениям, сообщенным для сердца свиньи при взятии биопсий при помощи дрели с последующим немедленным погружением в жидкий азот (АЫ!е, Р.С. апб Βοκκ, С., 1. Сагбюуакс. Ра11ю1. 3:225-236, 1990), что подтверждает тот факт, что использованные способы взятия проб были подходящими. Животные с сердечной недостаточностью обнаружили заметное уменьшение отношения АТФ/АДФ в пробах, взятых из межжелудочковой перегородки (1У8) (контроль, 14,8±1,1; сердечная недостаточность, 2,4±0,3, Р<0,0001, п=4 для обеих групп) и из латеральной стенки (контроль, 14,3±4,0; сердечная недостаточность, 2,4±0,9, Р=0,0012, п=4 для обеих групп). Это подтверждает нарушение баланса между подачей кислорода и потребностью в кислороде в миокарде.

1-Р. Миокардиальный кровоток

Регионарные отличия в миокардиальном кровотоке, непосредственное последствие быстрой желудочковой стимуляции, могут играть роль в патогенезе регионарной и глобальной дисфункции в индуцированной стимуляцией сердца сердечной недостаточности. Во время электрокардиостимуляции было обнаружено различие в миокардиальном кровотоке в минуту между латеральной стенкой левого желудочка (смежной с местом стимуляции) и межжелудочковой перегородкой (1У8). Пониженный кровоток присутствовал в латеральной стенке сразу же при инициации кардиостимуляции и сохранялся в течение 21-28 дней. Латеральная стенка левого желудочка, получающая меньший кровоток, чем 1У8, во время кардиостимуляции, обнаружила прогрессирующее уменьшение утолщения стенки (при выключении электрокардиостимулятора) во время 21-28 дней кардиостимуляции. В противоположность этому 1У8, получающая более высокий кровоток во время кардиостимуляции, сохраняла относительно нормальное утолщение стенки на протяжении 21-28 дней кардиостимуляции.

Поскольку миокардиальный кровоток в минуту не позволяет легко оценить относительную миокардиальную ишемию, авторы изобретения выражали также коронарный кровоток в виде эндокардиального кровотока на один удар (одно сокращение сердца). Физиологическая основа для такого анализа лежит в более ранних экспериментах, показывающих, что регионарный субэндокардиальный кровоток в минуту (в большей степени, чем наружная стенка трансмурального кровотока) представляет первичную детерминанту регионарного миокардиального сокращения в условиях прогрессирующего стеноза коронарных артерий (6а11адЬег, Κ.Ρ., е! а1., Ат. 1. Ρ1ινκίο1. 16:Н727-Н738, 1984) и что увеличение частоты сердечных сокращений смещает это отношение кровотока-функции вниз, к более низкой регионарной функции при любом уровне субэндокардиального кровотока (Ое1Ьаак, Т., е! а1., 1. Ρ1ινκίο1. 477:481-496, 1990). Однако, если отношение кровоток-функция нанести на график в виде зависимости регионарной функции от эндокардиального кровотока на удар для коррекции действий на частоту сердечных сокращений, то имеется единое отношение при различных частотах сердечных сокращений, что указывает на то, что эндокардиальный кровоток первично определяет уровень функции стенки при уменьшении коронарного кровотока

- 32 008538 (кровоснабжения) (1пбо1й, С, е! а1., С1гси1а!юп 80:933-993, 1989; Вокк, 1., С1гси1айоп 83:1076-1083, 1991). С инициацией кардиостимуляции было >50%-ное уменьшение эндокардиального кровотока на один удар в латеральной стенке в сравнении с 1У8 (Р <0,001; табл. 4).

В предыдущих исследованиях на находящейся в сознании свинье авторы изобретения установили, что 50%-ное уменьшение эндокардиального кровотока вызывало 50%-ное уменьшение регионарной функции и было связано с субэндокардиальным кровотоком на одно сокращение, сходным с таковым в латеральной стенке в этих исследованиях (табл. 4). Уменьшение кровотока в латеральной стенке во время кардиостимуляции сохранялось на протяжении всего исследования. Эти результаты обеспечивают доказательство миокардиальной ишемии в латеральной стенке при инициации электрокардиостимуляции желудочка. В противоположность этому функция и эндокардиальный кровоток на одно сокращение межжелудочковой перегородки (1У8) оставались относительно нормальными. При выключенном кардиостимуляторе субэндокардиальный кровоток на одно сокращение оставался нормальным в обоих районах во всем исследовании, тогда как регионарная дисфункция сохранялась в латеральной стенке, что согласуется с наличием миокардиального «шока» («оглушения») в этом районе. Таким образом, авторы утверждают, что продолжительная ишемия латеральной стенки оказывает существенное влияние на глобальную (общую) функцию сердца во время и после электрокардиостимуляции.

Пример 2. Получение иллюстративных конструкций доставки генов

2-А. Получение иллюстративных аденовирусных конструкций

В качестве исходного вектора доставки генов использовали хелпер-независимую, репликативнодефектную систему аденовируса-5. В качестве исходной иллюстрации векторных конструкций, авторы использовали гены, кодирующие β-галактозидазу и ЕСЕ-5. Рекомбинантные аденовирусы, кодирующие β-галактозидазу или ЕСЕ-5, конструировали с использованием полноразмерных кДНК. Эта система, использованная для получения рекомбинантных аденовирусов, давала предел упаковки около 5 т.п.н. для трансгенных инсертов. Каждый из генов β-β;·ι1 и ЕСЕ-5, функционально связанные с промотором СМУ и с последовательностями полиаденилирования 8У40, имел размер менее 4 т.п.н., вполне в пределах связанных с упаковкой ограничений.

Полноразмерную кДНК для ЕСЕ-5 человека выделяли из плазмиды рЬТВ122Е (Ζΐιηη е! а1., Мо1. Се11. Вю1., 8:3487, 1988) в виде ЕсоВ1-фрагмента 1,1 т.п.н., который включает в себя 981 п.н. открытой рамки считывания этого гена, и клонировали в полилинкер челночной векторной плазмиды АССМУрЬрА. Нуклеотидная и аминокислотная последовательность ЕСЕ-5 описаны на фиг. 1 Ζΐιηη е! а1., Мо1. Се11. Вю1., 8:3487, 1988. рАССМУрЬрА описана в Соте/.-Еогх е! а1., 1. Вю1. Сйет., 267:25129-25134,

1992. рАССМУрЬрА содержит 5'-конец генома аденовируса серотипа 5 (единицы картирования 0-17), где район Е1 был заменен энхансером-промотором цитомегаловируса человека (промотором СМУ), за которым следует сайт множественного клонирования (полилинкер) из рИС19 (плазмиды, хорошо известной в данной области), за которым следует сигнал полиаденилирования 8У40. Кодирующий ΕκΖ контрольный аденовирус основан на делеции Е1А/Е1В от единицы картирования 1 до 9,8. ЕСЕ-5кодирующий аденовирус (Аб.ЕСЕ-5) основан на делеции Е1А/Е1В от единицы картирования 1,3 до 9,3. Оба эти вектора элиминируют полные кодирующие последовательности Е1 А и большую часть кодирующих последовательностей Е1 В. Оба вектора имеют инсерты трансгенов, клонированные в инвертированной ориентации относительно последовательностей аденовируса. Таким образом, в маловероятном событии сквозного прочитывания (прочитывания терминатора) транскрипт аденовируса был бы антисмысловым и не экспрессировал бы вирусные белки.

ЕСЕ-5-ген-содержащую плазмиду котрансфицировали (с использованием осаждения фосфатом кальция) в клетки 293 с плазмидой ДМ17 (рДМ17), которая содержит полный геном аденовируса 5 человека с дополнительным инсертом 4,3 т.п.н., что делает рДМ17 слишком большой для инкапсидации в зрелые аденовирусные вирионы. Затем клетки накрывают содержащей питательные вещества агарозой. Инфекционные вирусные частицы, содержащие ангиогенный ген, получали гомологичной рекомбинацией спасения в клетках 293 и выделяли в виде отдельных бляшек спустя 10-12 дней. (Идентификацию успешного рекомбинантного вируса можно выполнять также котрансфекцией посредством липофекции и прямым просмотром на цитопатическое действие под микроскопом, как описано Ζ1ιηη§ е! а1., Вю!ес11шциек 15(5):868-872, 1993). Полученные аденовирусные векторы содержат трансген, но лишены последовательностей Е1 А/Е1 В и, следовательно, являются дефектными по репликации. Аденовирусный вектор, несущий ген ЕСЕ-5, называется здесь также Аб.ЕСЕ-5.

Хотя эти рекомбинантные аденовирусы были нерепликативными в клетках млекопитающих, они могут размножаться в клетках 293, которые были трансформированы Е1А/Е1В и обеспечивали эти необходимые генные продукты ίη 1таик. Рекомбинантный вирус из индивидуальных бляшек размножали в клетках 293 и вирусную ДНК характеризовали рестрикционным анализом.

Затем успешный рекомбинантный вирус подвергали двум раундам очистки из бляшек с использованием стандартных процедур. Вирусные исходные культуры размножали в клетках 293 до титров в диапазоне 1010-1012 на миллилитр (мл) с определением оптической денситометрией. Клетки 293 человека инфицировали при 80% конфлюентности и культуральный супернатант собирали на 36-48 ч. После

- 33 008538 подвергания вируссодержащего супернатанта циклам замораживания-оттаивания клеточные остатки (дебрис) осаждали стандартным центрифугированием и вирус дополнительно очищали двухкратным ультрацентрифугированием в градиенте хлорида цезия (СкС1) (ступенчатый градиент 1.33/1.45 СкС1; СкС1 готовили в 5 мМ Трис. 1 мМ ЭДТА (рН 7.8); 90000 х д (2 ч). 105000 х д (18 ч)). Перед инъекцией ш νί\Ό вирусные исходные растворы обессоливали гель-фильтрацией через Сефарозные колонки (например. С25 Сефадекс. уравновешенные ЗФР). Конечные концентрации вируса были около 1011 вирусных частиц на миллилитр (мл). как определено оптической денситометрией. Вирусные исходные растворы могут удобным образом храниться в клетках в среде при -70°С. Для инъекций вирусные исходные растворы предпочтительно ресуспендируют в солевом растворе. Препарат аденовирусного вектора был высокоочищенным и по существу не содержащим вируса дикого типа (потенциально репликативного) (т.е. предпочтительно содержащим менее. приблизительно. одной (1) частицы репликативно-компетентного аденовируса (ЯСА) на миллион. более предпочтительно менее 1 на 109 и наиболее предпочтительно менее 1 на 1012). Таким образом. аденовирусная инфекция и воспалительная инфильтрация в сердце были минимизированы.

Дополнительные иллюстрации аденовирусных векторных конструкций обеспечены ниже и. в комбинации с другими рекомендациями. обеспеченными здесь. могут быть использованы другие аденовирусные векторные конструкции. пригодные для применения в данном изобретении. в том числе конструкции на основе модифицированных аденовирусных векторов.

2-В. Дополнительные иллюстративные векторные и трансгенные конструкции

Как описано выше. различные вирусные и невирусные векторы могут быть использованы для доставки генов в соответствии с данным изобретением. В качестве иллюстративного примера другого вектора. могут быть получены аденоассоциированные вирусные (ААУ) векторы для доставки ш νί\Ό в соответствии со способами данного изобретения. описанными выше. В качестве иллюстративного примера другого ангиогенного гена. который может быть использован в контексте данного изобретения. авторы получили конструкции. содержащие ген 1СЕ. как описано выше. как в аденовирусных (Аб). так и ААУвекторных конструкциях.

Иллюстративные конструкции содержат ген 1СЕ-1 под контролем гетерологичного промотора (для целей иллюстрации использовали промотор СМУ) и названы гАб/ЮЕ или гААУ/ЮЕ. Кроме них. были сконструированы конструкции. содержащие маркерный ген. например. усиленный зеленый флуоресцентный белок (ЕСЕР). Конструкции гАб/ЮЕ или гААУ/ЮЕ могут быть также сконструированы для включения маркерного гена (например. ЕСЕР). Конструкции. содержащие ЕСЕР. являются коммерчески доступными (например. из С1оп(еск Ра1о А1(о. СаШогша).

Для генерирования гАб/1СЕ. ген 1СЕ-1 (доступный из АТСС) субклонируют в аденовирусный челночный вектор. такой как рАбкйиШе-СМУ. рАЭ5С1 и/или рАЭ(гаск-СМУ. Полученная челночная плазмида 1СЕ-1 подвергается процессу рекомбинации с хелперной плазмидой. рДМ17. либо в бактериях. либо в клетках 293 в зависимости от используемого челночного вектора. Полученный вирус гАб/1СЕ проверяют на экспрессию белка 1СЕ-1 при помощи ОТ-РЦР и/или вестерн-блоттинга.

В качестве иллюстрации авторы получали конструкции гАб/1СЕ с использованием челночного вектора и хелперной плазмиды рДМ17 в клетках 293 по существу. как описано и иллюстрировано выше для генерирования аденовирусных векторов. содержащих ангиогенный ген ЕСЕ-5. Аденовирусные векторы. содержащие ЕСЕР. получали в качестве контролей с использованием аналогичных способов.

Авторы получили конструкции гААУ/1СЕ с использованием способов получения рекомбинантных ААУ-векторов. описанных в данной области; см.. например. ссылки. относящиеся к получению ААУ. цитируемые выше. Хотя ААУ-векторы могут быть получены с использованием различных способов. описанных в данной области. авторы использовали основную процедуру с двумя трансфекциями. в основном. как описано Бати1кк1 е( а1.. 1. У1го1. 63:3822-3828. 1989. Вкратце. для получения гААУ/1СЕ ген 1СЕ-1 субклонировали в ДНК плазмиды гААУ (так чтобы ген 1СЕ-1 был фланкирован инвертированными повторами или 1ТЯ ААУ) и эту плазмиду гААУ затем котрансфицировали в клетки 293 с хелперной плазмидой ААУ (для обеспечения генов гер и сар ш (гапк). Затем инициировали получение ААУ инфицированием с хелперным аденовирусом (авторы использовали аденовирус с делетированным Е1. известный как б1312). Вирусные лизаты обычно обрабатывали нагреванием для инактивации аденовируса и обрабатывали ДНКазой и проназой согласно стандартным способам (см.. например. Бати1кк1 е( а1.. кирга).

Различные способы могут быть использованы для очистки ААУ-векторов. Для целей данной иллюстрации авторы использовали стандартную процедуру ультрацентрифугирования в хлориде цезия (СкС1) (две очистки с использованием СкС1) для начального отделения гААУ-частиц от примесей. в основном. как описано в данной области. После диализа авторы дополнительно очищали материал при помощи ВЖХ. В этом примере авторы использовали аффинную хроматографическую колонку. которая покрыта гепарином (РОЯОБ НЕ. который доступен из РЕ Вюкуйетк. Еок(ег Сйу. СаШогша) и элюировали солью (1-2М №1С1). В этом примере. большая часть ААУ элюировалась при приблизительно 0.7М ЫаС1. После диализа против ЗФР (рН 7.4) вектор обрабатывали нагреванием при 56°С в течение 60 мин для разруше

- 34 008538 ния остаточного аденовируса. Как и в случае аденовируса, полученные исходные растворы вектора обычно титровали на устойчивые к ДНКазе частицы (ЭКР) и испытывали на отсутствие цитопатического действия. Экспрессию 1СЕ-1 в гАб/1СЕ и гААУ/1СЕ подтверждали вестерн-блот-анализом. Затем их дополнительно испытывали на продуцирование функционального белка 1СЕ-1 с использованием теста пролиферации на культивируемых клетках МСЕ-7. Вкратце, клетки 293 НЕК (карциномы эмбриональных почек человека) трансдуцировали гАО/ЮЕ или гААУ/1СЕ в день 1 и культивировали в бессывороточной среде. После 48 ч инкубации бессывороточную среду собирали и помещали на клетки МСЕ-7, которые культивировали в бессывороточной среде. Пролиферацию клеток МСЕ-7 подвергали мониторингу в течение следующих 72 ч с использованием стандартного способа анализа пролиферации (например, МТТанализа), в основном, как описано Μοзтаηη (см., например, Μοзтаηη, I. Iттиηο1. Ме111. 16: 55-63, 1983). Аденовирусный или ААУ-вектор, несущий ген усиленного зеленого флуоресцентного белка, гАб/ЕСЕР или гААУ/ЕСЕР, использовали в качестве негативного контроля, а рекомбинантный белок 1СЕ-1 человека использовали в качестве позитивного контроля. Результаты из этого МТТ-анализа показали, что как векторная конструкция гАб/1СЕ, так и векторная конструкция гААУ/1СЕ были способны доставлять трансген 1СЕ-1 в клетки-мишени человека (НЕК 293) и что среда таких клеток-мишени после этого была способна индуцировать пролиферацию клеток МСЕ-7 аналогично очищенному белку 1СЕ-1. Не наблюдали значимой пролиферации с использованием среды от клеток, трансфицированных негативными контролями (т.е. гАб/ЕСЕР или гААУ/ЕСЕР). Авторы испытывали также эти векторные конструкции прямой трансфекцией клеток МСС-7 и показали, что конструкции 1СЕ-1 (как в ААУ, так и в аденовирусе) могут быть использованы для прямой индукции пролиферации в трансфицированных клетках образом, сравнимым с введением белка 1СЕ-1 в эти клетки (при концентрации около 3 мкг/мл).

Дополнительные тесты для подтверждения функциональности 1СЕ-1-векторных конструкций могут быть выполнены с использованием миоцитов, в которых можно наблюдать действия 1СЕ-1 на размер и/или функцию мышечных клеток. В качестве иллюстрации действие 1СЕ-1 на эмбриональные неонеатальные кардиомиоциты (ΝίΜ) или дифференцированные (зрелые) кардиомиоциты может быть испытано различными анализами. Например, 1СЕ-1 может быть доставлен аденовирусным или ААУ-векторами для индукции гипертрофии и клеточного синтеза ДНК в NСΜ. После трансдукции NСΜ при подходящей множественности заражения (МО1), обычно в диапазоне около 100-1000, кардиомиоциты окрашивают красителями кристаллическим зеленым или нейтральным красным. Клетки визуализируют под микроскопом и размер индивидуальных клеток, в том числе площадь, длина и ширина могут быть измерены автоматически (например, с использованием программного обеспечения 1таде Р1из). Действие 1СЕ-1 на клеточный синтез ДНК может быть определено количественно по клеточному включению 3Н-тимидина, посредством которого клеточный синтез наблюдают по 3Н-счету после осаждения ТХУ клеточной ДНК.

Векторы, содержащие ангиогенные трансгены, могут быть доставлены к сердцу интракоронарной доставкой, как описано и иллюстрировано здесь. В качестве начального испытания векторов-кандидатов, перед доставкой в модель крупного животного, такого как свинья, авторы использовали также крысиную модель, в которой авторы используют непрямую интракоронарную доставку вектора к миокарду. В этой модели, доставка достигается введением раствора, содержащего вектор (например, в забуференном фосфатом солевом растворе (ЗФР) или забуференном НЕРЕδ солевом растворе), в полость левого желудочка (а именно, введением в просвет полости, противоположно стенке желудочка) после пережимания как легочной артерии, так и дистальной аорты. Таким образом, кровоток из полости этого желудочка несет подлежащий доставке материал в коронарные артерии, так как альтернативные пути временно блокированы. Авторы использовали процедуру пережимания сосудов для сужения легочной артерии и аорты (см., например, На_цаг, е! а1., Ргос. №!1. Асаб. δα. υδΛ, 95: 5251-5256, 1998). Авторы использовали также предобработку вазоактивным агентом, как описано выше и в соответствующей ожидающей одновременного рассмотрения заявке, цитируемой выше, для усиления переноса гена посредством интракоронарной доставки. Авторы обычно используют в качестве вазоактивного агента либо гистамин, либо нитропруссид натрия (δΝΓ). Они могут применяться в диапазонах около 1-75 мг/мл. Обычно авторы используют около 25 мг/мл гистамина, инфузируемого перед доставкой вектора. В случае δΝΓ авторы обычно используют 50 мг/мл этого вазоактивного агента с инфузией, начинающейся за несколько минут перед введением вектора и продолжающейся до тех пор, пока вектор не будет полностью инъецирован. С использованием этих процедур авторы продемонстрировали очень высокие уровни переноса гена к миокарду посредством интракоронарной доставки как аденовирусного вектора, так и ААУ-вектора. Например, с использованием гААУ/ЕСЕР, описанного выше, доставляемого в дозе около 1 х 1011 ДНКазарезистентных частиц, авторы могут достигать трансдукции левого желудочка (ЬУ) при уровнях около 30% клеток (как измерено флуоресцентной микроскопией, после фиксации срезов ЬУ в параформальдегиде и срезания криостатом на срезы 8-10 мкм и количественным определением процента зеленой площади с использованием программного обеспечения 1тадеРго Р1из). Экспрессия гена в миокарде была наибольшей в эпикарде, но значимую экспрессию наблюдали даже в эндокарде. Дополнительно авторы продемонстрировали относительно долгоживущую экспрессию гена (с небольшим, если оно вообще имелось, снижением уровней экспрессии между 30 днями и 180 днями после инъекции) после доставки ААУ-вектора к миокарду, как описано. Кроме того, гистологические и патологические анализы выявили

- 35 008538 небольшую воспалительную реакцию или отсутствие воспалительной реакции в сердце и отсутствие детектируемой экспрессии гена в печени или в легком.

Пример 3. Перенос генов в кардиомиоциты крысы

3-А. Перенос и экспрессия гена Аб.в-да1

Дифференцированные крысиные кардиомиоциты получали перфузией Лангендорфа перфузатом, содержащим коллагеназу в соответствии со стандартными способами. Палочкообразные клетки культивировали на покрытых ламинином чашках и при 24 ч инъецировали кодирующим β-галактозидазу аденовирусом, полученным в описанном выше примере 2, при множественности заражения 1:1. После дополнительного 36-часового периода клетки фиксировали глутаровым альдегидом и инкубировали с Xда1. Обычно 70-90% дифференцированных миоцитов экспрессировали трансген β-галактозидазы после инъекции рекомбинантного аденовируса. При множественности заражения 1-2:1 не наблюдали цитотоксичности.

3- В. Перенос и экспрессия гена гААУ/1ОР-1

Для оценки эффектов экспрессии 1ОР-1 в крысиных неонатальных миоцитах сердца, 2 х 106 клеток высевали на чашки для культуры клеток с диаметром 10 см и инфицировали 1 х 1010 ДНКазарезистентных частиц гААУ/1ОР-1 или гААУ/ЕОРР. Клетки культивировали без сыворотки в минимальной среде и при нормальных уровнях кислорода при 37°С. Рекомбинантный белок 1ОР-1 (50 нг/мл) или фенилэфрин (50 мкМ) добавляли к культуре в качестве позитивных контролей. Клетки оценивали визуально спустя 48 ч после обработки. Клетки, обработанные гААУ/1ОР-1, проявляли значимую гипертрофию (в сравнении с гипертрофией, полученной с использованием фенилэфрина) на основе морфологического вида, в сравнении с необработанными клетками. Экзогенно добавленный белок 1ОР-1, повидимому, индуцировал только слабую гипертрофию в сравнении с гААУ/1ОР-1. Для количественного определения гипертрофии использовали стереологическую программу, 1таде Рго Р1ик (Меб1а СуЬетеБск, Саг1кЬаб, СаБГогша). Вкратце, программа 1таде Рго Р1ик позволяет прослеживать индивидуальные клетки и получать их измерения. Клетки были очерчены в этой программе и были рассчитаны размеры их площади. Приблизительно 50-100 клеток считали на одно состояние и строили графики в статистической программе Рпхт. Было обнаружено, что обработанные фенилэфрином клетки и инфицированные гААУ/1ОР-1 клетки продемонстрировали значимую гипертрофию с сравнении с необработанными клетками.

Кроме исследования гипертрофии, уровень секреции 1ОР-1 в среду после экспрессии гААУ/1ОР-1 определяли с использованием анализа ЕЫ8А для белка 1ОР-1. Вкратце, экспрессию белка обнаруживали в среде инфицированных гААУ/1ОР-1 культур, собранной на 48 ч, при уровнях приблизительно 0,1-1,0 нг/мл, представляющих значимое увеличение над уровнями 1ОР-1 в контрольных популяциях (необработанных или инфицированных гААУ/ЕОРР.

Пример 4. Перенос гена ш у1уо в миокард свиньи

4- А. Перенос и экспрессия гена Аб. в-да1

Кодирующий β-галактозидазу аденовирусный вектор, полученный в примере 2, размножали в пермиссивных клетках 293 и очищали ультрацентрифугированием в градиенте СкС1 с конечным вирусным титром 1,5 х 105 вирусных частиц на основе процедур примера 2. Анестезированную, вентилируемую свинью весом 40 кг подвергали торакотомии. Иглу-ЬийегДу 26 О (калибра) вставляли в среднюю левую переднюю нисходящую (ЬАЭ) коронарную артерию и вектор (1,5 х 1010 вирусных частиц) инъецировали в объеме 2 мл в забуференном фосфатом солевом растворе. Грудную клетку закрывали и животному давали выйти из наркоза. На четвертый день после инъекции животное убивали. Сердце фиксировали глутаровым альдегидом, делали срезы и инкубировали с Х-да1 в течение 16,5 ч. После заливки и приготовления срезов ткань окрашивали контрастным красителем эозином.

Микроскопический анализ срезов ткани (трансмуральных срезов ложа ЬАЭ спустя 96 ч после интракоронарной инъекции аденовируса, содержащего 1;·κΖ) выявил значительный уровень переноса гена, наблюдаемый в коронарном ложе ЬАЭ, причем многие срезы ткани демонстрировали значительную долю клеток, окрашивающихся положительно на β-галактозидазу. Зоны миокарда, удаленные от кровеносного ложа ЬАЭ, не показали окрашивания Х-да1 и служили в качестве негативного контроля, в то время как диффузную экспрессию гена наблюдали в миоцитах и в эндотелиальных клетках. Значительная доля миоцитов показала β-галактозидазную активность (синее окрашивание), и, в последующих исследованиях, использующих интракоронарную инъекцию закрытой грудной клетки, подобная активность присутствовала спустя 14 дней после переноса гена (п=8). Не было доказательства воспаления или некроза в зонах экспрессии гена.

4-В. Перенос и экспрессия гена гААУ/ЕОРР

Кодирующий ЕОРР аденоассоциированный вирусный вектор получали, размножали и очищали, как описано выше в примере 2. Четыре свиньи из питомника (~30 кг каждая) анестезировали, вентилировали и подвергали веносекции по средней линии шеи. Каротидную (сонную) артерию выделяли и вводили проводник (специальный зонд для введения катетера) 5 РгепсБ 1п!гобисег. Многоцелевой ангиокатетер 5 РгепсБ помещали в левую огибающую артерию (ЬСХ) с кончиком катетера, помещенным на приблизи

- 36 008538 тельно 1 см в просвет коронарной артерии. Шприц, применяемый для инъекции гена, сначала промывали ЗФР и затем раствор гена набирали в шприц. Интракоронарный гистамин, 25 мкг/мин, инфузировали в течение 3 мин в ЬСХ перед введением вируса, с последующим введением либо 2,36 х 1013 вирусных частиц гААУ/ТОЕР (п=3), либо 4,72 х 1013 вирусных частиц гААУ/ЕОЕР (и=1). Общий объем 1,5 мл раствора гена инъецировали в каждую свинью при скорости инфузии 1 мл/30 с. Затем ангиокатетер и проводник удаляли и шейный разрез закрывали. Животным давали выйти из наркоза и помещали их в клетку для их содержания до завершения данного исследования.

При 6-8 неделях после инъекции гена свиней умерщвляли и ткани собирали. Сердца иссекали и помещали в охлажденный льдом солевой раствор. Коронарные артерии перфузировали на холоду и ткань собирали и быстро замораживали в жидком азоте. Другие ткани брали подобным образом так быстро, как это возможно, и быстро замораживали в жидком азоте. Как флуоресцентная микроскопия, так и ОТПЦР срезов ткани продемонстрировали успешную доставку и экспрессию гена ЕСЕР гААУ-вектором с использованием этой прямой интракоронарной инъекционной доставки в свиней с закрытой грудной клеткой. В частности, как показано ниже, результаты из ОТ-ПЦР подтвердили, что ген был успешно доставлен и экспрессировался в ложе, снабжаемом кровью инъецированной артерией (т.е. ложе ЬСХ), в сравнении с ложем левой передней нисходящей коронарной артерии (ЬАО):

Свинья №1 Свинья №2 Свинья №3 Свинья №4

Срез 1 ЬСХ + + ++

Срез 2 ЬСХ + - ++

ЬАО....

Пример 5. Свиная модель опосредованной ангиогенезом генотерапии (с использованием трансгена ЕСЕ-5)

В данной свиной модели для миокардиальной ишемии и сердечной недостаточности животных подвергали стрессу электрической стимуляцией предсердия. Степень индуцированной стрессом миокардиальной дисфункции и недостаточного регионарного кровотока определяли количественно и затем выполняли перенос гена интракоронарной инъекцией иллюстративного рекомбинантного аденовируса, экспрессирующего ЕСЕ-5. Перенос гена выполняли после развития стабильного, но ограниченного эндогенного ангиогенеза и обнаружения присутствия индуцируемой ишемии, аналогичной стенокардии (грудной жабе), у пациентов. Животные не имели ишемии в состоянии покоя, но развивали ишемию во время активности или электрической стимуляции предсердия. Контрольные животные получали рекомбинантный аденовирус, экспресси-рующий Ε1Ζ (β-да!), для исключения возможности, что аденовирус сам, независимо от ЕСЕ-5, стимулировал образование новых кровеносных сосудов. Это было также контролем на возможное продолжающееся развитие коллатеральных сосудов, не связанное с переносом генов. Спустя две недели после переноса гена опять измеряли индуцированную стрессом сердечную дисфункцию и регионарный кровоток.

Свиньи, получающие ΙηοΖ. показали сходную степень индуцированной кардиостимуляцией дисфункции в ишемическом районе перед переносом гена и спустя две недели после переноса гена. В противоположность этому, спустя две недели после получения гена ЕСЕ-5 эти животные обнаружили увеличение утолщения стенки и улучшенный кровоток в ишемическом районе во время электрической кардиостимуляции. Эти результаты показали, что генный перенос ангиогенного трансгена (ЕСЕ-5) был эффективным для ослабления регионарной миокардиальной контрактильной дисфункции вследствие улучшения регионарного кровотока посредством новообразованных кровеносных сосудов.

Способы

Животные и модель

Использовали Йоркширских домашних свиней (§И8 хсгоГа. и=27) с весом 47 ± 9 кг. Двух животных подвергали интракоронарной инъекции рекомбинантного аденовируса, экспрессирующего 1;ιοΖ (1011 вирусных частиц в 2,0 мл солевого раствора), и их убивали спустя 3 или 5 дней после инъекции. Оставшиеся 25 животных имели катетеры, помещенные в левое предсердие, легочную артерию и аорту, что обеспечивало средство для измерения регионарного кровотока и мониторинга кровяного давления.

Проволоки закрепляли швами на левом предсердии для возможности регистрации ЭКГ и предсердной электрической стимуляции. Амероидный жгут помещали вокруг проксимальной левой огибающей коронарной артерии. Амероидный материал является гигроскопичным и медленно набухает, приводя к полному закрытию артерии через 10 дней после наложения, с минимальным повреждением (<1% левого желудочка) вследствие развития коллатеральных кровеносных сосудов. Миокардиальная функция и кровоток являются нормальными в состоянии покоя в районе, ранее перфузируемом закупоренной артерией (ишемическом районе), но кровоток является недостаточным для предотвращения ишемии, когда потребности миокарда в кислороде увеличиваются. Образование коллатеральных сосудов завершается в пределах 21 дня помещения амероида и остается неизмененным в течение по меньшей мере 4 месяцев (Κοΐΐι с1 а1., Ат. 1. РЬу8ю1. 253: Н1279-Н1288, 1987). Гидравлическую манжету помещают также вокруг

-37008538 артерии, смежно, но дистально относительно амероида. Эти процедуры описаны подробно Наттопб е1 а1., 1. Ат. Со11. Сагб1о1. 23: 475-482, 1994 и Наттопб е1 а1., 1. С1т. 1пуек1. 92: 2644-2652, 1993. Два животных умерли спустя 5 и 7 дней после помещания амероида. Спустя 38 (±2) дней после помещения амероида, когда ограниченная коллатеральная циркуляция была развита и стабилизирована, животных подвергали исследованиям для определения индуцируемых электрической кардиостимуляцией регионарной функции и кровотока, а затем животные получали рекомбинантный аденовирус, экспрессирующий либо 1;κΖ (п=7, контрольные животные), либо ЕСЕ-5 (п=16, группа обработки), доставляемые интракоронарной инъекцией. Затем, спустя 14 ± 1 дней, повторяли исследования для определения индуцируемых электрической кардиостимуляцией регионарной функции и кровотока. На следующий день животных с Аб1;·κΖ (п=7) и АбЕСЕ-5 (п=11) убивали и собирали ткани. Пять животных с АбЕСЕ-5 исследовали 12 недель после переноса гена и затем убивали. Рекомбинантный аденовирус и доставка трансгена.

Систему хелпер-независимого репликативно-дефектного аденовируса-5 человека получали, как описано в примере 2 выше.

Для интракоронарной доставки трансгена животных анестезировали и артериальный проводник 5Е для катетера помещали в сонную (каротидную) артерию. Многоцелевой (А2) коронарный катетер 5Е вставляли через проводник и в сонные артерии. Замыкание амероида подтверждали во всех животных инъекцией контрастного вещества в левую основную коронарную артерию. Затем кончик катетера помещали глубоко в артериальный просвет проксимальной аорты таким образом, чтобы терялось минимальное количество материала во время инъекции. Четыре миллилитра, содержащие 2 х 1011 вирусных частиц рекомбинантного аденовируса, доставляли медленной инъекцией 2,0 мл как в левую, так и в правую коронарные артерии.

Анализы:

(ί) Регионарная контрактильная функция и перфузия. Двумерные и М-модальные изображения получали из правого окологрудинного приближения на уровне средней сосочковой мышцы с использованием ультразвуковой системы визуализации (Не\\'1е11 Раскагб 8опок 1000). Находящихся в сознании животных обследовали подвешенными в удобной поддерживающей перевязи для минимизации движения тела. Изображения регистрировали на УН8-ленте с использованием животных в базовом (фоновом) состоянии и снова во время левой предсердной электрической стимуляции (частота сердечных сокращений = 200 ударов в минуту). Эти исследования выполняли в день 1 перед переносом гена и повторяли спустя 14 ± 1 дней. Пять животных обследовали опять спустя 12 недель после переноса гена (ЕСЕ-5) для определения, сохранялся ли эффект улучшенной функции. Произведения частота сердечных сокращенийдавление и левые предсердные давления были сходными в обеих группах до и после переноса гена, что указывает на условия сходных потребностей и нагрузки кислорода. Эхокардиографические измерения проводили с использованием стандартизованных критериев (8аЕп е1 а1., Спси1абоп 58: 1072-1083, 1978). Для демонстрации воспроизводимости эхокардиографических измерений, животных подвергали визуализации в два последовательных дня. Данные из этих отдельных определений были высоко воспроизводимыми (утолщение латеральной стенки: г2 = 0,90; Р = 0,005). Процентное уменьшение функции, измеренное трансторакальной эхокардиографией и ультразвуковой микрометрией в этой модели, являются сходными (НаттоНб е1 а1., 1. Ат. Со11. Сагбю1. 23: 475-482, 1994 и Наттопб е1 а1., 1. С1т. 1пуек1. 92: 2644-2652, 1993), что документирует точность эхокардиографии для оценки ишемической дисфункции. Анализ выполняли без знания группы обработки.

Контрастное вещество (ЬегоуМ; микроагрегаты галактозы) увеличивает эхогенность (белизну) изображения после левой предсердной инъекции. Микроагрегаты распределяются в коронарные артерии и стенки миокарда пропорционально кровотоку. Максимальная интенсивность контрастного усиления коррелирует с миокардиальным кровотоком, как измерено при помощи микросфер (8куЬа е1 а1., Спси1аЦоп 58: 1072-1083, 1978). Спустя тридцать восемь (±2) дней после помещения амероида, достаточно отдаленно по времени от смыкания амероида, но до переноса гена, выполняли контрастные эхокардиографические исследования во время электрокардиостимуляции (200 ударов в минуту) предсердий. Исследования повторяли спустя 14 ± 1 дней после генного переноса и, в пяти животных, спустя 2 недели после генного переноса с ЕСЕ-5. Максимальную контрастную интенсивность измеряли по видеоизображеням по компьютерной программе анализа видеоизображений (Со1ог Уие II, Nονа Мкгокошса, 1пб1апаро11к, 1пб1апа), которая обеспечивала объективное измерение интенсивности видеоизображений. Данные выражали в виде отношения максимальной интенсивности видеоизображения в ишемическом районе (ложе ЬСх) к максимальной интенсивности видеоизображения в межжелудочковой перегородке (1У8, района, получающего нормальный кровоток через незажатую левую переднюю нисходящую коронарную артерию). Различия в регионарном кровотоке во время предсердной стимуляции, измеренные контрастной эхокардиографией, были сходными с различиями, измеренными при помощи микросфер, в той же самой модели в лаборатории авторов, что подтверждает точность эхокардиографии для оценки регионарного кровотока миокарда. Контрастные исследования анализировали без знания того, какой ген получило животное.

- 38 008538 (ίί) Оценка ангиогенеза.

Плечеголовную артерию канюлировали, а другие крупные сосуды лигировали. После внутривенной инъекции гепарина (10000 МЕ), папаверина (60 мг) и затем хлорида калия (для индукции остановки сердца в диастоле), аорту пережимали и коронарную сосудистую сеть перфузировали. Раствор глутарового альдегида (6,25%, 0,1М какодилатный буфер) перфузировали при давлении 120 мм рт.ст.; сердце извлекали; ложа идентифицировали с использованием кодируемых цветом красителей, инъецированных антероградно через левую переднюю нисходящую, левую огибающую и правую коронарную артерии; и проверяли амероид для подтверждения закрытия сосудов. Пробы, взятые из нормально перфузируемых и ишемических районов (эндокардиальная треть и эпикардиальная треть), заливали в пластик и готовили для микроскопического анализа числа капилляров. Четыре поперечных среза с толщиной 1 мкм брали из каждой субпробы (эндокарда и эпикарда каждого района), как описано ранее (МаИки-Сокк11о, Мкготакс. Кек. 33: 98-117, 1987 и Роо1е апй МаИки-СокКИо, Ат. I. Рукю1. 259: Н204-Н210, 1990). Число капилляров вокруг каждого волокна и площадь поперечного сечения волокна в каждом из восьми полей зрения в каждой субпробе (случайным образом выбранной системным взятием проб) измеряли анализатором изображения (Укеотейк 150, Атепсап 1ппоуак1оп) при ΧΙ400. Было измерено число капилляров вокруг в целом 325 ±18 волокон. Плотность капилляров (число на площадь поперечного сечения волокна) оценивали счетом точек 15 ± 1 полей зрения на одну субпробу. Относительные стандартные ошибки числа капилляров вокруг волокна, площади поперечного сечения и плотности капилляров были

1,4, 4,1 и 4,2%, соответственно. Отношение капилляры:волокно рассчитывали в виде произведения плотности капилляров на площадь поперечного сечения. Не было значимого различия в площади поперечного сечения волокна в пробах миокарда из любой группы. Бромдезоксиуридин (50 мг/кг) инъецировали в перитонеальную полость пяти животных: контрольного животного (без амероида); двух животных с амероидными блокаторами, которые получали перенос гена 1;«Ζ за две недели до этого; и двух животных с амероидными блокаторами, которые получали перенос гена ЕСЕ-5 за две недели до этого. Спустя тридцать шесть часов после инъекции бромдезоксиуридина (ВКОИ) животных убивали и ткань препарировали для анализа с использованием описанных ранее способов (Калига е1 а1., Спс. Кек. 74:383-400, 1994). Срезы двенадцатиперстной кишки использовали в качестве позитивных контролей.

(ΐϊϊ) Экспрессия ДНК, мРНК и белка.

После переноса гена, гомогенаты левого желудочка подвергали исследованиям для подтверждения присутствия и экспрессии трансгена. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) с использованием смыслового праймера к промотору СМУ (ССАСАССТССТТТАСТСААС; БЕО ΙΌ N0:1) и антисмыслового праймера к внутренней последовательности ЕСЕ-5 (СААААТСССТАСАСАТАТССТ; БЕО ΙΌ N0:2) амплифицировала ожидаемый фрагмент 500 п.н. С использованием смыслового праймера к началу последовательности ЕСЕ-5 (АТСАССТТСТССТТССТССТС; БЕО ΙΌ N0:3) и антисмыслового праймера к внутренней последовательности ЕСЕ-5 (т.е. БЕО ΙΌ N0:2) ОТ-ПЦР амплифицировала ожидаемый фрагмент 400 п.н. Праймеры, направленные против района ДНК аденовируса, использовали для обнаружения вирусной ДНК дикого типа или рекомбинантной вирусной ДНК в тканях (ТССТТТСТСАССАССТСТТС; БЕО ΙΌ N0:4) и (САТСТСААСТСАААСССТСС; БЕО ΙΌ N0:5). Ожидаемый фрагмент 900 п.н. амплифицировали из этого рекомбинантного вируса. Эти исследования проводили на пробах ткани 200 мг из миокарда и других тканей. Чувствительность обнаружения ПЦР была равна 1 вирусной последовательности на 5 млн клеток. Поликлональное антитело, направленное против ЕСЕ-5 (Кйаока е1 а1., Шуей. 0р11а1то1. У1к. Бс1. 35:3189-3198), использовали в иммуноблотах белка из среды культивируемых крысиных фибробластов сердца спустя 48 ч после переноса гена ЕСЕ-5 или ΕκΖ. Белок ЕСЕ-5 был обнаружен в кондиционированной среде после переноса гена ЕСЕ-5, но не после переноса гена Π·«Ζ. Способы для ПЦР и вестерн-блоттинга были описаны подробно в Наттопй е1 а1., Е С1т. Шуей. 92: 2644-2652, 1993, КоЛ е! а1., I. С1т. Шуей. 91: 939-949, 1993 и Тка1 е! а1., Ат. I. РЫкк1. 267:Н2079-Н2085, 1994. Для испытания трансгена на митотическую активность ш ν 11го дифференцированные (зрелые) крысиные сердечные фибробласты инфицировали аденовирусом, кодирующим ЕСЕ-5, или аденовирусом, кодирующим Π«Ζ, или не инфицировали. Среды от этих культур клеток инкубировали с мышиными фибробластами NIН 3Т3 и измеряли включение тритированного тимидина (Тка1 е1 а1., Епйосппокду 136: 38313838,1995). (ίν) Высвобождение аденовируса во время интракоронарной доставки.

Легочную артериальную кровь брали непрерывно во время интракоронарной инъекции рекомбинантного аденовируса в трех животных. Сыворотку из каждой пробы использовали в стандартном анализе бляшкообразования. Неразведенную сыворотку (0,5 мл) добавляли к субконфлюентным клеткам Н293; спустя 10 дней бляшки не образовались. Однако, когда 0,5 мл сыворотки разводили в 200-8000 раз с использованием БМЕМ (2% ФТС), вирусные бляшки образовывались в день 9. Единственное сосудистое ложе (миокардиальное) разделяет коронарные и легочные артерии. Если вирус не присоединяется в этом ложе после инъекции в коронарную артерию, то концентрация вируса в легочной артерии должна отражать разведение коронарной синусной крови ситемной венозной кровью на протяжении времени инъекции. Измерения из лаборатории авторов показывают, что коронарный кровоток представляет 5% кровотока легочной артерии. С использованием этого фактора разведения (2-кратного), продолжительности коронарной инъекции и количества инъецированного вируса авторы рассчитали количество аденовируса,

- 39 008538 доставленного в легочную артерию, с предположением отсутствия ускользания или прикрепления вируса. Эта оценку сравнивали с измеренным количеством и разность использовали в качестве оценки количества вируса, выводимого миокардиальным сосудистым ложем.

(ν) Оценка воспаления.

Гематоксилин/эозин и трехцветные красители Маззои использовали для обнаружения инфильтратов воспаленных клеток, клеточного некроза и фиброза. Мышиные асциты, свиные моноклональные антитела против СЭ4 и против СЭ8 (1,0 мг/мл; УМКЭ, 1ис., Ри11таи, АазЫид1ои) использовали для обнаружения маркеров СЭ4 и СЭ8 на Т-лимфоцитах в замороженных срезах (6 мкм) селезенки (позитивный контроль) и сердца. Эти исследования выполняли на трансмуральных пробах сердец шести животных, которые получали амероидные блокаторы за 50 дней перед убиванием: двух животных, не получавших перенос гена, двух животных, получавших перенос гена ЕСЕ-5 за 2 недели перед убиванием, и двух животных, получавших перенос гена 1;κΖ за две недели перед этим. Анализ проводили без знания группы обработки.

(νί) Статистический анализ.

Данные выражали в виде среднего ± 1 средняя квадратичная ошибка (стандартная ошибка среднего). Измерения, сделанные до и после переноса генов ЕСЕ-5 и №Ζ, сравнивали с использованием двухфакторного дисперсионного анализа (Сгииск4, Сгииск 8ой^аге Согрогайои, Оак1аЮ, СаШогша). Данные из исследований ангиогенеза также подвергали двухфакторному дисперсионному анализу. Нулевую гипотезу отклоняли, когда Р<0,05.

Результаты с использованием трансгена РСР-5

Три измерения использовали для оценки, был ли перенос гена ЕСЕ-5 эффективным в лечении миокардиальной ишемии: регионарной контрактильной функции и перфузии (оцениваемыми до и после переноса гена) и числа капилляров. Все измерения проводили без знания, какой ген получали животные (ЕСЕ-5 против №Ζ).

Регионарная контрактильная функция и кровоток

Спустя тридцать восемь дней после помещения амероида у животных обнаруживали утолщение стенки во время электрической стимуляции предсердия. Свиньи, получающие №Ζ, имели сходную степень индуцированной электрической стимуляцией дисфункции в ишемическом районе перед переносом гена и спустя две недели после переноса гена. В противоположность этому, спустя две недели после переноса гена ЕСЕ-5 было 2,7-кратное увеличение толщины стенки в ишемическом районе во время электрической стимуляции (Р <0,0001; фиг. 6). Утолщение стенки в нормально перфузируемом районе (межжелудочковой перегородке) было нормальным во время электрической стимуляции и на него не влиял перенос гена (% утолщения стенки: №Ζ: перед переносом гена 53 ± 8%, после переноса гена 51 ± 6%; ЕСЕ-5: перед переносом гена 59 ± 4%, после переноса гена 59 ± 6%).

С улучшенной функцией в ишемическом районе был связан улучшенный регионарный кровоток. Спустя две недели после переноса гена №Ζ был стойкий дефицит кровотока в ишемическом районе во время электрической стимуляции (фиг. 8). Однако животные, получающие ген ЕСЕ-5, показали гомогенное контрастное усиление в двух районах спустя две недели, что указывает на улучшенный кровоток в ишемическом районе (Р = 0,0001). Для определения, были ли улучшенная функция и перфузия в ишемическом ложе долгосрочными, пять животных испытывали опять спустя 12 недель после переноса гена ЕСЕ-5. Каждое животное показало стойкие улучшения в функции (Р = 0,005; фиг. 6) и перфузии (Р = 0,001; фиг. 8).

Ангиогенез

Неинфицированные с амероидным пережиманием сосудов животные (без переноса гена) имели физиологические реакции, идентичные реакциям животных, получающих кодирующий №Ζ аденовирус, что указывало на то, что вектор №Ζ не влиял неблагоприятным образом на нативный ангиогенез. Для оценки ангиогенеза число миокардиальных капилляров определяли количественно с использованием микроскопического анализа фиксированных перфузией сердец (фиг. 9). Число капилляров, окружающих каждое миокардиальное волокно, было больше в эндокарде ишемического и неишемического районов в животных, которые получали перенос гена ЕСЕ-5, в сравнении с теми же самыми районами сердец животных, которые получали перенос гена 1;·κΖ (Р = 0,038). Таким образом, улучшенные регионарные функция и перфузия были связаны с капиллярным ангиогенезом спустя две недели после переноса гена ЕСЕ-5. Увеличенное число капилляров вокруг каждого волокна имеет тенденцию увеличиваться в эпикардиальной части стенки после переноса гена ЕСЕ-5 (Р = 0,13). Другие критерии капиллярности, такие как число капилляров на площадь поперечного сечения волокна и число капилляров на число волокон, не изменялись в эндокарде или эпикарде.

Экспрессия ДНК, мРНК и белка

После получения установленных благоприятных действий переноса гена ЕСЕ-5 на функцию, перфузию и число капилляров вокруг каждого волокна, настоятельно требовалось продемонстрировать присутствие и экспрессию этого трансгена в сердце. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и обратную транскриптазу, сопряженную с ПЦР (ОТ-ПЦР), использовали для обнаружения ДНК и мРНК трансген

- 40 008538 ного Е6Е-5 в миокарде из животных, получавших перенос гена Е6Е-5.

После переноса гена пробы левого желудочка испытывали для подтверждения включения и экспрессии трансгена. Вкратце, спустя 3 дня после интракоронарного переноса гена 1ас2 миокард обрабатывали Х-да1 и затем окрашивали контрастным красителем эозином Х120. Исследование с использованием стандартных гистологических способов выявило, что большая часть миоцитов показала βгалактозидазную активность (синее окрашивание). Активность была также видна спустя 14 ± 1 дней после переноса гена во всех животных, получавших перенос гена 1ас2. Более высокое увеличение активности в клетках, содержащих β-галактозидазную активность, подтверждает экспрессию гена в миоцитах. ПЦР-анализ с использованием смыслового праймера, направленного против внутренней последовательности Е6Е-5, проводили для подтверждения присутствия рекомбинантной аденовирусной ДНК, кодирующей Е6Е-5, в ишемическом (ΕΟχ) и неишемическом (ЬАО) районах трех животных, которые получали перенос гена Е6Е-5. Эти результаты, показанные на фиг. 10 А, подтвердили присутствие ожидаемых фрагментов 500 п.н. Затем экспрессию мРНК Е6Е-5 исследовали спустя 14 дней после переноса гена. Как показано на фиг. 10В, амплифицированный ОТ-ПЦР фрагмент 400 п. н. присутствовал в обоих районах из двух животных, тогда как контрольные животные не обнаружили сигнал. Поликлональное антитело, направленное против Е6Е-5, использовали в иммуноблотах белка из среды культивируемых крысиных сердечных фибробластов спустя 48 ч после переноса гена Е6Е-5 или 1ас2. Как показано на фиг. 10С, белок Е6Е-5 обнаруживали после переноса гена Е6Е-5 (Е), но не после переноса гена 1ас2 (β), что продемонстрировало экспрессию и внеклеточную секрецию белка после переноса гена Е6Е-5. Наконец, ПЦР, с использованием набора праймеров, направленных против аденовирусной ДНК (Е2-района), выполняли для определения, присутствует ли аденовирусная ДНК в сетчатке, печени или скелетной мышце двух животных, которые получали интракоронарную инъекцию аденовируса за 14 дней перед этим. Как показано на фиг. 10Ό, ожидаемый амплифицированный фрагмент 900 п.н. был обнаружен только в контрольной дорожке (+), содержащей рекомбинантный аденовирус (в качестве позитивного контроля), но не в дорожках, относящихся к сетчатке (г), печени (1) или скелетной мышце (т) обработанных животных.

Успешный перенос гена был подтвержден как в ишемическом, так и в неишемическом районах. Иммуноблоттинг показал белок Е6Е-5 в миокарде животных, которые получали перенос гена Е6Е-5. В дополнительных экспериментах с использованием культивируемых фибробластов авторы подтвердили, что перенос гена Е6Е-5 придавал этим клеткам способность синтезировать и секретировать внеклеточно Е6Е-5. Среда от культивируемых клеток, инфицированных рекомбинантным аденовирусом, экспрессирующим Е6Е-5, показала митогенную реакцию (14-кратное увеличение в сравнении с контролем; Р = 0,005). Наконец, спустя две недели после переноса гена пробы миокарда (но не пробы печени) из инфицированных 1ас2 животных обнаружили β-галактозидазную активность при гистологическом обследовании. Эти исследования подтверждают перенос гена и экспрессию ίη νίνο и демонстрируют биологическую активность продукта трансгена.

Спустя две недели после интракоронарной инъекции рекомбинантного аденовируса авторы изобретения были неспособны обнаружить вирусную ДНК в печени, сетчатке или скелетной мышце при помощи ПЦР, несмотря на присутствие вирусной ДНК в миокарде. Эти эксперименты показали, что интракоронарная доставка аденовирусного вектора минимизировала системное артериальное распространение вируса до уровня ниже порогов детектирования ПЦР-способов. Этот способ может быть трудным для достижения успеха в животных с меньшим размером коронарной артерии, таких как кролики.

Для оценки эффективности миокардиального поглощения аденовируса авторы изобретения измеряли количество аденовируса, высвободившегося из сердца, взятием проб легочной артериальной крови во время интракоронарной инъекции. Неожиданно 98,7% вируса выводились сердцем при первом пассаже. Неразведенная сыворотка, полученная из легочной артерии во время интракоронарной доставки вируса, была неспособна образовывать вирусные бляшки в подходящих условиях. Таким образом, данное изобретение обеспечивает эффективную специфическую для сердца систему доставки генов.

Оценка воспаления

Микроскопическое обследование трансмуральных срезов сердец животных, которые получали рекомбинантный аденовирус, не обнаружили инфильтратов воспаленных клеток, клеточного некроза или увеличенного фиброза. В качестве дополнительной оценки на индуцируемый аденовирусом цитопатический эффект авторы проводили иммуногистологические исследования для обнаружения антигенов ΟΌ4 и ΟΌ8, которые указывали бы на присутствие цитотоксических Т-клеток. Эти исследования показали редкие позитивные клетки на трансмуральных срезах сердца из неинфицированных животных (η=2) или животных, которые получали рекомбинантный аденовирус (η=4). Печень не содержала воспаления.

Пример 6. Опосредованный геном ангиогенез с использованием трансгена Е6Е-4

Этот экспериментальный пример продемонстрировал успешную генотерапию с использованием кодирующего другой ангиогенный белок гена, Е6Е-4. Протокол для терапии с геном Е6Е-4 был по существу таким, какой описан в примере 5 для Е6Е-5.

Ген Е6Е-4 человека выделяли из библиотеки кДНК, которую конструировали из мРНК клеток ΝΙΗ3Τ3, трансформированных ДНК саркомы Капоши. кДНК Е6Е-4 имеет длину около 1,2 т.п.н. и коди

- 41 008538 рует полипептид из 206 аминокислот, в том числе сигнальный полипептид из 30 аминокислот на Ν-конце (Эе11 Βονί е! а1. Се11 50:729-737, 1987; Ве^кй е! а1., 1. Се11 Βίο1. 121:705-713, 1993). Авторы изобретения субклонирова-ли кДНК РСР-4 в виде по существу полноразмерного ΕсοКI-фрагмента 1,2 т.п.н. в сайт ЕтоШ в аденовирусном векторе рАССМУрЬрА8К (для простоты рАС8К). 5'-стартовый сайт находился при паре оснований 243, а 3'-конец при паре оснований 863. Рекомбинантный аденовирус, кодирующий РСР-4 (также называемый здесь Аб.РСР-4), получали, как описано в примере 2 для получения РСР-5аденовируса.

Экспрессию РСР-4 в ткани сердца (и отсутствие экспрессии в других тканях, в том числе печени, скелетной мышце и в глазу) подтверждали Вестерн-блот-анализом с использованием антитела против РСР-4 для детектирования. Испытывали также митогенное действие РСР-4 на пролиферацию эндотелиальных клеток ш νί!Γο.

Спустя сорок пять дней после помещения амероида животных подвергали исследованиям для определения индуцированных стрессом регионарной функции и кровотока и затем полученный рекомбинантный аденовирус, экспрессирующий РСР-4 (п=6 животных), доставляли интракоронарной инъекцией. Спустя тринадцать дней, исследования для определения индуцированных стрессом регионарной функции и кровотока повторяли. На следующий день животных убивали и ткани собирали.

Доставка трансгена

Как и в случае РСР-5 перенос гена выполняли после затухания эндогенного ангиогенеза и получения индуцируемой миокардиальной ишемии, аналогичной стенокардии (грудной жабе) у пациентов. Для интракоронарной доставки трансгена животных анестезировали и артериальный проводник 5Р для катетера помещали в сонную (каротидную) артерию. Многоцелевой (А2) коронарный катетер 5Р вставляли через проводник и в сонные артерии. Замыкание амероида подтверждали во всех животных инъекцией контрастного вещества в левую основную коронарную артерию. Затем кончик катетера помещали на 1 см в артериальный просвет таким образом, чтобы минимальное количество материала терялось в проксимальной аорте во время инъекции. Пять миллилитров, содержащие 1,5 х 1012 вирусных частиц рекомбинантного аденовируса, экс-прессирующего РСР-4, доставляли медленной инъекцией 3,0 мл в левую и 2,0 мл в правую коронарные артерии.

Результаты с использованием трансгена ЕСЕ-4 Регионарная функция и перфузия

Спустя сорок пять дней после помещения амероида животные обнаруживали нарушенное утолщение стенки во время электрической стимуляции предсердий. В противоположность этому, спустя две недели после переноса гена РСР-4 было 2,7-кратное увеличение толщины стенки в ишемическом районе во время электрической стимуляции (р<0,0001; фиг. 11 и 12). Утолщение стенки в нормально перфузируемом районе (межжелудочковой перегородке) было нормальным во время стимуляции и на него не влиял перенос гена. Улучшение функции после переноса гена РСР-4 было статистически неотличимым от улучшения, полученного после переноса гена РСР-5 или РСР-2Ы + сигнальный пептид (кр) (фиг. 11). Улучшенная функция в ишемическом районе была связана с улучшенной регионарной перфузией (фиг. 12). Как показано на фиг. 12, перед переносом гена РСР-4 был недостаточный кровоток в ишемическом районе во время электрической стимуляции. Спустя две недели после переноса гена РСР-4 однородное контрастное усиление было видно в обоих районах, что указывало на улучшенный кровоток в ишемическом районе (р=0,0001). Результаты с РСР-4 были статистически неотличимы от результатов, полученных с РСР-5 и РСР-2Ь1 + кр (фиг. 13). РСР-2Ы + кр описан в примере 7 и является РСР-2, содержащим сигнальную последовательность.

Экспрессия трансгена

Эксклюзивную экспрессию РСР-4 в сердце подтверждали выполнением ПЦР и ОТ-ПЦР с использованием праймеров, специфических для последовательностей, кодирующих этот трансген. ДНК и мРНК РСР-4 обнаруживали в сердце, но они отсутствовали в глазу, печени и скелетной мышце. Эти данные подтверждают результаты, полученные при использовании Аб.РСР-5 (п=2) и Аб.РСР-2Ь1 + кр (п=1). Таким образом, эксклюзивную экспрессию этого трансгена в сердце подтверждали во всех четырех животных, которые получали аденовирусные векторы, содержащие разные гены, кодирующие ангиогенный белок.

Отсутствие воспаления миокарда

Исследовали трансмуральные миокардиальные биопсии из трех животных, которые получали Аб.РСР-4. Животных убивали спустя 2 недели после переноса гена. Не было доказательства инфильтратов воспаленных клеток, некроза или увеличенного фиброза в этих срезах в сравнении с контрольными амероидными животными, которые не получали аденовирус. Это имело место как в ложе ЬАО, так и в ложе ЬСх. Эти микроскопические препараты исследовались патологом, который производил оценку без знания варианта (вслепую) и высказал мнение, что не было доказательства миокардита ни в одном срезе.

Пример 7.Опосредованный геном ангиогенез при использовании мутеина РСР-2

Этот эксперимент продемонстрировал успешную генотерапию с использованием гена, кодирующего третий ангиогенный белок, РСР-2. Этот эксперимент демонстрирует также, каким образом ангиогенный белок может быть модифицирован для увеличения секреции и потенциально улучшения эффектив

- 42 008538 ности ангиогенной генотерапии в усилении кровотока и сердечной функции в сердце. Протокол, использованный для терапии с геном ЕСЕ-2 человека, был фактически идентичен протоколу, примененному для ЕСЕ-5 и ЕСЕ-4 выше.

Кислый ЕСЕ (аЕСЕ, ЕСЕ-1) и основной ЕСЕ (ЕСЕ-2) не содержат нативной секреторной последовательности; хотя некоторая секреция белка может иметь место. Альтернативный секреторный путь, не включающий в себя аппарат Гольджи, был описан для кислого ЕСЕ. Получали две конструкции ЕСЕ-2 (ЕСЕ-2Ь1+8р и ЕСЕ-2Ь1-8р), одну с последовательностью, кодирующей сигнальный пептид (ЕСЕ-2Ы+§р) для классического секреторного пути белка и одну без кодирующей сигнальный пепетид последовательности (ЕСЕ-2Ы-8р), для испытания на улучшенную эффективность ЕСЕ-2, имеющего добавленный сигнальный пептид, в сравнении с тем же самым белком без добавленного сигнального пептида.

Как показано ниже, ЕСЕ-2 имеет петлевую структуру из пяти остатков, которая простирается от аминокислотного остатка 118 до остатка 122. Эта петлевую структуру заменяли при помощи кассетного направленного мутагенеза соответствующей петлей из пяти остатков из интерлейкина-1в с получением мутантов с заменой петли ЕСЕ-2Ы. Вкратце, ген, кодирующий С1и3,5ЕСЕ-2 (^66οη е! а1., Апп. Ν.Υ. Асаб. 8с1. 638:98-108, 1991), клонировали в экспрессирующий вектор Т7 рЕТ-3а (М13), произведенный из рЕТ-3а (Κο^η^Γ§ е! а1., Сене 56:125-135, 1987), между сайтами рестрикции Ше1 и ВатН1. Уникальные сайты рестрикции, Βδ!ΒΙ и 8рИ, вводили в этот ген таким образом, чтобы не производить изменения в кодируемых аминокислотах (т. е. молчащие мутации), в положениях, которые фланкируют кодоны, кодирующие сегмент ^Γ117-Τιρ123 ЕСЕ-2.

Структурное сопоставление 1 петель β9-β10 в ЕСЕ-1, ЕСЕ-2 и ΙΌ-1 β.

110 115 120 125 130

ЕСЕ-1 ΕNНΥNΤΥI§ΚΚНΑΕΚНVЕУС^ΚΚNС (8ΕΟ Ш N0:6)

110 115 120 125 130

ЕСЕ-2 8\\¥\Т¥К8КК¥..Т8У¥УАЕККТС (8ΕΟ ΙΌ N0:7)

110 115 120 125

ΙΌ-1β NNΚ^ΕЕΕ§Α^Е..ΡNVΥI8Τ§^ΑΕ (8ΕΟ ΙΌ N0:8)

Нумерация для ЕСЕ-1 и ЕСЕ-2 идет от аминокислотного остатка 1, расшифрованного из кДНКпоследовательности, кодирующей форму из 155 остатков (описанную в №66οη е! а1., Ат. Ν.Υ. Асаб. 8сЕ 638:98-108, 1991), а нумерация для ЕС-1 β идет от остатка 1 зрелого полипептида из 153 остатков (1б.).

Замену остатков Агд 118-Όν 8119-Τν г 120-Τ11Γ121-8ег 122 ЕСЕ-5 последовательностью человека А1аСк-Рке-Рго-Аы! из соответствующей петли структурного аналога ЕС-1 β (115-119) выполняли по существу следующим образом.

ДНК плазмиды, рЕТ-3а (М13), подвергали расщеплению Βδ!ΒΙ и 8рП и полученный более крупный ДНК-фрагмент выделяли при помощи гель-электрофореза в агарозе. Этот ДНК-фрагмент лигировали при помощи ДНК-лигазы Т4 с двухцепочечной ДНК, полученной отжигом двух синтетических олигонуклеотидов: 5'-ССΑΑССΑΤΤССΑΑΤСΤΑΑΤΑ

ΑСΤΑСΑΑΤΑССΤΑССССΤСΤ ССССАет^'С СΤΑΑСΤССΤΑ ΤСΤСССΑСΤΤ ААСС-3' (8ΕΟ ΙΌ N0:9) и 5'-СΤΑСССΤΤΑΑ СΤСССΑСΑΤΑ ^АС^А^А ААСТССССАС ΑССССΤΑССΤ А^ОТАС^А ^АСА^^А АТОСЕГ^' (8Ε0 ΙΌ N0:10), которые содержат концы, совместимые с концами, получаемыми расщеплением Βδ!ΒΙ и 8р1Е Продукт лигирования использовали для трансфекции клеток ВхскепсЫа ^1ί (штамма ОН5о). Желаемую мутантную плазмиду (ЕСЕ-2Ы) отбирали на основе чувствительности к расщеплению во вновь введенном сайте рестрикции АЙ2 (подчеркнутом выше).

ЕСЕ-2Ы с сигнальным пептидом и без сигнального пептида конструировали с использованием способа на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для добавления последовательностей сигнального пептида ЕСЕ-4 к 5' ЕСЕ-2Ы и для гарантии, что сигнальный пептид будет отщеплен от ЕСЕ-2БЕ использовали кассету генов, примененную ΕοϊΌΐίβΙι Κ е! а1. для получения секретируемого ЕСЕ-1. С использованием праймера (рЕ1В: 5'-ССССАТСССС ССАТСССССС ССССССАСС СС-3' (8ΕΟ ΙΌ N0:11), спаривающегося с 5'-частью сигнального пептида ЕСЕ-4, и второго праймера (рЕ2К: 5'-СССΑΑΤΤСΤС ΤСΑΑССΤССΤ 6А’ПТССС-3' (8Ε0 ΙΌ N0:12) к 5'части ЕСЕ-1 авторы изобретения синтезировали, при помощи ПЦР, ДНК-фрагмент, содержащий сайт ВатШ на 5'-конце последовательностей сигнального пептида ЕСЕ-4, за которым следуют первые десять аминокислот ЕСЕ-1 и сайт Ε^ΚΙ на 3'-конце. С использованием другой пары праймеров (рЕ3К: 5'-СССΑΑΤΤСΑΤ СССТСААССС СΑΑΑΤСΑСС-3' (8Ε0 ΙΌ N0:13) и рЕ4НА: 5'-ССΤСΤΑСΑΤΤ АС^ОТАетС ТСССАСОТСС ΤΑΤСССΤΑСС ΤСΤΤΑССΑСΑ СΑΤΤССΑΑСΑ ААААС-3' (8Ε0 ΙΌ N0: 14)), спаривающихся с последовательностями 5'- и 3'- ЕСЕ-2Ы, соответственно, авторы получили второй ДНК-фрагмент, который имеет сайт Ε^ΚΙ на 5'-конце и метку гемагглютинина гриппа (НА) плюс сайт ХЬа! на 3'-конце ЕСЕ-2Е1. Затем эти два фрагмента субклонировали в вектор рс^NΑ3 в сайтах ВатШ и ХЬа! лигированием трех молекул. Плазмиду рЕСЕ2^I/с^NΑ3, которая была сходной с р8ΡЕСЕ-2^I/с^NΑ3, за исключением того, что она не имела сигнального пептида, субклонировали сходным образом. Затем обе плазмиды секвенировали для подтверждения правильности инсертов. Затем оба фрагмента ЕСЕ-2 Б! выделяли из рс^NΑ3 расщеплением ВатШ и ХЬа! и субклонировали в рАССМУрЬрА§К(+) (для простоты рАС8К), которая является чел

- 43 008538 ночным вектором, для получения рекомбинантного вируса. Рекомбинантный вирус и инъецируемый вектор готовили по существу, как описано в примере 2. Перенос гена выполняли, как описано в примере 5 (с использованием 8 животных для ЕСЕ-2Ы кр+ и 6 животных для ЕСЕ-2Ы кр-, с вектором ΕκΖ, служащим в качестве контроля, все с 1011-1012 вирусными частицами).

Результаты с применением мутеинов РСР-2

Спустя две недели после переноса гена ЕСЕ-2Ы +кр, отношение максимальных интенсивностей контрастов (ЬСх/ЬУ) во время вызываемого электрической стимуляцией при 200 ударах в минуту стресса значимо улучшалось в сравнении с переносом прегена. Фиг. 13 показывает результаты с использованием интракоронарного переноса гена рекомбинантным аденовирусом, экспрессирующим ΕκΖ, ЕСЕ-5, ЕСЕ-2Ы +кр, ЕСЕ-2Ы -кр и ЕСЕ-4 для сравнения. Черный столбец на правой стороне фиг. 13 показывает отношение нормального кровотока с использованием этого способа. ЕСЕ-2Ы +кр нормализовал отношение максимальных интенсивностей контрастов кровотока в этих животных.

Процент утолщения стенки также улучшался спустя две недели после интракоронарной доставки рекомбинантного аденовируса, экспрессирующего ЕСЕ-2Ы +кр. Фиг. 11 показывает результаты с использованием интракоронарного переноса гена рекомбинантного аденовируса, экспрессирующего ΕκΖ, ЕСЕ-5, ЕСЕ-2Ы +кр, ЕСЕ-2Ы -кр и ЕСЕ-4 для сравнения. Черный столбец на правой стороне фиг. 11 показывает нормальный процент утолщения стенки перед индуцируемым электрической стимуляцией стрессом. ЕСЕ-2Ы +кр улучшал регионарную функцию до степени, которая была статистически неотличимой от степени улучшения с использованием ЕСЕ-5. Хотя некоторое улучшение было отмечено после переноса гена ЕСЕ-2Ы -кр, улучшение с использованием содержащего сигнальный пептид трансгена было более значительным (фиг. 13).

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ увеличения кровотока в ишемической ткани скелетной мышцы пациента, предусматривающий доставку трансгена, кодирующего ангиогенный белок или пептид, к ишемической ткани скелетной мышцы путем инъекции раствора, содержащего вектор, содержащий трансген, в указанную ткань, посредством чего этот трансген экспрессируется в ткани, где ангиогенный белок или пептид вызывает увеличение кровотока и уменьшение ишемии в ткани, и где ангиогенный белок или пептид выбирают из тромбоцитарного фактора роста, фибробластного фактора роста, инсулиноподобного фактора роста, индуцируемого гипоксией фактора, ангиопоэтина, синтазы окиси азота, фактора роста гепатоцитов, цинк-связывающего белка, содержащего множество мотивов типа «цинковый палец», который индуцирует экспрессию эндогенного ангиогенного гена.
2. Способ по п.1, в котором инъекция представляет собой болюсную инъекцию.
3. Способ по п.1 или 2, в котором раствор содержит по меньшей мере около 1 мл.
4. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанный ангиогенный белок или пептид является фибробластным фактором роста.
5. Способ по п.4, где указанный фибробластный фактор роста является аЕСЕ, БЕСЕ, ЕСЕ-4, ЕСЕ-5 или ЕСЕ-6.
6. Способ по любому из пп.1-3, где указанный ангиогенный белок или пептид является инсулиноподобным фактором роста.
7. Способ по п.6, где указанный ангиогенный белок или пептид является инсулиноподобным фактором роста 1.
8. Способ по любому из пп.1-3, где указанный ангиогенный белок или пептид является индуцируемым гипоксией фактором.
9. Способ по любому из пп.1-3, где указанный ангиогенный белок или пептид является ангиопоэтином.
10. Способ по любому из пп.1-3, где указанный ангиогенный белок или пептид является фактором роста гепатоцитов.
11. Способ по любому из пп.1-3, где указанный ангиогенный белок или пептид является цинксвязывающим белком, содержащим множество мотивов типа «цинковый палец», который индуцирует экспрессию эндогенного ангиогенного гена.
12. Способ по любому из пп.1-3, где указанный ангиогенный белок или пептид является конститутивной синтазой окиси азота.
13. Способ по любому из пп.1-12, где указанный вектор содержит дополнительно второй трансген.
14. Способ по любому из пп.1-12, где указанный вектор содержит по меньшей мере два трансгена, каждый из которых независимо кодирует ангиогенный белок или пептид.
15. Способ по п.6, где второй трансген кодирует белок, который индуцирует кровоток и/или сократительную функцию.
16. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанный ангиогенный белок или пептид содержит секреторную сигнальную последовательность.
17. Способ по любому из предшествующих пунктов, где пациент имеет заболевание перифериче

- 44 008538 ских сосудов.
18. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанный вектор является аденовирусным вектором или аденоассоциированным вирусным вектором.
19. Способ по п.18, где вектор является репликативно-дефектным аденовирусным вектором.
20. Способ по п.19, где приблизительно 10⁹-10¹² аденовирусных частиц доставляются ш у1уо.
21. Способ по любому из пп.1-17, где вектор является невирусным вектором.
22. Способ по п.21, где вектор представляет собой платформу для доставки на основе невирусного белка или вектор на основе липида.
23. Способ по любому из предшествующих пунктов, где вектор представляет собой нацеленный вектор.
24. Способ по п.23, где нацеленный вектор включает половину пары лиганд-рецептор, а клеткамишень в ишемической ткани включает другую половину пары лиганд-рецептор.
25. Способ по любому из предшествующих пунктов, где экспрессия трансгена запускается конститутивным промотором.
26. Способ по п.25, в котором конститутивный промотор является промотором СМУ.
27. Способ по любому из пп.1-24, где экспрессия трансгена запускается тканеспецифическим промотором.
28. Способ по любому из предшествующих пунктов, где сократительная функция в ишемической ткани увеличивается.
29. Способ по любому из предшествующих пунктов, где доставка вектора к ишемической ткани пациента совпадает с или ей предшествует на несколько минут доставка вазоактивного агента в кровеносный сосуд, снабжающий ишемическую ткань.
30. Способ по п.29, в котором вазоактивный агент включает донор окиси азота.
31. Способ по п.29, в котором вазоактивный агент включает нитропруссид натрия.
32. Способ по п.31, в котором нитропруссид натрия находится в концентрации около 1-75 мг/мл.
33. Способ по п.32, в котором нитропруссид натрия находится в концентрации около 50 мг/мл.
34. Композиция для генной терапии для применения в способе по п.1, включающая в себя вектор, содержащий трансген, кодирующий ангиогенный белок или пептид, выбранный из тромбоцитарного фактора роста, фибробластного фактора роста, инсулиноподобного фактора роста, индуцируемого гипоксией фактора, ангиопоэтина, синтазы окиси азота, фактора роста гепатоцитов, и цинк-связывающего белка, содержащего множество мотивов типа «цинковый палец», который индуцирует экспрессию эндогенного ангиогенного гена.
35. Композиция по п.34, где указанный вектор является вирусным вектором.
36. Композиция по п.35, где указанный вектор является репликативно-дефектным вирусным вектором.
37. Композиция по п.35, где указанный вектор является аденовирусным вектором.
38. Композиция по п.37, где указанный вектор является репликативно-дефектным аденовирусным вектором.
39. Композиция по п.37, содержащая приблизительно 10⁷-10¹³ аденовирусных векторных частиц.
40. Композиция по п.39, содержащая приблизительно 10⁹-10¹² аденовирусных векторных частиц.
41. Композиция по п.34, где экспрессия указанного трансгена запускается промотором СМУ, который содержится в векторе.
42. Композиция по п.34, где экспрессия указанного трансгена запускается тканеспецифическим промотором, который содержится в векторе.
43. Композиция по п.34, в которой указанный ангиогенный белок или пептид является фибробластным фактором роста.
44. Композиция по п.43, в которой указанный ангиогенный белок или пептид является фибробластным фактором роста, выбранным из группы, состоящей из аРОР, ЬРОР, РОР-4, РОР-5 и РОР-6.
45. Композиция по п.34, в которой указанный ангиогенный белок или пептид является тромбоцитарным фактором роста.
46. Композиция по п.45, в которой указанный тромбоцитарный фактор роста выбирают из группы, состоящей из РЭСР А и РЭСР В.
47. Композиция по п.34, в которой указанный ангиогенный белок или пептид является инсулиноподобным фактором роста.
48. Композиция по п.47, в которой указанный ангиогенный белок или пептид является инсулиноподобным фактором роста 1.
49. Композиция по п.34, в которой указанный ангиогенный белок или пептид содержит сигнальный пептид.
50. Композиция по п.34, в которой указанный ангиогенный белок или пептид является ангиогенным полипептидным регулятором.
51. Композиция по п.34, в которой указанный вектор содержит дополнительно второй трансген, кодирующий ангиогенный белок или пептид.

- 45 008538
52. Композиция по п.34, в которой указанный вектор содержит трансген или трансгены, кодирующие по меньшей мере два ангиогенных белка или пептида.
53. Композиция по п.52, в которой указанные ангиогенные белки или пептиды, каждый независимо, выбраны из группы, состоящей из тромбоцитарного фактора роста, фибробластного фактора роста, инсулиноподобного фактора роста, индуцируемого гипоксией фактора, ангиопоэтина, синтазы окиси азота, фактора роста гепатоцитов, и цинк-связывающего белка, содержащего множество мотивов типа «цинковый палец», который индуцирует экспрессию эндогенного ангиогенного гена.
54. Композиция по п.52, в которой первый из указанных ангиогенных белков или пептидов выбран из группы, состоящей из тромбоцитарного фактора роста, фибробластного фактора роста, инсулиноподобного фактора роста, индуцируемого гипоксией фактора, ангиопоэтина, синтазы окиси азота, фактора роста гепатоцитов, и цинк-связывающего белка, содержащего множество мотивов типа «цинковый палец», который индуцирует экспрессию эндогенного ангиогенного гена, и в которой второй из указанных ангиогенных белков или пептидов выбран из другого представителя указанной группы.
55. Композиция по п.52, в которой первый из указанных ангиогенных белков или пептидов является фибробластным фактором роста, а второй из указанных ангиогенных белков или пептидов является инсулиноподобным фактором роста.
56. Композиция по п.52, в которой указанный вектор содержит трансген или трансгены, кодирующие фибробластный фактор роста и инсулиноподобный фактор роста.
57. Композиция по любому из пп.34-56, дополнительно содержащая фармацевтический эксципиент.
58. Набор для применения в способе по п.1, включающий вектор, содержащий трансген, кодирующий ангиогенный белок или пептид, выбранный из тромбоцитарного фактора роста, фибробластного фактора роста, инсулиноподобного фактора роста, индуцируемого гипоксией фактора, ангиопоэтина, синтазы окиси азота, фактора роста гепатоцитов, и цинк-связывающего белка, содержащего множество мотивов типа «цинковый палец», который индуцирует экспрессию эндогенного ангиогенного гена.
59. Набор по п.58, дополнительно содержащий устройство для введения этой композиции в ткань ίη νίνο.
60. Набор по п.59, в котором устройство является катетером.
61. Набор по любому из пп.58-60, дополнительно содержащий вазоактивный агент.
62. Набор по п. 61, в котором вазоактивный агент содержит донор окиси азота.
63. Набор по п.61, в котором вазоактивный агент включает нитропруссид натрия.
64. Набор по п.63, в котором нитропруссид натрия находится в концентрации около 1-75 мг/мл.
65. Набор по п.63, в котором нитропруссид натрия находится в концентрации около 50 мг/мл.