TW202417631A - 用ａａｖ基因治療載體治療心肌病 - Google Patents
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Abstract
本文提供治療患有肥厚性心肌病之個體之功能性心臟肌球蛋白結合蛋白C水平降低的基因治療組成物及方法。
Description
本文提供重組腺相關病毒(rAAV)基因治療載體及病毒顆粒，其可用於藉由增加心臟肌球蛋白結合蛋白C (cMyBP-C)之表現來治療及預防肥厚性心肌病。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2022年9月22日申請之美國臨時專利申請案第63/376,712號及2023年8月16日申請之美國臨時專利申請案第63/519,967號的優先權，該等臨時專利申請案中之各者以全文引用之方式併入本文中。
序列表之併入
本專利申請案包括電子格式之序列表(文件名：PCT_SeqListing.xml；創建於2023年9月6日；763,166位元組)且以全文引用之方式併入本文中。
雖然在預防由環境因素諸如菸鹼、高膽固醇血症或糖尿病引起之心臟病及對症治療心臟病況方面已取得相當大的進展，但仍需要改良遺傳性心肌病之治療的方法。由遺傳因素引起之心肌病為肥厚性心肌病(HCM)、擴張性心肌病(DCM)及致心律失常性右心室心肌病(ARVC)。
肥厚性心肌病為最普遍的遺傳性心臟病，且特徵在於原因不明的左心室肥厚。肥厚性心肌病與最初收縮功能正常，但舒張功能受損相關(Elliott等人,
Eur. Heart J.29: 270-6 (2008)；Gersch等人,
J. Thorac. Cardiovasc. Surg.142: el53-203 (2011)。肥厚性心肌病在一般人群中的發病率特別高，約為1:500 (Maron等人,
Circulation,92: 785-9 (1995)，且為年輕人尤其是運動員心因性猝死的主要原因。雖然HCM為一種危及生命的疾病，但迄今為止尚無治癒性治療(Carrier等人,
Cardiovasc. Res. 85:330-338 (2010)；Schlossarek等人,
J. Mol. Cell. Cardiol.50: 613-20 (2011)。
遺傳性肥厚性心肌病為一種遺傳性疾病，已知由至少10個編碼心臟肌節成分之基因中的超過1000種不同突變引起，諸如心臟肌球蛋白結合蛋白C (cMyBP-C)、β-肌球蛋白重鏈(MYH7)、心臟肌鈣蛋白T (TNNT2)、心臟肌鈣蛋白I (TNNI3)、肌球蛋白心室必需輕鏈1 (MYL3)、肌球蛋白心室調節輕鏈2 (MYL2)、心臟a肌動蛋白(ACTC)、a-肌旋蛋白(TPMl)、肌聯蛋白(TTN)、四個半LIM蛋白1 (FHL1) (Richard等人,
Circulation, 107: 2227-2232 (2003)；Schlossarek等人,
J. Mol. Cell Cardiol.50: 613-20 (2011)；Friedrich等人,
Hum. Mol. Genet.21: 3237-54 (2012)。許多突變為編碼全長突變多肽之誤義突變，而其他框移或剪接位點突變可導致截短(Marian等人,
Circ. Res.121: 749-70 (2017)；Walsh等人,
Genet. Med. 19: 192-203 (2017)。最常見的截短突變多肽為MYBPC3及FHL1，其主要表現為框移突變，導致C端截短蛋白。
HCM中最頻繁突變的基因為MYBPC3，其編碼心臟肌球蛋白結合蛋白C (cMyBP-C) (Bonne等人,
Nat. Genet.11 :438-40 (1995)；Watkins等人,
N. Engl. J. Med. 364: 1643-56 (2011)。cMyBP-C為肌節A帶之主要成分，其中其與肌球蛋白、肌動蛋白及肌聯蛋白相互作用(Schlossarek等人,
J. Mol. Cell. Cardiol.50: 613-20 (2011)。在人類及小鼠中，cMyBP-C僅在心臟中偵測到(Fougerousse等人,
Circ. Res. 82: 130-3 (1998)且參與心肌收縮及鬆弛的調節(Pohlmann等人,
Circ. Res. Circ. Res.101: 928-38 (2007)；Schlossarek等人,
J. Mol. Cell. Cardiol.50: 613-20 (2011)。MYBPC3基因中約70%之突變導致框移且產生C端截短蛋白(Carrier等人,
Circ. Res. 80: 427-34 (1997)。截短蛋白不穩定且從未在患者心肌組織中偵測到(Marston等人,
Circ. Res.105: 219-22 (2009)；van Dijk等人,
Circulation,119: 1473-83 (2009)；van Dijk等人,
Circ. Heart Fail.5: 36-46 (2012)。
目前基於藥物之HCM治療緩解症狀，但不治療疾病的潛在遺傳原因。基於基因或基於RNA之療法將為HCM之唯一治癒性治療。已結合非遺傳性心臟疾病成功地測試基因治療方法(Jessup等人,
Circulation,124: 304-13 (2011)。
本文所描述之實施例係關於一種載體構築體、重組複製缺陷型AAV顆粒、細胞及醫藥組成物，其用於向患有HCM之個體或缺乏功能性心臟肌原纖維蛋白諸如cMyBP-C之個體遞送心臟肌球蛋白結合蛋白C (cMyBP-C)。本文所描述之實施例亦關於此類AAV顆粒或此類載體構築體將編碼cMyBP-C之基因遞送至此類個體之心肌的用途。
基因治療載體適用於治療或預防需要治療之哺乳動物個體、較佳人類個體之HCM。在一些實施例中，需要治療之個體為攜帶至少一個或兩個編碼cMyBP-C之基因中之突變的個體。在向待治療之個體投予後，載體提供所編碼之心臟肌球蛋白結合蛋白在個體中、較佳在該個體之心肌中之表現。
在一個態樣中，本文所描述之實施例提供一種載體構築體，其包含編碼功能性cMyBP-C蛋白之核酸序列。在一或多個實施例中，功能性cMyBP-C蛋白包含與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列(人類心臟肌球蛋白結合蛋白C)至少90%、95%或98%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，功能性cMyBP-C蛋白包含與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列。在例示性實施例中，編碼功能性心臟肌球蛋白結合蛋白C之核酸序列為野生型序列，其中SEQ ID NO: 1、42及43為實例，或經密碼子最佳化，或為變異體。替代性密碼子最佳化或變異人類心臟肌球蛋白結合蛋白C編碼序列如SEQ ID NO: 44-46所示。在一些實施例中，心臟肌球蛋白結合蛋白C (cMyBP-C)之編碼序列經密碼子最佳化以在人類中表現。在一些實施例中，編碼功能性cMyBP-C之核酸序列與SEQ ID NO: 1或42-46中之任一者至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。
待表現之蛋白質亦可為功能變異體，其與SEQ ID NO: 2相比表現出顯著的胺基酸序列一致性(亦即，至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)。在此上下文中，術語「功能變異體」意謂cMyBP-C蛋白之變異體能夠實現天然存在之cMyBP-C蛋白的功能，例如為肌節提供結構及/或功能支持以恢復正常心肌收縮性，且視情況能夠抑制突變cMyBP-C蛋白或其他突變肌原纖維蛋白之表現及/或降低其水平。
cMyBP-C蛋白之功能變異體可包括例如藉由一或多個胺基酸取代、缺失或添加而與其天然存在之對應物不同的蛋白質。舉例而言，SEQ ID NO: 2之人類cMyBP-C蛋白的變異蛋白可具有至少2、3、4、5、6、10或更多及/或至多10、20、30或更多個位置相對於SEQ ID NO: 2經另一個胺基酸取代之胺基酸序列。作為另一實例，SEQ ID NO: 2之人類cMyBP-C蛋白的變異蛋白可為人類cMyBP-C蛋白之截短形式。舉例而言，功能變異體可選自由缺少外顯子5及6之天然存在之MYBPC3剪接變異體組成之群，稱為變異體4 (如SEQ ID NO: 46中所示)。
在一或多個實施例中，編碼cMyBP-C之核酸序列可操作地連接至一或多個異源表現控制元件。較佳地，編碼cMyBP-C之轉殖基因的表現由至少一個心肌細胞特異性表現控制元件控制。因此，在此類實施例中，在本文所描述之載體構築體中，編碼cMyBP-C之核酸序列可操作地連接至異源心肌細胞特異性轉錄調控區。在一些實施例中，在本文所描述之載體構築體中，表現控制元件包括以下中之一或多者：啟動子及/或強化子；視情況存在之內含子；視情況存在之外顯子；及多腺苷酸化(polyA)信號。此類元件將在本文中進一步描述。
心肌細胞特異性轉錄調控區可包含一或多個心肌細胞特異性表現控制元件，諸如心肌細胞特異性啟動子。較佳地，心肌細胞特異性啟動子包含人類心臟肌鈣蛋白T (hTNNT2)啟動子之至少一個片段或變異體。
在一些實施例中，心肌細胞特異性啟動子包含與SEQ ID NO: 47 (在SEQ ID NO: 47之全長上)至少或超過80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致的核酸序列。在一些實施例中，心肌細胞特異性啟動子可與位於cMyBP-C編碼序列之5'之內含子組合，該內含子增強cMyBP-C蛋白之表現。舉例而言，載體構築體及/或AAV顆粒在5'至3'方向上包含心肌細胞特異性啟動子、增強cMyBP-C蛋白表現之內含子及編碼cMyBP-C編碼序列之核苷酸序列。在一些實施例中，載體構築體及/或AAV顆粒包含(a)心肌細胞特異性啟動子，其包含與(i) SEQ ID NO: 47、(ii) SEQ ID NO: 48、(iii) SEQ ID NO: 49、(iv) SEQ ID NO: 50、(v) SEQ ID NO: 51或(vi) SEQ ID NO: 52中之任一者至少80%一致的核苷酸序列，(b)位於cMyBP-C編碼序列之5'之包含與SEQ ID NO: 53至少60%一致的核苷酸序列的內含子、編碼cMyBP-C之核苷酸序列及視情況存在之多腺苷酸化信號序列。或者，內含子包含與SEQ ID NO: 56或SEQ ID NO: 58至少60%一致的核苷酸序列。
在其他實施例中，心肌細胞特異性啟動子可與位於cMyBP-C編碼序列內之內含子組合，該內含子增強cMyBP-C蛋白之表現。在一些實施例中，內含子序列位於編碼cMyBP-C之核苷酸序列內，例如在任何外顯子之間，例如在外顯子2與3之間。在一些實施例中，內含子位於SEQ ID NO: 1或42-45中之任一者之位置293處。
在一些實施例中，載體構築體及/或所得AAV顆粒包含心肌細胞特異性啟動子序列，其為hTNNT2啟動子之片段或變異體，其長度大於420且小於544個核苷酸且包含與SEQ ID NO: 47至少90%一致的核酸序列。在本文所描述之實施例中之任一者中，心肌細胞特異性啟動子視情況不包括美國專利 公開案 第2021/0252165號之SEQ ID NO: 1至85中之任一者。
舉例而言，心肌細胞特異性啟動子序列包含與(i) SEQ ID NO: 47或其片段、(ii) SEQ ID NO: 48或其片段、(iii) SEQ ID NO: 49或其片段、(iv) SEQ ID NO: 50或其片段、(v) SEQ ID NO: 51或其片段或(vi) SEQ ID NO: 52或其片段中之任一者至少或超過80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致的核酸序列。在一例示性實施例中，心肌細胞特異性啟動子之序列包含與SEQ ID NO: 51至少96%、97%、98%或99%一致的核苷酸序列。在一些例示性實施例中，hTNNT啟動子之序列包含SEQ ID NO: 51之至少核苷酸1-106及507-532，或SEQ ID NO: 51之至少核苷酸507-532，或SEQ ID NO: 51之至少核苷酸521-532。
在一些實施例中，載體構築體包含一或多個內含子，其增強cMyBP-C編碼核酸之表現，例如使得心肌或心臟中可偵測到水平升高。在一些實施例中，內含子包含球蛋白內含子及/或其片段或變異體，或嵌合內含子及/或其片段或變異體。在一或多個實施例中，內含子包含與SEQ ID NO: 53至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致的核苷酸序列。在一或多個實施例中，內含子包含與SEQ ID NO: 56至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致的核苷酸序列。在一或多個實施例中，內含子包含與SEQ ID NO: 58至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致的核苷酸序列。在一些實施例中，內含子插入啟動子下游及cMyBP-C編碼序列之5'。在一些實施例中，內含子位於編碼cMyBP-C之核苷酸序列內，例如在任何外顯子之間，例如在外顯子2與3之間。在例示性實施例中，內含子插入SEQ ID NO: 1之MYBPC3野生型cDNA序列的核苷酸位置293處。在其他例示性實施例中，內含子插入SEQ ID NO: 42-45中之任一者之MYBPC3野生型cDNA序列的核苷酸位置293處。
在一些實施例中，載體構築體可進一步包含外顯子序列或其片段，較佳與內含子序列相鄰，例如球蛋白內含子與β球蛋白外顯子3 (SEQ ID NO: 54)之片段的3'端相鄰。心肌細胞特異性轉錄調控區可包含內含子及外顯子片段之組合，例如SEQ ID NO: 55。在一些例示性實施例中，心肌細胞特異性轉錄調控區包含SEQ ID NO: 56。
在一些實施例中，載體構築體包含多腺苷酸化信號，視情況存在之牛生長激素(BGH) polyA信號(例如SEQ ID NO: 59、60或61)或其片段、視情況存在之人類生長激素(hGH) polyA信號(例如SEQ ID NO: 62)或其片段、視情況存在之SV40 polyA信號(例如SEQ ID NO: 63)或其片段、視情況存在之Proudfoot合成polyA信號(例如SEQ ID NO: 65)或其片段、或視情況存在之兔β-球蛋白polyA信號(例如SEQ ID NO: 66)或其片段。在一些實施例中，polyA信號包含與SEQ ID NO: 64至少90%一致的核苷酸序列。在一些實施例中，polyA信號包含與SEQ ID NO: 59至少90%一致的核苷酸序列，例如包含SEQ ID NO: 60或其片段，或SEQ ID NO: 61或其片段。在例示性實施例中，polyA信號為SEQ ID NO: 62之片段，長度為約100至約500個核苷酸，或長度為約150至約400個核苷酸，或長度為約200至約300個核苷酸，或長度為約200至約250個核苷酸，包含SEQ ID NO 59。
在一些實施例中，載體構築體包含與SEQ ID NO: 3-41中之任一者至少97%、98%或99%一致的核苷酸序列。在其他實施例中，載體構築體包含與SEQ ID NO: 3-41或92-169中之任一者互補或為負(-)股之核苷酸序列至少97%、98%或99%一致的核苷酸序列。
在一些實施例中，載體構築體包含與SEQ ID NO: 3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36或39中之任一者至少97%、98%或99%一致的核苷酸序列。在其他實施例中，載體構築體包含與SEQ ID NO: 3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36或39中之任一者互補或為負(-)股之核苷酸序列至少97%、98%或99%一致的核苷酸序列。
在一些實施例中，載體構築體包含與SEQ ID NO: 4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37或40中之任一者至少97%、98%或99%一致的核苷酸序列。在其他實施例中，載體構築體包含與SEQ ID NO: 4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37或40中之任一者互補或為負(-)股之核苷酸序列至少97%、98%或99%一致的核苷酸序列。
在一些實施例中，載體構築體包含與SEQ ID NO: 5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38或41中之任一者至少97%、98%或99%一致的核苷酸序列。在其他實施例中，載體構築體包含與5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38或41中之任一者互補或為負(-)股之核苷酸序列至少97%、98%或99%一致的核苷酸序列。
例示性實施例包括以下：
構築體 C1之長度為4950 bp (SEQ ID NO:29)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、嵌合內含子(133 bp) (SEQ ID NO: 58)、經密碼子最佳化之hMYBPC3 (SEQ ID NO: 44)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。在其他實施例中，
構築體 C1視情況包含SEQ ID NO: 67-70之5' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)及/或SEQ ID NO: 71-74之3' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)，或其片段。
構築體 C2之長度為4801 bp (SEQ ID NO: 32)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、經密碼子最佳化之hMYBPC3 (SEQ ID NO: 44)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。在其他實施例中，
構築體 C2視情況包含SEQ ID NO: 67-70之5' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)及/或SEQ ID NO: 71-74之3' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)，或其片段。
構築體 C3之長度為4801 bp (SEQ ID NO: 35)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 43)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。在其他實施例中，
構築體 C3視情況包含SEQ ID NO: 67-70之5' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)及/或SEQ ID NO: 71-74之3' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)，或其片段。
構築體 C4之長度為4950 bp (SEQ ID NO: 38)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、嵌合內含子(133 bp) (SEQ ID NO: 58)、野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 43)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。在其他實施例中，
構築體 C4視情況包含SEQ ID NO: 67-70之5' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)及/或SEQ ID NO: 71-74之3' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)，或其片段。
構築體 C5之長度為4950 bp (SEQ ID NO: 41)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、嵌合內含子(133 bp) (SEQ ID NO: 58)、無CpG之hMYBPC3 (SEQ ID NO: 45)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。在其他實施例中，
構築體 C5視情況包含SEQ ID NO: 67-70之5' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)及/或SEQ ID NO: 71-74之3' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)，或其片段。
構築體 A1之長度為5074 bp (SEQ ID NO: 5)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)、HBB外顯子3 (SEQ ID NO: 54)；野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。在其他實施例中，
構築體 A1視情況包含SEQ ID NO: 67-70之5' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)及/或SEQ ID NO: 71-74之3' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)，或其片段。
構築體 A2之長度為4939 bp (SEQ ID NO: 8)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(469 bp) (SEQ ID NO: 49)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。在其他實施例中，
構築體 A2視情況包含SEQ ID NO: 67-70之5' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)及/或SEQ ID NO: 71-74之3' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)，或其片段。
構築體 A3之長度為4939 bp (SEQ ID NO: 11)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (169 bp) (SEQ ID NO: 59)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。在其他實施例中，
構築體 A3視情況包含SEQ ID NO: 67-70之5' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)及/或SEQ ID NO: 71-74之3' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)，或其片段。
構築體 A4之長度為4939 bp (SEQ ID NO: 14)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(499 bp) (SEQ ID NO: 50)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (202 bp) (SEQ ID NO: 60)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。在其他實施例中，
構築體 A4視情況包含SEQ ID NO: 67-70之5' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)及/或SEQ ID NO: 71-74之3' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)，或其片段。
構築體 A5之長度為4871 bp (SEQ ID NO: 17)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。在其他實施例中，
構築體 A5視情況包含SEQ ID NO: 67-70之5' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)及/或SEQ ID NO: 71-74之3' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)，或其片段。
構築體 A6之長度為5002 bp (SEQ ID NO: 20)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。在其他實施例中，
構築體 A6視情況包含SEQ ID NO: 67-70之5' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)及/或SEQ ID NO: 71-74之3' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)，或其片段。
構築體 A7之長度為4781 bp (SEQ ID NO: 23)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(469 bp) (SEQ ID NO: 49)、Kozac序列、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)、3'-UTR序列及3' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。在其他實施例中，
構築體 A7視情況包含SEQ ID NO: 67-70之5' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)及/或SEQ ID NO: 71-74之3' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)，或其片段。
構築體 A8之長度為4844 bp (SEQ ID NO: 26)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、Kozac序列、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)、3'-UTR序列及3' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。在其他實施例中，
構築體 A8視情況包含SEQ ID NO: 67-70之5' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)及/或SEQ ID NO: 71-74之3' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)，或其片段。
在前述實施例中之任一者中，載體構築體包含至少一個ITR序列。例示性ITR序列包括但不限於SEQ ID NO: 67-74，包括任何互補序列及/或其組合。
在前述實施例中之任一者中，以一個ITR開始且以第二個ITR結束之載體插入物的長度大小在約4 kb至約5.5 kb之間。在一或多個實施例中，載體構築體為AAV載體基因體，大小為約4 kb至約5.4 kb、大小為約4.5 kb至約5.5 kb、或大小為約4.8 kb至約5.2 kb、或大小為約4.5 kb至約5 kb。
載體構築體較佳為重組AAV載體構築體。在一些實施例中，載體構築體包含(a) (i) AAV 5'反向末端重複序列(ITR)及(ii) AAV 3' ITR中之一或兩者；(b)啟動子及/或強化子，例如心肌細胞特異性轉錄調控區；及(c)編碼功能活性人類cMyBP-C蛋白之核酸序列。在一些實施例中，載體構築體包含(a) AAV 5'反向末端重複(ITR)序列；(b)啟動子及/或強化子，例如心肌細胞特異性轉錄調控區；(c)編碼功能活性人類cMyBP-C蛋白之核酸序列；(d)內含子；(e)多腺苷酸化信號；及(f) AAV 3' ITR。在一些實施例中，內含子在啟動子下游且位於cMyBP-C編碼序列之5'，而在其他實施例中，內含子位於cMyBP-C編碼序列之外顯子之間，例如在外顯子2與外顯子3之間。在其他實施例中，載體構築體包含(a) AAV' 5'反向末端重複(ITR)序列；(b)啟動子及/或強化子，例如心肌細胞特異性轉錄調控區；(c)編碼功能活性人類cMyBP-C蛋白之核酸序列；(d)內含子；(e)及外顯子；(f)多腺苷酸化信號；及(g) AAV 3' ITR。AAV 5' ITR及/或AAV 3' ITR可來自異源AAV假模式標本(其可或可不如此項技術中已知進行修飾)。在一些實施例中，5' ITR及3' ITR序列來源於AAV2 (例如分別為SEQ ID NO: 67-70及71-74)。
在前述實施例中之任一者中，載體構築體包含分別與SEQ ID NO: 3-42及92-169中之任一者在SEQ ID NO: 3-42及92-169之長度上至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%或99.5%一致的核苷酸序列。在一些實施例中，載體構築體分別與SEQ ID NO: 3-42及92-169中之任一者在SEQ ID NO: 3-42及92-169之長度上至少97%、98%或99%一致。在特定實例中，載體構築體包含與SEQ ID NO: 29、32或41中之任一者至少85%一致或與SEQ ID NO: 35或38中之任一者至少95%一致的核苷酸序列。在其他實例中，載體構築體包含與SEQ ID NO: 29、32或41中之任一者至少90%一致或與SEQ ID NO: 35或38中之任一者至少98%一致的核苷酸序列。舉例而言，此類載體較佳包含側接ITR、編碼功能活性人類cMyBP-C蛋白編碼序列之核酸序列、心肌細胞特異性調控區、內含子及polyA信號。
在另一態樣中，本文提供一種重組腺相關病毒(rAAV)顆粒，其包含AAV衣殼及如本文實施例中之一或多者中所描述之載體構築體。可使用任何AAV衣殼，例如AAV1-13。在一些實施例中，用於遞送cMyBP-C編碼基因之重組AAV (rAAV)顆粒具有心臟向性。在此類實施例中，rAAV包含具有心臟向性之AAV衣殼，例如與SEQ ID NO: 75至少85%、90%或95%一致之AAV9型衣殼，或表現出心臟向性之AAV1型、AAV6型或AAV7型衣殼，或此等中之任一者之變異體。在一或多個實施例中，AAV衣殼為例如當藉由活體外IVIG中和評估時，與AAV9相比預先存在的體液免疫降低的衣殼。
在另一態樣中，本文提供用於產生可用作基因遞送載體之AAV顆粒的方法，該方法包含以下步驟：(1)向細胞(例如哺乳動物細胞)提供一或多種核酸構築體，其包含(a)如本文所描述之載體構築體，該載體構築體包含如本文所描述之編碼cMyBP-C之核酸，該核酸側接兩個AAV ITR核苷酸序列；(b)編碼一或多種AAV Rep蛋白之核苷酸序列，其可操作地連接至能夠驅動Rep蛋白表現之啟動子；(c)編碼一或多種AAV衣殼蛋白之核苷酸序列，其可操作地連接至能夠驅動衣殼蛋白表現之啟動子；及(d)視情況存在之編碼VP2/3中所含之AAP及MAAP之基因；(2)在有利於表現Rep蛋白及衣殼蛋白之條件下培養(1)中所定義之細胞；及視情況(3)回收AAV顆粒。在一些實施例中，細胞為哺乳動物細胞。在一些實施例中，哺乳動物細胞為HEK293細胞。本文亦提供藉由此類方法產生之rAAV顆粒群體。
在另一態樣中，本文提供醫藥組成物，其包含本文所描述之載體構築體或本文所描述之rAAV顆粒或rAAV顆粒群體，及無菌的醫藥學上可接受之稀釋劑、賦形劑或載劑。
在另一態樣中，本文提供向哺乳動物個體遞送MYBPC3基因之方法。此類方法包括在哺乳動物個體中表現肌球蛋白結合蛋白C之方法，其包含向該個體投予包含本文所描述之載體構築體、本文所描述之rAAV顆粒或本文所描述之醫藥組成物的組成物，從而在個體中表現所編碼之肌球蛋白結合蛋白。較佳地，在此類方法中，哺乳動物為人類且肌球蛋白結合蛋白C為如本文所描述之功能性人類肌球蛋白結合蛋白C。此類方法包括一種在哺乳動物之心肌細胞中表現肌球蛋白結合蛋白C之方法，其藉由投予有效增加哺乳動物心肌中肌球蛋白結合蛋白C之表現水平之量的載體構築體、rAAV顆粒或醫藥組成物。此類方法亦包括一種增加哺乳動物之心臟組織(例如心肌細胞)中功能性肌球蛋白結合蛋白C之水平的方法，其藉由投予有效增加哺乳動物之心臟組織(例如心肌細胞)中功能性肌球蛋白結合蛋白C之水平之量的載體構築體、rAAV顆粒或醫藥組成物。此類方法亦包括一種治療哺乳動物之功能性野生型肌球蛋白結合蛋白C缺乏症的方法，其藉由投予有效增加哺乳動物之心臟組織(例如心肌細胞)中功能性肌球蛋白結合蛋白C之水平之量的載體構築體、rAAV顆粒或醫藥組成物。在一些實施例中，載體構築體、rAAV顆粒或醫藥組成物之量有效增加心臟組織(例如心肌細胞)中肌球蛋白結合蛋白C之水平至少約2倍；及/或恢復活體外經工程改造之心臟組織或活體內動物組織之收縮力、相對張力、鈣活化張力、弛豫時間。
此類方法亦包括一種治療哺乳動物之HCM或治療或預防其任何症狀的方法，其包含投予治療有效量之載體構築體、rAAV顆粒或醫藥組成物。在一或多個實施例中，此類方法使心臟中之cMyBP-C表現水平與未治療之水平相比增加至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%，或增加至健康人類中所見之水平。此類方法例如減小心臟大小、減小心胸比、減小舒張末期或收縮末期左心室直徑、減小前壁或後壁厚度、增加射血時間、增加主動脈峰值流速或主動脈血流時間及/或減少疾病症狀。在一或多個實施例中，此類方法降低諸如心臟衰竭、心律失常、胸痛、呼吸短促、疲勞及眩暈之症狀的頻率或嚴重程度。
在本文所描述之任一方法中，rAAV顆粒以約1e12至6e14 vg/kg之劑量在水性懸浮液中遞送。在本文所描述之任一方法中，載體構築體、rAAV顆粒或醫藥組成物之投予可進一步包含預防性或治療性皮質類固醇治療劑之投予，及/或可進一步包括用於治療HCM之第二療法之投予。在本文任一方法中，在如上文所描述向患者投予AAV顆粒之前，可評定預期患者是否存在能夠阻斷細胞轉導或以其他方式降低治療整體效率之抗AAV衣殼抗體或抗AAV中和抗體。
熟習此項技術者在閱讀本說明書後將對其他實施例顯而易見。
本文提供編碼功能活性治療性cMyBP-C蛋白之核酸或載體構築體、包含此類載體構築體之AAV載體基因體及複製缺陷型rAAV顆粒，及包含此類載體構築體、載體基因體及AAV顆粒之醫藥組成物。本發明之組成物及方法可提供提高的AAV病毒產量及/或簡化的純化及/或增強的cMyBP-C蛋白在心臟、特別是心肌之細胞(心肌細胞)中之表現。本文亦提供製造載體構築體、包含此類載體構築體之AAV載體基因體及複製缺陷型rAAV顆粒的方法。本文進一步提供治療功能性野生型cMyBP-C缺乏症(包括HCM)之方法。
在另一個實施例中，提供產生包含本文所提供之AAV載體構築體中之任一者之重組腺相關病毒(AAV)顆粒的方法。該等方法包含以下步驟：培養已用本文所提供之AAV載體構築體(與各種AAV cap及rep基因相關)中之任一者轉染之細胞且自經轉染細胞或經轉染細胞培養物之上清液回收重組治療性AAV顆粒。
可用於本文所提供之重組AAV產生之細胞為易受桿狀病毒感染之任何細胞類型，包括昆蟲細胞，諸如High Five、Sf9、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf9、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、BM-N、Ha2302、Hz2E5及Ao38。在另一個實施例中，可以使用哺乳動物細胞，諸如HEK293、HeLa、CHO、NSO、SP2/0、PER.C6、Vero、RD、BHK、HT 1080、A549、Cos-7、ARPE-19及MRC-5。
在另一個實施例中，本文提供有效量之載體核酸、載體構築體或AAV顆粒之用途，其用於製備供治療罹患HCM或功能性野生型cMyBP-C蛋白缺乏症之個體用的藥物。在一個實施例中，罹患HCM之個體為人類。在一個實施例中，藥物係藉由靜脈內(IV)投予來投予。在另一個實施例中，藥物之投予致使心肌細胞中功能性cMyBP-C之水平升高，從而改善HCM症狀。在某些實施例中，藥物亦用於與預防性及/或治療性皮質類固醇共投予，以預防及/或治療與AAV顆粒之投予相關的任何毒性。預防性或治療性皮質類固醇治療劑可包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或更多毫克/天之皮質類固醇。在某些實施例中，預防性或治療性皮質類固醇可經至少約3、4、5、6、7、8、9、10週或更長時間之連續時間段投予。
在另一個實施例中，本文所提供之肥厚性心肌病療法視情況進一步包括投予，例如同時投予用於治療HCM之其他療法。
定義：
除非另外定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語具有與本揭示案所屬領域之一般熟習此項技術者通常所理解相同之含義。參見例如Singleton等人, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第2版, J.Wiley及Sons(New York, N.Y. 1994)；Sambrook等人, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harbor, N.Y. 1989)。出於本揭示案之目的，以下術語定義如下。
如本文所使用，在基因遞送之情形中，術語「載體」或「基因遞送載體」可指充當基因運載工具且包含包裝於例如包膜或衣殼內之核酸(亦即，包含本文所描述之載體構築體中之任一者的載體基因體)的顆粒。基因遞送載體可為病毒基因遞送載體或非病毒基因遞送載體。或者，在一些情形中，術語「載體」可用於僅指載體基因體或載體構築體。適用於本文中之病毒載體可為小病毒、腺病毒、反轉錄病毒、慢病毒或單純疱疹病毒。小病毒可為腺病毒相關病毒(AAV)。
如本文所使用，術語「AAV」係腺相關病毒之標準縮寫。腺相關病毒係僅在由共感染輔助病毒提供某些功能之細胞中生長之單股DNA小病毒。有多種已得到表徵之AAV血清型。AAV之總體資訊及評述可見於例如Carter, Handbook of Parvoviruses, 第1卷, 第169-228頁 (1989)；及Berns, Virology, 第1743-64頁, Raven Press, (New York) (1990)；Gao等人,
Meth. Mol. Biol. 807: 93-118 (2011)；Ojala等人,
Mol. Ther.26(1): 304-19 (2018)。然而，完全可以預料到此等相同原理將適用於另外的AAV血清型，因為眾所周知，各種血清型在結構上及功能上關聯極其緊密，甚至是在遺傳層面上亦如此。(參見例如Blacklowe, 1988, 第165-174頁, Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison編輯；及Rose, Comprehensive Virology 3:1-61 (1974))。舉例而言，所有AAV血清型均明顯展現由同源rep基因介導的極其類似之複製特性；且全部攜帶三種相關之衣殼蛋白。相關性程度得到非互補雙螺旋分析之進一步確定，該分析披露血清型之間沿基因體長度之廣泛交叉雜交；及在對應於「反向末端重複序列」(ITR)之末端處存在類似的自黏接區段。
如本文所使用，「AAV載體構築體」係指單股或雙股核酸，其具有(i) AAV 5'反向末端重複(ITR)序列及(ii) AAV 3' ITR中之至少一者，側接蛋白質編碼序列(在一個實施例中為功能性治療性蛋白質編碼序列，例如cMyBP-C編碼序列)，該蛋白質編碼序列可操作地連接至轉錄調控元件(亦稱為「表現控制元件」)，該等轉錄調控元件對於蛋白質編碼序列為異源的及/或對於AAV病毒基因體為異源的，亦即一或多個啟動子及/或強化子及視情況存在之多腺苷酸化序列及/或視情況存在之一或多個內含子。單股AAV載體係指存在於AAV病毒顆粒之基因體中，且可為本文所揭示之核酸序列之有義股或反義股的核酸。此類單股核酸之大小係以鹼基提供。雙股AAV載體係指存在於質體(例如pUC19)之DNA或雙股病毒(例如桿狀病毒)之基因體中的用於表現或轉移AAV載體核酸之核酸。此類雙股核酸之大小以鹼基對(bp)提供。
本文所提供之呈單股形式之AAV載體構築體的長度小於約7.0 kb，或長度小於6.5 kb，或長度小於6.4 kb，或長度小於6.3 kb，或長度小於6.2 kb，或長度小於6.0 kb，或長度小於5.8 kb，或長度小於5.6 kb，或長度小於5.5 kb，或長度小於5.4 kb，或長度小於5.3 kb，或長度小於5.2 kb。呈單股形式之AAV載體構築體的長度亦為至少約4.0 kb。較佳地，AAV載體構築體的長度亦為至少約4.5 kb。在一些實施例中，本文所提供之呈單股形式之AAV載體構築體的長度在約4.0 kb至約5.8 kb範圍內。
儘管已在文獻中報導AAV顆粒具有＞ 5.0 kb之AAV基因體，但在許多此等情況下，編碼基因之5'端或3'端似乎為截短的(參見Hirsch等人,
Molec. Ther.18: 6-8 (2010)及Ghosh等人,
Biotech. Genet. Engin. Rev.24: 165-78 (2007)。然而，已顯示重疊同源重組發生於感染AAV之細胞中具有5'端截短之核酸與具有3'端截短之核酸之間，由此產生編碼大型蛋白質之「完整」核酸，從而重構功能性全長基因。
過大AAV載體在5'端隨機截短且缺少5' AAV ITR。因為AAV為單股DNA病毒，且包裝有義股或反義股，所以過大AAV載體中之有義股缺少5' AAV ITR及目標蛋白編碼基因之5'端的可能部分，且過大AAV載體中之反義股缺少3' ITR及目標蛋白編碼基因之3'端的可能部分。功能性轉殖基因係在感染過大AAV載體之細胞中，藉由黏接目標細胞內之有義及反義截短基因體產生。因此，在某些實施例中，AAV cMyBP-C載體及/或病毒顆粒包含至少一個ITR。
如本文所使用，術語「反向末端重複序列(ITR)」係指在AAV基因體之5'末端及3'末端處發現的此項技術中公認之區域，其作為DNA複製起點及病毒基因體之包裝信號以順式方式起作用。AAV ITR與AAV rep編碼區一起實現插入兩個側接ITR之間之核苷酸序列的有效切除及救援以及該核苷酸序列整合至宿主細胞基因體中。某些AAV相關ITR之序列揭示於Yan等人,
J. Virol.79: 364-79 (2005)，該文獻以全文引用之方式併入本文中。可用於本文中之ITR序列可為保留功能性能力之全長、野生型AAV ITR或其片段，或可為能夠作為複製起點以順式方式起作用的全長、野生型AAV ITR之序列變異體。可用於本文所提供之實施例之重組AAV cMyBP-C載體的AAV ITR可來源於任何已知的AAV血清型，且在某些實施例中，來源於AAV2或AAV5血清型。
術語「控制序列」係指在特定宿主生物體中表現可操作地連接之編碼序列所需之DNA序列。適合於原核生物之控制序列例如包括啟動子、視情況存在之操縱子序列及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、多腺苷酸化信號及強化子。
「轉錄調控元件」係指參與基因轉錄調控之基因的核苷酸序列，包括啟動子，加上響應元件、活化因子及強化子序列，其用於結合轉錄因子以幫助RNA聚合酶結合且促進表現；以及操縱子或緘默子序列，抑制蛋白與該等序列結合以阻斷RNA聚合酶連接且防止表現。術語「心肌細胞特異性轉錄調控元件」或「心肌細胞特異性表現控制元件」係指在心肌細胞中特異性產生較佳基因表現之調控元件或區域，例如在心臟細胞中之活性比在任何其他非心臟細胞類型中高至少2倍或至少5倍的啟動子。在一些實施例中，心肌細胞特異性啟動子在心肌細胞中提供比在骨骼肌細胞中高至少5倍的表現。在一些實施例中，心肌細胞特異性啟動子在心肌細胞中之活性比其在非心臟細胞類型中之活性高至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍或至少50倍。
心臟特異性或心肌細胞特異性啟動子可操作地連接至編碼cMyBP-C蛋白之核酸序列，此意味著啟動子與編碼核酸組合，以便當整合至細胞之基因體中或作為基因體外核酸構築體存在於細胞中時，能夠在啟動子的控制下在心肌細胞中表現該編碼核酸。
轉錄調控元件視情況包括強化子元件、內含子、多腺苷酸化序列或轉錄後調控元件，用於增加肌球蛋白結合蛋白之表現水平。實例包括SV40早期基因強化子及勞斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)之長末端重複序列(LTR)之強化子(Gorman等人 (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. 79:6777)。載體亦視情況包含轉錄終止序列及多腺苷酸化序列，用於改善人類及/或非人類抗原之表現。適合的轉錄終止子及多腺苷酸化信號可例如來源於SV40 (Sambrook等人 (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual)。較佳地，bGH多腺苷酸化信號用於本發明之載體中。此項技術中已知的任何其他支援表現效率或特異性之元件可添加至表現載體中，諸如土撥鼠肝炎轉錄後調控元件(wPRE)。為了增加心臟或心肌細胞特異性，可引入其他元件以使基因在其他組織中之表現不活化，諸如編碼miRNA (諸如miR122)之序列(Geisler等人,
Gene Ther.18: 199-209 (2011)。
如本文所使用，「內含子」廣泛定義為可藉由RNA剪接移除之核苷酸序列。「RNA剪接」意謂自前mRNA切除內含子以形成成熟mRNA。內含子可位於基因編碼區之上游、下游或內部。將內含子插入核苷酸序列中可以藉由此項技術中已知之任何方法實現。插入內含子之位置之唯一限制為考慮AAV病毒顆粒(例如約5 kb)之包裝限制。
如本文所使用，術語「可操作地連接」用於描述調控元件與基因或其編碼區之間的聯接。典型地，基因表現處於一或多個調控元件控制下，例如但不限於組成性或誘導性啟動子、組織特異性調控元件及強化子。基因或編碼區稱為「可操作地連接至」或「以操作方式連接至」調控元件或與調控元件「可操作地締合」，意謂該基因或編碼區受調控元件控制或影響。舉例而言，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則其係可操作地連接至該編碼序列。
在某些實施例中，重組AAV載體構築體包含(a)包含AAV2 5'反向末端重複序列(ITR)之核酸(其可或可不如此項技術中已知進行修飾)，(b)心肌細胞特異性轉錄調控區，(c)功能性cMyBP-C蛋白編碼區，(d)視情況存在之一或多個內含子，(e)多腺苷酸化序列，及(f) AAV2 3' ITR (其可或可不如此項技術中已知進行修飾)。
在一個實施例中，載體構築體包含編碼功能活性cMyBP-C蛋白之核酸。cMyBP-C編碼序列可為野生型、經密碼子最佳化或為變異體。為了使外源基因在心臟中之表現可視化，可引入其他視情況選用之元件作為cMyBP-C編碼序列之一部分，諸如標籤序列(myc、FLAG、HA、His及其類似物)或螢光染料諸如GFP、YFP、RFP。
如本文所使用，野生型心臟肌球蛋白結合蛋白C (MYBPC3基因)具有以下核酸序列SEQ ID NO: 1 (GenBank寄存編號NM_000256.2)
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如本文所使用，野生型心臟肌球蛋白結合蛋白C具有以下胺基酸序列SEQ ID NO: 2 (GenBank寄存編號NP_000247.1)
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術語「經分離」在關於本揭示案之核酸分子使用時通常係指自至少一個通常與其天然來源相關聯之污染核酸鑑別及分開的核酸序列。經分離之核酸可以與在自然界中發現的形式或環境不同的形式或環境存在。因此，經分離之核酸分子有別於在天然細胞中存在的核酸分子。
如本文所使用，術語「變異體」係指具有與參考聚核苷酸(或多肽)實質上類似之序列的聚核苷酸(或多肽)。熟習此項技術者已知用於在聚核苷酸、蛋白質或多肽中引入核苷酸及胺基酸變化之程序(參見例如Sambrook等人(1989))。在聚核苷酸之情況下，相較於參考聚核苷酸，變異體可在5'端、3'端及/或一或多個內部位點處具有一或多個核苷酸之缺失、取代、添加。變異體與參考聚核苷酸之間的序列類似性及/或差異可使用此項技術中已知之習知技術，例如使用聚合酶鏈反應(PCR)及雜交技術偵測。變異體聚核苷酸亦包括以合成方式得到的聚核苷酸，諸如藉由使用定點突變誘發產生之聚核苷酸。一般而言，當藉由熟習此項技術者已知之序列比對程式測定時，聚核苷酸(包括但不限於DNA)之變異體可與參考聚核苷酸具有至少約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更大序列一致性。在多肽之情況下，相較於參考多肽，變異體可具有一或多個胺基酸之缺失、取代、添加。變異體與參考多肽之間之序列類似性及/或差異可以使用此項技術中已知之習知技術，例如使用西方印漬術(Western blot)偵測。一般而言，當藉由熟習此項技術者已知之序列比對程式測定時，多肽之變異體可與參考多肽具有至少約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高序列一致性。
胺基酸取代可為保守或非保守的。較佳地，取代為保守取代，亦即胺基酸殘基經充當功能等效物之具有類似極性之胺基酸取代。較佳地，用作取代物之胺基酸殘基選自與待取代之胺基酸殘基相同的胺基酸群。舉例而言，疏水性殘基可經另一疏水性殘基取代，或極性殘基可經具有相同電荷之另一極性殘基取代。可用於保守取代之功能同源胺基酸包含例如非極性胺基酸，諸如甘胺酸、纈胺酸、丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸及色胺酸。不帶電極性胺基酸之實例包含絲胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、酪胺酸及半胱胺酸。帶電極性(鹼性)胺基酸之實例包含組胺酸、精胺酸及離胺酸。帶電極性(酸性)胺基酸之實例包含天冬胺酸及麩胺酸。
亦視為變異體的為藉由添加、取代或缺失一或多個(例如2、3、4、5、10或15個)額外胺基酸而不同於其天然存在之對應物的蛋白質。額外胺基酸可存在於原始cMyBP-C蛋白之胺基酸序列內(亦即，作為插入)，或其可添加至蛋白質之一或兩個末端。此類插入、取代或缺失可發生在任何位置，其限制條件為其不損害多肽履行天然存在之cMyBP-C蛋白之功能及/或挽救經治療個體之單倍體不足的能力。此外，cMyBP-C蛋白之變異體亦包含與原始多肽相比缺少一或多個胺基酸之蛋白質。此類缺失可影響任何胺基酸位置，其限制條件為其不損害履行cMyBP-C蛋白之正常功能及/或挽救單倍體不足的能力。
最後，心臟cMyBP-C蛋白之變異體亦指藉由結構修飾諸如經修飾之胺基酸而不同於天然存在之蛋白質的蛋白質。經修飾之胺基酸為已藉由天然過程，諸如加工或轉譯後修飾，或藉由此項技術中已知的化學修飾方法修飾之胺基酸。典型的胺基酸修飾包含磷酸化、糖基化、乙醯化、O-連接之N-乙醯葡萄糖胺化、麩胱甘肽化、醯化、分支化、ADP核糖基化、交聯、二硫橋鍵形成、甲醯化、羥基化、羧化、甲基化、去甲基化、醯胺化、環化及/或共價或非共價鍵結至磷脂醯肌醇、黃素衍生物、脂磷壁酸、脂肪酸或脂質。此類修飾已廣泛描述於文獻中，例如在Proteins: Structure and Molecular Properties, T. Creighton, 第2版, W. H. Freeman and Company, New York (1993)中。在本發明之一較佳實施例中，核酸序列編碼人類cMyBP-C之組成性磷酸化同功異型物。已顯示此等同功異型物特別具有心臟保護性(Sadayappan等人 (2005), Circ Res 97:1156-1163；Sadayappan等人, 2006; Proc Natl Acad Sci U S A 103:16918-16923)。
術語「一致性」、「同源性」及其語法變化形式意謂兩個或更多個所提及實體在其為「比對」序列時相同。因此，舉例而言，在兩個多肽序列相同時，其至少在所提及之區域或部分內具有相同胺基酸序列。在兩個聚核苷酸序列相同時，其至少在所提及之區域或部分內具有相同聚核苷酸序列。一致性可在序列之界定區域(區或域)內。一致性之「區域」或「區」係指相同的兩個或更多個所提及實體之部分。因此，在兩個多肽或核酸序列在一或多個序列區域或區內相同時，其在該區內共有一致性。「比對」序列係指相較於參考序列，通常含有對缺失或額外鹼基或胺基酸(空位)之校正的多個聚核苷酸或多肽(胺基酸)序列。「實質上同源性」意謂分子在結構上或在功能上保守，以使得其具有或經預測具有參考分子或參考分子之與其共有同源性之相關/對應區或部分之一或多種結構或功能(例如生物功能或活性)中的至少部分結構或功能。
「核酸序列一致性或同源性百分比(%)」定義為在比對各別序列且必要時引入空位以實現最大序列一致性百分比後，候選序列中與參考序列一致之核苷酸的百分比。出於測定核酸序列一致性百分比之目的進行的比對可藉由在此項技術之技能範圍內的各種方式，例如使用公開可得的電腦軟體，諸如ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體實現。熟習此項技術者可確定用於量測比對之適當參數，包括在所比較序列之全長內達成最大比對所需的任何演算法。
關於本文中所鑑別之cMyBP-C胺基酸序列的「胺基酸序列一致性或同源性百分比(%)」定義為在比對序列且在必要時引入空位以達成最大序列一致性百分比之後且在不考慮任何保守取代作為序列一致性之一部分的情況下，候選序列中與cMyBP-C多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分比。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的進行的比對可藉由在此項技術之技能範圍內的各種方式，例如使用公開可得的電腦軟體，諸如ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體實現。熟習此項技術者可確定用於量測比對之適當參數，包括在所比較序列之全長內達成最大比對所需的任何演算法。
「密碼子最佳化(Codon optimization)」或「經密碼子最佳化(codon optimized)」係指為了使核苷酸序列相較於未經密碼子最佳化之序列更可能以相對較高水準表現而在該核苷酸序列中進行的變化。其不改變各密碼子編碼之胺基酸。
「AAV病毒粒子」或「AAV病毒顆粒」或「AAV載體顆粒」或「AAV病毒」係指由如本文所描述之至少一種AAV衣殼蛋白及衣殼化AAV載體構築體構成之病毒顆粒。若該顆粒包含異源聚核苷酸(亦即，不為野生型AAV基因體之聚核苷酸，諸如欲遞送至哺乳動物細胞之轉殖基因)，則其通常稱為「重組AAV載體顆粒」或簡稱為「AAV載體」。AAV載體顆粒之製造必定包括AAV載體基因體之製造，因此載體基因體被包含在AAV載體顆粒內。應理解，提及囊封於載體顆粒內之聚核苷酸AAV載體構築體及其複製係指AAV載體基因體。
如本文所使用，「治療性AAV病毒」係指包含編碼治療性蛋白質(諸如本文所描述之cMyBP-C)之異源聚核苷酸的AAV病毒粒子、AAV病毒顆粒、AAV載體顆粒或AAV病毒。如本文所使用，「AAV載體構築體」或「AAV載體基因體」係指包含一或多個編碼感興趣蛋白質之聚核苷酸(亦稱為轉殖基因)的載體構築體，該聚核苷酸側接至少一個AAV末端重複序列(ITR)且可操作地連接至一或多個表現控制元件。當存在於已經編碼及表現rep及cap基因產物之載體轉染的宿主細胞中時，此類AAV載體構築體可以複製且包裝至感染性病毒顆粒中。該術語一般係指能夠感染細胞以使得經感染細胞表現(例如藉由轉錄及/或藉由轉譯)感興趣元件(例如核苷酸序列、蛋白質等)之重組AAV。就此程度上，治療有效的rAAV顆粒可包括具有不同特性之衣殼或載體基因體(vgs)的AAV顆粒。舉例而言，治療有效的rAAV顆粒可具有攜帶不同轉譯後修飾之衣殼。在其他實例中，治療有效的AAV顆粒可含有具有不同大小/長度、正股或負股序列、不同正/反ITR組態正/反、反/正、正/正、反/反等)、不同數目之ITR (1、2、3等)或截短的載體基因體。舉例而言，重疊同源重組發生於感染rAAV之細胞中具有5'端截短之核酸與具有3'端截短之核酸之間，由此產生編碼大型蛋白質之「完整」核酸，從而重構功能性全長基因。在其他實例中，具有5'端截短及3'端截短之互補核酸序列彼此相互作用，從而在第二股合成期間形成「完整」核酸。「完整」核酸編碼大型蛋白質，從而重構功能性全長基因。治療有效的rAAV顆粒亦稱為重衣殼、全衣殼或部分全衣殼。相反，「治療無效」的AAV病毒係指空衣殼，亦即具有無法定量或無法偵測之載體基因體或無法重組為完整功能性核酸之載體基因體的衣殼。
如本文所使用，「治療性蛋白質」係指具有置換或補償內源蛋白質活性之損失或降低之生物活性的多肽。舉例而言，功能性cMyBP-C蛋白為用於HCM之治療性蛋白質。
如本文所使用，「肥厚性心肌病」係指一種由編碼心臟肌節成分(諸如心臟肌球蛋白結合蛋白C)之基因中的突變引起的遺傳性疾病，其特徵在於例如心臟衰竭、心律失常、胸痛、呼吸短促、疲勞及眩暈之症狀、心臟大小增加、心胸比增加、舒張末期左心室直徑增加、收縮末期左心室直徑增加、心室(前部或後部或兩者)壁厚增加、射血時間減少、主動脈峰值流速減小及/或主動脈血流時間減少。
如本文所使用，「心臟肌球蛋白結合蛋白C缺乏症」或「功能性野生型心臟肌球蛋白結合蛋白C缺乏症」係指一種由功能性cMyBP-C蛋白水平降低引起的遺傳性病況，其歸因於不存在蛋白質、蛋白質產生減少或產生非功能性蛋白質。此包括HCM。
如本文所使用，「對肥厚性心肌病治療有效」或「肥厚性心肌病療法」係指對患有HCM之個體的任何治療性干預，其改善功能性野生型cMyBP-C的特徵性缺乏、增加cMyBP-C蛋白水平(例如在心肌中之水平)、改善HCM症狀或降低HCM症狀之頻率、持續時間或嚴重程度。
如本文所使用，「肥厚性心肌病基因療法」係指對患有HCM之個體的任何治療性干預，其涉及經由將一或多種核酸分子遞送至該個體之表現功能性cMyBP之細胞來置換或恢復或增加cMyBP-C。在某些實施例中，MYBPC3基因療法係指涉及腺相關病毒(AAV)顆粒之基因療法，該顆粒包含表現人類cMyBP-C之載體構築體。在其他實施例中，基因療法涉及轉染表現人類cMyBP-C之質體。
如本文所使用，「治療(treat)」或「治療(treatment)」係指預防性或治療性治療，其係指向表現出病理(亦即HCM)徵象或症狀之個體投予的治療，其目的是減少或消除彼等徵象或症狀或改善其進展、嚴重程度或持續時間。該等徵象或症狀可以為生物化學、細胞、組織學、功能性、主觀或客觀的。
如本文所使用，「改善」係指減小疾病之症狀之嚴重程度、進展或持續時間的作用。
如本文所使用，「穩定治療(stably treating/stable treatment)」係指使用治療性載體構築體、AAV顆粒或細胞投予給個體，其中該個體穩定表現由該載體構築體、AAV顆粒或細胞所表現的治療性蛋白質。穩定表現之治療蛋白意謂該蛋白質在臨床上顯著的時間長度內表現。如本文所使用，「臨床上顯著的時間長度」意謂以治療有效水平表現對個體之生活品質產生有意義的影響的時間長度，例如藉由疾病之徵象或症狀減少來證明。在某些實施例中，臨床上顯著的時間長度為表現至少六個月、至少八個月、至少一年、至少兩年、至少三年、至少四年、至少五年、至少六年、至少七年、至少八年、至少九年、至少十年或個體之一生。
如本文所使用，術語「有效量」係指足以實現有益或所希望的生物及/或臨床結果之量。
如本文所使用，「個體」係指作為治療、觀察或實驗對象之動物。「動物」包括冷血及溫血脊椎動物及無脊椎動物，諸如魚類、貝類、爬行動物，且尤其哺乳動物。如本文所使用，術語「禽類」包括但不限於雞、鴨、鵝、鵪鶉、火雞及雉雞。如本文所使用，「哺乳動物」係指屬於哺乳綱之個體，且包括但不限於人類、家畜和農畜、動物園動物、運動動物及寵物動物。哺乳動物之非限制性實例包括小鼠；大鼠；兔子；天竺鼠；犬；貓；綿羊；山羊；牛；馬；靈長類動物，諸如猴、黑猩猩及猿，且尤其人類。在一些實施例中，哺乳動物為人類，包括嬰兒、兒童或青少年，例如年齡至多2、2-4、2-6或2-12歲的人類。
一般而言，「醫藥學上可接受之載劑」為對細胞無毒或不過度有害且較佳無菌的載劑。例示性醫藥學上可接受之載劑包括無菌、無熱原質水及無菌、無熱原質生理鹽水或磷酸鹽緩衝鹽水。醫藥學上可接受之載劑包括生理上可接受之載劑。術語「醫藥學上可接受之載劑」包括生理上相容的任何及所有溶劑、分散介質、包衣劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑，及其類似物。
載體構築體及 AAV 載體
本揭示案之重組載體構築體本身可用作基因療法，或可用於藉由本文所描述之方法產生rAAV顆粒，該方法包含向適合的宿主細胞提供重組載體構築體以及Rep及Cap基因。本文所描述之載體構築體包含編碼功能性cMyBP-C之核酸序列。重組載體構築體可包含編碼功能性人類cMyBP-C之核酸，其可操作地連接至異源表現控制元件，例如啟動子及/或強化子；視情況存在之內含子；及視情況存在之多腺苷酸化(polyA)信號。異源表現控制元件可為異源心肌細胞特異性轉錄調控區，例如本文所描述。
當用於產生rAAV顆粒時，重組載體構築體可包含(a) (i) AAV 5'反向末端重複(ITR)序列及(ii) AAV 3' ITR中之一或兩者，(b)異源心肌細胞特異性轉錄調控區，及(c)編碼功能性人類cMyBP-C之核酸，視情況其中AAV ITR為AAV2 ITR。較佳地，編碼功能性cMyBP-C之核酸可操作地連接至心肌細胞特異性表現控制元件。載體構築體可包括另外的表現控制元件，例如：啟動子及/或強化子；內含子；視情況存在之外顯子或其片段；及多腺苷酸化(polyA)信號。此類元件將在本文中進一步描述。在某些實施例中，重組AAV載體構築體包含核酸，其包含(a) AAV2 5'反向末端重複序列(ITR) (其可或可不如此項技術中已知進行修飾)，(b)心肌細胞特異性轉錄調控區，功能性MYBPC3蛋白編碼區，(c)一或多個內含子，包括較長內含子之片段，(d)視情況存在之外顯子或其片段，多腺苷酸化序列，及(f) AAV2 3' ITR (其可或可不如此項技術中已知進行修飾)。
較佳地，rAAV顆粒亦包含具有心臟向性之AAV衣殼，視情況選用AAV9型衣殼。具有心臟向性之例示性衣殼包括AAV1、6、7及9。
本文所提供之其他實施例係針對編碼功能性cMyBP-C多肽之載體構築體，其中該等構築體包含呈一或多個不同定向的上述構築體之個別元件中之一或多者及其組合。本文所提供之另一實施例係針對呈相反定向之上述構築體。
本文所提供之呈單股形式之AAV載體構築體的長度在約4.5 kb至約6.5 kb範圍內，或長度在約4.5 kb至約5.5 kb範圍內，或長度在約4 kb至約5.5 kb範圍內，或長度在約4.8 kb至約5.2 k範圍內，或長度在4.8 kb至5.1 kb範圍內，或長度在約4.9 kb至約5.5 kb範圍內，或長度在約4.8 kb至約6.0 kb範圍內，或長度在約5.0 kb至6.2 kb範圍內，或長度在約5.1 kb至約6.3 kb範圍內，或長度在約5.2 kb至約6.4 kb範圍內，或長度在約5.5 kb至約6.5 kb範圍內，或長度在約4.0 kb至約5.0 kb範圍內，或長度在約4至約4.5 kb範圍內，或長度在約4.5 kb至約5 kb範圍內。
當AAV載體係由過大的重組載體構築體產生時，其可能缺乏重組載體構築體之5'端或3'端之一部分。因為AAV為單股DNA病毒，且包裝有義股或反義股，所以過大AAV載體中之有義股缺少5' AAV ITR及目標蛋白編碼基因之5'端的可能部分，且過大AAV載體中之反義股缺少3' ITR及目標蛋白編碼基因之3'端的可能部分。功能性轉殖基因係在感染過大AAV載體之細胞中，藉由黏接目標細胞內之有義及反義截短基因體產生。因此，在某些實施例中，本發明之rAAV顆粒可包含重組載體構築體，其包含至少一個ITR及編碼功能性cMyBP-C之核苷酸序列的大部分，諸如SEQ ID NO: 1或42-45之片段，其超過核苷酸序列之長度的50%、60%、70%、80%或90%。舉例而言，重組載體構築體可包含至少一個ITR、心肌細胞特異性轉錄調控區及編碼功能性cMyBP-C之核苷酸序列的大部分。
載體構築體之產生可使用此項技術中熟知之任何適合基因工程改造技術實現，包括但不限於限制性核酸內切酶消化、連接、轉型、質體純化及DNA定序之標準技術，例如Sambrook等人 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989))中所描述者。
載體構築體可併入來自任何已知生物體之基因體的序列。序列可以其原生形式併入或可以任何方式修飾以獲得所需活性。舉例而言，序列可包含插入、缺失或取代。
當存在於經編碼及表現rep及cap基因產物之聚核苷酸轉染的宿主細胞中時，AAV載體構築體可經複製及包裝至感染性AAV顆粒中，較佳為複製缺陷型AAV顆粒。
轉錄調控元件或區
啟動子及強化子。
在一或多個實施例中，編碼cMyBP-C之核酸序列可操作地連接至一或多個異源表現控制元件。較佳地，表現控制元件為心肌細胞特異性表現控制元件。心肌細胞特異性控制元件之實例包括但不限於人類心臟肌鈣蛋白T (hTNNT2)啟動子或其片段或變異體。在心肌細胞中具有活性之其他啟動子包括以下任一者之片段或變異體：肌肉肌酸激酶(MCK)啟動子、巨細胞病毒強化子+肌球蛋白輕鏈2啟動子(CMV-MLC2、或CMV-MLC1.5、CMV-MLC260)、磷酸甘油酯激酶(PGK)啟動子、肌節特異性啟動子、α肌球蛋白重鏈啟動子、肌球蛋白輕鏈2v啟動子、α肌球蛋白重鏈啟動子、α-心臟肌動蛋白啟動子、α-肌旋蛋白啟動子、心臟肌鈣蛋白C啟動子、心臟肌鈣蛋白I啟動子、心臟肌球蛋白結合蛋白C啟動子及/或肌漿/內質網Ca2+'' ATP酶(SERCA)啟動子(例如此啟動子之同功異型物2 (SERCA2))及/或橫紋肌啟動子，諸如肌間線蛋白啟動子。亦考慮來源於心肌細胞特異性轉錄因子結合位點之強化子。
hTNNT2啟動子之片段或變異體之實例包括心肌細胞特異性啟動子序列，其包含與SEQ ID NO: 47至少90%一致的核酸序列。在一些實施例中，心肌細胞特異性轉錄調控區包含心肌細胞特異性啟動子序列，其包含與SEQ ID NO: 52至少80%一致的核酸序列。在一些實施例中，心肌細胞特異性轉錄調控區包含心肌細胞特異性啟動子序列，其包含與SEQ ID NO: 51至少80%一致的核酸序列。在一些實施例中，心肌細胞特異性轉錄調控區包含心肌細胞特異性啟動子序列，其包含與SEQ ID NO: 50至少80%一致的核酸序列。在一些實施例中，心肌細胞特異性轉錄調控區包含心肌細胞特異性啟動子序列，其包含與SEQ ID NO: 49至少80%一致的核酸序列。在一些實施例中，心肌細胞特異性轉錄調控區包含心肌細胞特異性啟動子序列，其包含與SEQ ID No: 49-52中之任一者(在SEQ ID NO之長度上)至少或超過80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致的核酸序列。在本文所描述之實施例中之任一者中，心肌細胞特異性啟動子視情況不包括美國專利 公開案 第2021/0252165號之SEQ ID NO: 1至85中之任一者。在一些實施例中，心肌細胞特異性轉錄調控區亦包含增強cMyBP-C蛋白之表現的內含子，及視情況存在之cMyBP-C編碼序列之5'的外顯子或其片段。舉例而言，載體構築體及AAV顆粒在5'至3'方向上包含心肌細胞特異性啟動子，其包含與SEQ ID NO: 47至少80%一致的核苷酸序列；與SEQ ID NO: 53至少70%一致的內含子核苷酸序列；及編碼cMyBP-C之核苷酸序列。
在其他實施例中，心肌細胞特異性啟動子包含(a)與(i) SEQ ID NO: 49或其片段，(ii) SEQ ID NO: 50或其片段，或(iii) SEQ ID NO: 51或其片段中之任一者至少80%一致的核酸序列；及(b)與SEQ ID NO: 53至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致的內含子核苷酸序列。在替代性實施例中，內含子包含與SEQ ID NO: 58至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致的核苷酸序列。其他例示性內含子為SEQ ID NO: 53-58。
在一些實施例中，載體構築體包含(a)與(i) SEQ ID NO: 49或其片段，(ii) SEQ ID NO: 50或其片段，或(iii) SEQ ID NO: 51或其片段中之任一者至少90%一致的核酸序列；及(b)包含與SEQ ID NO: 53至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致的核苷酸序列的內含子。在替代性實施例中，內含子包含與SEQ ID NO: 58至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致的核苷酸序列。其他例示性內含子為SEQ ID NO: 53-58。
在一些實施例中，心肌細胞特異性轉錄調控區可進一步包含(除hTNNT2啟動子及球蛋白內含子之片段或變異體外)外顯子序列或其片段，例如球蛋白內含子與β球蛋白外顯子3 (SEQ ID NO: 54)之片段的3'端相鄰。內含子及外顯子片段之組合為例如SEQ ID NO: 55。在一些例示性實施例中，心肌細胞特異性轉錄調控區包含SEQ ID NO: 56。
在一些實施例中，hTNNT2啟動子之片段或變異體的長度大於420且小於544個核苷酸，且包含與SEQ ID NO: 47至少90%一致的核酸序列。在本文所描述之實施例中之任一者中，心肌細胞特異性啟動子視情況不包括美國專利 公開案 第2021/0252165號之SEQ ID NO: 1至85中之任一者。
在一些實施例中，心肌細胞特異性啟動子序列包含與(i) SEQ ID NO: 49或其片段，(ii) SEQ ID NO: 50或其片段，(iii) SEQ ID NO: 51或其片段，或(iv) SEQ ID NO: 52或其片段中之任一者至少或超過80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致的核酸序列。舉例而言，心肌細胞特異性啟動子序列包含與(i) SEQ ID NO: 49或其片段，(ii) SEQ ID NO: 50或其片段，或(iii) SEQ ID NO: 51或其片段中之任一者至少或超過95%、97%、98%或99%一致的核酸序列。在一例示性實施例中，心肌細胞特異性啟動子之序列包含與SEQ ID NO: 51至少96%、97%、98%或99%一致的核苷酸序列。在一些例示性實施例中，hTNNT啟動子之序列包含SEQ ID NO: 51之至少核苷酸1-106及507-532，或SEQ ID NO: 51之至少核苷酸507-532，或SEQ ID NO: 51之至少核苷酸521-532。
在本文所揭示之載體構築體中，各種啟動子可與包含感興趣蛋白質人類心臟肌球蛋白結合蛋白C之編碼區的核酸可操作地連接。在一些實施例中，啟動子可驅動感興趣蛋白質在經衍生自病毒載體之病毒感染的細胞(諸如目標細胞)中表現。啟動子可為天然存在或非天然存在的。在一些實施例中，啟動子為合成啟動子。在一個實施例中，合成啟動子包含自然界中不存在且經設計以調控可操作地連接之基因之活性的序列。在另一個實施例中，合成啟動子包含天然啟動子之片段以形成自然界中不存在的新的DNA序列鏈段。合成啟動子通常包含調控元件、啟動子、強化子、內含子、剪接供體及受體，其經設計以產生增強的組織特異性表現。啟動子之實例包括但不限於病毒啟動子、植物啟動子及哺乳動物啟動子。在另一個實施例中，啟動子為心肌細胞特異性啟動子。
在一些實施例中，啟動子包含人類心臟肌鈣蛋白T (hTNNT2)啟動子。hTNNT2啟動子之部分可包含與SEQ ID No: 49-51中之任一者具有至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或更高序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，啟動子與SEQ ID No: 49-51中之任一者至少約或超過95%一致。
在一些實施例中，啟動子構築體包含呈一或多個不同定向的額外個別強化子元件中之一或多者。
在一些實施例中，啟動子與編碼一或多種感興趣蛋白質之聚核苷酸可操作地連接。在一些實施例中，啟動子與編碼cMyBP-C蛋白之聚核苷酸可操作地連接。
啟動子之大小可變化。由於AAV之包裝能力有限，故較佳使用大小較小但同時允許在宿主細胞中高水準製造感興趣蛋白質的啟動子。舉例而言，在一些實施例中，啟動子為至多約1.5 kb、至多約1.4 kb、至多約1.35 kb、至多約1.3 kb、至多約1.25 kb、至多約1.2 kb、至多約1.15 kb、至多約1.1 kb、至多約1.05 kb、至多約1 kb、至多約800個鹼基對、至多約600個鹼基對、至多約400個鹼基對、至多約200個鹼基對或至多約100個鹼基對。
其他調控元件。
各種另外的調控元件可以用於載體構築體中，例如進一步增加感興趣蛋白質在宿主細胞中之表現水準的強化子、多腺苷酸化信號、核糖體結合序列及/或共同剪接受體或剪接供體位點。在一些實施例中，調控元件可以有助於將重組DNA分子維持在宿主細胞之染色體外及/或改善載體效力(例如骨架/基質連接區(S/MAR))。該等調控元件為此項技術中熟知的。
本文所揭示之載體構築體可包括調控元件，諸如轉錄起始區及/或轉錄終止區。轉錄終止區之實例包括但不限於多腺苷酸化信號序列。多腺苷酸化信號序列之實例包括但不限於微型polyA、人類生長激素(hGH) poly(A)、牛生長激素(BGH) poly(A)、SV40晚期poly(A)、兔β-球蛋白(rBG) poly(A)、胸苷激酶(TK) poly(A)序列、Proudfoot polyA及其任何變異體。在一些實施例中，轉錄終止區位於轉錄後調控元件下游。在一些實施例中，轉錄終止區為多腺苷酸化信號序列。在一些實施例中，轉錄終止區為微型polyA (例如SEQ ID NO: 64)、bGH polyA (例如SEQ ID No: 59-61中之任一者)、hGH polyA (例如SEQ ID NO: 62)、SV40 polyA (例如SEQ ID NO: 53)、Proudfoot合成polyA (例如SEQ ID NO: 65)或兔β-球蛋白polyA (例如SEQ ID NO: 66)序列或其長度為約40至200個核苷酸的片段。
在一些實施例中，載體構築體包含多腺苷酸化信號、視情況存在之牛生長激素(BGH) polyA信號(例如SEQ ID No: 59-61)或人類生長激素(hGH) polyA信號(例如SEQ ID NO: 62)或其片段。
polyA信號之長度可為約150至約250個核苷酸、長度為約160至約240個核苷酸、長度為約170至約230個核苷酸、長度為約180至約220個核苷酸或長度為約200至約210個核苷酸。
在一些實施例中，載體構築體可包括額外轉錄及轉譯起始序列及/或額外轉錄及轉譯終止序列，其為此項技術中已知的。
感興趣蛋白質及編碼感興趣蛋白質之核酸 .
如本文所使用，「感興趣蛋白質」為任何功能性cMyBP-C蛋白，包括天然存在的及其非天然存在之變異體。在一些實施例中，編碼一或多種感興趣cMy-BP-C蛋白之聚核苷酸可插入本文所揭示之病毒載體中，其中該聚核苷酸與啟動子可操作地連接。在一些情況下，啟動子可驅動感興趣蛋白質在宿主細胞(例如人類心肌)中表現。
在一或多個實施例中，功能性cMyBP-C包含與SEQ ID NO: 2 (人類心臟肌球蛋白結合蛋白C)至少90%、95%或98%一致的胺基酸序列。本揭示內容亦提供一種經分離核酸分子，其編碼此類功能性野生型cMY-BP-C蛋白。核苷酸序列可與SEQ ID NO: 1之野生型核苷酸序列同源。在某些實施例中，核酸分子與SEQ ID NO: 1之核苷酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%同源性或至少98%同源性，或SEQ ID NO: 1或42-43之至少100、200、300、400或500個連續核苷酸。在例示性實施例中，編碼功能性心臟肌球蛋白結合蛋白C之核苷酸序列經密碼子最佳化或為變異體，且可與SEQ ID No: 44-46中之任一者至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致。
在某些實施例中，核酸分子與SEQ ID No: 1或42-46之核苷酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%同源性或至少98%同源性，或SEQ ID NO: 1或42-46之至少100、200、300、400或500個連續核苷酸。
在例示性實施例中，編碼功能性cMyBP-C之核酸序列為野生型MYBPC3序列，其中SEQ ID NO: 1為一個實例，或經密碼子最佳化，或為變異體。本文所描述之載體構築體可包含與野生型核苷酸序列不同但仍編碼與SEQ ID NO: 2至少90%、95%或98%一致的功能性cMyBP-C胺基酸序列的核苷酸序列。根據此態樣，核苷酸序列可包含與SEQ ID NO: 1或42-46之至少100個連續鹼基具有至少80%、85%、90%或95%同源性的部分，只要核苷酸序列編碼與SEQ ID NO: 2至少90%、95%或98%一致的功能性人類cMyBP-C蛋白即可。在例示性實施例中，核苷酸序列可包含與SEQ ID NO: 1之至少100、200、300、400或500個連續鹼基具有至少90%同源性的部分，只要核苷酸序列編碼與SEQ ID NO: 2至少90%一致的功能性人類cMyBP-C蛋白即可。在例示性實施例中，核苷酸序列與SEQ ID NO: 1或42-46之核苷酸序列具有實質同源性且編碼功能性cMyBP-C。術語實質同源性可參考同源性百分比(%)進一步定義，例如至少80%、85%、90%或95%同源。此在本文中別處進一步詳細論述。
在例示性實施例中，感興趣基因之核苷酸序列經密碼子最佳化，較佳經密碼子最佳化以便在人類中更有效地表現，或在人類之目標器官、目標組織及/或目標細胞中更有效地表現。目標器官、組織或細胞包括心臟組織及/或心肌細胞。編碼基因治療產物之核苷酸序列對人類細胞密碼子使用之適應性可表示為密碼子適應指數(CAI)。密碼子適應指數在本文中定義為基因之密碼子使用對高度表現人類基因之密碼子使用之相對適應性的量度。各密碼子之相對適應性(w)為各密碼子之使用與相同胺基酸之最豐富密碼子之使用的比率。CAI定義為此等相對適應性值之幾何平均值。不包括非同義密碼子及終止密碼子(取決於遺傳密碼)。CAI值範圍介於0至1，值愈高表明最豐富密碼子之比例愈高(參見Sharp及Li, 1987, Nucleic Acids Research 15: 1281-1295；亦參見：Kim等人, Gene. 1997, 199:293-301；zur Megede等人, Journal of Virology, 2000, 74: 2628-2635)。在某些實施例中，感興趣基因之CAI為至少0.75、0.80、0.85、0.90、0.95或0.99。
密碼子最佳化可例如使用DNA2.0密碼子最佳化演算法進行，參見Villalobos等人, 「Gene Designer: a synthetic biology tool for constructing artificial DNA segments,」 BMC Bioinformatics, 第7卷, 文章編號：285 (2006)或使用Operon/Eurofins Genomics密碼子最佳化軟體或其他密碼子最佳化工具進行，例如Grote等人, 「Jcat: a novel tool to adapt codon usage of a target gene to its potential expression host,」 Nucleic Acids Res. 33:W526-31 (2005)。
另外或作為密碼子最佳化之替代方案，可調整感興趣基因之核苷酸序列以減少CpG二核苷酸含量且視情況移除有義及反義方向上之任何額外ORF。CpG二核苷酸含量已被證明能活化樹突狀細胞中之TLR9，導致潛在的免疫活化及CTL反應。降低CpG含量可減少肝臟炎症及ALT。在一些實施例中，感興趣基因之核苷酸序列的CpG二核苷酸含量小於25、小於20、小於15或小於10。在另一個實施例中，感興趣基因之核苷酸序列的GC含量小於65%、小於60%或小於55%。
一般而言，密碼子最佳化或CpG減少不會改變各密碼子編碼之胺基酸。其僅改變核苷酸序列，以使其與非最佳化序列相比更可能以相對較高水平表現。
如本文所描述，編碼cMyBP-C蛋白之核苷酸序列可經修飾以提高蛋白質之表現效率。可用於改善本文中之基因之轉錄及/或轉譯的方法不受特別限制。舉例而言，核苷酸序列可經修飾以更好地反映宿主密碼子使用，以增加宿主(例如哺乳動物)之基因表現(例如蛋白質產生)。作為修飾之另一個非限制性實例，感興趣蛋白質之核苷酸序列中之剪接供體及/或剪接受體中之一或多者經修飾以降低外來剪接之可能性。作為修飾之另一個非限制性實例，一或多個內含子可插入感興趣蛋白質之核苷酸序列內或附近，以使AAV載體包裝最佳化且增強表現。
核酸分子編碼與SEQ ID NO: 2野生型胺基酸序列至少90%一致的功能性cMyBP-C蛋白。若核酸編碼包含相對於野生型胺基酸中之任一者具有變化之序列的蛋白質，則該蛋白質仍應為功能性蛋白質。技術人員應瞭解，可對蛋白質之一些胺基酸作出少量變化，而不會不利地影響蛋白質之功能。
在某些實施例中，核酸分子在適合的系統(例如宿主細胞)中表現時，產生功能性cMyBP-C蛋白且處於相對較高的水平。由於所產生之cMyBP-C具有功能性，因此其將具有與野生型cMyBP-C之至少一部分相同的構形。在某些實施例中，如本文所描述產生之功能性cMyBP-C蛋白有效地治療罹患野生型cMyBP-C蛋白缺乏症及/或HCM之個體。
熟習此項技術者完全有能力產生本文所提供之核酸分子。此可例如使用給定序列之化學合成來進行。此外，用於確定本文所描述之核酸是否表現功能性蛋白質之適合方法對於熟習此項技術者而言將為顯而易見的。舉例而言，一種適合的活體外方法涉及將核酸插入載體諸如AAV載體中，用載體轉導宿主細胞諸如293T或HeLa細胞，且分析cMyBP-C。或者，適合的活體內方法涉及將含有核酸之載體轉導至HCM小鼠中且分析功能性cMyBP-C。
內含子
在一些實施例中，載體包含一或多個內含子。內含子可有助於哺乳動物宿主細胞中RNA轉錄物之加工，增加感興趣蛋白質之表現及/或使AAV顆粒中載體包裝最佳化。此類內含子之非限制性實例為人類β球蛋白內含子、人類免疫球蛋白G (IgG)內含子或原生cMyBP-C內含子。在一些實施例中，內含子為合成內含子。
在一些實施例中，載體構築體及/或AAV顆粒包含心肌細胞特異性啟動子及一或多種額外異源表現控制元件，諸如增強cMyBP-C蛋白表現之內含子。舉例而言，載體構築體及/或AAV顆粒包含如上文所描述之心肌細胞特異性啟動子中之任一者，及視情況存在之位於編碼cMyBP-C之核苷酸序列之5'的內含子核苷酸序列。在其他實例中，載體構築體及/或AAV顆粒包含如上文所描述之心肌細胞特異性啟動子中之任一者，及視情況存在之位於編碼cMyBP-C之核苷酸序列內(例如在任何外顯子之間)的內含子核苷酸序列。在一些實施例中，內含子序列位於外顯子2與3之間。在一些實施例中，內含子序列位於編碼cMyBP-C之核酸內對應於SEQ ID NO: 1或42-46之位置293的位置處。
在一或多個實施例中，內含子包含與SEQ ID NO: 53至少60%、65%、70%、75%、80%或85%或90%或95%一致的核苷酸序列，且內含子之長度可為約50至約150個核苷酸，或長度為約100至約135個核苷酸。在例示性實施例中，內含子包含SEQ ID NO: 53或其片段，該片段為SEQ ID NO: 53之約50-150個核苷酸、75-145個核苷酸、100-135個核苷酸或120-135個核苷酸，或該片段之變異體，該變異體與該片段至少80%、85%、90%或95%一致。在一些實施例中，內含子可包含與SEQ ID NO: 53至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致的核苷酸序列。
在一或多個實施例中，內含子包含與SEQ ID NO: 58至少60%、65%、70%、75%、80%或85%或90%或95%一致的核苷酸序列，且內含子之長度可為約50至約150個核苷酸，或長度為約100至約135個核苷酸。在例示性實施例中，內含子包含SEQ ID NO: 58或其片段，該片段為SEQ ID NO: 58之約50-150個核苷酸、75-145個核苷酸、100-135個核苷酸或120-135個核苷酸，或該片段之變異體，該變異體與該片段至少80%、85%、90%或95%一致。在一些實施例中，內含子可包含與SEQ ID NO: 58至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致的核苷酸序列。
其他例示性內含子包含與SEQ ID NO: 53-58中之任一者至少60%、65%、70%、75%、80%或85%或90%或95%一致的核苷酸序列。
在一些實施例中，載體構築體可進一步包含外顯子序列或其片段；較佳與內含子序列之5'或3'端相鄰。在一例示性實施例中，載體構築體包含與外顯子相鄰之球蛋白內含子，該外顯子包含與SEQ ID NO: 54至少80%或85%或90%或95%一致的核苷酸序列。在另一個例示性實施例中，載體構築體包含與外顯子序列相鄰之球蛋白內含子，其包含與SEQ ID NO: 53至少80%或85%或90%或95%一致的核苷酸序列。在一例示性實施例中，載體構築體包含與HbB外顯子序列相鄰之球蛋白內含子，該外顯子序列包含與SEQ ID NO: 54至少80%或85%或90%一致的核苷酸序列。
載體中內含子之位置及大小可不同。在一些實施例中，內含子位於啟動子與編碼感興趣蛋白質之序列之間。在一些實施例中，內含子位於編碼感興趣蛋白質之序列的下游。在一些實施例中，內含子位於啟動子內。在一些實施例中，內含子包括強化子元件。在一些實施例中，內含子位於編碼感興趣蛋白質之序列內，較佳地在編碼感興趣蛋白質之序列的外顯子之間。在一些實施例中，內含子可包含在編碼感興趣蛋白質之序列內的天然存在之內含子的全部或一部分。在一些實施例中，內含子為球蛋白內含子。在一些實施例中，內含子為嵌合內含子且包含人類IgG內含子之片段。
與不存在內含子元件之情況下的表現相比，包括內含子元件可增強表現(參見例如Kurachi等人,
J. Biol. Chem. 270(10): 5276-81 (1995)。AAV載體通常接受具有限定大小範圍之DNA插入物，該範圍一般為約4 kb至約5.4 kb，或略多。然而，不存在極其高效的包裝及較小載體基因體包裝之最小大小。內含子及內含子片段滿足此要求，同時亦增強表現。因此，本揭示案不限於在AAV載體中包括cMyBP-C內含子序列，且包括其他內含子或其他DNA序列代替cMyBP-C內含子之部分。此外，可使用其他5'及3'核酸非轉譯區來代替針對人類cMyBP-C所敍述之彼等非轉譯區。
在一些實施例中，載體構築體包含與SEQ ID NO: 3-41或92-169中之任一者至少97%、98%或99%一致的核苷酸序列。在其他實施例中，載體構築體包含與SEQ ID NO: 3-41或92-169中之任一者互補或為負(-)股之核苷酸序列至少97%、98%或99%一致的核苷酸序列。
在一些實施例中，載體構築體包含與SEQ ID NO: 3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36或39中之任一者至少97%、98%或99%一致的核苷酸序列。在其他實施例中，載體構築體包含與SEQ ID NO: 3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36或39中之任一者互補或為負(-)股之核苷酸序列至少97%、98%或99%一致的核苷酸序列。
在一些實施例中，載體構築體包含與SEQ ID NO: 4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37或40中之任一者至少97%、98%或99%一致的核苷酸序列。在其他實施例中，載體構築體包含與SEQ ID NO: 4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37或40中之任一者互補或為負(-)股之核苷酸序列至少97%、98%或99%一致的核苷酸序列。
在一些實施例中，載體構築體包含與SEQ ID NO: 5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38或41中之任一者至少97%、98%或99%一致的核苷酸序列。在其他實施例中，載體構築體包含與5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38或41中之任一者互補或為負(-)股之核苷酸序列至少97%、98%或99%一致的核苷酸序列。
例示性實施例包括以下：
構築體 C1之長度為4950 bp (SEQ ID NO: 29)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、嵌合內含子(133 bp) (SEQ ID NO: 58)、經密碼子最佳化之hMYBPC3 (SEQ ID NO: 44)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。
在一些實施例中，
構築體 C1之長度為4980 bp (SEQ ID NO: 28)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 68)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、嵌合內含子(133 bp) (SEQ ID NO: 58)、經密碼子最佳化之hMYBPC3 (SEQ ID NO: 44)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 72)。
在一些實施例中，
構築體 C1之長度為4950 bp (SEQ ID NO: 92)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 69)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、嵌合內含子(133 bp) (SEQ ID NO: 58)、經密碼子最佳化之hMYBPC3 (SEQ ID NO: 44)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 73)。
在一些實施例中，
構築體 C1之長度為4980 bp (SEQ ID NO: 93)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 70)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、嵌合內含子(133 bp) (SEQ ID NO: 58)、經密碼子最佳化之hMYBPC3 (SEQ ID NO: 44)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 74)。
在一些實施例中，
構築體 C1之長度為4950 bp (SEQ ID NO: 94)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、嵌合內含子(133 bp) (SEQ ID NO: 58)、經密碼子最佳化之hMYBPC3 (SEQ ID NO: 44)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 73)。
在一些實施例中，
構築體 C1之長度為4980 bp (SEQ ID NO: 95)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 68)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、嵌合內含子(133 bp) (SEQ ID NO: 58)、經密碼子最佳化之hMYBPC3 (SEQ ID NO: 44)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 74)。
在一些實施例中，
構築體 C1之長度為4950 bp (SEQ ID NO: 96)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 69)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、嵌合內含子(133 bp) (SEQ ID NO: 58)、經密碼子最佳化之hMYBPC3 (SEQ ID NO: 44)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 69)。
在一些實施例中，
構築體 C1之長度為4980 bp (SEQ ID NO: 97)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 70)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、嵌合內含子(133 bp) (SEQ ID NO: 58)、經密碼子最佳化之hMYBPC3 (SEQ ID NO: 44)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 72)。
在一些實施例中，
構築體 C1之長度為4640 bp (SEQ ID NO: 27)且在5'至3'包含以下元件：hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、嵌合內含子(133 bp) (SEQ ID NO: 58)、經密碼子最佳化之hMYBPC3 (SEQ ID NO: 44)及微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)。在其他實施例中，
構築體 C1視情況包含SEQ ID NO: 67-70之5' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)及/或SEQ ID NO: 71-74之3' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)，或其片段。
構築體 C2之長度為4801 bp (SEQ ID NO: 32)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、經密碼子最佳化之hMYBPC3 (SEQ ID NO: 44)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。
在一些實施例中，
構築體 C2之長度為4831 bp (SEQ ID NO: 31)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 68)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、經密碼子最佳化之hMYBPC3 (SEQ ID NO: 44)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 72)。
在一些實施例中，
構築體 C2之長度為4801 bp (SEQ ID NO: 98)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 69)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、經密碼子最佳化之hMYBPC3 (SEQ ID NO: 44)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 73)。
在一些實施例中，
構築體 C2之長度為4831 bp (SEQ ID NO: 99)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 70)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、經密碼子最佳化之hMYBPC3 (SEQ ID NO: 44)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 74)。
在一些實施例中，
構築體 C2之長度為4801 bp (SEQ ID NO: 100)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、經密碼子最佳化之hMYBPC3 (SEQ ID NO: 44)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 73)。
在一些實施例中，
構築體 C2之長度為4831 bp (SEQ ID NO: 101)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 68)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、經密碼子最佳化之hMYBPC3 (SEQ ID NO: 44)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 74)。
在一些實施例中，
構築體 C2之長度為4801 bp (SEQ ID NO: 102)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 69)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、經密碼子最佳化之hMYBPC3 (SEQ ID NO: 44)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。
在一些實施例中，
構築體 C2之長度為4831 bp (SEQ ID NO: 103)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 70)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、經密碼子最佳化之hMYBPC3 (SEQ ID NO: 44)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 72)。
在一些實施例中，
構築體 C2之長度為4491 bp (SEQ ID NO: 30)且在5'至3'包含以下元件：hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、經密碼子最佳化之hMYBPC3 (SEQ ID NO: 44)及微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)。在其他實施例中，
構築體 C2視情況包含SEQ ID NO: 67-70之5' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)及/或SEQ ID NO: 71-74之3' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)，或其片段。
構築體 C3之長度為4801 bp (SEQ ID NO: 35)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 43)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。
在一些實施例中，
構築體 C3之長度為4831 bp (SEQ ID NO: 34)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 68)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 43)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 72)。
在一些實施例中，
構築體 C3之長度為4801 bp (SEQ ID NO: 104)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 69)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 43)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 73)。
在一些實施例中，
構築體 C3之長度為4831 bp (SEQ ID NO: 105)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 70)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 43)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 74)。
在一些實施例中，
構築體 C3之長度為4801 bp (SEQ ID NO: 106)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 43)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 73)。
在一些實施例中，
構築體 C3之長度為4831 bp (SEQ ID NO: 107)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 68)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 43)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 74)。
在一些實施例中，
構築體 C3之長度為4801 bp (SEQ ID NO: 108)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 69)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 43)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。
在一些實施例中，
構築體 C3之長度為4831 bp (SEQ ID NO: 109)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 70)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 43)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 72)。
在一些實施例中，
構築體 C3之長度為4491 bp (SEQ ID NO: 33)且在5'至3'包含以下元件：hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 43)及微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)。在其他實施例中，
構築體 C3視情況包含SEQ ID NO: 67-70之5' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)及/或SEQ ID NO: 71-74之3' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)，或其片段。
構築體 C4之長度為4950 bp (SEQ ID NO: 38)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、嵌合內含子(133 bp) (SEQ ID NO: 58)、野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 43)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。
在一些實施例中，
構築體 C4之長度為4980 bp (SEQ ID NO: 37)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 68)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、嵌合內含子(133 bp) (SEQ ID NO: 58)、野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 43)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 72)。
在一些實施例中，
構築體 C4之長度為4950 bp (SEQ ID NO: 110)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 69)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、嵌合內含子(133 bp) (SEQ ID NO: 58)、野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 43)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 73)。
在一些實施例中，
構築體 C4之長度為4980 bp (SEQ ID NO: 111)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 70)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、嵌合內含子(133 bp) (SEQ ID NO: 58)、野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 43)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 74)。
在一些實施例中，
構築體 C4之長度為4950 bp (SEQ ID NO: 112)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、嵌合內含子(133 bp) (SEQ ID NO: 58)、野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 43)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 73)。
在一些實施例中，
構築體 C4之長度為4980 bp (SEQ ID NO: 113)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 68)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、嵌合內含子(133 bp) (SEQ ID NO: 58)、野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 43)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 74)。
在一些實施例中，
構築體 C4之長度為4950 bp (SEQ ID NO: 114)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 69)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、嵌合內含子(133 bp) (SEQ ID NO: 58)、野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 43)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。
在一些實施例中，
構築體 C4之長度為4980 bp (SEQ ID NO: 115)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 70)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、嵌合內含子(133 bp) (SEQ ID NO: 58)、野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 43)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 72)。
在一些實施例中，
構築體 C4之長度為4640 bp (SEQ ID NO: 36)且在5'至3'包含以下元件：hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、嵌合內含子(133 bp) (SEQ ID NO: 58)、野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 43)及微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)。在其他實施例中，
構築體 C4視情況包含SEQ ID NO: 67-70之5' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)及/或SEQ ID NO: 71-74之3' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)，或其片段。
構築體 C5之長度為4950 bp (SEQ ID NO: 41)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、嵌合內含子(133 bp) (SEQ ID NO: 58)、無CpG之hMYBPC3 (SEQ ID NO: 45)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。
在一些實施例中，
構築體 C5之長度為4980 bp (SEQ ID NO: 40)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 68)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、嵌合內含子(133 bp) (SEQ ID NO: 58)、無CpG之hMYBPC3 (SEQ ID NO: 45)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 72)。
在一些實施例中，
構築體 C5之長度為4950 bp (SEQ ID NO: 116)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 69)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、嵌合內含子(133 bp) (SEQ ID NO: 58)、無CpG之hMYBPC3 (SEQ ID NO: 45)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 73)。
在一些實施例中，
構築體 C5之長度為4980 bp (SEQ ID NO: 117)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 70)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、嵌合內含子(133 bp) (SEQ ID NO: 58)、無CpG之hMYBPC3 (SEQ ID NO: 45)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 74)。
在一些實施例中，
構築體 C5之長度為4950 bp (SEQ ID NO: 118)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、嵌合內含子(133 bp) (SEQ ID NO: 58)、無CpG之hMYBPC3 (SEQ ID NO: 45)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 73)。
在一些實施例中，
構築體 C5之長度為4980 bp (SEQ ID NO: 119)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 68)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、嵌合內含子(133 bp) (SEQ ID NO: 58)、無CpG之hMYBPC3 (SEQ ID NO: 45)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 74)。
在一些實施例中，
構築體 C5之長度為4950 bp (SEQ ID NO: 120)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 69)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、嵌合內含子(133 bp) (SEQ ID NO: 58)、無CpG之hMYBPC3 (SEQ ID NO: 45)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。
在一些實施例中，
構築體 C5之長度為4980 bp (SEQ ID NO: 121)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 70)、hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、嵌合內含子(133 bp) (SEQ ID NO: 58)、無CpG之hMYBPC3 (SEQ ID NO: 45)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 72)。
在一些實施例中，
構築體 C5之長度為4806 bp (SEQ ID NO: 39)且在5'至3'包含以下元件：hTNNT2啟動子(544 bp) (SEQ ID NO: 52)、嵌合內含子(133 bp) (SEQ ID NO: 58)、無CpG之hMYBPC3 (SEQ ID NO: 45)及微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)。在其他實施例中，
構築體 C5視情況包含SEQ ID NO: 67-70之5' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)及/或SEQ ID NO: 71-74之3' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)，或其片段。
構築體 A1之長度為5074 bp (SEQ ID NO: 5)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)、HBB外顯子3 (SEQ ID NO: 54)；野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。
在一些實施例中，
構築體 A1之長度為5104 bp (SEQ ID NO: 4)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 68)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)、HBB外顯子3 (SEQ ID NO: 54)；野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 72)；
在一些實施例中，
構築體 A1之長度為5074 bp (SEQ ID NO: 122)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 69)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)、HBB外顯子3 (SEQ ID NO: 54)；野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 73)；
在一些實施例中，
構築體 A1之長度為5104 bp (SEQ ID NO: 123)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 70)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)、HBB外顯子3 (SEQ ID NO: 54)；野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 74)；
在一些實施例中，
構築體 A1之長度為5074 bp (SEQ ID NO: 124)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)、HBB外顯子3 (SEQ ID NO: 54)；野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 73)；
在一些實施例中，
構築體 A1之長度為5104 bp (SEQ ID NO: 125)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 68)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)、HBB外顯子3 (SEQ ID NO: 54)；野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 74)；
在一些實施例中，
構築體 A1之長度為5074 bp (SEQ ID NO: 126)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 69)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)、HBB外顯子3 (SEQ ID NO: 54)；野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)；
在一些實施例中，
構築體 A1之長度為5104 bp (SEQ ID NO: 127)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 70)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)、HBB外顯子3 (SEQ ID NO: 54)；野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 72)。
在一些實施例中，
構築體 A1之長度為4786 bp (SEQ ID NO: 3)且在5'至3'包含以下元件：hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)、HBB外顯子3 (SEQ ID NO: 54)；野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)及bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)。在其他實施例中，
構築體 A1視情況包含SEQ ID NO: 67-70之5' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)及/或SEQ ID NO: 71-74之3' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)，或其片段。
構築體 A2之長度為4939 bp (SEQ ID NO: 8)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(469 bp) (SEQ ID NO: 49)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。
在一些實施例中，
構築體 A2之長度為4969 bp (SEQ ID NO: 7)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 68)、hTNNT2啟動子(469 bp) (SEQ ID NO: 49)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 72)。
在一些實施例中，
構築體 A2之長度為4939 bp (SEQ ID NO: 128)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 69)、hTNNT2啟動子(469 bp) (SEQ ID NO: 49)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 73)。
在一些實施例中，
構築體 A2之長度為4969 bp (SEQ ID NO: 129)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 70)、hTNNT2啟動子(469 bp) (SEQ ID NO: 49)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 74)。
在一些實施例中，
構築體 A2之長度為4939 bp (SEQ ID NO: 130)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(469 bp) (SEQ ID NO: 49)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 73)。
在一些實施例中，
構築體 A2之長度為4969 bp (SEQ ID NO: 131)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 68)、hTNNT2啟動子(469 bp) (SEQ ID NO: 49)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 74)。
在一些實施例中，
構築體 A2之長度為4939 bp (SEQ ID NO: 132)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 69)、hTNNT2啟動子(469 bp) (SEQ ID NO: 49)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。
在一些實施例中，
構築體 A2之長度為4969 bp (SEQ ID NO: 133)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 70)、hTNNT2啟動子(469 bp) (SEQ ID NO: 49)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 72)。
在一些實施例中，
構築體 A2之長度為4663 bp (SEQ ID NO: 6)且在5'至3'包含以下元件：hTNNT2啟動子(469 bp) (SEQ ID NO: 49)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)及bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)。在其他實施例中，
構築體 A2視情況包含SEQ ID NO: 67-70之5' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)及/或SEQ ID NO: 71-74之3' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)，或其片段。
構築體 A3之長度為4939 bp (SEQ ID NO: 11)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (169 bp) (SEQ ID NO: 59)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。
在一些實施例中，
構築體 A3之長度為4969 bp (SEQ ID NO: 10)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 68)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (169 bp) (SEQ ID NO: 59)及3' AAV2 ITR (145) (SEQ ID NO: 72)。
在一些實施例中，
構築體 A3之長度為4939 bp (SEQ ID NO: 134)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 69)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (169 bp) (SEQ ID NO: 59)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 73)。
在一些實施例中，
構築體 A3之長度為4969 bp (SEQ ID NO: 135)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 70)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (169 bp) (SEQ ID NO: 59)及3' AAV2 ITR (145) (SEQ ID NO: 74)。
在一些實施例中，
構築體 A3之長度為4939 bp (SEQ ID NO: 136)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (169 bp) (SEQ ID NO: 59)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 73)。
在一些實施例中，
構築體 A3之長度為4969 bp (SEQ ID NO: 137)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 68)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (169 bp) (SEQ ID NO: 59)及3' AAV2 ITR (145) (SEQ ID NO: 74)。
在一些實施例中，
構築體 A3之長度為4939 bp (SEQ ID NO: 138)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 69)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (169 bp) (SEQ ID NO: 59)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。
在一些實施例中，
構築體 A3之長度為4969 bp (SEQ ID NO: 139)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 70)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (169 bp) (SEQ ID NO: 59)及3' AAV2 ITR (145) (SEQ ID NO: 72)。
在一些實施例中，
構築體 A3之長度為4663 bp (SEQ ID NO: 9)且在5'至3'包含以下元件：hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)及bGH poly A (169 bp) (SEQ ID NO: 59)。在其他實施例中，
構築體 A3視情況包含SEQ ID NO: 67-70之5' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)及/或SEQ ID NO: 71-74之3' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)，或其片段。
構築體 A4之長度為4939 bp (SEQ ID NO: 14)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(499 bp) (SEQ ID NO: 50)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (202 bp) (SEQ ID NO: 60)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。
在一些實施例中，
構築體 A4之長度為4969 bp (SEQ ID NO: 13)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 68)、hTNNT2啟動子(499 bp) (SEQ ID NO: 50)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (202 bp) (SEQ ID NO: 60)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 72)。
在一些實施例中，
構築體 A4之長度為4939 bp (SEQ ID NO: 140)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 69)、hTNNT2啟動子(499 bp) (SEQ ID NO: 50)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (202 bp) (SEQ ID NO: 60)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 73)。
在一些實施例中，
構築體 A4之長度為4969 bp (SEQ ID NO: 141)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 70)、hTNNT2啟動子(499 bp) (SEQ ID NO: 50)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (202 bp) (SEQ ID NO: 60)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 74)。
在一些實施例中，
構築體 A4之長度為4939 bp (SEQ ID NO: 142)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(499 bp) (SEQ ID NO: 50)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (202 bp) (SEQ ID NO: 60)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 73)。
在一些實施例中，
構築體 A4之長度為4969 bp (SEQ ID NO: 143)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 68)、hTNNT2啟動子(499 bp) (SEQ ID NO: 50)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (202 bp) (SEQ ID NO: 60)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 74)。
在一些實施例中，
構築體 A4之長度為4939 bp (SEQ ID NO: 144)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 69)、hTNNT2啟動子(499 bp) (SEQ ID NO: 50)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (202 bp) (SEQ ID NO: 60)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。
在一些實施例中，
構築體 A4之長度為4969 bp (SEQ ID NO: 145)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 70)、hTNNT2啟動子(499 bp) (SEQ ID NO: 50)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (202 bp) (SEQ ID NO: 60)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 72)。
在一些實施例中，
構築體 A4之長度為4663 bp (SEQ ID NO: 12)且在5'至3'包含以下元件：hTNNT2啟動子(499 bp) (SEQ ID NO: 50)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)及bGH poly A (202 bp) (SEQ ID NO: 60)。在其他實施例中，
構築體 A4視情況包含SEQ ID NO: 67-70之5' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)及/或SEQ ID NO: 71-74之3' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)，或其片段。
構築體 A5之長度為4871 bp (SEQ ID NO: 17)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。
在一些實施例中，
構築體 A5之長度為4901 bp (SEQ ID NO: 16)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 71)。
在一些實施例中，
構築體 A5之長度為4871 bp (SEQ ID NO: 146)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 69)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 73)。
在一些實施例中，
構築體 A5之長度為4901 bp (SEQ ID NO: 147)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 70)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 74)。
在一些實施例中，
構築體 A5之長度為4871 bp (SEQ ID NO: 148)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 73)。
在一些實施例中，
構築體 A5之長度為4901 bp (SEQ ID NO: 149)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 68)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 74)。
在一些實施例中，
構築體 A5之長度為4871 bp (SEQ ID NO: 150)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 69)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。
在一些實施例中，
構築體 A5之長度為4901 bp (SEQ ID NO: 151)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 70)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 72)。
在一些實施例中，
構築體 A5之長度為4595 bp (SEQ ID NO: 15)且在5'至3'包含以下元件：hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)及bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)。在其他實施例中，
構築體 A5視情況包含SEQ ID NO: 67-70之5' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)及/或SEQ ID NO: 71-74之3' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)，或其片段。
構築體 A6之長度為5002 bp (SEQ ID NO: 20)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。
在一些實施例中，
構築體 A6之長度為5032 bp (SEQ ID NO: 19)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 68)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 72)。
在一些實施例中，
構築體 A6之長度為5002 bp (SEQ ID NO: 152)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 69)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 73)。
在一些實施例中，
構築體 A6之長度為5032 bp (SEQ ID NO: 153)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 70)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 74)。
在一些實施例中，
構築體 A6之長度為5002 bp (SEQ ID NO: 154)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 73)。
在一些實施例中，
構築體 A6之長度為5032 bp (SEQ ID NO: 155)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 68)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 74)。
在一些實施例中，
構築體 A6之長度為5002 bp (SEQ ID NO: 156)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 69)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。
在一些實施例中，
構築體 A6之長度為5032 bp (SEQ ID NO: 157)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 70)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)及3' AAV2 ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 72)。
在一些實施例中，
構築體 A6之長度為4726 bp (SEQ ID NO: 18)且在5'至3'包含以下元件：hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)及bGH poly A (227 bp) (SEQ ID NO: 61)。在其他實施例中，
構築體 A6視情況包含SEQ ID NO: 67-70之5' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)及/或SEQ ID NO: 71-74之3' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)，或其片段。
構築體 A7之長度為4781 bp (SEQ ID NO: 23)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(469 bp) (SEQ ID NO: 49)、Kozac序列、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)、3'-UTR序列及3' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。
在一些實施例中，
構築體 A7之長度為4811 bp (SEQ ID NO: 22)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(469 bp) (SEQ ID NO: 49)、Kozac序列、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)、3'-UTR序列及3' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 71)。
在一些實施例中，
構築體 A7之長度為4781 bp (SEQ ID NO: 158)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 69)、hTNNT2啟動子(469 bp) (SEQ ID NO: 49)、Kozac序列、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)、3'-UTR序列及3' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 73)。
在一些實施例中，
構築體 A7之長度為4811 bp (SEQ ID NO: 159)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 70)、hTNNT2啟動子(469 bp) (SEQ ID NO: 49)、Kozac序列、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)、3'-UTR序列及3' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 74)。
在一些實施例中，
構築體 A7之長度為4781 bp (SEQ ID NO: 160)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(469 bp) (SEQ ID NO: 49)、Kozac序列、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)、3'-UTR序列及3' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 73)。
在一些實施例中，
構築體 A7之長度為4811 bp (SEQ ID NO: 161)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 68)、hTNNT2啟動子(469 bp) (SEQ ID NO: 49)、Kozac序列、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)、3'-UTR序列及3' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 74)。
在一些實施例中，
構築體 A7之長度為4781 bp (SEQ ID NO: 162)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 69)、hTNNT2啟動子(469 bp) (SEQ ID NO: 49)、Kozac序列、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)、3'-UTR序列及3' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。
在一些實施例中，
構築體 A7之長度為4811 bp (SEQ ID NO: 163)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 70)、hTNNT2啟動子(469 bp) (SEQ ID NO: 49)、Kozac序列、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)、3'-UTR序列及3' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 72)。
在一些實施例中，
構築體 A7之長度為4505 bp (SEQ ID NO: 21)且在5'至3'包含以下元件：hTNNT2啟動子(469 bp) (SEQ ID NO: 49)、Kozac序列、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3'-UTR序列。在其他實施例中，
構築體 A7視情況包含SEQ ID NO: 67-70之5' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)及/或SEQ ID NO: 71-74之3' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)，或其片段。
構築體 A8之長度為4844 bp (SEQ ID NO: 26)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、Kozac序列、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)、3'-UTR序列及3' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。
在一些實施例中，
構築體 A8之長度為4874 bp (SEQ ID NO: 25)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、Kozac序列、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)、3'-UTR序列及3' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 71)。
在一些實施例中，
構築體 A8之長度為4844 bp (SEQ ID NO: 164)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 69)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、Kozac序列、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)、3'-UTR序列及3' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 73)。
在一些實施例中，
構築體 A8之長度為4874 bp (SEQ ID NO: 165)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 70)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、Kozac序列、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)、3'-UTR序列及3' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 72)。
在一些實施例中，
構築體 A8之長度為4844 bp (SEQ ID NO: 166)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 67)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、Kozac序列、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)、3'-UTR序列及3' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 73)。
在一些實施例中，
構築體 A8之長度為4874 bp (SEQ ID NO: 167)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 68)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、Kozac序列、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)、3'-UTR序列及3' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 73)。
在一些實施例中，
構築體 A8之長度為4844 bp (SEQ ID NO: 168)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 69)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、Kozac序列、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)、3'-UTR序列及3' AAV2-ITR (130 bp) (SEQ ID NO: 71)。
在一些實施例中，
構築體 A8之長度為4874 bp (SEQ ID NO: 169)且在5'至3'包含以下元件：5' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 70)、hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、Kozac序列、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)、3'-UTR序列及3' AAV2-ITR (145 bp) (SEQ ID NO: 72)。
在一些實施例中，
構築體 A8之長度為4568 bp (SEQ ID NO: 24)且在5'至3'包含以下元件：hTNNT2啟動子(532 bp) (SEQ ID NO: 51)、Kozac序列、在外顯子之間具有球蛋白內含子(131 bp) (SEQ ID NO: 53)之野生型hMYBPC3 (SEQ ID NO: 42)、微型poly A (57 bp) (SEQ ID NO: 64)及3'-UTR序列。在其他實施例中，
構築體 A8視情況包含SEQ ID NO: 67-70之5' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)及/或SEQ ID NO: 71-74之3' AAV2-ITR序列中之任一者(或其互補序列)，或其片段。
在前述實施例中之任一者中，載體構築體包含至少一個ITR序列。例示性ITR序列包括但不限於SEQ ID No: 67-74，包括任何互補序列及/或其組合。
包括經修飾形式之聚核苷酸及多肽可使用各種標準選殖、重組DNA技術，經由熟習此項技術者已知的細胞表現或活體外轉譯及化學合成技術製備(Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版)。
基因遞送方法
.
亦提供一種使用如本文所描述之載體構築體或AAV顆粒來遞送編碼感興趣蛋白質之基因的方法。在一個實施例中，基因遞送載體可為病毒基因遞送載體，諸如病毒顆粒，或非病毒基因遞送載體，諸如編碼感興趣蛋白質之載體構築體或核酸。病毒載體包括慢病毒載體、腺病毒載體、疱疹病毒載體。其較佳為重組腺相關病毒(rAAV)載體。或者，可使用非病毒系統，包括使用裸DNA (具有或不具有染色質附著區)或共軛DNA，其藉由各種轉染方法諸如脂質或電穿孔引入細胞中。
如本文所描述之載體構築體之非限制性實例包括SEQ ID No: 3-41或92-169中之任一者。
在一些實施例中，載體構築體或AAV載體基因體包含與SEQ ID No: 3-41或92-169中之任一者(分別在SEQ ID No: 3-41或92-169之全長上)具有至少約80%、85%、90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或更高序列一致性的核苷酸序列。在一些實施例中，載體構築體包含與SEQ ID No: 3-41或92-169中之任一者具有至少約85%序列一致性的核苷酸序列。較佳地，載體構築體或AAV顆粒之AAV載體基因體包含與SEQ ID No: 3-41或92-169中之任一者具有至少約95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.5%或更高序列一致性的核苷酸序列。甚至更佳地，載體構築體之核苷酸序列與SEQ ID No: 3-41或92-169中之任一者至少97%或98%或99%或更高一致。在其他實施例中，載體構築體包含與SEQ ID NO: 3-41或92-169中之任一者互補或為負(-)股之核苷酸序列至少97%、98%或99%一致的核苷酸序列。
在一些實施例中，載體構築體包含與SEQ ID NO: 3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36或39中之任一者至少97%、98%或99%一致的核苷酸序列。在其他實施例中，載體構築體包含與SEQ ID NO: 3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36或39中之任一者互補或為負(-)股之核苷酸序列至少97%、98%或99%一致的核苷酸序列。
在一些實施例中，載體構築體包含與SEQ ID NO: 4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37或40中之任一者至少97%、98%或99%一致的核苷酸序列。在其他實施例中，載體構築體包含與SEQ ID NO: 4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37或40中之任一者互補或為負(-)股之核苷酸序列至少97%、98%或99%一致的核苷酸序列。
在一些實施例中，載體構築體包含與SEQ ID NO: 5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38或41中之任一者至少97%、98%或99%一致的核苷酸序列。在其他實施例中，載體構築體包含與5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38或41中之任一者互補或為負(-)股之核苷酸序列至少97%、98%或99%一致的核苷酸序列。
本揭示案可用於獸醫學及醫學應用。如本文所描述之基因遞送方法的適合個體包括禽類及哺乳動物，其中哺乳動物為較佳的且人類為最佳的。人類個體包括新生兒、嬰兒、青少年及成人。
非病毒基因遞送
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非病毒基因遞送可使用裸DNA進行，其為最簡單的非病毒轉染方法。例如，使用裸質體DNA投予本文所提供之載體構築體可為可能的。或者，載體構築體可使用涉及以下之方法遞送：電穿孔；聲致穿孔；或使用「基因槍」，其使用例如高壓氣體或倒置.22口徑槍(Helios®基因槍系統(BIO-RAD))將經DNA塗佈之金顆粒射入細胞；顯微注射；雷射；高溫；超音波；流體動力基因轉移；磁轉染；化學轉染(例如磷酸鈣、DEAE-聚葡萄糖)；脂質體；脂質複合物；樹枝狀聚合物；脂質奈米粒子或無機奈米粒子，其皆為此項技術中已知的。
為了改善載體構築體向細胞中之遞送，可能有必要保護其免受損傷且促進其進入細胞。為此目的，可使用能夠在轉染過程中保護核酸免於非所需降解之脂質複合物及聚合複合物。
載體構築體可在諸如微胞或脂質體之組織化結構中包覆有脂質。當組織化結構與DNA複合時，其稱為脂質複合物。陰離子及中性脂質可用於構築合成載體之脂質複合物。在一個實施例中，陽離子脂質由於其正電荷而可用於凝聚帶負電荷的DNA分子，以促進DNA囊封至脂質體中。若可能有必要將輔助脂質(通常為電中性脂質，諸如DOPE)添加至陽離子脂質以形成脂質複合物(Dabkowska等人,
J. R. Soc. Interface.9(68): 548-61 (2012)。
在某些實施例中，聚合物與DNA之複合物，稱為聚合複合物，可用於遞送載體構築體。大多數聚合複合物由陽離子聚合物組成，且其產生受離子相互作用調節。聚合複合物通常無法將其DNA負載釋放至細胞質中。因此，可能需要與諸如不活化腺病毒之內體溶解劑共轉染(以溶解內吞作用，亦即聚合複合物進入細胞之過程期間產生的內體) (Akinc等人,
J. Gene Medic.7 (5): 657-63)。
在某些實施例中，雜合方法可用於遞送組合兩種或更多種技術之載體構築體。病毒體為一個實例；其將脂質體與不活化HIV或流感病毒組合。在另一個實施例中，其他方法涉及將其他病毒載體與陽離子脂質混合或使病毒雜合，且可用於遞送核酸(Khan, Firdos Alam, Biotechnology Fundamentals, CRC Press, 2015年11月18日, 第395頁)。
在某些實施例中，樹枝狀聚合物可用於遞送載體構築體，特別是陽離子樹枝狀聚合物，亦即具有正表面電荷之樹枝狀聚合物。當在如DNA或RNA之遺傳物質存在下時，電荷互補性引起核酸與陽離子樹枝狀聚合物之暫時締合。到達目的地後，樹枝狀聚合物-核酸複合物隨後經由內吞作用導入細胞中(Amiji, Mansoor M.編, Polymeric Gene Delivery: Principles and Applications, CRC Press, 2004年9月29日, 第142頁)。
病毒顆粒
.
在一個實施例中，適合的病毒基因遞送載體諸如病毒顆粒可用於遞送核酸。在某些實施例中，適用於本文中之病毒基因遞送載體可為小病毒、腺病毒、反轉錄病毒、γ-反轉錄病毒、慢病毒、單純疱疹病毒、痘瘡病毒、麻疹病毒、水泡性口炎病毒、脊髓灰質炎病毒或里奧病毒。小病毒可為腺病毒相關病毒(AAV)。
因此，本發明提供用作基因遞送載體之病毒顆粒(包含本文所提供之載體構築體)，其基於動物小病毒，特別是依賴病毒，諸如感染性人類或猿猴AAV，及其組分(例如動物小病毒基因體)，用於在哺乳動物細胞中引入及/或表現cMyBP-C蛋白。因此，如本文所使用之術語「小病毒」涵蓋依賴病毒，諸如任何類型之AAV。
小病毒科之病毒為小DNA動物病毒。小病毒科可分為兩個亞科：小病毒亞科，其感染脊椎動物；及濃核病毒亞科，其感染昆蟲。小病毒亞科之成員在本文中稱為小病毒且包括依賴病毒屬。如自其屬名可推斷出，依賴病毒成員的獨特之處在於其通常需要與輔助病毒諸如腺病毒或疱疹病毒共感染，以用於細胞培養物中之生產性感染。依賴病毒屬包括通常感染人類(例如血清型1、2、3A、3B、4、5及6)、靈長類動物(例如血清型1及4)之AAV，及感染除鳥類及爬行動物之外的其他溫血動物的相關病毒(例如牛、犬、馬、小鼠、大鼠及綿羊腺相關病毒)。關於小病毒及小病毒科之其他成員的更多資訊描述於Kenneth I. Berns, 「Parvoviridae: The Viruses and Their Replication,」 Fields Virology第69章 (第3版1996)中。為方便起見，本揭示案藉由參考AAV在本文中進一步例示及描述。然而，應理解，本揭示案不限於AAV，但可同樣應用於其他小病毒。
AAV顆粒之產生需要AAV「rep」及「cap」基因，其分別為編碼複製及衣殼化蛋白之基因。AAV rep及cap基因已見於目前所檢查之所有AAV血清型中，且描述於本文及所引用之參考文獻中。在野生型AAV中，一般發現rep及cap基因在病毒基因體中彼此相鄰(亦即，其以鄰接或重疊轉錄單元方式「偶聯」在一起)，且其一般在AAV血清型中為保守的。AAV rep及cap基因亦獨立地且統稱為「AAV包裝基因」。本文中所使用之AAV cap基因編碼Cap蛋白質，其能夠在rep及腺輔助功能存在下包裝AAV載體且能夠結合目標細胞受體。在一些實施例中，AAV cap基因編碼具有來源於特定AAV血清型之胺基酸序列的衣殼蛋白。
用於產生AAV之AAV序列可來源於任何AAV血清型之基因體。一般而言，AAV血清型具有在胺基酸及核酸層面上具顯著同源性之基因體序列，提供一組類似的遺傳功能，產生在物理上及功能上基本上等效的病毒粒子，並藉由實際上相同的機制複製及組裝。關於AAV血清型之基因體序列及基因體相似性之論述。(參見例如GenBank寄存編號U89790；GenBank寄存編號J01901；GenBank寄存編號AF043303；GenBank寄存編號AF085716；Chiorini等人,
J. Virol.71: 6823-33 (1997)；Srivastava等人,
J. Virol.45: 555-64 (1983)；Chiorini等人,
J. Virol.73: 1309-19 (1999)；Rutledge等人,
J. Virol.72: 309-19 (1998)；及Wu等人,
J. Virol.74: 8635-47(2000))。
所有已知AAV血清型之基因體組織極其類似。AAV之基因體為長度小於約5,000個核苷酸(nt)之線性、單股DNA分子。反向末端重複序列(ITR)側接非結構複製(Rep)蛋白及結構(VP)蛋白之獨特編碼核苷酸序列。VP蛋白質形成衣殼。組裝活化蛋白(AAP)快速伴隨蛋白衣殼組裝且防止游離衣殼蛋白降解(Grosse等人,
J. Virol. 91(20): e01198-17 (2017)。末端145 nt為自互補的且經組織以使得形成T形髮夾的能量穩定之分子內雙螺旋能夠形成。此等髮夾結構用作病毒DNA複製之起點，充當細胞DNA聚合酶複合物之引子。Rep基因編碼Rep蛋白Rep78、Rep68、Rep52及Rep40。Rep78及Rep68由p5啟動子轉錄，且Rep 52及Rep40由p19啟動子轉錄。cap基因編碼VP蛋白VP1、VP2及VP3。cap基因係自p40啟動子轉錄。本發明實施例之載體中採用的ITR可對應於與相關cap基因相同之血清型，或可不同。在一個實施例中，本文中採用的ITR對應於AAV2血清型，且cap基因對應於AAV5血清型。
已知AAV VP蛋白質決定AAV病毒粒子之細胞向性。比起不同AAV血清型中之Rep蛋白及基因，VP蛋白質編碼序列之保守性明顯較低。Rep及ITR序列交叉補充其他血清型之對應序列的能力允許產生包含一種血清型(例如AAV1、5或8)之衣殼蛋白及另一種AAV血清型(例如AAV2)之Rep及/或ITR序列的假模式化AAV顆粒。該等假模式化rAAV顆粒為本揭示案之一部分。
本文所描述之AAV顆粒(及編碼AAV載體基因體)可包含WO-2018/022608或WO-2019/222136中所描述之衣殼蛋白中之任一者，該等專利中關於人類及猿猴AAV衣殼及其特性，諸如轉導效率、組織向性、聚醣結合及對IVIG中和之抗性的揭示內容以引用之方式整體併入本文中，包括但不限於序列表中之衣殼中之任一者及其變異體，例如具有嵌合交換可變區及/或聚醣結合序列及/或GH環。
在一個實施例中，用於本揭示案之上下文中之AAV ITR序列來源於AAV1、AAV2、AAV4及/或AAV6。同樣，在一個實施例中，Rep(例如Rep78及Rep52)編碼序列來源於AAV1、AAV2、AAV4及/或AAV6。然而，編碼用於本揭示案之上下文中之VP1、VP2及VP3衣殼蛋白的序列可獲自任何血清型，諸如獲自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12，或獲自猿猴AAV，包括WO 2018/022608或PCT/US19/32097中所描述之衣殼蛋白中之任一者，或藉由例如衣殼改組技術及AAV衣殼文庫獲得的新開發之AAV樣顆粒，或與SEQ ID No: 75-91中之任一者至少90%一致的任何衣殼。
舉例而言，公開各種衣殼之胺基酸序列。參見例如
AAVRh.1 / hu.14 / AAV9 AAS99264.1 (SEQ ID NO: 75)
美國專利 公開案 2013/0045186之AAVRh.8 SEQ97 (SEQ ID NO: 76)
美國專利 公開案 2013/0045186之AAVRh.10 SEQ81 (SEQ ID NO: 77)
國際 專利 公開案 WO 2013/123503之AAVRh.74 SEQ 1 (SEQ ID NO: 78)
AAV1 AAB_95452.1 (SEQ ID NO: 79)
AAV2 YP_680426.1 (SEQ ID NO: 80)
AAV3 NP_043941.1 (SEQ ID NO: 81)
AAV3B AAB95452.1 (SEQ ID NO: 82)
AAV4 NP_044927.1 (SEQ ID NO: 83)
AAV5 YP_068409.1 (SEQ ID NO: 84)
AAV6 AAB95450.1 (SEQ ID NO: 85)
AAV7 YP_077178.1 (SEQ ID NO: 86)
AAV8 YP_077180.1 (SEQ ID NO: 87)
AAV10 AAT46337.1 (SEQ ID NO: 88)
AAV11 AAT46339.1 (SEQ ID NO: 89)
AAV12 ABI16639.1 (SEQ ID NO: 90)
AAV13 ABZ10812.1 (SEQ ID NO: 91)
經修飾之「AAV」序列亦可用於本揭示案之上下文中，例如用於產生AAV基因治療載體。此類經修飾之序列，例如與AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9 ITR、Rep或VP具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或更高核苷酸及/或胺基酸序列一致性之序列(例如具有約75-99%核苷酸序列一致性之序列)，可用於代替野生型AAV ITR、Rep或VP序列。
在一些實施例中，編碼AAV衣殼蛋白之核酸序列可操作地連接至表現控制序列，用於在特定細胞類型中表現，諸如Sf9或HEK細胞。可以使用熟習此項技術者已知用於在昆蟲宿主細胞或哺乳動物宿主細胞中表現外來基因之技術來實踐該實施例。用於分子工程改造及在昆蟲細胞中表現多肽的方法描述於例如Summers及Smith (1986) A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bull. No. 7555, College Station, Tex.；Luckow (1991) In Prokop等人, Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors' Recombinant DNA Technology and Applications, 97-152；King, L. A.及R. D. Possee (1992) The baculovirus expression system, Chapman and Hall, United Kingdom；O'Reilly, D. R., L. K. Miller, V. A. Luckow (1992) Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York；W.H. Freeman及Richardson, C. D. (1995) Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, 第39卷；美國專利 第4,745,051號；US-2003148506；及WO-03/074714，其皆以全文引用的方式併入本文中。特別適合用於轉錄編碼AAV衣殼蛋白之核苷酸序列的啟動子為例如多面體啟動子。然而，此項技術中已知在昆蟲細胞中具有活性之其他啟動子，例如p10、p35或IE-1啟動子，且亦考慮以上參考文獻中所描述之其他啟動子。
昆蟲細胞用於表現異源蛋白質之用途以及將核酸(諸如載體，例如昆蟲細胞相容性載體)引入此類細胞中之方法及將此類細胞維持於培養物中之方法已得到充分證明。(參見例如METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 編輯Richard, Humana Press, N J (1995)；O'Reilly等人, BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS, A LABORATORY MANUAL, Oxford Univ. Press (1994)；Samulski等人,
J. Virol.63: 3822-8 (1989)；Kajigaya等人,
Proc. Nat ' l. Acad. Sci. USA, 88: 4646-50 (1991)；Ruffing等人,
J. Virol.66: 6922-30 (1992)；Kirnbauer等人,
Virol.219: 37-44 (1996)；Zhao等人,
Virol. 272: 382-93 (2000)；及美國專利第6,204,059號)。在一些實施例中，昆蟲細胞中編碼AAV蛋白(例如AAV rep或cap蛋白)之核酸構築體為昆蟲細胞相容性載體。如本文所使用，「昆蟲細胞相容性載體」或「載體」係指能夠進行昆蟲或昆蟲細胞之生產性轉型或轉染的核酸分子。例示性生物載體包括質體、線性核酸分子及重組病毒。可使用任何載體，只要其為昆蟲細胞相容的。載體可整合至昆蟲細胞基因體中，但載體無需永久存在於昆蟲細胞中，且亦包括短暫游離型載體。載體可藉由任何已知的方式，例如藉由化學處理細胞、電穿孔或感染引入。在一些實施例中，載體為桿狀病毒、病毒載體或質體。在一個實施例中，載體為桿狀病毒，亦即，構築體為桿狀病毒載體。桿狀病毒載體及其使用方法描述於上文所引用的關於昆蟲細胞之分子工程改造的參考文獻中。
產生重組 AAV 顆粒之方法
本揭示案提供用於在包含本文所描述之載體構築體中之任一者的昆蟲或哺乳動物細胞中產生重組AAV顆粒之材料及方法。在一些實施例中，載體構築體進一步包含啟動子及啟動子下游的限制位點，以允許插入編碼一或多種感興趣蛋白質之聚核苷酸，其中該啟動子及該限制位點位於5' AAV ITR之下游及3' AAV ITR之上游。在一些實施例中，載體構築體進一步包含轉錄後調控元件，其在限制位點之下游及3' AAV ITR之上游。在一些實施例中，載體構築體進一步包含插入限制位點且與啟動子可操作地連接之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含感興趣蛋白質之編碼區。熟習此項技術者應瞭解，本申請案中所揭示之AAV載體構築體中之任一者可用於產生重組AAV顆粒之方法中。
在一些實施例中，用於產生AAV之輔助功能係由包含腺病毒或桿狀病毒輔助基因之一或多種輔助質體或輔助病毒提供。腺病毒或桿狀病毒輔助基因之非限制性實例包括但不限於E1A、E1B、E2A、E4及VA，其可向AAV包裝提供輔助功能。
AAV之輔助病毒係此項技術中已知的，且包括例如來自腺病毒科(Adenoviridae)及疱疹病毒科(
Herpes viridae)之病毒。AAV之輔助病毒之實例包括但不限於美國公開案第20110201088號(其揭示內容以引用之方式併入本文中)中所描述之SadV-13輔助病毒及SadV-13樣輔助病毒，以及輔助載體pHELP (Applied Viromics)。熟習此項技術者應瞭解，本文中可使用可向AAV提供足夠輔助功能的AAV之任何輔助病毒或輔助質體。
在一些實施例中，AAV cap基因存在於質體中。質體可以進一步包含AAV rep基因，其可對應於或可不對應於與cap基因相同之血清型。來自本文所描述之任何AAV血清型(包括但不限於AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13及其任何變異體)之cap基因及/或rep基因均可用於產生重組AAV。在一些實施例中，AAV cap基因編碼來自血清型1、血清型2、血清型4、血清型5、血清型6、血清型7、血清型8、血清型9、血清型10、血清型11、血清型12、血清型13或其變異體之衣殼。
在一些實施例中，昆蟲或哺乳動物細胞可用輔助質體或輔助病毒、編碼AAV cap基因之載體構築體及質體轉染；且重組AAV病毒可在共轉染之後於不同時間點收集。舉例而言，重組AAV病毒可在共轉染之後約12小時、約24小時、約36小時、約48小時、約72小時、約96小時、約120小時或該等兩個時間點中之任一者之間的時間收集。
重組AAV顆粒亦可使用此項技術中已知適於產生感染性重組AAV之任何習知方法產生。在一些情況下，可以藉由使用穩定表現產生AAV顆粒所需之一些組分的昆蟲或哺乳動物細胞來產生重組AAV。舉例而言，可以將包含AAV rep及cap基因的質體(或多個質體)及選擇性標誌物(諸如新黴素抗性基因)整合至細胞的基因體中。接著，昆蟲或哺乳動物細胞可用輔助病毒(例如提供輔助功能之腺病毒或桿狀病毒)以及包含5'及3' AAV ITR (以及必要時，編碼異源蛋白質之核苷酸序列)之病毒載體構築體共感染。此方法之優勢在於，此等細胞係可選擇的且適於大規模產生重組AAV顆粒。作為另一個非限制性實例，可以使用腺病毒或桿狀病毒而非質體，將rep及cap基因引入包裝細胞中。作為又另一非限制性實例，含有5'及3' AAV LTR及rep-cap基因之病毒載體構築體可穩定整合至生產細胞之DNA中，且輔助功能可由野生型腺病毒提供以產生重組AAV。
在一個態樣中，本文提供用於產生可用作基因遞送載體之AAV顆粒的方法，該方法包含以下步驟：
(a)向容許AAV複製之細胞(例如昆蟲細胞或哺乳動物細胞)提供一或多種核酸構築體，其包含：
(i)本文所提供之核酸分子(例如重組載體構築體)，其側接至少一個AAV反向末端重複核苷酸序列；
(ii)編碼一或多種AAV Rep蛋白之核苷酸序列，其可操作地連接至能夠驅動該一或多種Rep蛋白在該細胞中表現的啟動子；
(iii)編碼一或多種AAV衣殼蛋白之核苷酸序列，其可操作地連接至能夠驅動該一或多種衣殼蛋白在該細胞中表現的啟動子；
(iv)及視情況存在之包含在VP2/3 mRNA中的AAP及MAAP
(b)在有利於表現Rep蛋白及衣殼蛋白之條件下培養(a)中所定義之細胞；且
視情況，(c)回收AAV基因遞送載體，及
視情況，(d)純化該AAV顆粒。舉例而言，(i)之重組載體構築體包含(1)至少一個AAV ITR，(2)如本文所描述之異源心肌細胞特異性轉錄調控區，及(3)編碼功能性cMyBP-C之核酸。較佳地，(i)之重組載體構築體包含5'及3' AAV ITR。
通常，本文所提供之用於產生AAV基因遞送載體的方法包含：向容許AAV複製之細胞提供(a)編碼用於產生載體基因體之模板的核苷酸序列，例如本揭示案之載體構築體(如本文中詳細描述)；(b)足以複製該模板以產生載體基因體之核苷酸序列(如以上所定義之第一表現卡匣)；(c)在足以複製該載體基因體並將其包裝至AAV衣殼中的條件下，足以將載體基因體包裝至AAV衣殼中之核苷酸序列(如以上所定義之第二表現卡匣)，由此在細胞中產生包含囊封於AAV衣殼內之載體基因體的AAV顆粒。
使用桿狀病毒表現載體系統(BEVS) (Mietzsch等人,
Hum. Gene Ther. 25: 212-22 (2014))進行的貼壁HEK293細胞之短暫轉染(Chahal等人,
J. Virol. Meth. 196: 163-73 (2014))及Sf9細胞之轉染係兩種最常用於產生AAV載體之方法。
包含本文所描述之載體構築體的病毒顆粒可使用任何細胞類型產生，諸如哺乳動物及無脊椎動物細胞類型，其允許產生AAV或生物產物且可維持在培養物中。
存在多種用於產生AAV病毒顆粒之方法：例如但不限於使用載體及AAV輔助序列轉染結合與AAV輔助病毒(例如腺病毒、疱疹病毒或痘瘡病毒)中之一者共感染，或用重組AAV載體、AAV輔助載體及附屬功能載體轉染。製造AAV病毒顆粒之方法描述於例如美國專利第US6204059號、第US5756283號、第US6258595號、第US6261551號、第US6270996號、第US6281010號、第US6365394號、第US6475769號、第US6482634號、第US6485966號、第US6943019號、第US6953690號、第US7022519號、第US7238526號、第US7291498號及第US7491508號、第US5064764號、第US6194191號、第US6566118號、第US8137948號；或國際公開案第WO1996039530號、第WO1998010088號、第WO1999014354號、第WO1999015685號、第WO1999047691號、第WO2000055342號、第WO2000075353號、第WO2001023597號、第WO2015191508號、第WO2019217513號、第WO2018022608號、第WO2019222136號、第WO2020232044號、第WO2019222132號；Methods In Molecular Biology, 編輯 Richard, Humana Press, NJ (1995)；O'Reilly等人, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, Oxford Univ. Press (1994)；Samulski等人, J. Vir.63:3822-8 (1989)；Kajigaya等人, Proc. Nat''l. Acad. Sci. USA 88: 4646-50 (1991)；Ruffing等人, J. Vir.66:6922-30 (1992)；Kimbauer等人, Vir., 219:37-44 (1996)；Zhao等人, Vir.272:382-93 (2000)；其各自之內容以全文引用之方式併入本文中。關於產生AAV病毒顆粒之方法的詳細描述，參見例如美國專利 第6,001,650號、第6,004,797號及第9,504,762號，各自以全文引用之方式併入本文中。在一個實施例中，使用三重轉染方法(參見例如美國專利第6,001,650號，其以全文引用之方式併入本文中)來產生AAV病毒顆粒。此方法不需要使用感染性輔助病毒，從而能夠在不存在任何可偵測之輔助病毒的情況下產生AAV病毒顆粒。此係藉由使用三種用於產生AAV病毒顆粒之載體來實現，亦即AAV輔助功能載體、附屬功能載體及AAV病毒顆粒表現載體。然而，熟習此項技術者應瞭解，由此等載體編碼之核酸序列可以各種組合提供於兩種或更多種載體上。在其他實施例中，宿主細胞可用輔助質體或輔助病毒、病毒構築體及編碼AAV cap基因之質體轉染；且AAV病毒顆粒可在共轉染後之不同時間點收集。
舉例而言，野生型AAV及輔助病毒可用於提供產生AAV病毒顆粒所必需之複製功能(參見例如美國專利第5,139,941號，其以全文引用之方式併入本文中)。或者，含有輔助功能基因之質體與眾所周知的輔助病毒中之一者的感染組合可用作複製功能之來源(參見例如美國專利第5,622,856號及美國專利第5,139,941號，兩者以全文引用之方式併入本文中)。類似地，含有附屬功能基因之質體可與野生型AAV感染組合使用，以提供必需的複製功能。熟習此項技術者亦可採用本文所描述及/或此項技術中眾所周知的其他方法來產生AAV病毒顆粒。
術語「載體」應理解為係指任何遺傳元件，諸如質體、噬菌體、轉位子、黏質體、桿狀病毒質體、微型質體(例如不含細菌元件之質體)、Doggybone DNA (例如最小的封閉線性構築體)、染色體、病毒、病毒粒子(例如桿狀病毒)等，其在與適當的控制元件結合時能夠複製且可在細胞之間轉移基因序列。如本文所使用，「哺乳動物細胞相容性載體」或「載體」係指能夠對哺乳動物或哺乳動物細胞進行生產性轉型或轉染的核酸分子。如本文所使用，「昆蟲細胞相容性載體」或「載體」係指能夠對昆蟲或昆蟲細胞進行生產性轉型或轉染的核酸分子。例示性生物載體包括質體、線性核酸分子及重組病毒。可使用任何載體，只要其為昆蟲細胞相容的。載體可整合至昆蟲細胞基因體中，但載體無需永久存在於昆蟲細胞中，且亦包括短暫游離型載體。載體可藉由任何已知的方式，例如藉由化學處理細胞、電穿孔或感染引入。載體及其使用方法描述於上文所引用之關於細胞之分子工程改造的參考文獻中。
細胞產生rAAV載體基因體之載體可含有啟動子及啟動子下游的限制位點，以允許插入編碼一或多種感興趣蛋白質之聚核苷酸，其中該啟動子及該限制位點位於5' AAV ITR之下游及3' AAV ITR之上游。載體亦可含有轉錄後調控元件，其在限制位點之下游及3' AAV ITR之上游。病毒構築體可進一步包含插入限制位點且與啟動子可操作地連接之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含感興趣蛋白質之編碼區。在一些實施例中，病毒構築體進一步包括啟動子及啟動子下游的限制位點，以允許插入編碼一或多種感興趣蛋白質之聚核苷酸，其中該啟動子及該限制位點位於5' AAV ITR之下游及3' AAV ITR之上游。在一些實施例中，病毒構築體進一步包括轉錄後調控元件，其在限制位點之下游及3' AAV ITR之上游。在一些實施例中，病毒構築體進一步包括插入限制位點且與啟動子可操作地連接之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包括感興趣蛋白質之編碼區。熟習此項技術者應瞭解，本申請案中所揭示之AAV載體中之任一者可作為病毒構築體用於方法中以產生rAAV病毒粒子。
術語「AAV輔助子」係指AAV衍生之編碼序列，其可經表現以提供AAV基因產物，該等產物又反式起作用以進行生產性AAV複製。因此，AAV輔助功能包括主要AAV開讀框(ORF) rep及cap兩者。Rep表現產物已顯示具有許多功能，尤其包括：識別、結合及切割AAV之DNA複製起點；DNA解旋酶活性；及調節自AAV (或其他異源)啟動子之轉錄。衣殼(Cap)表現產物供應必需的包裝功能。AAV輔助功能在本文中用於補充AAV載體基因體中缺失之反式AAV功能。
對於產生，具有AAV輔助功能之細胞會產生足以形成衣殼之重組衣殼蛋白。此包括至少VP1及VP3蛋白，但更通常，如原生AAV中發現的VP1、VP2及VP3蛋白中之全部三種。衣殼蛋白之序列決定宿主細胞產生之AAV病毒粒子的血清型。可用於本發明之衣殼包括來源於多種AAV血清型之衣殼，包括1、2、3、3B、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或混合血清型(參見例如美國專利案第8,318,480號對非天然混合血清型之揭示)。衣殼蛋白亦可為天然VP1、VP2及VP3之變異體，包括突變、嵌合或改組蛋白。衣殼蛋白可為rh.10或AAV各種分支內之其他亞型的衣殼蛋白；各種分支及亞型揭示於例如美國專利第7,906,111號中。由於廣泛的構築體可用性及廣泛表徵，以下所揭示之說明性AAV載體均來源於血清型2。不同血清型之AAV載體及AAV蛋白的構築及使用論述於Chao等人, Mol. Ther. 2:619-623, 2000；Davidson等人, PNAS 97:3428-3432, 2000；Xiao等人, J. Virol. 72:2224-2232, 1998；Halbert等人, J. Virol. 74:1524-1532, 2000；Halbert等人, J. Virol. 75:6615-6624, 2001；及Auricchio等人, Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081, 2001。
在各種實施例中，編碼VP蛋白之核苷酸序列可操作地連接至適合的表現控制序列。在各種實施例中，編碼Rep蛋白之核苷酸序列可操作地連接至適合的表現控制序列，諸如真核啟動子。舉例而言，核苷酸序列可操作地連接至真核啟動子，諸如SV40啟動子、CMV啟動子、RSV啟動子、UBC啟動子、EF1A啟動子、PGK啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、b-肌動蛋白啟動子、TRE (Tet、Tet-On、Tet-Off)啟動子、Cumate控制系統(CuR/CuO) (參見US2004/0205834)、溫度誘導之HSP70啟動子、p5啟動子、p10啟動子、p19啟動子及p40啟動子。在另一個實例中，核苷酸序列可操作地連接至桿狀病毒啟動子，諸如多角體蛋白(Polh)啟動子、ΔIE1啟動子、p5啟動子、p10啟動子、p19啟動子、p40啟動子、金屬硫蛋白啟動子、39K啟動子、p6.9啟動子及orf46啟動子。
對於產生，具有AAV輔助功能之細胞會產生Rep蛋白以促進rAAV之產生。已發現，當細胞中表現至少一種大Rep蛋白(Rep78或Rep68)及至少一種小Rep蛋白(Rep52及Rep40)時，可產生感染性顆粒。在一特定實施例中，表現Rep 78、Rep68、Rep52及Rep 40中之全部四者。或者，表現Rep78及Rep52、Rep78及Rep40、Rep 68及Rep52、或Rep68及Rep40。以下實例展現Rep78/Rep52組合之使用。Rep蛋白可來源於AAV-2或其他血清型。在各種實施例中，編碼Rep蛋白之核苷酸序列可操作地連接至適合的表現控制序列。在各種實施例中，編碼Rep蛋白之核苷酸序列可操作地連接至適合的表現控制序列，諸如真核啟動子。舉例而言，核苷酸序列可操作地連接至真核啟動子，諸如SV40啟動子、CMV啟動子、RSV啟動子、UBC啟動子、EF1A啟動子、PGK啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、b-肌動蛋白啟動子、TRE (Tet、Tet-On、Tet-Off)啟動子、Cumate控制系統(CuR/CuO) (參見US2004/0205834)及溫度誘導之HSP70啟動子、p5啟動子、p10啟動子、p19啟動子及p40啟動子。在其他實例中，核苷酸序列可操作地連接至桿狀病毒啟動子，諸如多角體蛋白(Polh)啟動子、ΔIE1啟動子、p5啟動子、p10啟動子、p19啟動子、p40啟動子、金屬硫蛋白啟動子、39K啟動子、p6.9啟動子及orf46啟動子。
在一些實施例中，AAV cap基因存在於質體或桿狀病毒質體中。質體可進一步包括AAV rep基因，其可對應於或可不對應於與cap基因相同的血清型。cap基因及/或rep基因來自任何AAV血清型。
具有AAV輔助功能之細胞亦可產生組裝活化蛋白(AAP)，其有助於組裝衣殼。在各種實施例中，編碼AAP之核苷酸序列可操作地連接至適合的表現控制序列。舉例而言，核苷酸序列可操作地連接至真核啟動子。在其他實例中，核苷酸序列可操作地連接至桿狀病毒啟動子，諸如多角體蛋白(Polh)啟動子、ΔIE1啟動子、p5啟動子、p10啟動子、p19啟動子、p40啟動子、金屬硫蛋白啟動子、39K啟動子、p6.9啟動子及orf46啟動子。
術語「非AAV輔助功能」係指AAV複製所依賴之非AAV衍生病毒及/或細胞功能。因此，該術語涵蓋AAV複製中所需之蛋白質及RNA，包括參與AAV基因轉錄活化、階段特異性AAV mRNA剪接、AAV DNA複製、Cap表現產物合成及AAV衣殼組裝之彼等部分。基於病毒之附屬功能可衍生自已知輔助病毒中之任一者，諸如腺病毒、疱疹病毒(1型單純疱疹病毒除外)及痘瘡病毒。
術語「非AAV輔助功能載體」一般係指包括提供附屬功能之核苷酸序列的核酸分子。附屬功能載體可轉染至適合的宿主細胞中，其中該載體隨後能夠支持宿主細胞中AAV病毒粒子的產生。該術語明確排除自然界中存在的感染性病毒顆粒，諸如腺病毒、疱疹病毒或痘瘡病毒顆粒。因此，附屬功能載體可呈質體、噬菌體、轉位子或黏質體形式。特別地，已證明，附屬輔助功能不需要腺病毒基因之完全互補序列。舉例而言，無法進行DNA複製及後期基因合成之腺病毒突變體已被證明容許AAV複製。Ito等人, (1970) J. Gen. Virol. 9:243；Ishibashi等人, (1971) Virology 45:317。類似地，E2B及E3區內之突變體已被證明支持AAV複製，表明E2B及E3區可能不參與提供附屬功能。Carter等人, (1983) Virology 126:505。然而，E1區缺陷或E4區缺失之腺病毒無法支持AAV複製。因此，E1A及E4區可能為AAV複製直接或間接所需的。Laughlin等人, (1982). J. Virol. 41:868；Janik等人, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1925；Carter等人, (1983) Virology 126:505。其他經表徵之Ad突變體包括：E1B (Laughlin等人 (1982), 見上文；Janik等人 (1981), 見上文；Ostrove等人, (1980) Virology 104:502)；E2A (Handa等人, (1975) J. Gen. Virol. 29:239；Strauss等人, (1976) J. Virol. 17:140；Myers等人, (1980) J. Virol. 35:665；Jay等人, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2927；Myers等人, (1981) J. Biol. Chem. 256:567)；E2B (Carter, Adeno-Associated Virus Helper Functions, in I CRC Handbook of Parvoviruses (P. Tijssen編, 1990))；E3 (Carter等人 (1983), 見上文)；及E4 (Carter等人 (1983), 見上文；Carter (1995))。雖然對E1B編碼區中具有突變之腺病毒所提供之附屬功能的研究產生相互矛盾的結果，但Samulski等人, (1988) J. Virol. 62:206-210最近報導E1B55k為AAV病毒粒子產生所需的，而E1B19k不是。另外，國際公開案WO 97/17458及Matshushita等人, (1998) Gene Therapy 5:938-945描述編碼各種Ad基因之附屬功能載體。特別較佳的附屬功能載體包含腺病毒VA RNA編碼區、腺病毒E4 ORF6編碼區、腺病毒E2A 72 kD編碼區、腺病毒E1A編碼區及缺乏完整E1B55k編碼區之腺病毒E1B區。此類載體描述於國際公開案第WO 01/83797號中。
在另一個實施例中，本文所提供之方法用允許AAV複製或生物產物產生且可維持在培養物中之任何哺乳動物細胞類型進行。在一個實施例中，所用哺乳動物細胞可為HEK293、HeLa、CHO、NSO、SP2/0、PER.C6、Vero、RD、BHK、HT 1080、A549、Cos-7、ARPE-19及MRC-5細胞。
昆蟲細胞用於表現異源蛋白質之用途以及將核酸(諸如載體，例如昆蟲細胞相容性載體)引入此類細胞中之方法及將此類細胞維持於培養物中之方法已得到充分證明。(參見例如METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Richard編, Humana Press, N J (1995)；O'Reilly等人, BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS, A LABORATORY MANUAL, Oxford Univ. Press (1994)；Samulski等人, J. Vir. (1989) 第63卷, 第3822-3828頁；Kajigaya等人, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA (1991) 第88卷, 第4646-4650頁；Ruffing等人, J. Vir. (1992) 第66卷, 第6922-6930頁；Kirnbauer等人, Vir. (1996) 第219卷, 第37-44頁；Zhao等人, Vir. (2000) 第272卷, 第382-393頁；及美國專利第6,204,059號)。在一些實施例中，昆蟲細胞中編碼AAV之核酸構築體為昆蟲細胞相容性載體。「表現載體」係指包括重組聚核苷酸之載體，該重組聚核苷酸包括可操作地連接至待表現之核苷酸序列的表現控制序列。表現載體包括足夠的順式作用元件用於表現；其他表現元件可由宿主細胞或活體外表現系統供應。表現載體包括此項技術中已知的所有表現載體，諸如黏質體、質體(例如裸質體或脂質體中所含之質體)、人工染色體及併入重組聚核苷酸之病毒。如本文所使用，「昆蟲細胞相容性載體」或「載體」係指能夠對昆蟲或昆蟲細胞進行生產性轉型或轉染的核酸分子。例示性生物載體包括質體、線性核酸分子及重組病毒。可使用任何載體，只要其為昆蟲細胞相容的。載體可整合至昆蟲細胞基因體中，但載體無需永久存在於昆蟲細胞中，且亦包括短暫游離型載體。載體可藉由任何已知的方式，例如藉由化學處理細胞、電穿孔或感染引入。在一些實施例中，載體為桿狀病毒、病毒載體或質體。在一更佳實施例中，載體為桿狀病毒，亦即，構築體為桿狀病毒載體。桿狀病毒載體及其使用方法描述於上文所引用的關於昆蟲細胞之分子工程改造的參考文獻中。
舉例而言，所用昆蟲細胞株可來自草地黏蟲(
Spodoptera frugiperda)，諸如SF9、SF21、SF900+；果蠅細胞株；蚊細胞株，例如白紋伊蚊(
Aedes albopictus)源性細胞株；家蠶細胞株，例如家蠶(
Bombyx mori)細胞株、粉紋夜蛾(
Trichoplusia ni)細胞株，諸如High Five細胞；或鱗翅目(Lepidoptera)細胞株，諸如小菜蛾(
Ascalapha odorata)細胞株。在一個實施例中，昆蟲細胞為來自易受桿狀病毒感染之昆蟲物種之細胞，包括High Five、Sf9、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf9、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、BM-N、Ha2302、Hz2E5及Ao38。
桿狀病毒為節肢動物之包膜DNA病毒，其兩個成員為熟知的用於在細胞培養物中產生重組蛋白之表現載體。桿狀病毒具有環狀雙股基因體(80-200 kbp)，其可經工程改造以允許將大型基因體內含物遞送至特定細胞。用作載體之病毒一般為加洲苜蓿夜蛾(Autographa californica)多衣殼核多角體病毒(AcMNPV)或家蠶核多角體病毒(BmNPV) (Kato等人,
Appl. Microbiol. Biotechnol. 85(3): 459-70 (2010)。
桿狀病毒常用於感染昆蟲細胞以表現重組蛋白。特定言之，昆蟲中異源基因表現可如例如以下中所描述來實現：美國專利 第4,745,051號；EP 127,839；EP 155,476；Vlak等人,
J. Gen. Virol.68: 765-76 (1988)；Miller等人, Ann. Rev. Microbiol. 42: 177-9 (1988)；Carbonell等人,
Gene, 73(2): 409-18 (1998)；Maeda等人,
Nature, 315: 592-4 (1985)；Lebacq-Veheyden等人,
Molec. Cell. Biol. 8(8): 3129-35 (1988)；Smith等人,
PNAS, 82: 8404-8 (1985)；及Miyajima等人,
Gene, 58: 273-81 (1987)。可用於蛋白質產生之許多桿狀病毒株及變異株以及相應容許昆蟲宿主細胞描述於Luckow等人,
Nat. Biotechnol. 6: 47-55 (1988)；Maeda等人,
Nature, 315: 592-4 (1985)；及McKenna等人,
J. Invert. Pathol.71(1): 82-90 (1998)。
桿狀病毒穿梭載體或桿狀病毒質體用於產生桿狀病毒。桿狀病毒質體作為大質體在諸如大腸桿菌之細菌中繁殖。當轉染至昆蟲細胞中時，桿狀病毒質體產生桿狀病毒。在另一個實施例中，本文所提供之方法用允許AAV複製或生物產物產生且可維持在培養物中之任何哺乳動物細胞類型進行。在一個實施例中，所用哺乳動物細胞可為HEK293、HeLa、CHO、NSO、SP2/0、PER.C6、Vero、RD、BHK、HT 1080、A549、Cos-7、ARPE-19及MRC-5細胞。
rAAV顆粒亦可使用各種實施例中所揭示之方法產生。在一些情況下，可藉由使用穩定表現產生AAV顆粒所需之一些組分的昆蟲或哺乳動物細胞來產生rAAV顆粒。舉例而言，可將包括AAV rep及cap基因以及可選標記(諸如新黴素抗性基因)之質體(或多個質體)整合至細胞的基因體中。在另一個實例中，可將包括可選標記(諸如新黴素抗性基因)之質體(或多個質體)整合至細胞的基因體中。接著，昆蟲、真菌或哺乳動物細胞可用輔助病毒(例如提供輔助功能之腺病毒或桿狀病毒)以及包括5'及3' AAV ITR (以及必要時，編碼異源蛋白質之核苷酸序列)之病毒載體共感染。此方法之優勢在於，該等細胞係可選擇的且適於大規模生產rAAV。作為另一個非限制性實例，可使用腺病毒或桿狀病毒而非質體將宿主調控基因、rep基因及cap基因引入包裝細胞中。
在一個實施例中，在經由一系列愈來愈大的培養平台在懸浮細胞培養物中擴增經轉染細胞後，經由多步驟製程純化經轉染細胞之懸浮液以移除製程雜質，包括重組桿狀病毒及宿主細胞，且富集包含重組小病毒(rAAV)載體構築體之病毒粒子。在另一個實施例中，本文所提供之方法可包含使用抗AAV抗體(在一個實施例中為固定化抗體)對rAAV載體構築體進行親和純化之步驟。在另一個實施例中，抗AAV抗體為單株抗體。本文使用之一種抗體為單鏈駱駝抗體或其片段，例如可獲自駱駝或駱馬(參見例如Muyldermans,
Biotechnol. 74: 277-302 (2001)。用於rAAV之親和純化的抗體係特異性結合AAV衣殼蛋白上之抗原決定基的抗體，由此在一個實施例中，抗原決定基係存在於超過一種AAV血清型之衣殼蛋白上的抗原決定基。舉例而言，該抗體可基於特異性結合至AAV5衣殼而產生或選擇，但同時其亦可特異性結合至AAV1、AAV2、AAV3、AAV6、AAV8或AAV9衣殼。
本文所提供的用於產生rAAV顆粒之方法產生rAAV顆粒群體。在一些實施例中，該群體藉由減少空衣殼之數目的步驟而富集包含全長或接近全長之載體基因體的顆粒。
藉由本文所提供之方法產生之rAAV顆粒群體例如用於在本文所描述之治療方法中之任一者中投予。
宿主生物體及 / 或細胞
在另一實施例中，提供包含上述載體之宿主細胞。在一個實施例中，載體構築體在宿主細胞中能夠複製或能夠表現本文所提供之核酸分子。在一些實施例中，本文提供HCM治療劑，其為包含載體構築體之宿主細胞，該載體構築體包含編碼cMyBP-C之核酸，用於HCM細胞療法。細胞可為個體自體或同種異體的。
如本文所使用，術語「宿主」係指攜帶本揭示案之核酸分子或載體構築體的生物體及/或細胞，以及適用於表現重組基因或蛋白質的生物體及/或細胞。本揭示案不意欲限於任何特定類型之細胞或生物體。實際上，經審慎考慮任何適合的生物體及/或細胞均可在本文中用作宿主。宿主細胞可呈單細胞、類似或不同細胞之群體形式，例如呈培養物(諸如液體培養物或固體受質上之培養物)、生物體或其部分形式。在一個實施例中，宿主細胞可允許表現本文所提供之核酸分子。因此，宿主細胞可為例如細菌、酵母、昆蟲或哺乳動物細胞或人類細胞。
在另一個實施例中，提供一種用於將本文所提供之核酸遞送至廣泛範圍之細胞(包括分裂及非分裂細胞)中的方式。本揭示案可用於將本文所提供之核酸活體外遞送至細胞，例如 活體外產生由此類核酸分子編碼之多肽或用於離體基因療法。
本揭示案之核酸分子、載體構築體、細胞及方法/用途另外可用於將本文提供之核酸遞送至宿主(通常為罹患HCM之宿主)中的方法。
醫藥調配物
在一個實施例中，提供一種醫藥組成物，其包含本文所提供之核酸或載體及醫藥學上可接受之稀釋劑、賦形劑或載劑。醫藥組成物可進一步包含第二治療劑或佐劑等。較佳地，若意欲非經腸投予，則組成物為無菌的。較佳地，組成物不含感染性病毒及毒素。較佳地，組成物在儲存條件下穩定一段適合的時間。
「醫藥學上可接受」意謂不為生物學上或在其他方面不合需要的材料，亦即，該材料可投予個體而不會引起任何不合需要的生物作用。因此，此類醫藥組成物可用於例如離體細胞轉染或用於直接向個體投予病毒顆粒或細胞。
載劑可適於非經腸投予，其包括靜脈內、腹膜內或肌肉內投予。或者，載劑可適於舌下或經口投予。醫藥學上可接受之載劑包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌注射溶液或分散液之無菌粉末。該等介質及試劑用於醫藥活性物質之用途為此項技術中熟知的。除非任何習知介質或試劑與活性化合物不相容，否則考慮將其用於本文所提供之醫藥組成物中。
在其他實施例中，本文提供AAV顆粒之醫藥組成物(亦即調配物)，其可用於向罹患遺傳病症之個體投予以遞送編碼感興趣蛋白質之基因。在某些實施例中，本文所提供之醫藥調配物係包括含本文所揭示之載體構築體中之任一者之重組AAV顆粒的液體調配物。調配物中重組AAV病毒粒子之濃度可變化。
在其他實施例中，本文所提供之AAV顆粒醫藥調配物包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑，以提供具有利於儲存及/或投予個體以治療遺傳病症之特性的調配物。
在某些態樣中，包含重組AAV顆粒之調配物進一步包含一或多種緩衝劑。
在另一個實施例中，本文所提供之重組AAV顆粒調配物可包含一或多種等張劑，諸如氯化鈉。此項技術中已知之其他緩衝劑及等張劑為適合的且可常規地採用於本文所提供之調配物中。
在另一個實施例中，本文所提供之重組AAV顆粒調配物可包含一或多種增積劑。例示性增積劑包括但不限於甘露糖醇、蔗糖、聚葡萄糖、乳糖、海藻糖及聚維酮(PVP K24)。
在又另一實施例中，本文所提供之重組AAV顆粒調配物可包含一或多種表面活性劑，其可為非離子型表面活性劑。例示性表面活性劑包括離子型表面活性劑、非離子型表面活性劑及其組合。舉例而言，界面活性劑可為但不限於TWEEN 80(又稱為聚山梨醇酯80，或其化學名稱聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯)、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸鈉、月桂基硫酸銨、TRITON AG 98(Rhone-Poulenc)、泊洛沙姆407、泊洛沙姆188及類似物，以及其組合。
本文所提供之重組AAV顆粒調配物通常為無菌且穩定的，且可長期儲存而不會出現不可接受的品質、效力或純度變化。
在一些實施例中，組成物中包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉。藉由在組成物中包括延遲吸收劑，例如單硬脂酸鹽及明膠，可實現可注射組成物之延長吸收。在某些實施例中，本文所提供之核酸或載體構築體可在時間或控制釋放調配物中，例如在包括緩慢釋放聚合物或保護化合物免於快速釋放之其他載劑(包括植入物及微囊封遞送系統)的組成物中投予。可例如使用可生物降解的生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯、聚乳酸及聚乳酸、聚乙醇酸共聚物(PLG)。
在某些實施例中，包含本文所提供之載體構築體或AAV顆粒的醫藥組成物可用於將遺傳物質轉移至細胞中。此類轉移可在活體外、離體或活體內進行。因此，一個實施例提供一種用於將核苷酸序列遞送至細胞之方法，該方法包含在使本文所提供之核酸或載體進入細胞的條件下接觸如本文所描述之核酸、載體構築體或醫藥組成物。細胞可為活體外、離體或活體內細胞。
治療方法
本文所描述之載體構築體或AAV顆粒以有效劑量向個體投予，以將MYBPC3基因遞送哺乳動物個體之心臟。個體較佳為人類，包括幼年個體。幼年個體之年齡範圍可為例如0-2、2-6、2-10、2-12、2-15、2-18、12-18或0-18歲。
此類方法包括在哺乳動物個體之心臟中表現cMyBP-C之方法，其包含向該個體投予有效量的包含本文所描述之載體構築體、本文所描述之rAAV顆粒的組成物或本文所描述之醫藥組成物，從而在該個體之心臟組織(例如心肌或心肌細胞)中表現cMyBP-C。
此類方法亦包括一種治療哺乳動物個體之功能性野生型肌球蛋白結合蛋白C缺乏症的方法，其藉由投予有效增加心臟組織(例如心肌細胞)中功能性肌球蛋白結合蛋白C之水平之量的載體構築體、rAAV顆粒或醫藥組成物。在一或多個實施例中，此類方法使心臟中之cMyBP-C表現水平與未治療之水平相比增加至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%，或增加至健康人類中所見之水平。在一些實施例中，載體構築體、rAAV顆粒或醫藥組成物磷酸化之量使心臟組織(例如心肌細胞)中肌球蛋白結合蛋白C之水平增加至少約2倍；及/或恢復活體外經工程改造之心臟組織或活體內動物組織之收縮力、相對張力、鈣活化張力、弛豫時間。
此類方法亦包括一種治療哺乳動物之HCM或治療或預防其任何症狀的方法，其包含投予治療有效量之載體構築體、rAAV顆粒或醫藥組成物。在此類方法中，哺乳動物可在cMyBP-C基因之一或兩個對偶基因中具有突變。此類方法例如減小心臟大小、減小心胸比、減小舒張末期或收縮末期左心室直徑、減小前壁或後壁厚度、增加射血時間、增加主動脈峰值流速或主動脈血流時間及/或減少疾病症狀。在一或多個實施例中，此類方法降低諸如心臟衰竭、心律失常、胸痛、呼吸短促、疲勞及眩暈之症狀的頻率或嚴重程度。
在本文所描述之任一方法中，rAAV顆粒以約1e12至約6e14 vg/kg之劑量在水性懸浮液中遞送。
在本文所描述之任一方法中，載體構築體、rAAV顆粒或醫藥組成物之投予可進一步包含預防性或治療性皮質類固醇治療劑之投予，及/或可進一步包括用於治療HCM之第二治療劑之投予，包括但不限於β阻斷劑、鈣通道阻斷劑、抗心律不整藥物及心臟肌球蛋白之小分子抑制劑。
在本文任一方法中，在如上文所描述向患者投予AAV顆粒之前，可評定預期患者是否存在能夠阻斷細胞轉導或以其他方式降低治療整體效率之抗AAV衣殼抗體或抗AAV中和抗體。
抗 AAV 抗體之偵測
為了使藉由全身性AAV介導之治療性基因轉移進行成功心臟轉導的可能性最大化，在如上文所描述的治療方案中向人類患者投予AAV顆粒之前，可評定預期患者是否存在能夠阻斷細胞轉導或以其他方式降低治療方案之整體效率的抗AAV衣殼抗體或抗AAV中和抗體。該等抗體可存在於預期患者之血清中且可針對任何血清型之AAV衣殼。在一個實施例中，預先存在之抗體所針對之血清型為AAV5。
偵測預先存在之AAV免疫性的方法係熟知的且常規地用於此項技術中，且包括基於細胞之活體外轉導抑制(TI)分析、活體內(例如在小鼠體內) TI分析及基於ELISA之總抗衣殼抗體(tAb)偵測(參見例如Masat等人, Discov. Med., 第15卷, 第379-389頁；及Boutin等人, (2010) Hum. Gene Ther., 第21卷, 第704-712頁)。TI分析可採用已預先引入AAV誘導性報告載體之宿主細胞。報告載體可包含誘導性報告基因，諸如GFP等。在宿主細胞經AAV病毒轉導後，誘導其表現。能夠預防/減少宿主細胞轉導的存在於人類血清中之抗AAV衣殼抗體將由此減少系統中報告基因之總體表現。因此，此類分析可用於偵測人類血清中能夠藉由治療性AAV顆粒預防/減少細胞轉導的抗AAV衣殼抗體之存在。
偵測抗AAV衣殼抗體之分析可採用固相結合之AAV衣殼作為「捕獲劑」，人類血清在其上越過，由此允許血清中存在之抗衣殼抗體結合至固相結合之衣殼「捕獲劑」。在經洗滌以移除非特異性結合後，可採用「偵測劑」偵測結合至捕獲劑之抗衣殼抗體的存在。偵測劑可為抗體、AAV衣殼或類似物，且可經可偵測地標記以幫助偵測及定量經結合抗衣殼抗體。在一個實施例中，偵測劑經釕或釕錯合物標記，該釕或釕錯合物可使用電化學發光技術及設備偵測。
相同上述方法可用於評估及偵測預先用感興趣治療性AAV病毒治療之患者中抗AAV衣殼免疫反應之產生。因此，在用治療性AAV病毒治療之前，不僅可以利用此等技術來評估抗AAV衣殼抗體之存在，而且亦可在投予之後利用其評估及量測針對所投予之治療性AAV病毒之免疫反應的誘導。因此，本文考慮組合用於偵測人類血清中之抗AAV衣殼抗體之技術及投予治療性AAV病毒治療法HCM的方法，其中用於偵測人類血清中之抗AAV衣殼抗體之技術可在投予治療性AAV病毒之前或之後執行。
在考慮以下說明性實例後，將理解本揭示案之其他態樣及優勢。
實例 實例 1 ： AAV 顆粒之產生
圖1顯示分別命名為A1-A8及C1-C5 SEQ ID NO: 3-41或92-169之載體構築體之元件的組織，該等構築體包含編碼人類cMyBP-C之核酸。包含AAV9衣殼及SEQ ID NO: 3-26之載體構築體的AAV顆粒係在HEK293細胞及Sf9細胞中產生。生成用於AAV產生之載體。例如，在用HEK293細胞產生AAV時，會生成質體。此等質體具有提供AAV載體基因體、編碼Rep及衣殼蛋白且提供非輔助AAV功能之核苷酸序列。使用轉染試劑將此等質體轉染至HEK293細胞中。在使HEK293在轉染後培養預定時間後，自培養物分離所產生之rAAV顆粒，純化且滴定。為了在Sf9細胞中產生AAV，生成桿狀病毒質體。此等桿狀病毒質體具有提供AAV載體基因體且編碼Rep及衣殼蛋白之核苷酸序列。使用轉染試劑將桿狀病毒質體轉染至未處理之Sf9細胞中。在使經轉染Sf9細胞培養預定時間後，分離重組桿狀病毒(rBV)，純化且滴定。為了產生rAAV，用rBV以預定感染倍率(MOI)感染Sf9細胞之另一未處理培養物。使Sf9細胞在感染後培養預定時間。在預定時間後，自培養物分離所產生之rAAV顆粒，純化且滴定。
實例 2 ：評估 AAV 顆粒在經工程改造之心臟組織中之作用.
以2D及3D形式分析使用本文所描述之MYBPC3載體構築體製備之AAV9顆粒對人類iPSC衍生之心肌細胞的影響。在2D形式中，量測外源蛋白質及RNA含量，以及對突變型MYBPC3轉錄本之抑制(參見以下實例5)。在3D形式中，亦量測對收縮功能之影響，包括搏動頻率、收縮力及動力學。
藉由CRISPR/Cas9基因體編輯，使用攜帶異型接合MYBPC3截短突變之患者特異性人類誘導性富潛能幹細胞(hiPSC)株創建兩種hiPSC株：1)攜帶額外同型接合MYBPC3截短突變之cpHet，導致MYBPC3蛋白完全不存在；及2)攜帶兩個野生型對偶基因之同基因型對照，得到正常水平之MYBPC3蛋白。參見Warnecke等人, Generation of bi-allelic MYBPC3 truncating mutant and isogenic control from an iPSC line of a patient with hypertrophic cardiomyopathy.
Stem Cell Res.55 (2021): 102489。
在2D及經工程改造之心臟組織(EHT)形式中，包含本文所描述之載體構築體的AAV9顆粒藉由與來源於cpHet hiPSC株及同基因型對照hiPSC株之人類心肌細胞(CM)接觸來測試。
hiPSC心肌細胞(hiPSC-CM)係藉由使cpHet或同基因型對照hiPSC細胞繼代、解離hiPSC細胞及藉由使用不同培養基經14天促進心臟分化來製備。將分化的心肌細胞在2D單層中或以3D經工程改造之心臟組織(EHT)形式培養。EHT係藉由將1百萬個hiPSC-CM嵌入纖維蛋白基質來製備，一般如Breckwoldt K等人, Differentiation of cardiomyocytes and generation of human engineered heart tissue. Nat Protoc 12, 1177-1197 (2017)及Hansen等人, Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue.
Circ. Res.107.1 (2010): 35-44中所述。
簡言之，將具有間隔物之EHT槽置於填充有2%瓊脂糖(1.6毫升/孔)之24孔盤中。當瓊脂糖為固體時，移除間隔物且將聚矽氧支架與一對支柱一起置於各模具中。對於各EHT鑄造，在含有馬血清、Y-27632 (Biorbyt, orb154626)、纖維蛋白原、L-麩醯胺酸、DMEM、青黴素/鏈黴素及凝血酶之主培養基中使用大約1百萬個hiPSC-CM。將hiPSC-CM及鑄造培養基置於瓊脂糖槽中。1.5小時後，EHT在聚矽氧支架周圍凝固，且移至培養基填充之培養盤中。隨後將EHT維持在37℃、7% CO
2、40% O
2及98%相對濕度下。
對於用AAV轉導，將呈2D之HiPSC-CM再接種且培養為貼壁細胞，每24孔盤220K細胞或每96孔盤20K細胞。在再接種後約4天，藉由將AAV顆粒(以300K之感染倍率(MOI))添加至培養基中來轉導2D cpHet hiPSC-CM。在生成後約2週，藉由將AAV顆粒(感染倍率(MOI)為300K)添加至組織培養基中來轉導cpHet EHT。
對於2D及3D EHT形式，分別在轉導後7或14天偵測人類cMyBP-C蛋白之表現。簡言之，收穫2D或EHT hiPSC-CM以提取蛋白質用於進一步分析。利用針對hMYBPC3之定製抗體，藉由西方墨點法使用全蛋白溶解物量測外源蛋白質水平。α-輔肌動蛋白及/或cTnT蛋白水平用作參考。在未轉導之cpHet hiPSC-CM中未偵測到MYBPC3。在用AAV9顆粒轉導後，偵測到外源MYBPC3蛋白，且蛋白質水平描繪為相較於同基因型對照增加的倍數。結果顯示於圖2中，且顯示用A2、A3、A4、A6達成至少2.5倍的表現增加，其中A6達成最高增加，且用C1、C2、C4及C5達成至少0.1-1.0倍的表現增加，其中C3達成最高增加。對在HEK293細胞或Sf9衍生細胞中產生之包含本文所描述之載體構築體的額外AAV9顆粒進行測試，藉由西方墨點法分析，結果顯示相較於同基因型對照甚至更高的5-12倍的變化。
在3D EHT形式中，在投予本文所描述之AAV9-MYBPC3載體構築體後評估對自發搏動頻率及收縮功能的影響。為了評估收縮功能，刺激經工程改造之心臟組織以使其收縮及舒張。EHT形式之hiPSC-CM在生成後1-2週開始展現固有的自發收縮性。對於作為功能終點的自發搏動頻率，在不進一步刺激的情況下分析固有的自發收縮頻率。
在具有1.8 mM鈣之低葡萄糖DMEM培養基中評估自發搏動活性，且在轉導後1週量測。與同基因型對照EHT相比，在cpHet EHT中持續觀察到較高的自發搏動頻率。用含有本文所描述之載體構築體的AAV9顆粒進行基因療法之目標為降低此異常高頻。在轉導後一週及兩週，在完全培養基及無血清DMEM中分析隨時間推移的頻率。構築體A2、A3、A4、A5及A6致使異常表型恢復至正常表型。具體而言，構築體A3、A4及A6顯示最佳且最一致的搏動速率(BPM)降低。相比之下，構築體A5僅顯示對搏動速率之輕微影響。
藉由使用電刺激進行起搏，以固定的搏動頻率評估收縮功能。參見Hirt等人, Functional improvement and maturation of rat and human engineered heart tissue by chronic electrical stimulation.
J. Molec. Cell. Cardiol.74 (2014): 151-161。在轉導後一或2週，在含有1.8 mM鈣之培養基中採用短期電起搏(1 Hz，2.5 V)評估在固定頻率下之終點，以基線力作為確認性QC終點且以收縮動力學作為功能性終點(相對延遲弛豫時間，RT
20%及RT
80%)。藉由調整時間點、轉導介質及轉導室，使轉導程序最佳化以提供穩定的力發展，其中未經轉導(NT)之cpHet與用載體轉導之EHT之間無顯著差異。
活化後，量測經工程改造之心臟組織中肌細胞的收縮力。在結合半自動視訊光學分析與圖形識別軟體之EHT測試系統中監測EHT之收縮力及動力學。藉由已知Sylgard 184 (2.6 kPa)彈性模數之聚矽氧柱距離(柱偏轉)的增量計算隨時間(秒)推移的力(mN)發展。為了描繪正規化平均峰，將各EHT之基線設定為0%且峰值力設定為100%。將未經轉導(NT)之cpHet EHT與經轉導之cpHet及同基因型對照EHT進行比較且正規化。結果顯示於圖3中。
量測自峰值肌節收縮至再延長的弛豫時間及速率。記錄的收縮藉由峰值標準來識別。基於確定的收縮，計算頻率、平均力、縮短分數、收縮時間(達到峰值的時間)及弛豫時間(RT)之值。弛豫時間百分比表示自最大柱偏轉至基線所需的時間百分比，例如RT20%表示自最大值(100%)至80%柱偏轉之時間(秒)。根據絕對RT，計算相對延遲RT (分數或%) = RT80% - RT50% / RT80%。延遲弛豫時間之相對百分比顯示於圖4A中。再延長20%或80%之弛豫時間(秒)分別顯示於圖4B及4C中。與同基因型對照相比，cpHet顯示相對延遲RT (RT80% - RT50% / RT80%)之分數始終較高。基因療法之目標為使收縮動力學正常化，包括藉由降低異常高的相對延遲RT。
評定在HEK293細胞、Sf9及Sf9衍生細胞中產生之含有各種MYBPC3載體構築體的AAV9顆粒對收縮功能的影響。在轉導後1週，將用AAV9-MYBPC3轉導之cpHet EHT與時間匹配的同基因型對照EHT進行比較。大多數測試的載體構築體，例如A2、A3、A4、A5、A6及C3，均使異常高的相對延遲RT恢復至更接近正常表型。在HEK293細胞中產生之AAV9顆粒對收縮功能的影響優於在Sf9細胞中產生之顆粒。A3、A4、A5及A6具有最大作用且完全恢復異常高的相對延遲RT。
亦評估絕對弛豫時間。與同基因型對照相比，cpHet EHT表現出20%及80%之絕對弛豫時間(RT
20%及RT
80%)顯著較短。經測試之載體構築體，例如A2、A3、A4、A5、A6及C3，顯著延長異常短的RT。用在HEK293細胞中產生之AAV顆粒處理cpHet EHT心肌細胞顯示與未經轉導之cpHet EHT心肌細胞相比，兩者(RT
20%及RT
80%)之恢復最明顯。構築體A6對RT
20%及RT
80%具有統計學上顯著之影響。載體A6轉導之EHT表現出顯著更長的RT
20%及更長的RT
80%。
此外，分析經AAV轉導之cpHet EHT的正規化平均收縮峰，且與cpHet及同基因型對照EHT之正規化平均收縮峰進行比較。所有測試載體均可見一些作用，例如A2、A3、A4、A5、A6及C3始終具有最大作用。在HEK293細胞中產生之包含載體構築體A6的AAV9顆粒使得收縮動力學完全正常化。用在HEK293衍生細胞中產生之含有載體構築體A3及A6的AAV9顆粒轉導cpHet EHT，改善弛豫動力學，使其接近同基因型對照。如圖4D所示，用在HEK293細胞中產生之A3及A6轉導之細胞(第3組)的正規化力%顯著大於用在昆蟲細胞中產生之A3及A6轉導之細胞(第4組)的正規化力%。總體而言，與在昆蟲細胞中產生之AAV9顆粒相比，哺乳動物細胞中產生之AAV9顆粒在改善收縮功能及收縮動力學方面展現優良活性。
實例 3 ：評估 AAV 顆粒活體內之作用
以2e14vg/kg之劑量向小鼠(n=10)投予如實例1中製備之AAV顆粒，且在8週時收集心臟組織。
藉由ddPCR評定編碼人類cMyBP-C之載體基因體的數目。結果(每二倍體基因數目之載體基因體)顯示於圖5A中。所有測試的AAV顆粒均提供每個細胞至少一個編碼人類cMyBP-C之基因複本的有效遞送。
藉由
ddPCR評定人類cMyBP-C mRNA轉錄本之數目。結果(每個RPLP0核糖體蛋白轉錄本之mRNA轉錄本)顯示於圖5B中。所有測試的AAV顆粒均提供有效轉譯為mRNA，其中A2及A4提供最高水平。
cMyBP-C蛋白之量藉由液相層析/質譜(LC/MS)測定。結果(微克/公克心臟組織及鼠類心臟中人類cMyBP-C佔總cMyBP-C蛋白之百分比)顯示於圖5C中。
用對人類cMyBP-C及ASG (a-肌聚糖，一種肌肉細胞膜標記物)具有特異性之抗體對心臟組織進行染色。完整細胞核亦用DAPI染色。在大多數心肌細胞中廣泛偵測到cMyBP-C蛋白，在投予A5、A6及C3之小鼠的製備物中，分別有77%及65%之心肌細胞對cMyBP-C呈陽性。參見圖6。
亦用對人類cMyBP-C及肌節中存在之肌動蛋白具有特異性之抗體對心臟組織進行染色。觀察到人類cMyBP-C蛋白定位於肌節。
結果表明，A5及A6載體構築體向投予包含此等載體構築體之AAV顆粒的小鼠提供人類cMyBP-C蛋白之有效遞送，且人類cMyBP-C蛋白有效地併入大多數心肌細胞肌節中。預期功能性人類cMyBP-C蛋白之整合將改善收縮性且減輕肥厚性心肌病及其相關症狀。
實例 4 ：進一步評估 AAV 顆粒活體內之作用
向MYBPC3 KO小鼠投予各種劑量之包含本文所描述之載體構築體的rAAV顆粒，以評估HCM表型(包括肥大及心臟功能障礙)之矯正。超音波心動描記術用於在整個研究期間監測此等小鼠之功能矯正，且在研究完成後，心臟組織將用於評估載體構築體之轉導及表現。
實例 5 ：評估突變型 MYBPC3 mRNA 水平
亦在如實例2中所述製備之2D hiPSC-CM中評估含有本文所描述之載體構築體的AAV9顆粒對突變型MYBPC3 mRNA水平的影響。
進行半定量RT-PCR以監測對突變型MYBPC3 mRNA之影響。用MYBPC3 c.2308G＞A突變位點周圍之引子進行的RT-PCR顯示，在同基因型對照CM中僅一個在912 bp處之條帶，對應於野生型mRNA，且在未經轉導之CpHet CM中有兩個額外的mRNA條帶，其大小與野生型條帶(亦即912bp)相比更大。藉由用如本文所描述之AAV9-MYBPC3載體構築體(例如A1、A2、A3、A4、A5、A6)轉導來防止由內源性突變基因產生之此等兩種異常MYBPC3 mRNA的累積。C1、C4及C5對突變型mRNA條帶之影響最小。
將在相關模型中進行心血管安全性及毒理學研究。將進行劑量反應研究，以確定MYBPC3-/-小鼠中轉導/蛋白質表現%，從而為劑量選擇提供資訊。
本文所描述之實施例僅意欲為例示性的，且熟習此項技術者將認識到，或將僅使用常規實驗就能夠確定特定構築體、材料及程序之許多等效物。所有此類等效物被認為在本揭示案之範圍內。
本文所提及之所有專利、專利申請案及出版物均以全文引用之方式併入本文中。本申請案中任何參考文獻之引用或標識並非承認該參考文獻可用作本申請案之先前技術。根據所附申請專利範圍將更好地理解本揭示案之完整範圍。
圖1描繪包含本文中表示為C1-C5及A1-A6之載體的AAV顆粒之元件的組織。
圖2描繪本文中表示為C1-C5及A1-A6之載體在經工程改造之心臟組織之全蛋白溶解物中藉由西方墨點法偵測到的cMyBP-C蛋白之倍數變化。
圖3描繪用包含本文中表示為C2、C3及A2-A6之載體的AAV顆粒處理的經工程改造之心臟組織中肌細胞之正規化收縮力。
圖4A-4C描繪用包含本文中表示為C2、C3及A1-A6之載體的AAV顆粒處理的經工程改造之心臟組織中肌細胞收縮後的弛豫時間。圖4A顯示延遲弛豫時間之相對百分比。圖4B顯示達到20%弛豫之時間，以秒為單位，圖4C顯示達到80%弛豫之時間，以秒為單位，且圖4D描繪在HEK293細胞(第3組)及昆蟲細胞(第4組)中產生之構築體A3及A6的力%正規化。
圖5A-5C分別描繪投予包含本文中表示為C1-C5及A1-A6之載體的AAV顆粒之小鼠的DNA複本數(載體基因體)、RNA複本數及cMyBP-C蛋白(μg/g心臟組織)。
圖6描繪投予包含本文中表示為C3、A5及A6之載體的AAV顆粒之小鼠的心臟組織中表現人類cMyBP-C之心肌細胞的百分比。
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Claims (49)
- 一種重組載體構築體，其包含： (a)編碼包含與SEQ ID NO: 2至少95%一致之胺基酸序列的功能性人類心臟肌球蛋白結合蛋白C (cMyBP-C)之核酸或其互補序列，其可操作地連接至 (b)異源心肌細胞特異性轉錄調控區，其包含hTNNT2啟動子之片段或變異體， (c)多腺苷酸化信號，及 (d) 5'及3' AAV反向末端重複(ITR)序列中之一或兩者。
- 如請求項1之載體構築體，其中該編碼功能性cMyBP-C胺基酸序列之核酸與SEQ ID NO: 1或42-45中之任一者或其互補序列至少85%一致。
- 如請求項1至2中任一項之載體構築體，其中該核酸具有與SEQ ID NO: 1或42-45之核酸序列或其互補序列至少97%、98%或99%一致的序列。
- 如請求項1之載體構築體，其視情況包含內含子及/或外顯子或其片段或變異體。
- 如請求項4之載體構築體，其中該內含子包含與SEQ ID NO: 53或58或其互補序列至少60%一致的核苷酸序列。
- 如請求項1至5中任一項之載體構築體，其中該心肌細胞特異性轉錄調控區包含 (a)心肌細胞特異性啟動子，其包含與SEQ ID NO: 47-52中之任一者或其片段或互補序列至少80%一致的核苷酸序列，及 (b)內含子，其包含與SEQ ID NO: 53、56或58中之任一者或其互補序列至少60%一致的核苷酸序列，其中該內含子位於該編碼功能性人類cMyBP-C之核酸的5'。
- 如請求項6之載體構築體，其包含外顯子之片段，視情況為HbB外顯子。
- 如請求項7之載體構築體，其中該外顯子包含SEQ ID NO: 54之核苷酸序列或其互補序列。
- 如請求項7之載體構築體，其包含SEQ ID NO: 56之核苷酸序列或其互補序列。
- 如請求項1至3中任一項之載體構築體，其進一步包含內含子。
- 如請求項10之載體構築體，其中該內含子包含與SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 58或其互補序列至少60%一致的核苷酸序列。
- 如請求項10之載體構築體，其中該內含子位於該編碼功能性人類cMyBP-C之核酸內。
- 如請求項10之載體構築體，其中該內含子位於該編碼功能性人類-MyBP-C之核酸的兩個外顯子之間。
- 如請求項10之載體構築體，其中該內含子位於該編碼功能性人類cMyBP-C之核酸的外顯子2與外顯子3之間。
- 如請求項10之載體構築體，其中該內含子位於SEQ ID NO: 1或42-45之位置293處。
- 如請求項1至15中任一項之載體構築體，其中該心肌細胞特異性轉錄調控區包含與SEQ ID NO: 49或其互補序列至少80%一致的核苷酸序列。
- 如請求項1至15中任一項之載體構築體，其中該心肌細胞特異性轉錄調控區包含與SEQ ID NO: 50或其互補序列至少80%一致的核苷酸序列。
- 如請求項1至15中任一項之載體構築體，其中該心肌細胞特異性轉錄調控區包含與SEQ ID NO: 51或其互補序列至少80%一致的核苷酸序列。
- 如請求項1之載體構築體，其中該心肌細胞特異性轉錄調控區包含與SEQ ID NO: 49或其互補序列至少95%一致的核苷酸序列。
- 如請求項1之載體構築體，其中該心肌細胞特異性轉錄調控區包含與SEQ ID NO: 50或其互補序列至少95%一致的核苷酸序列。
- 如請求項1之載體構築體，其中該心肌細胞特異性轉錄調控區包含與SEQ ID NO: 51或其互補序列大於95%一致的核苷酸序列。
- 如請求項1之載體構築體，其中該心肌細胞特異性轉錄調控區包含與SEQ ID NO: 52或其互補序列大於95%一致的核苷酸序列。
- 如請求項1之載體構築體，其中該心肌細胞特異性轉錄調控區包含與SEQ ID NO: 49或其互補序列至少97%一致的核苷酸序列。
- 如請求項1之載體構築體，其中該心肌細胞特異性轉錄調控區包含與SEQ ID NO: 50或其互補序列至少97%一致的核苷酸序列。
- 如請求項1之載體構築體，其中該心肌細胞特異性轉錄調控區包含與SEQ ID NO: 51或其互補序列至少97%一致的核苷酸序列。
- 如請求項1之載體構築體，其中該心肌細胞特異性轉錄調控區包含與SEQ ID NO: 52或其互補序列至少97%一致的核苷酸序列。
- 如請求項1至26中任一項之載體構築體，其中該多腺苷酸化信號為微型多腺苷酸化信號、生長激素多腺苷酸化信號、SV40多腺苷酸化信號或其片段。
- 如請求項27之載體構築體，其中該多腺苷酸化信號包含與SEQ ID NO: 64或其互補序列至少90%一致的核苷酸序列。
- 如請求項27之載體構築體，其中該多腺苷酸化信號為牛生長激素多腺苷酸化信號或其片段。
- 如請求項29之載體構築體，其中該多腺苷酸化信號包含與SEQ ID NO: 59-61或其互補序列中之任一者至少90%一致的核苷酸序列。
- 如請求項27之載體構築體，其中該多腺苷酸化信號為人類生長激素多腺苷酸化信號或其片段。
- 如請求項31之載體構築體，其中該多腺苷酸化信號包含與SEQ ID NO: 62或其片段或互補序列中之任一者至少90%一致的核苷酸序列。
- 如請求項1至32中任一項之載體構築體，其中該rAAV載體構築體之大小為約4至約5.5 kb。
- 如請求項1至32中任一項之載體構築體，其中該AAV 5' ITR及/或AAV 3' ITR來自AAV2。
- 如請求項1至32中任一項之載體構築體，其包含與SEQ ID NO: 3-41或92-169或其互補序列中之任一者至少97%、98%或99%一致的核苷酸序列。
- 一種rAAV顆粒，其包含如請求項1至35中任一項之載體構築體及AAV衣殼。
- 如請求項36之rAAV顆粒，其中該AAV衣殼具有心臟向性。
- 如請求項36之rAAV顆粒，其中該AAV衣殼為AAV9型衣殼。
- 一種產生如請求項36至38中任一項之rAAV顆粒的方法，其包含以下步驟： (a)提供包含一或多種核酸構築體之哺乳動物細胞，該一或多種核酸構築體包含 (i)如請求項1至35中任一項之載體構築體， (ii)可操作地連接至啟動子之編碼一或多種AAV Rep蛋白之核苷酸序列，及 (iii)可操作地連接至啟動子之編碼一或多種AAV衣殼蛋白之核苷酸序列， (b)在有利於表現該等Rep蛋白及衣殼蛋白之條件下培養該哺乳動物細胞，及(c)回收該rAAV顆粒。
- 如請求項39之方法，其中該哺乳動物細胞為HEK293細胞。
- 一種產生rAAV顆粒之方法，其包含以下步驟： (a)向容許AAV複製之細胞提供一或多種核酸構築體，該一或多種核酸構築體包含： (i)重組載體構築體，其包含(1)至少一個AAV ITR，(2)異源心肌細胞特異性轉錄調控區，及(3)編碼功能性人類心臟肌球蛋白結合蛋白C之核酸， (ii)編碼一或多種AAV Rep蛋白之核苷酸序列，其可操作地連接至能夠驅動該一或多種Rep蛋白在該細胞中表現的啟動子；及 (iii)編碼一或多種AAV衣殼蛋白之核苷酸序列，其可操作地連接至能夠驅動該一或多種衣殼蛋白在該細胞中表現的啟動子； (b)在容許表現該等Rep蛋白及該等衣殼蛋白之條件下培養該細胞；及視情況(c)回收該AAV顆粒。
- 如請求項41之方法，其中該細胞為昆蟲細胞。
- 如請求項41之方法，其中該細胞為哺乳動物細胞。
- 如請求項41至43中任一項之方法，其中該細胞具有如請求項1至35中任一項之重組載體構築體。
- 一種rAAV顆粒群體，其藉由如請求項39至44中任一項之方法產生，視情況藉由減少空衣殼之數目的步驟而富集包含全長或接近全長之載體基因體的顆粒。
- 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至35中任一項之載體構築體或如請求項36至38中任一項之rAAV顆粒或如請求項45之rAAV顆粒群體，處於具有無菌醫藥學上可接受之賦形劑的水性懸浮液中。
- 一種遞送人類心臟肌球蛋白結合蛋白C編碼序列之方法，其包含向患有肥厚性心肌病之患者投予如請求項1至35中任一項之載體構築體或如請求項36至38中任一項之rAAV顆粒或如請求項45之rAAV顆粒群體或如請求項46之醫藥組成物。
- 一種治療肥厚性心肌病之方法，其包含向患有肥厚性心肌病之患者投予治療有效量之如請求項1至35中任一項之載體構築體或如請求項36至38中任一項之rAAV顆粒或如請求項45之rAAV顆粒群體或如請求項46之醫藥組成物。
- 如請求項47或48之方法，其中該患者表現出一或兩個cMyBP-C對偶基因中之突變。
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| US63/376,712 | 2022-09-22 | ||
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