CN112424345A - Aav载体在青少年对象中的稳定表达 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及腺病毒相关病毒(AAV)载体以在青少年对象的肝脏中实现转基因的长期表达中的用途。本发明包括在向青少年对象单次施用AAV载体后，对象疾病症状的稳定长期改善，其中所述AAV载体将转基因递送至对象的肝。

Description

AAV载体在青少年对象中的稳定表达
本发明申请主张2018年5月14日提交的美国临时专利申请序列号No.62/671,271的优先权，该专利申请以其全部内容作为参考并入本文。
以电子形式提交的材料作为参考并入
作为公开内容的单独部分，本发明申请含有处于计算机-可读形式的序列表，其以其全部内容作为参考并入，并且如下表示：文件名：53094_Seqlisting.txt；大小：372,202字节；创建于：2019年5月11日。
发明领域
本发明涉及腺病毒相关病毒(AAV)载体的使用以实现转基因在青少年对象的肝脏中的长期表达。本发明包括在向青少年对象单次施用AAV载体后，对象疾病症状的稳定长期改善，其中所述AAV载体将转基因递送至对象的肝。
背景技术
腺病毒相关病毒(AAV)是感染人和一些其它灵长类动物种的小型、复制-缺陷型、非包膜动物病毒。AAV的几种特征使得该病毒成为通过基因疗法递送治疗性蛋白的有吸引力的载体，所述特征包括(例如)尚未知AAV引起人疾病并诱导轻度的免疫应答，和AAV载体可以感染分裂和休眠细胞，且不会整合到宿主细胞基因组中。已成功地在一些临床试验中使用了使用AAV的基因疗法载体，例如，用于将人因子IX(FIX)递送至成年人的肝脏以治疗乙型血友病。
尽管它们具有积极的特征，但是AAV基因疗法载体的确具有一些缺陷。具体地，受制于病毒的DNA包装能力，AAV载体的克隆能力是有限的。野生型AAV的单链DNA基因组为约4.7千碱基(kb)。实际上，多至约5.0kb(即全长)的AAV基因组似乎完全包装到AAV病毒颗粒中。由于要求AAV载体中的核酸基因组必须具有两个约145个碱基的AAV末端反向重复(ITR)，AAV载体的DNA包装能力使得可以蛋白衣壳包裹最大约4.4kb的蛋白-编码序列。
AAV载体的另一种限制在于转基因极少整合到靶细胞的基因组中。作为替代，将AAV载体作为游离基因拷贝维持。尽管在降低整合拷贝破坏宿主基因功能的风险方面基因组整合的这种缺少是所期望的，，但是认为整合的缺少阻碍了在分裂细胞/生长组织中的使用，因为游离基因拷贝在分裂细胞中随时间丧失。这见于(例如)青少年的肝脏，其中AAV介导的基因递送导致载体基因组数快速丧失以及相伴的转基因表达的降低。参见，例如，Cunningham等人,Molec.Ther.(2008)16卷,1081-1088页。
需要向青少年对象肝脏递送治疗性转基因的方法，其中所述转基因将所述转基因的有效表达水平维持临床显著的时间长度，并且优选地在对象的整个寿命中维持。照此，本发明涉及编码治疗性蛋白的AAV载体在青少年对象的肝脏中的使用。具体地，本发明提供了将AAV载体递送至青少年对象的肝脏的方法，其中AAV载体的仅单次施用提供了临床显著时间长度的治疗有效的转基因产生水平。
发明概述
本发明提供了使用AAV载体在青少年对象肝细胞中表达治疗性蛋白的方法。本发明的重组AAV载体包括其中已引入了编码功能性治疗性蛋白的核酸序列的AAV病毒的非天然存在的衍生物。治疗性蛋白替换或补偿内源基因产物活性的损失或降低。本发明的治疗性蛋白的非限制性实例包括因子VIII、因子IX和苯丙氨酸羟化酶(PAH)，其用于替换分别患有甲型血友病、乙型血友病和苯丙酮酸尿症的对象中丧失的内源活性。
在一个方面，本发明提供了改善患有遗传病症的青少年对象中的遗传病症的症状的方法，其包括向所述青少年对象施用治疗有效量的编码治疗性蛋白的治疗性AAV病毒的步骤，其中所述治疗性蛋白的表达改善了所述遗传病症的症状。
在本发明的一个实施方式中，所述治疗性蛋白是无功能的内源蛋白的功能性拷贝。在本发明的另一个实施方式中，所述治疗性蛋白是内源蛋白的修饰形式。在本发明的其它实施方式中，所述治疗性蛋白是补偿无功能的内源蛋白的异源蛋白质。
在本发明的一个实施方式中，所述青少年对象是青少年的人。在另一个实施方式中，所述青少年的人小于18岁。在本发明的另一个实施方式中，所述青少年的人小于12岁。
在本发明的一个实施方式中，在治疗性AAV病毒的施用后，通过青少年对象的肝细胞表达所述治疗性蛋白。在本发明的另一个实施方式中，所述治疗性AAV病毒在静脉内施用。
在本发明的一个实施方式中，所述遗传病症为血友病。在本发明的另一个实施方式中，所述遗传病症为甲型血友病，并且所述治疗性蛋白为因子VIII。在另一个实施方式中，所述因子VIII为因子VIII-SQ。在优选的实施方式中，所述治疗性AAV病毒为AAV5-FVIII-SQ。在其它实施方式中，所述血友病为乙型血友病，并且所述治疗性蛋白为因子IX。在另一个实施方式中，所述因子IX为R338L因子IX。
在本发明的一个实施方式中，所述遗传病症为苯丙酮酸尿症(PKU)，并且所述治疗性蛋白为苯丙氨酸羟化酶(PAH)。
在本发明的另一个实施方式中，施用于青少年对象的治疗性AAV病毒的量对应于在成年对象中有效的治疗性AAV病毒的相同绝对数目。在本发明的其它实施方式中，将约1E12 vg/kg至约1E15 vg/kg的所述治疗性AAV病毒施用于所述青少年对象。在一些实施方式中，将约2E12 vg/kg至约2E13 vg/kg的治疗性AAV病毒施用于青少年对象，或者将约2E12vg/kg至约2E14 vg/kg的治疗性AAV病毒施用于青少年对象，或者将约5E12 vg/kg至约5E13vg/kg施用于青少年对象，或者将约5E13 vg/kg至约5E14 vg/kg的治疗性AAV病毒施用于青少年对象，或者将约5E13至约5E15 vg/kg的治疗性AAV病毒施用于青少年对象，或者将约1E13 vg/kg至约1E14 vg/kg的治疗性AAV病毒施用于青少年对象，或者将约1E14 vg/kg至约1E15 vg/kg的治疗性AAV病毒施用于青少年对象，或者将约1E12 vg/kg至约2E16 vg/kg的治疗性AAV病毒施用于青少年对象，或者将约6E12 vg/kg至约2E14 vg/kg的治疗性AAV病毒施用于青少年对象，或者将约6E12 vg/kg至约6E13 vg/kg施用于青少年对象，或者将约2E13 vg/kg至约2E15 vg/kg的治疗性AAV病毒施用于青少年对象，或者将约2E13 vg/kg至约2E16 vg/kg的治疗性AAV病毒施用于青少年对象，或者将约2E14 vg/kg至约2E16 vg/kg的治疗性AAV病毒施用于青少年对象，或者将约6E13 vg/kg至约6E14 vg/kg的治疗性AAV病毒施用于青少年对象。
在本发明的一个实施方式中，将AAV病毒配制为含有浓度为约0.1mg/ml至约3mg/ml的磷酸氢二钠，浓度为约0.1mg/ml至约3mg/ml的一水合磷酸二氢钠，浓度为约1mg/ml至约20mg/ml的氯化钠，浓度为约5mg/ml至约40mg/ml的甘露糖醇和浓度为约0.1mg/ml至约4mg/ml的泊洛沙姆188的药物组合物。
在本发明的某些实施方式中，用浓度范围在5mg/天至60mg/天的皮质类固醇预防性治疗青少年对象。在其它实施方式中，用浓度在5mg/天至60mg/天的皮质类固醇治疗性治疗青少年对象。
在其它实施方式中，本发明导致至少约5IU/dl的功能性因子VIII蛋白在青少年对象中表达。另一种实施方式导致在青少年对象中至少约1IU/dl的功能性因子VIII蛋白的升高。
在另一个方面，本发明提供了减少患有血友病的青少年对象中出血发作的出血时间的方法，其中所述方法包括在出血发作之前，向所述青少年对象施用治疗有效量的治疗性AAV病毒的步骤。在本发明的一个实施方式中，所述施用步骤在出血发作之前至少3周发生。在另一个实施方式中，静脉内施用所述治疗性AAV病毒。在其它实施方式中，所述血友病为甲型血友病，并且所述治疗性AAV病毒表达因子VIII。在另一个实施方式中，所述因子VIII为因子VIII-SQ。在优选的实施方式中，所述治疗性AAV病毒为AAV5-FVIII-SQ。在另一个实施方式中，所述血友病为乙型血友病，并且所述治疗性AAV病毒表达因子IX。在另一个实施方式中，所述因子IX为R338L因子IX。在另一个实施方式中，施用于青少年对象的治疗性AAV病毒的量对应于在成年对象中有效的治疗性AAV病毒的相同绝对数目。在其它实施方式中，将约1E12 vg/kg至约1E15vg/kg的所述治疗性AAV病毒施用于所述青少年对象。在其它示例性实施方式中，将约1E12 vg/kg至约1E16 vg/kg的治疗性AAV病毒施用于青少年对象，或者将约2E12 vg/kg至约2E13 vg/kg的治疗性AAV病毒施用于青少年对象，或者将约2E12 vg/kg至约2E14vg/kg的治疗性AAV病毒施用于青少年对象，或者将约5E13 vg/kg至约5E14 vg/kg的治疗性AAV病毒施用于青少年对象，或者将约6E12 vg/kg至约6E14 vg/kg的治疗性AAV病毒施用于青少年对象，或者将约6E13 vg/kg至约6E14 vg/kg的治疗性AAV病毒施用于青少年对象。在一个实施方式中，在包含浓度为约0.1mg/ml至约3mg/ml的磷酸氢二钠，浓度为约0.1mg/ml至约3mg/ml的一水合磷酸二氢钠，浓度为约1mg/ml至约20mg/ml的氯化钠，浓度为约5mg/ml至约40mg/ml的甘露糖醇和浓度为约0.1mg/ml至约4mg/ml的泊洛沙姆188的溶液中配制治疗性AAV病毒。
在另一个方面，本发明提供了提高因子VIII蛋白在对其有需要的青少年对象中的表达的方法，其中所述方法包括向所述青少年对象施用治疗性病毒的步骤，其中所述治疗性AAV病毒为AAV5-FVIII-SQ。在本发明的一个实施方式中，静脉内施用所述治疗性AAV病毒。在另一个实施方式中，施用于青少年对象的治疗性AAV病毒的量对应于在成年对象中有效的治疗性AAV病毒的相同绝对数目。在另一个实施方式中，将约1E12vg/kg至约1E15 vg/kg的所述治疗性AAV病毒施用于所述青少年对象。在其它实施方式中，将约6E13 vg/kg至约6E14 vg/kg的所述治疗性AAV病毒施用于所述青少年对象。在其它实施方式中，本发明导致至少约5IU/dl的功能性因子VIII蛋白在青少年对象中表达。在其它实施方式中，本发明导致至少约1IU/dl的功能性因子VIII蛋白在青少年对象中表达。在另一个实施方式中，本发明导致在青少年对象中至少约1IU/dl的功能性FVIII活性的升高。在一个实施方式中，用浓度范围在5mg/天至60mg/天的皮质类固醇治疗青少年对象。在其它实施方式中，预防性进行所述皮质类固醇治疗。在其它实施方式中，治疗性进行所述皮质类固醇治疗。在其它实施方式中，用浓度范围在5mg/天至60mg/天的皮质类固醇治疗青少年对象至少3、4、5、6、7、8、9或10周或以上的一段连续时间。本发明的实施方式包括确定在施用治疗有效量的AAV5-FVIII-SQ之后，在青少年对象的血清中是否存在抗-AAV衣壳抗体的步骤。在另一个实施方式中，本发明包括在确定青少年对象的血清中存在抗-AAV衣壳抗体之后，向所述对象施用有效量的皮质类固醇的步骤。
编码功能活性的治疗性蛋白的基因组优选地长度至多为7.0kb，更优选地长度至多为6.5kb，更优选地长度至多为6.0kb，更优选地长度至多为5.5kb，更优选地长度至多为5.0kb，具有提高的启动子功能。
如本文所使用的，当在培养细胞中表达时，或者体内，当在细胞或身体组织中表达时，“功能活性的因子VIII”或“功能活性的FVIII”是具有野生型FVIII蛋白的体外功能性的FVIII蛋白。在整个本发明申请中，术语“因子VIII”和“FVIII”是相同的并且是可互换使用的。这包括(例如)在患有甲型血友病的对象中，在功能上促使血液凝固级联和/或降低血液凝固所需的时间。野生型FVIII通过凝血级联参与血液凝固，从而起到激活的因子IX(FIXa)的辅因子的作用，其在存在钙离子和磷脂的情况下，形成了将因子X(FX)转化为激活的FX(FXa)的复合物。因此，功能活性的FVIII可以与FIXa形成复合物，其可以将FX转化为FXa。功能活性的FVIII蛋白的一个实例是如WO 2015/038625中所述的FVIII SQ蛋白，该专利作为参考并入本文。
本发明还提供了提高PAH蛋白在对其有需要的青少年对象中的表达的方法，其包括向所述青少年对象施用治疗性病毒，其中所述治疗性AAV病毒是AAV5-PAH。例如，在任何方法中，静脉内施用所述治疗性AAV病毒。本发明还提供了治疗性AAV病毒用于制备用于提高PAH蛋白在对其有需要的青少年对象中的表达的药剂的使用，其中所述AAV病毒是AAV5-PAH。在另一个实施方式中，本发明提供了组合物，其包含用于提高PAH蛋白在对其有需要的青少年对象中的表达的治疗性AAV病毒，其中所述AAV病毒是AAV5-PAH。在任何所述使用或组合物中，将AAV病毒配制用于静脉内施用。在用于提高PAH表达的这些方法、使用和组合物中，将约1E12 vg/kg至约1E16vg/kg的治疗性AAV病毒施用于青少年对象，或者将约2E12vg/kg至约2E13 vg/kg的治疗性AAV病毒施用于青少年对象，或者将约2E12 vg/kg至约2E14vg/kg的治疗性AAV病毒施用于青少年对象，或者将约5E13 vg/kg至约5E14 vg/kg的治疗性AAV病毒施用于青少年对象，或者将约6E12 vg/kg至约6E14 vg/kg的治疗性AAV病毒施用于青少年对象。在任何所述方法、使用和组合物中，所述青少年对象为约3周至约5周大。例如，所述青少年对象为约3周大，或约4周大，或约5周大，或约22天大，或约23天大，或约24天大，或约25天大，或约26天大，或约27天大，或约29天大，或约30天大，或约31天大，或约32天大，或约33天大，或约34天大。另外，任何这些方法还可以包括确定在施用治疗有效量的AAV5-PAH之后，在青少年对象的血清中是否存在抗-AAV衣壳抗体的步骤。
如本文所使用的，“AAV载体”是指具有AAV 5'末端反向重复(ITR)序列和AAV 3'ITR的单链或双链核酸，其侧接可操作性地连接至对于AAV病毒基因组异源的转录调控元件(即一个或多个启动子和/或增强剂)的蛋白-编码序列(优选地功能性治疗性蛋白-编码序列；例如，FVIII、FIX和PAH)和任选地，在蛋白-编码序列的外显子之间插入的多腺苷酸化序列和/或一个或多个内含子。单链AAV载体是指在AAV病毒颗粒的基因组中存在的核酸，并且可以是本文所公开的核酸序列的有义链或反义链。以碱基提供了这些单链核酸的大小。双链AAV载体是指存在于质粒，例如，pUC19或双链病毒，例如，杆状病毒的基因组的DNA中，用于表达或输送AAV载体核酸的核酸。以碱基对(bp)提供这些双链核酸的尺寸。
如本文所使用的术语“末端反向重复(ITR)”是指本领域-承认的存在于AAV基因组的5'和3'末端的区域，其作为DNA复制起点并且作为病毒基因组的包装信号顺式作用。AAVITR，以及AAV rep编码区提供了有效切除，并且挽回了在两个侧接ITR之间插入的核苷酸序列向宿主细胞基因组中的整合。Yan等人,J.Virol.(2005)79卷,364-379页公开了某些AAV-相关ITR的序列，该文献以其整体作为参考并入本文。在本文中使用的ITR序列可以是保留功能能力的全长的野生型AAV ITR或其片段，或者可以是能够作为复制起点顺式作用的全长的野生型AAV ITR的序列变体。在本发明的重组AAV FVIII载体中有用的AAV ITR可以来源于任何已知的AAV血清型，并且在某些优选实施方式，来源于AAV2或AAV5血清型。
“转录调控元件”是指参与基因转录调控的基因的核苷酸序列，包括启动子，加上响应元件，用于转录因子结合以辅助RNA聚合酶结合并促进表达的激活子和增强子序列，以及与阻遏子蛋白结合以阻断RNA聚合酶连接并防止表达的操纵子和沉默子序列。术语“肝特异性转录调控元件”是指特异性调节肝组织中基因表达的调控元件。肝特异性调控元件的实例包括(但不限于)小鼠甲状腺素启动子(mTTR)、内源人因子VIII启动子(F8)、人α-1-抗胰蛋白酶启动子(hAAT)及其活性片段、人白蛋白最小启动子和小鼠白蛋白启动子。还考虑了来源于肝特异性转录因子结合位点的增强子，如EBP、DBP、HNF1、HNF3、HNF4、HNF6以及Enh1。
在一个实施方式中，本发明所述的AAV载体包含编码B域被14个氨基酸的SQ序列替换的功能活性的因子VIII蛋白的核酸。在Ward等人,Blood(2011)117卷,798-807页；McIntosh等人,Blood(2013)121卷,3335-3344页；WO 2013/186563；和WO 2015/038625中公开了SQ序列。FVIII编码区序列可以是密码子-优化的FVIII-编码序列(参见，例如，美国专利申请公开US2015158930、US2015071883和US20170216408；和美国专利9,447,168和9,504,762，以上所有专利以其全部内容作为参考并入本文)。在示例性实施方式中，编码AAV载体或重组AAV病毒颗粒的功能活性的人FVIII蛋白的核酸由编码功能性FVIII蛋白序列的SEQ ID NO:1所示的核酸序列的核苷酸403至4776组成；该序列在本文中被称为“FVIII-SQ”或者“因子VIII-SQ”。在示例性实施方式中，本发明所述的AAV载体包含SEQ ID NO：1-45中任一项所示的核酸序列。
在一个实施方式中，本发明所述的AAV载体包含编码功能活性的因子IX蛋白的核酸。因子IX编码序列可以是野生型的，密码子优化的或者变体(参见，例如，美国专利4,994,371，该专利以其全部内容作为参考并入本文)。在某些实施方式中，因子IX编码序列编码位置338处的精氨酸残基改变的蛋白，其中所述精氨酸残基改变为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、丝氨酸或苏氨酸。在优选的实施方式中，位置338处的精氨酸残基改变为亮氨酸(R338L因子IX)(参见，例如，美国专利6,531,298；美国专利9,249,405；美国专利申请公开US2002/0031799；和美国专利申请公开US2011/0244550，以上所有专利以所有的全部内容作为参考并入)。在示例性实施方式中，本发明所述的AAV载体包含编码SEQ ID NO：46所示的因子IX蛋白序列或者在SEQ ID NO：46的位置338处的精氨酸具有变化的修饰的FIX蛋白的核酸序列。
在其它实施方式中，本发明所述的AAV载体包含编码功能活性的苯丙氨酸羟化酶(PAH)蛋白的核酸，如编码SEQ ID NO：48所示的野生型PAH氨基酸序列的核酸序列。所述PAH编码序列可以是野生型的，密码子优化的或者变体(参见，例如，Fang等人,Gene Ther.,1卷,247-254页(1994)；Eisensmith等人,J.Inherit.Metab.Dis.,19卷,412-423页(1996)；Nagasaki等人,Pediatr.Res.,45卷,465-473页(1999)；和Laipis等人,Mol.Ther.,7卷,S391-S392页(2003))。通过SEQ ID NO：47所示的核酸序列编码野生型PAH。在示例性实施方式中，本发明所述的AAV载体包含编码SEQ ID NO：48所示的野生型PAH蛋白序列的核酸序列。在示例性实施方式中，本发明所述的AAV载体包含SEQ ID NO：49-55中任一项所示的核酸序列。在美国临时专利申请No.62/755,207和2019年5月8日提交的国际专利申请(其主张美国临时专利申请No.62/755,207的优先权)中提供了包含编码功能活性的PAH的核酸的示例性的AAV载体，以上两项专利申请以其全部内容作为参考并入本文。
在其它实施方式中，本发明所述的重组AAV载体包含含有AAV2 5'末端反向重复(ITR)(如本领域中已知的，其可以或可以不修饰)、肝-特异性转录调控区、密码子-优化的治疗性蛋白编码区，任选地一个或多个内含子、多腺苷酸化序列和AAV2 3'ITR(如本领域中已知的，其可以或可以不修饰)的核酸。在某些实施方式中，所述治疗性蛋白是人因子VIII或其变体。在其它实施方式中，所述治疗性蛋白是人因子IX或其变体。在其它实施方式中，所述治疗性蛋白是人PAH或其变体。在优选的实施方式中，所述肝-特异性转录调控区包含缩短的ApoE增强子序列；186个碱基的人α抗-胰蛋白酶(hAAT)近端启动子，包括5'未翻译区(UTR)的42个碱基；选自下列的一个或多个增强子：(i)34个碱基的人ApoE/C1增强子，(ii)32个碱基的人AAT启动子远端X区和(iii)80个其它碱基的人AAT近端启动子的远端元件；和编码FVIII-SQ变体的密码子-优化的功能活性的FVIII编码区。在另一个优选的实施方式中，肝特异性转录调控区包含α-微球蛋白增强子序列和186个碱基的人α抗-胰蛋白酶(AAT)近端启动子。
在其它实施方式中，本发明涉及编码功能性因子VIII多肽的载体构建体，其中所述构建体以一种或多种不同取向包含上述构建体的各个元件中的一个或多个及其组合。本发明还涉及处于相反取向的上述构建体。本发明还涉及包含本文所述的AAV FVIII载体的重组AAV病毒颗粒以及它们用于治疗甲型血友病的使用。
在其它实施方式中，本发明涉及编码功能性因子IX多肽的载体构建体，其中所述构建体以一种或多种不同取向包含上述构建体的各个元件中的一个或多个及其组合。本发明还涉及处于相反取向的上述构建体。本发明还涉及包含本文所述的AAV IX载体的重组AAV病毒颗粒以及它们用于治疗青少年对象中的乙型血友病的使用。
在其它实施方式中，本发明涉及编码功能性PAH多肽的载体构建体，其中所述构建体以一种或多种不同取向包含上述构建体的各个元件中的一个或多个及其组合。本发明还涉及处于相反取向的上述构建体。本发明还涉及包含本文所述的AAV PAH载体的重组AAV病毒颗粒以及它们用于治疗青少年对象中的PKU的使用。
处于单链形式的本发明的AAV载体为小于约7.0kb长，小于约6.5kb长，小于约6.4kb长，小于约6.3kb长，小于约6.2kb长，小于约6.0kb长，小于约5.8kb长，小于约5.6kb长，小于约5.5kb长，小于约5.4kb长，小于约5.4kb长，小于约5.2kb长或小于约5.0kb长。处于单链形式的本发明的AAV载体在约5.0kb至约6.5kb长的范围内，或约4.8kb至约5.2k长，或4.8kb至5.3kb长，或约4.9kb至约5.5kb长的范围内，或约4.8kb至约6.0kb长，或约5.0kb至6.2kb长或约5.1kb至约6.3kb长，或约5.2kb至约6.4kb长，或约5.5kb至约6.5kb长。
在另一个实施方式中，本发明提供了产生包含任何本发明所述的AAV载体的重组腺病毒相关病毒(AAV)颗粒的方法。所述方法包括培养已用任何本发明所述的AAV载体(结合多种AAV cap和rep基因)转染的细胞和从转染细胞的上清液回收重组治疗性AAV病毒颗粒的步骤。
用于重组AAV生产的本发明所述的细胞是对杆状病毒感染敏感的任何细胞类型，包括昆虫细胞，如High Five、Sf9、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf9、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、BM-N、Ha2302、Hz2E5和Ao38。所使用的优选的哺乳动物细胞可以是HEK293、HeLa、CHO、NSO、SP2/0、PER.C6、Vero、RD、BHK、HT 1080、A549、Cos-7、ARPE-19和MRC-5。
本发明还提供了包含任何本发明所述的AAV载体的重组病毒颗粒或者通过本发明先前的方法所产生的任何病毒颗粒。
“AAV病毒粒子”或“AAV病毒颗粒”或“AAV载体颗粒”或“AAV病毒”是指由如本文所述的至少一种AAV衣壳蛋白和蛋白衣壳包裹的多核苷酸AAV载体组成的病毒颗粒。如果所述颗粒包含异源多核苷酸(即除野生型AAV基因组以外的多核苷酸，如要递送至哺乳动物细胞的转基因)，则通常将其称为“AAV载体颗粒”或简单地“AAV载体”。因此，AAV载体颗粒的产生必需包括AAV载体的产生，照此载体包含在AAV载体颗粒内。
如本文所使用的“治疗性AAV病毒”是指包含编码治疗性蛋白的异源多核苷酸的AAV病毒粒子、AAV病毒颗粒、AAV载体颗粒或者AAV病毒。
如本文所使用的“治疗性蛋白”是指具有替换或补偿内源蛋白活性损失或降低的生物活性的多肽。例如，当用于替换患有甲型血友病的对象中的无活性的人因子VIII的活性时，人因子VIII或其功能性片段的功能性拷贝是治疗性蛋白。类似地，功能性人因子IX是患有乙型血友病的对象的治疗性蛋白，并且功能性苯丙氨酸羟化酶(PAH)是苯丙酮酸尿症(PKU)的治疗性蛋白。
如本文所使用的“青少年对象”是指生理学未成熟或未发育的对象。具体地，青少年对象是其中多个组织或器官的细胞仍以大于成熟对象的速度分裂的对象。在某些实施方式中，所述青少年对象是人。在另一个实施方式中，所述青少年对象是小于十八岁的人。在另一个实施方式中，所述青少年对象是小于十二岁的人。本发明的青少年对象包括小于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18岁的人。
如本文所使用的“遗传病症”是指由对象基因组中的一个或多个异常所引起的病症。在优选的实施方式中，遗传病症是单基因的，其表示它是由单个基因的一个或两个拷贝中的异常所导致的。基因组异常破坏基因并导致所破坏的基因所编码的内源蛋白的活性降低或损失，并导致由内源蛋白活性降低或损失所导致的遗传病症的症状。
如本文所使用的“稳定地治疗”或“稳定治疗”是指使用施用于青少年对象的治疗性AAV病毒的治疗性治疗，其中所述青少年对象稳定表达通过治疗性AAV病毒所表达的治疗性蛋白。稳定表达的治疗性蛋白表示蛋白表达临床显著的时间长度。如本文所使用的“临床显著的时间长度”表示以治疗有效的水平表达对青少年对象的生活质量具有有意义的影响的一段时间长度。在某些实施方式中，通过不需要静脉内或皮下施用替代疗法来证明对生活质量的有意义的影响。在某些实施方式中，临床显著的时间长度是表达至少6个月、至少8个月、至少1年、至少2年、至少3年、至少4年、至少5年、至少6年、至少7年、至少8年、至少9年、至少10年或者至少对象终生。
在另一个实施方式中，本发明提供了治疗患有甲型血友病的青少年对象的方法，其包括向所述青少年对象施用治疗有效量的任何本发明的因子VIII AAV载体，或者本发明的病毒颗粒，或者通过本发明所述的方法所产生的病毒颗粒。
在另一个实施方式中，本发明提供了提高对其有需要的青少年对象中的循环FVIII蛋白水平的方法，其包括向所述青少年对象施用任何本发明的AAV载体，或者本发明的病毒颗粒，或者通过本发明所述的方法所产生的病毒颗粒。
在另一个实施方式中，本发明提供了提高对其有需要的青少年对象中的循环因子IX蛋白水平的方法，其包括向所述青少年对象施用任何本发明的AAV载体，或者本发明的病毒颗粒，或者通过本发明所述的方法所产生的病毒颗粒。
在另一个实施方式中，本发明提供了提高对其有需要的对象中的循环PAH蛋白水平的方法，其包括向所述对象施用任何表达PAH蛋白的本发明的AAV载体，或者本发明的病毒颗粒，或者通过本发明所述的方法所产生的病毒颗粒。
在另一个实施方式中，本发明提供了包含如本文所述的治疗性AAV病毒颗粒的药物制剂。更具体地，在某些方面，本发明涉及包含表达因子VIII、因子IX或PAH的重组AAV病毒；缓冲剂；等渗剂；填充剂；和表面活性剂的药物制剂。在特别优选的实施方式中，本发明所述的药物制剂包含AAV5-FVIII-SQ或任何其它本文所述的载体和/或在存储期间稳定至少两周。
在本发明的其它实施方式中，药物制剂包含浓度为约0.1mg/ml至约3mg/ml的磷酸氢二钠，浓度为约0.1mg/ml至约3mg/ml的一水合磷酸二氢钠，浓度为约1mg/ml至约20mg/ml的氯化钠，浓度为约5mg/ml至约40mg/ml的甘露糖醇和浓度为约0.1mg/ml至约4mg/ml的泊洛沙姆188。在特别优选的实施方式中，本发明的药物制剂包含浓度约1.42mg/ml的磷酸氢二钠，浓度约1.38mg/ml的一水合磷酸二氢钠，浓度约8.18mg/ml的氯化钠，浓度约20mg/ml的甘露糖醇和浓度约2mg/ml的泊洛沙姆188。
本发明所述的药物制剂可以处于液体形式并且可以包含约1E12vg/ml至约2E14vg/ml的浓度，更优选地约2E13vg/ml的浓度的AAV治疗性蛋白病毒颗粒。在一个实施方式中，本发明所述的药物制剂对于向患有甲型血友病、乙型血友病或者PKU的人的静脉内施用是有用的。
本发明还涉及用于稳定治疗患有甲型血友病的青少年对象的方法、用途和组合物，其包括向所述对象施用治疗有效量的重组AAV因子VIII病毒的步骤，任选地可以如上所述配制所述病毒。在优选的实施方式中，患有甲型血友病的青少年对象是人。在一个实施方式中，所述重组AAV因子VIII病毒为AAV5-FVIII-SQ。在一个实施方式中，通过静脉内(IV)施用完成所述施用步骤。在本发明的某些方面，所述施用步骤导致至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或以上的IU/dl的因子VIII蛋白在青少年对象的血流中，优选地至少约5IU/dl的因子VIII蛋白在青少年对象的血流中稳定表达。在某些实施方式中，所述施用步骤导致在施用后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多周，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或以上IU/dl的因子VIII蛋白在青少年对象的血流中表达。在某些实施方式中，所述因子VIII蛋白在青少年对象的血流中表达至少约6、7、8、9、10、11、12或更多个月。在某些实施方式中，所述因子VIII蛋白在青少年对象的血流中表达至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多年。在某些实施方式中，向所述青少年对象施用的治疗有效量的AAV因子VIII病毒基于在成年对象中被认为是有效剂量的治疗性AAV病毒的相同绝对数目。治疗有效量可以在至少1E12 vg/kg体重至至少1E15 vg/kg体重的范围内。
在某些实施方式中，除治疗有效量的AAV因子VIII病毒的施用之外，用皮质类固醇预防性、治疗性或两者治疗对象以预防和/或治疗与AAV因子VIII病毒的施用有关的任何肝脏毒性。在一个实施方式中，通过将基线(即因子VIII AAV剂量施用前)丙氨酸转氨酶(ALT)水平与治疗后的ALT水平相比较来测量相关肝脏毒性，其中剂量施用后的ALT水平的升高是相关肝脏毒性的证据。预防性皮质类固醇治疗是指施用皮质类固醇以预防对象中的肝脏毒性和/或预防所测量的ALT水平的升高。治疗性皮质类固醇治疗是指施用皮质类固醇以降低由AVV因子VIII病毒的施用所引起的肝脏毒性和/或降低由AAV因子VIII病毒的施用所引起的对象血流中升高的ALT浓度。在某些实施方式中，预防性或治疗性皮质类固醇治疗可以包括向所述对象施用至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或以上的mg/天的皮质类固醇。在某些实施方式中，可以在至少约3、4、5、6、7、8、9、10周或更多周的连续时间段内发生对象的预防性或治疗性皮质类固醇治疗。
本发明还涉及用于稳定治疗患有乙型血友病的青少年对象的方法、使用和组合物，其包括向所述对象施用治疗有效量的重组AAV因子IX病毒的步骤，任选地可以如上所述配制所述病毒。在优选的实施方式中，患有乙型血友病的青少年对象是人。在一个实施方式中，所述重组AAV因子IX病毒表达R338L因子IX。在一个实施方式中，通过静脉内(IV)施用完成所述施用步骤。在本发明的某些方面，所述施用步骤导致至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或以上的IU/dl的因子IX蛋白在青少年对象的血流中，优选地至少约5IU/dl的因子IX蛋白在青少年对象的血流中稳定表达。在某些实施方式中，所述施用步骤导致在施用后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多周，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或以上IU/dl的因子IX蛋白在青少年对象的血流中表达。在某些实施方式中，所述因子IX蛋白在青少年对象的血流中表达至少约6、7、8、9、10、11、12或更多个月。在某些实施方式中，所述因子IX蛋白在青少年对象的血流中表达至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多年。在某些实施方式中，向所述青少年对象施用的治疗有效量的AAV因子IX病毒基于在成年对象中被认为是有效剂量的治疗性AAV病毒的相同绝对数目。治疗有效量可以在至少1E12vg/kg体重至至少1E15 vg/kg体重的范围内。在某些实施方式中，除治疗有效量的AAV因子IX病毒的施用之外，用皮质类固醇预防性、治疗性或两者治疗对象以预防和/或治疗与AAV因子IX病毒的施用有关的任何肝脏毒性。在一个实施方式中，通过将基线(即因子IX AAV剂量施用前)丙氨酸转氨酶(ALT)水平与治疗后的ALT水平相比较来测量相关肝脏毒性，其中剂量施用后的ALT水平的升高是相关肝脏毒性的证据。预防性皮质类固醇治疗是指施用皮质类固醇以预防对象中的肝脏毒性和/或预防所测量的ALT水平的升高。治疗性皮质类固醇治疗是指施用皮质类固醇以降低由AVV因子IX病毒的施用所引起的肝脏毒性和/或降低由AAV因子IX病毒的施用所引起的对象血流中升高的ALT浓度。在某些实施方式中，预防性或治疗性皮质类固醇治疗可以包括向所述对象施用至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或以上的mg/天的皮质类固醇。在某些实施方式中，可以在至少约3、4、5、6、7、8、9、10周或更多周的连续时间段内发生对象的预防性或治疗性皮质类固醇治疗。
本发明还涉及治疗有效量的重组AAV因子VIII病毒用于制备用于治疗患有甲型血友病的青少年对象的药剂的用途。在某些实施方式中，所述AAV因子VIII病毒是包含p-100ATGB载体的AAV5-FVIII-SQ或病毒。任选地，可以如上所述配制所述药剂。在优选的实施方式中，患有甲型血友病的青少年对象是人。在一个实施方式中，通过静脉内(IV)施用来施用所述药剂。在本发明的一个方面，所述药剂的施用导致在施用后16周或以上，至少约5IU/dl的因子VIII蛋白在对象的血流中，优选地至少约5IU/dl的因子VIII蛋白在青少年对象的血流中表达。在某些实施方式中，所述药剂还包含用于预防和/或治疗与AAV因子VIII病毒的施用有关的任何肝脏毒性的预防性和/或治疗性皮质类固醇。包含预防性或治疗性皮质类固醇治疗的药剂可以包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或以上mg/天的皮质类固醇。在某些实施方式中，可以在至少约3、4、5、6、7、8、9、10周以上的连续时间段内施用包含预防性或治疗性皮质类固醇的药剂。
本发明还涉及治疗有效量的重组AAV因子IX病毒用于制备用于治疗患有乙型血友病的青少年对象的药剂的使用。在某些实施方式中，所述AAV因子IX病毒表达R338L因子IX。任选地，可以如上所述配制所述药剂。在优选的实施方式中，患有乙型血友病的青少年对象是人。在一个实施方式中，通过静脉内(IV)施用来施用所述药剂。在本发明的一个方面，所述药剂的施用导致在施用后16周或以上，至少约5IU/dl的因子IX蛋白在对象的血流中，优选地至少约5IU/dl的因子IX蛋白在青少年对象的血流中表达。在某些实施方式中，所述药剂还包含用于预防和/或治疗与AAV因子IX病毒的施用有关的任何肝脏毒性的预防性和/或治疗性皮质类固醇。包含预防性或治疗性皮质类固醇治疗的药剂可以包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或以上mg/天的皮质类固醇。在某些实施方式中，可以在至少约3、4、5、6、7、8、9、10周以上的连续时间段内施用包含预防性或治疗性皮质类固醇的药剂。
本发明还涉及用于降低患有甲型血友病的青少年对象中的出血发作的出血时间的包含治疗有效量的重组AAV因子VIII病毒的组合物。在一个实施方式中，所述AAV因子VIII病毒为AAV5-FVIII-SQ。任选地，可以如上所述配制所述组合物。在优选的实施方式中，患有甲型血友病的青少年对象是人。可以在出血发作之前施用所述组合物。在一个实施方式中，在出血发作之前，通过静脉内(IV)施用来施用所述组合物。在本发明的一个方面，所述施用步骤导致至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或以上的IU/dl的因子VIII蛋白在青少年对象的血流中，优选地至少约5IU/dl的因子VIII蛋白在青少年对象的血流中表达。在某些实施方式中，所述施用步骤导致在施用后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多周，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或以上IU/dl的因子VIII蛋白在青少年对象的血流中表达。在某些实施方式中，将用于减少出血时间的包含治疗有效量的AAV因子VIII病毒的组合物与如上所述，用于预防和/或治疗与AAV因子VIII病毒的施用有关的任何肝脏毒性的包含预防性和/或治疗性皮质类固醇的组合物一起施用。
本发明还涉及用于降低患有甲型血友病的青少年对象中的出血发作的出血时间的包含治疗有效量的重组AAV因子IX病毒的组合物。在一个实施方式中，所述AAV因子IX病毒表达R338L因子IX。任选地，可以如上所述配制所述组合物。在优选的实施方式中，患有甲型血友病的青少年对象是人。可以在出血发作之前施用所述组合物。在一个实施方式中，在出血发作之前，通过静脉内(IV)施用来施用所述组合物。在本发明的一个方面，所述施用步骤导致至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或以上的IU/dl的因子IX蛋白在青少年对象的血流中，优选地至少约5IU/dl的因子IX蛋白在青少年对象的血流中表达。在某些实施方式中，所述施用步骤导致在施用后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多周，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或以上IU/dl的因子IX蛋白在青少年对象的血流中表达。在某些实施方式中，将用于减少出血时间的包含治疗有效量的AAV因子IX病毒的组合物与如上所述，用于预防和/或治疗与AAV因子IX病毒的施用有关的任何肝脏毒性的包含预防性和/或治疗性皮质类固醇的组合物一起施用。
本发明还涉及治疗有效量的重组AAV PAH病毒用于制备用于治疗患有PKU的青少年对象的药剂的用途。任选地，可以如上所述配制所述药剂。在优选的实施方式中，患有PKU的青少年对象是人。在一个实施方式中，通过静脉内(IV)施用来施用所述药剂。在本发明的一个方面，所述药剂的施用导致在施用后16周或以上，在对象的血流中足以降低青少年对象血流中的苯丙氨酸的浓度的PAH蛋白的表达。在某些实施方式中，所述药剂还包含用于预防和/或治疗与AAV PAH病毒的施用有关的任何肝脏毒性的预防性和/或治疗性皮质类固醇。包含预防性或治疗性皮质类固醇治疗的药剂可以包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或以上mg/天的皮质类固醇。在某些实施方式中，可以在至少约3、4、5、6、7、8、9、10周以上的连续时间段内施用包含预防性或治疗性皮质类固醇的药剂。
本发明还涉及用于诱导功能性治疗性蛋白在对其有需要的青少年对象中的表达的方法，其包括向所述对象施用表达如本文所述的治疗性蛋白的重组AAV病毒的步骤，任选地可以如本文所述配制所述病毒，其中这种施用导致功能性治疗性蛋白的表达升高，或者功能性治疗性蛋白在对象血流中的浓度升高。在优选的实施方式中，有需要的对象是人。在一个实施方式中，通过静脉内(IV)施用完成所述施用步骤。在本发明的一个方面，所述施用步骤导致所述治疗性蛋白在青少年对象血流中表达，优选地达到正常青少年对象中存在的治疗性蛋白水平的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％或者150％。在某些实施方式中，所述施用步骤导致在施用后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多周，在青少年对象的血流中表达至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％或者150％的正常青少年对象中存在的治疗性蛋白水平。
在某些实施方式中，除表达治疗性蛋白的AAV病毒的施用之外，用皮质类固醇预防性、治疗性或两者治疗对象以预防和/或治疗如上所述，与AAV病毒的施用有关的任何肝脏毒性。另外，在本发明所述的任何方法中，在提高所述治疗性蛋白的表达的AAV病毒的施用之后，确定对象血清中是否存在抗-AAV衣壳抗体。如果确定所述对象在血清中具有抗-AAV衣壳抗体，则考虑向在血清中具有抗-AAV衣壳抗体的对象施用有效量的皮质类固醇。
本发明还涉及本发明的AAV病毒用于制备诱导功能性治疗性蛋白在对其有需要的青少年对象中的表达的药剂的使用，其中所述重组AAV病毒表达如本文所述的治疗性蛋白，并且任选地可以如本文所述配制所述药剂，其中这种药剂导致功能性治疗性蛋白的表达升高，或者功能性治疗性蛋白在对象血流中的浓度升高。在优选的实施方式中，将所述药剂施用于有需要的人对象。在一个实施方式中，通过静脉内(IV)施用来施用所述药剂。在本发明的一个方面，所述药剂的施用导致所述治疗性蛋白在青少年对象血流中表达，优选地达到正常青少年对象中存在的治疗性蛋白水平的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％或者150％。在某些实施方式中，所述药剂的施用导致在施用后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多周，在青少年对象的血流中表达至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％或者150％的正常青少年对象中存在的治疗性蛋白水平。
在某些实施方式中，除表达治疗性蛋白的AAV病毒的施用之外，用皮质类固醇预防性、治疗性或两者治疗对象以预防和/或治疗如上所述，与AAV病毒的施用有关的任何肝脏毒性。另外，在本发明所述的任何使用中，在提高所述治疗性蛋白的表达的药剂的施用之后，确定对象血清中是否存在抗-AAV衣壳抗体。如果确定所述对象在血清中具有抗-AAV衣壳抗体，则考虑用于制备向在血清中具有抗-AAV衣壳抗体的对象施用的药剂的有效量的皮质类固醇的使用。
本发明还涉及诱导功能性治疗性蛋白在对其有需要的青少年对象中的表达的组合物，其中所述组合物包含表达如本文所述的治疗性蛋白的重组AAV病毒，任选地可以如本文所述配制所述组合物，其中这种组合物的施用导致功能性治疗性蛋白的表达升高，或者功能性治疗性蛋白在对象血流中的浓度升高。在优选的实施方式中，有需要的对象是人。在一个实施方式中，将所述组合物配制用于静脉内(IV)施用。在本发明的一个方面，所述组合物的施用导致所述治疗性蛋白在青少年对象血流中表达，优选地达到正常青少年对象中存在的治疗性蛋白水平的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％或者150％。在某些实施方式中，所述组合物的施用导致在施用后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多周，在青少年对象的血流中表达至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％或者150％的正常青少年对象中存在的治疗性蛋白水平。
通过阅读本专利说明书，本发明的其它实施方式将对于本领域技术人员是显而易见的。
附图说明
图1A和1B分别提供了研究设计图表。简要地，向对照成年小鼠(8周大)提供单一剂量的AAV5-FVIII-SQ(3.5E13 vg/kg，约8.9E11 vg每只小鼠)。将幼年小鼠(2天大)分成两个群组。一个群组接受单一剂量的总vg与成年小鼠相同的AAV5-FVIII-SQ(8.9E11 vg/小鼠)。另一个群组接受单一剂量的vg/kg与成年小鼠相同的AAV5-FVIII-SQ(3.5E13 vg/kg)。
图2为显示幼体(剂量施用与成年相同的总vg)具有与成年相同的吸收AAV病毒DNA的能力的一组图，如通过左图中的总肝脏因子VIII DNA和右图中的肝脏中的总因子VIIIRNA所示。
图3是显示幼年小鼠的体重(左图)和肝重(右图)两者在AAV5-FVIII-SQ施用后快速升高的一组图。
图4是显示AAV5-FVIII-SQ不会在幼年小鼠中引起肝损伤的图，如通过ALT测量所确定的。
图5是显示幼年小鼠需要与成年相同的总载体基因组量以维持成年中的治疗性因子VIII水平的一组图。左图显示了随时间的血浆因子VIII浓度，并且右图显示了剂量施用了与成年相同的总载体基因组量(8.9E11 vg/小鼠，其相当于约4.5E14 vg/kg)或与成年相同的vg/体重(3.5E13 vg/kg)的幼年小鼠中的总循环因子VIII。在两者中，将这些值与用3.5E13 vg/kg处理的成年相比较。通过将血浆FVIII浓度乘以估计血容量(在这种情况下，估计血容量是体重的10％)来确定总循环FVIII。
图6A&6B。图6A是来自用AAV5-FVIII-SQ处理的成年小鼠的肝脏切片中的AAV5衣壳的免疫组织化学分析。图6B是来自用AAV5-FVIII-SQ处理的幼年小鼠的AAV5衣壳的免疫印迹分析。
图7是显示总体研究设计的表，其将确定用于在PKU对象的肝脏中表达PAH的最优条件。
图8A-8C提供了在用2×1014vg/kg AAV5-PAH或载体剂量施用之前或之后8周，每组AAV-和载体治疗的所有ENU小鼠的体重(g；平均值±SEM)。图8A提供了治疗之前的体重。图8B提供了剂量施用后4周的体重。图8C提供了剂量施用后8周的体重。如通过单因素方差分析所确定的，*p<0.05，****p，0.0001。
图9A-9B提供了在用2×1014vg/kg AAV5-PAH或载体剂量施用之前或之后8周，每组AAV-和载体治疗的所有ENU小鼠的血浆PHE浓度(μM；平均值±SEM)。图9A提供了剂量施用后4周的血浆PHE浓度。图9B提供了剂量施用后8周的血浆PHE浓度。如通过单因素方差分析所确定的，*p<0.05，****p，0.0001。
发明详述
本发明提供了编码功能活性的治疗性蛋白的AAV载体(例如，完全包装的AAV因子VIII载体、AAV因子IX载体和AAV PAH载体)。本发明的重组AAV治疗性蛋白载体具有改善的转基因表达，和改善的AAV病毒产率以及简化的纯化。向治疗性蛋白-编码区引入一个或多个内含子提高了表达。重新配置增强子的数目和位置也提高表达。
AAV载体
如本文所使用的，术语“AAV”是腺病毒相关病毒的标准缩写。腺病毒相关病毒是仅在其中通过共感染辅助病毒提供某些功能的细胞中生长的单链DNA细小病毒。目前存在13种已鉴定的AAV血清型。AAV的一般信息和综述可见于(例如)Carter,1989,Handbook ofParvoviruses,1卷,169-228页和Berns,1990,Virology,1743-1764页,Raven Press,(NewYork)。然而，完全预期这些相同原理将适用于其它AAV血清型，因为熟知多种血清型在结构上和功能上，甚至在遗传水平上是相当密切相关的。(参见，例如，Blacklowe,1988,Parvoviruses and Human Disease的165-174页,J.R.Pattison主编；和Rose,Comprehensive Virology 3:1-61(1974))。例如，所有AAV血清型明显显示出通过同源rep基因介导的非常类似的复制性质；并且全部具有3种相关衣壳蛋白。通过显示血清型之间沿基因组长度的广泛交叉杂交的异源双链分析；和对应于“末端反向重复序列”(ITR)的位于末端的类似自退火节段的存在，进一步表明了相关程度。类似的感染性类型也表明每种血清型中的复制功能处于类似的调控控制下。
如本文所使用的“AAV载体”是指包含侧接AAV末端重复序列(ITRs)并且可操作性地连接至一个或多个表达控制元件的一个或多个所关心的多核苷酸(或转基因)的载体。当在已被编码和表达rep和cap基因产物的载体转染的宿主细胞中存在时，这些AAV载体可以复制并包装到感染性病毒颗粒中。
“AAV病毒粒子”或“AAV病毒颗粒”或“AAV载体颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白和蛋白衣壳包裹的多核苷酸AAV载体组成的病毒颗粒。如果所述颗粒包含异源多核苷酸(即除野生型AAV基因组以外的多核苷酸，如要递送至哺乳动物细胞的转基因)，则通常将其称为“AAV载体颗粒”或简单地“AAV载体”。因此，AAV载体颗粒的产生必需包括AAV载体的产生，照此载体包含在AAV载体颗粒内。
AAV“rep”和“cap”基因分别是编码复制和衣壳蛋白包裹蛋白的基因。已在目前为止检查的所有AAV血清型中发现了AAV rep和cap基因，并且在本文中和在所引用的参考文献中描述了所述基因。在野生型AAV中，rep和cap基因通常在病毒基因组中彼此邻近存在(即它们作为邻接或重叠转录单元“偶联”在一起)，并且它们通常在AAV血清型中是保守的。AAV rep和cap基因还单独或共同称为“AAV包装基因”。根据本发明的AAV cap基因编码能够在存在rep和腺辅助病毒功能(adeno helper function)的情况下包装AAV载体并且能够结合靶标细胞受体的Cap蛋白。在一些实施方式中，AAV cap基因编码具有来源于特定AAV血清型的氨基酸序列的衣壳蛋白。
用于产生AAV的AAV序列可以来源于任何AAV血清型的基因组。一般地，AAV血清型具有在氨基酸和核酸水平上具有显著同源性的基因组序列，提供了类似的遗传功能组，产生了基本上物理和功能等价的病毒粒子，并且通过几乎相同的机制复制和组装。对于AAV血清型的基因组序列和基因组相似性的讨论(参见，例如，GenBank登录号U89790；GenBank登录号J01901；GenBank登录号AF043303；GenBank登录号AF085716；Chiorini等人,J.Vir.(1997)71卷,6823-6833页；Srivastava等人,J.Vir.(1983)45卷,555-564页；Chiorini等人,J.Vir.(1999)73卷,1309-1319页；Rutledge等人,J.Vir.(1998)72卷,309-319页；和Wu等人,J.Vir.(2000)74卷,8635-8647页)。
所有已知的AAV血清型的基因组组织是非常类似的。AAV的基因组是长度小于约5,000个核苷酸(nt)的直链、单链DNA分子。末端反向重复(ITR)侧接非结构复制(Rep)蛋白和结构(VP)蛋白的独特编码核苷酸序列。VP蛋白形成衣壳。末端145个nt是自互补的并且组织，从而可以形成形成了T形发夹的能量稳定的分子内双螺旋。这些发夹结构起到病毒DNA复制起点的作用，其用作细胞DNA聚合酶复合物的引物。Rep基因编码Rep蛋白，Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。Rep78和Rep68是从p5启动子转录的，Rep52和Rep40是从p19启动子转录的。cap基因编码VP蛋白，VP1、VP2和VP3。cap基因是从p40启动子转录的。在本发明的载体中使用的ITR可以对应于与相关cap基因相同的血清型，或者它们可以是不同的。在特别优选的实施方式中，在本发明的载体中使用的ITR对应于AAV2血清型，并且cap基因对应于AAV5血清型。
在一些实施方式中，编码AAV衣壳蛋白的核酸序列可操作性地连接至用于在特定细胞类型，如Sf9或HEK细胞中表达的表达控制序列。本领域技术人员已知用于在昆虫宿主细胞或哺乳动物宿主细胞中表达外源基因的技术可以用于实践本发明。例如，在Summersand Smith(1986)A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect CultureProcedures,Texas Agricultural Experimental Station Bull.No.7555,CollegeStation,Tex.；Luckow(1991)In Prokop等人,Cloning and Expression of HeterologousGenes in Insect Cells with Baculovirus Vectors'Recombinant DNA Technology andApplications,97-152；King,L.A.and R.D.Possee(1992)The baculovirus expressionsystem,Chapman and Hall,United Kingdom；O'Reilly,D.R.,L.K.Miller,V.A.Luckow(1992)Baculovirus Expression Vectors:A Laboratory Manual,New York；W.H.Freemanand Richardson,C.D.(1995)Baculovirus Expression Protocols,Methods inMolecular Biology,39卷；美国专利No.4,745,051；US2003148506；和WO 03/074714中描述了用于分子工程和多肽在昆虫细胞中表达的方法，以上所有文献以其全部内容作为参考并入本文。特别适合于编码AAV衣壳蛋白的核苷酸序列的转录的启动子是(例如)多面体启动子。然而，在昆虫细胞中具有活性的其它启动子在本领域中是已知的，例如，p10、p35或IE-1启动子，并且还考虑了上述参考中所述的其它启动子。
昆虫细胞用于异源蛋白质表达的用途，以及将核酸引入这些细胞中的方法，如载体，例如，昆虫-细胞相容性载体，和维持这些细胞培养的方法已被很好地描述。(参见，例如，METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Richard主编,Humana Press,N J(1995)；O'Reilly等人,BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS,A LABORATORY MANUAL,Oxford Univ.Press(1994)；Samulski等人,J.Vir.(1989)63卷,3822-3828页；Kajigaya等人,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA(1991)88卷,4646-4650页；Ruffing等人,J.Vir.(1992)66卷,6922-6930卷；Kirnbauer等人,Vir.(1996)219卷,37-44页；Zhao等人,Vir.(2000)272卷,382-393页；和美国专利No.6,204,059)。在一些实施方式中，在昆虫细胞中编码AAV的核酸构建体是昆虫细胞-相容性载体。如本文所使用的“昆虫细胞-相容性载体”或“载体”是指能够生产性转化或转染昆虫或昆虫细胞的核酸分子。示例性的生物载体包括质粒、直链核酸分子和重组病毒。可以使用任何载体，只要它是昆虫细胞-相容的。所述载体可以整合到昆虫细胞基因组中，但是所述载体在昆虫细胞中的存在不需要是持久的，并且还包括了瞬时附加型载体。可以通过任何已知的方式引入所述载体，例如，通过细胞的化学处理、电穿孔或感染。在一些实施方式中，所述载体是杆状病毒、病毒载体或质粒。在更优选的实施方式中，所述载体是杆状病毒，即所述构建体是杆状病毒载体。在以上有关昆虫细胞的分子工程所引用的参考文献中描述了杆状病毒载体和它们的使用方法。
杆状病毒是节肢动物的包膜DNA病毒，它们中的两个成员是熟知的用于在细胞培养物中产生重组蛋白的表达载体。杆状病毒具有环状双链基因组(80-200kbp)，其可以工程化以允许将大的基因组内容物递送至特定细胞。用作载体的病毒通常为苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(AcMNPV)或家蚕(Bm)NPV。
杆状病毒通常用于表达重组蛋白的昆虫细胞的感染。具体地，可以如下所述实现异源基因在昆虫中的表达，例如，美国专利No.4,745,051；Friesen等人(1986)；EP 127,839；EP 155,476；Vlak等人(1988)；Miller等人(1988)；Carbonell等人(1988)；Maeda等人(1985)；Lebacq-Verheyden等人(1988)；Smith等人(1985)；Miyajima等人(1987)；和Martin等人(1988)。可以用于蛋白质生产的多种杆状病毒株和变体以及相应的许可的昆虫宿主细胞描述于Luckow等人,(1988)；Miller等人(1986)；Maeda等人(1985)和McKenna(1989)。
用于产生重组AAV的方法
本发明公开提供了用于在昆虫或哺乳动物细胞中产生重组AAV的材料和方法。在一些实施方式中，所述病毒构建体还包含启动子和启动子下游的限制性位点以允许编码一种或多种所关心的蛋白的多核苷酸的插入，其中所述启动子和限制性位点位于5'AAV ITR的下游和3'AAV ITR上游。在一些实施方式中，所述病毒构建体还包含位于限制性位点下游和3'AAV ITR上游的转录后调控元件。在一些实施方式中，所述病毒构建体还包含插入在所述限制性位点并且与启动子可操作性地连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含所关心的蛋白的编码区。如技术人员将理解的，在本发明申请中公开的AAV载体中的任一种可以作为病毒构建体在所述方法中使用以产生重组AAV。
在一些实施方式中，通过包含腺病毒或杆状病毒辅助基因的一个或多个辅助质粒或辅助病毒提供辅助功能。腺病毒或杆状病毒辅助基因的非限制性实例包括(但不限于)E1A、E1B、E2A、E4和VA，其可以提供对于AAV包装的辅助功能。
AAV的辅助病毒在本领域中是已知的并且包括(例如)来自腺病毒科(Adenoviridae)和疹病毒科(Herpesviridae)的病毒。AAV的辅助病毒的实例包括(但不限于)美国专利公开No.20110201088(其公开内容作为参考并入本文)中所述的SAdV-13辅助病毒和SAdV-13-样辅助病毒、辅助载体pHELP(Applied Viromics)。技术人员将理解可以在本文中使用可以为AAV提供足够的辅助功能的任何AAV的辅助病毒或辅助质粒。
在一些实施方式中，AAV cap基因存在于质粒中。所述质粒还可以包含可以或可以不对应于与cap基因相同的血清型的AAV rep基因。可以在本文中使用来自任何AAV血清型(包括(但不限于)AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13和其任何变体)的cap基因和/或rep基因以产生重组AAV。在一些实施方式中，AAV cap基因编码来自血清型1、血清型2、血清型4、血清型5、血清型6、血清型7、血清型8、血清型9、血清型10、血清型11、血清型12、血清型13或其变体的衣壳。
在一些实施方式中，可以用辅助质粒或辅助病毒转染昆虫或哺乳动物细胞，所述病毒构建体和所述质粒编码AAV cap基因；并且可以在共转染后的多个时间点收集重组AAV病毒。例如，可以在共转染后约12小时，约24小时，约36小时，约48小时，约72小时，约96小时，约120小时或者任何这两个时间点之间的时间收集重组AAV病毒。
还可以使用本领域中已知的适合于产生感染性重组AAV的任何常规方法产生重组AAV。在一些情况下，可以通过使用稳定表达AAV颗粒生产的一些必需组分的昆虫或哺乳动物细胞产生重组AAV。例如，可以将包含AAV rep和cap基因和可选择标志物，如新霉素抗性基因的质粒(或多个质粒)整合到细胞基因组中。然后，可以用辅助病毒(例如，提供辅助功能的腺病毒或杆状病毒)包含5'和3'AAV ITR(并且如果需要，编码异源蛋白质的核苷酸序列)的病毒载体共感染昆虫或哺乳动物细胞。这种方法的优势在于所述细胞是可选择的并且适合于重组AAV的大规模生产。作为另一种非限制性实例，腺病毒或杆状病毒，而不是质粒可以用于将rep和cap基因引入到包装细胞中。作为另一种非限制性实例，含有5'和3'AAVLTR和rep-cap基因的病毒载体两者可以稳定整合到生产细胞的DNA中，并且可以通过野生型腺病毒提供辅助功能以产生重组AAV。
在AAV生产中使用的细胞类型
可以使用允许生产AAV或生物产品并且可以维持培养的任何无脊椎动物细胞类型来生产包含本发明的AAV载体的病毒颗粒。例如，所使用的昆虫细胞系可以来自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)，如SF9、SF21、SF900+、果蝇细胞系、蚊子细胞系，例如，白纹伊蚊(Aedes albopictus)来源的细胞系、家蚕细胞系，例如，家蚕(Bombyx mori)细胞系、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞系，如High Five细胞或鳞翅目(Lepidoptera)细胞系，如黑巫婆飞蛾(Ascalapha odorata)细胞系。优选的昆虫细胞为来自对杆状病毒感染敏感的昆虫种的细胞，其包括High Five、Sf9、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf9、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、BM-N、Ha2302、Hz2E5和Ao38。
杆状病毒是节肢动物的包膜DNA病毒，它们中的两个成员是熟知的用于在细胞培养物中产生重组蛋白的表达载体。杆状病毒具有环状双链基因组(80-200kbp)，其可以工程化以允许将大的基因组内容物递送至特定细胞。用作载体的病毒通常为苜蓿丫纹夜蛾核多角体(Autographa californica)病毒(AcMNPV)或家蚕(Bombyx mori)(Bm-NPV)(Kato等人,2010)。
杆状病毒通常用于表达重组蛋白的昆虫细胞的感染。具体地，可以如下所述实现异源基因在昆虫中的表达，例如，美国专利No.4,745,051；Friesen等人(1986)；EP 127,839；EP 155,476；Vlak等人(1988)；Miller等人(1988)；Carbonell等人(1988)；Maeda等人(1985)；Lebacq-Verheyden等人(1988)；Smith等人(1985)；Miyajima等人(1987)；和Martin等人(1988)。可以用于蛋白质生产的多种杆状病毒株和变体以及相应的许可的昆虫宿主细胞描述于Luckow等人,(1988)；Miller等人(1986)；Maeda等人(1985)和McKenna(1989)。
在本发明的另一个方面，还使用允许AAV复制或生物产品生产并且可以维持培养的任何哺乳动物细胞类型来实施本发明所述的方法。所使用的优选的哺乳动物细胞可以是HEK293、HeLa、CHO、NSO、SP2/0、PER.C6、Vero、RD、BHK、HT 1080、A549、Cos-7、ARPE-19和MRC-5细胞。
药物制剂
在其它实施方式中，本发明涉及用于向患有遗传病症的对象施用的治疗性蛋白表达AAV载体/病毒粒子的药物制剂。在某些方面，本发明所述的药物制剂是包含由本文所公开的载体所产生的重组治疗性蛋白表达AAV病毒粒子的液体制剂，其中重组AAV病毒粒子在所述制剂中的浓度可以广泛不同。在某些实施方式中，重组AAV病毒粒子在所述制剂中的浓度可以在1E12 vg/ml至2E16 vg/ml的范围内。在特别优选的实施方式中，重组AAV病毒粒子在所述制剂中的浓度为约2E13 vg/ml。在优选的实施方式中，存在于所述制剂中的重组AAV病毒粒子来源于AAV5-FVIII-SQ。在本发明的其它优选实施方式中，存在于所述制剂中的重组AAV病毒粒子来源于表达因子IX或表达PAH的AAV载体。
在其它方面，本发明所述的AAV药物制剂包含一种或多种药物可用的赋形剂以提供具有对于储存和/或用于遗传病症治疗的向对象的施用有利的性质的制剂。在某些实施方式中，本发明所述的药物制剂能够在-65℃储存至少2周，优选地至少4周，更优选地至少6周，更优选地至少约8周的一段时间，而在稳定性方面无可检测的变化。就此而言，术语“稳定的”是指存在于所述制剂中的重组AAV病毒在储存期间基本保留了其物理稳定性、化学稳定性和/或生物活性。在本发明的某些实施方式中，存在于所述药物制剂中的重组AAV病毒在-65℃储存确定的一段时间期间，保留了至少约80％的其在人患者中的生物活性，更优选地至少约85％、90％、95％、98％或99％其在青少年人对象中的生物活性。
在某些方面，包含重组AAV病毒粒子的制剂还包含一种或多种缓冲剂。例如，在多个方面，本发明所述的制剂包含浓度约0.1mg/ml至约3mg/ml，约0.5mg/ml至约2.5mg/ml，约1mg/ml至约2mg/ml或者约1.4mg/ml至约1.6mg/ml的磷酸二钠。在特别优选的实施方式中，本发明所述的AAV制剂包含约1.42mg/ml的磷酸氢二钠(干的)。可以在本发明所述的重组AAV制剂中使用的另一种缓冲剂为一水合磷酸二氢钠，在一些实施方式中，其以约0.1mg/ml至约3mg/ml，约0.5mg/ml至约2.5mg/ml，约1mg/ml至约2mg/ml或者约1.3mg/ml至约1.5mg/ml的浓度使用。在特别优选的实施方式中，本发明所述的AAV制剂包含约1.38mg/ml的一水合磷酸二氢钠。在本发明的更特别优选的实施方式中，本发明所述的重组AAV制剂包含约1.42mg/ml的磷酸氢二钠和约1.38mg/ml的一水合磷酸二氢钠。
在另一个方面，本发明所述的重组AAV制剂可以包含一种或多种等渗剂，如氯化钠，其优选地处于约1mg/ml至约20mg/ml，例如，约1mg/ml至约10mg/ml，约5mg/ml至约15mg/ml，或者约8mg/ml至约20mg/ml的浓度。在特别优选的实施方式中，本发明所述的制剂包含约8.18mg/ml的氯化钠。本领域中已知的其它缓冲剂和等渗剂是适合的并且可以常规用于本发明公开所述的制剂中的使用。
在另一个方面，本发明所述的重组AAV制剂可以包含一种或多种填充剂。示例性的填充剂无限制地包括甘露糖醇、蔗糖、右旋糖酐、乳糖、海藻糖和聚维酮(PVP K24)。在某些优选实施方式中，本发明所述的制剂包含甘露糖醇，其可以以约5mg/ml至约40mg/ml，或者约10mg/ml至约30mg/ml，或者约15mg/ml至约25mg/ml的量存在。在特别优选的实施方式中，甘露糖醇以约20mg/ml的浓度存在。
在另一个方面，本发明所述的重组AAV制剂可以包含一种或多种表面活性剂，其可以是非离子型表面活性剂。示例性的表面活性剂包括离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂及其组合。例如，所述表面活性剂可以(无限制地)为吐温80(也称为聚山梨酯80，或其化学名为聚环氧乙烷单油酸脱水山梨糖醇酯)、十二烷基磺酸钠、硬脂酸钠、月桂基硫酸铵、TRITON AG 98(Rhone-Poulenc)、泊洛沙姆407、泊洛沙姆188等，及其组合。在特别优选的实施方式中，本发明所述的制剂包含泊洛沙姆188，其可以以约0.1mg/ml至约4mg/ml，或者约0.5mg/ml至约3mg/ml，约1mg/ml至约3mg/ml，约1.5mg/ml至约2.5mg/ml或者约1.8mg/ml至约2.2mg/ml的浓度存在。在特别优选的实施方式中，泊洛沙姆188以约2.0mg/ml的浓度存在。
在本发明特别优选的实施方式中，本发明的药物制剂包含以液体溶液配制的AAV5-FVIII-SQ，所述液体溶液包含约1.42mg/ml的磷酸氢二钠、约1.38mg/ml的一水合磷酸二氢钠、约8.18mg/ml的氯化钠、约20mg/ml的甘露糖醇和约2mg/ml的泊洛沙姆188。
本发明公开所述的含有表达重组治疗性蛋白的AAV病毒的制剂是稳定的并且可以长期储存而质量、效力或纯度无不可接受的改变。在一个方面，所述制剂在约5℃(例如，2℃至8℃)的温度下稳定至少1个月，例如，至少1个月、至少3个月、至少6个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或更长时间。在另一个方面，所述制剂在小于或等于约-20℃的温度下稳定至少6个月，例如，至少6个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月、至少36个月或更长时间。在另一个方面，所述制剂在小于或等于约-40℃的温度下稳定至少6个月，例如，至少6个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月、至少36个月或更长时间。在另一个方面，所述制剂在小于或等于约-60℃的温度下稳定至少6个月，例如，至少6个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月、至少36个月或更长时间。
治疗方法
在某些实施方式中，本发明涉及用于治疗患有遗传病症的对象的方法，其包括向该对象施用治疗有效量的表达治疗性蛋白的AAV载体或包含所述载体的药物组合物。在这种情况下，“治疗有效量”是在施用后导致所述治疗性蛋白以足以至少部分并且优选地完全改善所述遗传病症症状的水平表达的AAV载体的量。
例如，本发明涉及治疗疾病或病症的方法，所述病症包括癌症，如癌瘤、肉瘤、白血病、淋巴瘤；和自体免疫疾病，如多发性硬化。癌瘤的非限制性实例包括食道癌；肝细胞癌；基底细胞癌、鳞状细胞癌(各种组织)；膀胱癌，包括移行细胞癌；支气管癌；结肠癌；结肠直肠癌；胃癌；肺癌，包括小细胞癌和肺非小细胞癌；肾上腺皮质癌；甲状腺癌；胰腺癌；乳腺癌；卵巢癌；前列腺癌；腺癌；汗腺癌；皮脂腺癌；乳头状癌；乳头状腺癌；囊腺癌；髓样癌；肾细胞癌；原位管癌或胆管癌；绒毛膜癌；精原细胞瘤；胚胎癌；胚胎性癌肉瘤；宫颈癌；子宫癌；睾丸癌；成骨性癌；上皮性癌；和鼻咽癌。肉瘤的非限制性实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、骨原性肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤和其它软组织肉瘤。实体瘤的非限制性实例包括神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、寡枝神经胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。白血病的非限制性实例包括慢性骨髓增生性综合征；急性髓性白血病；慢性淋巴细胞性白血病，包括B细胞CLL、T细胞CLL、幼淋巴细胞白血病和毛细胞白血病；和急性淋巴母细胞性白血病。淋巴瘤的实例包括(但不限于)B细胞淋巴瘤，如伯基特氏淋巴瘤；霍奇金淋巴瘤；等。可以使用AAV载体、重组病毒和本文所公开的方法治疗的疾病的其它非限制性实例包括遗传病症，其包括镰刀形红细胞贫血症、囊性纤维化、溶酶体酸性脂肪酶(LAL)缺乏症1、氨基己糖苷A酶缺乏病、苯丙酮酸尿症、黏多糖贮积症、糖原贮积病(GSD，例如，I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII和XIV型GSD)、半乳糖血、肌营养不良(例如，杜氏肌肉营养不良症)、威尔森氏症、遗传性血管性水肿(HAE)、α1抗胰蛋白酶缺乏、法布里病、戈谢病和血友病，如甲型血友病(经典型血友病)和乙型血友病(克里斯马斯氏病)。另外，AAV载体、重组病毒和本文所公开的方法可以用于可以通过转基因在肝脏中的局部表达或者通过从肝脏或肝细胞分泌的蛋白的表达治疗的其它病症。
在优选的实施方式中，本发明涉及用于降低患有甲型血友病的青少年对象中出血发作期间的出血时间的方法，其包括向该青少年对象施用治疗有效量的AAV FVIII载体、重组AAV FVIII病毒或包含它们的药物组合物。就此而言，关于甲型血友病的治疗或在降低患有甲型血友病的对象中的出血发作期间的出血时间的方法中的使用，“治疗有效量”是指能够引起以下作用中的一种或多种的量：(1)在一定程度上，减少、抑制或预防甲型血友病的一种或多种生理学症状，其包括(例如)瘀伤、关节疼痛或肿胀、长时间头痛、呕吐或疲劳，(2)改善凝血能力，(3)降低出血发作期间的整体出血时间，(4)导致对象血浆中功能性FVIII蛋白的浓度或活性的可测量的升高的施用和/或(5)在一定程度上，缓解与所述病症有关的一种或多种症状。
出于如本文所述的治疗目的，可以根据经验并以常规方式确定AAV载体或病毒或者包含它们的药物组合物的“治疗有效量”。在特别优选的实施方式中，用于青少年对象的治疗的治疗有效量的治疗性AAV病毒是已确定、计算或估计以在成年对象中产生治疗反应的病毒颗粒的相同绝对数目。因此，本发明提供了当以vg/kg体重测量时，以比成年人高的剂量向青少年对象施用AAV载体。在一些实施方式中，这对应于当作为vg/kg表示时，向成年人提供的AAV载体的量的2至15倍。然而，在某些实施方式中，“治疗有效量”的重组AAV病毒在约1E12 vg/kg体重至约1E14 vg/kg体重，优选地约6E12 vg/kg体重至约6E13 vg/kg体重的范围内。在优选的实施方式中，治疗有效量的重组AAV病毒为约2E13 vg/kg体重。在另一个优选的实施方式中，治疗有效量的重组AAV病毒为约6E13 vg/kg体重。
可以通过多种已知的施用技术将本发明的重组AAV载体/病毒施用于青少年对象，优选地青少年哺乳动物对象，更优选地，青少年人对象。在优选的实施方式中，作为单个弹丸或在长时间段(其可以是至少约1、5、10、15、30、45、60、75、90、120、150、180、210或240分钟或更长)内，通过静脉注射施用重组AAV基因疗法病毒。在优选的实施方式中，所施用的重组AAV病毒表达因子VIII、因子IX或PAH。在本发明的特别优选的实施方式中，所施用的重组AAV病毒为AAV5-FVIII-SQ
本发明的重组AAV FVIII载体/病毒或者包含它们的药物制剂的施用优选地导致与施用前对象血浆中存在的功能性FVIII蛋白活性的量相比，对象血浆中功能性FVIII蛋白活性升高至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 12、13、14、15或更多的IU/dl。在某些实施方式中，本发明的重组AAV FVIII载体/病毒或包含它们的药物制剂的施用导致至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或以上IU/dl的功能性FVIII蛋白活性在对象血浆中表达。就此而言，对于FVIII活性，术语“IU”或“国际单位”是很好地理解和接受的术语，其中1IU FVIII活性相当于1mL正常人血浆中的FVIII的量。可以通过一些熟知和接受的测定定量确定血浆中的FVIII活性，例如，活化部分凝血活酶时间(APPT)法(参见，例如，Miletich JP:Activatedpartial thromboplastin time.In Williams Hematology.第5版.E Beutler,M ALichtman,B A Coller,T J Kipps主编.New York,McGraw-Hill,1995,L85-86页,Greavesand Preston,Approach to the bleeding patient.In Hemostasis and Thrombosis:Basic Principles and Clinical Practice.第4版.R W Colman,J Hirsh,V J Marder等人主编,Philadelphia,JB Lippincott Co,2001,1197-1234页和Olson等人,(1998)Arch.Pathol.Lab.Med.,122卷,782-798页)或FXa显色测定(Harris等人,(2011)Thromb.Res.,128卷,125-129页)。
在本发明的其它实施方式中，可以通过熟知和接受的技术测量对象中的出血时间，例如，Ivy法(参见，例如，Ivy等人,(1935)Surg.Gynec.Obstet.,60卷,781页(1935)和Ivy等人,(1941)J.Lab.Clin.Med.,26卷,1812页)或Duke法(参见，例如，Duke等人,(1910)JAMA,卷55,1185页)。对象中的“出血发作”是指导致对象中出血的外部或内部创伤，并且一般包括从创伤至血液凝块形成的时间段。
在涉及表达PAH的AAV载体治疗青少年对象中的PKU的本发明的方面中，可以通过测量所治疗的青少年对象血液中的苯丙氨酸水平来监测AAV载体的有效性。用于确定苯丙氨酸的循环水平的准确定量测定在本领域中是熟知的并且包括荧光测定(参见，McCaman,M.W.and Robins,E.,(1962)J.Lab.Clin.Med.,59卷,885-890页)；基于薄层色谱法的测定(参见，Tsukerman,G.L.(1985)Laboratornoe delo,6卷,326-327页)；酶促测定(参见，LaDu,B.N.,等人(1963)Pediatrics,31卷,39-46页；和Peterson,K.,等人(1988)Biochem.Med.Metab.Biol.,39卷,98-104页)；使用高压液相色谱法(HPLC)的方法(参见，Rudy,J.L.,等人(1987)Clin.Chem.,33卷,1152-1154页)；和高通量自动化方法(参见，Hill,J.B.,等人(1985)Clin.Chem.,5卷,541-546页)。
在一些情况下，本发明的AAV病毒的施用可以导致可观察程度的肝脏毒性。可以通过多种熟知和常用的技术，例如，测量AAV施用之前(即基线)和AAV施用之后对象血流中的某些肝-相关酶(例如，丙氨酸转氨酶，ALT)的浓度来测量肝脏毒性。AAV施用后ALT浓度的可观察的升高(与施用之前相比)指示了药物-引起的肝脏毒性。在本发明的某些实施方式中，除治疗有效量的AAV病毒的施用之外，可以用皮质类固醇预防性、治疗性或两者治疗对象以预防和/或治疗与AAV病毒的施用有关的任何肝脏毒性。
“预防性”皮质类固醇治疗是指施用皮质类固醇以预防对象中的肝脏毒性和/或预防所测量的ALT水平的升高。“治疗性”皮质类固醇治疗是指施用皮质类固醇以降低由AVV因子的施用所引起的肝脏毒性和/或降低由AAV病毒的施用所引起的对象血流中升高的ALT浓度。在某些实施方式中，预防性或治疗性皮质类固醇治疗可以包括向所述对象施用至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或以上的mg/天的皮质类固醇。在某些实施方式中，可以在至少约3、4、5、6、7、8、9、10周或更多周的连续时间段内发生对象的预防性或治疗性皮质类固醇治疗。在本文所述的方法中使用的皮质类固醇包括任何已知的或常用的皮质类固醇，其包括(例如)地塞米松、泼尼松、氟氢可的松、氢化可的松等。
抗-AAV抗体的检测
为了使得用全身性AAV-介导的治疗性基因转移的成功肝转导的可能性最大化，如上所述在治疗方案中向人患者施用AAV载体之前，可以对预期患者评价能够阻断细胞转导或另外降低治疗方案的整体效率的抗-AAV衣壳抗体的存在。这些抗体可以存在于预期患者的血清中并且可以抗任何血清型的AAV衣壳。在一个实施方式中，已存在的抗体所抗的血清型为AAV5。
检测已存在的AAV免疫性的方法是本领域熟知和常用的并且包括总抗-衣壳抗体(TAb)的细胞-基体外转导抑制(TI)测定、体内(例如，小鼠中)TI测定和ELISA-基检测(参见，例如，Masat等人,Discov.Med.,15卷,379-389页和Boutin等人,(2010)Hum.GeneTher.,21卷,704-712页)。TI测定可以使用先前已引入AAV-诱导型报告载体的宿主细胞。所述报告载体可以包含可诱导的报告基因，如GFP等，通过AAV病毒对宿主细胞的转导诱导了它们的表达。存在于人血清中的能够防止/降低宿主细胞转导的抗-AAV衣壳抗体将借此降低所述系统中报告基因的整体表达。因此，可以使用这些测定来检测人血清中能够通过治疗性FVIII AAV病毒防止/降低细胞转导的抗-AAV衣壳抗体的存在。
检测抗-AAV衣壳抗体的TAb测定可以使用固相-结合的AAV衣壳作为“捕获剂”，在其上使人血清流过，借此使得存在于血清中的抗-衣壳抗体结合至固相-结合的衣壳“捕获剂”。一旦清洗以除去非特异性结合，可以使用“检测剂”来检测结合至捕获剂的抗-衣壳抗体的存在。所述检测剂可以是抗体、AAV衣壳等，并且可以可检测地标记以帮助结合的抗-衣壳抗体的检测和定量。在一个实施方式中，用使用电化学发光技术和设备可以检测的钌或钌-复合物标记检测剂。
可以使用相同的上述方法来评价和检测抗-AAV衣壳免疫应答在先前用所关心的治疗性AAV病毒治疗的患者中的产生。照此，这些技术不仅可以用于评价用治疗性AAV病毒治疗之前抗-AAV衣壳抗体的存在，它们还可以用于评价和测量施用后对所施用的治疗性AAV病毒的免疫应答的诱导。照此，本发明考虑了将用于检测人血清中抗-AAV衣壳抗体的技术和用于治疗甲型血友病的治疗性AAV病毒的施用相结合的方法，其中用于检测人血清中的抗-AAV衣壳抗体的技术可以在治疗性AAV病毒的施用之前或之后进行。
通过考虑以下说明性实例，将理解本发明的其它方面和优势。
实施例
实施例1
AAV年龄比较研究
为了检查幼年小鼠对AAV介导的基因疗法的反应能力，将两个剂量的表达人因子VIII的AAV(AAV5-FVIII-SQ)施用于两个幼年(2天大)Rag2/FVIII双敲除小鼠(DKO)群组。所有剂量均通过尾静脉静脉内施用。将成年(8周大)Rag2/FVIII DKO小鼠用作对照并用3.5E13 vg/kg(在成年中，对应于8.9E11 vg/小鼠)处理。用与成年相同的剂量/体重(即3.5E13 vg/kg)处理群组1的幼年小鼠(2天大)，而用与成年相同的绝对vg/小鼠(即8.9E11vg/小鼠，对应于2天大小鼠中的4.5E14 vg/kg)处理群组2的幼年小鼠(2天大)。图1A和1B提供了研究设计和采样时间点。在AAV施用后，对幼年小鼠组的研究很好地延续至成年(超过8周大)。
为了确定幼年肝细胞吸收AAV5-FVIII-SQ的能力，测量了所处理的幼年和成年小鼠的肝脏中的FVIII DNA和FVIII RNA的量。如图2所示，接受与成年小鼠相同的总vg的幼年小鼠(8.9E11 vg/小鼠；4.5E14 vg/kg体重幼年小鼠)具有与成年小鼠类似的FVIII DNA水平，从而表明不存在由于幼年小鼠中的肝细胞分裂所造成的额外的DNA损失。根据有关AAV载体的文献，该结果是意外的，该文献教导由于细胞分裂和动物生长，用AAV处理的幼体的肝细胞失去了病毒基因组。另外，如图2(右图)所示，剂量施用了AAV5-FVIII-SQ的成年小鼠中的因子VIII RNA水平随时间升高。意外地，剂量施用了与成年小鼠相同的绝对剂量的幼年小鼠显示出因子VIII RNA随时间的类似升高。这些数据表明幼年肝细胞具有与成年肝细胞相同的吸收AAV基因组和表达AAV递送的转基因的能力，而与本领域的教导内容相反，幼年肝细胞不会在组织生长和细胞分裂期间失去病毒基因组。
通过测量AAV施用后随时间的体重和肝重两者，评价了AAV处理对幼年小鼠的整体健康和发育的影响。如图3所示，AAV处理的幼年小鼠的肝重和体重两者随时间升高，并且在施用后8周，达到正常成年水平。此外，为了评价靶向转基因表达的AAV处理是否在肝脏中导致肝损伤，测量了血液丙氨酸转氨酶水平(ALT)。如图4所示，ALT水平不会对AAV5-FVIII-SQ处理起反应而升高，尽管向幼年小鼠提供了与成年相同的绝对载体基因组量，即比对照成年动物更高的vg/体重水平。总之，这些数据表明尽管施用了相对高水平的病毒基因组，AAV处理不会对幼年小鼠的整体健康或发育具有副作用，并且不引起肝损伤。
通过测量血浆因子VIII浓度和估计总循环因子VIII蛋白，评价了幼年小鼠中AAV递送的转基因的疗效。如图5所示，当达到成年时，用基于单位体重的与成年相同的剂量(3.5E13 vg/kg)处理的幼年不会产生治疗水平的因子VIII。该结果与表明在AAV施用后数周，施用转基因的幼年肝细胞停止产生可检测水平的AAV的先前研究一致。意外地，剂量施用成年剂量的绝对数目的病毒基因组(8.9E11 vg)的幼年小鼠开始表达高水平的血浆因子VIII。这些水平由于血容量增大而在1至3周之间降低。然而，从第1周至第16周研究结束，循环因子VIII总量保持稳定。尽管比所处理的成年小鼠中所观察到的水平低5至6倍，但是幼年小鼠中的这种维持的因子VIII蛋白水平仍在治疗有效窗内。因此，这些数据表明当以绝对病毒基因组量/对象的成年剂量施用AAV时，AAV在递送治疗剂量的转基因中是有效的。此外，这些数据表明转基因表达长期稳定并保持恒定。
实施例2
PAH在幼年PKU对象肝脏中的递送和表达
在哺乳动物中，肝脏酶苯丙氨酸羟化酶(PAH)将过量的苯丙氨酸(Phe)在体内转化为酪氨酸(Tyr)。在人中，编码PAH的基因中的突变可以导致所述酶的产生或活性降低或缺失，从而导致体内Phe积累和Tyr水平降低，其表型后果包括生长不足、皮肤和毛发浅色、认知缺陷、睡眠障碍和癫痫发作。在人中，这种疾病状态被称为苯丙酮酸尿症(PKU)。PKU的ENU2小鼠模型(Sheldovsky 1993)是通过使用N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)在编码PAH的基因的外显子7中的化学诱变所产生的。Phe263被Ser263替换，从而导致PAH蛋白水平轻微降低，但是无可检测的PAH催化活性。这与Phe263突变为Leu263的大的亚组人PKU患者中所存在的突变类似。ENU2小鼠具有囊括了PKU患者中所观察到的几种的表型，其包括高血浆和组织Phe水平、低Tyr水平、身材/体重小、浅棕色毛色(而野生型对应物为黑色)和癫痫发作。
如下所列，将雄性ENU2小鼠招募至各个年龄组(n＝10/组)并在近似年龄，以2e14vg/kg静脉内注射AAV5-PAH：组1，在2天大时施用AAV；组2，在1周大时施用AAV；组3，在2周大时施用AAV；组4，在3周大时施用AAV；组5，在5周大时施用AAV；组6，在8周大时施用AAV(整体研究设计参见图7)；
在研究开始之前和在剂量施用后4和8周，测量体重。在剂量施用后4和8周采集血液样品，将其处理为血浆，并通过液相色谱/质谱分析Phe。使用含有稳定同位素内标(13C9,15N(PheIS))的乙腈使血浆蛋白沉淀。通过与苯甲酰氯反应使上清液衍生化并在LC-MS/MS进样前稀释。
在剂量施用前，各年龄组中的动物的体重是类似的(图8A)。剂量施用后4周(图8B)，在3或8周大用AAV5-PAH处理的动物的体重增加显著大于其载体-处理对应物，而在2天或者1、2或5周大处理的那些未有此显示。在剂量施用后8周(图8C)，在5周大处理的小鼠也实现了显著大于对照的体重增加。
在4(图9A)和8-周(图9B)时间点，在5或8周大处理的小鼠中，Phe水平降低至WT范围。在3周大处理的小鼠具有变化更大的phe水平，从而表明了部分起反应。在2天、1周或2周大处理的小鼠不具有明显的血浆Phe降低。
当处理时，小鼠为至少5周大时，用AAV5PAH，2E14 vg/kg处理对低体重和高血浆Phe的ENU2表型实现了最大效果。当在3周大处理小鼠时，实现了对体重的显著效果，但对Phe降低仅具有部分效果。
序列表
<110> 生物马林药物股份有限公司
<120> AAV载体在青少年对象中的稳定表达
<130> 30610/53094
<150> US-62/671,271
<151> 2018-05-14
<160> 55
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4970
<212> DNA
<213> 腺病毒相关病毒
<400> 1
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<212> DNA
<213> 腺病毒相关病毒
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<213> 腺病毒相关病毒
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<212> DNA
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<213> 腺病毒相关病毒
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<213> 腺病毒相关病毒
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<213> 腺病毒相关病毒
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<212> DNA
<213> 腺病毒相关病毒
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<213> 腺病毒相关病毒
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<212> DNA
<213> 腺病毒相关病毒
<400> 28
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg 60
cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
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<213> 腺病毒相关病毒
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<212> DNA
<213> 腺病毒相关病毒
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<213> 腺病毒相关病毒
<400> 38
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<213> 腺病毒相关病毒
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ctgcctctgg ccagtatggc cagtgggccc ccaagctggc caggctgcac tactctggca 4500
gcatcaatgc ctggagcacc aaggagccct tcagctggat caaggtggac ctgctggccc 4560
ccatgatcat ccatggcatc aagacccagg gggccaggca gaagttcagc agcctgtaca 4620
tcagccagtt catcatcatg tacagcctgg atggcaagaa gtggcagacc tacaggggca 4680
acagcactgg caccctgatg gtgttctttg gcaatgtgga cagctctggc atcaagcaca 4740
acatcttcaa cccccccatc attgccagat acatcaggct gcaccccacc cactacagca 4800
tcaggagcac cctgaggatg gagctgatgg gctgtgacct gaacagctgc agcatgcccc 4860
tgggcatgga gagcaaggcc atctctgatg cccagatcac tgccagcagc tacttcacca 4920
acatgtttgc cacctggagc cccagcaagg ccaggctgca cctgcagggc aggagcaatg 4980
cctggaggcc ccaggtcaac aaccccaagg agtggctgca ggtggacttc cagaagacca 5040
tgaaggtgac tggggtgacc acccaggggg tgaagagcct gctgaccagc atgtatgtga 5100
aggagttcct gatcagcagc agccaggatg gccaccagtg gaccctgttc ttccagaatg 5160
gcaaggtgaa ggtgttccag ggcaaccagg acagcttcac ccctgtggtg aacagcctgg 5220
acccccccct gctgaccaga tacctgagga ttcaccccca gagctgggtg caccagattg 5280
ccctgaggat ggaggtgctg ggctgtgagg cccaggacct gtactgacct cgaggaataa 5340
aggaaattta ttttcattgc aatagtgtgt tggttttttg tgtcacgtgg cggccgcagg 5400
aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg 5460
ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag 5520
cgcgcagaga gggagtggcc aa 5542
<210> 45
<211> 5126
<212> DNA
<213> 腺病毒相关病毒
<400> 45
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg 60
cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcctgcggc cgcacgcgtg ggaggctgct ggtgaatatt 180
aaccaaggtc accccagtta tcggaggagc aaacaggggc taagtccacg gggaggctgc 240
tggtgaatat taaccaaggt caccccagtt atcggaggag caaacagggg ctaagtccac 300
ggtcgactgg acacaggacg ctgtggtttc tgagccaggg ggcgactcag atcccagcca 360
gtggacttag cccctgtttg ctcctccgat aactggggtg accttggtta atattcacca 420
gcagcctccc ccgttgcccc tctggatcca ctgcttaaat acggacgagg acagggccct 480
gtctcctcag cttcaggcac caccactgac ctgggacagt gaatcgcgat cgccaccatg 540
cagattgagc tgagcacctg cttcttcctg tgcctgctga ggttctgctt ctctgccacc 600
aggagatact acctgggggc tgtggagctg agctgggact acatgcagtc tgacctgggg 660
gagctgcctg tggatgccag gttccccccc agagtgccca agagcttccc cttcaacacc 720
tctgtggtgt acaagaagac cctgtttgtg gagttcactg accacctgtt caacattgcc 780
aagcccaggc ccccctggat gggcctgctg ggccccacca tccaggctga ggtgtatgac 840
actgtggtga tcaccctgaa gaacatggcc agccaccctg tgagcctgca tgctgtgggg 900
gtgagctact ggaaggcctc tgagggggct gagtatgatg accagaccag ccagagggag 960
aaggaggatg acaaggtgtt ccctgggggc agccacacct atgtgtggca ggtgctgaag 1020
gagaatggcc ccatggcctc tgaccccctg tgcctgacct acagctacct gagccatgtg 1080
gacctggtga aggacctgaa ctctggcctg attggggccc tgctggtgtg cagggagggc 1140
agcctggcca aggagaagac ccagaccctg cacaagttca tcctgctgtt tgctgtgttt 1200
gatgagggca agagctggca ctctgaaacc aagaacagcc tgatgcagga cagggatgct 1260
gcctctgcca gggcctggcc caagatgcac actgtgaatg gctatgtgaa caggagcctg 1320
cctggcctga ttggctgcca caggaagtct gtgtactggc atgtgattgg catgggcacc 1380
acccctgagg tgcacagcat cttcctggag ggccacacct tcctggtcag gaaccacagg 1440
caggccagcc tggagatcag ccccatcacc ttcctgactg cccagaccct gctgatggac 1500
ctgggccagt tcctgctgtt ctgccacatc agcagccacc agcatgatgg catggaggcc 1560
tatgtgaagg tggacagctg ccctgaggag ccccagctga ggatgaagaa caatgaggag 1620
gctgaggact atgatgatga cctgactgac tctgagatgg atgtggtgag gtttgatgat 1680
gacaacagcc ccagcttcat ccagatcagg tctgtggcca agaagcaccc caagacctgg 1740
gtgcactaca ttgctgctga ggaggaggac tgggactatg cccccctggt gctggcccct 1800
gatgacagga gctacaagag ccagtacctg aacaatggcc cccagaggat tggcaggaag 1860
tacaagaagg tcaggttcat ggcctacact gatgaaacct tcaagaccag ggaggccatc 1920
cagcatgagt ctggcatcct gggccccctg ctgtatgggg aggtggggga caccctgctg 1980
atcatcttca agaaccaggc cagcaggccc tacaacatct acccccatgg catcactgat 2040
gtgaggcccc tgtacagcag gaggctgccc aagggggtga agcacctgaa ggacttcccc 2100
atcctgcctg gggagatctt caagtacaag tggactgtga ctgtggagga tggccccacc 2160
aagtctgacc ccaggtgcct gaccagatac tacagcagct ttgtgaacat ggagagggac 2220
ctggcctctg gcctgattgg ccccctgctg atctgctaca aggagtctgt ggaccagagg 2280
ggcaaccaga tcatgtctga caagaggaat gtgatcctgt tctctgtgtt tgatgagaac 2340
aggagctggt acctgactga gaacatccag aggttcctgc ccaaccctgc tggggtgcag 2400
ctggaggacc ctgagttcca ggccagcaac atcatgcaca gcatcaatgg ctatgtgttt 2460
gacagcctgc agctgtctgt gtgcctgcat gaggtggcct actggtacat cctgagcatt 2520
ggggcccaga ctgacttcct gtctgtgttc ttctctggct acaccttcaa gcacaagatg 2580
gtgtatgagg acaccctgac cctgttcccc ttctctgggg agactgtgtt catgagcatg 2640
gagaaccctg gcctgtggat tctgggctgc cacaactctg acttcaggaa caggggcatg 2700
actgccctgc tgaaagtctc cagctgtgac aagaacactg gggactacta tgaggacagc 2760
tatgaggaca tctctgccta cctgctgagc aagaacaatg ccattgagcc caggagcttc 2820
agccagaacc ccccagtgct gaagaggcac cagagggaga tcaccaggac caccctgcag 2880
tctgaccagg aggagattga ctatgatgac accatctctg tggagatgaa gaaggaggac 2940
tttgacatct acgacgagga cgagaaccag agccccagga gcttccagaa gaagaccagg 3000
cactacttca ttgctgctgt ggagaggctg tgggactatg gcatgagcag cagcccccat 3060
gtgctgagga acagggccca gtctggctct gtgccccagt tcaagaaggt ggtgttccag 3120
gagttcactg atggcagctt cacccagccc ctgtacagag gggagctgaa tgagcacctg 3180
ggcctgctgg gcccctacat cagggctgag gtggaggaca acatcatggt gaccttcagg 3240
aaccaggcca gcaggcccta cagcttctac agcagcctga tcagctatga ggaggaccag 3300
aggcaggggg ctgagcccag gaagaacttt gtgaagccca atgaaaccaa gacctacttc 3360
tggaaggtgc agcaccacat ggcccccacc aaggatgagt ttgactgcaa ggcctgggcc 3420
tacttctctg atgtggacct ggagaaggat gtgcactctg gcctgattgg ccccctgctg 3480
gtgtgccaca ccaacaccct gaaccctgcc catggcaggc aggtgactgt gcaggagttt 3540
gccctgttct tcaccatctt tgatgaaacc aagagctggt acttcactga gaacatggag 3600
aggaactgca gggccccctg caacatccag atggaggacc ccaccttcaa ggagaactac 3660
aggttccatg ccatcaatgg ctacatcatg gacaccctgc ctggcctggt gatggcccag 3720
gaccagagga tcaggtggta cctgctgagc atgggcagca atgagaacat ccacagcatc 3780
cacttctctg gccatgtgtt cactgtgagg aagaaggagg agtacaagat ggccctgtac 3840
aacctgtacc ctggggtgtt tgagactgtg gagatgctgc ccagcaaggc tggcatctgg 3900
agggtggagt gcctgattgg ggagcacctg catgctggca tgagcaccct gttcctggtg 3960
tacagcaaca agtgccagac ccccctgggc atggcctctg gccacatcag ggacttccag 4020
atcactgcct ctggccagta tggccagtgg gcccccaagc tggccaggct gcactactct 4080
ggcagcatca atgcctggag caccaaggag cccttcagct ggatcaaggt ggacctgctg 4140
gcccccatga tcatccatgg catcaagacc cagggggcca ggcagaagtt cagcagcctg 4200
tacatcagcc agttcatcat catgtacagc ctggatggca agaagtggca gacctacagg 4260
ggcaacagca ctggcaccct gatggtgttc tttggcaatg tggacagctc tggcatcaag 4320
cacaacatct tcaacccccc catcattgcc agatacatca ggctgcaccc cacccactac 4380
agcatcagga gcaccctgag gatggagctg atgggctgtg acctgaacag ctgcagcatg 4440
cccctgggca tggagagcaa ggccatctct gatgcccaga tcactgccag cagctacttc 4500
accaacatgt ttgccacctg gagccccagc aaggccaggc tgcacctgca gggcaggagc 4560
aatgcctgga ggccccaggt caacaacccc aaggagtggc tgcaggtgga cttccagaag 4620
accatgaagg tgactggggt gaccacccag ggggtgaaga gcctgctgac cagcatgtat 4680
gtgaaggagt tcctgatcag cagcagccag gatggccacc agtggaccct gttcttccag 4740
aatggcaagg tgaaggtgtt ccagggcaac caggacagct tcacccctgt ggtgaacagc 4800
ctggaccccc ccctgctgac cagatacctg aggattcacc cccagagctg ggtgcaccag 4860
attgccctga ggatggaggt gctgggctgt gaggcccagg acctgtactg acctcgagga 4920
ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt gtgttggttt tttgtgtcac gtggcggccg 4980
caggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag 5040
gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag 5100
cgagcgcgca gagagggagt ggccaa 5126
<210> 46
<211> 415
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(415)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (338)..(338)
<223> 对应SEQ ID No. 2的384残基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (338)..(338)
<223> 请求保护的发明中突变的残基
<300>
<308> NCBI/NP_000124
<309> 2009-04-12
<313> (1)..(415)
<400> 46
Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg
1 5 10 15
Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe
20 25 30
Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly
35 40 45
Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp
50 55 60
Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys
65 70 75 80
Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu
85 90 95
Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr
100 105 110
Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val
115 120 125
Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr
130 135 140
Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu
145 150 155 160
Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn
165 170 175
Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe
180 185 190
Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly
195 200 205
Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu
210 215 220
Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu
225 230 235 240
Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His
245 250 255
His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu
260 265 270
Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile
275 280 285
Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser
290 295 300
Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala
305 310 315 320
Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys
325 330 335
Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly
340 345 350
Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro
355 360 365
His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser
370 375 380
Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys
385 390 395 400
Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr
405 410 415
<210> 47
<211> 1359
<212> DNA
<213> 苯丙氨酸羟化酶
<400> 47
atgtccactg cggtcctgga aaacccaggc ttgggcagga aactctctga ctttggacag 60
gaaacaagct atattgaaga caactgcaat caaaatggtg ccatatcact gatcttctca 120
ctcaaagaag aagttggtgc attggccaaa gtattgcgct tatttgagga gaatgatgta 180
aacctgaccc acattgaatc tagaccttct cgtttaaaga aagatgagta tgaatttttc 240
acccatttgg ataaacgtag cctgcctgct ctgacaaaca tcatcaagat cttgaggcat 300
gacattggtg ccactgtcca tgagctttca cgagataaga agaaagacac agtgccctgg 360
ttcccaagaa ccattcaaga gctggacaga tttgccaatc agattctcag ctatggagcg 420
gaactggatg ctgaccaccc tggttttaaa gatcctgtgt accgtgcaag acggaagcag 480
tttgctgaca ttgcctacaa ctaccgccat gggcagccca tccctcgagt ggaatacatg 540
gaggaagaaa agaaaacatg gggcacagtg ttcaagactc tgaagtcctt gtataaaacc 600
catgcttgct atgagtacaa tcacattttt ccacttcttg aaaagtactg tggcttccat 660
gaagataaca ttccccagct ggaagacgtt tctcagttcc tgcagacttg cactggtttc 720
cgcctccgac ctgtagctgg cctgctttcc tctcgggatt tcttgggtgg cctggccttc 780
cgagtcttcc actgcacaca gtacatcaga catggatcca agcccatgta tacccccgaa 840
cctgacatct gccatgagct gttgggacat gtgcccttgt tttcagatcg cagctttgcc 900
cagttttccc aggaaattgg ccttgcctct ctgggtgcac ctgatgaata cattgaaaag 960
ctcgccacaa tttactggtt tactgtggag tttgggctct gcaaacaagg agactccata 1020
aaggcatatg gtgctgggct cctgtcatcc tttggtgaat tacagtactg cttatcagag 1080
aagccaaagc ttctccccct ggagctggag aagacagcca tccaaaatta cactgtcacg 1140
gagttccagc ccctgtatta cgtggcagag agttttaatg atgccaagga gaaagtaagg 1200
aactttgctg ccacaatacc tcggcccttc tcagttcgct acgacccata cacccaaagg 1260
attgaggtct tggacaatac ccagcagctt aagattttgg ctgattccat taacagtgaa 1320
attggaatcc tttgcagtgc cctccagaaa ataaagtaa 1359
<210> 48
<211> 452
<212> PRT
<213> 苯丙氨酸羟化酶
<400> 48
Met Ser Thr Ala Val Leu Glu Asn Pro Gly Leu Gly Arg Lys Leu Ser
1 5 10 15
Asp Phe Gly Gln Glu Thr Ser Tyr Ile Glu Asp Asn Cys Asn Gln Asn
20 25 30
Gly Ala Ile Ser Leu Ile Phe Ser Leu Lys Glu Glu Val Gly Ala Leu
35 40 45
Ala Lys Val Leu Arg Leu Phe Glu Glu Asn Asp Val Asn Leu Thr His
50 55 60
Ile Glu Ser Arg Pro Ser Arg Leu Lys Lys Asp Glu Tyr Glu Phe Phe
65 70 75 80
Thr His Leu Asp Lys Arg Ser Leu Pro Ala Leu Thr Asn Ile Ile Lys
85 90 95
Ile Leu Arg His Asp Ile Gly Ala Thr Val His Glu Leu Ser Arg Asp
100 105 110
Lys Lys Lys Asp Thr Val Pro Trp Phe Pro Arg Thr Ile Gln Glu Leu
115 120 125
Asp Arg Phe Ala Asn Gln Ile Leu Ser Tyr Gly Ala Glu Leu Asp Ala
130 135 140
Asp His Pro Gly Phe Lys Asp Pro Val Tyr Arg Ala Arg Arg Lys Gln
145 150 155 160
Phe Ala Asp Ile Ala Tyr Asn Tyr Arg His Gly Gln Pro Ile Pro Arg
165 170 175
Val Glu Tyr Met Glu Glu Glu Lys Lys Thr Trp Gly Thr Val Phe Lys
180 185 190
Thr Leu Lys Ser Leu Tyr Lys Thr His Ala Cys Tyr Glu Tyr Asn His
195 200 205
Ile Phe Pro Leu Leu Glu Lys Tyr Cys Gly Phe His Glu Asp Asn Ile
210 215 220
Pro Gln Leu Glu Asp Val Ser Gln Phe Leu Gln Thr Cys Thr Gly Phe
225 230 235 240
Arg Leu Arg Pro Val Ala Gly Leu Leu Ser Ser Arg Asp Phe Leu Gly
245 250 255
Gly Leu Ala Phe Arg Val Phe His Cys Thr Gln Tyr Ile Arg His Gly
260 265 270
Ser Lys Pro Met Tyr Thr Pro Glu Pro Asp Ile Cys His Glu Leu Leu
275 280 285
Gly His Val Pro Leu Phe Ser Asp Arg Ser Phe Ala Gln Phe Ser Gln
290 295 300
Glu Ile Gly Leu Ala Ser Leu Gly Ala Pro Asp Glu Tyr Ile Glu Lys
305 310 315 320
Leu Ala Thr Ile Tyr Trp Phe Thr Val Glu Phe Gly Leu Cys Lys Gln
325 330 335
Gly Asp Ser Ile Lys Ala Tyr Gly Ala Gly Leu Leu Ser Ser Phe Gly
340 345 350
Glu Leu Gln Tyr Cys Leu Ser Glu Lys Pro Lys Leu Leu Pro Leu Glu
355 360 365
Leu Glu Lys Thr Ala Ile Gln Asn Tyr Thr Val Thr Glu Phe Gln Pro
370 375 380
Leu Tyr Tyr Val Ala Glu Ser Phe Asn Asp Ala Lys Glu Lys Val Arg
385 390 395 400
Asn Phe Ala Ala Thr Ile Pro Arg Pro Phe Ser Val Arg Tyr Asp Pro
405 410 415
Tyr Thr Gln Arg Ile Glu Val Leu Asp Asn Thr Gln Gln Leu Lys Ile
420 425 430
Leu Ala Asp Ser Ile Asn Ser Glu Ile Gly Ile Leu Cys Ser Ala Leu
435 440 445
Gln Lys Ile Lys
450
<210> 49
<211> 2822
<212> DNA
<213> 腺病毒相关病毒
<400> 49
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtaggct cagaggcaca caggagtttc 180
tgggctcacc ctgccccctt ccaacccctc agttcccatc ctccagcagc tgtttgtgtg 240
ctgcctctga agtccacact gaacaaactt cagcctactc atgtccctaa aatgggcaaa 300
cattgcaagc agcaaacagc aaacacacag ccctccctgc ctgctgacct tggagctggg 360
gcagaggtca gagacctctc tgggcccatg ccacctccaa catccactcg accccttgga 420
atttcggtgg agaggagcag aggttgtcct ggcgtggttt aggtagtgtg agaggggtcg 480
acgatcttgc taccagtgga acagccacta aggattctgc agtgagagca gagggccagc 540
taagtggtac tctcccagag actgtctgac tcacgccacc ccctccacct tggacacagg 600
acgctgtggt ttctgagcca ggtacaatga ctcctttcgg taagtgcagt ggaagctgta 660
cactgcccag gcaaagcgtc cgggcagcgt aggcgggcga ctcagatccc agccagtgga 720
cttagcccct gtttgctcct ccgataactg gggtgacctt ggttaatatt caccagcagc 780
ctcccccgtt gcccctctgg atccactgct taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc 840
ctcagcttca ggcaccacca ctgacctggg acagtgaatc gtaagtacta gcagctacaa 900
tccagctacc attctgcttt tattttatgg ttgggataag gctggattat tctgagtcca 960
agctaggccc ttttgctaat catgttcata cctcttatct tcctcccaca gctcctgggc 1020
aacgtgctgg tctgtgtgct ggcccatcac tttggcaaag aattgcgatc gccaccatgt 1080
ccactgcggt cctggaaaac ccaggcttgg gcaggaaact ctctgacttt ggacaggaaa 1140
caagctatat tgaagacaac tgcaatcaaa atggtgccat atcactgatc ttctcactca 1200
aagaagaagt tggtgcattg gccaaagtat tgcgcttatt tgaggagaat gatgtaaacc 1260
tgacccacat tgaatctaga ccttctcgtt taaagaaaga tgagtatgaa tttttcaccc 1320
atttggataa acgtagcctg cctgctctga caaacatcat caagatcttg aggcatgaca 1380
ttggtgccac tgtccatgag ctttcacgag ataagaagaa agacacagtg ccctggttcc 1440
caagaaccat tcaagagctg gacagatttg ccaatcagat tctcagctat ggagcggaac 1500
tggatgctga ccaccctggt tttaaagatc ctgtgtaccg tgcaagacgg aagcagtttg 1560
ctgacattgc ctacaactac cgccatgggc agcccatccc tcgagtggaa tacatggagg 1620
aagaaaagaa aacatggggc acagtgttca agactctgaa gtccttgtat aaaacccatg 1680
cttgctatga gtacaatcac atttttccac ttcttgaaaa gtactgtggc ttccatgaag 1740
ataacattcc ccagctggaa gacgtttctc agttcctgca gacttgcact ggtttccgcc 1800
tccgacctgt agctggcctg ctttcctctc gggatttctt gggtggcctg gccttccgag 1860
tcttccactg cacacagtac atcagacatg gatccaagcc catgtatacc cccgaacctg 1920
acatctgcca tgagctgttg ggacatgtgc ccttgttttc agatcgcagc tttgcccagt 1980
tttcccagga aattggcctt gcctctctgg gtgcacctga tgaatacatt gaaaagctcg 2040
ccacaattta ctggtttact gtggagtttg ggctctgcaa acaaggagac tccataaagg 2100
catatggtgc tgggctcctg tcatcctttg gtgaattaca gtactgctta tcagagaagc 2160
caaagcttct ccccctggag ctggagaaga cagccatcca aaattacact gtcacggagt 2220
tccagcccct gtattacgtg gcagagagtt ttaatgatgc caaggagaaa gtaaggaact 2280
ttgctgccac aatacctcgg cccttctcag ttcgctacga cccatacacc caaaggattg 2340
aggtcttgga caatacccag cagcttaaga ttttggctga ttccattaac agtgaaattg 2400
gaatcctttg cagtgccctc cagaaaataa agtaacctcg agctgtgcct tctagttgcc 2460
agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca 2520
ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta 2580
ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc 2640
atgctgggga tgcggtgggc tctatggacc ggtgcggccg caggaacccc tagtgatgga 2700
gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc 2760
ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca 2820
gg 2822
<210> 50
<211> 2822
<212> DNA
<213> 腺病毒相关病毒
<400> 50
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gg 2822
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tatgctaata tttttggtgg gattttgtcc cacctgaaaa tacattgctt tatgctaaga 1980
ttcctgtgac ctctctagct gattgggagg caggggtagc acattggtca gggctgtgca 2040
catacttagt gctcagtgtg tttgggcatg caatcaacaa atccttttgg ggcatgactg 2100
gatacgatta gatatcttgt gaaaacctat gatgttctca gcactgtggg tggggaggaa 2160
gatgggggac acatagaaat tgtaaggaag agaaactgcc tcctttagga tctaacaggg 2220
gaagcaaata ttctgagcag ctggggaggg aaggcagagc atgagaagtt atctcagtaa 2280
aaggtagctt tatagacatg atcttattca gtctaatgaa aataacatga ggtaggagct 2340
atttctgccc ccatttttca gagatagaaa ctgatgctta gaggggttag gtaaatgtgc 2400
ccaaggtcaa acagctagta aatacggaag aaatcattta aacccaggca ttctgagtct 2460
agaacctaca tacactctta actgctattc agtactgccc cagacagaac gggcttcata 2520
gtttgcaggg cgcagtgcaa aatgaaaacg tggggtctct tcctcaataa caggaaataa 2580
tgctgttaaa agtactaaaa tatataactt tatcctttct tctgtggtct ctctcatgtc 2640
ctgttatggt gtttttgatt tgccatttag ttgtgctctc ctcccctggg caccttggcc 2700
ctctaactgc tgggttccct gtccagccag ggctgggctg acagccaagc ccctaccaag 2760
gatggggaaa tccatcttcc atttccgtgg acctgctgca ccaacccaca gtgatgagct 2820
atcccccaag agattgtaac ctctggaatg agaatggaaa ggaagcttgc ctgaacttgg 2880
ttttaaagaa gaaaaagtaa acaacttttg caaatttaag gactttttta tactcttata 2940
aaaataattg tattcttgaa ctctccattt tgttgcgtta ggttttcctg ttctggttct 3000
gcatctttgg cctgcgttag ttccagtgac tgtctcctca ccctccccat tctctcttct 3060
aggagaatga tgtaaacctg acccacattg aatctagacc ttctcgttta aagaaagatg 3120
agtatgaatt tttcacccat ttggataaac gtagcctgcc tgctctgaca aacatcatca 3180
agatcttgag gcatgacatt ggtgccactg tccatgagct ttcacgagat aagaagaaag 3240
acacagtgcc ctggttccca agaaccattc aagagctgga cagatttgcc aatcagattc 3300
tcagctatgg agcggaactg gatgctgacc accctggttt taaagatcct gtgtaccgtg 3360
caagacggaa gcagtttgct gacattgcct acaactaccg ccatgggcag cccatccctc 3420
gagtggaata catggaggaa gaaaagaaaa catggggcac agtgttcaag actctgaagt 3480
ccttgtataa aacccatgct tgctatgagt acaatcacat ttttccactt cttgaaaagt 3540
actgtggctt ccatgaagat aacattcccc agctggaaga cgtttctcag ttcctgcaga 3600
cttgcactgg tttccgcctc cgacctgtag ctggcctgct ttcctctcgg gatttcttgg 3660
gtggcctggc cttccgagtc ttccactgca cacagtacat cagacatgga tccaagccca 3720
tgtatacccc cgaacctgac atctgccatg agctgttggg acatgtgccc ttgttttcag 3780
atcgcagctt tgcccagttt tcccaggaaa ttggccttgc ctctctgggt gcacctgatg 3840
aatacattga aaagctcgcc acaatttact ggtttactgt ggagtttggg ctctgcaaac 3900
aaggagactc cataaaggca tatggtgctg ggctcctgtc atcctttggt gaattacagt 3960
actgcttatc agagaagcca aagcttctcc ccctggagct ggagaagaca gccatccaaa 4020
attacactgt cacggagttc cagcccctgt attacgtggc agagagtttt aatgatgcca 4080
aggagaaagt aaggaacttt gctgccacaa tacctcggcc cttctcagtt cgctacgacc 4140
catacaccca aaggattgag gtcttggaca atacccagca gcttaagatt ttggctgatt 4200
ccattaacag tgaaattgga atcctttgca gtgccctcca gaaaataaag taacctcgag 4260
ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 4320
tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 4380
tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 4440
gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggaccgg tgcggccgca 4500
ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc 4560
cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg 4620
agcgcgcagc tgcctgcagg 4640
<210> 54
<211> 2822
<212> DNA
<213> 苯丙氨酸羟化酶
<400> 54
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtaggct cagaggcaca caggagtttc 180
tgggctcacc ctgccccctt ccaacccctc agttcccatc ctccagcagc tgtttgtgtg 240
ctgcctctga agtccacact gaacaaactt cagcctactc atgtccctaa aatgggcaaa 300
cattgcaagc agcaaacagc aaacacacag ccctccctgc ctgctgacct tggagctggg 360
gcagaggtca gagacctctc tgggcccatg ccacctccaa catccactcg accccttgga 420
atttcggtgg agaggagcag aggttgtcct ggcgtggttt aggtagtgtg agaggggtcg 480
acgatcttgc taccagtgga acagccacta aggattctgc agtgagagca gagggccagc 540
taagtggtac tctcccagag actgtctgac tcacgccacc ccctccacct tggacacagg 600
acgctgtggt ttctgagcca ggtacaatga ctcctttcgg taagtgcagt ggaagctgta 660
cactgcccag gcaaagcgtc cgggcagcgt aggcgggcga ctcagatccc agccagtgga 720
cttagcccct gtttgctcct ccgataactg gggtgacctt ggttaatatt caccagcagc 780
ctcccccgtt gcccctctgg atccactgct taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc 840
ctcagcttca ggcaccacca ctgacctggg acagtgaatc gtaagtacta gcagctacaa 900
tccagctacc attctgcttt tattttatgg ttgggataag gctggattat tctgagtcca 960
agctaggccc ttttgctaat catgttcata cctcttatct tcctcccaca gctcctgggc 1020
aacgtgctgg tctgtgtgct ggcccatcac tttggcaaag aattgcgatc gccaccatga 1080
gcactgctgt gctggagaac cctggcctgg gcagaaagct gtctgacttt ggccaggaga 1140
ccagctacat tgaggacaac tgcaaccaga atggggccat cagcctgatc ttcagcctga 1200
aggaggaggt gggggccctg gccaaggtgc tgagactgtt tgaggagaat gatgtgaacc 1260
tgacccacat tgagagcaga cccagcagac tgaagaagga tgagtatgag ttcttcaccc 1320
acctggacaa gagaagcctg cctgccctga ccaacatcat caagatcctg agacacgata 1380
ttggggccac tgtgcacgag ctgagcagag acaagaagaa ggacactgtg ccctggttcc 1440
ccagaactat ccaggagctg gacagatttg ccaaccagat cctgagctat ggggctgagc 1500
tggatgctga ccaccctggc ttcaaggacc ctgtgtacag agccagaaga aagcagtttg 1560
ctgacattgc ctacaactac agacacggcc agcccatccc cagagtggag tacatggagg 1620
aggagaagaa gacctggggc actgtgttca agaccctgaa gagcctgtac aagacccacg 1680
cctgctatga gtacaaccac atcttccccc tgctggagaa gtactgtggc ttccacgagg 1740
acaacatccc ccagctggag gatgtgagcc agttcctgca gacctgcact ggcttcagac 1800
tgagacctgt ggctggcctg ctgagcagca gagacttcct ggggggcctg gccttcagag 1860
tgttccactg cacccagtac atcagacacg gcagcaagcc catgtacacc cctgagcctg 1920
atatctgcca cgagctgctg ggccacgtgc ccctgttctc tgacagaagc tttgcccagt 1980
tcagccagga gattggcctg gccagcctgg gggcccctga tgagtatatt gagaagctgg 2040
ccactatcta ctggttcact gtggagtttg gcctgtgcaa gcagggggac agcatcaagg 2100
cctatggggc tggcctgctg agcagctttg gggagctgca gtactgcctg tctgagaagc 2160
ccaagctgct gcccctggag ctggagaaga ctgccatcca gaactacact gtgactgagt 2220
tccagcccct gtactatgtg gctgagagct tcaatgatgc caaggagaag gtgagaaact 2280
ttgctgccac catccccaga cccttctctg tgagatacga cccctacacc cagagaattg 2340
aggtgctgga caacacccag cagctgaaga tcctggctga cagcatcaac tctgagattg 2400
gcatcctgtg ctctgccctg cagaagatca agtgacctcg agctgtgcct tctagttgcc 2460
agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca 2520
ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta 2580
ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc 2640
atgctgggga tgcggtgggc tctatggacc ggtgcggccg caggaacccc tagtgatgga 2700
gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc 2760
ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca 2820
gg 2822
<210> 55
<211> 2822
<212> DNA
<213> 苯丙氨酸羟化酶
<400> 55
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtaggct cagaggcaca caggagtttc 180
tgggctcacc ctgccccctt ccaacccctc agttcccatc ctccagcagc tgtttgtgtg 240
ctgcctctga agtccacact gaacaaactt cagcctactc atgtccctaa aatgggcaaa 300
cattgcaagc agcaaacagc aaacacacag ccctccctgc ctgctgacct tggagctggg 360
gcagaggtca gagacctctc tgggcccatg ccacctccaa catccactcg accccttgga 420
atttcggtgg agaggagcag aggttgtcct ggcgtggttt aggtagtgtg agaggggtcg 480
acgatcttgc taccagtgga acagccacta aggattctgc agtgagagca gagggccagc 540
taagtggtac tctcccagag actgtctgac tcacgccacc ccctccacct tggacacagg 600
acgctgtggt ttctgagcca ggtacaatga ctcctttcgg taagtgcagt ggaagctgta 660
cactgcccag gcaaagcgtc cgggcagcgt aggcgggcga ctcagatccc agccagtgga 720
cttagcccct gtttgctcct ccgataactg gggtgacctt ggttaatatt caccagcagc 780
ctcccccgtt gcccctctgg atccactgct taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc 840
ctcagcttca ggcaccacca ctgacctggg acagtgaatc gtaagtacta gcagctacaa 900
tccagctacc attctgcttt tattttatgg ttgggataag gctggattat tctgagtcca 960
agctaggccc ttttgctaat catgttcata cctcttatct tcctcccaca gctcctgggc 1020
aacgtgctgg tctgtgtgct ggcccatcac tttggcaaag aattgcgatc gccaccatga 1080
gcactgctgt gctggagaac cctggcctgg gcagaaagct gtctgacttt ggccaggaga 1140
ccagctacat tgaggacaac tgcaaccaga atggggccat cagcctgatc ttcagcctga 1200
aggaggaggt gggggccctg gccaaggtgc tgagactgtt tgaggagaat gatgtgaacc 1260
tgacccacat tgagagcaga cccagcagac tgaagaagga tgagtatgag ttcttcaccc 1320
acctggacaa gagaagcctg ccagccctga ccaatattat caagatcctg aggcacgata 1380
ttggggccac agtgcacgag ctgagcagag acaagaagaa ggacacagtg ccctggttcc 1440
ccaggactat ccaggagctg gacaggtttg ccaaccagat cctgagctac ggagctgagc 1500
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cctatggggc tggcctgctg agcagctttg gggagctgca gtactgcctg tcagagaagc 2160
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ttgctgccac catccccagg cccttctctg tgagatatga cccctacacc cagaggattg 2340
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agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca 2520
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ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc 2640
atgctgggga tgcggtgggc tctatggacc ggtgcggccg caggaacccc tagtgatgga 2700
gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc 2760
ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca 2820
gg 2822

Claims (69)

1.改善患有遗传病症的青少年对象中的遗传病症的症状的方法，其包括向所述青少年对象施用治疗有效量的编码治疗性蛋白的治疗性AAV病毒，其中所述治疗性蛋白的表达改善了所述遗传病症的症状。
2.治疗性AAV病毒在制备用于改善患有遗传病症的青少年对象中的遗传病症的症状的药剂中的用途，其中所述药剂包含治疗有效量的编码治疗性蛋白的治疗性AAV病毒，其中所述治疗性蛋白的表达改善了所述遗传病症的症状。
3.组合物，其包含用于在改善患有所述遗传病症的青少年对象中的遗传病症的症状中使用的治疗有效量的编码治疗性蛋白的治疗性AAV病毒。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述治疗性蛋白为无功能的内源蛋白的功能性拷贝。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述治疗性蛋白为所述内源蛋白的修饰形式。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述治疗性蛋白为补偿无功能内源蛋白的异源蛋白质。
7.根据以上权利要求中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述青少年对象为青少年的人。
8.根据权利要求7所述的方法、用途或组合物，其中所述青少年的人小于18岁。
9.根据权利要求7所述的方法、用途或组合物，其中所述青少年的人小于12岁。
10.根据以上权利要求中任一项所述的方法、用途或组合物，其中在所述治疗性AAV病毒的施用后，通过所述青少年对象的肝细胞表达所述治疗性蛋白。
11.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中静脉内施用所述治疗性AAV病毒。
12.根据以上权利要求中的任一项所述的用途或组合物，其中所述药剂配制用于静脉内施用。
13.根据以上权利要求中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述遗传病症是血友病。
14.根据权利要求13所述的方法、用途或组合物，其中所述血友病为甲型血友病，并且所述治疗性蛋白为因子VIII。
15.根据权利要求14所述的方法、用途或组合物，其中所述因子VIII为因子VIII-SQ。
16.根据权利要求14所述的方法、用途或组合物，其中所述治疗性AAV病毒为AAV5-FVIII-SQ。
17.根据权利要求13所述的方法、用途或组合物，其中所述血友病为乙型血友病，并且所述治疗性蛋白为因子IX。
18.根据权利要求17所述的方法、用途或组合物，其中所述因子IX为R338L因子IX。
19.根据权利要求1-12中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述遗传病症为苯丙酮酸尿症(PKU)，并且所述治疗性蛋白为苯丙氨酸羟化酶(PAH)。
20.根据以上权利要求中任一项所述的方法、用途或组合物，其中施用于所述青少年对象的治疗性AAV病毒的量与在成年对象中有效的治疗性AAV病毒的相同绝对数目相对应。
21.根据权利要求20所述的方法、用途或组合物，其中将约1E12vg/kg至约1E15vg/kg的所述治疗性AAV病毒施用于所述青少年对象。
22.根据权利要求20所述的方法、用途或组合物，其中将约6E13vg/kg至约6E14vg/kg的所述治疗性AAV病毒施用于所述青少年对象。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的方法、用途或组合物，其中将AAV病毒配制为包含浓度为约0.1mg/ml至约3mg/ml的磷酸氢二钠，浓度为约0.1mg/ml至约3mg/ml的一水合磷酸二氢钠，浓度为约1mg/ml至约20mg/ml的氯化钠，浓度为约5mg/ml至约40mg/ml的甘露糖醇和浓度为约0.1mg/ml至约4mg/ml的泊洛沙姆188的药物组合物。
24.根据权利要求20-23中任一项所述的方法、用途或组合物，其中用浓度范围在5mg/天至60mg/天的皮质类固醇预防性治疗所述青少年对象。
25.根据权利要求20-23中任一项所述的方法、用途或组合物，其中用浓度范围在5mg/天至60mg/天的皮质类固醇治疗性治疗所述青少年对象。
26.根据权利要求20-25中任一项所述的方法、用途或组合物，其导致至少约5IU/dl的功能性因子VIII蛋白在所述青少年对象中表达。
27.根据权利要求20-25中任一项所述的方法、用途或组合物，其导致在所述青少年对象中至少约1IU/dl的功能性因子VIII蛋白的升高。
28.减少患有血友病的青少年对象中出血发作的出血时间的方法，其包括在出血发作之前，向所述青少年对象施用治疗有效量的治疗性AAV病毒。
29.治疗有效量的治疗性AAV病毒用于制备降低患有血友病的青少年对象中的出血发作的出血时间的药剂的用途，其中在所述出血发作之前，向所述青少年对象施用所述药剂。
30.组合物，其包含用于降低患有血友病的青少年对象中的出血发作的出血时间的治疗有效量的治疗性AAV病毒，其中在所述出血发作之前，向所述青少年对象施用所述组合物。
31.根据权利要求28-30中任一项所述的方法、组合物或用途，其中所述施用发生在所述出血发作之前至少3周。
32.根据权利要求28-31中任一项所述的方法，其中静脉内施用所述治疗性AAV病毒。
33.根据权利要求28-31中任一项所述的用途或组合物，其中将所述治疗性AAV配制用于静脉内施用。
34.根据权利要求28-33中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述血友病为甲型血友病，并且所述治疗性AAV病毒表达因子VIII。
35.根据权利要求34所述的方法、用途或组合物，其中所述因子VIII为因子VIII-SQ。
36.根据权利要求34所述的方法、用途或组合物，其中所述治疗性AAV病毒为AAV5-FVIII-SQ。
37.根据权利要求28-33所述的方法、用途或组合物，其中所述血友病为乙型血友病，并且所述治疗性AAV病毒表达因子IX。
38.根据权利要求37所述的方法、用途或组合物，其中所述因子IX为R338L因子IX。
39.根据权利要求28-38中任一项所述的方法、用途或组合物，其中施用于所述青少年对象的治疗性AAV病毒的量与在成年对象中有效的治疗性AAV病毒的相同绝对数目相对应。
40.根据权利要求39所述的方法、用途或组合物，其中将约1E12 vg/kg至约1E15vg/kg的所述治疗性AAV病毒施用于所述青少年对象。
41.根据权利要求39所述的方法、用途或组合物，其中将约6E13 vg/kg至约6E14vg/kg的所述治疗性AAV病毒施用于所述青少年对象。
42.根据权利要求28-41中任一项所述的方法、用途或组合物，其中在包含浓度为约0.1mg/ml至约3mg/ml的磷酸氢二钠，浓度为约0.1mg/ml至约3mg/ml的一水合磷酸二氢钠，浓度为约1mg/ml至约20mg/ml的氯化钠，浓度为约5mg/ml至约40mg/ml的甘露糖醇和浓度为约0.1mg/ml至约4mg/ml的泊洛沙姆188的溶液中配制治疗性AAV病毒。
43.在对其有需要的青少年对象中提高因子VIII蛋白表达的方法，其包括向所述青少年对象施用治疗性病毒，其中所述治疗性AAV病毒为AAV5-FVIII-SQ。
44.治疗性AAV病毒在制备用于在对其有需要的青少年对象中提高因子VIII蛋白的表达的药剂的用途，其中所述AAV病毒是AAV5-FVIII-SQ。
45.组合物，其包含用于在对其有需要的青少年对象中提高因子VIII蛋白的表达的治疗性AAV病毒，其中所述AAV病毒为AAV5-FVIII-SQ。
46.根据权利要求43所述的方法，其中所述治疗性AAV病毒通过静脉内施用。
47.根据权利要求44或45所述的用途或组合物，其中所述AAV病毒配制用于静脉内施用。
48.根据权利要求43-47中任一项所述的方法、用途或组合物，其中施用于所述青少年对象的治疗性AAV病毒的量与在成年对象中有效的治疗性AAV病毒的相同绝对数目相对应。
49.根据权利要求48所述的方法、用途或组合物，其中将约1E12vg/kg至约1E15vg/kg的所述治疗性AAV病毒施用于所述青少年对象。
50.根据权利要求48所述的方法、用途或组合物，其中将约6E13vg/kg至约6E14vg/kg的所述治疗性AAV病毒施用于所述青少年对象。
51.根据权利要求43-50中任一项所述的方法、用途或组合物，其导致至少约5IU/dl的功能性因子VIII蛋白在所述青少年对象中表达。
52.根据权利要求51所述的方法、用途或组合物，其导致至少约1IU/dl的功能性因子VIII蛋白在青少年对象中表达。
53.根据权利要求43-52中任一项所述的方法、用途或组合物，其导致在所述青少年对象中至少约1IU/dl的功能性FVIII活性的升高。
54.根据权利要求41-50中任一项所述的方法、用途或组合物，其中用浓度范围在5mg/天至60mg/天的皮质类固醇治疗所述青少年对象。
55.根据权利要求54所述的方法、用途或组合物，其中预防性进行所述皮质类固醇治疗。
56.根据权利要求54所述的方法、用途或组合物，其中治疗性进行所述皮质类固醇治疗。
57.根据权利要求54-56所述的方法、用途或组合物，其中用浓度范围在5mg/天至60mg/天的皮质类固醇治疗所述青少年对象至少3、4、5、6、7、8、9或10周或以上的一段连续时间。
58.根据权利要求54-57中任一项所述的方法，还包括在施用治疗有效量的AAV5-FVIII-SQ之后，确定所述青少年对象的血清中是否存在抗-AAV衣壳抗体的步骤。
59.根据权利要求58所述的方法，还包括在确定所述青少年对象的血清中存在抗-AAV衣壳抗体之后，向所述对象施用有效量的皮质类固醇的步骤。
60.在对其有需要的青少年对象中提高苯丙氨酸羟化酶(PAH)蛋白表达的方法，其包括向所述青少年对象施用治疗性病毒，其中所述治疗性AAV病毒包含编码功能活性的PAH的核酸序列。
61.治疗性AAV病毒在制备用于在对其有需要的青少年对象中提高苯丙氨酸羟化酶(PAH)蛋白的表达的药剂中的用途，其中所述AAV病毒包含编码功能活性的PAH的核酸序列。
62.组合物，其包含用于在对其有需要的青少年对象中提高苯丙氨酸羟化酶(PAH)蛋白表达的治疗性AAV病毒，其中所述AAV病毒包含编码功能活性的PAH的核酸序列。
63.根据权利要求60所述的方法，其中所述治疗性AAV病毒通过静脉内施用。
64.根据权利要求61或62所述的用途或组合物，其中所述AAV病毒配制用于静脉内施用。
65.根据权利要求60-64所述的方法、用途或组合物，其中将约1E12vg/kg至约2E16vg/kg的所述治疗性AAV病毒施用于所述青少年对象。
66.根据权利要求60-64所述的方法、用途或组合物，其中将约2E12vg/kg至约2E14vg/kg的所述治疗性AAV病毒施用于所述青少年对象。
67.根据权利要求60-64所述的方法、用途或组合物，其中将约6E12vg/kg至约2E14vg/kg的所述治疗性AAV病毒施用于所述青少年对象。
68.根据权利要求60-66中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述青少年对象为3周至5周大。
69.根据权利要求60-67中任一项所述的方法，还包括在施用治疗有效量的包含编码功能活性的PAH的核酸序列的AAV病毒之后，确定所述青少年对象的血清中是否存在抗-AAV衣壳抗体的步骤。
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