TW202016298A - Aav 載體於幼年受試者中之穩定表現 - Google Patents

Abstract

本發明係關於腺相關病毒(AAV)載體在幼年受試者肝臟中達成轉殖基因長期表現的用途。本發明包括在將AAV載體單次投與幼年受試者後，受試者的疾病症狀得到長期穩定的改善，其中所述AAV載體將轉殖基因遞送至受試者的肝臟。

Description

AAV載體於幼年受試者中之穩定表現

本申請案主張2018年5月14日提交之美國臨時專利申請案第62/671,271的優先權，該臨時專利申請案以引用的方式全文併入本文中。以電子方式提交之材料以引用之方式併入

本申請案包含電腦可讀形式的序列表作為本揭示案的單獨部分，其以引用的方式全文併入並且標識如下：文檔名：53094_Seqlisting.txt；大小：372,202個位元組；2019年5月11日建立。

本發明係關於腺相關病毒(AAV)載體在幼年受試者肝臟中達成轉殖基因長期表現的用途。本發明包括在將AAV載體單次投與幼年受試者後，受試者的疾病症狀得到長期穩定的改善，其中所述AAV載體將轉殖基因遞送至受試者的肝臟。

腺相關病毒(AAV)係一種小的複制缺乏型無包膜動物病毒，其感染人類及其他一些靈長類物種。AAV的若干個特徵使該病毒成為藉由基因療法遞送治療性蛋白質的有吸引力之媒介物，包括例如已知AAV不會引起人類疾病並且不會誘導輕度免疫反應，以及AAV載體可以感染分裂的細胞與休眠的細胞而不整合至宿主細胞基因組中。使用AAV的基因治療載體已成功用於一些臨床試驗，例如用於將人類因子IX(FIX)遞送至成人肝臟以治療血友病B。

儘管其具有陽性特徵，但AAV基因治療載體確實存在一些缺點。具體言之，AAV載體的選殖能力因病毒之DNA包裝能力而受到限制。野生型AAV的單股DNA基因組為約4.7千鹼基(kb)。在實務中，高達約5.0 kb的AAV基因組似乎被完全(亦即，全長)包裝成AAV病毒顆粒。在AAV載體中之核酸基因組必須具有約145個鹼基之兩個AAV反向末端重複序列(ITR)的條件下，AAV載體的DNA包裝能力使得最多約4.4 kb的蛋白質編碼序列可以用衣殼包裹。

AAV載體的另一個限制在於轉殖基因很少整合至靶細胞的基因組中。實情為，AAV載體係以游離型複本形式維持。雖然基因組整合的此缺乏合乎需要之處在於其降低所整合複本破壞宿主基因功能的風險，但是認為缺乏整合阻礙了在分裂細胞/生長組織中的使用，因為游離型複本在分裂細胞中隨時間而失去。此發現於例如幼年肝臟中，其中AAV介導的基因遞送導致載體基因組數目快速損失及轉殖基因表現的伴隨減少。參見例如Cunningham等人，分子療法(Molec. Ther. )(2008)第16卷，第1081-1088頁。

需要將治療性轉殖基因遞送至幼年受試者肝臟的方法，其中轉殖基因在臨床上顯著的時間長度內並且較佳在受試者一生中維持轉殖基因的有效表現水準。因此，本發明係關於編碼治療性蛋白質的AAV載體用於幼年受試者肝臟中的用途。具體言之，本發明提供將AAV載體遞送至幼年受試者肝臟的方法，其中AAV載體僅投與一次便在臨床上顯著的時間長度內提供治療有效水準的轉殖基因產生。

本發明提供了使用AAV載體在幼年受試者肝細胞中表現治療性蛋白質的方法。本發明的重組AAV載體包括非天然存在之AAV病毒衍生物，其中已引入編碼功能性治療性蛋白質的核酸序列。治療性蛋白質置換或補償內源基因產物活性的損失或減少。本發明治療性蛋白質的非限制性實例包括因子VIII、因子IX及苯丙胺酸羥化酶(PAH)，其分別用於置換患有血友病A、血友病B及苯酮尿症之受試者中失去的內源活性。

在一個態樣中，本發明提供改善罹患遺傳病症之幼年受試者之遺傳病症症狀的方法，包括向幼年受試者投與治療有效量之編碼治療性蛋白質之治療性AAV病毒的步驟，其中治療性蛋白質的表現改善遺傳病症的症狀。

在本發明的一個實施例中，治療性蛋白質為非功能性內源蛋白質的功能性複本。在本發明的另一個實施例中，治療性蛋白質為內源蛋白質的修飾形式。在本發明的另一個實施例中，治療性蛋白質為補償非功能性內源蛋白質的異源蛋白質。

在本發明的一個實施例中，幼年受試者為幼年人類。在另一個實施例中，幼年人類不到18歲。在本發明的另一個實施例中，幼年人類不到12歲。

在本發明的一個實施例中，投與治療性AAV病毒後，幼年受試者的肝細胞表現治療性蛋白質。在本發明的另一個實施例中，治療性AAV病毒係靜脈內投與。

在本發明的一個實施例中，遺傳病症為血友病。在本發明的另一個實施例中，遺傳病症為血友病A，且治療性蛋白質為因子VIII。在另一個實施例中，因子VIII為因子VIII-SQ。在一個較佳實施例中，治療性AAV病毒為AAV5-FVIII-SQ。在另一個實施例中，血友病為血友病B，且治療性蛋白質為因子IX。在另一個實施例中，因子IX為R338L因子IX。

在本發明的一個實施例中，遺傳病症為苯酮尿症(PKU)，且治療性蛋白質為苯丙胺酸羥化酶(PAH)。

在本發明的另一個實施例中，投與幼年受試者之治療性AAV病毒的量對應於治療性AAV病毒在成人受試者中有效之相同絕對數目。在本發明的其他實施例中，向幼年受試者投與約1E12 vg/kg至約1E15 vg/kg治療性AAV病毒。在一些實施例中，將約2E12 vg/kg至約2E13 vg/kg的治療性AAV病毒投與幼年受試者，或將約2E12 vg/kg至約2E14 vg/kg的治療性AAV病毒投與幼年受試者，或將約5E12 vg/kg至約5E13 vg/kg的治療性AAV病毒投與幼年受試者，或將約5E13 vg/kg至約5E14 vg/kg的治療性AAV病毒投與幼年受試者，或將約5E13至約5E15 vg/kg的治療性AAV病毒投與幼年受試者，或將約1E13 vg/kg至約1E14 vg/kg的治療性AAV病毒投與幼年受試者，或將約1E14 vg/kg至約1E15 vg/kg的治療性AAV病毒投與幼年受試者，或將約1E12 vg/kg至約2E16 vg/kg的治療性AAV病毒投與幼年受試者，或將約6E12 vg/kg至約2E14 vg/kg的治療性AAV病毒投與幼年受試者，或將約6E12 vg/kg至約6E13 vg/kg的治療性AAV病毒投與幼年受試者，或將約2E13 vg/kg至約2E15 vg/kg的治療性AAV病毒投與幼年受試者，或將約2E13 vg/kg至約2E16 vg/kg的治療性AAV病毒投與幼年受試者，或將約2E14 vg/kg至約2E16 vg/kg的治療性AAV病毒投與幼年受試者，將約6E13 vg/kg至約6E14 vg/kg的治療性AAV病毒投與幼年受試者。

在本發明的一個實施例中，將AAV病毒調配成醫藥組合物，其含有濃度約0.1 mg/ml至約3 mg/ml的磷酸氫二鈉；濃度約0.1 mg/ml至約3 mg/ml的單水合磷酸二氫鈉；濃度約1 mg/ml至約20 mg/ml的氯化鈉；濃度約5 mg/ml至約40 mg/ml的甘露糖醇，以及濃度約0.1 mg/ml至約4 mg/ml的泊洛沙姆188。

在本發明的某些實施例中，用濃度在5 mg/天至60 mg/天範圍內的皮質類固醇預防性地治療幼年受試者。在其他實施例中，用濃度5 mg/天至60 mg/天的皮質類固醇治療性治療幼年受試者。

在其他實施例中，本發明引起幼年受試者中至少約5 IU/dl的功能因子VIII蛋白表現。另一個實施例引起幼年受試者中至少約1 IU/dl的功能因子VIII蛋白增加。

在另一態樣中，本發明提供一種減少罹患血友病之幼年受試者之出血事件之出血時間的方法，其中所述方法包括在出血事件之前向幼年受試者投與治療有效量之治療性AAV病毒的步驟。在本發明的一個實施例中，投藥步驟在出血事件之前的至少三週進行。在另一個實施例中，治療性AAV病毒係靜脈內投與。在其他實施例中，血友病為血友病A，且治療性AAV病毒表現因子VIII。在另一個實施例中，因子VIII為因子VIII-SQ。在一個較佳實施例中，治療性AAV病毒為AAV5-FVIII-SQ。在另一個實施例中，血友病為血友病B，且治療性AAV病毒表現因子IX。在另一個實施例中，因子IX為R338L因子IX。在另一個實施例中，投與幼年受試者之治療性AAV病毒的量對應於治療性AAV病毒在成人受試者中有效的相同絕對數目。在其他實施例中，將約1E12vg/kg至約1E15vg/kg的治療性AAV病毒給予幼年受試者。在其他示例性實施例中，將約1E12 vg/kg至約1E16 vg/kg的治療性AAV病毒投與幼年受試者，或將約2E12 vg/kg至約2E13 vg/kg的治療性AAV病毒投與幼年受試者，或將約2E12 vg/kg至約2E14 vg/kg的治療性AAV病毒投與幼年受試者，或將約5E13 vg/kg至約5E14 vg/kg的治療性AAV病毒投與幼年受試者，或將約6E12 vg/kg至約6E14 vg/kg的治療性AAV病毒投與幼年受試者，或將約6E13 vg/kg至約6E14 vg/kg的治療性AAV病毒投與幼年受試者。在一個實施例中，將治療性AAV病毒調配成溶液，所述溶液包含濃度約0.1 mg/ml至約3 mg/ml的磷酸氫二鈉、濃度約0.1 mg/ml至約3 mg/ml的單水合磷酸二氫鈉、濃度約1 mg/ml至約20 mg/ml的氯化鈉、濃度約5 mg/ml至約40 mg/ml的甘露糖醇及濃度約0.1 mg/ml至約4 mg/ml的泊洛沙姆188。

在另一態樣中，本發明提供使有需要之幼年受試者中之因子VIII蛋白表現增加的方法，其中該方法包括向幼年受試者投與治療性病毒的步驟，其中治療性AAV病毒為AAV5-FVIII-SQ。在本發明的一個實施例中，治療性AAV病毒係靜脈內投與。在另一個實施例中，投與幼年受試者之治療性AAV病毒的量對應於治療性AAV病毒在成人受試者中有效的相同絕對數目。在另一個實施例中，將約1E12 vg/kg至約1E15 vg/kg治療性AAV病毒投與幼年受試者。在另一個實施例中，將約6E13 vg/kg至約6E14 vg/kg治療性AAV病毒投與幼年受試者。在其他實施例中，本發明引起幼年受試者中至少約5 IU/dl的功能因子VIII蛋白表現。在另外的實施例中，本發明引起幼年受試者中至少約1 IU/dl的功能因子VIII蛋白表現。在另一個實施例中，本發明引起幼年受試者中至少約1 IU/dl的功能性FVIII活性增加。在一個實施例中，用濃度在5 mg/天至60 mg/天範圍內的皮質類固醇治療幼年受試者。在其他實施例中，皮質類固醇治療係預防性進行。在其他實施例中，皮質類固醇治療係治療性進行。在另一個實施例中，在至少3、4、5、6、7、8、9或10週或更長的連續時間內，用濃度在5 mg/天至60 mg/天範圍內的皮質類固醇治療幼年受試者。本發明的一個實施例包括在投與治療有效量的AAV5-FVIII-SQ後確定幼年受試者血清中存在或不存在抗AAV衣殼抗體的步驟。在另一個實施例中，本發明包括在確定幼年受試者血清中存在抗AAV衣殼抗體後向受試者投與有效量之皮質類固醇的步驟。

編碼功能活性治療性蛋白質之基因組的長度較佳為至多7.0 kb，更佳為至多6.5 kb，又更佳為至多6.0 kb，又更佳為至多5.5 kb，又更佳為至多5.0 kb長度，其具有增強的啟動子功能。

如本文所用，「功能活性因子VIII」或「功能活性FVIII」為FVIII蛋白，其在活體外(當在培養細胞中表現時)或在活體內(當在細胞或身體組織中表現時)具有野生型FVIII蛋白的功能。在通篇本申請案中，術語「因子VIII」與「FVIII」相同並且可互換使用。此包括例如在功能上促成血液凝固級聯及/或減少罹患血友病A之受試者中血液凝結所花費的時間。野生型FVIII藉由凝血級聯參與血液凝固，充當活化因子IX(FIXa)的輔因子，其在鈣離子及磷脂的存在下形成將因子X(FX)轉化為活化FX(FXa)的複合物。因此，具功能活性的FVIII可與FIXa形成複合物，其可將FX轉化為FXa。功能活性FVIII蛋白的一個實例為如WO 2015/038625中所述的FVIII SQ蛋白，所述文獻以引用的方式併入本文。

本發明亦提供了使有需要之幼年受試者中之PAH蛋白表現增加的方法，包括向幼年受試者投與治療性病毒，其中治療性AAV病毒為AAV5-PAH。舉例而言，在任一方法中，靜脈內投與治療性AAV病毒。本發明亦提供治療性AAV病毒用於製備供增加有需要之幼年受試者中PAH蛋白表現之藥劑的用途，其中AAV病毒為AAV5-PAH。在另一個實施例中，本發明提供包含治療性AAV病毒的組合物，用於在有此需要之幼年受試者中增加PAH蛋白表現，其中AAV病毒為AAV5-PAH。在任一用途或組合物中，AAV病毒經調配用於靜脈內給藥。在用於增加PAH表現之此等方法、用途及組合物中，將約1E12 vg/kg至約1E16 vg/kg治療性AAV病毒投與幼年受試者，或將約2E12 vg/kg至約2E13 vg/kg治療性AAV病毒投與幼年受試者，或將約2E12 vg/kg至約2E14 vg/kg治療性AAV病毒投與幼年受試者，或將約5E13 vg/kg至約5E14 vg/kg治療性AAV病毒投與幼年受試者，或將約6E12 vg/kg至約6E14 vg/kg治療性AAV病毒投與幼年受試者。在任一方法、用途及組合物中，幼年受試者為約3週至約5週齡。舉例而言，幼年受試者約為3週齡，或約4週齡，或約5週齡，或約22日齡，或約23日齡，或約24日齡，或約25日齡，或約26日齡，或約27日齡，或約29日齡，或約30日齡，或約31日齡，或約32日齡，或約33日齡，或約34日齡。另外，此等方法中的任一種可以進一步包含在投與治療有效量的AAV5-PAH後確定幼年受試者血清中存在或不存在抗AAV衣殼抗體的步驟。

如本文所用，「AAV載體」係指具有AAV 5'反向末端重複(ITR)序列的單股或雙股核酸及AAV 3' ITR，所述ITR側接蛋白質編碼序列(較佳為功能性治療蛋白質編碼序列；例如FVIII、FIX及PAH)，所述蛋白質編碼序列可操作地連接至與AAV病毒基因組異源的轉錄調控元件，亦即，一種或多種啟動子及/或增強子及視情況存在的多腺苷酸化序列及/或在蛋白質編碼序列之外顯子之間所插入的一個或多個內含子。單股AAV載體係指存在於AAV病毒顆粒基因組中的核酸，並且可為本文所揭示之核酸序列的有義股或反義股。此類單股核酸的尺寸以鹼基提供。雙股AAV載體係指存在於質體(例如pUC19)DNA中的核酸，或用於表現或轉移AAV載體核酸之雙股病毒(例如桿狀病毒)的基因組。此類雙股核酸的尺寸以鹼基對(bp)提供。

如本文所用，術語「反向末端重複序列(ITR)」係指在AAV基因組之5'及3'末端發現的本領域公認之區域，其作為DNA複製起點及作為病毒基因組的包裝信號起順式作用。AAV ITR與AAV rep編碼區一起實現插入兩個側翼ITR之間之核苷酸序列的有效切除及救援以及整合至宿主細胞基因組中。某些AAV相關ITR之序列揭示於Yan等人,J. Virol. (2005)第79卷, 第364-379頁中，所述文獻以全文引用的方式併入本文中。可用於本文的ITR序列可以是保留功能能力的全長野生型AAV ITR或其片段，或者可以是能夠作為複制起點起順式作用之全長野生型AAV ITR的序列變異體。可用於本發明重組AAV FVIII載體的AAV ITR可衍生自任何已知的AAV血清型，並且在某些較佳實施例中，衍生自AAV2或AAV5血清型。

「轉錄調節元件」係指參與遺傳轉錄調節之基因的核苷酸序列，包括啟動子，加上響應元件，活化因子及增強子序列，用於結合轉錄因子以幫助RNA聚合酶結合且促進表現；以及抑制蛋白所結合的操縱或靜默序列，以阻斷RNA聚合酶附著且阻止表現。術語「肝特異性轉錄調節元件」係指特異性調節肝臟組織中基因表現的調節元件。肝特異性調節元件的實例包括但不限於小鼠甲狀腺素啟動子(mTTR)、內源人類因子VIII啟動子(F8)、人類α-1-抗胰蛋白酶啟動子(hAAT)及其活性片段、人類白蛋白最小啟動子及小鼠白蛋白啟動子。亦涵蓋衍生自肝特異性轉錄因子結合位點的增強子，例如具有Enh1的EBP、DBP、HNF1、HNF3、HNF4、HNF6。

在一個實施例中，本發明的AAV載體包含編碼功能活性因子VIII蛋白的核酸，所述功能活性因子VIII蛋白具有被14個胺基酸SQ序列置換的B結構域。SQ序列揭示於Ward等人，Blood (2011) 第117卷，第798-807頁；McIntosh等人，Blood (2013) 第121卷，第3335-3344頁；WO 2013/186563；及WO 2015/038625。FVIII編碼區序列可為密碼子最佳化的FVIII編碼序列(參見例如美國專利申請公開案US2015158930、US2015071883及US20170216408；及美國專利9,447,168及9,504,762，所述文獻以全文引用的方式併入本文)。在一個示例性實施例中，編碼AAV載體或重組AAV病毒顆粒之功能活性人類FVIII蛋白的核酸由編碼功能性FVIII蛋白序列之核酸序列SEQ ID NO: 1的核苷酸403至4776組成；該序列在本文中稱為「FVIII-SQ」或「因子VIII-SQ」。在示例性實施例中，本發明的AAV載體包含SEQ ID NO: 1-45中任一者所示的核酸序列。

在一個實施例中，本發明的AAV載體包含編碼功能活性因子IX蛋白的核酸。因子IX編碼序列可為野生型、密碼子最佳化的或變異體(參見例如美國專利4,994,371，其以全文引用的方式併入本文)。在某些實施例中，因子IX編碼序列編碼其中在位置338之精胺酸殘基發生變化的蛋白質，其中精胺酸殘基變為丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、絲胺酸或蘇胺酸。在較佳實施例中，將位置338的精胺酸殘基變為白胺酸(R338L因子IX)(參見例如美國專利6,531,298；美國專利9,249,405；美國專利申請公開案US2002/0031799；及美國專利申請公開案US2011/0244550，所有此等文獻以全文引用的方式併入本文)。在一個示例性實施例中，本發明的AAV載體包含編碼SEQ ID NO: 46之因子IX蛋白質序列的核酸序列或經修飾的FIX蛋白質，所述蛋白質在SEQ ID NO: 46之位置338的精胺酸已發生變化。

在另一個實施例中，本發明的AAV載體包含編碼功能活性苯丙胺酸羥化酶(PAH)蛋白的核酸，例如編碼SEQ ID NO: 48之野生型PAH胺基酸序列的核酸序列。PAH編碼序列可為野生型、密碼子最佳化的或變異體(參見例如Fang等人,Gene Ther. , 第1卷, 第247-254頁(1994)；Eisensmith等人，,J. Inherit.Metab.Dis. , 第19卷, 第412-423頁(1996)；Nagasaki等人,Pediatr.Res. , 第45卷, 第465-473頁(1999)；及Laipis等人,Mol. Ther. , 第7卷, 第S391-S392頁(2003))。野生型PAH由SEQ ID NO: 47的核酸序列編碼。在一個示例性實施例中，本發明的AAV載體包含編碼SEQ ID NO: 48之野生型PAH蛋白序列的核酸序列。在示例性實施例中，本發明的AAV載體包含SEQ ID NO: 49-55中任一者所示的核酸序列。包含編碼功能活性PAH之核酸的示例性AAV載體提供於2019年5月8日提交的美國臨時申請案第62/755,207號及國際申請案第PCT/US2019/031252號(其主張美國臨時申請案第62/755,207號的優先權)中，兩者均以全文引用的方式併入本文。

在其他實施例中，本發明的重組AAV載體包含核酸，所述核酸包含AAV2 5'反向末端重複序列(ITR)(其可以或可以不如本領域已知的那樣修飾)、肝臟特異性轉錄調節區域、密碼子最佳化治療性蛋白質編碼區、視情況存在的一個或多個內含子、多腺苷酸化序列及AAV2 3' ITR(其可以或可以不如本領域已知的那樣修飾)。在某些實施例中，治療性蛋白質為人類因子VIII或其變異體。在其他實施例中，治療性蛋白質為人類因子IX或其變異體。在另外的實施例中，治療性蛋白質為人類PAH或其變異體。在一個較佳實施例中，肝特異性轉錄調節區包含縮短的ApoE增強子序列；186個鹼基人類α抗胰蛋白酶(hAAT)近端啟動子，包括5'非轉譯區(UTR)的42個鹼基；一個或多個增強子，其選自(i)34個鹼基人類ApoE/C1增強子、(ii)32個鹼基人類AAT啟動子遠端X區，及(iii)人類AAT近端啟動子之遠端元件的80個額外鹼基；及編碼FVIII-SQ變異體的密碼子最佳化功能活性FVIII編碼區。在另一個較佳實施例中，肝特異性轉錄調節區包含α-微球蛋白增強子序列及186個鹼基人類α抗胰蛋白酶(AAT)近端啟動子。

在其他實施例中，本發明係關於編碼功能因子VIII多肽的載體構建體，其中構建體依一種或多種不同取向包含上述構建體的一種或多種個別元件及其組合。本發明亦係關於呈相反取向的上述構建體。本發明亦係關於包含本文所述AAV FVIII載體的重組AAV病毒顆粒及其用於治療血友病A的用途。

在其他實施例中，本發明係關於編碼功能因子IX多肽的載體構建體，其中所述構建體依一種或多種不同取向包含上述構建體的一種或多種個別元件及其組合。本發明亦係關於呈相反取向的上述構建體。本發明亦係關於包含本文所述AAV IX載體的重組AAV病毒顆粒及其用於治療幼年受試者之血友病B的用途。

在其他實施例中，本發明係關於編碼功能性PAH多肽的載體構建體，其中構建體依一種或多種不同取向包含上述構建體的一種或多種個別元件及其組合。本發明亦係關於呈相反取向的上述構建體。本發明亦係關於包含本文所述AAV PAH載體的重組AAV病毒顆粒及其在幼年受試者中用於治療PKU的用途。

呈單股形式之本發明AAV載體長度小於約7.0 kb，或長度小於6.5 kb，或長度小於6.4 kb，或長度小於6.3 kb，或長度小於6.2 kb，或長度小於6.0 kb，或長度小於5.8 kb，或長度小於5.6 kb，或長度小於5.5 kb，或長度小於5.4 kb，或長度小於5.4 kb，或長度小於5.2 kb或長度小於5.0 kb。呈單股形式之本發明AAV載體的長度範圍為約5.0 kb至約6.5 kb，或長度範圍為約4.8 kb至約5.2 kb，或長度範圍為4.8 kb至5.3 kb，或長度範圍為約4.9 kb至約5.5 kb，或長度範圍為約4.8 kb至約6.0 kb，或長度範圍為約5.0 kb至6.2 kb，或長度範圍為約5.1 kb至約6.3 kb，或長度範圍為約5.2 kb至約6.4 kb，或長度約為5.5 kb至約6.5 kb。

在另一個實施例中，本發明提供產生包含本發明之任何AAV載體之重組腺相關病毒(AAV)顆粒的方法。方法包括培養已經本發明之任何AAV載體(與各種AAV帽及rep基因結合)轉染之細胞及自轉染細胞上清液中回收重組治療性AAV病毒顆粒的步驟。

可用於產生重組AAV的本發明細胞為容易被任何對桿狀病毒感染的細胞類型，包括昆蟲細胞，諸如High Five、Sf9、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf9、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、BM-N、Ha2302、Hz2E5及Ao38。使用的較佳哺乳動物細胞可為HEK293、HeLa、CHO、NSO、SP2/0、PER.C6、Vero、RD、BHK、HT 1080、A549、Cos-7、ARPE-19及MRC-5。

本發明亦提供重組病毒顆粒，其包含本發明的任何AAV載體或藉由本發明前述方法產生的任何病毒顆粒。

「AAV病毒粒子(AAV virion)」或「AAV病毒顆粒(AAV viral particle)」或「AAV載體顆粒」或｢AAV病毒｣係指由至少一種AAV衣殼蛋白及衣殼化聚核苷酸AAV載體構成之病毒顆粒，如本文所述。若顆粒包含異源聚核苷酸(亦即除野生型AAV基因組之外的聚核苷酸，諸如待遞送至哺乳動物細胞之轉殖基因)，則其典型地稱為「AAV載體顆粒」或簡稱為「AAV載體」。因此，AAV載體顆粒之產生必定包含AAV載體之產生，原因為此載體包含於AAV載體顆粒內。

如本文所用，「治療性AAV病毒」係指AAV病毒粒子、AAV病毒顆粒、AAV載體顆粒或AAV病毒，其包含編碼治療性蛋白質的異源聚核苷酸。

如本文所用，「治療性蛋白質」係指具有置換或補償內源蛋白質活性損失或降低之生物活性的多肽。舉例而言，當用於置換患有血友病A之受試者中之無活性人類因子VIII的活性時，人類因子VIII的功能性複本或其功能片段為治療性蛋白質。類似地，功能性人類因子IX為罹患血友病B之受試者的治療性蛋白質，且功能性苯丙胺酸羥化酶(PAH)為苯酮尿症(PKU)的治療性蛋白質。

如本文所用，「幼年受試者」係指生理上不成熟或未發育的受試者。具體言之，幼年受試者為多個組織或器官之細胞仍然以大於成熟受試者之速率分裂的受試者。在某些實施例中，幼年受試者為人類。在另一個實施例中，幼年受試者為不到18歲的人類。在另一個實施例中，幼年受試者為不到12歲的人類。本發明的幼年受試者包括小於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18歲的人類。

如本文所用，「遺傳病症」係指由受試者基因組中的一種或多種異常引起的病症。在一個較佳實施例中，遺傳病症為單基因的，此意謂其由單個基因之一個或兩個複本的異常引起。基因組異常破壞基因並導致被破壞之基因所編碼之內源蛋白質的活性降低或損失，並且遺傳病症的症狀由內源蛋白質的活性降低或損失引起。

如本文所用，「穩定治療(stably treating)」或「穩定治療(stable treatment)」係指使用投與幼年受試者之治療性AAV病毒進行的治療性治療，其中幼年受試者穩定表現由治療性AAV病毒表現的治療性蛋白質。穩定表現的治療性蛋白質意謂蛋白質在臨床上顯著的時間長度內表現。如本文所用，「臨床上顯著的時間長度」係指在治療有效水準上表現的時間長度，其對幼年受試者的生活品質具有有意義的影響。在某些實施例中，無需靜脈內或皮下投與替代療法證明對生活品質的有意義之影響。在某些實施例中，臨床上顯著的時間長度為表現至少六個月，至少八個月，至少一年，至少兩年，至少三年，至少四年，至少五年，至少六年，至少七年，至少八年，至少九年，至少十年，或受試者之至少一生。

在另一個實施例中，本發明提供治療罹患血友病A之幼年受試者的方法，包括向幼年受試者投與治療有效量之本發明的任何因子VIII AAV載體，或本發明的病毒顆粒，或藉由本發明方法產生的病毒顆粒。

在另一個實施例中，本發明提供增加有需要之幼年受試者中之循環FVIII蛋白含量的方法，包括向幼年受試者投與本發明的任何AAV載體，或本發明的病毒顆粒，或藉由本發明方法產生的病毒顆粒。

在另一個實施例中，本發明提供增加有需要之幼年受試者中之循環因子IX蛋白含量的方法，包括向幼年受試者投與本發明的任何AAV載體，或本發明的病毒顆粒，或藉由本發明方法產生的病毒顆粒。

在另一個實施例中，本發明提供增加有需要之受試者中之循環PAH蛋白含量的方法，包括向受試者投與本發明的任何AAV載體，或本發明的病毒顆粒，或藉由本發明方法產生的表現PAH蛋白之病毒顆粒。

在另一個實施例中，本發明提供包含如本文所述之治療性AAV病毒顆粒的醫藥調配物。更特定言之，在某些態樣中，本發明係關於醫藥調配物，其包含表現因子VIII、因子IX或PAH之重組AAV病毒；緩沖劑；等張劑；增積劑；及界面活性劑。在特別較佳實施例中，本發明的醫藥調配物包含AAV5-FVIII-SQ或本文所述及/或在儲存期間穩定至少兩週的任何其他載體。

在本發明的其他實施例中，醫藥調配物包含濃度約0.1 mg/ml至約3 mg/ml的磷酸氫二鈉、濃度約0.1 mg/ml至約3 mg/ml的單水合磷酸二氫鈉、濃度約1 mg/ml至約20 mg/ml的氯化鈉、濃度約5 mg/ml至約40 mg/ml的甘露糖醇，及濃度約0.1 mg/ml至約4 mg/ml的泊洛沙姆188。在一個尤佳實施例中，本發明之醫藥調配物包含濃度約1.42 mg/ml之磷酸氫二鈉、濃度約1.38 mg/ml之單水合磷酸二氫鈉、濃度約8.18 mg/ml之氯化鈉、濃度約20 mg/ml之甘露糖醇及濃度約2 mg/ml之泊洛沙姆188。

本發明的醫藥調配物可以呈液體形式，並且可以包含濃度約1E12 vg/ml至約2E14 vg/ml，濃度更佳約2E13 vg/ml的AAV治療性蛋白質病毒顆粒。在一個實施例中，本發明的醫藥調配物可用於靜脈內投與罹患血友病A、血友病B或PKU的人類。

本發明亦係關於用於穩定治療罹患血友病A之幼年受試者的方法、用途及組合物，其包括向受試者投與治療有效量之重組AAV因子VIII病毒的步驟，其視情況可以如上文所述調配。在較佳實施例中，罹患血友病A的幼年受試者為人類。在一個實施例中，重組AAV因子VIII病毒為AAV5-FVIII-SQ。在一個實施例中，投藥步驟藉由靜脈內(IV)投與完成。在本發明的某些態樣中，投藥步驟引起幼年受試者血流中至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多IU/dl因子VIII蛋白的穩定表現，較佳為幼年受試者血流中至少約5 IU/dl因子VIII蛋白的穩定表現。在某些實施例中，在投藥後的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20週或更多週，投藥步驟引起幼年受試者血流中至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 IU/dl或更多因子VIII蛋白的表現。在某些實施例中，因子VIII蛋白在幼年受試者血流中表現至少約6、7、8、9、10、11、12個月或更多個月。在某些實施例中，因子VIII蛋白在幼年受試者血流中表現至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年。在某些實施例中，投與幼年受試者之AAV因子VIII病毒的治療有效量係基於在成人受試者中發現為有效劑量之治療性AAV病毒的相同絕對數目。治療有效量可以在每公斤體重至少1E12 vg至每公斤體重至少1E15 vg範圍內。

在某些實施例中，除了投與治療有效量的AAV因子VIII病毒外，亦用皮質類固醇預防，治療或兩者治療受試者，以預防及/或治療與投與AAV因子VIII病毒相關的任何肝毒性。在一個實施例中，藉由比較基線(亦即，預先給與因子VIII AAV)丙胺酸轉胺酶(ALT)水準與治療後ALT水準來測量相關的肝毒性，其中給藥後ALT水準的增加為相關肝毒性的證據。預防性皮質類固醇治療係指投與皮質類固醇以預防肝毒性及/或預防受試者中的所測量ALT水準增加。治療性皮質類固醇治療係指投與皮質類固醇以減少由投與AVV因子VIII病毒引起的肝毒性及/或降低由投與AAV因子VIII病毒引起的受試者血流中ALT濃度升高。在某些實施例中，預防性或治療性皮質類固醇治療可包括向受試者投與至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 mg/天或更多的皮質類固醇。在某些實施例中，受試者的預防性或治療性皮質類固醇治療可以在至少約3、4、5、6、7、8、9、10週或更長的連續時段內發生。

本發明亦係關於用於穩定治療罹患血友病B之幼年受試者的方法、用途及組合物，其包括向受試者投與治療有效量之重組AAV因子IX病毒的步驟，其視情況可以如上所述調配。在較佳實施例中，罹患血友病B的幼年受試者為人類。在一個實施例中，重組AAV因子IX病毒表現R338L因子IX。在一個實施例中，投藥步驟藉由靜脈內(IV)投與完成。在本發明的某些態樣中，投藥步驟引起幼年受試者血流中至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 IU/dl或更多因子IX蛋白的穩定表現，較佳為幼年受試者血流中至少約5 IU/dl因子IX蛋白的穩定表現。在某些實施例中，在投藥後的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20週或更多週，投藥步驟引起幼年受試者血流中至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 IU/dl或更多因子IX蛋白的表現。在某些實施例中，因子IX蛋白在幼年受試者血流中表現至少約6、7、8、9、10、11、12個月或更多個月。在某些實施例中，因子IX蛋白在幼年受試者血流中表現至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年。在某些實施例中，投與幼年受試者之AAV因子IX病毒的治療有效量係基於在成人受試者中發現為有效劑量之治療性AAV病毒的相同絕對數目。治療有效量可以在每公斤體重至少1E12 vg至每公斤體重至少1E15 vg範圍內。在某些實施例中，除了投與治療有效量的AAV因子IX病毒之外，在預防上、治療上或兩者上用皮質類固醇治療受試者以預防及/或治療與投與AAV因子IX病毒相關的任何肝毒性。在一個實施例中，藉由比較基線(亦即，預先給與因子IX AAV)丙胺酸轉胺酶(ALT)水準與治療後ALT水準來測量相關的肝毒性，其中給藥後ALT水準的增加為相關肝毒性的證據。預防性皮質類固醇治療係指投與皮質類固醇以預防肝毒性及/或預防受試者中的所測量ALT水準增加。治療性皮質類固醇治療係指投與皮質類固醇以減少由投與AVV因子IX病毒引起的肝毒性及/或降低由投與AAV因子IX病毒引起的受試者血流中ALT濃度升高。在某些實施例中，預防性或治療性皮質類固醇治療可包括向受試者投與至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 mg/天或更多的皮質類固醇。在某些實施例中，受試者的預防性或治療性皮質類固醇治療可以在至少約3、4、5、6、7、8、9、10週或更長的連續時段內進行。

本發明亦係關於治療有效量的重組AAV因子VIII病毒用於製備供治療罹患血友病A之幼年受試者之藥劑的用途。在某些實施例中，AAV因子VIII病毒為AAV5-FVIII-SQ或包含p-100 ATGB載體的病毒。藥劑視情況可以如上所述調配。在較佳實施例中，罹患血友病A的幼年受試者為人類。在一個實施例中，藥劑藉由靜脈內(IV)投與來投與。在本發明的一個態樣中，在投藥後的16週或更長時間，投藥引起受試者血流中至少約5 IU/dl因子VIII蛋白的表現，較佳為幼年受試者血流中至少約5 IU/dl因子VIII蛋白的表現。在某些實施例中，所述藥劑亦包含預防性及/或治療性皮質類固醇，用於預防及/或治療與投與AAV因子VIII病毒相關的任何肝毒性。包含預防性或治療性皮質類固醇療法的藥劑可包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 mg/天或更多的皮質類固醇。在某些實施例中，包含預防性或治療性皮質類固醇的藥劑可以在至少約3、4、5、6、7、8、9、10週或更長的連續時段內投與。

本發明亦係關於治療有效量的重組AAV因子IX病毒用於製備供治療罹患血友病B之幼年受試者之藥劑的用途。在某些實施例中，AAV因子IX病毒表現R338L因子IX 。藥劑視情況可以如上所述調配。在較佳實施例中，罹患血友病B的幼年受試者為人類。在一個實施例中，藥劑藉由靜脈內(IV)投與來投與。在本發明的一個態樣中，在投藥後的16週或更長時間，投藥引起受試者血流中至少約5 IU/dl因子IX蛋白的表現，較佳引起幼年受試者血流中至少約5 IU/dl因子IX蛋白的表現。在某些實施例中，所述藥劑亦包含預防性及/或治療性皮質類固醇，用於預防及/或治療與投與AAV因子IX病毒相關的任何肝毒性。包含預防性或治療性皮質類固醇療法的藥劑可包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 mg/天或更多的皮質類固醇。在某些實施例中，包含預防性或治療性皮質類固醇的藥劑可以在至少約3、4、5、6、7、8、9、10週或更長的連續時段內投與。

本發明亦係關於包含治療有效量之重組AAV因子VIII病毒的組合物，其用於減少罹患血友病A之幼年受試者之出血事件的出血時間。在一個實施例中，AAV因子VIII病毒為AAV5-FVIII-SQ。組合物視情況可以如上所述調配。在較佳實施例中，罹患血友病A的幼年受試者為人類。可以在出血事件之前投與組合物。在一個實施例中，組合物在出血事件之前藉由靜脈內(IV)投與來投與。在本發明的一個態樣中，投藥步驟引起幼年受試者血流中至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 IU/dl或更多因子VIII蛋白的表現，較佳引起幼年受試者血流中至少約5 IU/dl因子VIII蛋白的表現。在某些實施例中，在投藥後的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20週或更多週，投藥步驟引起幼年受試者血流中至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 IU/dl或更多因子VIII蛋白的表現。在某些實施例中，包含用於減少出血時間之治療有效量之AAV因子VIII病毒的組合物與包含用於預防及/或治療與投與AAV因子VIII病毒相關之任何肝毒性之預防性及/或治療性皮質類固醇的組合物一起投與。

本發明亦係關於包含治療有效量之重組AAV因子IX病毒的組合物，其用於減少罹患血友病A之幼年受試者之出血事件的出血時間。在一個實施例中，AAV因子IX表現R338L因子IX。組合物視情況可以如上所述調配。在較佳實施例中，罹患血友病A的幼年受試者為人類。可以在出血事件之前投與組合物。在一個實施例中，組合物在出血事件之前藉由靜脈內(IV)投與來投與。在本發明的一個態樣中，投藥步驟引起幼年受試者血流中至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 IU/dl或更多因子IX蛋白的表現，較佳引起幼年受試者血流中至少約5 IU/dl因子IX蛋白的表現。在某些實施例中，在投藥後的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20週或更多週，投藥步驟引起幼年受試者血流中至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 IU/dl或更多因子IX蛋白的表現。在某些實施例中，包含用於減少出血時間之治療有效量之AAV因子IX病毒的組合物與包含用於預防及/或治療與投與AAV因子IX病毒相關之任何肝毒性之預防性及/或治療性皮質類固醇的組合物一起投與，如上所述。

本發明亦係關於治療有效量的重組AAV PAH病毒用於製備供治療罹患PKU之幼年受試者之藥劑的用途。藥劑視情況可以如上所述調配。在較佳實施例中，罹患PKU的幼年受試者為人類。在一個實施例中，藥劑藉由靜脈內(IV)投與來投與。在本發明的一個態樣中，在投藥後的16週或更長時間內，投藥引起的受試者血流中之PAH蛋白表現足以降低幼年受試者血流中苯丙胺酸的濃度。在某些實施例中，所述藥劑亦包含用於預防及/或治療與投與AAV PAH病毒相關之任何肝毒性的預防性及/或治療性皮質類固醇。包含預防性或治療性皮質類固醇療法的藥劑可包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 mg/天或更多的皮質類固醇。在某些實施例中，包含預防性或治療性皮質類固醇的藥劑可以在至少約3、4、5、6、7、8、9、10週或更長的連續時段內投與。

本發明亦係關於在有需要之幼年受試者中誘導功能性治療性蛋白質表現的方法，所述方法包括向受試者投與表現如本文所述之治療性蛋白質之重組AAV病毒的步驟，所述病毒視情況可以如本文所述調配，其中此類投藥引起受試者血流中功能性治療蛋白質的表現增加或功能性治療蛋白質的濃度增加。在較佳實施例中，有需要的受試者為人類。在一個實施例中，投藥步驟藉由靜脈內(IV)投與完成。在本發明的一個態樣中，投藥步驟引起治療性蛋白質在幼年受試者血流中表現，較佳為在正常幼年受試者中所發現之治療性蛋白質含量的至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%或150%。在某些實施例中，在投藥後的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20週或更多週，投藥步驟引起的表現為在正常幼年受試者中所發現之治療性蛋白質含量的至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%或150%。

在某些實施例中，除了投與表現治療性蛋白質的AAV病毒之外，在預防上、在治療上或在此兩者上，用皮質類固醇治療受試者以預防及/或治療與投與AAV病毒相關的任何肝毒性，如上所述。此外，在本發明的任何方法中，在投與AAV病毒以增加治療性蛋白質表現後，確定受試者血清中抗AAV衣殼抗體的存在或不存在。若確定受試者的血清中具有抗AAV衣殼抗體，則涵蓋向血清中具有抗AAV衣殼抗體的受試者投與有效量的皮質類固醇。

本發明亦係關於本發明AAV病毒用於製備藥劑的用途，所述藥劑用於在有需要之幼年受試者中誘導功能性治療蛋白質的表現，其中所述重組AAV病毒表現如本文所述的治療性蛋白質，且所述藥劑視情況可以如本文所述調配，其中此類藥劑引起受試者血流中功能性治療蛋白質的表現增加或功能性治療蛋白質的濃度增加。在較佳實施例中，將藥劑投與有需要的人類受試者。在一個實施例中，藥劑藉由靜脈內(IV)投與來投與。在本發明的一個態樣中，投藥引起治療性蛋白質在幼年受試者的血流中表現，較佳為正常幼年受試者中所發現之治療性蛋白質含量的至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%或150%。在某些實施例中，在投藥後的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20週或更多週，投藥在幼年受試者血流中引起正常幼年受試者中所發現之治療性蛋白質含量之至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%或150%的表現。

在某些實施例中，除了投與表現治療性蛋白質的AAV病毒之外，在預防上、在治療上或在此兩者上，用皮質類固醇治療受試者以預防及/或治療與投與AAV病毒相關的任何肝毒性，如上所述。此外，在本發明的任何用途中，在投與藥劑以增加治療性蛋白質的表現後，確定受試者血清中抗AAV衣殼抗體的存在或不存在。若確定受試者血清中具有抗AAV衣殼抗體，則涵蓋使用有效量的皮質類固醇製備藥劑的用途，所述藥劑用於投與血清中具有抗AAV衣殼抗體的受試者。

本發明亦係關於用於在有需要的幼年受試者中誘導功能性治療蛋白質表現的組合物，其中所述組合物包含表現如本文所述之治療性蛋白質的重組AAV病毒，其視情況可如本文所述調配，其中此類組合物的投藥引起受試者血流中的功能性治療蛋白質表現增加或功能性治療蛋白質濃度增加。在較佳實施例中，有需要的受試者為人類。在一個實施例中，組合物經調配用於靜脈內(IV)投藥。在本發明的一個態樣中，組合物的投與引起治療性蛋白質在幼年受試者血流中表現，較佳為正常幼年受試者中所發現之治療性蛋白質含量的至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%或150%。在某些實施例中，在投藥後的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20週或更多週，組合物的投與在幼年受試者血流中引起正常幼年受試者中所發現之治療性蛋白質含量之至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%或150%的表現。

本領域技術人類員在閱讀本專利說明書後，顯而易知本發明的其他實施例。

本發明提供編碼功能活性治療性蛋白質的AAV載體(例如完全包裝的AAV因子VIII載體、AAV因子IX載體及AAV PAH載體)。本發明的重組AAV治療性蛋白質載體具有改良的轉殖基因表現，以及改良的AAV病毒產量及簡化的純化。將一個或多個內含子引入治療性蛋白質編碼區增強了表現。重新配置增強子的數目及位置亦增強了表現。 AAV載體

如本文所用，術語「AAV」為腺相關病毒之標準縮寫。腺相關病毒為僅在某些功能藉由共感染輔助病毒提供之細胞中生長之單股DNA小病毒。當前存在十三種已表徵之AAV血清型。AAV之總體資訊及評述可見於例如Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, 第1卷, 第169-228頁；及Berns, 1990, Virology, 第1743-1764頁, Raven Press, (New York)。然而，完全預期此等相同原理將適用於其他AAV血清型，因為熟知各種血清型在結構上與功能上非常緊密相關，甚至在基因層面上亦如此。(參見例如Blacklowe, 1988, Parvoviruses and Human Disease第165-174頁, J. R. Pattison編；及Rose, Comprehensive Virology 3:1-61 (1974))。舉例而言，所有AAV血清型明顯展現由同源rep基因介導之極類似複製特性；並且所有皆帶有三種相關衣殼蛋白質異雙螺旋分析進一步表明相關程度，所述分析揭露各血清型之間沿著基因組長度存在廣泛的交叉雜交；及在對應於「反向末端重複序列」(ITR)的末端存在類似的自黏接區段。類似感染模式亦表明各血清型之複製功能處於類似調節控制下。

如本文所用，「AAV載體」係指包括一種或多種所關注之聚核苷酸(或轉殖基因)之載體，所述聚核苷酸側接AAV末端重複序列(ITR)並且可操作地連接至一個或多個表現控制元件。感染性病毒顆粒當存在於已經編碼及表現rep及cap基因產物之載體轉染的宿主細胞中時，此類AAV載體可以在感染性病毒顆粒中複製且包裝。

「AAV病毒粒子」或「AAV病毒顆粒」或「AAV載體顆粒」係指由至少一個AAV衣殼蛋白及衣殼化聚核苷酸AAV載體組成之病毒顆粒。若顆粒包含異源聚核苷酸(亦即除野生型AAV基因組之外的聚核苷酸，諸如待傳遞至哺乳動物細胞之轉殖基因)，則其通常稱為「AAV載體顆粒」或簡稱為「AAV載體」。因此，AAV載體顆粒的產生必定包括AAV載體的產生，原因為此類載體包含於AAV載體顆粒中。

AAV「rep」及「cap」基因分別為編碼複製及衣殼蛋白的基因。迄今檢查的所有AAV血清型中均已發現AAV rep及cap基因，並且在本文及所引用的參考文獻中已描述。在野生型AAV中，通常發現rep及cap基因在病毒基因組中彼此相鄰(亦即，其作為相鄰或重疊的轉錄單元「偶聯」在一起)，並且其在AAV血清型中通常是保守的。AAV rep及cap基因亦個別地及統稱為「AAV包裝基因」。根據本發明的AAV cap基因編碼Cap蛋白，所述Cap蛋白能夠在rep及腺輔助功能的存在下包裝AAV載體並且能夠結合靶細胞受體。在一些實施例中，AAV cap基因編碼具有衍生自特定AAV血清型之胺基酸序列的衣殼蛋白。

用於產生AAV的AAV序列可以源自任何AAV血清型的基因組。通常，AAV血清型的基因組序列在胺基酸及核酸層面上具有顯著同源性，提供一組類似遺傳功能，產生基本上在實體上及功能上等效的病毒粒子，並藉由幾乎相同的機制複製及組裝。關於AAV血清型的基因組序列及基因組相似性的討論。(參見例如GenBank登錄號U89790；GenBank登錄號J01901；GenBank登錄號AF043303；GenBank登錄號AF085716；Chiorini等人，J. Vir. (1997) 第71卷, 第6823-6833頁；Srivastava等人,J. Vir. (1983) 第45卷, 第555-564頁；Chiorini等人,J. Vir. (1999) 第73卷, 第1309-1319頁；Rutledge等人,J. Vir. (1998) 第72卷, 第309-319頁；及Wu等人,J. Vir. (2000) 第74卷, 第8635-8647頁)。

所有已知AAV血清型的基因組組織非常相似。AAV基因組為線性單股DNA分子，其長度小於約5,000個核苷酸(nt)。反向末端重複序列(ITR)側接非結構複製(Rep)蛋白及結構(VP)蛋白的獨特編碼核苷酸序列。VP蛋白形成衣殼。末端145 nt自身互補並且經組織以使得可以形成能量穩定性分子內雙螺旋，其形成T形髮夾。此等髮夾結構用作病毒DNA複製的起點，用作細胞DNA聚合酶複合物的引子。Rep基因編碼Rep蛋白Rep78、Rep68、Rep52及Rep40。Rep78及Rep68由p5啟動子轉錄，且Rep 52及Rep40由p19啟動子轉錄。cap基因編碼VP蛋白VP1、VP2及VP3。cap基因由p40啟動子轉錄。本發明載體中使用的ITR可以對應於與相關cap基因相同的血清型，或者可以不同。在特別較佳實施例中，本發明載體中使用的ITR對應於AAV2血清型，並且cap基因對應於AAV5血清型。

在一些實施例中，編碼AAV衣殼蛋白的核酸序列可操作地連接至表現控制序列，用於在特定細胞類型中表現，諸如Sf9或HEK細胞。本領域技術人類員已知用於在昆蟲宿主細胞或哺乳動物宿主細胞中表現外源基因的技術可用於實施本發明。用於分子工程及昆蟲細胞中表現多肽的方法描述於例如Summers及Smith (1986) A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bull.No. 7555, College Station, Tex.; Luckow (1991) 於Prokop等人, Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors' Recombinant DNA Technology and Applications, 97-152；King, L. A.及R. D. Possee (1992) The baculovirus expression system, Chapman and Hall, United Kingdom; O'Reilly, D. R., L. K. Miller, V. A. Luckow (1992) Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York; W.H. Freeman and Richardson, C. D.(1995) Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, 第39卷; 美國專利第4,745,051號；第US2003148506號；及WO 03/074714，所有此等文獻以全文引用的方式併入。特別適用於轉錄編碼AAV衣殼蛋白之核苷酸序列的啟動子為例如多角體啟動子。然而，在昆蟲細胞中有活性的其他啟動子是本領域已知的，例如p10、p35或IE-1啟動子，並且亦涵蓋上述參考文獻中描述的其他啟動子。

昆蟲細胞用於表現異源蛋白質的用途已被充分證明，將核酸(諸如載體，例如昆蟲細胞相容性載體)引入此類細胞的方法及此類細胞在培養物中維持的方法亦已充分證明。(參見例如METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Richard編, Humana Press, N J (1995)；O'Reilly等人, BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS, A LABORATORY MANUAL, Oxford Univ.Press (1994)；Samulski等人,J. Vir. (1989)第63卷, 第3822-3828頁；Kajigaya等人,Proc. Nat'l.Acad. Sci. USA (1991)第88卷, 第4646-4650頁；Ruffing等人,J. Vir. (1992)第66卷, 第6922-6930頁；Kirnbauer等人,Vir. (1996)第219卷, 第37-44頁；Zhao等人,Vir. (2000)第272卷, 第382-393頁；及美國專利第6,204,059號)。在一些實施例中，編碼昆蟲細胞中之AAV的核酸構建體為昆蟲細胞相容的載體。如本文所用，「昆蟲細胞相容性載體」或「載體」係指能夠有效轉型或轉染昆蟲或昆蟲細胞的核酸分子。示例性生物載體包括質體、線性核酸分子及重組病毒。可以使用任何載體，只要其與昆蟲細胞相容即可。載體可以整合至昆蟲細胞基因組中，但載體無需永久存在於昆蟲細胞中，並且亦包括短暫游離型載體。載體可以藉由任何已知方法引入，例如藉由細胞的化學處理、電穿孔或感染。在一些實施例中，載體為桿狀病毒、病毒載體或質體。在更佳的實施例中，載體為桿狀病毒，亦即構建體為桿狀病毒載體。桿狀病毒載體及其使用方法描述於關於昆蟲細胞分子工程的上述參考文獻中。

桿狀病毒為節肢動物的包膜DNA病毒，其中兩個成員為用於在細胞培養物中產生重組蛋白的熟知表現載體。桿狀病毒具有環狀雙股基因組(80-200 kbp)，其可以經工程改造以允許將大的基因組內容物遞送至特定細胞。用作載體的病毒通常是苜蓿銀紋夜蛾多囊核多角體病毒(AcMNPV)或家蠶(Bm)NPV)。

桿狀病毒通常用於感染昆蟲細胞以表現重組蛋白。具體而言，異源基因在昆蟲中的表現可以如以下文獻所述完成：例如美國專利第4,745,051號；Friesen等人(1986)；EP 127,839；EP 155,476；Vlak等人(1988)；Miller等人(1988)；Carbonell等人(1988)；Maeda等人(1985)；Lebacq-Verheyden等人(1988)；Smith等人(1985)；Miyajima等人(1987)；及Martin等人(1988)。Luckow等人(1988)；Miller等人(1986)；Maeda等人(1985)及McKenna (1989)中描述可用於產生蛋白質的許多桿狀病毒株及變異體以及相應的允許昆蟲宿主細胞。 產生重組AAV的方法

本揭示案提供用於在昆蟲或哺乳動物細胞中產生重組AAV的材料及方法。在一些實施例中，病毒構建體進一步包含啟動子及啟動子下游的限制性位點，以允許插入編碼一種或多種所關注蛋白質的聚核苷酸，其中啟動子及限制性位點位於5' AAV ITR的下游及3' AAV ITR的上游。在一些實施例中，病毒構建體進一步包含限制性位點下游及3' AAV ITR上游的轉錄後調控元件。在一些實施例中，病毒構建體進一步包含插入限制性位點並可操作地連接至啟動子的聚核苷酸，其中聚核苷酸包含所關注蛋白質的編碼區。如本領域技術人類員將理解，本申請案中所揭示的任一種AAV載體可以在所述方法中用作病毒構建體以產生重組AAV。

在一些實施例中，輔助功能由一種或多種輔助質體或包含腺病毒或桿狀病毒輔助基因的輔助病毒提供。腺病毒或桿狀病毒輔助基因的非限制性實例包括但不限於E1A、E1B、E2A、E4及VA，其可向AAV包裝提供輔助功能。

AAV的輔助病毒是本領域已知的，且包括例如來自腺病毒科(Adenoviridae)及疱疹病毒科(Herpesviridae)的病毒。AAV的輔助病毒實例包括但不限於美國公開案第20110201088號中描述的SAdV-13輔助病毒及SAdV-13樣輔助病毒(其揭示內容以引用方式併入本文)、輔助載體pHELP(Applied Viromics)。本領域技術人類員將瞭解，本文可使用能夠為AAV提供足夠輔助功能的任何輔助病毒或AAV輔助質體。

在一些實施例中，AAV cap基因存在於質體中。質體可以進一步包含AAV rep基因，其可以對應於或不對應於與cap基因相同的血清型。來自任何AAV血清型(包括但不限於AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13及其任何變異體)的cap基因及/或rep基因在本文中可以用於產生重組AAV。在一些實施例中，AAV cap基因編碼來自血清型1、血清型2、血清型4、血清型5、血清型6、血清型7、血清型8、血清型9、血清型10、血清型11、血清型12、血清型13或其變異體的衣殼。

在一些實施例中，昆蟲或哺乳動物細胞可以用輔助質體或輔助病毒、病毒構建體及編碼AAV cap基因的質體轉染；並且可以在共轉染後的不同時間點收集重組AAV病毒。舉例而言，可以在共轉染後的約12小時、約24小時、約36小時、約48小時、約72小時、約96小時、約120小時或任意此兩個時間點之間的時間收集重組AAV病毒。

重組AAV亦可使用本領域已知的適於產生感染性重組AAV之任何習知方法產生。在一些情況下，可以藉由使用穩定表現AAV顆粒產生所需之一些組件的昆蟲或哺乳動物細胞來產生重組AAV。舉例而言，可以將包含AAV rep及cap基因的質體(或多個質體)及選擇標記(諸如新黴素抗性基因)整合至細胞的基因組中。昆蟲或哺乳動物細胞接著可以用輔助病毒(例如提供輔助功能的腺病毒或桿狀病毒)及包含5'及3' AAV ITR的病毒載體(以及編碼異源蛋白的核苷酸序列，若需要)共轉染。此方法之優勢在於細胞為可選的且適用於大規模生產rAAV。作為另一個非限制性實例，可以使用腺病毒或桿狀病毒而非質體將rep及cap基因引入包裝細胞中。作為另一個非限制性實例，含有5'及3' AAV LTR的病毒載體與rep-cap基因均可以穩定地整合至生產細胞的DNA中，並且可以藉由產生重組AAV的野生型腺病毒提供輔助功能。 AAV生產中使用的細胞類型

包含本發明AAV載體的病毒顆粒可以使用允許產生AAV或生物產物並且可以在培養物中維持的任何無脊椎動物細胞類型產生。舉例而言，所用昆蟲細胞系可以來自草地夜蛾(Spodoptera frugiperda )(諸如SF9、SF21、SF900+)、果蠅細胞系、蚊細胞系(例如白紋伊蚊 (Aedes albopictus )衍生的細胞系)、家蠶細胞系(例如桑蠶(Bombyx mori )細胞系)、粉紋夜蛾(Trichoplusia)細胞系(諸如High Five細胞)，或鱗翅目細胞系(諸如黑巫婆飛蛾(Ascalaphaodorata )細胞系)。較佳的昆蟲細胞為來自容易感染桿狀病毒之昆蟲物種的細胞，包括High Five、Sf9、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf9、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、BM-N、Ha2302、Hz2E5及Ao38。

桿狀病毒為節肢動物的包膜DNA病毒，其中兩個成員為用於在細胞培養物中產生重組蛋白的熟知表現載體。桿狀病毒具有環狀雙股基因組(80-200 kbp)，其可以經工程改造以允許將大的基因組內容物遞送至特定細胞。用作載體的病毒通常是苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica )多 衣殼核多角體病毒(AcMNPV)或家蠶(Bm-NPV)(Kato等人，2010)。

桿狀病毒通常用於感染昆蟲細胞以表現重組蛋白。具體而言，異源基因在昆蟲中的表現可以如以下文獻中所述完成：例如美國專利第4,745,051號；Friesen等人(1986)；EP 127,839；EP 155,476；Vlak等人(1988)；Miller等人(1988)；Carbonell等人(1988)；Maeda等人(1985)；Lebacq-Verheyden等人(1988)；Smith等人(1985)；Miyajima等人(1987)；及Martin等人(1988)。Luckow等人(1988)；Miller等人(1986)；Maeda等人(1985)及McKenna (1989)描述可用於產生蛋白質的許多桿狀病毒株及變異體以及相應的允許昆蟲宿主細胞。

在本發明的另一個態樣中，本發明的方法亦用允許AAV複製或生物產物產生並且可以在培養物中維持的任何哺乳動物細胞類型進行。所用較佳哺乳動物細胞可為HEK293、HeLa、CHO、NSO、SP2/0、PER.C6、Vero、RD、BHK、HT 1080、A549、Cos-7、ARPE-19及MRC-5細胞。 醫藥調配物

在其他實施例中，本發明係關於表現AAV載體/病毒粒子之治療性蛋白質的醫藥調配物，其用於投與罹患遺傳病症的受試者。在某些態樣中，本發明的醫藥調配物為液體製劑，其包含表現由本文所揭示載體產生的表現重組治療性蛋白之AAV病毒粒子，其中調配物中的重組AAV病毒粒子濃度可以廣泛變化。在某些實施例中，調配物中的重組AAV病毒粒子濃度可為1E12 vg/ml至2E16 vg/ml。在特別較佳實施例中，調配物中的重組AAV病毒粒子濃度為約2E13 vg/ml。在較佳實施例中，調配物中存在的重組AAV病毒粒子衍生自AAV5-FVIII-SQ。在本發明的其他較佳實施例中，調配物中存在的重組AAV病毒粒子衍生自表現因子IX或表現PAH的AAV載體。

在其他態樣中，本發明的AAV醫藥調配物包含一種或多種醫藥學上可接受的賦形劑，以使調配物具有用於儲存及/或投與受試者以治療遺傳病症的有利特性。在某些實施例中，本發明的醫藥調配物能夠在-65℃下儲存至少2週，較佳至少4週，更佳至少6週且又更佳至少約8週的時段，而穩定性不會發生可偵測到的變化。在此態樣中，術語「穩定」係指調配物中存在的重組AAV病毒在儲存期間基本上保持其物理穩定性、化學穩定性及/或生物活性。在本發明之某些實施例中，存在於醫藥調配物中的重組AAV病毒在-65℃儲存確定之時間段期間保持其在人類患者中之生物活性的至少約80%，更佳為其在幼年人類受試者中之生物活性的至少約85%、90%、95%、98%或99%。

在某些態樣中，包含重組AAV病毒粒子的調配物進一步包含一種或多種緩沖劑。舉例而言，在多個態樣中，本發明的調配物包含濃度約0.1 mg/ml至約3 mg/ml、約0.5 mg/ml至約2.5 mg/ml、約1 mg/ml至約2 mg/ml或約1.4 mg/ml至約1.6 mg/ml的磷酸氫二鈉。在特別較佳實施例中，本發明的AAV調配物包含約1.42 mg/ml的磷酸氫二鈉(乾燥)。可用於本發明重組AAV調配物中的另一種緩沖劑為單水合磷酸二氫鈉，在一些實施例中，其使用濃度為約0.1 mg/ml至約3 mg/ml，約0.5 mg/ml至約2.5 mg/ml，約1 mg/ml至約2 mg/ml，或約1.3 mg/ml至約1.5 mg/ml。在特別較佳實施例中，本發明的AAV調配物包含約1.38 mg/ml的單水合磷酸二氫鈉。在本發明之又一更特別較佳實施例中，本發明的重組AAV調配物包含約1.42 mg/ml磷酸氫二鈉及約1.38 mg/ml的單水合磷酸二氫鈉。

在另一態樣中，本發明的重組AAV調配物可包含一種或多種等張劑，諸如氯化鈉，其濃度較佳為約1 mg/ml至約20 mg/ml，例如約1 mg/ml至約10 mg/ml、約5 mg/ml至約15 mg/ml，或約8 mg/ml至約20 mg/ml。在特別較佳實施例中，本發明的調配物包含約8.18 mg/ml的氯化鈉。本領域已知的其他緩沖劑及等張劑為合適的並且可以常規用於本揭示案的調配物中。

在另一態樣中，本發明的重組AAV調配物可包含一種或多種增積劑。示例性增積劑包括但不限於甘露糖醇、蔗糖、葡聚醣、乳糖、海藻糖及聚維酮(PVP K24)。在某些較佳實施例中，本發明的調配物包含甘露糖醇，其存在的量可為約5 mg/ml至約40 mg/ml，或約10 mg/ml至約30 mg/ml，或約15 mg/ml至約25 mg/ml。在特別較佳實施例中，甘露糖醇以約20 mg/ml的濃度存在。

在另一個態樣中，本發明的重組AAV調配物可包含一種或多種界面活性劑，其可為非離子界面活性劑。示例性界面活性劑包括離子界面活性劑、非離子界面活性劑及其組合。舉例而言，界面活性劑可為(但不限於)TWEEN 80(亦稱為聚山梨醇酯80，或其化學名稱聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯)、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸鈉、十二烷基硫酸銨、TRITON AG 98(Rhone-Poulenc)、泊洛沙姆407、泊洛沙姆188及其類似物，及其組合。在一個特別較佳實施例中，本發明的調配物包含泊洛沙姆188，其可以存在的濃度為約0.1 mg/ml至約4 mg/ml，或約0.5 mg/ml至約3 mg/ml，約1 mg/ml至約3 mg/ml，約1.5 mg/ml至約2.5 mg/ml，或約1.8 mg/ml至約2.2 mg/ml。在特別較佳實施例中，泊洛沙姆188以約2.0 mg/ml的濃度存在。

在本發明之一個特別較佳實施例中，本發明的醫藥調配物包含液體溶液中所調配的AAV5-FVIII-SQ，所述液體溶液包含約1.42 mg/ml的磷酸氫二鈉、約1.38 mg/ml的單水合磷酸二氫鈉、約8.18 mg/ml氯化鈉、約20 mg/ml甘露糖醇及約2 mg/ml泊洛沙姆188。

本揭示案之含有表現重組治療性蛋白質之AAV病毒的調配物係穩定的並且可以儲存延長的時段，而品質、效力或純度不會發生不可接受的變化。在一個態樣中，調配物在約5℃(例如2℃至8℃)的溫度下穩定至少1個月，例如至少1個月、至少3個月、至少6個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月或更長時間。在另一個態樣中，調配物在小於或等於約-20℃的溫度下穩定至少6個月，例如至少6個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月、至少36個月或更長時間。在另一個態樣中，調配物在小於或等於約-40℃的溫度下穩定至少6個月，例如至少6個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月、至少36個月或更長時間。在另一個態樣中，調配物在小於或等於約-60℃的溫度下穩定至少6個月，例如至少6個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月、至少36個月或更長時間。 治療方法

在某些實施例中，本發明係關於治療罹患遺傳病症之受試者的方法，包括向該受試者投與治療有效量之表現治療性蛋白質的AAV載體或包含其的醫藥組合物。在此情況下，「治療有效量」為AAV載體的量，其在投與後引起治療性蛋白質的表現量足以至少部分地且較佳完全改善遺傳病症的症狀。

舉例而言，本發明係關於治療病症或病症(包括癌症，諸如癌瘤、肉瘤、白血病、淋巴瘤)的方法；及自體免疫疾病，諸如多發性硬化症。癌瘤的非限制性實例包括食道癌；肝細胞癌；基底細胞癌；鱗狀細胞癌(各種組織)；膀胱癌，包括移行細胞癌；支氣管源性癌；結腸癌；結腸直腸癌；胃癌；肺癌，包括小細胞肺癌及非小細胞肺癌；腎上腺皮質癌；甲狀腺癌；胰臟癌；乳癌；卵巢癌；前列腺癌；腺癌；汗腺癌；皮脂腺癌；乳頭狀癌；乳頭狀腺癌；囊腺癌；髓樣癌；腎細胞癌；導管原位癌或膽管癌；絨毛膜癌；精原細胞瘤；胚胎癌；威爾姆氏腫瘤(Wilm's tumor)；宮頸癌；子宮癌；睾丸癌；成骨細胞癌；上皮癌；及鼻咽癌。肉瘤的非限制性實例包括纖維肉瘤、黏膜肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、成骨肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤及其他軟組織肉瘤。實體瘤的非限制性實例包括神經膠質瘤、星形細胞瘤、神經管胚細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、寡突神經膠質瘤、血管瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤及視網膜母細胞瘤。白血病的非限制性實例包括慢性骨髓增生症候群；急性髓性白血病；慢性淋巴球白血病，包括B細胞CLL、T細胞CLL前淋巴球白血病及毛細胞白血病；及急性淋巴母細胞白血病。淋巴瘤的實例包括但不限於B細胞淋巴瘤，諸如伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)；霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)及其類似淋巴瘤。可使用本文所揭示之AAV載體、重組病毒及方法治療之病症的其他非限制性實例包括遺傳性病症，包括鐮狀細胞性貧血、囊性纖維化、溶酶體酸性脂肪酶(LAL)缺乏症1、泰伊-薩奇病(Tay-Sachs disease)、苯酮尿症、黏多醣貯積病、糖原貯積病(GSD，例如GSD I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII及XIV型)、半乳糖血症、肌營養不良症(例如杜琴恩肌營養不良症(Duchenne muscular dystrophy))、威爾遜氏病(Wilson's disease)、遺傳性血管性水腫(HAE)、α1抗胰蛋白酶缺乏症、法布里病(Fabry Disease)、戈謝病(Gaucher Disease)及血友病，諸如血友病A(典型血友病)及血友病B(聖誕病)。此外，本文所揭示的AAV載體、重組病毒及方法可用於其他病症，所述其他病症可藉由肝臟中轉殖基因的局部表現或藉由表現來自肝臟或肝細胞的分泌蛋白質來治療。

在一個較佳實施例中，本發明係關於罹患血友病A之幼年受試者在出血事件期間減少出血時間的方法，包括向該幼年受試者投與治療有效量的AAV FVIII載體、重組AAV FVIII病毒或包含其的醫藥組合物。就此而言，關於治療血友病A或用於罹患血友病A之受試者在出血事件期間減少出血時間之方法中的「治療有效量」係指能夠引起一種或多種以下效果的量：(1)在一定程度上減輕、抑制或預防血友病A的一種或多種生理症狀，包括例如瘀傷、關節疼痛或腫脹、長期頭痛、嘔吐或疲勞；(2)血液凝固能力的改善；(3)出血事件期間總出血時間的減少；(4)投藥引起受試者血漿中功能性FVIII蛋白的濃度或活性的可測量的增加；及/或(5)在某種程度上緩解與所述病症相關的一種或多種症狀。

可以憑經驗及以常規方式確定如本文所述用於治療目的之AAV載體或病毒或包含其之醫藥組合物的「治療有效量」。在一個特別較佳實施例中，用於治療幼年受試者之治療性AAV病毒的治療有效量為已測定、計算或估計可在成年受試者中產生治療反應之病毒顆粒的相同絕對數目。因此，當以vg/kg體重測量時，本發明提供向幼年受試者投與AAV載體的劑量高於與成年受試者。在一些實施例中，當以vg/kg表示時，此相當於給予成人之AAV載體量的2至15倍。然而，在某些實施例中，重組AAV病毒的「治療有效量」範圍為約1E12 vg/kg體重至約1E14 vg/kg體重，較佳約6E12 vg/kg體重至約6E13 vg/kg體重。在較佳實施例中，重組AAV病毒的治療有效量為約2E13 vg/kg體重。在另一個較佳實施例中，重組AAV病毒的治療有效量為約6E13 vg/kg體重。

本發明的重組AAV載體/病毒可以藉由各種已知的投藥技術投與幼年受試者，較佳幼年哺乳動物受試者，更佳幼年受試者。在一個較佳實施例中，重組AAV基因治療病毒係作為單次推注或在延長的時間段(其可為至少約1、5、10、15、30、45、60、75、90、120、150、180、210或240分鐘或更長時間)內藉由靜脈注射投與。在較佳實施例中，所投與的重組AAV病毒表現因子VIII、因子IX或PAH。在本發明特別較佳實施例中，所投與的重組AAV病毒為AAV5-FVIII-SQ。

與投藥前受試者血漿中存在之功能性FVIII蛋白活性的量相比，投與本發明的重組AAV FVIII載體/病毒或包含其的醫藥調配物較佳在受試者血漿中引起至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 IU/dl或更多功能性FVIII蛋白活性的增加。在某些實施例中，投與本發明的重組AAV FVIII載體/病毒或包含其之醫藥調配物在受試者血漿中引起至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多IU/dl的功能性FVIII蛋白活性。就此而言，關於FVIII活性的術語「IU」或「國際單位」為經充分理解及接受的術語，其中1 IU的FVIII活性等於1 ml正常人類血漿中FVIII的量。血漿中的FVIII活性可以藉由許多熟知且可接受的分析來定量測定，包括例如活化的部分促凝血活酶時間(APPT)方法(參見例如Miletich JP: Activated partial thromboplastin time。於Williams Hematology.第五版.E Beutler, M A Lichtman, B A Coller, T J Kipps.編, New York, McGraw-Hill, 1995, 第L85-86頁, Greaves及Preston, Approach to the bleeding patient。於Hemostasis and Thrombosis: Basic Principles and Clinical Practice.第四版.R W Colman, J Hirsh, V J Marder等人編, Philadelphia, JB Lippincott Co, 2001, 第1197-1234頁及Olson等人, (1998)Arch.Pathol.Lab.Med. , 第122卷, 第782-798頁)或色素原FXa分析(Harris等人, (2011)Thromb.Res. , 第128卷, 第125-129頁)。

在本發明的其他實施例中，受試者的出血時間可以藉由熟知且接受的技術測量，包括例如Ivy方法(參見例如Ivy等人, (1935)Surg.Gynec.Obstet. , 第60卷, 第781頁(1935)及Ivy等人, (1941)J. Lab.Clin.Med. , 第26卷, 第1812頁)或杜克方法(Duke method)(參見例如Duke等人, (1910)JAMA , 第55卷, 第1185頁)。受試者中的「出血事件」係指引起受試者在外部或內部出血的損傷，並且通常包括自受傷至血凝塊形成的時間段。

在涉及表現PAH之AAV載體治療幼年受試者之PKU的本發明態樣中，可以藉由測量經治療之幼年受試者血液中的苯丙胺酸含量來監測AAV載體的有效性。用於測定苯丙胺酸循環含量的精確定量分析是本領域熟知的，包括螢光分析(參見McCaman, M.W.及Robins, E., (1962)J. Lab.Clin.Med., 第59卷, 第885-890頁)；基於薄層層析之分析(參見Tsukerman, G. L.(1985)Laboratornoe delo , 第6卷, 第326-327頁)；酶分析(參見La Du, B. N.等人, (1963)Pediatrics , 第31卷, 第39-46頁；及Peterson, K.等人, (1988)Biochem.Med. Metab.Biol. , 第39卷, 第98-104頁)；利用高壓液相層析(HPLC)的方法(參見Rudy, J. L.等人, (1987)Clin.Chem. , 第33卷, 第1152-1154頁)；及高通量自動化分析(參見Hill, J. B.等人, (1985)Clin.Chem. , 第5卷, 第541-546頁)。

在某些情況下，投與本發明的AAV病毒可引起可觀測程度的肝毒性。肝毒性可藉由各種熟知的常規使用技術測量，例如在AAV投與之前(亦即，基線)及AAV投與之後，測量受試者血流中某些肝相關酶(例如丙胺酸轉胺酶，ALT)的濃度。AAV投與後，ALT濃度之可觀測到的增加(與投與前相比)表明藥物誘導的肝毒性。在本發明的某些實施例中，除了投與治療有效量的AAV病毒之外，可以在預防上、在治療上或這兩者上用皮質類固醇治療受試者，以預防及/或治療與投與AAV病毒相關的任何肝毒性。

「預防性」皮質類固醇治療係指投與皮質類固醇以預防肝毒性及/或預防受試者中的ALT含量測量值增加。「治療性」皮質類固醇治療係指投與皮質類固醇以減少由投與AVV病毒引起的肝毒性及/或降低由投與AAV病毒引起的受試者血流中升高的ALT濃度。在某些實施例中，預防性或治療性皮質類固醇治療可包括向受試者投與至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 mg/天或更多的皮質類固醇。在某些實施例中，受試者的預防性或治療性皮質類固醇治療可以在至少約3、4、5、6、7、8、9、10週或更長的連續時段內進行。可用於本文所述方法的皮質類固醇包括任何已知的或常規使用的皮質類固醇，包括例如地塞米松(dexamethasone)、潑尼松(prednisone)、氟氫可的松(fludrocortisone)、氫化可的松(hydrocortisone)及其類似物。 偵測抗AAV抗體

為了使利用系統性AAV介導治療性基因轉移成功進行肝轉導的可能性最大化，在如上所述將AAV載體以治療方案投與人類患者之前，可以評估預期患者中之抗AAV衣殼抗體的存在，所述抗體能夠阻斷細胞轉導或以其他方式降低治療方案的總效率。此類抗體可以存在於預期患者的血清中，並且可以針對任何血清型的AAV衣殼。在一個實施例中，預先存在的抗體所針對的血清型為AAV5。

偵測預先存在之AAV免疫性的方法是本領域熟知的常規使用方法，包括基於細胞的活體外轉導抑制(TI)分析、活體內(例如在小鼠中)TI分析，及基於ELISA偵測總抗衣殼抗體(TAb)(參見例如Masat等人， Discov.Med. , 第15卷, 第379-389頁及Boutin等人, (2010)Hum. Gene Ther. , 第21卷, 第704-712頁)。TI分析可以使用其中已預先引入AAV誘導型報導載體的宿主細胞。報導載體可以包含誘導型報導基因，諸如GFP等，其表現在AAV病毒轉導宿主細胞後誘導。存在於人類血清中之能夠預防/減少宿主細胞轉導的抗AAV衣殼抗體因此會降低系統中報導基因的總體表現。因此，可以利用此類分析來偵測人類血清中抗AAV衣殼抗體的存在，其能夠預防/減少治療性FVIII AAV病毒的細胞轉導。

用於偵測抗AAV衣殼抗體的TAb分析可以使用固相結合的AAV衣殼作為人類血清通過的「捕捉劑」，從而允許血清中存在的抗衣殼抗體結合固相結合的衣殼「捕捉劑」。一旦洗滌去除非特異性結合，則可以使用「偵測劑」來偵測與捕捉劑結合之抗衣殼抗體的存在。偵測劑可為抗體、AAV衣殼或其類似物，並且可以可偵測地標記以有助於偵測及定量所結合的抗衣殼抗體。在一個實施例中，偵測劑用釕或釕錯合物標記，其可以使用電化學發光技術及設備偵測。

可以利用相同的上述方法來評估及偵測先前用所關注治療性AAV病毒治療之患者中抗AAV衣殼免疫反應的產生。因此，在用治療性AAV病毒治療之前，不僅可以利用此等技術來評估抗AAV衣殼抗體的存在，而且可以在投藥後利用其評估及測量針對所投與之治療性AAV病毒之免疫反應的誘導。因此，本發明涵蓋將偵測人類血清中之抗AAV衣殼抗體的技術與投與用於治療血友病A之治療性AAV病毒之技術組合的方法，其中用於偵測人類血清中之抗AAV衣殼抗體的技術可以是在投與治療性AAV病毒之前或之後進行。

考慮以下說明性實例，將理解本發明的其他態樣及優點。實例 實例 1 AAV 年齡比較研究

為了檢查幼年小鼠對AAV介導之基因治療的反應能力，將表現人類因子VIII的兩劑AAV(AAV5-FVIII-SQ)投與兩組幼年小鼠(2日齡)Rag2/FVIII雙敲除小鼠(DKO)。所有劑量均藉由尾靜脈在靜脈內投與。成年(8週齡)Rag2/FVIII DKO小鼠用作對照並用3.5E13 vg/kg處理，其在成年小鼠中對應於每隻小鼠8.9E11 vg。第1組幼年小鼠(2日齡)用與成年小鼠相同的單位體重劑量(亦即3.5E13 vg/kg)治療，而第2組幼年小鼠(2日齡)用與成年小鼠相同的絕對vg/小鼠進行治療(亦即，每隻小鼠8.9E11 vg，相當於2日齡小鼠中4.5E14 vg/kg)。圖1A及1B提供研究設計及樣品採集時間點。在AAV投與後，將個組幼年小鼠充分研究至成年期(超過8週齡)。

為了確定幼年肝細胞攝取AAV5-FVIII-SQ的能力，測量經處理之幼年及成年小鼠之肝臟中的FVIII DNA及FVIII RNA之量。如圖2所示，接受與成年小鼠相同總vg(每隻小鼠8.9E11 vg；4.5E14 vg/kg體重幼年小鼠)之幼年小鼠中的FVIII DNA含量與成年小鼠相似，證明由於幼年小鼠中之肝細胞分裂而DNA無額外的損失。根據關於AAV載體的文獻，該結果令人驚訝，該文獻教導用AAV處理之幼年肝細胞由於細胞分裂及動物生長而失去病毒基因組。另外，如圖2(右圖)所示，在給予AAV5-FVIII-SQ的成年小鼠中，因子VIII RNA含量隨時間增加。令人驚訝的是，給予與成年小鼠相同絕對劑量的幼年小鼠展現出因子VIII RNA隨時間出現類似增加。此等資料表明幼年肝細胞攝取AAV基因組及表現AAV所遞送之轉殖基因的能力與成年肝細胞相同，並且與本領域的教導相反，幼年肝細胞在組織生長及細胞分裂期間不會失去病毒基因組。

AAV投與後藉由隨時間測量體重與肝重來評估AAV處理對幼年小鼠之整體健康及發育的影響。如圖3所示，AAV處理之幼年小鼠的肝重與體重均隨時間增加並且在投與後8週達到正常成年水準。此外，為了評估靶向肝臟中之轉殖基因表現的AAV療法是否導致肝損傷，測量血液丙胺酸胺基轉移酶(ALT)含量。如圖4所示，儘管載體基因組給予幼年小鼠的絕對量與成年相同，亦即，單位體重的vg水準高於對照成年動物，但ALT含量未響應於AAV5-FVIII-SQ處理而增加。總之，此等資料表明AAV處理對幼年小鼠的整體健康或發育無負面影響，並且儘管投與相對高水準的病毒基因組但不會引起肝損傷。

藉由測量血漿因子VIII濃度及估計總循環因子VIII蛋白來評估AAV遞送之轉殖基因在幼年小鼠中的治療有效性。如圖5所示，以與成年相同之劑量(基於單位體重)(3.5E13 vg/kg)處理的幼年動物在其達到成年後不產生治療水準的因子VIII。該結果與先前研究一致，證明在AAV投與後數週，幼年肝細胞停止產生可偵測水準的經AAV投與之轉殖基因。令人驚訝的是，給予成年劑量之絕對數目個病毒基因組(8.9E11 vg)的幼年小鼠最初表現高水準的血漿因子VIII。由於血容量擴大，此等水準在第1週與第3週之間下降。然而，循環因子VIII的總量自第1週至第16週研究結束時保持穩定。幼年小鼠中維持的此因子VIII蛋白水準，雖然比經處理之成年小鼠中所見之水準低五至六倍，但仍處於治療有效窗內。因此，此等資料表明，當AAV以每個受試者絕對病毒基因組量之成年劑量投與時，AAV有效遞送治療劑量的轉殖基因。此外，此等資料表明轉殖基因表現穩定並長時間保持恆定。實例 2 幼年 PKU 受試者肝臟中之 PAH 的遞送及表現

在哺乳動物中，肝酶苯丙胺酸羥化酶(PAH)將體內過量的苯丙胺酸(Phe)轉化為酪胺酸(Tyr)。在人類中，編碼PAH之基因突變可導致酶的產生或活性減少或缺乏，引起體內Phe積累及Tyr含量降低，產生表型後果，包括生長障礙、淺膚色及髮色、認知缺乏、睡眠障礙及癲癇發作。在人類中，此類疾病狀態稱為苯酮尿症(PKU)。PKU的ENU2小鼠模型(Sheldovsky 1993)係藉由使用N-乙基-N-亞硝基脲(ENU)在編碼PAH之基因的外顯子7中進行化學誘變來建立。Phe263經Ser263置換，導致PAH蛋白水準輕度降低，但PAH催化活性偵測不到。此類似於在大部分人類PKU患者中發現的突變，其中Phe263已突變為Leu263。ENU2小鼠的表型中已有若干在PKU患者中再現，包括血漿及組織中的高Phe含量、低Tyr含量、小體型/體重、淺棕色毛色(而野生型對應物呈黑色)，及癲癇發作。

將雄性ENU2小鼠募集至如下所列的個別年齡組(n=10/組)，並在大約年齡時以2e14 vg/kg靜脈內註射AAV5-PAH：第一組，在2日齡時投與AAV；第二組，在1週齡時投與AAV；第三組，在2週齡時投與AAV；第四組，在3週齡時投與AAV；第五組，在5週齡時投與AAV；及第六組，在8週齡時投與AAV(總體研究設計參見圖7)。

在研究開始前及給藥後第四週及第八週測量體重。在給藥後4週及8週收集血樣，處理成血漿，並藉由液相層析/質譜分析Phe。使用含有穩定同位素內標(13C9,15N(PheIS))的乙腈沈澱血漿蛋白。上清液藉由與苯甲醯氯反應而衍生化，並在LC-MS/MS注射前稀釋。

在給藥之前，每個年齡組動物的體重相似(圖8A)。給藥後四週(圖8B)，在3或8週齡時用AAV5-PAH處理的動物，而非在2日齡或1、2或5週齡時處理的動物，其體重增加明顯大於其經載體處理的對應物。截至給藥後8週(圖8C)，5週齡時處理的小鼠亦達成比對照組顯著更多的體重增加。

在4週(圖9A)與8週(圖9B)時間點，5或8週齡時處理之小鼠中Phe含量降低至WT範圍。3週齡時處理之小鼠具有更大的可變phe含量，表明部分響應。2日齡、1週或2週齡時處理之小鼠的血漿Phe無明顯降低。

當小鼠在處理時為至少5週齡時，2E14 vg/kg AAV5PAH處理對低體重及高血漿Phe之ENU2表型達成最大作用。當小鼠在3週齡進行處理時，對體重有顯著影響，但對Phe減少僅有部分影響。

圖1A及1B分別提供研究設計的圖示及圖表。簡而言之，對照成年小鼠(8週齡)給予單次劑量的AAV5-FVIII-SQ(3.5E13 vg/kg，每隻小鼠約8.9E11 vg)。將幼年小鼠(2日齡)分成兩組。一組接受單次劑量的AAV5-FVIII-SQ，其總vg與成年小鼠相同(8.9E11 vg/小鼠)。另一組接受單次劑量的AAV5-FVIII-SQ，其vg/kg與成年小鼠相同(3.5E13 vg/kg)。 圖2為一組圖，其表明幼年(其劑量總vg與成年相同)與成年攝入AAV病毒DNA的能力相同，如左圖中的總肝臟因子VIII DNA及右圖中的總肝臟因子VIII RNA所示。 圖3為一組圖，其表明在AAV5-FVIII-SQ投與後，幼年小鼠的體重(左圖)與肝重(右圖)均迅速增加。 圖4圖示AAV5-FVIII-SQ在幼年小鼠中不引起肝損傷，如藉由ALT測量所確定。 圖5為一組圖，其表明幼年小鼠需要的載體基因組總量與成年相同以維持成年期的治療性因子VIII水準。左圖顯示隨時間變化的血漿因子VIII濃度，且右圖顯示以與成年相同之載體基因組總量(8.9E11 vg/小鼠，相當於約4.5E14 vg/kg)或與成年相同之單位體重vg(3.5E13 vg/kg)給予之幼年小鼠中的總循環因子VIII。在兩者中，將此等值與3.5E13 vg/kg處理的成年小鼠進行比較。藉由將血漿FVIII濃度乘以估計的血液體積來確定總循環FVIII(在此類情況下，估計的血液體積為體重的10%)。 圖6A及6B。圖6A為用AAV5-FVIII-SQ處理之成年小鼠之肝切片中之AAV5衣殼的免疫組織化學分析。圖6B為來自AAV5-FVIII-SQ處理之幼年小鼠之AAV5衣殼的西方墨點分析。 圖7為顯示研究總體設計的表，該研究將確定在PKU受試者之肝臟中表現PAH的最佳條件。 圖8A-8C提供在給予2x10¹⁴ vg/kg AAV5-PAH或媒劑之前及之後8週，每組經AAV處理及媒劑處理之所有ENU小鼠的體重(g；平均值±SEM)。圖8A提供治療前的體重。圖8B提供給藥後4週的體重。圖8C提供給藥後8週的體重。*p ＜ 0.05，****p ,0.0001，如藉由單向方差分析所測定。 圖9A-9B提供在給予2x10¹⁴ vg/kg AAV5-PAH或媒劑之前及之後8週，每組經AAV處理及媒劑處理之所有ENU小鼠的血漿PHE濃度(μM；平均值±SEM)。圖9A提供給藥後4週的血漿PHE濃度。圖9B提供給藥後8週的血漿PHE濃度。*p ＜ 0.05，****p ,0.0001，如藉由單向方差分析所測定。

Claims (55)

1. 一種治療性AAV病毒的用途，其用於製備供改善罹患遺傳病症之幼年受試者之所述遺傳病症之症狀的藥劑，其中所述藥劑包含治療有效量之編碼治療性蛋白質的治療性AAV病毒，其中所述治療性蛋白質的表現改善所述遺傳病症的症狀。
2. 如請求項1的用途，其中所述治療性蛋白質為非功能性內源蛋白質的功能複本。
3. 如請求項1的用途，其中所述治療性蛋白質為內源蛋白質的修飾形式。
4. 如請求項1的用途，其中所述治療性蛋白質為補償非功能性內源蛋白質的異源蛋白質。
5. 如請求項1的用途，其中所述幼年受試者為幼年人類。
6. 如請求項5的用途，其中所述幼年人類不到18歲。
7. 如請求項5的用途，其中所述幼年人類不到12歲。
8. 如請求項1的用途，其中在投與所述治療性AAV病毒後，所述幼年受試者的肝細胞表現所述治療性蛋白質。
9. 如請求項1的用途，其中所述藥劑經調配用於靜脈內投藥。
10. 如請求項1的用途，其中所述遺傳病症為血友病。
11. 如請求項10的用途，其中所述血友病為血友病A，並且所述治療性蛋白質為因子VIII。
12. 如請求項10的用途，其中所述因子VIII為因子VIII-SQ。
13. 如請求項10的用途，其中所述治療性AAV病毒為AAV5-FVIII-SQ。
14. 如請求項10的用途，其中所述血友病為血友病B，並且所述治療性蛋白質為因子IX。
15. 如請求項14的用途，其中所述因子IX為R338L因子IX。
16. 如請求項1的用途，其中所述遺傳病症為苯酮尿症(PKU)，並且所述治療性蛋白質為苯丙胺酸羥化酶(PAH)。
17. 如請求項1的用途，其中投與所述幼年受試者之治療性AAV病毒的量對應於在成年受試者中有效之治療性AAV病毒的相同絕對數目。
18. 如請求項17的用途，其中將約1E12 vg/kg至約1E15 vg/kg的所述治療性AAV病毒投與所述幼年受試者。
19. 如請求項17的用途，其中將約6E13 vg/kg至約6E14 vg/kg的所述治療性AAV病毒投與所述幼年受試者。
20. 如請求項17的用途，其中所述AAV病毒係調配成醫藥組合物，所述醫藥組合物包含濃度約0.1 mg/ml至約3 mg/ml的磷酸氫二鈉、濃度約0.1 mg至約3 mg/ml的單水合磷酸二氫鈉、濃度約1 mg/ml至約20 mg/ml的氯化鈉、濃度約5 mg/ml至約40 mg/ml的甘露糖醇，及濃度約0.1 mg/ml至約4 mg/ml的泊洛沙姆188。
21. 如請求項17的用途，其中所述幼年受試者用濃度在5 mg/天至60 mg/天範圍內的皮質類固醇進行預防性治療。
22. 如請求項21的用途，其中所述幼年受試者用濃度為5 mg/天至60 mg/天的皮質類固醇進行治療性治療。
23. 如請求項17的用途，其在所述幼年受試者中引起至少約5 IU/dl功能因子VIII蛋白的表現。
24. 如請求項17的用途，其在所述幼年受試者中引起至少約1 IU/dl的功能因子VIII蛋白增加。
25. 一種治療有效量之治療性AAV病毒的用途，其用於製備供減少罹患血友病之幼年受試者之出血事件之出血時間的藥劑，其中所述藥劑在所述出血事件之前投與所述幼年受試者。
26. 如請求項25的用途，其中所述投藥係在所述出血事件之前的至少三週進行。
27. 如請求項25的用途，其中所述治療性AAV經調配用於靜脈內投藥
28. 如請求項25的用途，其中所述血友病為血友病A，且所述治療性AAV病毒表現因子VIII。
29. 如請求項28的用途，其中所述因子VIII為因子VIII-SQ。
30. 如請求項28的用途，其中所述治療性AAV病毒為AAV5-FVIII-SQ。
31. 如請求項28的用途，其中所述血友病為血友病B，並且所述治療性AAV病毒表現因子IX。
32. 如請求項31的用途，其中所述因子IX為R338L因子IX。
33. 如請求項25的用途，其中投與所述幼年受試者之治療性AAV病毒的量對應於在成年受試者中有效之所述治療性AAV病毒的相同絕對數目。
34. 如請求項25的用途，其中向所述幼年受試者投與約1E12 vg/kg至約1E15 vg/kg的所述治療性AAV病毒。
35. 如請求項25的用途，其中向所述幼年受試者投與約6E13 vg/kg至約6E14 vg/kg的所述治療性AAV病毒。
36. 如請求項25的用途，其中所述治療性AAV病毒係在包含以下之溶液中調配：濃度約0.1 mg/ml至約3 mg/ml的磷酸氫二鈉、濃度約0.1 mg/ml至約3 mg/ml的單水合磷酸二氫鈉、濃度約1 mg/ml至約20 mg/ml的氯化鈉、濃度約5 mg/ml至約40 mg/ml的甘露糖醇，及濃度約0.1 mg/ml至約4 mg/ml的泊洛沙姆188。
37. 一種治療性AAV病毒的用途，其用於製備供增加有需要之幼年受試者中之因子VIII蛋白表現的藥劑，其中所述AAV病毒為AAV5-FVIII-SQ。
38. 如請求項37的用途，其中所述AAV病毒經調配用於靜脈內投藥。
39. 如請求項37的用途，其中投與所述幼年受試者之治療性AAV病毒的量對應於在成年受試者中有效之治療性AAV病毒的相同絕對數目。
40. 如請求項37的用途，其中向所述幼年受試者投與約1E12 vg/kg至約1E15 vg/kg的所述治療性AAV病毒。
41. 如請求項37的用途，其中向所述幼年受試者投與約6E13 vg/kg至約6E14 vg/kg的所述治療性AAV病毒。
42. 如請求項37的用途，其在所述幼年受試者中引起功能因子VIII蛋白至少約5 IU/dl的表現。
43. 如請求項37的用途，其在所述幼年受試者中引起功能因子VIII蛋白至少約1 IU/dl的表現。
44. 如請求項37的用途，其在所述幼年受試者引起至少約1 IU/dl的功能FVIII活性增加。
45. 如請求項37的用途，其中所述幼年受試者用濃度在5 mg/天至60 mg/天範圍內的皮質類固醇治療。
46. 如請求項45的用途，其中所述皮質類固醇治療係預防性進行。
47. 如請求項45的用途，其中所述皮質類固醇治療係治療性進行。
48. 如請求項45的用途，其中所述幼年受試者在至少3、4、5、6、7、8、9或10週或更長的連續時段內用濃度在5 mg/天至60 mg/天範圍內的皮質類固醇治療。
49. 如請求項37的用途，進一步包含在投與治療有效量的所述AAV5-FVIII-SQ後，確定所述幼年受試者血清中抗AAV衣殼抗體之存在或不存在的步驟。
50. 一種治療性AAV病毒的用途，其用於製備供增加有需要之幼年受試者中之苯丙胺酸羥化酶(PAH)蛋白表現的藥劑，其中所述AAV病毒包含編碼功能活性PAH的核酸序列。
51. 如請求項50的用途，其中所述AAV病毒經調配用於靜脈內投藥。
52. 如請求項50的用途，其中向所述幼年受試者投與約1E12 vg/kg至約2E16 vg/kg的所述治療性AAV病毒。
53. 如請求項50的用途，其中向所述幼年受試者投與約2E12 vg/kg至約2E14 vg/kg的所述治療性AAV病毒。
54. 如請求項50的用途，其中向所述幼年受試者投與約6E12 vg/kg至約2E14 vg/kg的所述治療性AAV病毒。
55. 如請求項50的用途，其中所述幼年受試者為3週至5週齡。

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