BR112020023159A2

BR112020023159A2 - método para melhorar os sintomas de um transtorno genético em um indivíduo jovem, uso de um vírus aav terapêutico, composição, método para redução do tempo de sangramento, uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vírus aav terapêutico e método para aumentar a expressão proteica

Info

Publication number: BR112020023159A2
Application number: BR112020023159-2A
Authority: BR
Inventors: Stuart Bunting
Original assignee: Biomarin Pharmaceutical Inc.
Priority date: 2018-05-14
Filing date: 2019-05-14
Publication date: 2021-02-02
Also published as: SG11202010832YA; TW202016298A; EP3794112A1; JP2021523198A; JP2024028696A; CA3100000A1; AR117427A1; WO2019222132A1; US20200069819A1; CN112424345A; MX2020012167A; AU2019270972A1; KR20210008491A; WO2019222132A8

Abstract

  A invenção se refere ao uso de vetores de vírus adeno-associados (AAV) para obter a expressão prolongada de um transgene no fígado de um indivíduo jovem. A invenção inclui uma melhoria prolongada estável de sintomas da doença do indivíduo após uma administração única de um vetor AAV a um indivíduo jovem, em que o vetor AAV entrega o transgene ao fígado do indivíduo.

Description

“MÉTODO PARA MELHORAR OS SINTOMAS DE UM TRANSTORNO GENÉTICO EM UM INDIVÍDUO JOVEM, USO DE UM VÍRUS AAV TERAPÊUTICO, COMPOSIÇÃO, MÉTODO PARA REDUÇÃO DO TEMPO DE SANGRAMENTO, USO

DE UMA QUANTIDADE TERAPEUTICAMENTE EFICAZ DE UM VÍRUS AAV TERAPÊUTICO E MÉTODO PARA AUMENTAR A EXPRESSÃO PROTEICA” Este pedido de patente reivindica a prioridade deste ao Pedido de Patente U.S. Provisório No de 62/671 271, depositado em 14 de maio de 2018, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência.

Incorporação por referência do material submetido eletronicamente Este pedido de patente contém, como parte separada da exposição, uma Listagem de Sequências em forma para leitura por computador, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência e identificado como: Nome do arquivo: 53094_Seqlisting.txt; Tamanho: 372.202 bytes, criado em: 11 de maio de 2019.

Campo da invenção A invenção refere-se ao uso de vetores de vírus adenoassociados (AAV) para obter a expressão em longo prazo de um transgene no fígado de indivíduo jovem. A invenção inclui a melhora estável prolongada de sintomas da doença no indivíduo após uma única administração de um vetor AAV a um indivíduo jovem, em que o vetor AAV entrega o transgene ao fígado do indivíduo.

Fundamentos da invenção O vírus adenoassociado (AAV) é um vírus pequeno, com defeito de replicação, sem envelope que infecta humanos e algumas outras espécies de primatas. Diversos recursos do AAV tornam esse vírus um veículo atraente para a entrega de proteínas terapêuticas para terapia gênica, inclusive, por exemplo, que não se sabe que o AAV causa doença a humanos e induz uma resposta imune leve e que os vetores de AAV podem infectar células em divisão e quiescentes sem integração no genoma da célula hospedeira. Vetores de terapia genética que usam AAV foram bem sucedidos em alguns estudos clínicos, por exemplo, para a entrega do Fator IX humano (FIX) ao fígado de adultos para o tratamento de hemofilia B.

Apesar de seus recursos positivos, os vetores AVV para terapia genética, na verdade, apresenta algumas desvantagens. Especificamente, a capacidade para clonagem de vetores AAV é limitada como consequência da capacidade de empacotamento do DNA viral. O genoma de DNA de fita simples do AAV do tipo selvagem é formado por aproximadamente 4,7 quilobases (kb). Na prática, genomas de AAV de até aproximadamente 5,0 kb parecem ser completamente empacotados, ou seja, em seu comprimento total em partículas virais de AAV. Com a exigência de que o genoma de ácido nucleico em vetores AAV deva ter duas repetições terminais invertidas (ITRs) de AVV com aproximadamente 145 bases, a capacidade para empacotamento do DNA de um vetor AAV é tal que, no máximo, aproximadamente 4,4 kb da sequência de codificação proteica pode ser envolvida em capsídeo.

Outra limitação de vetores AAV é que o transgene muito raramente integra-se no genoma das células alvo. Em vez disso, o vetor AAV é mantido como uma cópia na forma de epissoma. Embora essa falta de integração genômica seja desejável por reduzir o risco de cópias integradas afetarem a função de genes do hospedeiro, acredita-se que a falta de integração impeça o uso em células em divisão/tecido em crescimento porque as cópias na forma de epissoma são perdidas com o passar tempo nas células em divisão. Isso é visto, por exemplo, no fígado jovem onde a entrega de genes mediada por AAV resultou na perda rápida de números de genoma do vetor e redução concomitante na expressão do transgene. Ver, p. ex., Cunningham et al., Molec. Ther. (2008) vol. 16, pág. 1081-1088.

Há necessidade de métodos para a entrega de transgenes terapêuticos aos fígados de indivíduos jovens, onde o transgene mantém níveis eficazes de expressão do transgene por períodos de tempo clinicamente significativos e, de preferência, por toda a vida do indivíduo. Assim, a presente invenção refere-se ao uso de vetores AAV que codificam proteínas terapêuticas no fígado de indivíduos jovens. Especificamente, a invenção provê métodos para a entrega de vetores AAV aos fígados de indivíduos jovens, em que uma única administração do vetor AAV proporciona níveis terapeuticamente eficazes da produção do transgene por períodos de tempo clinicamente significativos.

Sumário da invenção A presente invenção provê métodos de utilização de vetores AAV para expressão de proteínas terapêuticas nas células hepáticas de indivíduos jovens. Os vetores AAV recombinantes da presente invenção incluem derivados não naturais do vírus AAV no qual foram introduzidas sequências de ácido nucleico que codificam proteínas terapêuticas funcionais. As proteínas terapêuticas substituem ou compensam a perda ou redução da atividade de um produto de um gene endógeno. Exemplos não limitantes de proteínas terapêuticas da invenção incluem Fator

VIII, Fator IX e fenilalanina hidroxilase (PAH), as quais são usadas para substituir a atividade endógena perdida em indivíduos com hemofilia A, hemofilia B e fenilcetonúria, respectivamente.

Em um aspecto, a invenção provê um método para melhorar os sintomas de um transtorno genético em um indivíduo jovem que sofre do transtorno genético, o qual inclui a etapa de administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vírus AAV terapêutico que codifica uma proteína terapêutica ao indivíduo jovem, em que a expressão da proteína terapêutica melhora os sintomas do transtorno genético.

Em uma modalidade da invenção, a proteína terapêutica é uma cópia funcional de uma proteína endógena não funcional. Em outra modalidade da invenção, a proteína terapêutica é uma versão modificada da proteína endógena. Em mais uma modalidade da invenção, a proteína terapêutica é uma proteína heteróloga que compensa um proteína endógena não funcional.

Em uma modalidade da invenção, o indivíduo jovem é um ser humano jovem. Em outra modalidade o ser humano jovem tem menos de 18 anos de idade. Em ainda outra modalidade da invenção, o ser humano jovem tem menos de 12 anos de idade.

Em uma modalidade da invenção, a proteína terapêutica é expressa pelos hepatócitos do indivíduo jovem após a administração do vírus AAV terapêutico. Em outra modalidade da invenção, o vírus AAV terapêutico é administrado por via intravenosa.

Em uma modalidade da invenção, o transtorno genético é uma hemofilia. Em outra modalidade da invenção, o transtorno genético é a hemofilia A e a proteína terapêutica é o Fator VIII. Em ainda outra modalidade, o Fator VIII é Fator VIII-SQ. Em uma modalidade preferida, o vírus AAV terapêutico é o AAV5-FVIII- SQ. Em mais uma modalidade, a hemofilia é a hemofilia B e a proteína terapêutica é o Fator IX. Em outra modalidade, o Fator IX é o Fator IX R338L.

Em uma modalidade da invenção, o transtorno genético é fenilcetonúria (FCN) e a proteína terapêutica é a fenilalanina hidroxilase (PAH).

Em outra modalidade da invenção, a quantidade de vírus AAV terapêutico administrada ao indivíduo jovem corresponde ao mesmo número absoluto do vírus AAV terapêutico que é eficaz em indivíduos adultos. Em ainda mais modalidades da invenção, são administrados entre aproximadamente 1E12 genoma viral (vg)/kg e 1E15 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem. Em algumas modalidades, são administrados entre aproximadamente 2E12 vg/kg e 2E13 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem ou são administrados entre aproximadamente 2E12 vg/kg e 2E14 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem ou são administrados entre aproximadamente 5E12 vg/kg e 5E13 vg/kg ao indivíduo jovem ou são administrados entre aproximadamente 5E13 vg/kg e 5E14 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem ou são administrados entre aproximadamente 5E13 e 5E15 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem ou são administrados entre aproximadamente 1E13 vg/kg e 1E14 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem ou são administrados entre aproximadamente 1E14 vg/kg e 1E15 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem ou são administrados entre aproximadamente 1E12 vg/kg e 2E16 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem ou são administrados entre aproximadamente 6E12 vg/kg e 2E14 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem ou são administrados entre aproximadamente 6E12 vg/kg e 6E13 vg/kg ao indivíduo jovem ou são administrados entre aproximadamente 2E13 vg/kg e 2E15 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem ou são administrados entre aproximadamente 2E13 vg/kg e 2E16 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem ou são administrados entre aproximadamente 2E14 vg/kg e 2E16 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem ou são administrados entre aproximadamente 6E13 vg/kg e 6E14 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem.

Em uma modalidade da invenção, o vírus AAV é formulado como uma composição farmacêutica contendo fosfato de sódio, dibásico a uma concentração entre aproximadamente 0,1 mg/mL e 3 mg/mL, fosfato de sódio monobásico monoidratado a uma concentração entre aproximadamente 0,1 mg/mL e 3 mg/mL, cloreto de sódio a uma concentração entre aproximadamente 1 mg/mL e 20 mg/mL, manitol a uma concentração entre aproximadamente 5 mg/mL e 40 mg/mL e poloxâmero 188 a uma concentração entre aproximadamente 0,1 mg/mL e 4 mg/mL.

Em certas modalidades da invenção, o indivíduo jovem é tratado profilaticamente com um corticosteroide a uma concentração que varia de 5 mg/dia a 60 mg/dia. Em outras modalidades, o indivíduo jovem é tratado terapeuticamente com um corticosteroide a uma concentração de 5 mg/dia a 60 mg/dia.

Em uma modalidade adicional, a invenção resulta na expressão de pelo menos aproximadamente 5 UI/dL da proteína Fator VIII funcional no indivíduo jovem. Outra modalidade resulta em um aumento na proteína Fator VIII funcional de pelo menos aproximadamente 1 UI/dL no indivíduo jovem.

Em outro aspecto, a invenção provê um método para reduzir o tempo de sangramento de um episódio de sangramento em um indivíduo jovem que sofre de hemofilia, em que o método inclui a etapa de administração, antes do episódio de sangramento, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem. Em uma modalidade da invenção, a etapa de administração ocorre pelo menos três semanas antes do episódio de sangramento. Em outra modalidade, o vírus AAV terapêutico é administrado por via intravenosa. Em modalidades adicionais, a hemofilia é hemofilia A e o vírus AAV terapêutico expressa Fator VIII. Em ainda outra modalidade, o Fator VIII é Fator VIII-SQ. Em uma modalidade preferida, o vírus AAV terapêutico é AAV5-FVIII-SQ. Em outra modalidade, a hemofilia é hemofilia B e o vírus AAV terapêutico expressa Fator IX. Em ainda outra modalidade, o Fator IX é Fator IX R338L. Em ainda outra modalidade, a quantidade de vírus AAV terapêutico administrada ao indivíduo jovem corresponde ao mesmo número absoluto do vírus AAV terapêutico que é eficaz em indivíduos adultos. Em modalidades adicionais, são administrados entre aproximadamente 1E12 vg/kg e 1E15 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem. Em modalidades exemplares adicionais, são administrados entre aproximadamente 1E12 vg/kg e 1E16 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem ou são administrados entre aproximadamente 2E12 vg/kg e 2E13 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem ou são administrados entre aproximadamente 2E12 vg/kg e 2E14 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem ou são administrados entre aproximadamente 5E13 vg/kg e

5E14 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem ou são administrados entre aproximadamente 6E12 vg/kg e 6E14 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem ou são administrados entre aproximadamente 6E13 vg/kg e 6E14 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem. Em uma modalidade, o vírus AAV terapêutico é formulado em uma solução compreendendo fosfato de sódio, dibásico a uma concentração entre aproximadamente 0,1 mg/mL e 3 mg/mL, fosfato de sódio monobásico monoidratado a uma concentração entre aproximadamente 0,1 mg/mL e 3 mg/mL, cloreto de sódio a uma concentração entre aproximadamente 1 mg/mL e 20 mg/mL, manitol a uma concentração entre aproximadamente 5 mg/mL e 40 mg/mL e poloxâmero 188 a uma concentração entre aproximadamente 0,1 mg/mL e 4 mg/mL.

Em outro aspecto, a invenção provê um método para aumentar a expressão proteica do Fator VIII em um indivíduo jovem com necessidade do mesmo, em que o método inclui a etapa de administração de um vírus terapêutico ao indivíduo jovem, em que o vírus AAV terapêutico é AAV5-FVIII-SQ. Em uma modalidade da invenção, o vírus AAV terapêutico é administrado por via intravenosa. Em ainda outra modalidade, a quantidade de vírus AAV terapêutico administrada ao indivíduo jovem corresponde ao mesmo número absoluto do vírus AAV terapêutico que é eficaz em indivíduos adultos. Em outra modalidade, são administrados entre aproximadamente 1E12 vg/kg e 1E15 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem. Em mais uma modalidade, são administrados entre aproximadamente 6E13 vg/kg e 6E14 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem. Em outras modalidades, a invenção resulta na expressão de pelo menos aproximadamente 5 UI/dL da proteína Fator VIII funcional no indivíduo jovem. Em modalidades adicionais, a invenção resulta na expressão de pelo menos aproximadamente 1 UI/dL da proteína Fator VIII funcional no indivíduo jovem. Em ainda outra modalidade, a invenção resulta em um aumento na atividade de FVIII funcional de pelo menos aproximadamente 1 UI/dL no indivíduo jovem. Em uma modalidade, o indivíduo jovem é tratado com um corticosteroide a uma concentração que varia de 5 mg/dia a 60 mg/dia. Em outras modalidades, o tratamento com o corticosteroide é realizado profilaticamente. Em modalidades adicionais, o tratamento com o corticosteroide é realizado terapeuticamente. Em mais uma modalidade, o indivíduo jovem é tratado com um corticosteroide a uma concentração que varia de 5 mg/dia a 60 mg/dia ao longo de um período contínuo de pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 semanas ou maior. Uma modalidade da invenção inclui uma etapa para determinar a ausência ou presença de anticorpos anti- capsídeo de AAV no soro do indivíduo jovem depois da administração da quantidade terapeuticamente eficaz do AAV5- FVIII-SQ. Em outra modalidade, a invenção inclui a etapa de administração de uma quantidade eficaz de um corticosteroide ao indivíduo depois de feita uma determinação da presença de anticorpos anti-capsídeo de AAV no soro do indivíduo jovem.

Os genomas que codificam proteínas terapêuticas funcionalmente ativas têm, de preferência, no máximo 7,0 kb de comprimento, mais preferivelmente no máximo 6,5 kb de comprimento, ainda mais preferivelmente no máximo 6,0 kb de comprimento, ainda mais preferivelmente no máximo 5,5 kb de comprimento, ainda mais preferivelmente no máximo 5,0 kb de comprimento, com função aumentada de promotor.

Neste relatório descritivo, um “Fator VIII funcionalmente ativo” ou “FVIII funcionalmente ativo” é uma proteína FVIII que tem a funcionalidade de um proteína FVIII do tipo selvagem in vitro, quando expressa em células cultivadas ou, in vivo, quando expressa em células ou tecidos do corpo. Por todo este pedido de patente, os termos “Fator VIII” e “FVIII” são idênticos e são usados alternadamente. Isso inclui, por exemplo, a funcionalidade que contribui na cascata da coagulação sanguínea e/ou reduz o tempo necessário para que o sangue coagule em um indivíduo que sofre de hemofilia A. FVIII do tipo selvagem participa na coagulação do sangue através da cascata de coagulação, atuando como um cofator para o Fator IX ativado (FIXa)que, na presença de íons cálcio e fosfolipídios forma um complexo que converte o Fator X (FX) em FX ativado (FXa). Deste modo, um FVIII funcionalmente ativo pode formar um complexo com FIXa, o qual pode converter FX em FXa. Um exemplo de proteína FVIII funcionalmente ativa é uma proteína FVIII SQ como descrita em WO 2015/038625, aqui incorporado por referência.

A invenção também provê métodos para aumentar a expressão proteica de PAH em um indivíduo jovem com necessidade do mesmo, o qual compreende administrar ao indivíduo jovem um vírus terapêutico, em que o vírus AAV terapêutico é AAV5-PAH. Por exemplo, em qualquer um dos métodos, o vírus AAV terapêutico é administrado por via intravenosa. A invenção também provê o uso de um vírus AAV terapêutico na preparação de um medicamento para aumentar a expressão proteica de PAH em um indivíduo jovem com necessidade do mesmo, em que o vírus AAV é AAV5-PAH. Em outra modalidade, a invenção provê composições que compreendem um vírus AAV terapêutico para aumentar a expressão proteica de PAH em um indivíduo jovem com necessidade do mesmo, em que o vírus AAV é AAV5-PAH.

Em qualquer um dos usos ou composições, o vírus AAV é formulado para administração intravenosa.

Nesses métodos, usos e composições para aumentar a expressão de PAH, são administrados entre aproximadamente 1E12 vg/kg e 1E16 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem ou são administrados entre aproximadamente 2E12 vg/kg e 2E13 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem ou são administrados entre aproximadamente 2E12 vg/kg e 2E14 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem ou são administrados entre aproximadamente 5E13 vg/kg e 5E14 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem ou são administrados entre aproximadamente 6E12 vg/kg e 6E14 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem.

Em qualquer um dos métodos, usos e composições, o indivíduo jovem tem entre aproximadamente 3 semanas e 5 semanas de idade.

Por exemplo, o indivíduo jovem tem aproximadamente 3 semanas de idade, aproximadamente 4 semanas de idade, aproximadamente 5 semanas de idade, aproximadamente 22 dias de idade, aproximadamente 23 dias de idade, aproximadamente 24 dias de idade, aproximadamente 25 dias de idade, aproximadamente 26 dias de idade, aproximadamente 27 dias de idade, aproximadamente 29 dias de idade, aproximadamente 30 dias de idade, aproximadamente 31 dias de idade, aproximadamente 32 dias de idade, aproximadamente 33 dias de idade ou aproximadamente 34 dias de idade.

Além disso, qualquer um desses métodos pode compreender ainda uma etapa para determinar a ausência ou presença de anticorpos anti-capsídeo de AAV no soro do indivíduo jovem depois da administração da quantidade terapeuticamente eficaz do AAV5- PAH.

Neste relatório descritivo, um “vetor AAV” refere-se a ácidos nucleicos, quer de fita simples ou fita dupla, que contêm uma sequência de repetição terminal invertida (ITR) 5' de AAV e uma sequência ITR 3' de AAV flanqueando uma sequência codificadora de uma proteína (de preferência, uma sequência codificadora de uma proteína terapêutica funcional; p. ex., FVIII, FIX, e PAH) ligadas operacionalmente a elementos reguladores da transcrição que são heterólogos ao genoma viral do AAV, ou seja, um ou mais promotores e/ou reforçadores (enhancers) e, opcionalmente, uma sequência de poliadenilação e/ou um ou mais íntrons inseridos entre exons da sequência codificadora da proteína. Um vetor AAV de fita simples refere- se a ácidos nucleicos que estão presentes no genoma de uma partícula viral de AAV, e pode ser a fita sense ou a fita antisense das sequências de ácido nucleico aqui descritas. O tamanho de tais ácidos nucleicos de fita simples é fornecido em bases. Um vetor AAV de fita dupla refere-se a ácidos nucleicos que estão presentes no DNA de plasmídeos, p. ex., pUC19, ou no genoma de um vírus de dupla fita, p. ex., baculovírus, usados para expressar ou transferir os ácidos nucleicos do vetor AAV. O tamanho de tais ácidos nucleicos de fita dupla é fornecidos em pares de bases (bp).

O termo “repetição terminal invertida (ITR)”, neste relatório descritivo, refere-se a regiões reconhecidas pela técnica encontradas nas terminações 5' e 3' do genoma do AAV que funcionam em cis como origens de replicação do DNA e como sinais de empacotamento para o genoma viral. ITRs de AAV, junto com a região de codificação de rep do AAV, proporcionam excisão eficiente e resgate de, e a integração de uma sequência de nucleotídeos interposta entre duas ITRs flanqueando no genoma de uma célula hospedeira. Sequências de certas ITRs associadas ao AAV são reveladas por Yan et al., J. Virol. (2005) vol. 79, pág. 364-379, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência. As sequências de ITR que encontram utilidade no presente podem ser ITRs completas do AAV do tipo selvagem ou fragmentos das mesmas que retêm capacidade funcional, ou podem ser variantes de sequência de ITRs completas do AAV do tipo selvagem que sejam capazes de funcionar em cis como origens de replicação. As ITRs de AAV úteis nos vetores AAV recombinantes de FVIII da presente invenção podem ser derivadas de qualquer sorotipo de AAV conhecido e, em certas modalidades preferidas, derivadas do sorotipo AAV2 ou AAV5.

Um “elemento regulador da transcrição” refere-se a sequências nucleotídicas envolvidas na regulação da transcrição genética incluindo um promotor, mais elementos de resposta, sequências de ativador e reforçador para ligação de fatores de transcrição que auxiliam a ligação da RNA polimerase e promovem a expressão, sequências de operador ou silenciador às quais se ligam proteínas repressoras para bloquear a ligação da RNA polimerase e impedir a expressão. O termo “elemento regulador da transcrição específico do fígado” refere-se a um elemento regulador que modula a expressão gênica especificamente no tecido hepático. Exemplos de elementos reguladores específicos do fígado incluem, entre outros, o promotor da thyretin do camundongo (mTTR), o promotor do fator VIII humano endógeno (F8), o promotor da alfa-1-antitripsina humana (hAAT) e fragmentos ativos dos mesmos, o promotor mínimo da albumina humana e o promotor da albumina do camundongo. Reforçadores derivados de sítios de ligação do fator de transcrição específico do fígado são também contemplados, tais como EBP, DBP, HNF1, HNF3, HNF4, HNF6, com Enh1.

Em uma modalidade, o vetor AAV da invenção compreende um ácido nucleico que codifica a proteína Fator VIII funcionalmente ativa tendo o domínio B substituído pela sequência SQ de 14 aminoácidos. A sequência SQ é revelada em Ward et al., Blood (2011) vo. 117, pág. 798-807; McIntosh et al., Blood (2013) vo. 121, pág. 3335-3344; WO 2013/186563; e WO 2015/038625. A sequência da região de codificação de FVIII pode ser uma sequência codificadora de FVIII com códons otimizados (ver, p. ex., as Publicações dos Pedidos de Patente U.S. US2015158930, US2015071883 e US20170216408; e as Patentes U.S. 9 447 168 e 9 504 762, cujos conteúdos são todos aqui incorporados, em sua totalidade, por referência). Em uma modalidade exemplar, o ácido nucleico que codifica a proteína FVIII humana funcionalmente ativa do vetor AAV ou da partícula viral de AAV recombinante consiste nos nucleotídeos 403 a 4776 da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:1 que codifica uma sequência da proteína FVIII funcional; essa sequência é aqui referida como “FVIII-SQ” ou “Fator VIII-SQ”. Em modalidades exemplares, o vetor AAV da invenção compreende a sequência de ácido nucleico apresentada em qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 1-45.

Em uma modalidade, o vetor AAV da invenção compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína Fator IX funcionalmente ativa. A sequência de codificação do Fator IX pode ser do tipo selvagem, compreender códons otimizados ou ser uma variante (ver, p. ex., Patente U.S. 4 994 371, a qual é aqui incorporada, em sua totalidade, por referência). Em certas modalidades, a sequência de codificação do Fator IX codifica uma proteína com uma mudança no resíduo de arginina na posição 338, em que o resíduo de arginina é mudado para alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, triptofano, metionina, serina ou treonina. Em uma modalidade preferida, o resíduo de arginina na posição 338 é trocado por leucina (Fator IX R338L) (ver, p. ex., Patente U.S. 6 531 298; Patente U.S. 9 249 405; Publicação do Pedido de Patente U.S. US2002/0031799; e Publicação do Pedido de Patente U.S. US2011/0244550, todos os quais são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência). Em uma modalidade exemplar, o vetor AAV da invenção compreende a sequência de ácido nucleico que codifica a sequência da proteína Fator IX de SEQ ID NO: 46 ou uma proteína FIX modificada com uma mudança na arginina na posição 338 da SEQ ID NO: 46.

Em mais uma modalidade, o vetor AAV da invenção compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína fenilalanina hidroxilase (PAH) funcionalmente ativa, tal como uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de PAH do tipo selvagem de SEQ ID NO: 48. A sequência que codifica PAH pode ser do tipo selvagem, compreender códons otimizados ou ser uma variante (ver, p. ex., Fang et al., Gene Ther., vol. 1, páginas 247-254 (1994); Eisensmith et al., J. Inherit. Metab. Dis., vol. 19, páginas 412-423 (1996); Nagasaki et al., Pediatr. Res., vol. 45, páginas 465-473 (1999); e Laipis et al., Mol. Ther., vol. 7, páginas S391-S392 (2003)). A PAH do tipo selvagem é codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 47. Em uma modalidade exemplar, o vetor AAV da invenção compreende a sequência de ácido nucleico que codifica a sequência da proteína PAH do tipo selvagem de SEQ ID NO: 48. Em modalidades exemplares, o vetor AAV da invenção compreende a sequência de ácido nucleico apresentada em qualquer uma dentre SEQ ID NO: 49-

55. Vetores AAV exemplares que compreendem um ácido nucleico codificador de uma PAH funcionalmente ativa são fornecidos no Pedido de Patente U.S. Provisório No 62/755 207 e O Pedido de Patente Internacional No PCT/US2019/031252, depositado em 08 de maio de 2019 (o qual reivindica a prioridade deste ao Pedido de Patente U.S. Provisório No 62/755,207), ambos os quais são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência.

Em outras modalidades, O vetor AAV recombinante da invenção compreende um ácido nucleico incluindo uma repetição terminal invertida (ITR) 5’ de AAV (a qual pode ser modificada ou como conhecido na técnica), uma região reguladora da transcrição específica do fígado, uma região de codificação com códons otimizados de uma proteína terapêutica, opcionalmente um ou mais íntrons, uma sequência de poliadenilação e uma ITR 3' de AAV2 (a qual pode ser modificada ou não como conhecido na técnica). Em certas modalidades a proteína terapêutica é o Fator VIII humano ou variantes do mesmo. Em outras modalidades, a proteína terapêutica é o Fator IX humano ou variantes do mesmo. Em modalidades adicionais, a proteína terapêutica é a PAH humana ou variantes da mesma. Em uma modalidade preferida, a região reguladora da transcrição específica do fígado compreende uma sequência abreviada do reforçador de ApoE; um promotor proximal de alfa anti-tripsina humana (hAAT) com 186 bases, incluindo 42 bases da região não traduzida (UTR) 5'; um ou mais reforçadores selecionados a partir do grupo que consiste em (i) um reforçador de ApoE/C1 humano de 34 bases, (ii) uma região X distal do promotor de AAT humana de 32 bases e (iii) 80 bases adicionais do elemento distal do promotor proximal de AAT humana; e uma região de codificação com códons otimizados de FVIII funcionalmente ativo que codifica a variante FVIII-SQ. Em outra modalidade preferida, a região reguladora da transcrição específica do fígado compreende uma sequência do reforçador de α-microglobulina e o promotor proximal da alfa anti-tripsina (AAT) humana de 186 bases.

Em ainda outras modalidades, a presente invenção é direcionada a construções de vetores que codificam um polipeptídeo funcional do Fator VIII, em que as construções compreendem um ou mais dos elementos individuais das construções descritas acima, e combinações dos mesmos, em uma ou mais orientações diferentes. A presente invenção é também direcionada às construções descritas acima em orientação oposta. A presente invenção é também direcionada partículas virais recombinantes de AAV que compreendem os vetores AAV de FVIII descritos acima e ao seu uso para o tratamento de hemofilia A.

Em modalidades adicionais, a presente invenção é direcionada a construções de vetores que codificam um polipeptídeo funcional do Fator IX, em que as construções compreendem um ou mais um ou mais dos elementos individuais das construções descritas acima, e combinações dos mesmos, em uma ou mais orientações diferentes. A presente invenção é também direcionada às construções descritas acima em orientação oposta. A presente invenção é também direcionada partículas virais recombinantes de AAV que compreendem os vetores AAV IX aqui descritos e ao seu uso para o tratamento de hemofilia B em indivíduos jovens.

Em ainda outras modalidades, a presente invenção é direcionada a construções de vetores que codificam um polipeptídeo funcional de PAH, em que as construções compreendem um ou mais dos elementos individuais das construções descritas acima, e combinações dos mesmos, em uma ou mais orientações diferentes. A presente invenção é também direcionada às construções descritas acima em orientação oposta. A presente invenção é também direcionada partículas virais recombinantes de AAV que compreendem os vetores AAV de PAH aqui descritos e ao seu uso para o tratamento de FCN em indivíduos jovens.

Os vetores AAV da invenção em forma de fita simples têm menos do que aproximadamente 7,0 kb de comprimento, menos do que 6,5 kb de comprimento, menos do que 6,4 kb de comprimento, menos do que 6,3 kb de comprimento, menos do que 6,2 kb de comprimento, menos do que 6,0 kb de comprimento, menos do que 5,8 kb de comprimento, menos do que 5,6 kb de comprimento, menos do que 5,5 kb de comprimento, menos do que 5,4 kb de comprimento, menos do que 5,4 kb de comprimento, menos do que 5,2 kb de comprimento ou menos do que 5,0 kb de comprimento. Os vetores AAV da invenção em forma de fita simples variam entre aproximadamente 5,0 kb e 6,5 kb de comprimento ou variam entre aproximadamente 4,8 kb e 5,2 k de comprimento, entre 4,8 kb e 5,3 kb de comprimento, ou varia entre aproximadamente 4,9 kb e 5,5 kb de comprimento, ou entre aproximadamente 4,8 kb e 6,0 kb de comprimento, entre aproximadamente 5,0 kb e 6,2 kb de comprimento ou entre aproximadamente 5,1 kb e 6,3 kb de comprimento, ou entre aproximadamente 5,2 kb e 6,4 kb de comprimento ou entre aproximadamente 5,5 kb e 6,5 kb de comprimento.

Em outra modalidade, a invenção provê métodos para a produção de partículas recombinantes do vírus adenoassociado (AAV) que compreendem qualquer um dos vetores AAV da invenção. Os métodos compreendem as etapas de cultura de uma célula que foi transfectada com qualquer um dos vetores AAV da invenção (associados com vários genes cap e rep de AAV) e recuperação de partículas virais recombinantes terapêuticas de AAV do sobrenadante da célula transfectada.

As células da invenção úteis para a produção de AAV recombinante são qualquer tipo de célula suscetível à infecção por baculovírus, incluindo células de insetos tais como High Five, Sf9, Se301, SeIZD2109, SeUCR1, Sf9, Sf900+, Sf21, BTI-TN- 5B1-4, MG-1, Tn368, HzAm1, BM-N, Ha2302, Hz2E5 e Ao38. As células usadas preferidas de mamíferos podem ser HEK293, HeLa, CHO, NSO, SP2/0, PER.C6, Vero, RD, BHK, HT 1080, A549, Cos-7, ARPE-19 e MRC-5.

A invenção também provê uma partícula viral recombinante que compreende qualquer um dos vetores AAV da invenção ou qualquer partícula viral produzida pelos métodos anteriores da invenção.

Um “vírion de AAV” ou “partícula viral de AAV” ou “partícula do vetor AAV” ou “vírus AAV” refere-se a uma partícula viral composta por pelo menos uma proteína do capsídeo de AAV e um vetor polipeptídico de AAV envolvido em capsídeo conforme aqui descrito. Se compreende um polinucleotídeo heterólogo (ou seja, um polinucleotídeo diferente de um genoma de AAV do tipo selvagem, tal como um transgene a ser entregue a uma célula de mamífero), a partícula é tipicamente referida como uma “partícula de vetor AAV” ou simplesmente um “vetor AAV”. Assim,

a produção de partículas de vetor AAV inclui necessariamente a produção do vetor AAV, uma vez que tal vetor está contido dentro de uma partícula de vetor AAV.

Neste relatório descritivo, “vírus AAV terapêutico” refere-se a um vírion de AAV, partícula viral de AAV, partícula de vetor AAV ou vírus AAV que compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma proteína terapêutica.

Neste relatório descritivo, “proteína terapêutica” refere-se a um polipeptídeo com uma atividade biológica que substitui ou compensa a perda ou redução de atividade de uma proteína endógena. Por exemplo, uma cópia funcional do Fator VIII humano, ou um fragmento funcional do mesmo, é uma proteína terapêutica quando usada para substituir a atividade do Fator VIII humano inativo em indivíduos portadores de hemofilia A. Do mesmo modo, o Fator IX humano funcional é uma proteína terapêutica para indivíduos com hemofilia B, e fenilalanina hidroxilase (PAH) funcional é uma proteína terapêutica para fenilcetonúria (FCN).

Neste relatório descritivo, “indivíduo jovem” refere-se a um indivíduo que é fisiologicamente imaturo ou subdesenvolvido. Em particular, um indivíduo jovem é aquele no qual as células de múltiplos tecidos ou órgãos estão ainda dividindo-se a uma taxa maior do que aquela de um indivíduo maduro. Em certas modalidades, o indivíduo jovem é um humano. Em outra modalidade, o indivíduo jovem é um humano com menos de dezoito anos de idade. Em ainda outra modalidade, o indivíduo jovem é um humano com menos de doze anos de idade. Os indivíduos jovens da invenção incluem humanos com menos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 anos de idade.

Neste relatório descritivo, “transtorno genético” refere- se a um transtorno causado por uma ou mais anormalidades no genoma de um indivíduo. Em uma modalidade preferida, o transtorno genético é monogênico, significando que ele resulta de uma anormalidade em uma ou ambas as cópias de um único gene. A anormalidade genômica afeta um gene e leva a uma redução ou perda de atividade da proteína endógena codificada pelo gene afetado, e os sintomas do transtorno genético resultam da redução ou perda de atividade da proteína endógena.

Neste relatório descritivo, “tratar estavelmente” ou “tratamento estável” refere-se a um tratamento terapêutico usando um vírus AAV terapêutico administrado a um indivíduo jovem, em que o indivíduo jovem expressa estavelmente uma proteína terapêutica expressa pelo vírus AAV terapêutico. Uma proteína terapêutica expressa estavelmente significa que a proteína é expressa por um período de tempo clinicamente significativo. “Período de tempo clinicamente significativo” significa, neste relatório descritivo, a expressão em níveis terapeuticamente eficazes por um período de tempo com impacto significativo sobre a qualidade de vida do indivíduo jovem. Em certas modalidades, um impacto significativo sobre a qualidade de vida é demonstrado pela falta de necessidade de terapias alternativas administradas por via intravenosa ou via subcutânea. Em certas modalidades, o período de tempo clinicamente significativo é a expressão por pelo menos seis meses, por pelo menos oito meses, por pelo menos um ano, por pelo menos dois anos, por pelo menos três anos, por pelo menos quatro anos, por pelo menos cinco anos, por pelo menos seis anos, por pelo menos sete anos, por pelo menos oito anos, por pelo menos nove anos, por pelo menos dez anos ou por pelo menos a vida do indivíduo.

Em outra modalidade, a invenção provê métodos para o tratamento de um indivíduo jovem que sofre de hemofilia A, os quais compreendem administrar ao indivíduo jovem uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um dos vetores AAV de Fator VIII da invenção, de uma partícula viral da invenção ou de uma partícula viral produzida por um método da invenção.

Em outra modalidade, a invenção provê métodos para aumentar os níveis circulantes da proteína FVIII em um indivíduo jovem com necessidade do mesmo, os quais compreendem administrar ao indivíduo jovem qualquer um dos vetores AAV da invenção, uma partícula viral da invenção ou uma partícula viral produzida por um método da invenção.

Em outra modalidade, a invenção provê métodos para aumentar os níveis circulantes da proteína Fator IX em um indivíduo jovem com necessidade do mesmo, os quais compreendem administrar ao indivíduo jovem qualquer um dos vetores AAV da invenção, uma partícula viral da invenção ou uma partícula viral produzida por um método da invenção.

Em outra modalidade, a invenção provê métodos para aumentar os níveis circulantes da proteína PAH em um indivíduo com necessidade do mesmo, os quais compreendem administrar ao indivíduo qualquer um dos vetores AAV da invenção, partículas virais da invenção ou uma partícula viral produzida por um método da invenção que expressam a proteína PAH.

Em outra modalidade, a invenção provê formulações farmacêuticas que compreendem partículas virais terapêuticas de

AAV como aqui descritas. Mais especificamente, em certos aspectos, a presente invenção é direcionada a formulações farmacêuticas que compreendem um vírus AAV recombinante que expressa Fator VIII, Fator IX ou PAH; um agente tamponante; um agente de isotonicidade; um agente de volume; e um tensoativo. Em modalidades especialmente preferidas, as formulações farmacêuticas da presente invenção compreendem AAV5-FVIII-SQ ou qualquer um dos outros vetores aqui descritos e/ou são estáveis durante o armazenamento por pelo menos duas semanas.

Em ainda outras modalidades da presente invenção, a formulação farmacêutica compreende fosfato de sódio, dibásico a uma concentração entre aproximadamente 0,1 mg/mL e 3 mg/mL, fosfato de sódio monobásico monoidratado a uma concentração entre aproximadamente 0,1 mg/mL e 3 mg/mL, cloreto de sódio a uma concentração entre aproximadamente 1 mg/mL e 20 mg/mL, manitol a uma concentração entre aproximadamente 5 mg/mL e 40 mg/mL e poloxâmero 188 a uma concentração entre aproximadamente 0,1 mg/mL e 4 mg/mL. Em uma modalidade especialmente preferida, a formulação farmacêutica da presente invenção compreende fosfato de sódio, dibásico a uma concentração próxima de 1,42 mg/mL, fosfato de sódio monobásico monoidratado a uma concentração próxima de 1,38 mg/mL, cloreto de sódio a uma concentração próxima de 8,18 mg/mL, manitol a uma concentração próxima de 20 mg/mL e poloxâmero 188 a uma concentração próxima de 2 mg/mL.

As formulações farmacêuticas da presente invenção podem estar em forma líquida e podem compreender a partícula viral da proteína terapêutica de AAV a uma concentração entre aproximadamente 1E12 vg/mL e 2E14 vg/mL, mais preferivelmente a uma concentração próxima de 2E13 vg/mL. Em uma modalidade, as formulações farmacêuticas da invenção são úteis para administração intravenosa a um humano que sofre de hemofilia A, hemofilia B ou FCN.

A presente invenção é também direcionada a métodos, usos e composições para tratar estavelmente um indivíduo jovem que sofre de hemofilia A, que inclui a etapa de administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vírus AAV recombinante do Fator VIII, o qual pode ser opcionalmente formulado como descrito acima. Em uma modalidade preferida, o indivíduo jovem que sofre de hemofilia A é um humano. Em uma modalidade, o vírus AAV recombinante do Fator VIII é AAV5-FVIII- SQ. Em uma modalidade, a etapa de administração é realizada por via intravenosa (IV). Em certos aspectos da presente invenção, a etapa de administração resulta na expressão estável de pelo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais UI/dL de proteína Fator VIII na corrente sanguínea do indivíduo jovem, de preferência pelo menos aproximadamente 5 UI/dL de proteína Fator VIII na corrente sanguínea do indivíduo jovem. Em certas modalidades, a etapa de administração resulta na expressão de pelo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais UI/dL de proteína Fator VIII na corrente sanguínea do indivíduo jovem em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais semanas depois da administração. Em certas modalidades, a proteína Fator VIII é expressa por pelo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais meses na corrente sanguínea do indivíduo jovem. Em certas modalidades, a proteína Fator VIII é expressa por pelo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais anos na corrente sanguínea do indivíduo jovem. Em certas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz do vírus AAV de Fator VIII administrada ao indivíduo jovem baseia-se no mesmo número absoluto de vírus AAV terapêutico constatado como uma dose eficaz em um indivíduo adulto. A quantidade terapeuticamente eficaz pode variar de pelo menos 1E12 vg/kg de peso corporal a pelo menos 1E15 vg/kg de peso corporal.

Em certas modalidades, além da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do vírus AAV de Fator VIII, o indivíduo é tratado de modo profilático, terapêutico, ou ambos, com um corticosteroide para prevenir e/ou tratar qualquer hepatotoxicidade associada com a administração do vírus AAV do Fator VIII. Em uma modalidade, a hepatotoxicidade associada é medida comparando os níveis basais (ou seja, antes da dose do AAV de Fator VIII) de alanina transaminase (ALT) aos níveis de ALT pós-tratamento, em que um aumento nos níveis de ALT pós- administração é evidência de hepatotoxicidade associada. Tratamento profilático com corticosteroide refere-se à administração de um corticosteroide para prevenir hepatotoxicidade e/ou para prevenir um aumento nos níveis de ALT medidos no indivíduo. Tratamento terapêutico com corticosteroide refere-se à administração de um corticosteroide para reduzir a hepatotoxicidade causada pela administração de um vírus AVV de Fator VIII e/ou para reduzir uma concentração elevada de ALT na corrente sanguínea do indivíduo causada pela administração de um vírus AAV de Fator VIII. Em certas modalidades, o tratamento profilático ou terapêutico com corticosteroide pode compreender a administração de pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ou mais mg/dia do corticosteroide ao indivíduo. Em certas modalidades, o tratamento profilático ou terapêutico com corticosteroide de um indivíduo pode ocorrer ao longo de um período contínuo de pelo menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais semanas.

A presente invenção é também direcionada a métodos, usos e composições para tratar estavelmente um indivíduo jovem que sofre de hemofilia B, os quais compreendem a etapa de administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vírus AAV recombinante de Fator IX, o qual pode ser formulado opcionalmente como descrito acima. Em uma modalidade preferida, o indivíduo jovem que sofre de hemofilia B é um humano. Em uma modalidade, o vírus AAV recombinante de Fator IX expressa o Fator IX R338L. Em uma modalidade, a etapa de administração é realizada por via intravenosa (IV). Em certos aspectos da presente invenção, a etapa de administração resulta na expressão estável de pelo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais UI/dL de proteína Fator IX na corrente sanguínea do indivíduo jovem, de preferência pelo menos aproximadamente 5 UI/dL de proteína Fator IX na corrente sanguínea do indivíduo jovem. Em certas modalidades, a etapa de administração resulta na expressão de pelo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais UI/dL de proteína Fator IX na corrente sanguínea do indivíduo jovem em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais semanas depois da administração. Em certas modalidades, a proteína Fator IX é expressa por pelo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais meses na corrente sanguínea do indivíduo jovem. Em certas modalidades, a proteína Fator IX é expressa por pelo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais anos na corrente sanguínea do indivíduo jovem.

Em certas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz do vírus AAV de Fator IX administrada ao indivíduo jovem baseia-se no mesmo número absoluto de vírus AAV terapêutico constatado como uma dose eficaz em um indivíduo adulto.

A quantidade terapeuticamente eficaz pode variar de pelo menos 1E12 vg/kg de peso corporal a pelo menos 1E15 vg/kg de peso corporal.

Em certas modalidades, além da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do vírus AAV de Fator IX, o indivíduo é tratado de modo profilático, terapêutico, ou ambos, com um corticosteroide para prevenir e/ou tratar qualquer hepatotoxicidade associada com administração do vírus AAV de Fator IX.

Em uma modalidade, a hepatotoxicidade associada é medida comparando os níveis basais (ou seja, antes da dose do AAV de Fator IX) de alanina transaminase (ALT) aos níveis de ALT pós-tratamento, em que um aumento nos níveis de ALT pós-administração é evidência de hepatotoxicidade associada.

Tratamento profilático com corticosteroide refere-se à administração de um corticosteroide para prevenir hepatotoxicidade e/ou para prevenir um aumento nos níveis de ALT medidos no indivíduo.

Tratamento terapêutico com corticosteroide refere-se à administração de um corticosteroide para reduzir a hepatotoxicidade causada pela administração de um vírus AVV de Fator IX e/ou para reduzir uma concentração elevada de ALT na corrente sanguínea do indivíduo causada pela administração de um vírus AAV de Fator IX.

Em certas modalidades, o tratamento profilático ou terapêutico com corticosteroide pode compreender administração de pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ou mais mg/dia do corticosteroide ao indivíduo.

Em certas modalidades, o tratamento profilático ou terapêutico com corticosteroide de um indivíduo pode ocorrer ao longo de um período contínuo de pelo menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais semanas.

A presente invenção é também direcionada ao uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz do vírus AAV recombinante de Fator VIII na preparação de um medicamento para o tratamento de um indivíduo jovem que sofre de hemofilia A. Em certas modalidades, o vírus AAV de Fator VIII é AAV5-FVIII-SQ ou um vírus que compreende o vetor p-100 ATGB. O medicamento pode ser formulado opcionalmente como descrito acima. Em uma modalidade preferida, o indivíduo jovem que sofre de hemofilia A é um humano. Em uma modalidade, o medicamento é administrado por via intravenosa (IV). Em um aspecto da presente invenção, a administração do medicamento resulta na expressão de pelo menos aproximadamente 5 UI/dL de proteína Fator VIII na corrente sanguínea do indivíduo, de preferência pelo menos aproximadamente 5 UI/dL de proteína Fator VIII na corrente sanguínea do indivíduo jovem em 16 semanas ou mais depois da administração. Em certas modalidades, o medicamento também compreende um corticosteroide profilático e/ou terapêutico para a prevenção e/ou o tratamento de qualquer hepatotoxicidade associada com a administração do vírus AAV do Fator VIII. O medicamento incluindo um tratamento profilático ou terapêutico com corticosteroide pode compreender pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ou mais mg/dia do corticosteroide. Em certas modalidades, o medicamento compreendendo um corticosteroide profilático ou terapêutico pode ser administrado ao longo de um período contínuo de pelo menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais semanas.

A presente invenção é também direcionada ao uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz do vírus AAV recombinante de Fator IX na preparação de um medicamento para o tratamento de um indivíduo jovem que sofre de hemofilia B. Em certas modalidades, o vírus AAV de Fator IX expressa o Fator IX R338L. O medicamento pode ser formulado opcionalmente como descrito acima. Em uma modalidade preferida, o indivíduo jovem que sofre de hemofilia B é um humano. Em uma modalidade, o medicamento é administrado por via intravenosa (IV). Em um aspecto da presente invenção, a administração do medicamento resulta na expressão de pelo menos aproximadamente 5 UI/dL de proteína Fator IX na corrente sanguínea do indivíduo, de preferência pelo menos aproximadamente 5 UI/dL de proteína Fator IX na corrente sanguínea do indivíduo jovem em 16 semanas ou mais depois da administração. Em certas modalidades, o medicamento também compreende um corticosteroide profilático e/ou terapêutico para a prevenção e/ou o tratamento de qualquer hepatotoxicidade associada com a administração do vírus AAV de Fator IX. O medicamento compreendendo um tratamento profilático ou terapêutico com corticosteroide pode compreender pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ou mais mg/dia do corticosteroide. Em certas modalidades, o medicamento compreendendo um corticosteroide profilático ou terapêutico pode ser administrado ao longo de um período contínuo de pelo menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 semanas ou mais.

A presente invenção é também direcionada a uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vírus AAV recombinante de Fator VIII para uso em reduzir o tempo de sangramento de um episódio de sangramento em um indivíduo jovem que sofre de hemofilia A. Em uma modalidade, o vírus AAV de Fator VIII é AAV5-FVIII-SQ. A composição pode ser formulada opcionalmente como descrito acima. Em uma modalidade preferida, o indivíduo jovem que sofre de hemofilia A é um humano. A composição pode ser administrada antes do episódio de sangramento. Em uma modalidade, a composição é administrada por via intravenosa (IV) antes do episódio de sangramento. Em um aspecto da presente invenção, a etapa de administração resulta na expressão de pelo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais UI/dL de proteína Fator VIII na corrente sanguínea do indivíduo jovem, de preferência pelo menos aproximadamente 5 UI/dL de proteína Fator VIII na corrente sanguínea do indivíduo jovem. Em certas modalidades, a etapa de administração resulta na expressão de pelo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais UI/dL de proteína Fator VIII na corrente sanguínea do indivíduo jovem em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais semanas depois da administração. Em certas modalidades, as composições compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do vírus AAV de Fator VIII para uso em reduzir o tempo de sangramento são administradas com uma composição compreendendo um corticosteroide profilático e/ou terapêutico para uso em prevenir e/ou tratar qualquer hepatotoxicidade associada com a administração do vírus AAV do Fator VIII, como descrito acima.

A presente invenção é também direcionada a uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vírus AAV recombinante de Fator IX para uso em reduzir o tempo de sangramento de um episódio de sangramento em um indivíduo jovem que sofre de hemofilia A. Em uma modalidade, o AAV de Fator IX expressa o Fator IX R338L. A composição pode ser formulada opcionalmente como descrito acima. Em uma modalidade preferida, o indivíduo jovem que sofre de hemofilia A é um humano. A composição pode ser administrada antes do episódio de sangramento. Em uma modalidade, a composição é administrada por via intravenosa (IV) antes do episódio de sangramento. Em um aspecto da presente invenção, a etapa de administração resulta na expressão de pelo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais UI/dL de proteína Fator IX na corrente sanguínea do indivíduo jovem, de preferência pelo menos aproximadamente 5 UI/dL de proteína Fator IX na corrente sanguínea do indivíduo jovem. Em certas modalidades, a etapa de administração resulta na expressão de pelo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais UI/dL de proteína Fator IX na corrente sanguínea do indivíduo jovem em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais semanas depois da administração. Em certas modalidades, as composições compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do vírus AAV de Fator IX para uso em reduzir o tempo de sangramento são administradas com uma composição compreendendo um corticosteroide profilático e/ou terapêutico para uso em prevenir e/ou tratar qualquer hepatotoxicidade associada com administração do vírus AAV de Fator IX, como descrito acima.

A presente invenção é também direcionada ao uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz do vírus AAV recombinante de PAH na preparação de um medicamento para o tratamento de um indivíduo jovem que sofre de FCN. O medicamento pode ser formulado opcionalmente como descrito acima. Em uma modalidade preferida, o indivíduo jovem que sofre de FCN é um humano. Em uma modalidade, o medicamento é administrado por via intravenosa (IV). Em um aspecto da presente invenção, a administração do medicamento resulta na expressão proteica de PAH na corrente sanguínea do indivíduo, suficiente para diminuir a concentração de fenilalanina na corrente sanguínea do indivíduo jovem em 16 semanas ou mais depois da administração. Em certas modalidades, o medicamento também compreende um corticosteroide profilático e/ou terapêutico para a prevenção e/ou o tratamento de qualquer hepatotoxicidade associada com a administração do vírus AAV de PAH. O medicamento compreendendo um tratamento profilático ou terapêutico com corticosteroide pode compreender pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ou mais mg/dia do corticosteroide. Em certas modalidades, o medicamento compreendendo um corticosteroide profilático ou terapêutico pode ser administrado ao longo de um período contínuo de pelo menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais semanas.

A presente invenção é também direcionada a métodos para induzir a expressão de uma proteína terapêutica funcional em um indivíduo jovem com necessidade do mesmo, os quais compreendem a etapa de administração ao indivíduo de um vírus AAV recombinante que expressa uma proteína terapêutica como aqui descrita, a qual pode ser formulada opcionalmente como aqui descrito, em que tal administração resulta em expressão aumentada da proteína terapêutica funcional ou concentrações aumentadas da proteína terapêutica funcional na corrente sanguínea do indivíduo. Em uma modalidade preferida, o indivíduo com necessidade é um humano. Em uma modalidade, a etapa de administração é realizada por via intravenosa (IV). Em um aspecto da presente invenção, a etapa de administração resulta na expressão da proteína terapêutica na corrente sanguínea do indivíduo jovem, de preferência até pelo menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140% ou 150% do nível encontrado da proteína terapêutica em um indivíduo jovem normal. Em certas modalidades, a etapa de administração resulta na expressão de pelo menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140% ou 150% do nível encontrado da proteína terapêutica em um indivíduo jovem normal na corrente sanguínea do indivíduo jovem em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais semanas depois da administração.

Em certas modalidades, além da administração de um vírus AAV que expressa uma proteína terapêutica, o indivíduo é tratado de modo profilático, terapêutico, ou ambos, com um corticosteroide para prevenir e/ou tratar qualquer hepatotoxicidade associada com a administração do vírus AAV, como descrito acima. Além disso, em qualquer um dos métodos da invenção depois da administração do vírus AAV para aumentar a expressão da proteína terapêutica, é determinada a ausência ou presença de anticorpos anti-capsídeo de AAV no soro do indivíduo. Se determinado que o indivíduo tem anticorpos anti-capsídeo de AAV no soro, é contemplada a administração de uma quantidade eficaz de um corticosteroide ao indivíduo com anticorpos anti- capsídeo de AAV no soro.

A presente invenção é também direcionada ao uso do vírus AAV da invenção na preparação de um medicamento para induzir a expressão de uma proteína terapêutica funcional em um indivíduo jovem com necessidade do mesmo, em que o vírus AAV recombinante expressa uma proteína terapêutica como aqui descrito, e o medicamento pode ser formulado opcionalmente como aqui descrito, em que tal medicamento resulta na expressão aumentada da proteína terapêutica funcional ou concentrações aumentadas da proteína terapêutica funcional na corrente sanguínea do indivíduo. Em uma modalidade preferida, o medicamento é administrado a um humano com necessidade. Em uma modalidade, o medicamento é administrado por via intravenosa (IV). Em um aspecto da presente invenção, a administração do medicamento resulta na expressão da proteína terapêutica na corrente sanguínea do indivíduo jovem, de preferência até pelo menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140% ou 150% do nível encontrado da proteína terapêutica em um indivíduo jovem normal. Em certas modalidades, a administração do medicamento resulta na expressão de pelo menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140% ou 150% do nível encontrado da proteína terapêutica em um indivíduo jovem normal na corrente sanguínea do indivíduo jovem em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais semanas depois da administração.

Em certas modalidades, além da administração de um vírus AAV que expressa uma proteína terapêutica, o indivíduo é tratado de modo profilático, terapêutico, ou ambos, com um corticosteroide para prevenir e/ou tratar qualquer hepatotoxicidade associada com a administração do vírus AAV, como descrito acima. Além disso, em qualquer um dos usos da invenção depois da administração do medicamento para aumentar a expressão da proteína terapêutica, é determinada a ausência ou presença de anticorpos anti-capsídeo de AAV no soro do indivíduo. Se determinado que o indivíduo tem anticorpos anti-capsídeo de AAV no soro, contempla-se o uso de uma quantidade eficaz de um corticosteroide na preparação de um medicamento para a administração ao indivíduo com anticorpos anti-capsídeo de AAV no soro.

A presente invenção é também direcionada a composições para induzir a expressão de uma proteína terapêutica funcional em um indivíduo jovem com necessidade do mesmo, em que a composição compreende um vírus AAV recombinante que expressa uma proteína terapêutica como aqui descrito, a qual pode ser formulada opcionalmente como aqui descrito, em que a administração de tal composição resulta na expressão aumentada da proteína terapêutica funcional ou concentrações aumentadas da proteína terapêutica funcional na corrente sanguínea do indivíduo. Em uma modalidade preferida, o indivíduo com necessidade é um humano. Em uma modalidade, a composição é formulada para administração intravenosa (IV). Em um aspecto da presente invenção, a administração da composição resulta na expressão da proteína terapêutica na corrente sanguínea do indivíduo jovem, de preferência até pelo menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140% ou 150% do nível encontrado da proteína terapêutica em um indivíduo jovem normal. Em certas modalidades, a administração da composição resulta na expressão de pelo menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140% ou 150% do nível encontrado da proteína terapêutica em um indivíduo jovem normal na corrente sanguínea do indivíduo jovem em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,

8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais semanas depois da administração.

Outras modalidades da presente invenção serão evidentes para o técnico no assunto quando da leitura do presente relatório descritivo da patente.

Descrição dos desenhos As Figuras 1A e 1B fornecem uma ilustração e um diagrama do desenho do estudo, respectivamente. Em resumo, camundongos adultos controle (8 semanas de idade) receberam uma dose única de AAV5-FVIII-SQ (3,5E13 vg/kg que é aproximadamente 8,9E11 vg por camundongo). Camundongos jovens (2 dias de idade) foram divididos em duas coortes. Uma coorte recebeu uma dose única de AAV5-FVIII-SQ que era a mesma quantidade total de vg que a de camundongos adultos (8,9E11 vg/camundongo). A outra coorte recebeu uma dose única de AAV5-FVIII-SQ que era a mesma quantidade de vg/kg que a de camundongos adultos (3,5E13 vg/kg).

A Figura 2 é um conjunto de gráficos que mostram que jovens (que receberam a mesma dose total de vg que adultos) têm a mesma capacidade que adultos para absorver o DNA viral de AAV como mostrado pelo DNA total do Fator VIII no fígado no gráfico à esquerda e o RNA total de Fator VIII RNA no fígado no gráfico à direita.

A Figura 3 é um conjunto de gráficos que mostram que o peso corporal (gráfico à esquerda) e o peso do fígado (gráfico à direita) de camundongos jovens aumentaram rapidamente depois da administração de AAV5-FVIII-SQ.

A Figura 4 é um gráfico que mostra que AAV5-FVIII-SQ não causou lesão hepática em camundongos jovens, conforme determinado pela medição de ALT.

A Figura 5 é um conjunto de gráficos que mostram que camundongos jovens precisam a mesma quantidade total de genoma do vetor que adultos para manter níveis terapêuticos do Fator VIII na idade adulta. O painel esquerdo mostra a concentração plasmática do Fator VIII ao longo do tempo e o painel direito mostra o Fator VIII total circulante em camundongos jovens tratados com a mesma quantidade total de genoma do vetor que adultos (8,9E11 vg/camundongo que é equivalente a aproximadamente 4,5E14 vg/kg) ou o vg por peso corporal que adultos (3,5E13 vg/kg). Em ambos, esses valores são comparados a adultos tratados com 3,5E13 vg/kg. O FVIII circulante total foi determinado multiplicando a concentração plasmática de FVIII pelo volume sanguíneo estimado (nesse caso, o volume sanguíneo estimado é 10% do peso corporal).

Figuras 6A e 6B. A Figura 6A é a análise imuno-histoquímica do capsídeo de AAV5 em cortes do fígado de camundongos adultos tratados com AAV5-FVIII-SQ. A Figura é uma análise por Western blotting do capsídeo de AAV5 de camundongos jovens tratados com AAV5-FVIII-SQ.

A Figura 7 é uma tabela mostrando o desenho global de um estudo que determinará as condições ótimas para expressão de PAH nos fígados de indivíduos com FCN.

As Figuras 8A-8C fornece o peso corporal (g; média ± SEM) para cada grupo de todos os camundongos ENU tratados com AAV e veículo antes e 8 semanas depois da dose com 2x1014 vg/kg de

AAV5-PAH ou veículo. A Figura 8A fornece o peso corporal antes do tratamento. A Figura 8B fornece o peso corporal 4 semanas após a administração. A Figura 8C fornece o peso corporal 8 semanas após a administração. * p< 0,05, **** p,0,0001 como determinada por ANOVA one-way (análise de variância com um fator).

As Figuras 9A-9B fornecem a concentração plasmática de PHE (µM; média ±SEM) para cada grupo de todos os camundongos ENU tratados com AAV e com veículo antes e 8 semanas depois da dose com 2x1014 vg/kg de AAV5-PAH ou veículo. A Figura 9A fornece a concentração plasmática de PHE 4 semanas após a administração. A Figura 9B fornece a concentração plasmática de PHE 8 semanas após a administração. * p< 0,05, **** p,0,0001 como determinada por ANOVA one-way.

Descrição detalhada da invenção A presente invenção provê vetores AAV que codificam proteínas terapêuticas funcionalmente ativas (p. ex., vetores AAV de Fator VIII, vetores AAV de Fator IX e vetores AAV de PAH completamente empacotados). Os vetores AAV recombinantes de proteínas terapêuticas da invenção melhoraram a expressão do transgene, bem como melhoraram o rendimento da produção viral de AAV e simplificaram a purificação. A introdução de um ou mais íntrons na região de codificação da proteína terapêutica aumenta a expressão. Reconfigurar o número e o posicionamento de reforçadores também aumenta a expressão.

Vetores AAV Neste relatório descritivo, o termo “AAV” é uma abreviação padrão para vírus adenoassociado. O vírus adenoassociado é um parvovírus com DNA de fita simples que cresce somente em células nas quais certas funções são proporcionadas por um vírus auxiliar (helper virus) co-infectante. Existem atualmente treze sorotipos de AAV que foram caracterizados. Informações gerais e revisões sobre AAV podem ser encontradas, por exemplo, em Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pág. 169-228; e Berns, 1990, Virology, pág. 1743-1764, Raven Press, (New York). No entanto, é totalmente esperado que esses mesmos princípios venham a ser aplicáveis a sorotipos adicionais de AAV, pois sabe-se bem que os vários sorotipos são muito estritamente relacionados, não estruturalmente, mas também funcionalmente, mesmo em nível genético (Ver, p. ex., Blacklowe, 1988, pág. 165-174 de Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed.; e Rose, Comprehensive Virology 3:1-61 (1974)). Por exemplo, todos os sorotipos de AAV aparentemente exibem propriedades de replicação muito semelhantes, mediadas por genes rep homólogos; e todos carregam três proteínas relacionadas ao capsídeo. O grau de afinidade é sugerido ainda mais pela análise de heteroduplex que revela extensa hibridização cruzada entre os sorotipos ao longo do comprimento do genoma; e a presença de segmentos análogos de auto-anelamento nos terminais que correspondem a “sequências de repetição terminal invertida” (ITRs). Os padrões semelhantes de infectividade também sugerem que a replicação funciona em cada sorotipo sob controle regulador semelhante.

Um “vetor AAV”, neste relatório descritivo, refere-se a um vetor que compreende um ou mais polinucleotídeos de interesse (ou transgenes) que são flanqueados por sequências de repetição terminal (ITRs) de AAV e operacionalmente ligados a um ou mais elementos de controle da expressão. Tais vetores AAV podem ser replicados e empacotados em partículas virais infecciosas quando presentes em uma célula hospedeira que foi transfectada com um vetor que codifica e expressa produtos dos genes rep e cap.

Um “vírion de AAV” ou “partícula viral de AAV” ou “partícula de vetor AAV” refere-se a uma partícula viral composta por pelo menos uma proteína do capsídeo de AAV e um vetor polinucleotídico de AAV envolvido em capsídeo. Se compreende um polinucleotídeo heterólogo (ou seja, um polinucleotídeo diferente do genoma de um AAV do tipo selvagem tal como um transgene a ser entregue a uma célula de mamífero), a partícula é referida tipicamente como uma “partícula de vetor AAV” ou simplesmente um “vetor AAV”. Assim, a produção da partícula de vetor AAV inclui necessariamente a produção do vetor AAV, uma vez que tal vetor está contido dentro de uma partícula de vetor AAV.

Os genes “rep” e “cap” de AAV são genes que codificam proteínas para replicação e encapsidação, respectivamente. Os genes rep e cap de AAV foram encontrados em todos os sorotipos de AAV examinados até o momento, e são aqui descritos e nas referências citadas. No AAV do tipo selvagem, os genes rep e cap são geralmente encontrados adjacentes um ao outro no genoma viral (ou seja, estão “acoplados” juntos como unidades transcricional adjacentes ou sobrepostas) e, em geral, são conservados entre os sorotipos de AAV. Os genes rep e cap de AAV são também referidos individual e coletivamente como “genes de empacotamento de AAV”. Os genes cap de AAV, de acordo com a presente invenção, codificam proteínas Cap que são capazes de empacotar vetores AAV na presença de função rep e adeno auxiliar e são capazes de ligar- se a receptores celulares alvo. Em algumas modalidades, os genes cap de AAV codifica uma proteína do capsídeo tendo uma sequência de aminoácidos derivada de um sorotipo de AAV em particular.

As sequências de AAV empregadas para a produção do AAV podem ser derivadas do genoma de qualquer sorotipo de AAV. Em geral, os sorotipos de AAV possuem sequências genômicas de homologia significativa em níveis de aminoácidos e ácido nucleico, fornecem um conjunto semelhante de funções genéticas, produzem vírions que são essencialmente equivalentes física e funcionalmente e replicam e juntam-se por mecanismos praticamente idênticos. Para a sequência genômica de sorotipos de AAV e uma discussão sobre as similaridades genômicas, ver, p. ex., número de acesso GenBank U89790; número de acesso GenBank J01901; número de acesso GenBank AF043303; número de acesso GenBank AF085716; Chiorini et al., J. Vir. (1997) vol. 71, pág. 6823-6833; Srivastava et al., J. Vir. (1983) vol. 45, pág. 555- 564; Chiorini et al., J. Vir. (1999) vol. 73, pág. 1309-1319; Rutledge et al., J. Vir. (1998) vol. 72, pág. 309-319; e Wu et al., J. Vir. (2000) vol. 74, pág. 8635-8647.

A organização genômica de todos os sorotipos conhecidos de AAV é muito semelhante. O genoma do AAV é uma molécula de DNA linear, de fita simples com menos de aproximadamente 5.000 nucleotídeos (nt) de comprimento. Repetições terminais invertidas (ITRs) flanqueiam as sequências nucleotídicas únicas de codificação para as proteínas não estruturais de replicação (Rep) e as proteínas estruturais (VP). As proteínas VP formam o capsídeo. Os 145 nt das terminações são autocomplementares e são organizados de modo que um duplex intramolecular energeticamente estável formando um grampo de cabelo (hairpin) em forma de T possa ser formado. Essas estruturas em grampo de cabelo funcionam como uma origem para replicação do DNA viral, servindo como primers (iniciadores) para o complexo DNA polimerase celular. Os genes Rep codificam as proteínas Rep, Rep78, Rep68, Rep52 e Rep40. Rep78 e Rep68 são transcritas a partir do promotor p5, e Rep 52 e Rep40 são transcritas a partir do promotor p19. Os genes cap codificam as proteínas VP, VP1, VP2 e VP3. Os genes cap são transcritas a partir do promotor p40. As ITRs empregadas nos vetores da presente invenção podem corresponder ao mesmo sorotipo que os genes cap associados, ou podem diferir. Em uma modalidade especialmente preferida, as ITRs empregadas nos vetores da presente invenção correspondem a um sorotipo AAV2 e os genes cap correspondem a um sorotipo AAV5.

Em algumas modalidades, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína do capsídeo de AAV é operacionalmente ligada a sequências de controle da expressão para a expressão em um tipo celular específico, tal como células Sf9 ou HEK. Técnicas conhecidas pelo técnico no assunto para expressar genes exógenos em células hospedeiras de insetos ou células hospedeiras de mamíferos podem ser utilizadas na prática da invenção. A metodologia para engenharia molecular e expressão de polipeptídeos em células de insetos é descrita, por exemplo, em Summers and Smith (1986) A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bull. No. 7555, College Station, Tex.; Luckow (1991), em Prokop et al., Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors' Recombinant DNA Technology and Applications, 97-152; King, L. A. and R. D. Possee (1992) The baculovirus expression system, Chapman and Hall, United Kingdom; O'Reilly, D. R., L. K. Miller,

V. A. Luckow (1992) Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York; W.H. Freeman and Richardson, C. D. (1995) Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, volume 39; Patente U.S. No 4 745 051; US2003148506; e WO 03/074714, todos os quais são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência. Um promotor especialmente adequado para a transcrição de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína do capsídeo de AAV é, p. ex., o promotor poliédrico. No entanto, outros promotores que são ativos em células de insetos são conhecidos na técnica, p. ex. os promotores p10, p35 ou IE-1 e promotores adicionais descritos nas referências acima são também contemplados.

O uso de células de insetos para a expressão de proteínas heterólogas está bem documentado, como o são os métodos para introdução de ácidos nucleicos, tais como vetores, p. ex., em vetores compatíveis com células de insetos, em tais células e métodos para manter tais células em cultura (Ver, p. ex., Methods in Molecular Biology, ed. Richard, Humana Press, N J (1995); O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, Oxford Univ. Press (1994); Samulski et al., J. Vir. (1989) vol. 63, pág.3822-3828; Kajigaya et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA (1991) vol. 88, pág. 4646-4650; Ruffing et al., J. Vir. (1992) vol. 66, pág. 6922-6930; Kirnbauer et al., Vir. (1996) vol. 219, pág. 37-44; Zhao et al., Vir. (2000) vol. 272, pág. 382-393; e Patente U.S. No 6 204 059). Em algumas modalidades, a construção do ácido nucleico que codifica AAV em células de insetos é um vetor compatível com células de insetos. Um “vetor compatível com células de insetos” ou “vetor”, neste relatório descritivo, refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transformação produtiva ou transfecção de um inseto ou célula de inseto. Vetores biológicos exemplares incluem plasmídeos, moléculas de ácido nucleico linear e vírus recombinantes. Qualquer vetor pode ser empregado desde que seja compatível com células de insetos. O vetor pode integrar-se no genoma das células de inseto, mas a presença do vetor na célula de inseto não precisa ser permanente, e vetores epissomais transitórios também estão incluídos. Os vetores podem ser introduzidos por qualquer meio conhecido, por exemplo, por tratamento químico das células, eletroporação ou infecção. Em algumas modalidades, o vetor é um baculovírus, um vetor ou um plasmídeo. Em uma modalidade mais preferida, o vetor é um baculovírus, ou seja, a construção é um vetor baculoviral. Vetores baculovirais e métodos para o seu uso são descritos nas referências citadas acima sobre engenharia molecular de células de insetos.

Os baculovírus são vírus de DNA com envelope que infectam artrópodes, entre os quais, dois membros são vetores de expressão bem conhecidos para a produção de proteínas recombinantes em culturas celulares. Os baculovírus possuem genomas circulares de fita dupla (80-200 kbp) que podem ser criados para permitir a entrega de grande teor genômico a células específicas. Os virus usados como um vetor são geralmente o nucleopoliedrovírus multicapsídeo que infecta Autographa californica (AcMNPV) ou Bombyx mori (BmNPV).

Os baculovírus são comumente utilizados na infecção de células de insetos para a expressão de proteínas recombinantes. Em particular, a expressão de genes heterólogos em insetos pode ser realizada como descrito em, por exemplo, a Patente U.S. No 4

745 051; Friesen et al (1986); EP 127,839; EP 155,476; Vlak et al (1988); Miller et al (1988); Carbonell et al (1988); Maeda et al (1985); Lebacq-Verheyden et al (1988); Smith et al (1985); Miyajima et al (1987); e Martin et al (1988). Inúmeras cepas e variantes de baculovírus e células hospedeiras de insetos permissivas correspondentes que podem ser utilizadas para a produção de proteínas são descritas em Luckow et al (1988), Miller et al (1986); Maeda et al (1985) e McKenna (1989).

Métodos para a produção de AAVs recombinantes A presente invenção provê materiais e métodos para a produção de AAVs recombinantes em células de insetos ou de mamíferos. Em algumas modalidades, a construção viral compreende ainda um promotor e um sítio de restrição a jusante (downstream) do promotor para permitir a inserção de um polinucleotídeo que codifica uma ou mais proteínas de interesse, em que o promotor e o sítio de restrição estão localizados a jusante da ITR de AAV 5' e a montante (upstream) da ITR de AAV 3'. Em algumas modalidades, a construção viral compreende ainda um elementos regulador pós-transcricional a jusante do sítio de restrição e a montante da ITR de AAV 3'. Em algumas modalidades, a construção viral compreende ainda um polinucleotídeo inserido no sítio de restrição e ligado operacionalmente com o promotor, em que o polinucleotídeo compreende a região de codificação de uma proteína de interesse. Como o técnico no assunto apreciará, qualquer um dos vetores AAV revelados no presente pedido de patente pode ser utilizado no método como a construção viral para produzir o AAV recombinante.

Em algumas modalidades, as funções de auxiliares são fornecidas por um ou mais plasmídeos auxiliares ou vírus auxiliares compreendendo genes auxiliares adenovirais ou baculovirais. Exemplos não limitantes dos genes auxiliares adenovirais ou baculovirais incluem, entre outros, E1A, E1B, E2A, E4 e VA, os quais podem proporcionar funções auxiliares para o empacotamento do AAV.

Vírus auxiliares de AAV são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, vírus da família Adenoviridae e da família Herpesviridae. Exemplos de vírus auxiliares de AAV incluem, entre outros, o vírus auxiliar SAdV-13 o vírus auxiliar SAdV- 13-like descrito na Publicação U.S. No 20110201088 (cujo conteúdo é aqui incorporado por referência), os vetores auxiliares pHELP (Applied Viromics). O técnico no assunto apreciará que é possível utilizar no presente qualquer vírus auxiliar ou plasmídeo auxiliar de AAV que possa proporcionar função auxiliar adequada para AAV.

Em algumas modalidades, os genes cap de AAV estão presentes em um plasmídeo. O plasmídeo pode compreender ainda um gene rep de AAV que pode corresponder ao não ao mesmo sorotipo que os genes cap. Os genes cap e/ou gene rep de qualquer sorotipo de AAV (incluindo, entre outros, AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13 e quaisquer variantes dos mesmos) podem ser utilizados para produzir o AAV recombinante. Em algumas modalidades, os genes cap de AAV codificam um capsídeo do sorotipo 1, sorotipo 2, sorotipo 4, sorotipo 5, sorotipo 6, sorotipo 7, sorotipo 8, sorotipo 9, sorotipo 10, sorotipo 11, sorotipo 12, sorotipo 13 ou uma variante dos mesmos.

Em algumas modalidades, a célula de inseto ou de mamífero pode ser transfectada com o plasmídeo auxiliar ou o vírus auxiliar, a construção viral e o plasmídeo que codificam os genes cap de AAV; e o vírus AAV recombinante pode ser coletado em vários momentos após a co-transfecção. Por exemplo, o vírus AAV recombinante pode ser coletado em aproximadamente 12 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 72 horas, aproximadamente 96 horas, aproximadamente 120 horas ou em um momento entre qualquer um desses dois após a co-infecção.

O AAV recombinante pode também ser produzido utilizados métodos convencionais conhecidos na técnica, adequados para a produção de AAV recombinante infeccioso. Em alguns casos, um AAV recombinante pode ser produzido utilizando uma célula de inseto ou de mamífero que expressa estavelmente alguns dos componentes necessários para a produção da partícula de AAV. Por exemplo, um plasmídeo (ou múltiplos plasmídeos), compreendendo genes rap e cap de AAV, e um marcador selecionável, tal como um gene de resistência à neomicina, podem ser integrados no genoma da célula. A célula de inseto ou de mamífero pode então ser co- infectada com um vírus auxiliar (p. ex., adenovírus ou baculovírus proporcionando as funções de auxiliar) e o vetor viral compreendendo as ITRs de AAV 5' e 3' (e a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína heteróloga, se desejado). As vantagens desse método são que as células são selecionáveis e adequadas para a produção em grande escala do AAV recombinante. Como outro exemplo não limitante, um adenovírus ou baculovírus em vez de plasmídeos pode ser utilizado para introduzir os genes rep e cap em células de empacotamento. Como ainda outro exemplo não limitante, ambos, o vetor viral contendo as LTRs de AAV 5' e 3' e os genes rep-cap podem ser integrados estavelmente no DNA de células produtoras, e as funções do auxiliar podem ser proporcionadas por um adenovírus do tipo selvagem para produzir o AAV recombinante.

Tipos de células usadas na produção de AAV As partículas virais compreendendo os vetores AAV da invenção podem ser produzidas utilizando qualquer tipo de célula de invertebrados que permita a produção de AAV ou produtos biológicos e que possa ser mantido em cultura. Por exemplo, a linhagem de célula de inseto usada pode ser de Spodoptera frugiperda, tal como SF9, SF21, SF900+, linhagem de células de drosófila, linhagens de células de mosquito, p. ex., linhagens celulares derivadas de Aedes albopictus, linhagens celulares de bicho da seda, p. ex., linhagens celulares de Bombyx mori, linhagens celulares de Trichoplusia ni, tais como células High Five, ou linhagens celulares de Lepidoptera tais como linhagens celulares de Ascalapha odorata. As células preferidas de insetos são células das espécies de insetos que são suscetíveis à infecção por baculovírus, incluindo High Five, Sf9, Se301, SeIZD2109, SeUCR1, Sf9, Sf900+, Sf21, BTI-TN-5B1-4, MG-1, Tn368, HzAm1, BM-N, Ha2302, Hz2E5 e Ao38.

Os baculovírus são vírus de DNA com envelope que infectam artrópodes, entre os quais, dois membros são vetores de expressão bem conhecidos para a produção de proteínas recombinantes em culturas celulares. Os baculovírus possuem genomas circulares de fita dupla (80-200 kbp) que podem ser criados para permitir a entrega de grande teor genômico a células específicas. Os virus usados como um vetor são geralmente o nucleopoliedrovírus multicapsídeo que infecta Autographa californica (AcMNPV) ou Bombyx mori (BmNPV) (Kato et al., 2010).

Os baculovírus são comumente usados na infecção de células de insetos para a expressão de proteínas recombinantes. Em particular, a expressão de genes heterólogos em insetos pode ser realizada como descrito em, por exemplo, a Patente U.S. No 4 745 051; Friesen et al (1986); EP 127,839; EP 155,476; Vlak et al (1988); Miller et al (1988); Carbonell et al (1988); Maeda et al (1985); Lebacq-Verheyden et al (1988); Smith et al (1985); Miyajima et al (1987); e Martin et al (1988). Inúmeras cepas de baculovírus e variantes e células hospedeiras de insetos permissivas correspondentes que podem ser utilizadas para a produção de proteínas são descrias em Luckow et al (1988), Miller et al (1986); Maeda et al (1985) e McKenna (1989).

Em outro aspecto da invenção, os métodos da invenção são também realizados com qualquer tipo de célula de mamífero que permita a replicação de AAV ou a produção de produtos biológicos, e que possa ser mantida em cultura. As células preferidas de mamíferos usadas podem ser células HEK293, HeLa, CHO, NSO, SP2/0, PER.C6, Vero, RD, BHK, HT 1080, A549, Cos-7, ARPE-19 e MRC-5.

Formulações farmacêuticas Em outras modalidades, a presente invenção é direcionada a formulações farmacêuticas da proteína terapêutica que expressa vetores/vírions de AAV, úteis para administração a indivíduos que sofrem de um transtorno genético. Em certos aspectos, as formulações farmacêuticas da presente invenção são formulações líquidas que compreendem a proteína terapêutica recombinante que expressa vírions de AAV produzidos a partir dos vetores aqui descritos, em que a concentração de vírions de AAV recombinante na formulação pode variar bastante. Em certas modalidades, a concentração do vírion de AAV recombinante na formulação pode variar de 1E12 vg/mL a 2E16 vg/mL. Em uma modalidade especialmente preferida, a concentração do vírion de AAV recombinante na formulação é aproximadamente 2E13 vg/mL. Em uma modalidade preferida, o vírion de AAV recombinante presente na formulação é derivado de AAV5-FVIII-SQ. Em outras modalidades preferidas da invenção, o vírion de AAV recombinante presente na formulação é derivado de vetores AAV que expressam Fator IX ou expressam PAH.

Em outros aspectos, a formulação farmacêutica de AAV da invenção compreende um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis para conferir à formulação propriedades vantajosas no armazenamento e/ou administração a indivíduos para o tratamento do transtorno genético. Em certas modalidades, as formulações farmacêuticas da presente invenção são capazes de ser armazenadas a -65 ºC por um período de pelo menos 2 semanas, de preferência pelo menos 4 semanas, mais preferivelmente pelo menos 6 semanas e ainda mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 8 semanas, sem alteração detectável na estabilidade. A esse respeito, o termo “estável” significa que o vírus AAV recombinante presente na formulação retém essencialmente sua estabilidade física, estabilidade química e/ou atividade biológica durante o armazenamento. Em certas modalidades da presente invenção, o vírus AAV recombinante presente na formulação retém pelo menos cerca de 80% de sua atividade biológica em um paciente humano durante o armazenamento por um período determinado de tempo a -65 ºC, mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de sua atividade biológica em um ser humano jovem.

Em certos aspectos, a formulação compreendendo os vírions do AAV recombinante compreende ainda um ou mais agentes tamponantes. Por exemplo, em vários aspectos, a formulação da presente invenção compreende fosfato de sódio dibásico a uma concentração entre aproximadamente 0,1 mg/mL e 3 mg/mL, entre aproximadamente 0,5 mg/mL e 2.5 mg/mL, entre aproximadamente 1 mg/mL e 2 mg/mL ou entre aproximadamente 1,4 mg/mL e 1,6 mg/mL. Em uma modalidade especialmente preferida, a formulação o AAV da presente invenção compreende aproximadamente 1,42 mg/mL de fosfato de sódio, dibásico (seco). Outro agente tamponante que pode encontrar utilidade nas formulações do AAV recombinante da presente invenção é fosfato de sódio, monobásico monoidratado que, em algumas modalidades, encontra utilidade a uma concentração entre aproximadamente 0,1 mg/mL e 3 mg/mL, entre aproximadamente 0,5 mg/mL e 2,5 mg/mL, entre aproximadamente 1 mg/mL e 2 mg/mL ou entre aproximadamente 1,3 mg/mL e 1,5 mg/mL. Em uma modalidade especialmente preferida, a formulação do AAV da presente invenção compreende aproximadamente 1,38 mg/mL de fosfato de sódio, monobásico monoidratado. Em ainda uma modalidade mais especialmente preferida da presente invenção, a formulação do AAV recombinante da presente invenção compreende aproximadamente 1,42 mg/mL de fosfato de sódio, dibásico e aproximadamente 1,38 mg/mL de fosfato de sódio, monobásico monoidratado.

Em outro aspecto, a formulação do AAV recombinante da presente invenção pode compreender um ou mais agentes de isotonicidade, como cloreto de sódio, de preferência a uma concentração entre aproximadamente 1 mg/mL e 20 mg/mL, por exemplo, entre aproximadamente 1 mg/mL e 10 mg/mL, entre aproximadamente 5 mg/mL e 15 mg/mL ou entre aproximadamente 8 mg/mL e 20 mg/mL. Em uma modalidade especialmente preferida, a formulação da presente invenção compreende aproximadamente 8,18 mg/mL cloreto de sódio. Outros agentes tamponantes e agentes de isotonicidade conhecidos na técnica são adequados e podem ser empregados rotineiramente para uso nas formulações da presente invenção.

Em outro aspecto, as formulações do AAV recombinante da presente invenção podem compreender um ou mais agentes de volume. Agentes de volume exemplares incluem, entre outros, manitol, sacarose, dextrano, lactose, trealose e povidona (PVP K24). Em certas modalidades preferidas, as formulações da presente invenção compreendem manitol, o qual pode estar presente em uma quantidade entre aproximadamente 5 mg/mL e 40 mg/mL, entre aproximadamente 10 mg/mL e 30 mg/mL ou entre aproximadamente 15 mg/mL e 25 mg/mL. Em uma modalidade especialmente preferida, manitol está presente a uma concentração próxima de 20 mg/mL.

Em ainda outro aspecto, as formulações do AAV recombinante da presente invenção podem compreender um ou mais tensoativos, os quais podem ser tensoativos não iônicos. Os tensoativos exemplares incluem tensoativos iônicos, tensoativos não iônicos e combinações dos mesmos. Por exemplo, o tensoativo pode ser, sem limitação, TWEEN 80 (também conhecido como polissorbato 80, ou seu nome químico monooleato de polioxietileno sorbitana), dodecilsulfato de sódio, estearato de sódio, lauril sulfato de sódio, lauril sulfato de amônio, TRITON AG 98 (Rhone-Poulenc), poloxâmero 407, poloxâmero 188 e similares, além de combinações dos mesmos. Em uma modalidade especialmente preferida, a formulação da presente invenção compreende poloxâmero 188, o qual pode estar presente a uma concentração entre aproximadamente 0,1 mg/mL e 4 mg/mL, entre aproximadamente 0,5 mg/mL e 3 mg/mL, entre aproximadamente 1 mg/mL e 3 mg/mL, entre aproximadamente 1,5 mg/mL e 2,5 mg/mL ou entre aproximadamente 1,8 mg/mL e 2,2 mg/mL. Em uma modalidade especialmente preferida, poloxâmero 188 está presente a uma concentração próxima de 2,0 mg/mL.

Em uma modalidade especialmente preferida da presente invenção, a formulação farmacêutica da presente invenção compreende AAV5-FVIII-SQ formulado em uma solução líquida que compreende aproximadamente 1,42 mg/mL de fosfato de sódio, dibásico, aproximadamente 1,38 mg/mL de fosfato de sódio, monobásico monoidratado, aproximadamente 8,18 mg/mL de cloreto de sódio, aproximadamente 20 mg/mL de manitol e aproximadamente 2 mg/mL de poloxâmero 188.

As formulações contendo o vírus AAV que expressa a proteína terapêutica recombinante da presente invenção são estáveis e podem ser armazenadas por períodos prolongados de tempo sem uma alteração inaceitável na qualidade, potência ou pureza. Em um aspecto, a formulação é estável a uma temperatura de aproximadamente 5 ºC (p. ex., 2 ºC a 8 C) por pelo menos 1 mês, por exemplo, pelo menos 1 mês, pelo menos 3 meses, pelo menos 6 meses, pelo menos 12 meses, pelo menos 18 meses, pelo menos 24 meses ou mais. Em outro aspecto, a formulação é estável a uma temperatura inferior ou igual a aproximadamente -20 ºC por pelo menos 6 meses, por exemplo, pelo menos 6 meses, pelo menos 12 meses, pelo menos 18 meses, pelo menos 24 meses, pelo menos 36 meses ou mais. Em outro aspecto, a formulação é estável a uma temperatura inferior ou igual a aproximadamente -40 ºC por pelo menos 6 meses, por exemplo, pelo menos 6 meses, pelo menos 12 meses, pelo menos 18 meses, pelo menos 24 meses, pelo menos 36 meses ou mais. Em outro aspecto, a formulação é estável a uma temperatura inferior ou igual a aproximadamente -60 ºC por pelo menos 6 meses, por exemplo, pelo menos 6 meses, pelo menos 12 meses, pelo menos 18 meses, pelo menos 24 meses, pelo menos 36 meses ou mais.

Métodos de tratamento Em certas modalidades, a presente invenção é direcionada a métodos para tratar um indivíduo que sofre de um transtorno genético, o qual compreende administrar àquele indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor AAV que expressa uma proteína terapêutica ou de uma composição farmacêutica que compreende o mesmo. Nesse caso, uma “quantidade terapeuticamente eficaz” é uma quantidade de vetor AAV que, depois da administração, resulta na expressão da proteína terapêutica em um nível suficiente para pelo menos melhorar parcialmente e, de preferência, totalmente os sintomas do transtorno genético.

Por exemplo, a presente invenção é direcionada a métodos para tratar doenças ou transtornos incluindo câncer, como carcinoma, sarcoma, leucemia, linfoma; e doenças autoimunes como esclerose múltipla. Exemplos não limitantes de carcinomas incluem carcinoma do esôfago; carcinoma hepatocelular; carcinoma basocelular; carcinoma de células escamosas (vários tecidos); carcinoma de bexiga, incluindo carcinoma de células transicionais; carcinoma broncogênico; carcinoma de cólon; carcinoma colorretal; carcinoma gástrico; carcinoma pulmonar, incluindo carcinoma de pequenas células e carcinoma de não pequenas células do pulmão; carcinoma adrenocortical; carcinoma de tireoide; carcinoma pancreático; carcinoma de mama; carcinoma de ovário; carcinoma de próstata; adenocarcinoma; carcinoma de glândulas sudoríparas; carcinoma de glândulas sebáceas; carcinoma papilar; adenocarcinoma papilar; cistadenocarcinoma; carcinoma medular; carcinoma de células renais; carcinoma ductal in situ ou carcinoma de ductos biliares; coriocarcinoma; seminoma; carcinoma embrionário; tumor de Wilm; carcinoma cervical; carcinoma uterino; carcinoma testicular; carcinoma osteogênico; carcinoma epitelial; e carcinoma nasofaríngeo.

Exemplos não limitantes de sarcomas incluem fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, cordoma, sarcoma osteogênico, osteossarcoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma, linfangioendoteliossarcoma, sinovioma, mesotelioma, sarcoma de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma e outros sarcomas de tecidos moles.

Exemplos não limitantes de tumores sólidos incluem glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma e retinoblastoma.

Exemplos não limitantes de leucemias incluem síndromes mieloproliferativas crônicas; leucemias mielogênicas agudas; leucemias linfocítica crônicas (LLC), incluindo LLC de células B, LLC de células T, leucemia pró-linfocítica e leucemia de células cabeludas; e leucemias linfoblásticas agudas.

Exemplos de linfomas incluem, entre outros, linfomas de células B, como linfoma de Burkitt; linfoma de Hodgkin; e similares.

Outros exemplos não limitantes das doenças que podem ser tratadas utilizando os vetores AAV, vírus recombinantes e os métodos aqui descritos incluem transtornos genéticos como anemia falciforme, fibrose cística, deficiência

1 de lipase ácida lisossomal (LAL), doença de Tay-Sachs, fenilcetonúria, mucopolissacaridoses, doenças de armazenamento do glicogênio (GSD, p. ex., GSD tipos I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII e XIV), galactossemia, distrofia muscular (p. ex., distrofia muscular de Duchenne), doença de Wilson, angioedema hereditário (AEH), deficiência de alfa 1 antitripsina, doença de Fabry, doença de Gaucher e hemofilia como hemofilia A (hemofilia clássica) e hemofilia B (doença de Christmas). Além disso, os vetores AAV, vírus recombinantes e os métodos aqui descritos podem ser usados para outros transtornos que podem ser tratados pela expressão local de um transgene no fígado ou pela expressão de uma proteína secretada no fígado ou por um hepatócito.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção é direcionada a métodos para reduzir o tempo de sangramento durante um episódio de sangramento em um indivíduo jovem que sofre de hemofilia A, os quais compreendem administrar àquele indivíduo jovem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor AAV FVIII, um vírus recombinante AAV FVIII ou de uma composição farmacêutica compreendendo os mesmos. A esse respeito, uma “quantidade terapeuticamente eficaz”, em referência ao tratamento de hemofilia A ou para uso em um método para reduzir o tempo de sangramento durante um episódio de sangramento em um indivíduo que sofre de hemofilia A, refere-se a uma quantidade capaz de suscitar um ou mais dos seguintes efeitos: (1) redução, inibição ou prevenção, em alguma medida, de um ou mais dos sintomas fisiológicos de hemofilia A, incluindo, por exemplo, contusão, dor articular ou edema, cefaleia prolongada, vômito ou fadiga, (2) melhora na capacidade de coagulação do sangue, (3)

redução do tempo de sangramento global durante um episódio de sangramento, (4) administração resultando em um aumento mensurável na concentração ou atividade da proteína FVIII funcional no plasma de um indivíduo e/ou (5) alívio, em alguma medida, de um ou mais sintomas associados com o transtorno.

Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” de um vetor AAV ou vírus ou de uma composição farmacêutica compreendendo os mesmos, para efeito de tratamento como aqui descrito, pode ser determinada empiricamente e de maneira rotineira. Em uma modalidade especialmente preferida, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vírus AAV terapêutico para o tratamento de um indivíduo jovem é o mesmo número absoluto de partículas virais que foi determinado, calculado ou estimado para produzir uma resposta terapêutica em indivíduos adultos. Consequentemente, a invenção provê a administração de vetores AAV a indivíduos jovens em doses maiores, em comparação a adultos, quando medida em vg/kg de peso corporal. Em algumas modalidades, isso corresponde de 2 a 15 vezes a quantidade de vetor AAV fornecida a um adulto quando expressa em vg/kg. Em certas modalidades, no entanto, uma “quantidade terapeuticamente eficaz” do vírus AAV recombinante varia entre aproximadamente 1E12 vg/kg de peso corporal e 1E14 vg/kg de peso corporal, de preferência entre aproximadamente 6E12 vg/kg de peso corporal e 6E13 vg/kg de peso corporal. Em uma modalidade preferida, uma quantidade terapeuticamente eficaz do vírus AAV recombinante é próxima de 2E13 vg/kg de peso corporal. Em outra modalidade preferida, uma quantidade terapeuticamente eficaz do vírus AAV recombinante é próxima de 6E13 vg/kg de peso corporal.

Os vetores vírus AAV recombinantes da presente invenção podem ser administrados a um indivíduo jovem, de preferência um mamífero jovem, mais preferivelmente um ser humano jovem, através de várias técnicas conhecidas de administração. Em uma modalidade preferida, o vírus AAV recombinante da terapia gênica é administrado por injeção intravenosa quer em um bolus único ou durante um período de tempo prolongado, o qual pode ser de pelo menos aproximadamente 1, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150, 180, 210, 240 minutos ou mais. Em modalidades preferidas, o vírus AAV recombinante administrado expressa Fator VIII, Fator IX ou PAH. Em uma modalidade especialmente preferida da presente invenção, o vírus AAV recombinante administrado é AAV5-FVIII- SQ.

A administração de um vetor/vírus AAV recombinante de FVIII, ou de uma formulação farmacêutica compreendendo o mesmo, da presente invenção, de preferência, resulta em um aumento na atividade de proteína FVIII funcional no plasma do indivíduo de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais UI/dL em comparação ao valor da atividade de proteína FVIII funcional presente no plasma do indivíduo antes da administração. Em certas modalidades, a administração de um vetor/vírus AAV recombinante de FVIII, ou de uma formulação farmacêutica compreendendo o mesmo, da presente invenção resulta na expressão de pelo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais UI/dL de atividade de proteína FVIII funcional no plasma do indivíduo. A esse respeito, o termo “UI” ou “unidade internacional” em relação à atividade de FVIII é um termo bem entendido e aceito, em que 1 UI de atividade de FVIII é equivalente à quantidade de FVIII em um mL de plasma humano normal. A atividade de FVIII no plasma pode ser determinada quantitativamente por vários ensaios bem conhecidos e aceitos, incluindo, por exemplo, o método do tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) (ver, p. ex., Miletich JP: Activated partial thromboplastin time. Em Williams Hematology, quinta edição, editado por E Beutler, M A Lichtman, B A Coller, T J Kipps. New York, McGraw-Hill, 1995, pág. L85-86, Greaves e Preston, Approach to the bleeding patient. Em Hemostasis and Thrombosis: Basic Principles and Clinical Practice, quarta edição, editado por R W Colman, J Hirsh, V J Marder, et al. Philadelphia, JB Lippincott Co, 2001, pág. 1197-1234 e Olson et al, (1998) Arch. Pathol. Lab. Med., vol. 122, pág. 782-798) ou ensaio cromogênico de FXa (Harris et al., (2011) Thromb. Res., vol. 128, pág. 125-129).

Em outras modalidades da presente invenção, o tempo de sangramento em um indivíduo pode ser medido por técnicas bem conhecidas e aceitas, incluindo, por exemplo, o método de Ivy (ver, p. ex., Ivy et al., (1935) Surg. Gynec. Obstet., vol. 60, página 781 (1935) e Ivy et al., (1941) J. Lab. Clin. Med., vol. 26, página 1812) ou o método de Duke (ver, p. ex., Duke et al., (1910) JAMA, vol. 55, página 1185). Um “episódio de sangramento” em um indivíduo refere-se a uma lesão que resulta em sangramento no indivíduo, quer externa ou internamente, e em geral compreende o período de tempo desde a lesão até a formação de um coágulo sanguíneo.

Em aspectos da invenção envolvendo um vetor AAV que expressa PAH para tratar FCN em indivíduos jovens, a eficácia do vetor AAV pode ser monitorada medindo os nível de fenilalanina no sangue do indivíduo jovem tratado. Ensaios quantitativos precisos para determinar os níveis circulantes de fenilalanina são bem conhecidos na técnica e incluem ensaios fluorimétricos (ver, McCaman, M.W. e Robins, E., (1962) J. Lab. Clin. Med., vol. 59, pág. 885-890); ensaios à base de cromotagrofia em camada fina (ver, Tsukerman, G. L. (1985) Laboratornoe delo, vol. 6, pág. 326-327); ensaios enzimáticos (ver, La Du, B. N., et al. (1963) Pediatrics, vol. 31, pág. 39-46; e Peterson, K., et al. (1988) Biochem. Med. Metab. Biol., vol. 39, pág. 98-104); métodos que empregam cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) (ver, Rudy, J. L., et al. (1987) Clin. Chem., vol. 33, pág. 1152- 1154); e automação de alto rendimento (ver, Hill, J. B., et al. (1985) Clin. Chem., vol. 5, pág. 541-546).

A administração de um vírus AAV da presente invenção pode, em alguns casos, resultar em um grau observável de hepatotoxicidade. A hepatotoxicidade pode ser medida por várias técnicas bem conhecidas e usadas rotineiramente, por exemplo, medindo as concentrações de certa(s) enzima(s) associada(s) ao fígado (p. ex., alanina transaminase, ALT) na corrente sanguínea de um indivíduo tanto antes da administração do AAV (ou seja, basais) como depois da administração do AAV. Um aumento observável na concentração de ALT depois da administração do AAV (em comparação a antes da administração) é indicativo hepatotoxicidade induzida por fármaco. Em certas modalidades da presente invenção, além da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do vírus AAV, o indivíduo pode ser tratado de modo profilático, terapêutico, ou ambos, com um corticosteroide para prevenir e/ou tratar qualquer hepatotoxicidade associada com administração do vírus AAV.

Tratamento “profilático” com um corticosteroide refere- se à administração de um corticosteroide para prevenir hepatotoxicidade e/ou prevenir um aumento em níveis medidos de ALT no indivíduo. Tratamento “terapêutico” com um corticosteroide refere-se à administração de um corticosteroide para reduzir a hepatotoxicidade causada pela administração de um vírus AVV e/ou reduzir uma concentração elevada de ALT na corrente sanguínea do indivíduo causada pela administração de um vírus AAV. Em certas modalidades, o tratamento profilático ou terapêutico com corticosteroide pode compreender a administração de pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ou mais mg/dia do corticosteroide ao indivíduo. Em certas modalidades, o tratamento profilático ou terapêutico com corticosteroide de um indivíduo pode ocorrer ao longo de um período contínuo de pelo menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 semanas ou mais. Os corticosteroides que encontram utilidade nos métodos aqui descritos incluem qualquer corticosteroide conhecido ou empregado rotineiramente, incluindo, por exemplo, dexametasona, prednisona, fludrocortisona, hidrocortisona e similares.

Detecção de anticorpos anti-AAV Para maximizar a probabilidade de transdução bem sucedida no fígado com a transferência sistêmica do gene terapêutico mediado por AAV, antes da administração de um vetor AAV em um esquema terapêutico a um paciente humano como descrito acima, o paciente prospectivo pode ser avaliado quanto à presença de anticorpos anti-capsídeo de AAV que são capazes de bloquear a transdução celular ou de outra forma reduzir a eficiência global do esquema terapêutico. Tais anticorpos podem estar presentes no soro do paciente prospectivo e podem ser direcionados contra o capsídeo de um AAV de qualquer sorotipo. Em uma modalidade, o sorotipo contra o qual anticorpos pré-existentes são direcionados é AAV5.

Métodos para detector imunidade pré-existente contra AAV são bem conhecidos e empregados rotineiramente na técnica e incluem ensaios celulares de inibição da transdução in vitro (TI), ensaios TI in vivo (p. ex., em camundongos) e detecção com base em ensaio ELISA de anticorpos totais anti-capsídeo (TAb) (ver, p. ex., Masat et al., Discov. Med., vol. 15, pág. 379-389 e Boutin et al., (2010) Hum. Gene Ther., vol. 21, pág. 704-712). Os ensaios TI podem empregar células hospedeiras nas quais um vetor AAV repórter induzível tenha sido previamente introduzido. O vetor repórter pode compreender um gene repórter induzível, como GFP etc. cuja expressão seja induzida quando da transdução da célula hospedeira por um vírus AAV. Anticorpos anti-capsídeo de AAV presentes no soro humano que são capazes de impedir/reduzir a transdução da célula hospedeira reduziriam, com isso, a expressão global do gene repórter no sistema. Portanto, tais ensaios podem ser empregados para detectar a presença de anticorpos anti-capsídeo de AAV no soro humano que são capazes de evitar e/ou reduzir a transdução de células pelo vírus terapêutico AAV de FVIII.

Ensaios de TAb para detectar anticorpos anti-capsídeo de AAV podem empregar o capsídeo de AAV ligado à fase sólida como um “agente de captura” no qual o soro humano é passado, permitindo, assim, que anticorpos anti-capsídeo presentes no soro se liguem ao “agente de captura” de capsídeo ligado à fase sólida. Uma vez lavado para remover ligações não específicas, um

“agente de detecção” pode ser empregado para detectar a presença de anticorpos anti-capsídeo ligados ao agente de captura. O agente de detecção pode ser um anticorpo, um capsídeo de AAV, ou similares, e pode ser marcado de modo detectável para ajudar na detecção e quantificação de anticorpo anti-capsídeo ligado. Em uma modalidade, o agente de detecção é marcado com rutênio ou um complexo de rutênio que possa ser detectado utilizando técnicas e equipamento de eletroquimioluminescência.

A mesma metodologia descrita acima pode ser empregada para avaliar e detectar a geração de uma resposta imune anti- capsídeo de AAV em um paciente tratado anteriormente com um vírus AAV terapêutico de interesse. Assim, não só essas técnicas podem ser empregadas para avaliar a presença de anticorpos anti- capsídeo de AAV antes do tratamento com um vírus AAV terapêutico, mas também podem ser empregadas para avaliar e medir a indução de uma resposta imune contra o vírus AAV terapêutico administrado depois da administração. Sendo assim, a presente invenção contempla métodos que combinam técnicas para detecção de anticorpos anti-capsídeo de AAV no soro humano e a administração de um vírus AAV terapêutico para o tratamento de hemofilia A, em que as técnicas para detecção de anticorpos anti-capsídeo de AAV no soro humano podem ser realizadas quer antes ou depois da administração do vírus AAV terapêutico.

Outros aspectos e vantagens da presente invenção serão entendidos depois de considerados os exemplos ilustrativos seguintes.

Exemplos Exemplo 1. Estudo comparativo de idades com AAV

Para examinar a capacidade de camundongos jovens para responder à terapia gênica mediada por AAV, duas doses de um AAV que expressa o Fator VIII humano (AAV5-FVIII-SQ) foram administradas a duas coortes de camundongos Rag2/FVIII jovens (2 dias de idade) com duplo knock-out (DKO). Todas as doses foram administradas por via intravenosa através da veia do rabo. Camundongos Rag2/FVIII DKO adultos (8 semanas de idade) foram usados como controles e foram tratados com 3,5E13 vg/kg, que no adulto corresponde a 8,9E11 vg por camundongo. A Coorte 1 dos camundongos jovens (2 dias de idade) foi tratada com a mesma dose por peso corporal que os adultos (ou seja, 3,5E13 vg/kg), enquanto a Coorte 2 dos camundongos jovens (2 dias de idade) foi tratada com o mesmo vg absoluto por camundongo que os adultos (ou seja, 8,9E11 vg por camundongo, que corresponde a 4,5E14 vg/kg em camundongos de 2 dias de idade). As Figuras 1A e 1B fornecem o desenho do estudo e os momentos de coleta de amostras. Os grupos de camundongos jovens foram estudos até a idade adulta (além de 8 semanas de idade) após a administração do AAV.

Para determinar a capacidade de hepatócitos jovens absorver AAV5-FVIII-SQ, as quantidades de DNA de FVIII e RNA de FVIII nos fígados de camundongos jovens e adultos foram medidas. Como mostrado na Figura 2, os camundongos jovens que receberam o mesmo vg total que os camundongos adultos (8,9 E11 vg por camundongo; 4,5E14 vg/kg de peso corporal dos camundongos jovens) apresentaram níveis semelhantes de DNA de FVIII que os camundongos adultos, demonstrando que não houve perda adicional de DNA devido à divisão de hepatócitos em camundongos jovens. Esse resultado foi surpreendente à vista da literatura sobre vetores AAV, a qual ensina que hepatócitos de jovens tratados com AAV perdem genomas virais em decorrência da divisão celular e do crescimento do animal. Além disso, como mostrado na Figura 2 (gráfico à direita), os níveis de RNA do Fator VIII aumentaram ao longo do tempo em camundongos adultos que receberam AAV5- FVIII-SQ. Surpreendentemente, camundongos jovens que receberam a mesma dose absoluta que os camundongos adultos demonstraram um aumento semelhante no RNA do Fator VIII ao longo do tempo. Esses dados demonstram que hepatócitos jovens dispõem da mesma capacidade para absorver genomas de AAV e expressam transgenes entregues pelo AAV do mesmo modo que hepatócitos adultos e que hepatócitos jovens, ao contrário do ensinado pela técnica, não perdem genomas virais durante o crescimento de tecido e a divisão celular.

O efeito do tratamento com AAV sobre a saúde global dos camundongos jovens foi avaliado pelo peso corporal e pelo peso do fígado medidos ao longo do tempo depois da administração do AAV. Como mostrado na Figura 3, o peso do fígado e o peso corporal camundongos jovens tratados com o AAV aumentaram ao longo do tempo e atingiram os níveis de adultos normais em 8 semanas após a administração. Além disso, para avaliar se o tratamento com AAV direcionado à expressão de transgene resultou em lesão hepática, mediram-se os níveis sanguíneos de alanina aminotransferase (ALT). Como mostrado na Figura 4, os níveis de ALT não aumentaram em resposta ao tratamento com AAV5-FVIII-SQ apesar de os camundongos jovens terem recebido a mesma quantidade absoluta de genoma do vetor que os adultos, ou seja, níveis maiores de vg por peso corporal do que os animais adulto de controle. Considerados em conjunto, esses dados demonstram que o tratamento com AAV não teve um efeito negativo sobre a saúde global ou o desenvolvimento de camundongos jovens e não causou lesão hepática apesar dos níveis relativamente altos de genomas virais administrados.

A eficácia terapêutica dos transgenes entregues por AAV em camundongos jovens foi avaliada medindo a concentração plasmática do Fator VIII e estimando a proteína Fator VIII total circulante. Como mostrado na Figura 5, jovens tratados com a mesma dose com base no peso corporal que adultos (3,5E13 vg/kg) não produziu níveis terapêuticos de Fator VIII quando eles atingiram a idade adulta. Esse resultado é compatível com estudos anteriores, demonstrando que hepatócitos jovens param de produzir níveis detectáveis de transgene administrados com AAV diversas semanas depois da administração do AAV. Surpreendentemente, camundongos jovens, que receberam a dose de adultos com o número absoluto de genomas (8,9E11 vg), inicialmente expressam níveis altos de Fator VIII no plasma. Esses níveis diminuíram entre 1 a 3 semanas devido à expansão do volume sanguíneo. No entanto, a quantidade total de Fator VIII circulante permaneceu estável desde a semana 1 até o final do estudo na semana 16. Esse nível mantido de proteína Fator VIII em camundongos jovens, embora cinco a seis vezes menor do que os níveis vistos em camundongos adultos tratados, permaneceu dentro da janela terapeuticamente eficaz. Assim, esses dados demonstram que AAV são eficazes na entrega de uma dose terapêutica de um transgene quando os AAV são administrados a uma dose de adultos com quantidade absoluta de genomas virais por indivíduo. Além disso, esses dados demonstram que a expressão do transgene estabiliza e permanece constante por longas durações.

Exemplo 2

Entrega e expressão de PAH nos fígados de indivíduos jovens com FCN Em mamíferos, a enzima do fígado fenilalanina hidroxilase (PAH) converte o excesso de fenilalanina (Phe) no corpo em tirosina (Tyr). Em humanos, mutações no gene que codifica PAH podem resultar em produção ou atividade diminuída ou ausente da enzima, levando a um acúmulo de Phe e diminuição dos níveis de Tyr no corpo, com consequências fenotípicas, incluindo falha de crescimento, coloração clara da pele e cabelo, déficits cognitivos, alteração do sono e crises convulsivas. Em humanos, esse estado de doença é chamado fenilcetonúria (FCN). O modelo de camundongo ENU2 de FCN (Sheldovsky 1993) foi criado por mutagênese química, usando N-etil-N–nitrosoureia (ENU), no exon 7 do gene que codifica PAH. Phe263 é substituído por Ser263, resultando em uma redução leve dos níveis proteicos de PAH, mas nenhuma atividade catalítica detectável de PAH. Isso é análogo a uma mutação encontrada em um grande subgrupo de pacientes humanos com FCN, onde Phe263 sofreu mutação para Leu263. Os camundongos ENU2 têm fenótipos que recapitulam diversos daqueles vistos em pacientes com FCN, incluindo níveis elevados no plasma e tecidos de Phe, níveis baixos de Tyr, tamanho/peso corporal pequeno, uma cor da penugem marrom claro (enquanto os correspondentes do tipo selvagem são pretos) e crises convulsivas.

Camundongos ENU2 machos foram incluídos em grupos etários individuais (n=10/grupo) como listados abaixo e injetados, por via intravenosa, com o AAV5-PAH a 2e14 vg/kg na idade aproximada: Grupo Um, AAV administrado com 2 dias de idade; Grupo Dois, AAV administrado com 1 semana de idade; Grupo Três, AAV administrado com 2 semanas de idade; Grupo Quatro, AAV administrado com 3 semanas de idade; Grupo Cinco, AAV administrado com 5 semanas de idade; e Grupo Seis, AAV administrado com 8 semanas de idade (ver a Figura 7 para o desenho global do estudo).

Os pesos corporais foram medidos antes do início do estudo e em quatro e oito semanas após a dose. Amostras de sangue foram coletadas 4 e 8 semanas após a dose, processadas para plasma e analisadas quanto a Phe por cromatografia líquida/espectrometria de massa. As proteínas plasmáticas foram precipitadas com acetonitrila contendo um isótopo estável de padrões internos(13C9,15N (PheIS)). O sobrenadante foi derivado por reação com cloreto de benzoíla e diluído antes da injeção para LC-MS/MS.

Os pesos corporais dos animais em cada grupo etário foram semelhantes aos de antes das doses (Figura 8A). Quatro semanas após a dose (Figura 8B), os animais tratados com AAV5-PAH com 3 ou 8 semanas de idade, mas não aqueles tratados com 2 dias ou com 1, 2 ou 5 semanas de idade, ganharam significativamente mais peso do que seus correspondentes tratados com veículos. Em 8 semanas após a administração (Figura 8C), os camundongos tratados com 5 semanas de idade também obtiveram significativamente mais ganho do peso do que os controles.

Nos momentos de 4 (Figura 9A) e 8 semanas (Figura 9B), os níveis de Phe foram reduzidos para o intervalo do tipo selvagem (WT) em camundongos tratados com 5 ou 8 semanas de idade. Os camundongos tratados com 3 semanas de idade apresentaram níveis mais variáveis de Phe, sugerindo uma resposta parcial. Os camundongos tratados com 2 dias, 1 semana ou 2 semanas de idade não apresentaram redução apreciável no nível plasmático de Phe.

O efeito máximo do tratamento com AAV5PAH, 2E14 vg/kg, sobre os fenótipos de ENU2 de baixo peso corporal e nível plasmático elevado de Phe foi alcançado quando os camundongos tinham pelo menos 5 semanas de idade na ocasião do tratamento. Um efeito significativo sobre o peso corporal, mas somente um efeito parcial sobre a redução de Phe, foi conseguido quando os camundongos foram tratados com 3 semanas de idade.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para melhorar os sintomas de um transtorno genético em um indivíduo jovem que sofre do transtorno genético CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo jovem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vírus AAV terapêutico que codifica uma proteína terapêutica, em que a expressão da proteína terapêutica melhora os sintomas do transtorno genético.

2. Uso de um vírus AAV terapêutico CARACTERIZADO pelo fato de ser na preparação de um medicamento para melhorar os sintomas de um transtorno genético em um indivíduo jovem que sofre do transtorno genético, em que o medicamento compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vírus AAV terapêutico que codifica uma proteína terapêutica, em que a expressão da proteína terapêutica melhora os sintomas do transtorno genético.

3. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vírus AAV terapêutico que codifica uma proteína terapêutica para uso na melhoria dos sintomas de um transtorno genético em um indivíduo jovem que sofre do transtorno genético.

4. Método, uso ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína terapêutica é uma cópia funcional de um proteína endógena não funcional.

5. Método, uso ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína terapêutica é uma versão modificada da proteína endógena.

6. Método, uso ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína terapêutica é uma proteína heteróloga que compensa uma proteína endógena não funcional.

7. Método, uso ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo jovem é um ser humano jovem.

8. Método, uso ou composição, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o ser humano jovem tem menos de 18 anos de idade.

9. Método, uso ou composição, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o ser humano jovem tem menos de 12 anos de idade.

10. Método, uso ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína terapêutica é expressa pelos hepatócitos do indivíduo jovem após a administração do vírus AAV terapêutico.

11. Método de acordo, com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o vírus AAV terapêutico é administrado por via intravenosa.

12. Uso ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o medicamento é formulado para administração intravenosa.

13. Método, uso ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o transtorno genético é uma hemofilia.

14. Método, uso ou composição, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a hemofilia é hemofilia A e a proteína terapêutica é Fator VIII.

15. Método, uso ou composição, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o Fator VIII é Fator VIII-SQ.

16. Método, uso ou composição, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o vírus AAV terapêutico é AAV5- FVIII-SQ.

17. Método, uso ou composição, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a hemofilia é hemofilia B e a proteína terapêutica é Fator IX.

18. Método, uso ou composição, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o Fator IX é Fator IX R338L.

19. Método, uso ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o transtorno genético é fenilcetonúria (FCN) e a proteína terapêutica é fenilalanina hidroxilase (PAH).

20. Método, uso ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade de vírus AAV terapêutico administrada ao indivíduo jovem corresponde ao mesmo número absoluto de vírus AAV terapêutico que é eficaz em indivíduos adultos.

21. Método, uso ou composição, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que são administrados de cerca de 1E12 vg/kg a cerca de 1E15 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem.

22. Método, uso ou composição, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que são administrados de cerca de 6E13 vg/kg a cerca de 6E14 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem.

23. Método, uso ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o vírus AAV é formulado como uma composição farmacêutica compreendendo fosfato de sódio, dibásico a uma concentração de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 3 mg/mL, fosfato de sódio monobásico monoidratado a uma concentração de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 3 mg/mL, cloreto de sódio a uma concentração de cerca de 1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL, manitol a uma concentração de cerca de 5 mg/mL a cerca de 40 mg/mL e poloxâmero 188 a uma concentração de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 4 mg/mL.

24. Método, uso ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo jovem é tratado profilaticamente com um corticosteroide a uma concentração variando de 5 mg/dia a 60 mg/dia.

25. Método, uso ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo jovem é tratado terapeuticamente com um corticosteroide a uma concentração de 5 mg/dia a 60 mg/dia.

26. Método, uso ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 25, CARACTERIZADO pelo fato de que resulta na expressão de ao menos cerca de 5 UI/dL de proteína Fator VIII funcional no indivíduo jovem.

27. Método, uso ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 25, CARACTERIZADO pelo fato de que resulta em um aumento na proteína Fator VIII funcional de ao menos cerca de 1 UI/dL de proteína no indivíduo jovem.

28. Método para redução do tempo de sangramento de um episódio de sangramento em um indivíduo jovem que sofre de hemofilia CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo jovem, antes do episódio de sangramento, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vírus AAV terapêutico.

29. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vírus AAV terapêutico CARACTERIZADO pelo fato de ser na preparação de um medicamento para reduzir o tempo de sangramento de um episódio de sangramento em um indivíduo jovem que sofre de hemofilia, em que o medicamento é administrado ao indivíduo jovem antes do episódio de sangramento.

30. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vírus AAV terapêutico útil para reduzir o tempo de sangramento de um episódio de sangramento em um indivíduo jovem que sofre de hemofilia, em que a composição é administrada ao indivíduo jovem antes do episódio de sangramento.

31. Método, composição ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 30, CARACTERIZADO pelo fato de que a administração ocorre pelo menos três semanas antes do episódio de sangramento.

32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 31, CARACTERIZADO pelo fato de que o vírus AAV terapêutico é administrado por via intravenosa.

33. Uso ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 31, CARACTERIZADO pelo fato de que o AAV terapêutico é formulado para administração intravenosa

34. Método, uso ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 33, CARACTERIZADO pelo fato de que a hemofilia é hemofilia A e o vírus AAV terapêutico expressa o Fator VIII.

35. Método, uso ou composição, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato de que o Fator VIII é Fator VIII-SQ.

36. Método, uso ou composição, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato de que o vírus AAV terapêutico é AAV5- FVIII-SQ.

37. Método, uso ou composição, de acordo com as reivindicações 28 a 33, CARACTERIZADO pelo fato de que a hemofilia é hemofilia B e o vírus AAV terapêutico expressa o Fator IX.

38. Método, uso ou composição, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADO pelo fato de que o Fator IX é o Fator IX R338L.

39. Método, uso ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 38, CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade de vírus AAV terapêutico administrada ao indivíduo jovem corresponde ao mesmo número absoluto de vírus AAV terapêutico que é eficaz em indivíduos adultos.

40. Método, uso ou composição, de acordo com a reivindicação 39, CARACTERIZADO pelo fato de que são administrados de cerca de 1E12 vg/kg a cerca de 1E15 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem.

41. Método, uso ou composição, de acordo com a reivindicação 39, CARACTERIZADO pelo fato de que são administrados de cerca de 6E13 vg/kg a cerca de 6E14 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem.

42. Método, uso ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 41, CARACTERIZADO pelo fato de que vírus AAV terapêutico é formulado em uma solução compreendendo fosfato de sódio, dibásico a uma concentração de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 3 mg/mL, fosfato de sódio monobásico monoidratado a uma concentração de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 3 mg/mL, cloreto de sódio a uma concentração de cerca de 1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL, manitol a uma concentração de cerca de 5 mg/mL a cerca de 40 mg/mL e poloxâmero 188 a uma concentração de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 4 mg/mL.

43. Método para aumentar a expressão proteica de Fator VIII em um indivíduo jovem com necessidade do mesmo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo jovem um vírus terapêutico, em que o vírus AAV terapêutico é AAV5-FVIII-SQ

44. Uso de um vírus AAV terapêutico, CARACTERIZADO pelo fato de ser na preparação de um medicamento para aumentar a expressão proteica do Fator VIII em um indivíduo jovem com necessidade do mesmo, em que o vírus AAV é AAV5-FVIII-SQ.

45. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um vírus AAV terapêutico para aumentar a expressão proteica de Fator VIII em um indivíduo jovem com necessidade do mesmo, em que o vírus AAV é AAV5-FVIII-SQ.

46. Método, de acordo com a reivindicação 43, CARACTERIZADO pelo fato de que o vírus AAV terapêutico é administrado por via intravenosa.

47. Uso ou composição, de acordo com a reivindicação 44 ou 45, CARACTERIZADO pelo fato de que o vírus AAV é formulado for administração intravenosa.

48. Método, uso ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 47, CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade de vírus AAV terapêutico administrada ao indivíduo jovem corresponde ao mesmo número absoluto de vírus AAV terapêutico que é eficaz em indivíduos adultos.

49. Método, uso ou composição, de acordo com a reivindicação 48, CARACTERIZADO pelo fato de que são administrados de cerca de 1E12 vg/kg a cerca de 1E15 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem.

50. Método, uso ou composição, de acordo com a reivindicação 48, CARACTERIZADO pelo fato de que são administrados de cerca de 6E13 vg/kg a cerca de 6E14 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem.

51. Método, uso ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 50, CARACTERIZADO pelo fato de que resulta na expressão de ao menos cerca de 5 UI/dL da proteína Fator VIII funcional no indivíduo jovem.

52. Método, uso ou composição, de acordo com a reivindicação 51, CARACTERIZADO pelo fato de que resulta na expressão de ao menos cerca de 1 UI/dL da proteína Fator VIII funcional no indivíduo jovem.

53. Método, uso ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 52, CARACTERIZADO pelo fato de que resulta em um aumento na atividade de FVIII funcional de ao menos cerca de 1 UI/dL no indivíduo jovem.

54. Método, uso ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 50, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo jovem é tratado com um corticosteroide a uma concentração variando de 5 mg/dia a 60 mg/dia.

55. Método, uso ou composição, de acordo com a reivindicação 54, CARACTERIZADO pelo fato de que o tratamento com o corticosteroide é realizado profilaticamente.

56. Método, uso ou composição, de acordo com a reivindicação 54, CARACTERIZADO pelo fato de que o tratamento com o corticosteroide é realizado terapeuticamente.

57. Método, uso ou composição, de acordo com as reivindicações 54 a 56, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo jovem é tratado com um corticosteroide a uma concentração variando de 5 mg/dia a 60 mg/dia ao longo de um período contínuo de pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 semanas ou maior.

58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 54 a 57, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma etapa de determinação da ausência ou presença de anticorpos anti-capsídeo de AAV no soro do indivíduo jovem após a administração da quantidade terapeuticamente eficaz do AAV5-FVIII-SQ.

59. Método, de acordo com a reivindicação 58, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda a etapa de administração de uma quantidade eficaz de um corticosteroide ao indivíduo após uma determinação da presença de anticorpos anti-capsídeo de AAV no soro do indivíduo jovem ser feita.

60. Método para aumentar a expressão proteica de fenilalanina hidroxilase (PAH) em um indivíduo jovem com necessidade do mesmo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo jovem um vírus terapêutico, em que o vírus AAV terapêutico compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma PAH funcionalmente ativa.

61. Uso de um vírus AAV terapêutico CARACTERIZADO por ser na preparação de um medicamento para aumentar a expressão proteica de fenilalanina hidroxilase (PAH) em um indivíduo jovem com necessidade do mesmo, em que o vírus AAV compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma PAH funcionalmente ativa.

62. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um vírus AAV terapêutico para aumentar a expressão proteica de fenilalanina hidroxilase (PAH) em um indivíduo jovem com necessidade do mesmo, em que o vírus AAV compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma PAH funcionalmente ativa.

63. Método, de acordo com a reivindicação 60, CARACTERIZADO pelo fato de que o vírus AAV terapêutico é administrado por via intravenosa.

64. Uso ou composição, de acordo com a reivindicação 61 ou 62, CARACTERIZADO pelo fato de que o vírus AAV é formulado por administração intravenosa.

65. Método, uso ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 60 a 64, CARACTERIZADO pelo fato de que são administrados de cerca de 1E12 vg/kg a cerca de 2E16 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem.

65. Método, uso ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 60 a 64, CARACTERIZADO pelo fato de que são administrados de cerca de 2E12 vg/kg a cerca de 2E14 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem.

66. Método, uso ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 60 a 64, CARACTERIZADO pelo fato de que são administrados de cerca de 6E12 vg/kg a cerca de 2E14 vg/kg do vírus AAV terapêutico ao indivíduo jovem.

67. Método, uso ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 60 a 66, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo jovem tem 3 semanas a 5 semanas de idade.

68. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 60 a 67, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma etapa de determinação da ausência ou presença de anticorpos anti-capsídeo de AAV no soro do indivíduo jovem após a administração da quantidade terapeuticamente eficaz do vírus AAV compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma PAH funcionalmente ativa.