BR112016005576B1 - Vetor de fator viii de vírus adeno-associado, partícula de vírus adeno-associado recombinante, partícula viral, uso do referido vetor ou da referida partícula viral para o tratamento de hemofilia a e método para produzir uma partícula de vírus adeno-associado - Google Patents

Abstract

VETORES DE FATOR VIII DE VÍRUS ADENO-ASSOCIADO. A invenção fornece vetores de Fator VIII (FVIII) de vírus adeno-associado (AAV) melhorados, incluindo vetores FVIII de AAV que produzem um polipeptídeo do Fator VIII funcional e vetores FVIII de AAV com alta atividade de expressão.

Description

[001]Este pedido reivindica o benefício da prioridade do Pedido de Patente Provisório US N.° de Série 61/877.042, depositado em 12 de setembro de 2013, que é aqui incorporado como referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002]A invenção refere-se aos vetores de Fator VIII (FVIII) de vírus adeno- associado (AAV), incluindo vetores FVIII de AAV com atividade de expressão alta e vetores FVIII de AAV que expressam FVIII funcional inteiro ou truncado. A invenção também se refere aos métodos para preparar os vetores FVIII de AAV aqui descritos e usos terapêuticos associados aos mesmos.

FUNDAMENTO

[003]O vírus adeno-associado (AAV) é um vírus de animal pequeno, com de-feito de replicação, não envelopado que infecta os seres humanos e algumas outras espécies de primatas. Várias características de AAV tornam este vírus um veículo atraente para liberação de proteínas terapêuticas por terapia gênica, incluindo, por exemplo, que AAV não é conhecido por causar doença humana e induz uma resposta imune suave, e que vetores de AAV podem infectar células dividindo e quiescentes sem integrar no genoma celular do hospedeiro. Vetores de terapia gênica usando AAV são utilizados com sucesso em alguns ensaios clínicos, por exemplo, para a liberação de Fator IX (FIX) humano para o fígado para o tratamento da Hemofilia B (Nathwani et al., New Engl. J. Med. 365:2357-2365, 2011).

[004]Vetores de terapia genética AAV têm alguns inconvenientes, no entanto. Em particular, a capacidade de clonagem de vetores de AAV é limitada como conse-quência da capacidade de empacotamento do DNA do vírus. O genoma de DNA de fita simples do AAV de tipo selvagem possui cerca de 4,7 kilobases (kb). Na prática, os genomas de AAV de até cerca de 5,0 kb parecem estar completamente empacota-dos, ou seja, são inteiros, em partículas de vírus de AAV. Com a exigência de que o genoma de ácido nucleico em vetores de AAV deve ter duas repetições terminais in-vertidas (ITRs) de AAV de cerca de 145 bases, a capacidade de empacotamento do DNA de um vetor de vírus adeno-associado é tal que um máximo de cerca de 4,4 kb da sequência de codificação de proteínas pode ser encapsulado.

[005]Devido a essa restrição de tamanho, grandes genes terapêuticos, ou seja, aqueles maiores que cerca de 4,4 kb de comprimento, geralmente não são ade-quados para uso em vetores de AAV. Um tal gene terapêutico é o gene do Fator VIII (FVIII), que tem um mRNA de cerca de 7,0 kb que codifica um polipeptídeo de 2332 aminoácidos compreendendo, de N- a C-terminal, um peptídeo sinal de 19 aminoáci- dos, e três grandes domínios (ou seja, a cadeia pesada ou domínio A, o central ou domínio B, e a cadeia leve ou domínio C). Uma estratégia que foi empregada para superar a limitação de tamanho do vetor de AAV para FVIII era usar dois vetores de AAV, um codificando a cadeia pesada ou domínio A, e a outra codifica a cadeia leve ou domínio C (ver, por exemplo, Coutu et al., Pat. US Nos. 6.221.349, 6.200.560 e 7.351.577). Outra estratégia para contornar essa restrição de tamanho foi gerar veto-res de AAV codificando FVIII em que a porção central ou domínio B da proteína foi deletado e substituído com um ligante de 14 aminoácidos, conhecido como sequência SQ (Ward et al., Blood, 117:798-807, 2011, e McIntosh et al., Blood 121:3335-3344, 2013).

[006]Embora os vetores de AAV tenham sido relatados na literatura tendo ge- nomas de AAV de > 5,0 kb, em muitos destes casos, as extremidades 5’ ou 3’ dos genes codificados parecem ser truncadas (ver Hirsch et al., Molec. Ther. 18-6-8, 2010, e Ghosh et al., Biotech. Genet. Engin. Rev. 24:165-178, 2007). Demonstrou-se, no entanto, que a sobreposição de recombinação homóloga ocorre nas células infectadas com AAV entre ácidos nucleicos tendo truncamentos na extremidade 5’ e truncamentos na extremidade 3’ para que um ácido nucleico “completo” codificando a proteína grande seja gerado, reconstruindo, assim, um gene funcional, inteiro.

[007]Há uma necessidade de novos vetores de AAV que codificam uma pro-teína de Fator VIII funcional útil em abordagens de terapia gênica para o tratamento da hemofilia A. Como tal, a presente invenção refere-se aos vetores de AAV que co-dificam FVIII funcionalmente ativo de forma que os virions de AAV encapsulam o ácido nucleico inteiro que codifica a proteína terapêutica, ou seja, vetores FVIII de AAV completamente embalados, evitando assim os problemas acima mencionados de geno- mas de grandes dimensões, ou pelo menos, produz uma proteína de Fator VIII funcionalmente ativa, que pode ou não ser truncada. Além disso, para evitar a resposta imune direcionada ao capsídeo, vetores de AAV devem ter a maior atividade de trans- dução/expressão possível da proteína alvo por partículas de capsídeo. Esta invenção também se refere à produção de vetores FVIII de AAV completamente com atividade de expressão alta. Finalmente, a presente invenção refere-se aos métodos para produzir os vetores de AAV de Fator VIII descritos aqui e métodos associados para usar os mesmos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008]A presente invenção fornece vetores de AAV que codificam FVIII funcio-nalmente ativo (referido aqui como “vetores FVIII de AAV”). Os genomas que codifi-cam FVIII funcionalmente ativo possuem preferencialmente no máximo 7,0 kb de comprimento, mais preferencialmente no máximo 6,5 kb de comprimento, ainda mais preferencialmente no máximo 6,0 kb de comprimento, ainda mais preferencialmente no máximo 5,5 kb de comprimento, ainda mais preferencialmente no máximo 5,0 kb de comprimento, com função de promotor potencializada.

[009]Como usado aqui, um “FVIII funcionalmente ativo” é uma proteína FVIII que tem a funcionalidade de uma proteína FVIII de tipo selvagem in vitro, quando expressa em células cultivadas, ou in vivo quando expressa em células ou tecidos do corpo. Isso inclui, por exemplo, permitir que a coagulação de sangue ocorra e diminuir o tempo que leva para o sangue coagular em um sujeito que está sofrendo de Hemofilia A. FVIII de tipo selvagem participa na coagulação do sangue através da cascata de coagulação, atuando como um cofator para FIX ativado (FIXa) que, na presença de íons de cálcio e fosfolipídios, forma um complexo que converte o Fator X (FX) em FX ativado (FXa). Nesse sentido, um FVIII funcionalmente ativo pode formar um complexo com FIXa, que pode converter FX para FXa.

[0010]Como usado aqui, um “vetor de AAV” refere-se aos ácidos nucleicos, de fita simples ou fita dupla, tendo uma sequência de repetição terminal invertida (ITR) 5’ de AAV e uma ITR 3’ de AAV flanqueando uma sequência de codificação de proteína operacionalmente ligada a elementos reguladores de transcrição, ou seja, um ou mais promotores e/ou potencializadores, e uma sequência de poliadenilação, e, opcionalmente, um ou mais íntrons inseridos entre éxons da sequência de codificação de proteína. Um vetor de AAV de fita simples se refere aos ácidos nucleicos que estão presentes no genoma de uma partícula de vírus AAV, e pode ser fita senso ou o fita antissenso das sequências de ácido nucleico divulgadas aqui. O tamanho desses ácidos nucleicos de fita simples é fornecido em bases. Um vetor de AAV de fita simples se refere aos ácidos nucleicos que estão presentes no DNA de plasmídeos, por exemplo, pUC19, ou genoma de um vírus de fita dupla, por exemplo, baculovírus, usado para expressar ou transferir os ácidos nucleicos do vetor de AAV. O tamanho desses ácidos nucleicos de fita dupla é fornecido em pares de bases (bp).

[0011]O termo “repetição terminal invertida (ITR)” como usado aqui se refere às regiões reconhecidas na técnica encontradas em 5’ e 3’ terminal do genoma de AAV que funciona em cis como origens de replicação do DNA e como sinais de em-pacotamento para o genoma viral. ITRs de AAV, juntamente com a região da codifi-cação rep de AAV, fornecem excisão eficiente e resgate de, e integração de uma se-quência de nucleotídeos interposta entre dois ITRs flanqueando em um genoma de célula do hospedeiro. Sequências de certos ITRs associados à AAV são divulgadas por Yan et al., J. Virol. 79(1):364-379 (2005), que é aqui incorporado como referência em sua totalidade.

[0012]Um “elemento de transcrição reguladora” refere-se a sequências de nu- cleotídeos de um gene envolvido na regulação da transcrição genética, incluindo um promotor, além de elementos de resposta, sequências de ativador e potencializador para ligação de fatores de transcrição para auxiliar a ligação da RNA polimerase e promover a expressão, e sequências de operador ou silenciador para os quais as proteínas repressoras se ligam para bloquear a ligação da RNA polimerase e impede a expressão. O termo “elemento regulatório de transcrição específico de fígado” refere- se a um elemento regulador que modula a expressão do gene especificamente no tecido hepático. Exemplos de elementos regulatórios específicos de fígados incluem, entre outros, o promotor de tiretina de camundongo (mTTR), o promotor de fator VIII humano endógeno (F8), promotor de alfa-1-antitripsina humana (hAAT) e fragmentos ativos dos mesmos, promotor mínimo de albumina humana, e promotor de albumina de camundongo. Potencializadores derivados de sítios de ligação de fator de transcrição específicos de fígado são também contemplados, como EBP, DBP, HNF1, HNF3, HNF4, HNF6, com Enh1. .

[0013]Em uma modalidade, o vetor de AAV da invenção compreende um ácido nucleico que codifica FVIII funcionalmente ativo tendo o domínio B substituído pela sequência SQ de 14 aminoácidos, ou seja, que codifica SQ de FVIII. A sequência SQ é divulgada em Ward et al., Blood, 117:798-807, 2011, e McIntosh et al., Blood 121:3335-3344, 2013. A sequência da região que codifica FVIII é uma sequência de códon otimizado (ver Nathwani et al., Pub. Ped. Pat. US N.° 2013/0024960A1, publi-cada em Janeiro 24, 2013, que está incorporada aqui como referência em sua totali-dade, e McIntosh et al., Blood 121:3335-3344, 2013). Essa sequência é referida aqui como “UCL SQ FVIII.”

[0014]Em um primeiro aspecto, o vetor de AAV da invenção compreende Proto 1, que é mostrado esquematicamente na Figura 2A, e compreende a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 1.

[0015]Em um segundo aspecto, o vetor de AAV da invenção compreende Proto 1S, que é mostrado esquematicamente na Figura 2B, e compreende a sequên-cia de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 2.

[0016]Em um terceiro aspecto, o vetor de AAV da invenção compreende Proto 2S, que é mostrado esquematicamente na Figura 2C, e compreende a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 3.

[0017]Em um quarto aspecto, o vetor de AAV da invenção compreende Proto 3S, que é mostrado esquematicamente na Figura 2D, e compreende a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 4.

[0018]Em outra modalidade, o vetor de AAV da invenção compreende um ácido nucleico que codifica FVIII desprovido do domínio B inteiro, incluindo a sequência SQ, e o domínio a3, que está localizado apenas N-terminal para a cadeia leve ou domínio C. A sequência da região que codifica FVIII é uma sequência de códon otimizado (ver Nathwani et al., Pub. Ped. Pat. US N.° 2013/0024960A1, publicada em Janeiro 24, 2013, que está incorporada aqui como referência em sua totalidade, e McIntosh et al., Blood 121:3335-3344, 2013).

[0019]Em um primeiro aspecto, o vetor de AAV da invenção compreende Proto 4, que é mostrado esquematicamente na Figura 3A, e compreende a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 5.

[0020]Em um segundo aspecto, o vetor de AAV da invenção compreende Proto 5, que é mostrado esquematicamente na Figura 3B, e compreende a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 6.

[0021]Em um terceiro aspecto, o vetor de AAV da invenção compreende Proto 6, que é mostrado esquematicamente na Figura 3C, e compreende a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 7.

[0022]Em um quarto aspecto, o vetor de AAV da invenção compreende Proto 7, que é mostrado esquematicamente na Figura 3D, e compreende a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 8.

[0023]Em outra modalidade, o vetor de AAV da invenção compreende um ácido nucleico compreendendo uma repetição terminal invertida (ITR) 5’ de AAV2, uma região regulatória de transcrição específica do fígado, uma região de codificação de FVIII funcionalmente ativo de códon otimizado, opcionalmente um ou mais íntrons, uma sequência de poliadenilação, e um AAV2 3’ ITR. Em uma modalidade preferencial, a região regulatória de transcrição específica de fígado compreende uma sequência de potencializador ApoE encurtada, um promotor proximal de alfa anti-tripsina humana (hAAT) de 186 bases, incluindo 42 bases da região não traduzida 5’ (UTR), e um ou mais potencializadores selecionados do grupo que consiste em (i) um potenci- alizador ApoE/C1 humano de 34 bases, (ii) uma região X distal de promotor AAT humano de 32 bases e (iii) 80 bases adicionais de elemento distal do promotor proximal AAT humano; e regiões de codificação de FVIII funcionalmente ativo de códon otimizado codificam a variante SQ de FVIII. Em outra modalidade preferencial, a região regulatória de transcrição específica de fígado compreende uma sequência potencia- lizadora de a1 micro-globulina e o promotor proximal de alfa anti-tripsina humana (AAT) de 186 bases.

[0024]Em um primeiro aspecto, o vetor de AAV da invenção compreende o Constructo 100ATG compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 9.

[0025]Em um segundo aspecto, o vetor de AAV da invenção compreende o Constructo 100ATG bGH poli A compreendendo a sequência de ácido nucleico esta-belecida em SEQ ID NO: 10.

[0026]Em um terceiro aspecto, o vetor de vírus AAV da invenção compreende a sequência do Constructo 100ATG curto bGH poliA estabelecida em SEQ ID NO: 11.

[0027]Em um quarto aspecto, o vetor de AAV da invenção compreende o Constructo 103ATG compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 12.

[0028]Em um quinto aspecto, o vetor de AAV da invenção compreende o Constructo 103ATG curto bGH poli A compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 13.

[0029]Em um sexto aspecto, o vetor de AAV da invenção compreende o Cons- tructo 105ATG bGH poli A compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 14.

[0030]Em um sétimo aspecto, o vetor de AAV da invenção compreende o Constructo DC172ATG FVIII compreendendo a sequência de ácido nucleico estabe-lecida em SEQ ID NO: 15.

[0031]Em um oitavo aspecto, o vetor de AAV da invenção compreende o Constructo DC172ATG FVIII hAAT compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 16.

[0032]Em um nono aspecto, o vetor de AAV da invenção compreende o Cons- tructo DC172 2xHCR ATG FVIII compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 17.

[0033]Em um décimo aspecto, o vetor de AAV da invenção compreende o Constructo DC172 2xHCR ATG FVIII hAAT compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 18.

[0034]Em um décimo primeiro aspecto, o vetor de AAV da invenção compre-ende o Constructo 2x SerpinA hAAT ATG FVIII compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 19.

[0035]Em um décimo segundo aspecto, o vetor de AAV da invenção compre-ende o Constructo 2x SerpinA hAAT ATG FVIII 2x μ-globulina potencializador com-preendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 20.

[0036]Em um décimo terceiro aspecto, o vetor de AAV da invenção compre-ende o Constructo 100ATG curto poliA 2x μ-globulina potencializador compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 21.

[0037]Em um décimo quarto aspecto, o vetor de AAV da invenção compre-ende o Constructo Fator VIII-BMN001 compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 22.

[0038]Em um décimo quinto aspecto, o vetor de vírus AAV da invenção com-preende a sequência do Constructo Fator VIII-BMN002 estabelecida em SEQ ID NO: 23.

[0039]Em um décimo sexto aspecto, o vetor de AAV da invenção compreende o Constructo 99 compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 24.

[0040]Em um décimo sétimo aspecto, o vetor de AAV da invenção compre-ende o Constructo 100 compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 25.

[0041]Em um décimo oitavo aspecto, o vetor de AAV da invenção compreende o Constructo 100 orientação inversa compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 26.

[0042]Em um décimo nono aspecto, o vetor de AAV da invenção compreende o Constructo 100AT compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 27.

[0043]Em um vigésimo aspecto, o vetor de AAV da invenção compreende o Constructo 100AT 2x MG compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 28.

[0044]Em um vigésimo primeiro aspecto, o vetor de AAV da invenção compre-ende o Constructo 100AT 2x MG bGH poli A compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 29.

[0045]Em um vigésimo segundo aspecto, o vetor de AAV da invenção com-preende o Constructo 100AT 2x MG (inverso) bGH poli A compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 30.

[0046]Em um vigésimo terceiro aspecto, o vetor de AAV da invenção compre-ende o Constructo 100 bGH poliA compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 31.

[0047]Em um vigésimo quarto aspecto, o vetor de AAV da invenção compre-ende o Constructo 100-400 compreendendo a sequência de ácido nucleico estabele-cida em SEQ ID NO: 32.

[0048]Em um vigésimo quinto aspecto, o vetor de AAV da invenção compre-ende o Constructo 101 compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 33.

[0049]Em um vigésimo sexto aspecto, o vetor de AAV da invenção compre-ende o Constructo 102 compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 34.

[0050]Em um vigésimo sétimo aspecto, o vetor de AAV da invenção compre-ende o Constructo 103 compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 35.

[0051]Em um vigésimo nono aspecto, o vetor de AAV da invenção compre-ende o Constructo 103 orientação inversa compreendendo a sequência de ácido nu- cleico estabelecida em SEQ ID NO: 36.

[0052]Em um trigésimo aspecto, o vetor de AAV da invenção compreende o Constructo 103AT compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 37.

[0053]Em um trigésimo primeiro aspecto, o vetor de AAV da invenção com-preende o Constructo 103AT 2xMG compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 38.

[0054]Em um trigésimo segundo aspecto, o vetor de AAV da invenção com-preende o Constructo 103AT 2xMG bGH poliA compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 39.

[0055]Em um trigésimo terceiro aspecto, o vetor de AAV da invenção compre-ende o Constructo 103 bGH poliA compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 40.

[0056]Em um trigésimo quarto aspecto, o vetor de AAV da invenção compre-ende o Constructo 104 compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 41.

[0057]Em um trigésimo quinto aspecto, o vetor de AAV da invenção compre-ende o Constructo 105 compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 42.

[0058]Em um trigésimo sexto aspecto, o vetor de AAV da invenção compre-ende o Constructo 106 compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 43.

[0059]Em um trigésimo sétimo aspecto, o vetor de AAV da invenção compre-ende o Constructo 106AT compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 44.

[0060]Em um trigésimo oitavo aspecto, o vetor de AAV da invenção compre-ende o Constructo 2x SerpinA hAAT compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 45.

[0061]Ainda em outras modalidades, a presente invenção está direcionada aos constructos de vetor que codificam um polipeptídeo de fator VIII funcional, em que os referidos constructos compreendem um ou mais dos elementos individuais dos constructos acima descritos e combinações dos mesmos, em uma ou mais orientações diferentes. A presente invenção também é direcionada para os constructos descritos acima em uma orientação oposta.

[0062]Os vetores de AAV da invenção em fita simples são menores que cerca de 7,0 kb de comprimento, ou menores que 6,5 kb de comprimento, ou menores que 6,4 kb de comprimento, ou menores que 6,3 kb de comprimento, ou menores que 6,2 kb de comprimento, ou menores que 6,0 kb de comprimento ou menores que 5,8 kb de comprimento, ou menores que 5,6 kb de comprimento, ou menores que 5,5 kb de comprimento, ou menores que 5,4 kb de comprimento, ou menores que 5,4 kb de comprimento, ou menores que 5,2 kb de comprimento ou menores que 5,0 kb de comprimento. Os vetores de AAV da invenção em fita simples variam de cerca de 5,0 kb a cerca de 6,5 kb de comprimento, ou variam de cerca de 4,8 kb a cerca de 5,2 k de comprimento, ou 4,8 kb a 5,3 kb de comprimento, ou variam de cerca de 4,9 kb a cerca de 5,5 kb de comprimento, ou cerca de 4,8 kb a cerca de 6,0 kb de comprimento, ou cerca de 5,0 kb a 6,2 kb de comprimento, ou cerca de 5,1 kb a cerca de 6,3 kb de comprimento, ou cerca de 5,2 kb a cerca de 6,4 kb de comprimento, ou cerca de 5,5 kb a cerca de 6,5 kb de comprimento.

[0063]Em outra modalidade, a invenção fornece métodos de produzir uma partícula de vírus adeno-associado (AAV) recombinante compreendendo qualquer um dos vetores de AAV da invenção. Os métodos compreendem as etapas de cultivar uma célula que foi transfectada com qualquer um dos vetores de AAV da invenção e recuperar o AAV recombinante do sobrenadante da célula transfectada.

[0064]As células da invenção são qualquer tipo de célula que são suscetíveis à infecção por baculovírus, incluindo células de insetos como High Five, Sf9, Se301, SeIZD2109, SeUCR1, Sf9, Sf900+, Sf21, BTI-TN-5B1-4, MG-1, Tn368, HzAm1, BM- N, Ha2302, Hz2E5 e Ao38. Células de mamíferos preferenciais usadas podem ser células HEK293, HeLa, CHO, NS0, SP2/0, PER.C6, Vero, RD, BHK, HT 1080, A549, Cos-7, ARPE-19 e MRC-5, incluindo células de mamíferos como células HEK293, HeLa, CHO, NS0, SP2/0, PER.C6, Vero, RD, BHK, HT 1080, A549, Cos-7, ARPE-19 e MRC-5.

[0065]A invenção também fornece uma partícula viral compreendendo qual-quer um dos vetores de AAV da invenção ou qualquer partícula viral produzida pelos métodos anteriores da invenção.

[0066]Um “virion AAV” ou “partícula viral de AAV” ou “partícula de vetor de AAV” refere-se a uma partícula viral composta de pelo menos uma proteína de capsí- deo de AAV e um vetor de AAV de polinucleotídeo encapsulado. Se a partícula com-preende uma polinucleotídeo heterólogo (ou seja, um polinucleotídeo diferente de um genoma de AAV de tipo selvagem como um transgene para ser liberado a uma célula de mamífero), é geralmente referido como uma “partícula de vetor de AAV” ou simplesmente um “vetor de AAV”. Assim, a produção de partículas de vetor de AAV necessariamente inclui a produção de vetor de AAV, uma vez que esse vetor está contido dentro de uma partícula de vetor de AAV.

[0067]A invenção também fornece células compreendendo qualquer um dos vetores de AAV da invenção, e partículas virais produzidas por essas células da in-venção.

[0068]Em outra modalidade, a invenção fornece métodos para tratar um paci-ente que sofre de hemofilia A compreendendo administrar ao paciente uma quanti-dade eficaz de qualquer um dos vetores de AAV da invenção, ou uma partícula viral da invenção ou partículas virais produzidas por um método da invenção.

[0069]Em outra modalidade, a invenção fornece um uso de qualquer um dos vetores de AAV da invenção para a preparação de um medicamento para o tratamento da hemofilia A. Em um aspecto, o medicamento compreende uma quantidade do vetor de AAV que expressa o FVIII humano em uma quantidade eficaz para tratar a hemofilia A.

[0070]Em outra modalidade, a invenção fornece uma composição compreen-dendo qualquer um dos vetores de AAV da invenção para o tratamento da hemofilia A. Em um aspecto, a composição compreende uma quantidade do vetor de AAV que expressa o FVIII humano em uma quantidade eficaz para tratar a hemofilia A.

[0071]Em outra modalidade, os vetores de AAV da invenção são usados para produzir partículas de vírus de AAV que são úteis para tratar um paciente que sofre de Hemofilia A.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0072]A Figura 1 fornece um diagrama esquemático do vetor UCL SQ. Da esquerda para a direita, o vetor UCL SQ compreende o AAV2 5’ ITR, sequência viral de AAV2 de tipo selvagem, o potencializador ApoE/C1 humano de 34 bases, a região X distal do promotor de AAT humano de 32 bases, promotor de AAT humano de 186 bases, incluindo 42 bases de sequência 5’ UTR, uma códon sequência SQ de FVIII humano de códon otimizado (ver Nathwani et al., Pub. Ped. Pat. US N.° 2013/0024960A1, publicada em Janeiro 24, 2013, que está incorporada aqui como referência em sua totalidade, e McIntosh et al., Blood 121:3335-3344, 2013) a sequência de poliadenilação sintética de 49 bases, sequência viral de AAV2 de tipo selvagem, e AAV2 3’ITR. O vetor UCL SQ possui 5081 bases de comprimento.

[0073]A Figura 2 fornece esquemas e sequências dos vetores Proto 1, Proto 1S, Proto 2S e Proto 3S. (A) Esquema do vetor Proto 1. A partir do vetor UCL SQ (ver Figura 1), as sequências virais de AAV2 de tipo selvagem estranhas foram deletadas, e sequências correspondentes aos sítios de restrição entre AAT 5’ UTR humano e região de codificação de FVIII humano, e entre o códon de terminação de FVIII hu-mano e a sequência de poliadenilação sintética, foram deletadas. (B) Esquema do vetor Proto 1S. A partir do vetor Proto 1, 10 bases na extremidade 3’ do AAV2 5’ ITR e 10 bases na extremidade 5’ do 3’ ITR foram deletadas. (C) Esquema do vetor Proto 2S. A partir do vetor de Proto 1S, o potencializador ApoE/C1 humano e região X distal de promotor AAT humano foram movidos em um íntron sintético 100 de bases que foi inserido entre os éxons 1 e 2 da sequência de FVIII humano. Conforme indicado pelas setas, a orientação do potencializador ApoE/C1 humano e região X distal de promotor AAT humano é revertida em comparação com a sua orientação em Proto 1S. (D) Esquema do vetor Proto 3S. A partir do Proto 2S, a região X distal de promotor AAT humano é substituída por uma segunda cópia do potencializador de ApoE/C1 humano na orientação inversa.

[0074]A Figura 3 fornece esquemas dos vetores Proto 4, Proto 5, Proto 6 e Proto 7. (A) Esquema do vetor Proto 4. A partir do vetor Proto 1, a sequência SQ e domínio a3 foram deletados. (B) Esquema do vetor Proto 5. A partir do vetor Proto 4, um íntron do FVIII de 129 bases foi inserido entre éxons 1 e 2 da sequência de Fator VIII humano. (C) Esquema do vetor Proto 6. A partir do vetor Proto 5, uma segunda cópia do potencializador ApoE/C1 humano foi inserida na orientação direta para o ín- tron de FVIII. (D) Esquema do vetor Proto 7. A partir do vetor Proto 5, uma segunda cópia do potencializador ApoE/C1 humano foi inserida na orientação inversa para o íntron de FVIII.

[0075]Figura 4A - Figura 4KK fornece esquemas dos vetores FVIII de AAV com sequências de promotor/potencializador melhoradas. (A) Esquema do Constructo 100ATG. (B) Esquema do Constructo 100ATG bGH poliA. (C) Esquema do Constructo 100ATG curto bGH poli A. (D) Esquema do Constructo 103ATG. (E) Esquema do Constructo 103ATG curto bGH poli A. (F) Esquema do Constructo 105ATG bGH poliA. (G) Esquema do Constructo DC172ATG FVIII. (H) Esquema do Constructo DC172ATG FVIII hAAT. (I) Esquema do Constructo DC172 2xHCR ATG FVIII. (J) Esquema do Constructo DC172 2xHCR ATG FVIII hAAT. (K) Esquema do Constructo 2x SerpinA hAAT ATG FVIII. (L) esquema do Constructo 2x SerpinA hAAT ATG FVIII 2x μ-globulina potencializador. (M) Esquema do Constructo 100ATG curto bGH poli A 2x μ-globulina potencializador. (N) Esquema do Constructo Fator VIII-BMN001. (O) Es-quema do Constructo FVIII-BMN002. (P) Esquema do Constructo 99. (Q) Esquema do Constructo 100. (R) Esquema do Constructo 100 orientação inversa. (S) Esquema do Constructo 100AT. (T) Esquema do Constructo 100AT 2x MG. (U) Esquema do Constructo 100ATG 2x MG bGH poliA. (V) Esquema do Constructo 100AT 2x MG (inverso) bGH poli A. (W) Constructo 100 bGH poli A. (X) Esquema do Constructo 100400. (Y) Esquema do Constructo 101. (Z) Esquema do Constructo 102. (AA) Esquema do Constructo 103. (BB) Esquema do Constructo 103 orientação inversa (CC) Esquema do Constructo 103AT. (DD) Esquema do Constructo 103AT 2x MG. (EE) Esquema do Constructo 103AT 2x MG bGH poli A. (FF) Esquema de 103 sbGH poli A. (GG) Esquema do Constructo 104. (HH) Esquema do Constructo 105. (II) Esquema do Constructo 106. (JJ) Esquema do Constructo 106AT. (KK) Esquema do Constructo 2x SerpinA hAAT.

[0076]A Figura 5 fornece os resultados da avaliação dos Constructos Proto em camundongos Rag2, e demonstra que Proto 1 transduz FVIII de forma semelhante ao tipo selvagem.

[0077]As Figuras 6 e 7 demonstram que Proto 1, Proto 1S, Proto 2S e Proto 3S expressam a proteína VP1, VP2 e VP3 (Figura 5) e o DNA de VP1, VP2 e VP3 (Figura 6).

[0078]As Figuras 8-10 demonstram que constructos de promotor melhorados aumentaram a expressão de FVIII.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0079]Vetores de AAV de grandes dimensões são aleatoriamente truncados nas extremidades 5’ e são desprovidos de 5’ AAV ITR. Devido ao fato de AAV ser um vírus de DNA de fita simples, e empacotar a fita senso ou antissenso, a fita senso em vetores de AAV de grandes dimensões não possui 5’ AAV ITR e possivelmente por-ções da extremidade 5’ do gene de codificação de proteína alvo, e a fita antissenso em vetores de AAV de grandes dimensões são desprovidos de 3’ ITR e possivelmente porções da extremidade 3’ do gene de codificação de proteína alvo. Um transgene funcional é produzido em células infectadas com vetores de AAV de grandes dimensões pelo anelamento dos genomas truncados senso e antissenso dentro da célula alvo.

[0080]A invenção fornece vetores de AAV que codificam FVIII funcionalmente ativo, ou seja, vetores FVIII de AAV completamente empacotados ou vetores FVIII de AAV com atividade de expressão alta. Os vetores FVIII de AAV da invenção melhoraram a expressão/partícula, bem como rendimento de produção de vírus AAV melhorado e purificação simplificada. A introdução de um ou mais íntrons na região de codificação de proteína FVIII potencializa a expressão. A reconfiguração do número e posicionamento dos potencializadores também potencializa a expressão.

Vetor UCL SQ

[0081]O vetor UCL SQ, que é descrito em detalhes em Nathwani et al., Publ. Ped. Pat. US N.° 2013/0024960A1, publicada em Janeiro 24, 2013, que está incorpo-rada aqui como referência em sua totalidade, e McIntosh et al., Blood 121:3335-3344, 2013, é em grandes dimensões, ou seja, maior que 5,0 kb, vetor de AAV. Como mos-trado na Figura 1, o vetor UCL SQ compreende, da esquerda para a direita, o sorotipo AAV 2 (AAV2) 5’ ITR, a viral de AAV2 de tipo selvagem, o potencializador de apolipo- proteína E (ApoE)/C1 humano de 34 bases, a região X distal de promotor de alfa anti- tripsina (AAT) humana de 32 bases, o promotor AAT humano de 186 bases, incluindo 42 bases da sequência de região não traduzida (UTR) 5’, a sequência de FVIII humano de códon otimizado em que o domínio B é substituído com a sequência SQ de 14 aminoácidos, a sequência de poliadenilação sintética de 49 bases, a sequência viral de AAV2 de tipo selvagem, e AAV2 3’ ITR. O vetor UCL SQ possui 5081 bases de comprimento.

[0082]Como mostrado em Nathwani et al, Publ. Ped. Pat. US N.° 2013/0024960A1, publicada em 24 de janeiro de 2013, e McIntosh et al., Blood 121:3335-3344, 2013, o vetor UCL SQ expressa FVIII funcionalmente ativo in vitro e in vivo. Vetores Proto 1, Proto 1S, Proto 2S e Proto 3S

[0083]Para evitar o problema de vetores de AAV de grandes dimensões e/ou aumentar a expressão dos vetores de AAV, a invenção fornece vetores de AAV com-pletamente empacotados, menores, ou seja, menores que 5,0 kb que codificam a va-riante FVIII SQ. A sequência de nucleotídeos de 4970 bp de sequência de Proto 1 é estabelecida em SEQ ID NO: 1.

[0084]Para gerar o vetor de AAV Proto 1, sequências que parecem ser des-necessários para a produção de FVIII funcionalmente ativo foram deletadas em com-paração com o vetor UCL SQ. Conforme mostrado no Exemplo 1, 110 bases de DNA estranho foram removidas, incluindo 53 bases de sequência viral 3’ de AAV2 para o AAV2 5’ ITR, 46 bases de sequência viral 5’ de AAV2 para a AAV2 3’ ITR, e 11 bases adjacentes para a região de codificação de FVIII SQ de códon otimizado. O vetor Proto 1 resultante possui 4970 bases de comprimento. Quando projetado, era desconhecido se o vetor Proto 1 seria capaz de expressar polipeptídeo de FVIII funcional, in vitro ou in vivo.

[0085]Para gerar o vetor de AAV Proto 1S, 10 bases na extremidade 3’ do AAV2 5’ ITR, e 10 bases na extremidade 5’ do AAV32 3’ ITR, foram removidas do vetor Proto 1. O vetor Proto 1S resultante possui 4950 bases de comprimento. A se-quência de nucleotídeos da sequência de Proto 1S é estabelecida em SEQ ID NO: 2.

[0086]Para gerar o vetor de AAV Proto 2S, um íntron de base sintética 100 foi inserido entre éxons 1 e 2 da sequência de FVIII SQ de códon otimizado no vetor Proto 1S. O potencializador ApoE/C1 de 34 bases e região X distal de promotor AAT humano de 32 bases foi removido da região a montante do promotor de AAT humano e inserido no íntron sintético na orientação inversa (em comparação com a orientação quando estes elementos estão localizados a montante do promotor de AAT humano). O vetor Proto 2S resultante possui 4983 bases de comprimento. A sequência de nu- cleotídeos da sequência de Proto 2S é estabelecida em SEQ ID NO: 3.

[0087]Para gerar o vetor de AAV Proto 3S, a região X distal do promotor de AAT humano foi removida do vetor Proto 2S, e substituída com uma segunda cópia do potencializador ApoE/C1 de 34 bases na orientação inversa. O vetor Proto 3S re-sultante possui 4984 bases de comprimento. A sequência de nucleotídeos da sequência de Proto 3S é estabelecida em SEQ ID NO: 4. Vetores Proto 4, Proto S, Proto 6 e Proto 7

[0088]Para reduzir o tamanho dos vetores de AAV e/ou aumentar a expressão dos vetores de AAV, a invenção também fornece vetores de AAV completamente empacotados, menores, ou seja, menores que 5,0 kb, que codificam o domínio B e FVIII deletado de domínio a3.

[0089]Para gerar o vetor de AAV Proto 4, a sequência SQ de 14 aminoácidos e o domínio a3 localizado adjacente ao domínio C foram removidos do vetor Proto 1. A quantidade total da sequência de FVIII deletada é 55 aminoácidos ou 165 bases. O vetor Proto 4 resultante possui 4805 bases de comprimento. A sequência de nucleo- tídeos da sequência de Proto 4 é estabelecida em SEQ ID NO: 5.

[0090]Para gerar o vetor de AAV Proto 5, um íntron de FVIII de 129 bases foi inserido entre éxons 1 e 2 da sequência de FVIII de códon otimizado no vetor Proto 4. O vetor Proto 5 resultante possui 4934 bases de comprimento. A sequência de nucle- otídeos da sequência de Proto 5 é estabelecida em SEQ ID NO: 6.

[0091]Para gerar o vetor Proto 6 de AAV, 34 bases do íntron de FVIII foram substituídas por uma segunda cópia do potencializador ApoE/C1 humano de 34 bases na orientação direta do vetor Proto 5. O vetor Proto 6 resultante possui 4934 bases de comprimento. A sequência de nucleotídeos da sequência de Proto 6 é estabelecida em SEQ ID NO: 7.

[0092]Para gerar o vetor Proto 7 de AAV, 34 bases do íntron de FVIII foram substituídas por uma segunda cópia do potencializador ApoE/C1 humano de 34 bases na orientação inversa do vetor Proto 5. O vetor Proto 7 resultante possui 4934 bases de comprimento. A sequência de nucleotídeos da sequência de Proto 7 é estabelecida em SEQ ID NO: 8. Vetores de FVIII de AAV Adicionais Com Sequências de Promotor/Potenciali- zador Melhoradas

[0093]Vetores de AAV de grandes dimensões com promotores fortes foram gerados para aumentar a expressão do FVIII deletado de domínio B e domínio a3, e esses constructos foram gerados com sequências de potencializador e/ou promotor modificadas. Em algumas modalidades, os vetores FVIII de AAV expressam um FVIII funcional truncado. Esses constructos compreenderam uma ou mais sequências de promotor e potencializador como ApoE HCR ou fragmentos dos mesmos, o potencia- lizador de μ-globulina ou fragmentos dos mesmos, o promotor de alfa-1 antitripsina humana (hAAT) ou fragmentos do mesmo, potencializador de Serpin A ou fragmentos do mesmo, o potencializador de promotor LP1 ou fragmento do mesmo, ou potencia- lizador de macroglobulina ou fragmento do mesmo. Esses constructos compreendem uma sequência de poliadenilação como a sequência bGH poli A ou a sequência poli A β-globina de coelho sintética. Em algumas modalidades, os constructos compreendem um íntron ou fragmentos de um íntron como um íntron hAAT ou um íntron β- globina.

[0094]O Constructo 100ATG possui 5511 bases de comprimento. Esse cons- tructo é estabelecido em SEQ ID NO: 9 em que bases 1-145 são 5’ AAV2 ITR, bases 160-502 são ApoE HCR, bases 509-726 são um promotor hAAT, bases 727-910 são um 2° íntron de β-globina humana modificada, bases 923-5296 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 5305-5352 são β-globina poli A de coelho sintética e bases 5367-5511 são 3’ AAV2 ITR.

[0095]O Constructo 100ATG bGH poli A possui 5688 bases de comprimento. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 10 em que bases 1-145 são 5’ AAV2 ITR, bases 160-502 são um ApoE HCR, bases 509-726 são um promotor hAAT, bases 727-910 são um 2° íntron de β-globina humana modificada, bases 923-5296 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 5305-5529 são um bGH poli A e bases 55445688 são 3’ AAV2 ITR.

[0096]O constructo 100ATG curto bGH poli A possui 5613 bases de compri-mento. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 11 em que bases 1-145 são 5’ AAV2 ITR, bases 160-502 são um ApoE HCR, bases 509-726 são um promotor hAAT, bases 727-910 são um 2° íntron de β-globina humana modificada, bases 923-5296 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 5305-5454 são um bGH poli A curto e bases 5469-5613 são 3’ AAV2 ITR.

[0097]O Constructo 103ATG possui 5362 bases de comprimento. Esse cons- tructo é estabelecido em SEQ ID NO: 12 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 169-344 são quatro cópias (4x) de uma repetição ApoE de 44bp, bases 360577 são um promotor hAAT, bases 578-761 são um 2° íntron de β-globina humana modificada, bases 774-5147 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 5156-5203 são β-globina poli A de coelho sintética e bases 5218-5362 são 3’ AAV2 ITR.

[0098]O constructo 103ATG curto bGH poli A possui 5464 bases de compri-mento. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 13 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 169-344 são quatro cópias (4x) de uma repetição ApoE de 44bp, bases 360-577 são um promotor hAAT, bases 578-761 são um 2° íntron de β-globina humana modificada, bases 774-5147 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 5156-5305 são bGH curto poli A e bases 5320-5464 são 3’ AAV2 ITR.

[0099]O Constructo 105ATG bGH poliA possui 6354 bases de comprimento. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 14 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 173-512 são duas cópias (2x) um potencializador de microglobulina de 170bp, bases 519-736 são um promotor hAAT, bases 737-920 são um 2° íntron de β- globina humana modificada, bases 933-5306 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 5315-5539 são um bGH poli A, bases 5546-6195 são duas cópias (2x) de um ApoE HCR de 325 bp e bases 6210-6354 são o 3’ AAV2 ITR.

[00100]O constructo DC172ATG FVIII possui 6308 bases de comprimento. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 15 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 160-449 são duas cópias (2x) de um potencializador de macroglobulina de 145 bp, bases 450-1347 são um promotor hAAT de 898 bp, bases 1348-1531 são um 2° íntron de β-globina humana modificada, bases 1544-5917 são um SQ FVIII de có- don otimizado, bases 5926-6149 são um bGH poli A e bases 6164-6308 são o 3’ AAV2 ITR.

[00101]O constructo DC172ATG FVIII hAAT possui 5635 bases de compri-mento. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 16 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 160-449 são duas cópias (2x) de um potencializador de macro- globulina de 145 bp, bases 457-674 são um promotor hAAT, bases 675-858 são um 2° íntron de β-globina humana modificada, bases 871-5244 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 5253-5476 são um bGH poli A e bases 5490-5635 são o 3’ AAV2 ITR.

[00102]O constructo DC172 2xHCR ATG FVIII possui 6962 bases de compri-mento. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 17 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 160-807 são duas cópias (2x) de um ApoE HCR de 321 bp, bases 814-1103 são duas cópias (2x) de um potencializador de macroglobulina de 145 bp, bases 1104-2001 são um promotor hAAT de 898 bp, bases 2002-2185 são um 2° íntron de β-globina humana modificada, bases 2198-6571 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 6580-6803 são um bGH poli A e bases 6818-6962 são o 3’ AAV2 ITR.

[00103]O constructo DC172 2xHCR ATG FVIII hAAT possui 6289 bases de comprimento. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 18 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 160-807 são duas cópias (2x) de um ApoE HCR de 321 bp, bases 814-1103 são duas cópias (2x) de um potencializador de macroglobulina de 145 bp, bases 1111-1328 são um promotor hAAT, bases 1329-1512 são um 2° íntron de β-globina humana modificada, bases 1525-5898 são um SQ FVIII de códon otimi-zado, bases 5907-6130 são um bGH poli A e bases 6245-6289 são 3’ AAV2 ITR.

[00104]O constructo 2x SerpinA hAAT ATG FVIII possui 5430 bases de com-primento. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 19 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 168-309 são duas cópias (2x) de um potencializador SerpinA de 71 bp, bases 326-543 são um promotor hAAT, bases 544-727 são um 2° íntron de β-globina humana modificada, bases 740-5113 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 5122-5271 são um curto bGH poli A, e bases 5286-5430 são 3’ AAV2 ITR.

[00105]O constructo 2x SerpinA hAAT ATG FVIII 2x μ-globulina potencializa- dor possui 5779 bases de comprimento. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 20 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 168-309 são duas cópias (2x) de um potencializador SerpinA de 71 bp, bases 326-543 são um promotor hAAT, ba-ses 544-727 são um 2° íntron de β-globina humana modificada, bases 740-5113 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 5122-5271 são um curto bGH poli A, bases 5279-5618 são duas cópias (2x) de um potencializador de μ-globulina de 170 bp e bases 5635-5779 são 3’ AAV2 ITR.

[00106]O constructo 100ATG curto bGH poli A 2x μ-globulina potencializador possui 5962 bases de comprimento. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 21 em que bases 1-145 são 5’ AAV2 ITR, bases 160-502 são um ApoE HCR, bases 509-726 são um promotor hAAT, bases 727-910 são um 2° íntron de β-globina hu-mana modificada, bases 923-5296 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 5305- 5454 são um bGH poli A curto, bases 5462-5801 são duas cópias (2x) de um poten- cializador de microglobulina de 170 bp e bases 5818-5962 são 3’ AAV2 ITR.

[00107]O constructo Fator VIII-BMN001 possui 5919 bases de comprimento. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 22 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 160-480 são um ApoE HCR, bases 487-884 são um promotor hAAT de 398bp, bases 885-1145 são um íntron hAAT truncado, bases 1155-5528 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 5537-5760 são um bGH poli A e bases 5775-5919 são 3’ AAV2 ITR.

[00108]O constructo FVIII-BMN002 possui 5306 bases de comprimento. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 23 nos quais bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 175-705 são um promotor/potencializador de LP1, bases 718-5091 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 5100-5147 são uma β-globina poli A de coelho sintética e bases 5162-5306 são 3’ AAV2 ITR.

[00109]O constructo 99 possui 5461 bases de comprimento. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 24 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 169-627 são um ApoE HCR/MAR, bases 634-866 são um promotor hAAT, bases 873-5246 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 5255-5302 são uma β-globina poli A de coelho sintética e bases 5317-5461 são 3’ AAV2 ITR.

[00110]O constructo 100 possui 5327 bases de comprimento. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 25 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 169-493 são um ApoE HCR, bases 509-726 são um promotor hAAT, bases 739-5112 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 5121-5168 são uma β-globina poli A de coelho sintética e bases 5183-5327 são 3’ AAV2 ITR.

[00111]O constructo 100 orientação inversa possui 5309 bases de compri-mento. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 26 em que bases 1-145 são 5’ AAV2 ITR, bases 160-484 são um ApoE HCR em orientação inversa, bases 491708 são um promotor hAAT, bases 721-5094 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 5103-5150 são uma β-globina poli A de coelho sintética e bases 5165-5309 são 3’ AAV2 ITR.

[00112]O constructo 100AT possui 5532 bases de comprimento. Esse cons- tructo é estabelecido em SEQ ID NO: 27 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 169-493 são um ApoE HCR, bases 509-726 são um promotor hAAT, bases 727-931 são um íntron hAAT, bases 944-5317 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 5326-5373 são uma β-globina poli A de coelho sintética e bases 5183-5327 são 3’ AAV2 ITR.

[00113]O constructo 100AT 2x MG possui 5877 bases de comprimento. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 28 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 169-493 são um ApoE HCR, bases 508-847 são duas cópias (2x) de um poten- cializador de μ-globulina de 170bp, bases 854-1071 são um promotor hAAT, bases 1072-1276 são um íntron hAAT, bases 1289-5662 são um SQ FVIII de códon otimi-zado, bases 5671-5718 são uma β-globina poli A de coelho sintética e bases 5733-5877 são 3’ AAV2 ITR.

[00114]O Constructo 100AT 2x MG bGH poli A possui 6054 bases de compri-mento. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 29 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 169-493 são um ApoE HCR, bases 508-847 são duas cópias (2x) de um potencializador de μ-globulina de 170bp, bases 854-1071 são um promotor hAAT, bases 1072-1276 são um íntron hAAT, bases 1289-5662 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 5671-5895 são um bGH poli A e bases 5910-6054 são 3’ AAV2 ITR.

[00115]O constructo 100AT 2x MG (inverso) bGH poli A possui 6054 bases de comprimento. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 30 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 169-493 são um ApoE HCR, bases 508-847 são duas cópias (2x) de um potencializador de μ-globulina de 170bp em orientação inversa, bases 8541071 são um promotor hAAT, bases 1072-1276 são um íntron hAAT, bases 1289- 5662 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 5671-5895 são um bGH poli A e bases 5910-6054 são 3’ AAV2 ITR.

[00116]O constructo 100 bGH poli A possui 5504 bases de comprimento. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 31 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 169-493 são um ApoE HCR, bases 509-726 são um promotor hAAT, bases 739-5112 são um SQ FVIII de códon otimizado, pares de bases 5121-5345 são um bGH poli A e bases 5360-5504 são 3’ AAV2 ITR.

[00117]O constructo 100-400 possui 5507 bases de comprimento. Esse cons- tructo é estabelecido em SEQ ID NO: 32 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 169-493 são um ApoE HCR, bases 512-906 são promotor hAAT de 398 bp, bases 919-5292 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 5301-5348 são uma β- globina poli A de coelho sintética e bases 5363-5507 são 3’ AAV2 ITR.

[00118]O constructo 101 possui 5311 bases de comprimento. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 33 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 170-477 são duas cópias (2x) de um ApoE HCR de 154bp, bases 493-710 são um promotor hAAT, bases 723-5096 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 51055152 são uma β-globina poli A de coelho sintética e bases 5167-5311 são 3’ AAV2 ITR.

[00119]O constructo 102 possui 5156 bases de comprimento. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 34 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 169-322 são um ApoE HCR de 154bp, bases 338-555 são um promotor hAAT, bases 568-4941 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 4950-4997 são uma β-globina poli A de coelho sintética e bases 5012-5156 são o 3’ AAV2 ITR.

[00120]O constructo 103 possui 5178 bases de comprimento. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 35 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 169-344 são quatro cópias (4x) de um ApoE HCR de 44 bp, bases 360-577 são um promotor hAAT, bases 590-4963 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 4972- 5019 são uma β-globina poli A de coelho sintética e bases 5034-5178 são 3’ AAV2 ITR.

[00121]O constructo 103 orientação inversa possui 5160 bases de compri-mento. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 36 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 160-335 são quatro cópias (4x) de um ApoE HCR de 44 bp em orientação inversa, bases 342-559 são um promotor hAAT, bases 572-4945 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 4954-5001 são uma β-globina poli A de coelho sintética e bases 5016-5160 são 3’ AAV2 ITR.

[00122]O constructo 103AT possui 5383 bases de comprimento. Esse cons- tructo é estabelecido em SEQ ID NO: 37 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 169-344 são quatro cópias (4x) de um ApoE HCR de 44 bp, bases 360-577 são um promotor hAAT, bases 578-782 são um íntron hAAT, bases 795-4374 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 5177-5224 são uma β-globina poli A de coelho sinté-tica e bases 5239-5383 são 3’ AAV2 ITR.

[00123]O constructo 103AT 2x MG possui 5728 bases de comprimento. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 38 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 169-344 são quatro cópias (4x) de um ApoE HCR de 44 bp, bases 359-698 são duas cópias (2x) de um potencializador de μ-globulina de 170bp, bases 705-922 são um promotor hAAT, bases 923-1127 são um íntron hAAT, bases 1140-5513 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 5522-5569 são uma β-globina poli A de coelho sintética e bases 5728-5584 são 3’ AAV2 ITR.

[00124]O constructo 103AT 2x MG bGH poli A possui 5905 bases de compri-mento. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 39 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 169-344 são quatro cópias (4x) de um ApoE HCR de 44 bp, bases 359-698 são duas cópias (2x) de um potencializador de μ-globulina de 170bp, bases 705-922 são um promotor hAAT, bases 923-1127 são um íntron hAAT, bases 11405513 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 5522-5746 são uma β-globina poli A de coelho sintética e bases 5761-5905 são 5’ AAV2 ITR.

[00125]O constructo 103 bGH poli A possui 5355 bases de comprimento. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 40 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 169-344 são quatro cópias (4x) de um ApoE HCR de 44 bp, bases 360-577 são um promotor hAAT, bases 590-4963 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 4972-5196 são uma β-globina poli A de coelho sintética e bases 5211-5355 são 3’ AAV2 ITR.

[00126]O constructo 104 possui 5618 bases de comprimento. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 41 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 169-784 são quatro cópias (4x) de um ApoE HCR de 154bp, bases 800-1017 são um promotor hAAT, bases 1030-5403 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 54125459 são uma β-globina poli A de coelho sintética e bases 5474-5618 são o 3’ AAV2 ITR.

[00127]O constructo 105 possui 5993 bases de comprimento. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 42 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 173-512 são duas cópias (2x) um potencializador de μ-globulina de 170 bp, bases 519-736 são um promotor hAAT, bases 749-5122 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 5131-5178 são uma β-globina poli A de coelho sintética, bases 51855834 são duas cópias (2x) de um ApoE HCR e bases 5849-5993 são 3’ AAV2 ITR.

[00128]O constructo 106 possui 5337 bases de comprimento. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 43 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 173-512 são duas cópias (2x) um potencializador de μ-globulina de 170 bp, bases 519-736 são um promotor hAAT, bases 749-5122 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 5131-5178 são uma β-globina poli A de coelho sintética e bases 51935337 são 3’ AAV2 ITR.

[00129]O constructo 106AT possui 5542 bases de comprimento. Esse cons- tructo é estabelecido em SEQ ID NO: 44 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 173-512 são duas cópias (2x) um potencializador de μ-globulina de 170 bp, bases 519-736 são um promotor hAAT, bases 737-941 são um íntron hAAT, bases 954-5327 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 5336-5383 são uma β-globina poli A de coelho sintética e bases 5398-5542 são 3’ AAV2 ITR.

[00130]O constructo 2 x SerpinA hAAT possui 5126 base. Esse constructo é estabelecido em SEQ ID NO: 45 em que bases 1-145 são o 5’ AAV2 ITR, bases 160-301 são um ApoE HCR, bases 308-525 são um promotor hAAT, bases 538-4911 são um SQ FVIII de códon otimizado, bases 4920-4967 são uma β-globina poli A de coelho sintética e bases 4982-5126 são o 3’ AAV2 ITR. Vetores de AAV

[00131]Como usado aqui, o termo “AAV” é a abreviatura padrão de vírus adeno-associado. O vírus adeno-associado é um Parvovírus de DNA de fita simples que cresce apenas nas células em que determinadas funções são fornecidas por um vírus auxiliar coinfectante. Existem atualmente treze sorotipos do AAV que foram ca-racterizados, como mostrado abaixo na Tabela 1. Informações gerais e comentários de AAV podem ser encontrados em, por exemplo, Carter, 1989, Handbook of Parvo-viruses, Vol. 1, pp. 169-228, e Berns, 1990, Virology, pp. 1743-1764, Raven Press, (New York). No entanto, espera-se totalmente que esses mesmos princípios sejam aplicáveis a sorotipos de AAV adicionais uma vez que é sabido que os vários sorotipos são bastante intimamente relacionados, estrutural e funcionalmente, mesmo em nível genético. (Ver, por exemplo, Blacklowe, 1988, pp. 165-174 of Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed.; e Rose, Comprehensive Virology 3:1-61 (1974)). Por exemplo, todos os sorotipos de AAV aparentemente apresentam propriedades de re- plicação muito semelhantes mediadas por genes homólogos rep; e todos tendo três proteínas de capsídeo relacionadas como aqueles expressas em AAV 6. O grau de parentesco é ainda sugerido pela análise de heteroduplex que revela extensa hibridi- zação cruzada entre sorotipos ao longo do comprimento do genoma; e a presença dos segmentos de autoanelamento análogos nas terminações que correspondem às “sequências de repetição terminal invertidas” (ITRs). Os padrões de infecciosidade semelhantes também sugerem que as funções de replicação em cada sorotipo estão sob controle regulatório semelhante.

[00132]Um “vetor de AAV” como usado aqui se refere a um vetor compreen-dendo um ou mais polinucleotídeos de interesse (ou transgenes) que são flanqueados por sequências de repetição terminal (ITRs) de AAV. Esses vetores de AAV podem ser replicados e empacotados nas partículas virais infecciosas quando presentes em uma célula hospedeira que foi transfectada com um vetor que codifica e expressa produtos de genes rep e cap.

[00133]Um “virion de AAV” ou “partícula viral de AAV” ou “partícula de vetor de AAV” refere-se a uma partícula viral composta de pelo menos uma proteína de capsídeo de AAV e um vetor de AAV de polinucleotídeo encapsulado. Se a partícula compreende uma polinucleotídeo heterólogo (ou seja, um polinucleotídeo diferente de um genoma de AAV de tipo selvagem como um transgene para ser liberado a uma célula de mamífero), é geralmente referido como uma “partícula de vetor de AAV” ou simplesmente um “vetor de AAV”. Assim, a produção de partículas de vetor de AAV necessariamente inclui a produção de vetor de AAV, uma vez que esse vetor está contido dentro de uma partícula de vetor de AAV.

[00134]Genes “rep” e “cap” de AAV são genes que codificam proteínas de replicação e encapsulamento, respectivamente. Genes de rep e cap de AAV foram encontrados em todos os sorotipos de AAV examinados até à data, e são descritos aqui e nas referências citadas. No AAV de tipo selvagem, os genes rep e cap foram encontrados geralmente adjacentes entre si no viral genoma (ou seja, são “acoplados” juntos como unidades transcricionais adjacentes ou sobrepostas), e geralmente são conservados entre os sorotipos de AAV. Genes rep e cap de AAV são também individualmente e coletivamente referidos como “genes de empacotamento de AAV.” O gene cap de AAV em conformidade com a presente invenção codifica uma proteína Cap que é capaz de empacotamento de vetores de AAV na presença de rep e função auxiliar de adeno e é capaz de se liga aos receptores celulares alvo. Em algumas modalidades, o gene cap de AAV codifica uma proteína de capsídeo tendo uma se-quência de aminoácidos derivada de um sorotipo de AAV particular, por exemplo, os sorotipos mostrados na Tabela 1. Tabela 1. Sorotipos de AAV

[00135]As sequências de AAV empregadas para a produção de AAV podem ser derivadas do genoma de qualquer sorotipo de AAV. Geralmente, os sorotipos de vírus de AAV têm sequências genômicas de homologia significativa com os níveis de aminoácido e ácido nucleico, fornecem um conjunto semelhante de funções genéticas, produzem virions que são essencialmente fisicamente e funcionalmente equivalentes, e se replicam e montam por mecanismos praticamente idênticos. Para a sequência genômica de sorotipos de AAV e uma discussão das semelhanças genômicas, ver, por exemplo, número de Acessão GenBank U89790; número de Acessão GenBank J01901; número de Acessão GenBank AF043303; número de Acessão GenBank AF085716; Chlorini et al, J. Vir. 71: 6823-33(1997); Srivastava et al., J. Vir. 45:555-64 (1983); Chlorini et al., J. Vir. 73:1309-1319 (1999); Rutledge et al., J. Vir. 72:309-319 (1998); e Wu et al., J. Vir. 74: 8635-47 (2000).

[00136]A organização genômica de todos os sorotipos de AAV conhecidos é muito semelhante. O genoma do AAV é uma molécula de DNA linear, de fita simples que possui menos de cerca de 5.000 nucleotídeos (nt) de comprimento. Repetições terminais invertidas (ITRs) flanqueiam as sequências de nucleotídeo de codificação únicas para as proteínas de replicação (Rep) não estruturais e proteínas estruturais (VP). As proteínas VP formam o capsídeo. Os 145 nt terminais são autocomplemen- tares e são organizados de forma que um duplex intramolecular energeticamente es-tável formando um grampo em forma de T pode ser formado. Estas estruturas de grampo funcionam como uma origem para replicação do DNA viral, servindo como iniciadores para o complexo de DNA polimerase celular. Os genes Rep codificam as proteínas Rep, Rep78, Rep68, Rep52 e Rep40. Rep78 e Rep68 são transcritas do promotor p5, e Rep 52 e Rep40 são transcritas do promotor p19. Os genes cap codi-ficam as proteínas VP, VP1, VP2 e VP3. Os genes de cap são transcritos do promotor p40.

[00137]Em algumas modalidades, uma sequência de ácido nucleico que co-difica uma proteína de capsídeo de AAV está operacionalmente ligada às sequências de controle de expressão para expressão em um tipo de célula específico, como células Sf9 ou HEK. Técnicas conhecidas por um especialista para expressar genes estrangeiros em células hospedeiras de insetos ou células hospedeiras de mamíferos podem ser usadas para a prática da invenção. A metodologia para engenharia mole-cular e expressão de polipeptídeos em células de inseto é descrita, por exemplo, em Summers e Smith. 1986. A Manual of Methods for Baculovírus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bull. N.° 7555, College Station, Tex.; Luckow. 1991. Em Prokop et al., Cloning and Expression of Heterolo-gous Genes in Insect Cells with Baculovírus Vectors’ Recombinant DNA Technology and Applications, 97-152; King, L. A. and R. D. Possee, 1992, The baculovírus expression system, Chapman and Hall, United Kingdom; O’Reilly, D. R., L. K. Miller, V. A. Luckow, 1992, Baculovírus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York; W.H. Freeman and Richardson, C. D., 1995, Baculovírus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, volume 39; Pat. US N.° 4.745.051; US2003148506; e WO 03/074714. Um promotor particularmente adequado para a transcrição de uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína de capsídeo do AAV é, por exemplo, é o promotor poliedro. No entanto, outros promotores que estão ativos nas células de inseto são conhecidos na técnica, por exemplo, os promotores p10, p35 ou IE-1 e outros promotores descritos nas referências acima também são contemplados.

[00138]O uso de células de inseto para expressão de proteínas heterólogas está bem documentado, assim como os métodos para introduzir ácidos nucleicos, como vetores, por exemplo, vetores compatíveis com células de inseto, nessas células e métodos para manter essas células em cultura. Ver, por exemplo, METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, ed. Richard, Humana Press, NJ (1995); O’Reilly et al., BACULOVÍRUS EXPRESSION VECTORS, A LABORATORY MANUAL, Oxford Univ. Press (1994); Samulski et al., J. Vir. 63:3822-8 (1989); Kajigaya et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 88: 4646-50 (1991); Ruffing et al., J. Vir. 66:6922-30 (1992); Kirnbauer et al., Vir. 219:37-44 (1996); Zhao et al., Vir. 272:382-93 (2000); e Samulski et al., Pat. US N.° 6.204.059. Em algumas modalidades, o constructo de ácido nucleico que codifica AAV em células de inseto é um vetor compatível com célula de inseto. Um “vetor compatível com célula de inseto” ou “vetor” como usado aqui se refere a uma molécula de ácido nucleico capaz de transfecção ou transformação produtiva de um inseto ou célula de inseto. Vetores biológicos exemplares incluem plasmídeos, moléculas de ácido nucleico lineares, e vírus recombinantes. Qualquer vetor pode ser empregado desde que seja compatível com célula de inseto. O vetor pode se integrar no genoma de células de inseto, mas a presença do vetor na célula de inseto não precisa ser permanente e vetores epissomais transientes também estão incluídos. Os vetores podem ser introduzidos por quaisquer meios conhecidos, por exemplo, por tratamento químico das células, eletroporação ou infecção. Em algumas modalidades, o vetor é um baculovírus, um vetor viral, ou um plasmídeo. Em uma modalidade mais preferencial, o vetor é um baculovírus, ou seja, o constructo é um vetor baculoviral. Vetores baculovirais e métodos para uso dos mesmos são descritos nas referências citadas acima em engenharia molecular das células de inseto.

[00139]Baculovírus são vírus de DNA envelopados de artrópodes, dois mem-bros dos quais são vetores de expressão bem conhecidos para a produção de prote-ínas recombinantes em culturas de células. Baculovírus têm genomas de fita dupla circulares (80-200 kbp) que podem ser projetados para permitir a liberação de grande conteúdo genômico para células específicas. Os vírus usados como um vetor são ge-ralmente Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) ou Bom- byx mori (Bm)NPV) (Kato et al., 2010).

[00140]Baculovírus são comumente utilizados para a infecção de células de insetos para a expressão de proteínas recombinantes. Em particular, a expressão de genes heterólogos em insetos pode ser realizada conforme descrito, por exemplo, Pat. US N.° 4.745.051; Friesen et al (1986); EP 127.839; EP 155.476; Vlak et al (1988); Miller et al (1988); Carbonell et al (1988); Maeda et al (1985); Lebacq-Verheyden et al (1988); Smith et al (1985); Miyajima et al (1987); e Martin et al (1988). Inúmeras cepas e variantes de baculovírus e células hospedeiras de inseto permissivas correspondentes que podem ser usadas para a produção de proteína são descritas em Luckow et al (1988), Miller et al (1986); Maeda et al (1985) e McKenna (1989).

Métodos para Produzir AAVs Recombinantes

[00141]A presente divulgação fornece materiais e métodos para produzir AAVs recombinantes em células de inseto ou mamíferos. Em algumas modalidades, o constructo viral ainda compreende um promotor e um sítio de restrição à jusante do promotor para permitir a inserção de um polinucleotídeo que codifica uma ou mais proteínas de interesse, em que o promotor e o sítio de restrição estão localizados a jusante de 5’ AAV ITR e a montante de 3’ AAV ITR. Em algumas modalidades, o constructo viral ainda compreende um elemento regulatório pós-transcricional a ju-sante do sítio de restrição e a montante de 3’ AAV ITR. Em algumas modalidades, o constructo viral ainda compreende um polinucleotídeo inserido no sítio de restrição e operacionalmente ligado com o promotor, onde polinucleotídeo compreende a região de codificação de uma proteína de interesse. Como um especialista na técnica vai apreciar, qualquer um do vetor de AAV divulgado no presente pedido pode ser usado no método como constructo viral para produzir o AAV recombinante.

[00142]Em algumas modalidades, as funções auxiliares são fornecidas por um ou mais plasmídeos auxiliares ou vírus auxiliares compreendendo por genes au-xiliares de adenovírus ou baculovírus. Exemplos não limitantes dos genes auxiliares de adenovírus ou baculovírus incluem, entre outros, E1A, E1B, E2A, E4 e VA, que pode fornecer funções auxiliares para empacotamento de AAV.

[00143]Vírus auxiliares de AAV são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, vírus da família Adenoviridae e da família Herpesviridae. Exemplos de vírus auxiliares de AAV incluem, entre outros, vírus auxiliar SAdV-13 e vírus auxiliar tipo SAdV-13 descrito na Publicação US N.° 20110201088 (cuja divulgação é incorporada aqui como referência), vetores auxiliares pHELP (Applied Viromics). Um especialista na técnica apreciará que qualquer vírus auxiliar ou plasmídeo auxiliar de AAV que pode fornecer a função auxiliar adequada para AAV pode ser usado aqui.

[00144]Em algumas modalidades, os genes cap de AAV estão presentes em um plasmídeo. O plasmídeo pode ainda compreender um gene rep de AAV. Os genes cap e/ou gene rep de qualquer sorotipo de AAV (incluindo, entre outros, AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13 e quaisquer variantes dos mesmos) pode ser usado aqui para produzir o AAV recombinante. Em algumas modalidades, os genes cap de AAV codificam um capsídeo de sorotipo 1, sorotipo 2, sorotipo 4, sorotipo 5, sorotipo 6, sorotipo 7, sorotipo 8, sorotipo 9, sorotipo 10, sorotipo 11, sorotipo 12, sorotipo 13 ou uma variante dos mesmos.

[00145]Em algumas modalidades, a célula de inseto ou mamífero pode ser transfectada com o plasmídeo auxiliar ou vírus auxiliar, o constructo viral e o plasmí- deo que codifica os genes cap de AAV; e o vírus AAV recombinante pode ser coletado em vários pontos de tempo após a cotransfecção. Por exemplo, o vírus AAV recombi- nante pode ser coletado em cerca de 12 horas, cerca de 24 horas, cerca de 36 horas, cerca de 48 horas, cerca de 72 horas, cerca de 96 horas, cerca de 120 horas, ou um tempo entre qualquer um destes dois pontos de tempo após a cotransfecção.

[00146]AAV recombinante também pode ser produzido usando quaisquer métodos convencionais conhecidos na técnica adequados para produzir AAV recombi- nante infeccioso. Em alguns casos, um AAV recombinante pode ser produzido usando uma célula de inseto ou de mamífero que expressa de forma estável alguns dos componentes necessários para a produção de partícula de AAV. Por exemplo, um plasmí- deo (ou plasmídeos múltiplos) compreendendo genes rep e cap de AAV, e um marcador selecionável, como um gene de resistência de neomicina, pode ser integrado no genoma da célula. A célula de inseto ou mamífero podem então ser coinfectada com um vírus auxiliar (por exemplo, adenovírus ou baculovírus fornecendo as funções auxiliares) e o vetor viral compreendendo o 5’ e 3’ AAV ITR (e a sequência de nucleotídeo que codifica a proteína heteróloga, se desejado). As vantagens desse método são que as células são selecionáveis e são adequadas para a produção em grande escala de AAV recombinante. Como outro exemplo não limitante, adenovírus ou baculovírus ao invés de plasmídeos podem ser usados para introduzir genes rep e cap em células de empacotamento. Ainda outro exemplo não limitantes, o vetor viral contendo 5’ e 3’ AAV LTRs e os genes rep-cap pode ser integrado de forma estável no DNA das células produtoras, e as funções auxiliares podem ser fornecidas por um adenovírus de tipo selvagem para produzir o AAV recombinante. Tipos de Célula Utilizados na Produção de AAV

[00147]As partículas virais compreendendo os vetores de AAV da invenção podem ser reduzidas usando qualquer tipo de célula de invertebrados que permite a produção de AAV ou produtos biológicos e que podem ser mantidos em cultura. Por exemplo, a linhagem de células de inseto usada pode ser de Spodoptera frugiperda, como SF9 SF21, SF900+, linhagens de células de drosophila, linhagens de células de mosquito, por exemplo, linhas de células derivadas de Aedes albopictus, linhagens de células de bicho de seda doméstico, por exemplo, linhagens de células de Bombyx- mori, linhagens de células de Trichoplusia ni como células High Five ou Lepidoptera, linhagens de células como linhagens de células de Ascalapha odorata. Células de inseto preferenciais são células de espécies de insetos que são suscetíveis à infecção por baculovírus, incluindo High Five, Sf9, Se301, SeIZD2109, SeUCR1, Sf9, Sf900+, Sf21, BTI-TN-5B1-4, MG-1, Tn368, HzAm1, BM-N, Ha2302, Hz2E5 e Ao38.

[00148]Baculovírus são vírus de DNA envelopados de artrópodes, dois mem-bros dos quais são vetores de expressão bem conhecidos para a produção de prote-ínas recombinantes em culturas de células. Baculovírus têm genomas de fita dupla circulares (80-200 kbp) que podem ser projetados para permitir a liberação de grande conteúdo genômico para células específicas. Os vírus usados como um vetor são ge- ralmente Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) ou Bom- byx mori (Bm)NPV) (Kato et al., 2010).

[00149]Baculovírus são comumente utilizados para a infecção de células de insetos para a expressão de proteínas recombinantes. Em particular, a expressão de genes heterólogos em insetos pode ser realizada conforme descrito, por exemplo, Pat. US N.° 4.745.051; Friesen et al (1986); EP 127.839; EP 155.476; Vlak et al (1988); Miller et al (1988); Carbonell et al (1988); Maeda et al (1985); Lebacq-Verheyden et al (1988); Smith et al (1985); Miyajima et al (1987); e Martin et al (1988). Inúmeras cepas e variantes de baculovírus e células hospedeiras de inseto permissivas correspondentes que podem ser usadas para a produção de proteína são descritas em Luckow et al (1988), Miller et al (1986); Maeda et al (1985) e McKenna (1989).

[00150]Em outro aspecto da invenção, os métodos da invenção são também realizados com qualquer tipo de células de mamíferos que permite a replicação de AAV ou produção de produtos biológicos, e que podem ser mantidos em cultura. Cé-lulas de mamíferos preferenciais usadas podem ser células HEK293, HeLa, CHO, NS0, SP2/0, PER.C6, Vero, RD, BHK, HT 1080, A549, Cos-7, ARPE-19 e MRC-5.

Teste de Vetores FVIII de AAV

[00151]Ensaios para testar os vetores FVIII de AAV completamente empaco-tados da invenção incluem, por exemplo, (1) transfecção transiente de plasmídeos de DNA de fita dupla compreendendo os ácidos nucleicos de vetor de AAV nas células HepG2, uma linhagem de célula derivada de fígado humano para verificar a expressão e processamento de mRNA específica de fígado, e produção de proteína FVIII e secreção in vitro; (2) produção de virions de AAV compreendendo os vetores FVIII de AAV em células 293 e células de inseto infectadas com baculovírus; (3) avaliação dos ácidos nucleicos de vetor de AAV por análise de gel alcalino e ensaios de replicação; e (4) avaliação da expressão de FVIII, atividade de FVIII, e atividade específica de FVIII em camundongos Rag2. Estes ensaios são descritos mais detalhadamente nos

Exemplos.

[00152]Os vetores FVIII de AAV completamente empacotados da invenção apresentam pelo menos a mesma expressão e/ou atividade do vetor UCL SQ, e pre-ferencialmente 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, ou 5 vezes ou mais expressão e/ou atividade em comparação com o vetor UCL SQ.

[00153]Os vetores FVIII de AAV completamente empacotados da invenção têm alto rendimento de vetor com pouco ou nenhum contaminante fragmentário de genoma, e preferencialmente 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, ou 5 vezes maior rendimento de vetor em comparação com o vetor UCL SQ.

[00154]Outros aspectos e vantagens da presente invenção serão compreen-didos após consideração dos seguintes exemplos ilustrativos.

EXEMPLOS Exemplo 1 Geração de Vetores Proto 1, Proto 1S, Proto 2S e Proto 3S

[00155]O vetor UCL SQ, que é descrito em detalhes em Nathwani et al., Publ. Ped. Pat. US N.° 2013/0024960A1, publicada em Janeiro 24, 2013, que está incorpo-rada aqui como referência em sua totalidade, e McIntosh et al., Blood 121:3335-3344, 2013, é em grandes dimensões, ou seja, maior que 5,0 kb, vetor de AAV. Como mos-trado na Figura 1, o vetor UCL SQ compreende, da esquerda para a direita, o sorotipo AAV 2 (AAV2) 5’ ITR, a viral de AAV2 de tipo selvagem, o potencializador de apolipo- proteína E (ApoE)/C1 humano de 34 bases, a região X distal de promotor de alfa anti- tripsina (AAT) humana de 32 bases, o promotor AAT humano de 186 bases, incluindo 42 bases da sequência de região não traduzida (UTR) 5’, a sequência de FVIII humano de códon otimizado em que o domínio B é substituído com a sequência SQ de 14 aminoácidos, a sequência de poliadenilação sintética de 49 bases, a sequência viral de AAV2 de tipo selvagem, e AAV2 3’ ITR. O vetor UCL SQ possui 5081 bases de comprimento.

[00156]Para obter um vetor que é menor do que o vetor UCL SQ, sequências de DNA acreditadas pelos inventores aqui como sendo desnecessárias para a expressão e/ou atividade de FVIII, ou para a produção de virion de AAV, foram removidas da sequência de vetor UCL SQ. Sequência de DNA estranho foi removida, incluindo 53 bases de sequência viral 3’ de AAV2 para o AAV2 5’ ITR, 46 bases de sequência viral 5’ de AAV2 para a AAV2 3’ ITR, e 11 bases adjacentes para a região de codificação de FVIII SQ de códon otimizado. O vetor Proto 1 resultante, que possui 4970 bases de comprimento, é mostrado de forma esquemática na Figura 2A, e a sequência é estabelecida em SEQ ID NO: 1. Proto 1 produziu vírus infeccioso e codifica um poli- peptídeo de Fator VIII funcional.

[00157]Sequências adjacentes à alça do grampo cabelo no AAV2 ITR podem também ser dispensáveis em vetores de AAV recombinantes (ver Srivastava et al., Pat. US N.° 6.521.225; Wang et al, J. Virol. 70:1668-1677, 1996; e Wang et al., J. Virol. 71:3077-3082, 1997). Para reduzir ainda mais o tamanho do vetor Proto 1, 10 bases de sequência de AAV2 foram removidas diretamente 3’ para a alça de grampo no AAV2 5’ ITR e 10 bases da sequência de AAV2 foram removidas diretamente 5’ para a alça de grampo no AAV2 3’ ITR. O vetor Proto 1S resultante, que possui 4950 bases de comprimento, é mostrado de forma esquemática na Figura 2B, e a sequência é estabelecida em SEQ ID NO: 2.

[00158]Em um esforço para aumentar a expressão da variante FVIII SQ no vetor Proto 1S, um íntron sintético de 100 bases foi inserido entre éxons 1 e 2 na sequência FVIII de códon otimizado. É sabido que a inserção de um íntron pode re-sultar em nível aumentado de expressão de mRNA em outra forma de íntron-menos genes, como, por exemplo, os genes de interferon.

[00159]Potencializadores são definidos como trabalhando de forma indepen-dente de distância e orientação. O potencializador ApoE/C1 de 34 bases trabalha de forma independente de distância e orientação no que diz respeito à expressão de FVIII, como exemplificado pela sua atividade potencializadora presuntiva em Gray et al., Pat. US N.° 8.030.065 (expressão de FIX) e em Nathwani et al., Publ. Ped. Pat. US N.° 2013/0024960 (expressão de FVIII), ambos os quais são aqui incorporados como referência em suas totalidades. A região X distal do promotor AAT humano de 32 bases, descrita em Di Simone et al., EMBO J. 6:2759-2766, 1987, está localizada dentro de um domínio regulatório que potencializa a expressão de um promotor hete- rólogo.

[00160]Em mais uma tentativa para aumentar ainda mais a expressão da va-riante FVIII SQ no vetor Proto 1S, a sequência de íntron sintética incorporou o poten- cializador ApoE/C1 humano de 34 bases e região X distal do promotor AAT humano de 32 bases, que foi movido de seu local a montante do promotor AAT humano. Estes dois elementos regulatórios foram inseridos na orientação inversa em relação às suas orientações em Proto 1S. O vetor Proto 2S resultante, que possui 4983 bases de comprimento, é mostrado de forma esquemática na Figura 2C, e a sequência é estabelecida em SEQ ID NO: 3.

[00161]Como a região X distal do promotor AAT humano não foi anteriormente mostrada para funcionar a jusante do sítio de início de transcrição em um íntron, este elemento regulatório do vetor Proto 2S foi substituído com uma segunda cópia do potencializador ApoE/C1 humano de 34 bases na mesma orientação da primeira cópia do potencializador no íntron. O vetor Proto 3S resultante, que possui 4985 bases de comprimento, é mostrado de forma esquemática na Figura 2D, e a sequência é estabelecida em SEQ ID NO: 4.

[00162]Os ácidos nucleicos do vetor Proto 1, Proto 1S, Proto 2S e Proto 3S foram clonados para o plasmídeo de expressão bacteriana pUC19, gerando assim formas de fita dupla dos vetores FVIII de AAV. Exemplo 2 Geração de Vetores Proto 4, Proto 5, Proto 6 e Proto 7

[00163]Para reduzir ainda mais o tamanho do vetor Proto 1 e/ou aumentar a expressão de FVIII em comparação com o vetor Proto 1, o domínio a3, que está loca-lizado ao lado da cadeia leve ou domínio C, foi deletado. O domínio a3 está envolvido na ligação do Fator de von Willenbrand, mas pode ser dispensável para FVIII funcionalmente ativo in vivo.

[00164]A partir do vetor Proto 1, a sequência SQ de 14 aminoácidos e domínio a3 de 41 aminoácidos (correspondente aos aminoácidos 1649-1689 de FVIII de tipo selvagem) foram deletadas. O vetor Proto 4 resultante, que possui 4805 bases de comprimento, é mostrado de forma esquemática na Figura 3A, e a sequência é estabelecida em SEQ ID NO: 5.

[00165]Na tentativa de aumentar a expressão de FVIII de domínio B e domínio a3 deletados, um íntron de FVIII de 129 bases, truncado foi inserido entre éxons 1 e 2 na sequência FVIII de códon otimizado no vetor Proto 4. O vetor Proto 5 resultante, que possui 4934 bases de comprimento, é mostrado de forma esquemática na Figura 3B, e a sequência é estabelecida em SEQ ID NO: 6.

[00166]Na tentativa de aumentar a expressão de FVIII de domínio B e domínio a3 deletados, uma segunda cópia do potencializador ApoE/C1 humano de 34 bases foi inserida na orientação direta ou inversa no vetor Proto 5. O vetor Proto 6 resultante, que possui 4934 bases de comprimento e tem o potencializador ApoE/C1 intrônico na posição direta, é mostrado de forma esquemática na Figura 3C, e a sequência é estabelecida em SEQ ID NO: 7.

[00167]O vetor Proto 7 resultante, que possui 4934 bases de comprimento e tem o potencializador ApoE/C1 intrônico na posição inversa, é mostrado de forma es-quemática na Figura 3D, e a sequência é estabelecida em SEQ ID NO: 8.

[00168]Os ácidos nucleicos do vetor Proto 4, Proto 5, Proto 6 e Proto 7 foram clonados para o plasmídeo de expressão bacteriana pUC19, gerando assim formas de fita dupla dos vetores FVIII de AAV. Exemplo 3 Ensaios para Testar a Expressão e a Atividade dos Vetores FVIII de AAV

[00169]Ensaios para testar os vetores FVIII de AAV da invenção incluem, por exemplo, (1) transfecção transiente de plasmídeos de DNA de fita dupla compreen-dendo os ácidos nucleicos de vetor de AAV nas células HepG2, uma linhagem de célula derivada de fígado humano para verificar a expressão e processamento de mRNA específica de fígado, e produção de proteína FVIII e secreção in vitro; (2) pro-dução de virions de AAV compreendendo os vetores FVIII de AAV em células 293 e células de inseto infectadas com baculovírus; (3) avaliação dos ácidos nucleicos de vetor de AAV por análise de gel alcalino e ensaios de replicação; e (4) avaliação da expressão de FVIII, atividade de FVIII, e atividade específica de FVIII em camundon-gos Rag2. Ensaios de Transfecção Transiente

[00170]Um ensaio in vitro preliminar é realizado para comparar a expressão de FVIII e de atividade dos vetores FVIII de AAV da presente invenção com o do vetor UCL SQ. Formas de fita dupla dos vetores FVIII de AAV da presente invenção são transientemente transfectadas na linhagem de célula hepática humanas, HepG2. Após transfecção, por exemplo, 24 ou 48 horas depois, antígeno FVIII e atividade nos sobrenadantes de cultura são medidos.

[00171]Usando este ensaio, a atividade de FVIII em células HepG2 transien-temente transfectadas com os vetores Proto 1, Proto 1S e Proto 2S foi semelhante à atividade de FVIII obtida usando o vetor UCL SQ, demonstrando que os vetores Proto 1, Proto 1S e Proto 2S foram capazes de expressar a proteína de Fator VIII funcional. Produção de Virions de AAV em células 293 e Células de Inseto Infectadas com Baculovírus.

[00172]Para demonstrar que os vetores FVIII de AAV da presente invenção de fato empacotaram os ácidos nucleicos que codificam FVIII, as formas de fita dupla dos vetores FVIII de AAV gerados conforme descrito nos Exemplos 1 e 2 são introdu-zidas em células capazes de produzir virions de AAV. Em um primeiro sistema de produção de vírus AAV, plasmídeos compreendendo os ácidos nucleicos do vetor FVIII de AAV em forma de fita dupla são cotransfectados em células 293 juntamente com um plasmídeo que expressa proteínas Cap e Rep de AAV e um plasmídeo que expressa funções de auxiliar de Adenovírus necessária para produção do virion de AAV. Em um segundo sistema de produção de vírus AAV, constructos de baculovírus são gerados expressando os ácidos nucleicos do vetor FVIII de AAV e as proteínas Cap e Rep de AAV, e então são coinfectados em células Sf9 de inseto. Os virions de AAV resultantes produzidos nas células 293 transientemente transfectadas ou células Sf9 infectadas com baculovírus são purificados e analisados por métodos padrão conhecidos na técnica. Avaliação por Gel Alcalino e Ensaio de Replicação

[00173]Um ensaio de eletroforese de gel alcalino é usado para determinar o tamanho do ácido nucleico empacotado. Um ensaio de centro de replicação é usado para determinar quais vetores FVIII de AAV são empacotados de forma intacta pelos métodos de empacotamento.

[00174]Um ensaio de extensão de iniciador é usado para quantificar a quantidade de ácidos nucleicos de vetores FVIII de AAV que têm extremidades completas, ou seja, terminam na extremidade 5’ da alça do grampo no AAV2 5’ ITR (fita senso) ou 3’ ITR (fita antissenso).

[00175]Alternativamente, um ensaio de PCR é usado para determinar se os ácidos nucleicos de vetores FVIII de AAV têm extremidades completas, ou seja, ter-minam na extremidade 5’ da alça do grampo no AAV2 5’ ITR (fita senso) ou 3’ ITR (fita antissenso). Avaliação em Camundongos Rag2

[00176]Os virions de AAV produzidos em células 293 transientemente trans- fectadas ou Sf9 células infectadas por baculovírus vetores empacotados são testadas para expressão e atividade de FVIII em camundongos Rag2 em genomas virais 2e11, 2e12 e 2e13 (vg)/kg, administrados por via intravenosa. Camundongos Rag2 são usados neste ensaio porque a expressão e/ou atividade de FVIII não é complicada pela presença de uma resposta imune do hospedeiro ao vírus AAV ou proteína FVIII humana.

[00177]O antígeno FVIII é determinado usando um ensaio baseado em ELISA. A atividade de FVIII é determinada usando um ensaio de coagulação e/ou um ensaio de ativação de FXa. Usando os ensaios de antígeno e atividade de FVIII, a atividade específica de FVIII é determinada.

[00178] Inúmeras modificações e variações na prática da invenção são espe-radas ocorrer aos especialistas na técnica mediante a consideração das modalidades atualmente preferenciais da mesma. Consequentemente, as únicas limitações que devem ser colocadas sobre o escopo da invenção são as que aparecem na reivindi-cação anexa. Exemplo 4 Geração de Construtos com Sequências de Promotor/Potencializador Melho-radas

[00179]Para gerar vetores de AAV adicionais com promotores fortes que au-mentam a expressão de FVIII funcional, constructos foram gerados com sequências de potencializador e/ou promotor modificadas. Em algumas modalidades, os construc- tos compreenderam versões encurtadas do ApoE ou os potencializadores de μ-globu- lina. Esses constructos foram gerados usando técnicas de clonagem de DNA padrão, e as sequências dos mesmos são mostradas em SEQ ID NOS: 9-45. Exemplo 5 Geração de Partículas Virais de AAV Geração de Bacmídeo Recombinante

[00180]Células competentes DH10 Bac foram descongeladas em gelo. Plas- mídeo de transporte recombinante (por exemplo, pFB-GFP) foi adicionado e suave-mente misturado com as células competentes e incubado em gelo por 30 minutos. As células competentes foram então submetidas ao calor a uma temperatura de aproxi-madamente 42°C por 30 segundos e então resfriadas em gelo por 2 minutos. As cé-lulas competentes foram chocadas com calor por 30 segundos a 42°C e refrigeradas em gelo por 2 min. SOC foi adicionado às células e incubado a 37°C com agitação por 4 horas para permitir que a recombinação ocorra. Durante o período de incubação, X- gal foi espalhado em duas placas LB (adicionalmente contendo vários antibióticos (por exemplo, canamicina, gentamicina e tetraciclina) para a transformação, é seguido por IPTG.

[00181]Uma quantidade da mistura de incubação foi obtida, diluída e então espalhada nas duas placas LB e incubada a 37°C por aproximadamente 30-48 horas. Várias colônias brancas foram selecionadas de cada placa e cultivadas durante a noite em meio LB contendo a mesma combinação de antibióticos fornecida nas placas LB. Em seguida, o DNA do Bacmídeo e um estoque de glicerol foram preparados e armazenados a -80°C. Purificação de DNA de Bacmídeo recombinante

[00182]Uma quantidade de estoque de glicerol de Bacmídeo é removida e inoculada em meio LB contendo a mesma combinação de antibiótico fornecida nas placas LB descritas no Exemplo 1. As culturas crescem durante a noite a 37°C com agitação. Em seguida, uma quantidade da cultura é girada em uma microcentrífuga em velocidade máxima por aproximadamente 30 segundos.

[00183]Os pellets foram ressuspensos em um tampão de ressuspensão usando uma pipeta, seguido por um tampão de lise, e o tubo foi invertido várias vezes para misturar o tampão e então incubado a temperatura ambiente por aproximada-mente 5 minutos. Um tampão de ressuspensão exemplar compreende 50 mM TrisCL, pH 8,0, 10 mM EDTA e 100ug/mL RNase A. Um tampão de lise exemplar com-preende 200 mM NaOH e 1% SDS. Uma quantidade de tampão de precipitado (por exemplo, um tampão compreendendo 3,0 M acetato de potássio, pH 5,5) foi lenta-mente adicionada e o tubo foi invertido várias vezes para misturar o tampão e então incubado no gelo por aproximadamente 10 minutos. O tubo foi centrifugado por apro-ximadamente 10 minutos na velocidade máxima e o sobrenadante é vertido em um tubo contendo isopropanol. O tubo foi invertido várias vezes para misturar a solução.

[00184]Em seguida, a solução foi centrifugada em alta velocidade por aproxi-madamente 15 minutos em temperatura ambiente e o sobrenadante foi removido imediatamente após a centrifugação com pipeta.

[00185]Uma quantidade de 70% etanol foi adicionada para lavar o pellet e girada novamente na velocidade máxima por 1 minuto. O etanol foi então removido e a solução é girada novamente para remover vestígios do etanol. Uma quantidade de Tampão TE/EB foi adicionada a cada tubo e o pellet é dissolvido com cuidado pela pipeta. A solução foi armazenada a -20°C se não usada imediatamente. Produção de P0 estoque de baculovírus recombinante

[00186]Células Sf9 foram propagadas em aproximadamente 1 x 106 célu- las/poço em uma placa de 6 poços (ou 6 x 106 células em uma placa de 10 cm ou 1,7 x 107 células em uma placa de 15 cm) e as células fixaram por pelo menos 1 hora antes da transfecção.

[00187]Soluções de transfecção A e B são preparadas como segue: Solução A: uma quantidade da Bacmídeo foi diluída em uma quantidade de meio livre de soro sem antibióticos em um tubo de 15 mL. Solução B: uma quantidade da CellFectin foi diluída em uma quantidade de meio livre de soro sem antibióticos em um tubo de 15 mL. A Solução B foi adicionada à Solução A e suavemente misturada por pipeta aproximadamente 3 vezes com uma pipeta, e incubada em temperatura ambiente por 30 ~ 45 minutos. Em seguida, o meio da placa foi aspirado e uma quantidade de meio livre de soro sem antibióticos foi adicionada para lavar as células. Uma quantidade de SF900II sem antibióticos foi adicionada a cada tubo contendo misturas de lipídio-DNA.

[00188]O meio das células foi aspirado, a solução de transfecção foi adicio-nada para as células e as células foram incubadas por aproximadamente 5 horas a 28°C. A solução de transfecção foi removida e uma quantidade de e meio livre de soro + antibióticos é adicionada, e incubada por aproximadamente 4 dias a 28°C. O meio que contém o baculovírus recombinante foi coletado e girado por aproximadamente 5 minutos a 1000 rpm para remover os resíduos de célula. O baculovírus foi armazenado a 4°C no escuro. Amplificação de baculovírus (P1)

[00189]Células Sf9 foram crescidas para aproximadamente de 4 x 106 célu- las/mL e diluídas a aproximadamente 2 x 106 células/mL com meio fresco em frascos em agitação. Uma quantidade de células Sf9 foi infectada com uma quantidade do baculovírus P0 estoque. A multiplicidade da infecção (MOI) é aproximadamente 0,1.

[00190]As células Sf9 foram incubadas por aproximadamente 3 dias e o ba- culovírus foi coletado. As células foram giradas a 2.000 rpm por 5 minutos para formar pellet das células e o sobrenadante foi coletado e armazenado a 4°C no escuro. O título do baculovírus foi determinado de acordo com o Protocolo de Kit de Título Rápido de Clontech. Produção de AAV usando baculovírus recombinante P1

[00191]Células Sf9 foram crescidas a cerca de 1 x 107 células/mL e diluídas a cerca de 5 x 106 células/mL. Uma quantidade das células Sf9 diluídas foi infectada com Bac-vetor (5Moi) e Bac-auxiliar (15Moi) por 3 dias. A viabilidade celular foi avali-ada no terceiro dia (aproximadamente 50% ~ 70% de células mortas são observadas).

[00192]Pellets de célula foram coletados por centrifugação a 3000 rpm por 10 minutos. O meio foi removido e as células lisadas (ou os pellets de célula foram armazenados a-20°C se não usados imediatamente). Lise e protocolo de banda

[00193]Uma quantidade de tampão de Lise Sf9 mais Benzonase é adicionada para cada pellet de célula e agitado completamente para ressuspender as células. As células Sf9 resuspensas foram incubadas em gelo por aproximadamente 10 min. para resfriar o lisado. O lisado foi lisado por aproximadamente 20 segundos para lisar as células completamente e então incubado a 37°C por aproximadamente 30 minutos.

[00194]Uma quantidade de 5 M NaCl foi adicionada e a mistura é agitada e então incubada por mais 30 minutos a 37°C. Uma quantidade de NaCI foi adicionada para trazer a concentração de sal a cerca de 500mM, agitada e centrifugada a 8.000 rpm por 20 minutos a 15°C para produzir um lisado límpido.

[00195]Os lisado límpido prossegui para etapas de ultracentrifugação. Um gradiente de CsCl foi preparado adicionando primeiro o lisado límpido, então uma quantidade de 1,32 g/cc e uma quantidade de 1,55 g/cc soluções de CsCl através de uma seringa com agulha longa. A interface entre as soluções de CsCl foi marcada. PBS foi adicionado até o topo dos tubos de centrífuga e os tubos são cuidadosamente equilibrados e selados.

[00196]Os tubos foram centrifugados a 55.000 rpm por aproximadamente 20 horas a 15°C. Um buraco foi furado no topo de cada tubo e a banda de AAV localizada ligeiramente acima da marca da interface das duas soluções de CsCl é marcada.

[00197]Uma segunda centrifugação de CsCl é realizada transferindo a solu-ção de AAV para tubo de centrífuga para 70,1 Ti rotor e uma quantidade de solução de CsCl para perto do topo do tubo foi adicionada. Os tubos foram equilibrados e selados. Os tubos são centrifugados a 65.000rpm por aproximadamente 20 horas e a banda de AAV (banda inferior, a banda maior é de capsídeos vazios) foi coletada. Exemplo 5 Avaliação dos Constructos em Camundongos Rag2

[00198]Genomas AAV que compreendem uma sequência de gene que codi-fica SQ FVIII de códon otimizado foram gerados usando baculovírus e células 293 usando os constructos UCL SQ, Proto 1, Proto S1, Proto S2 e Proto S3. Os limites de empacotamento são 4800bp para baculovírus e 4950 para células 293.

[00199]Como mostrado na Figura 5, Proto 1 com genomas truncados ou não truncados transduz FVIII de forma semelhante ao constructo UCL SQ. O AAV5.2 pro-duzido a partir de baculovírus e lisados de células 293T como medido em 4-12% Gel Bis-Tris. Cada uma das amostras expressara proteína VP1, VP2 e VP3, conforme mostrado na Figura 6. O DNA genômico das amostras de AAV foi corrido em 0,8% gel de agarose alcalina, conforme mostrado na Figura 7.

[00200]Transdução de Proto 1 foi semelhante à do constructo UCL SQ quando estes AAV foram preparados pelo sistema de baculovírus. A inclusão do íntron contendo Proto2S e 3S não transduz melhor que Proto 1. O vetor UCL SQ contendo as sequências flanqueando AAV preparado em células 293 foi mais potente que UCL SQ desprovido da sequência AAV preparada em baculovírus. Como resultado, potencia- lizadores adicionais foram adicionados ao Proto 1, por exemplo, Constructo 101, 102, 102 e 104, em uma tentativa de aumentar a potência. Exemplo 6 Expressão e Atividade de Vetores FVIII de AAV com Sequências de Promo- tores/Potencializadores Melhoradas

[00201]A expressão e a atividade dos vetores de AAV compreendendo Cons- tructos 99 a Constructo106 foram testadas usando o protocolo de injeção hidrodinâ-mica. A liberação hidrodinâmica é um método rápido para triar promotores de fígado in vivo. DNA de plasmídeo de AAV foi gerado usando o método descrito no Exemplo 5 e então diluído em Solução de Liberação Hidrodinâmica TransIT-QR. O plasmídeo de DNA foi injetado na veia da cauda de camundongos C57Bl/6 de 5-6 semanas de idade (18-25 g) em um volume determinado por (peso do camundongo (g)/10) = 0,1 ml solução de liberação). O tempo de injeção foi menos de 5 segundos. Plasma de cada camundongo foi coletado 48 horas após a injeção e a quantidade de antígeno FVIII expresso foi medida utilizando um ensaio de ELISA.

[00202]Doses crescentes de plasmídeo Proto 1 (2,5, 5, 12,5 e 50 μg) foram injetadas na veia da cauda de camundongos. A quantidade de FVIII no plasma do camundongo injetado foi medida utilizando um teste de ELISA e FVIII recombinante (equivalentes Xyntha SQ) foi usado como um padrão para comparação.

[00203]Para investigar a expressão, elementos de promotor/potencializador do constructo p100-400, Constructo 100(p100), Constructo FVIII-BMN001 (pFVIII- BMN001), Proto1, Constructo 100AT (p100-AT), Constructo 100 bGH poli A (p100- bGHPA), Constructo 101 (p101) e Constructo 104 (p104). Como mostrado na Figura 8, todos os constructos produziram FVIII funcional em diferentes níveis de eficiência.

[00204]As Figuras 9 e 10 fornecem dados para injeção de 1 μg de plasmídeo de vários constructos. Como mostrado na Figura 8, a injeção de Constructo FVIII- BMN001, Constructo FVIII-BMN002, Constructo 102 (p102), Constructo 103 (p103) e Constructo 104 (p104) resultou na expressão pelo menos 20 ng de FVIII em 5 de 10 camundongos. Como mostrado na Figura 9, a injeção de Constructo FVIII-BMN001, Constructo 103 (p103), Constructo 103-AT (p103-AT; promotor hAAT de 398 bp), Constructo 100 (p100), Constructo 100AT (p100-AT; promotor hAAT de 398 bp) resul-tou na expressão de pelo menos 100 ng/ml de FVIII em 5 de 10 camundongos.

Claims (13)

1. Vetor de Fator VIII (FVIII) de vírus adeno-associado (AAV) CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um ácido nucleico compreendendo uma repetição terminal invertida (ITR) de AAV5’, e/ou uma ITR AAV 3’ de AAV2, uma região regulatória de transcrição específica do fígado, uma região de codificação de FVIII funcionalmente ativo de códon otimizado, opcionalmente um ou mais íntrons, uma sequência de poliadenilação, em que a referida região de codificação de FVIII funcionalmente ativo compreende os nucleotídeos 923 a 5296 da SEQ ID NO: 9, e ainda em que o vetor possui menos que 5,0 kb de comprimento.

2. Vetor de FVIII de AAV, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida região regulatória de transcrição espe-cífica do fígado compreende os nucleotídeos 146 a 397 da SEQ ID NO: 1.

3. Vetor de FVIII de AAV, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende os nucleotídeos 1 a 397 da SEQ ID NO: 1.

4. Vetor de FVIII de AAV, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste na sequência de ácido nucleico apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7.

5. Método para produzir uma partícula de vírus adeno-associado (AAV) re- combinante CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: A) cultivar uma célula que foi transfectada com um vetor de AAV, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4; e B) recuperar a partícula de AAV recombinante do sobrenadante da célula transfectada.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida célula é uma célula de inseto.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida célula de inseto é uma célula Sf9.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a transfecção da referida célula que foi transfec- tada com um vetor de FVIII de AAV é realizada por infecção da referida célula por um baculovírus compreendendo o referido vetor de FVIII de AAV.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a transfecção da referida célula que foi transfec- tada com um vetor de FVIII de AAV é uma co-transfecção com um segundo vetor compreendendo genes rep e cap de AAV.

10. Partícula de vírus adeno-associado (AAV) recombinante CARACTERIZADA pelo fato de que é produzida pelo método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 9.

11. Partícula de AAV recombinante, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um capsídeo AAV5.

12. Partícula viral CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o vetor viral AAV, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

13. Uso de um vetor de FVIII de AAV, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou de uma partícula viral, conforme definida na reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que é para preparar um medicamento para o tratamento de hemofilia A.