BR112020023292A2 - vírus adeno-associado (aav), composição, método para a entrega de um transgene a uma célula, uso do aav, método para o tratamento de um indivíduo, vetor, célula, método para a produção de um vírus adeno-associado (aav), vírus adeno-associado (aav) - Google Patents

vírus adeno-associado (aav), composição, método para a entrega de um transgene a uma célula, uso do aav, método para o tratamento de um indivíduo, vetor, célula, método para a produção de um vírus adeno-associado (aav), vírus adeno-associado (aav) Download PDF

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Abstract

A invenção refere-se a novas proteínas do capsídeo de vírus adeno-associados (AAV), partículas de AAV compreendendo uma nova proteína do capsídeo, polinucleotídeos que codificam essas proteínas do capsídeo e vetores AAV que expressam essas proteínas do capsídeo. A invenção também sem refere a métodos para produzir os vetores AAV aqui descritos que expressam as novas proteínas do capsídeo da invenção e usos terapêuticos associados das mesmas.

Description

VÍRUS ADENO-ASSOCIADO (AAV), COMPOSIÇÃO, MÉTODO PARA A ENTREGA DE UM TRANSGENE A UMA CÉLULA, USO DO AAV, MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE UM INDIVÍDUO, VETOR, CÉLULA, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM VÍRUS ADENO-ASSOCIADO (AAV), VÍRUS ADENO-ASSOCIADO (AAV) Este pedido de patente reivindica a prioridade deste ao Pedido de Patente U.S. Provisório No de 62/671 265, depositado em 14 de maio de 2018, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência.
Incorporação por referência do material submetido eletronicamente Este pedido de patente contém, como parte separada da exposição, uma Listagem de Sequências em forma para leitura por computador, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência e identificado como: Nome do arquivo: 53120_Seqlisting.txt; Tamanho: 68.3612 bytes, criado em: 10 de maio de 2019.
Campo da invenção A invenção refere-se a novas proteínas do capsídeo de vírus adenoassociados (AAV), partículas de AAV compreendendo uma nova proteína do capsídeo, polinucleotídeos que codificam essas proteínas do capsídeo e vetores AAV que expressam essas proteínas do capsídeo. A invenção também sem refere a métodos para produzir os vetores AAV aqui descritos que expressam as novas proteínas do capsídeo da invenção e usos terapêuticos associados das mesmas.
Fundamentos da invenção
AAV é um parvovírus com defeito de replicação, cujo genoma de DNA de fita simples tem aproximadamente 4,7 kb de comprimento incluindo repetições terminais invertidas (ITRs) com 145 nucleotídeos.
A sequência de nucleotídeos do genoma de AAV sorotipo 2 (AAV2) é apresentada em Srivastava et al., J.
Virol., 45: 555-564 (1983), conforme corrigida por Ruffing et al., J.
Gen.
Virol., 75: 3385-3392 (1994). Sequências atuando em cis direcionando a replicação do DNA viral (rep), a encapsidação/empacotamento e integração no cromossomo da célula hospedeira estão contidas nas ITRs.
Três promotores de AAV, p5, p19 e p40 (denominados por suas localizações relativas no mapa), direcionam a expressão das duas fases de leitura aberta (open reading frame) internas do AAV que codificam os genes rep e cap.
Os dois promotores rep (p5 e p19), acoplados com o splicing diferencial do único íntron de AAV (nos nucleotídeos 2107 e 2227), resultam na produção de quatro proteínas rep (rep 78, rep 68, rep 52 e rep 40) a partir do gene rep.
As proteínas rep possuem múltiplas propriedades enzimáticas, as quais são, no final, responsáveis pela replicação do genoma viral.
O gene cap é expresso desde o promotor p40 e codifica as três proteínas do capsídeo VP1, VP2 e VP3. O splicing alternativo e um sítio de início da tradução não de consenso são responsáveis pela produção das três proteínas relacionadas ao capsídeo.
Um único sítio de poliadenilação de consenso está localizado na posição 95 do mapa do genoma de AAV.
O ciclo de vida e genética de AAV são revisados em Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992).
Quando AAV infecta uma célula humana, o genoma viral pode integrar-se no cromossomo 19 resultando em infecção latente da célula. A produção de vírus infeccioso não ocorre a menos que a célula seja infectada por um vírus auxiliar (helper virus) (por exemplo, adenovírus ou herpesvírus). No caso de adenovírus, os genes E1A, E1B, E2A, E4 e VA proporcionam funções de auxiliares. Quando da infecção por um vírus auxiliar, o pró- vírus AAV é resgatado e amplificado e, ambos, AAV e adenovírus são produzidos.
AAV possui recursos únicos que o tornam atraente como vetor vacinal para expressão de peptídeos/polipeptídeos imunogênicos e como vetor para a entrega de DNA exógeno a células, por exemplo, na terapia gênica. A infecção de células pelo AAV em cultura é não citopática, e a infecção natural de humanos e outros animais é silenciosa e assintomática. Além disso, AAV infecta muitas células de mamíferos admitindo a possibilidade do direcionamento para muitos tecidos diferentes in vivo. O genoma proviral do AAV é infeccioso como DNA clonado em plasmídeos, o que torna viável a construção de genomas recombinantes. Além do mais, por causa dos sinais direcionados para replicação do AAV, a encapsidação e integração do genoma estão contidos nas ITRs do genoma do AAV, parte ou todos os aproximadamente 4,3 kb internos do genoma (que codificam proteínas de replicação e estruturais do capsídeo, rep-cap) podem ser substituídos por DNA exógeno, tal como um cassete gênico contendo um promotor, um DNA de interesse e um sinal de poliadenilação. As proteínas rep e cap podem ser fornecidas em trans. Outro recurso significativo de AAV é este ser um vírus extremamente estável e farto. Ele pode suportar facilmente as condições usadas para inativar adenovírus (56 ºC a 65 ºC por diversas horas), fazendo com que a conservação a frio de vetores rAAV seja menos crítica. AAV pode até mesmo ser liofilizado. Finalmente, células infectadas por AAV não são resistentes à superinfecção.
Os vetores AAV encontram utilidade em inúmeras aplicações para terapia gênica de mamíferos e há necessidade de vetores AAV novos e/ou modificados e vírus associados que encontram utilidade em aplicações de terapia gênica. A presente invenção provê novos vetores AAV que expressam as novas proteínas do capsídeo de AAV da presente invenção e novos vírions de AAV não naturais que compreendem esses vetores ou proteínas do capsídeo.
Sumário da invenção A invenção provê novas proteínas do capsídeo de AAV, as quais podem ser novas proteínas do capsídeo VP1, VP2 ou VP3, vírus AAV não naturais que compreendem qualquer uma dessas proteínas do capsídeo e o uso de tais vírus para aplicações de terapia gênica e para uso na preparação de medicamentos para aplicações de terapia gênica. Em algumas modalidades, as proteínas do capsídeo de AAV foram isoladas e identificadas em vários tecidos de mamíferos. As sequências de aminoácidos de certas novas proteínas VP1 do capsídeo de AAV derivadas de mamíferos são estabelecidas na SEQ ID NOS:1-7, e as localizações associadas das respectivas sequências de VP2 e VP3 são também aqui descritas. Coletivamente, as novas proteínas do capsídeo são aqui referidas como “proteínas do capsídeo de AAV da invenção”.
Em uma modalidade, a invenção provê um vírus adenoassociado (AAV) tendo uma proteína do capsídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica a (i) qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7, (ii) a região VP2 de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7, ou (iii) a região VP3 de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7, e tendo ainda um transgene, em que o transgene é composto por um gene heterólogo operacionalmente ligado a sequências reguladoras que controlam a expressão do gene heterólogo em uma célula hospedeira. Em outra modalidade, a proteína do capsídeo possui a sequência de aminoácidos de (i) qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7, (ii) a região VP2 de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7, ou (iii) a região VP3 de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7. Em ainda outra modalidade, o AAV possui uma sequência de repetição terminal invertida de AAV. Em mais modalidades, os AAV são misturados com um veículo fisiologicamente compatível.
Em outra modalidade, a invenção provê um método para a entrega de um transgene a uma célula, o qual envolve a etapa de colocar a célula em contato com qualquer um dos AAV aqui revelados. Em outra modalidade, a invenção provê um método para o tratamento em um indivíduo de um transtorno ou doença associado com atividade anormal de uma proteína endógena, o qual envolve a etapa de administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um AAV aqui revelado, em que o AAV é portador de um transgene que codifica uma cópia biologicamente ativa da proteína. Em ainda outra modalidade, os métodos envolvem a entrega de um transgene a uma célula hepática.
Em mais uma modalidade, a invenção provê uma composição que compreendem qualquer um dos AAV da invenção para a entrega de um transgene a uma célula, tal como uma célula hepática. Além disso, a invenção provê o uso de qualquer um dos AAV da invenção na preparação de um medicamento para a entrega de um transgene a uma célula.
Em uma modalidade, a invenção provê uma proteína do capsídeo de um vírus adenoassociado (AAV) isolado, em que a proteína do capsídeo compreende (i) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de VP1 de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7 ou a região VP2 ou VP3 de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7 ou (ii) uma sequência de aminoácidos de VP1 compreendendo qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7 ou a região VP2 ou VP3 de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7. Em certas modalidades, a proteína do capsídeo é ligada a uma sequência heteróloga de aminoácidos. A invenção também provê partículas de AAV não naturais tendo ou compreendendo qualquer uma dessas proteínas do capsídeo. Em certas modalidades, a partícula de AAV não natural, compreendendo qualquer uma das proteínas do capsídeo VP1, VP2 ou VP3 descritas acima, compreende um ácido nucleico com repetições terminais invertidas de AAV e um transgene que compreende um gene heterólogo operacionalmente ligado a sequências reguladoras que direcionam a expressão do gene heterólogo em uma célula hospedeira. Em outras modalidades, a partícula de AAV não natural, compreendendo qualquer uma das sequências de VP1, VP2 ou VP3 do capsídeo aqui descritas, compreende um transgene heterólogo operacionalmente ligado a sequências reguladoras que controlam a expressão do transgene em uma célula hospedeira. Neste relatório descritivo, os termos “gene heterólogo” ou “sequência reguladora heteróloga” significam que o gene ou a sequência reguladora citados não está naturalmente presente no vetor ou partícula de AAV e é artificialmente introduzida nos mesmos. O termo “transgene” refere-se a um ácido nucleico que compreende ambos, um gene heterólogo e sequências reguladoras que são operacionalmente ligadas ao gene heterólogo e que que controlam a expressão daquele gene em uma célula hospedeira.
A invenção também provê um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína do capsídeo de vírus adenoassociado (AAV), em que a proteína do capsídeo compreende (i) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de VP1 de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7 ou a região VP2 ou VP3 de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7 ou (ii) uma sequência de aminoácidos de VP1 compreendendo qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7 ou a região VP2 ou VP3 de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7, em que o polinucleotídeo é operacionalmente ligado a uma sequência reguladora heteróloga de controle. Assim, entende-se que os polinucleotídeos da presente invenção não são naturais. A invenção também provê vetores AAV que compreendem qualquer uma dessas sequências de polinucleotídeos operacionalmente ligadas uma sequência reguladora heteróloga e composições que compreendem esses vetores AAV, incluindo composições farmacêuticas.
Em outra modalidade, a invenção provê um vetor de vírus adenoassociado (AAV) isolado que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma proteína do capsídeo e uma sequência de transgene heterólogo, em que a proteína do capsídeo compreende (i) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de VP1 de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7 ou a região VP2 ou VP3 de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7 ou (ii) uma sequência de aminoácidos de VP1 compreendendo qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7 ou a região VP2 ou VP3 de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7. A invenção também provê for composições que compreendem esses vetores AAV, incluindo composições farmacêuticas.
Em outra modalidade, a invenção provê um vírus adenoassociado (AAV) que compreende uma proteína do capsídeo, em que a proteína do capsídeo compreende um fragmento funcional de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 1-7, e que compreende ainda um transgene compreendendo um gene heterólogo operacionalmente ligado a uma sequência reguladora que controla a expressão do gene heterólogo em uma célula hospedeira. Por exemplo, o fragmento funcional compreende uma ou mais dentre as regiões variáveis (VR), as regiões constantes que estão localizadas entre as regiões variáveis, o domínio GBS e a alça GH da sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1-7. A invenção também provê composições que compreendem esses vetores AAV, incluindo composições farmacêuticas.
Em uma modalidade adicional, a invenção provê um vírus adenoassociado que compreende uma proteína do capsídeo, em que a proteína do capsídeo compreende uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de nucleotídeos que hibridiza com uma sequência de nucleotídeos que codifica (i) uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1-7, (ii) a região VP2 da sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1-7 ou a região VP3 da sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1-7, e que compreende ainda um transgene compreendendo um gene heterólogo operacionalmente ligado a uma sequência reguladora que controla a expressão do gene heterólogo em uma célula hospedeira. Por exemplo, a sequência de nucleotídeos hibridizou com uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína do capsídeo ou um fragmento funcional de uma proteína do capsídeo da invenção sob condições rigorosas. A invenção também provê composições que compreendem esses vetores AAV, incluindo composições farmacêuticas.
As “regiões variáveis” referem-se às nove regiões variáveis na sequência de VP1 de uma proteína do capsídeo de AAV. As regiões variáveis (VR) são aqui referidas como VR I, VR II, VR III VR IV, VR V, VR VI, VR VII, VR VIII e VR IX, e suas respectivas localizações em várias sequências de VP1 são aqui descritas. As VR exibem a maior variação na sequência e estrutural dentro da sequência de VP1 do capsídeo de AAV e podem também exercer funções em ligação ao receptor, ativação da transcrição de transgenes, transdução em tecidos e antigenicidade.
A “sequência de ligação ao glicano (GBS)” ou “domínio GBS” ou “região GBS” referem-se à sequência de aminoácidos localizada entre VR IV e VR V que rege a especificidade de ligação ao glicano da capsídeo viral. As localizações das regiões GBS em várias sequências de aminoácidos de VP1 de AAV são aqui descritas, e aquelas de outras sequências de aminoácidos de VP’ de AAV são conhecidas na técnica e/ou podem ser identificadas rotineiramente.
A “alça GH” refere-se à sequência de uma alça que é flanqueada por G da fita β e H da fita β dentro do barril β interno da proteína do capsídeo. A sequência da “alça GH” compreende desde a região variável VR IV à VR VIII, incluindo a sequência GBS englobada e toda a sequência da cadeia principal (backbone) conservada intercalada do doador. As localizações das regiões da alça GH em várias sequências de aminoácidos de VP1 de AAV são aqui descritas e aquelas de outras sequências de aminoácidos de VP1 de AAV podem ser identificadas rotineiramente.
Em relação às localizações aqui descritas das regiões VR, GBS e da alça GH, deve-se ressaltar que a localização das extremidades N-terminal e/ou C-terminal daquelas regiões modem variar em até 1 aminoácido, 2 aminoácidos, 3 aminoácidos, 4 aminoácidos ou 5 aminoácidos das localizações de aminoácidos daquelas regiões que são aqui explicitamente descritas (particularmente na Tabela 2). As novas sequências de capsídeo que compreendem uma ou mais regiões substituídas VR, GBS e/ou da alça GH que variam em até 5 aminoácidos na extremidade N-terminal e/ou C-terminal, como aqui definido, são abrangidas pela presente invenção.
A invenção provê métodos para a produção de uma partícula de vírus adenoassociado (AAV) recombinante, os quais compreendem as etapas de: cultivar uma célula que foi transfectada com qualquer um dos vetores AAV da invenção e recuperar a partícula de AAV recombinante do sobrenadante da célula transfectada. Além disso, a invenção provê partículas virais que compreendem qualquer um dos vetores virais ou proteínas do capsídeo da invenção e células que compreendem esses vetores virais.
Uma modalidade da invenção provê um método para a produção de qualquer um dos AAV recombinantes aqui descritos, o qual compreende cultivar uma célula para produção viral na qual foi introduzido um primeiro vetor de ácido nucleico tendo sequências de repetições terminais invertidas 5’ e 3’ de AAV flanqueando um transgene com um gene heterólogo operacionalmente ligado a sequências reguladoras que controlam a expressão do gene heterólogo em uma célula hospedeira, e um segundo vetor de ácido nucleico com sequências de ácidos nucleicos de rep e cap de AAV, em que a dita sequência de ácido nucleico de cap que codifica um capsídeo de AAV é pelo menos 95% idêntica a qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7; e recuperar o AAV do sobrenadante da cultura celular de produção viral. Em outra modalidade, a célula para produção viral é de mamífero. Em uma modalidade preferida, a célula de inseto é uma célula HEK293.
Em outra modalidade, a invenção provê métodos para o tratamento de um paciente que sofre de um transtorno ou doença, os quais compreendem administrar ao paciente uma quantidade eficaz de qualquer um dos vetores ou vírus AAV da invenção.
Em uma modalidade adicional, a invenção provê o uso de qualquer um dos vetores ou vírus AAV da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento de um transtorno ou doença. A invenção também provê composições que compreendem qualquer um dos vetores ou vírus AAV da invenção para o tratamento de uma doença ou transtorno.
Em ainda outra modalidade, a doença ou transtorno em um indivíduo está associado com atividade anormal de uma proteína endógena. Neste relatório descritivo, “proteína endógena” significa uma proteína ou o produto de um gene codificado pelo genoma do indivíduo que sofre da doença ou transtorno.
Um “vírion de AAV” ou “partícula viral de AAV” ou “partícula do vetor AAV” ou “vírus AAV” refere-se a uma partícula viral composta por pelo menos uma proteína do capsídeo de AAV e um vetor de polinucleotídeo de AAV envolvido em capsídeo. Se compreender um polinucleotídeo heterólogo (ou seja, um polinucleotídeo diferente de um genoma de AAV do tipo selvagem, como um transgene a ser entregue a uma célula de mamífero), a partícula é tipicamente referida como “partícula de vetor AAV” ou simplesmente um “vetor AAV”. Assim, a produção de uma partícula de vetor AAV inclui necessariamente a produção do vetor AAV, uma vez que tal vetor está contido em uma partícula de vetor AAV.
A invenção também provê células que compreendem qualquer um dos vetores AAV da invenção, e partículas virais produzidas por essas células da invenção.
O termo “repetição terminal invertida (ITR)”, neste relatório descritivo, refere-se a regiões reconhecidas na técnica que são encontradas nas terminações 5’ e 3’ do genoma de AAV e que funcionam em cis como origens de replicação do DNA e como sinais de empacotamento para o genoma viral. As ITRs de AAV, junto com a região de codificação de rep de AAV, permitem excisão eficiente e resgate de um vetor plasmidial, e a integração de uma sequência de nucleotídeos interposta entre duas ITRs flanqueadoras no genoma de uma célula hospedeira. Sequências de certas ITRs associadas a AAV são reveladas por Yan et al., J. Virol. 79(1):364-379 (2005), cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência.
A frase “funções auxiliares para gerar uma infecção produtiva por AAV”, neste relatório descritivo, refere-se a sequências de codificação derivadas de AAV que podem ser expressas para fornecer produtos gênicos de AAV que, por sua vez, funcionam em trans para replicação produtiva de AAV. Assim, funções auxiliares de AAV incluem as regiões rep e cap. Os produtos da expressão de rep demonstraram possuir muitas funções, incluindo, entre outros: reconhecimento, ligação e corte (nicking) da origem de replicação do DNA de AAV; atividade de DNA helicase; e modulação da transcrição de promotores de AAV (ou de outros heterólogos). Os produtos da expressão de cap fornecem as funções necessárias para o empacotamento. As funções auxiliares de AAV são aqui utilizadas para complementar as funções de AAV em trans que estão faltando em vetores AAV. As funções auxiliares para gerar uma infecção produtiva por AAV podem também incluir certas funções auxiliares de baculovírus, herpesvírus, adenovírus ou vírus Vaccinia.
Em algumas modalidades, a construção viral compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica os genes rep e cap de AAV.
O termo “gene rep de AAV”, neste relatório descritivo, refere-se à região reconhecida na técnica do genoma de AAV que codifica as proteínas de replicação do vírus que são necessárias para replicar o genoma viral e inserir o genoma viral no genoma de um hospedeiro durante infecção latente. Para uma descrição detalhada da região de codificação de rep de AAV, ver, p. ex., Muzyczka et al., Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129 (1992); Kotin et al., Human Gene Therapy 5:793-801 (1994), cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência. A região de codificação de rep, neste relatório descritivo, pode ser derivada de qualquer sorotipo viral, tal como os sorotipos de AAV descritos acima. A região não precisa incluir todos os genes do tipo selvagem, mas pode ser alterada, p. ex., pela inserção, deleção ou substituição de nucleotídeos, desde que os genes rep retenham as características funcionais desejadas quando expressos em uma célula receptora adequada.
O termo “gene capa de AAV”, neste relatório descritivo, refere-se à região reconhecida na técnica do genoma de AAV que codifica as proteínas do revestimento do vírus que são necessárias para o empacotamento do genoma viral. Para uma descrição detalhada da região de codificação de cap, ver, p. ex., Muzyczka et al., Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129 (1992); Kotin et al., Human Gene Therapy 5:793-801 (1994), cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência. A região de codificação de cap de AAV, neste relatório descritivo, pode ser derivada de qualquer sorotipo de AAV, como descrito acima. A região não precisa incluir todos os genes cap do tipo selvagem, mas pode ser alterada, p. ex., pela inserção, deleção ou substituição, desde que os genes proporcionem funções suficientes de empacotamento quando presentes em uma célula hospedeira juntamente com um vetor AAV.
O termo “transfecção” é usado para se referir à absorção do DNA exógeno por uma célula. Uma célula foi “transfectada” quando o DNA exógeno foi introduzido para dentro da membrana celular. Várias técnicas de transfecção são geralmente conhecidas na área. Ver, p. ex., Graham et al., Virology 52:456 (1973); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier (1986); Chu et al., Gene 13:197 (1981), cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência. Tais técnicas podem ser utilizadas para introduzir uma ou mais porções de DNA exógeno, tais como um vetor de integração de nucleotídeo e outras moléculas de ácido nucleico em células hospedeiras adequadas. O termo englobe procedimentos químicos, elétricos e mediados por vírus de transfecção.
Em ainda outro aspecto, descreve-se uma partícula de AAV produzida por um método aqui descrito. Em algumas modalidades, a partícula de AAV compreende em seu genoma pelo menos um nucleotídeo que codifica uma proteína heteróloga.
O termo “proteínas ou peptídeos heterólogos” refere- se a qualquer proteínas que não é expressa por AAV do tipo selvagem incluindo etiquetas (tags), como hexahistidina, FLAG, myc, polihistidina, ou marcações ou imunógenos, adjuvantes, marcadores de seleção, proteínas terapêuticas ou proteínas ou peptídeos de direcionamento, para citar alguns.
Exemplos da proteína heteróloga aqui descrita incluem, entre outras, β-globina, hemoglobina, ativador do plasminogênio tecidual e fatores de coagulação; fatores estimuladores de colônias (CSF); interleucinas, como IL-1, IL- 2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 etc.; fatores de crescimento, como fator de crescimento de queratinócitos (KGF), fator de células-tronco (SCF), fator de crescimento de fibroblastos (FGF, como FGF básico e FGF ácido), fator de crescimento de hepatócitos (HGF), fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGFs), proteína óssea morfogenética (BMP), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento e de diferenciação-9 (GDF-9), fator de crescimento derivado de hepatoma (HDGF), miostatina (GDF-8), fator de crescimento nervoso (NGF), neurotrofinas, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), trombopoietina (TPO), fator de crescimento transformador alfa (TGF-α), fator de crescimento transformador beta (TGF-β) e similares; receptores solúveis, como receptores solúveis de TNF-α, receptores solúveis de interleucinas (p. ex., receptores solúveis de IL-1 e receptores solúveis de IL-1 tipo II), receptores solúveis γ/Δ de células T, fragmentos de ligação a ligantes de um receptor solúvel e similares; enzimas, como α-glicosidase, imiglucerase, β- glucocerebrosidase e alglucerase; ativadores de enzimas, como ativador do plasminogênio tecidual; quimiocinas, como 1P-10, monocina induzida por interferon-gama (Mig), Groα/IL-8, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, MCP-1, PF-4 e similares; agentes angiogênicos, como fatores de crescimento endotelial vascular (VEGFs, p. ex., VEGF121, VEGF165, VEGF-C, VEGF-2), fator de crescimento derivado de glioma, angiogenina, angiogenina-2; e similares; agentes anti-angiogênicos, como um receptor solúvel de VEGF; vacina de proteína; peptídeos neuroativos, como fator de crescimento nervoso (NGF), bradicinina, colecistocinina, gastina, secretina, oxitocina, hormônio liberador de gonadotropina, beta-endorfina, encefalina, substância P, somatostatina, prolactina, galanina, hormônio liberador do hormônio de crescimento, bombesina, dinorfina, varfarina, neurotensina, motilina, tirotropina, neuropeptídeo Y, hormônio luteinizante, calcitonina, insulina, glucagons, vasopressina, angiotensina II, hormônio liberador de tirotropina, peptídeo vasoativo intestinal, um peptídeo do sono e similares; agentes trombolíticos; peptídeo natriurético atrial; relaxina; proteína ácida fibrilar glial; hormônio estimulante de folículos (FSH); antitripsina alfa-1 humana; fator inibidor de leucemia (LIF); fatores teciduais, hormônio luteinizante; fatores ativadores de macrófagos; fator de necrose tumoral (TNF); fator quimiotático de neutrófilos (NCF); inibidores teciduais de metaloproteinases; peptídeo vasoativo intestinal; angiogenina; angiotropina; fibrina; hirudina; antagonistas de receptores de IL-1; fator neurotrófico ciliar (CNTF); fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF); neurotrofinas 3 e 4/5 (NT-3 e 4/5); fator neurotrófico derivado de células gliais (GDNF); descarboxilase de aminoácidos aromáticos (AADC); Fator VIII, Fator IX, Fator X; distrofina ou nini-distrofina; lipase ácida lisossomal; fenilalanina hidroxilase (PAH); enzimas relacionadas à doenças de armazenamento do glicogênio, como glicose-6-fosfatase, maltase ácida, enzima de desramificação do glicogênio, glicogênio fosforilase muscular, glicogênio fosforilase hepática, fosfofrutoquinase muscular, fosforilase quinase, transportador de quinase, aldolase A, β-enolase, glicogênio sintase; e enzimas lisossomais.
Descrição dos desenhos A Figura 1 é um conjunto de tabelas mostrando a especificidade, relativa aos tecidos, da infectividade de AAV tendo as novas proteínas do capsídeo designadas. Os dados são apresentados como Fluxo Total em cada tecido (fótons/segundo/cm2/radiano). Para cada tecido, a linha de cima representa o fluxo médio e o fluxo de baixo representa o desvio padrão.
A Figura 2 fornece dados de um ensaio de neutralização de IVIG para os novos capsídeos: Bba-45, Bba-46, Bba-47, Bba-50 e Bba-51 e os capsídeos controle: AAV5, AAV8 e AAV9. Esse ensaio demonstra que os novos capsídeos exibiram propriedades de resistência a IVIG.
A Figura 3 fornece dados de transdução para os novos capsídeos: Bba-45, Bba-46, Bba-47, Bba-50 e Bba-51 e os capsídeos controle: AAV5, AAV8 e AAV9. Esses dados foram gerados em múltiplos experimentos e os múltiplos pontos de dados para cada capsídeo representa diferentes experimentos. Os AAV tendo os novos capsídeos possuem um grau significativamente maior de especificidade por células hepáticas quando comparados ao AAV5. Os dados são mostrados como atividade de fluxo total, que é um substituto para infectividade de AAV em cada sistema de órgãos.
A Figura 4 fornece dados de transdução em múltiplos tecidos para os novos capsídeos: Bba-45, Bba-46, Bba-47, Bba-50 e Bba-51 e os capsídeos controle: AAV5, AAV8 e AAV9. Esses dados demonstram que os AAV tendo os novos capsídeos possuem um grau significativamente maior de especificidade por células hepáticas quando comparados ao AAV5.
A Figura 5 fornece os níveis plasmáticos da proteína bCG após a injeção dos novos capsídeos: Bba-45, Bba-46, Bba-47, Bba-49 e Bba-50 e dos capsídeos controle: AAV8, AAV-rh10 e AAV- anc80L65.
A Figura 6 fornece os níveis da proteína bCG no fígado e no plasma após a injeção dos novos capsídeos: Bba-45, Bba-46, Bba-47, Bba-49 e Bba-50 e dos capsídeos controle: AAV8, AAV-rh10 e AAV-anc80L65.
As Figuras 7A-7C fornecem o nível de DNA de bCG (Painel A), RNA de bCG (Painel B) e proteína bCG (Painel C) no fígado após a injeção dos novos capsídeos: Bba-45, Bba-46, Bba- 47, Bba-49 e Bba-50 e dos capsídeos controle: AAV8, AAV-rh10 e AAV-anc80L65.
A Figura 8A-8B demonstra que os níveis do DNA de bCG e do RNA de bCG no fígado correlacionam-se com os níveis da proteína bCG no fígado após a injeção dos novos capsídeos: Bba- 45, Bba-46, Bba-47, Bba-49 e Bba-50 e dos capsídeos controle: AAV8, AAV-rh10 e AAV-anc80L65.
A Figura 9 fornece a porcentagem de hepatócitos transduzidos por AAV após a injeção dos novos capsídeos: Bba- 45, Bba-46, Bba-47, Bba-49 e Bba-50 e dos capsídeos controle: AAV8, AAV-rh10 e AAV-anc80L65 conforme determinada por imuno- histoquímica.
A Figura 10 fornece fotos exemplares mostrando a coloração por imuno-histoquímica de hepatócitos após a injeção dos novos capsídeos: Bba-45, Bba-46, Bba-47, Bba-49 e Bba-50 e dos capsídeos controle: AAV8, AAV-rh10 e AAV-anc80L65.
A Figura 11 fornece a porcentagem de hepatócitos transduzidos por AAV tendo o novo capsídeo Bba-49 e o capsídeo de AAV5 de várias fontes. Esses AAV transduziram os hepatócitos com o transgene –AGXT. O AAV.Bba-49. AGXT transduziu aproximadamente 96% dos hepatócitos.
Descrição detalhada da invenção A invenção provê novas proteínas do capsídeo de AAV, ácidos nucleicos que codificam essas proteínas do capsídeo e vírus AAV que compreendem essas novas proteínas do capsídeo. Em algumas modalidades, as proteínas do capsídeo de AAV foram isoladas e identificadas em vários tecidos de mamíferos. As sequências de aminoácidos das novas proteínas VP1 do capsídeo de
AAV são estabelecidas como SEQ ID NOS:1-7, e as localizações das regiões VP2 e VP3 associadas são aqui reveladas.
Vetores AAV Neste relatório descritivo, o termo “AAV” é uma abreviação padrão para vírus adenoassociado. O vírus adenoassociado é um parvovírus com DNA de fita simples que cresce somente em células nas quais certas funções são fornecidas por um vírus auxiliar co-infectante. Há atualmente pelo menos treze sorotipos de AAV que foram caracterizados, conforme mostrado abaixo na Tabela 1. Informações gerais e revisões sobre AAV podem ser encontradas em, por exemplo, Carter, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pág. 169-228 (1989), e Berns, Virology, pág. 1743-1764, Raven Press, (New York, 1990). No entanto, é totalmente esperado que esses mesmos princípios venham a ser aplicáveis a sorotipos adicionais de AAV, uma vez que se sabe bem que os vários sorotipos são bastante relacionados, estrutural e funcionalmente, mesmo em nível genético (Ver, por exemplo, Blacklowe, pág. 165-174 de Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed. (1988); e Rose, Comprehensive Virology 3:1-61 (1974)). Por exemplo, todos os sorotipos de AAV exibem aparentemente propriedades de replicação muito semelhantes mediadas por genes rep homólogos; e todos carregam três proteínas relacionadas do capsídeo tais como aquelas expressas em AAV6. O grau de afinidade é ainda sugerido pela análise de heteroduplex que revela extensa hibridização cruzada entre os sorotipos ao longo do comprimento do genoma; e a presença de segmentos análogos de auto-anelamento nas terminações que correspondem a “sequências de repetições terminais invertidas” (ITRs). Os padrões semelhantes de infectividade também sugerem que as funções de replicação em cada sorotipo estão sob controle regulador semelhante.
Um “vetor AAV”, neste relatório descritivo, refere- se a um vetor que compreende um ou mais polinucleotídeos de interesse (ou transgenes) que são flanqueados por sequências de repetições terminais (ITRs) de AAV. Tais vetores AAV podem ser replicados e empacotados em partículas virais infecciosas quando presentes em uma célula hospedeira que foi transfectada com um vetor que codifica e expressa os produtos dos genes rep e cap.
Um “vírion AAV” ou “partícula viral de AAV” ou “partícula de vetor AAV” ou “vírus AAV” refere-se a uma partícula viral composta por pelo menos uma proteína do capsídeo de AAV e um vetor de polinucleotídeo de AAV envolvido em capsídeo. Se compreende um polinucleotídeo heterólogo (ou seja, um polinucleotídeo diferente de um genoma de AAV do tipo selvagem, como um transgene a ser entregue a uma célula de mamífero), a partícula é tipicamente referida como uma “partícula de vetor AAV” ou simplesmente um “vetor AAV”. Assim, a produção da partícula de vetor AAV inclui necessariamente a produção do vetor AAV, uma vez que tal vetor está contido em uma partícula de vetor AAV.
Os genes “rep” e “cap” de AAV são genes que codificam proteínas da replicação e encapsidação, respectivamente. Os genes rep e cap de AAV foram encontrados em todos os sorotipos de AAV examinados até o momento, e são descritos e nas referências citadas. No AAV do tipo selvagem, os genes rep e cap são geralmente encontrados adjacentes um ao outro no genoma viral (ou seja, são “acoplados” junto como unidades adjacentes ou sobrepostas da transcrição), e são em geral conservadas entre os sorotipos de AAV. Os genes rep e cap de AAV são também individual e coletivamente referidos como “genes do empacotamento de AAV”. O gene cap de AAV de acordo com a presente invenção codifica uma proteína Cap que é capaz de empacotar vetores AAV na presença de função rep e adeno e é capaz de ligar-se a receptores celulares alvo. Em algumas modalidades, o gene cap de AAV codifica uma proteína do capsídeo tendo uma sequência de aminoácidos derivada de um sorotipo de AAV em particular, por exemplo, os sorotipos mostrados na Tabela 1.
Tabela 1. Sorotipos de AAV Sorotipo de AAV No de acesso no Genbank AAV-1 NC_002077.1 AAV-2 NC_001401.2 AAV-3 NC_001729.1 AAV-3B AF028705.1 AAV-4 NC_001829.1 AAV-5 NC_006152.1 AAV-6 AF028704.1 AAV-7 NC_006260.1 AAV-8 NC_006261.1 AAV-9 AX753250.1 AAV-10 AY631965.1 AAV-11 AY631966.1 AAV-12 DQ813647.1 AAV-13 EU285562.1
As sequências de AAV empregadas para a produção de AAV podem ser derivadas do genoma de qualquer sorotipo de AAV. Em geral, os sorotipos de AAV têm sequências genômicas de homologia significativa em nível de aminoácido e de ácido nucleico, fornecem um conjunto semelhante de funções genéticas, produzem vírions que são essencialmente equivalentes em termos físicos e funcionais e replicam e montam-se por mecanismos praticamente idênticos. Para a sequência genômica de sorotipos de AAV e uma discussão sobre as similaridades genômicas, ver, por exemplo, Número de acesso GenBank U89790; Número de acesso GenBank J01901; Número de acesso GenBank AF043303; Número de acesso GenBank AF085716; Chlorini et al., J. Vir. 71:6823- 33(1997); Srivastava et al., J. Vir. 45:555-64 (1983); Chlorini et al., J. Vir. 73:1309-1319 (1999); Rutledge et al., J. Vir. 72:309-319 (1998); e Wu et al., J. Vir. 74: 8635-47 (2000).
A organização genômica de todos os sorotipos conhecidos de AAV é muito semelhante. O genoma de AAV é uma molécula de DNA linear de fita simples com menos de aproximadamente 5.000 nucleotídeos (nt) de comprimento. Repetições terminais invertidas (ITRs) flanqueiam as sequências nucleotídicas únicas de codificação para as proteínas de replicação não estruturais (Rep) e as proteínas estruturais (VP). As proteínas VP formam o capsídeo. Os 145 nt terminais se auto-complementam e são organizados de modo que um duplex intramolecular energeticamente estável formando um grampo de cabelo (hairpin) em formato de T possa ser formado. Essas estruturas em grampo de cabelo funcionam como uma origem para replicação do DNA viral, servindo como primers (iniciadores) para o complexo celular com DNA polimerase. Os genes Rep codificam as proteínas Rep, Rep78, Rep68, Rep52 e Rep40. Rep78 e Rep68 são transcritas a partir do promotor p5, e Rep 52 e Rep40 são transcritas a partir do promotor p19. Os genes cap codificam as proteínas VP, VP1, VP2 e VP3. Os genes cap são transcritos a partir do promotor p40.
Em algumas modalidades, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína do capsídeo de AAV é operacionalmente ligada a sequências reguladoras de controle da expressão para expressão em um tipo de célula específica, tal como células Sf9 ou HEK. Técnicas conhecidas pelo entendido no assunto para a expressão de genes exógenos em células hospedeiras de insetos ou células hospedeiras de mamíferos podem ser utilizadas na prática da invenção. A metodologia para engenharia molecular e expressão de polipeptídeos em células de insetos é descrita, por exemplo, em Summers e Smith. A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bull. No. 7555, College Station, Tex. (1986); Luckow. 1991. Em Prokop et al., Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors' Recombinant DNA Technology and Applications, 97-152 (1986); King, L. A. e R. D. Possee, The baculovirus expression system, Chapman e Hall, United Kingdom (1992); O'Reilly, D. R., L. K. Miller, V. A. Luckow, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York (1992); W.H. Freeman e Richardson, C. D., Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, volume 39 (1995); Patente U.S. No 4 745 051; US2003148506; e WO 03/074714. Um promotor especialmente adequado para a transcrição de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína do capsídeo de AAV é, p.
ex., o promotor poliédrico. No entanto, outros promotores que são ativos em células de insetos são conhecidos na técnica, p. ex., os promotores p10, p35 ou IE-1 e promotores adicionais são descritos nas referências acima são também contemplados.
O uso de células de inseto para a expressão de proteínas heterólogas é bem documentado, como o são os métodos para introduzir ácidos nucleicos, tais como vetores, p. ex., vetores compatíveis com células de insetos, em tais células e métodos para manter tais células em cultura. Ver, por exemplo, Methods in Molecular Biology, ed. Richard, Humana Press, NJ (1995); O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, Oxford Univ. Press (1994); Samulski et al., J. Vir. 63:3822-8 (1989); Kajigaya et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88:4646-50 (1991); Ruffing et al., J. Vir. 66:6922-30 (1992); Kirnbauer et al., Vir. 219:37-44 (1996); Zhao et al., Vir. 272:382-93 (2000); e Samulski et al., Patente U.S. No 6 204
059. Em algumas modalidades, o AAV que codifica a construção de ácido nucleico em células de inseto é um vetor compatível com células de insetos. Um “vetor compatível com células de insetos” ou “vetor”, neste relatório descritivo, refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transformação produtiva ou transfecção de um inseto ou célula de inseto. Os vetores biológicos exemplares incluem plasmídeos, moléculas de ácido nucleico linear e vírus e recombinantes. Qualquer vetor pode ser empregado desde que seja compatível com células de insetos. O vetor pode integrar-se no genoma da célula de inseto, mas a presença do vetor na célula de inseto não precisa ser permanente, e vetores epissomais transitórios estão incluídos também. Os vetores podem ser introduzidos por qualquer meio conhecido, por exemplo, por tratamento químico das células, eletroporação ou infecção. Em algumas modalidades, o vetor é um baculovírus, um vetor ou um plasmídeo. Em uma modalidade mais preferida, o vetor é um baculovírus, ou seja, a construção é um vetor baculoviral. Vetores baculovirais e métodos para o seu uso são descritos nas referências citadas acima sobre engenharia molecular de células de insetos.
Os baculovírus são vírus de DNA com envelope de artrópodes, sendo dois de seus membros vetores de expressão bem conhecidos para a produção de proteínas recombinantes em culturas de células. Os baculovírus possuem genomas circulares de fita dupla (80-200 kbp) que podem ser criados para permitir a entrega de grande teor genômico a células específicas. Os vírus usados como um vetor são geralmente o nucleopoliedrovírus multicapsídeo que infecta Autographa californica (AcMNPV) ou Bombyx mori (BmNPV) (Kato et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 85(3):459-470 (2010)). Os baculovírus são comumente usados na infecção de células de insetos para a expressão de proteínas recombinantes. Em particular, a expressão de genes heterólogos em insetos pode ser realizada como descrito em, por exemplo, a Patente U.S. No 4 745 051; Friesen et al (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 131:31-49. (1986); EP 127,839; EP 155,476; Miller et al., Ann. Rev. of Microbiol. 42: 177-199 (1988); Carbonell et al., Gene 73(2):409-18 (1988); Maeda et al., Nature 315(6020):592-4 (1985); Lebacq-Verheyden et al., Mol. Cell. Biol. 8(8):3129-35 (1988); Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 82(24):8404-8 (1985); Miyajima et al., Gene 58(2-3):273- 81 (1987); e Martin et al., DNA 7(2):99-106 (1988). Inúmeras cepas e variantes de baculovírus e células hospedeiras de insetos permissivas correspondentes que podem ser utilizadas para a produção de proteínas são descritas em Luckow et al., Nature Biotechnology 6:47-55 (1988), e Maeda et al., Nature 315(6020):592-4 (1985).
Nova proteína do capsídeo de AAV Em um primeiro aspecto, a invenção provê novas proteínas do capsídeo de AAV que foram isoladas de vários tecidos de mamíferos. As novas proteínas do capsídeo VP1 de AAV são fornecidas como SEQ ID NOS:1-7 e as localizações das regiões VP2 e VP3 associadas são aqui descritas. A invenção também provê polinucleotídeos que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica essas novas proteínas do capsídeo de AAV. A invenção provê as sequências de aminoácidos das novas proteínas do capsídeo de AAV (aqui referidas coletivamente como as “proteínas do capsídeo de AAV da invenção”), e as sequências de ácido nucleico que codificam as proteínas do capsídeo de AAV da invenção. São também providos os fragmentos dessas sequências de ácido nucleico e aminoácidos do capsídeo de AAV da invenção. Cada uma dessas sequências pode ser rapidamente utilizada em uma variedade de sistemas de vetores e células hospedeiras. Os fragmentos desejáveis das proteínas do capsídeo VP1 incluem VP2, VP3 e regiões variáveis, o domínio GBS e a alça GH, e sequências polinucleotídicas que codificam essas proteínas. Esses fragmentos podem ser rapidamente utilizados em uma variedade de sistemas de vetores e células hospedeiras. Tais fragmentos podem ser utilizados isoladamente, em combinação com outras sequências ou fragmentos de AAV ou em combinação com elementos de sequências de outros AAV ou virais não de AAV. Em uma modalidade especialmente desejável, um vetor contém as sequências do capsídeo de AAV da invenção.
As sequências do capsídeo de AAV da invenção e fragmentos das mesmas são úteis na produção de rAAV, e são igualmente úteis como vetores antisense de entrega, vetores de terapia gênica ou vetores vacinais. A invenção provê ainda moléculas de ácido nucleico, vetores para a entrega de genes e células hospedeiras que contém as novas sequências do capsídeo de AAV da invenção.
Fragmentos adequados podem ser determinados utilizando as informações aqui fornecidas. Os alinhamentos são realizados empregando qualquer um de uma variedade de Programas de Alinhamento de Múltiplas Sequências disponíveis pública ou comercialmente, tais como “Clustal W”, acessível através de Servidores da Rede na Internet. Alternativamente, as utilidades do Vector NTI são igualmente utilizadas. Existem também vários algoritmos conhecidos na técnica que podem ser usados para medir a identidade de sequências de nucleotídeo, incluindo aqueles contidos nos programas descritos acima. Como outro exemplo, sequências de polinucleotídeos podem ser comparadas usando o FASTA, um programa em GCG Versão 6.1. O FASTA proporciona alinhamentos e o percentual de identidade de sequências das regiões da melhor sobreposição entre as sequências query (consulta) e search (pesquisa). Por exemplo, o percentual de identidade de sequência entre sequências de ácidos nucleicos pode ser determinado utilizando o FASTA com seus parâmetros padrão (tamanho de palavra de 6 e o fator NOPAM para a matriz de pontuação) como fornecidos em GCG Versão 6.1, aqui incorporado por referência. Existem programas semelhantes disponíveis para sequências de aminoácidos, p. ex., o programa “Clustal X”. Ferramentas adicionais para o alinhamento de sequências que podem ser usadas são fornecidas por (alinhamento de sequências de proteínas; (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)) e (alinhamento de ácidos nucleicos; http://www.ebi.ac.uk/Tools /psa/emboss_needle/nucleotide.html)). Em geral, qualquer um desses programas são usados com configurações padrão, embora o técnico no assunto possa alterar essas configurações se necessário. Alternativamente, o técnico no assunto pode utilizar outro algoritmo ou programa de computador que forneça pelo menos o nível de identidade ou alinhamento como aquele fornecido pelos algoritmos e programas citados.
Os termos “identidade substancial”, “homologia substancial” ou “similaridade substancial”, quando se referirem a um ácido nucleico, ou fragmento do mesmo, indica que, quando otimamente alinhado com as inserções ou deleções adequadas de nucleotídeos com outro ácido nucleico (ou sua fita complementar), há identidade de sequência de nucleotídeos em pelo menos aproximadamente 95 a 99% das sequências alinhadas, tal como 95% de identidade, 96% de identidade, 97% de identidade, 98% de identidade e 99% de identidade. De preferência, a homologia é ao longo da extensão toda das duas sequências em comparação, ou uma fase de leitura aberta das mesmas, ou outro fragmento adequado que tenha pelo menos 15 nucleotídeos de comprimento. Exemplos de fragmentos adequados são aqui descritos. Estão também incluídas nas sequências de ácidos nucleicos as variantes naturais e as modificações criadas dos ácidos nucleicos que codificam os capsídeos de AAV da invenção e sua fita complementar. Tais modificações incluem, por exemplo, marcações que são conhecidas na técnica, metilação e a substituição de um ou mais dos nucleotídeos naturais por um nucleotídeo degenerado.
Os termos “identidade substancial”, “homologia substancial” ou “similaridade substancial”, quando se referirem a aminoácidos ou fragmentos dos mesmos, indica que, quando otimamente alinhado com as inserções ou deleções adequadas de aminoácidos com outro aminoácido (ou sua fita complementar), há identidade de sequência de aminoácidos em pelo menos 95 a 99% das sequências alinhadas, tal como 95% de identidade, 96% de identidade, 97% de identidade, 98% de identidade e 99% de identidade. De preferência, a homologia é ao longo da extensão toda das duas sequências em comparação, ou uma proteína das mesmas, p. ex., uma proteína cap, uma proteína rep ou um fragmento das mesmas que tenha pelo menos 8 aminoácidos, ou mais desejavelmente, pelo menos 15 aminoácidos de comprimento. Exemplos de fragmentos adequados são aqui descritos.
Pelo termo “altamente conservado”, entende-se pelo menos 80% de identidade, de preferência pelo menos 90% de identidade e mais preferivelmente acima de 97% de identidade. A identidade é rapidamente determinada pelo técnico no assunto com recurso de algoritmos e programas de computador conhecidos pelos técnicos no assunto.
O termo “percentual de identidade de sequência” ou “idêntica”, no contexto de sequências de ácidos nucleicos ou sequências de aminoácidos refere-se aos resíduos nas duas sequências que são iguais quando alinhadas para correspondência máxima. A extensão da comparação de identidade de sequência pode ser toda a extensão das duas sequências em comparação, toda a extensão de uma sequência de codificação de um gene ou um fragmento com pelo menos 500 a 5000 nucleotídeos. No entanto, a identidade entre fragmentos menores, p. ex., com pelo menos nove nucleotídeos, normalmente entre pelo menos aproximadamente 20 e 24 nucleotídeos, entre pelo menos aproximadamente 28 e 32 nucleotídeos, pelo menos aproximadamente 36 ou mais nucleotídeos, pode também ser desejada. Do mesmo modo, o “percentual de identidade de sequência” pode ser rapidamente determinado para sequências de aminoácidos ao longo da extensão toda de uma proteína, ou um fragmento da mesma. Adequadamente, um fragmento tem pelo menos 8 aminoácidos de comprimento e pode ter até aproximadamente 700 aminoácidos. Exemplos de fragmentos adequados são aqui descritos.
Os novos capsídeos da invenção podem compreender uma ou mais substituições conservadoras adicionais de aminoácidos que não afetam a atividade biológica e/ou imunogênica do polipeptídeo. O termo “substituição conservadora de aminoácido” refere-se a uma substituição de um resíduo de aminoácido nativo por um resíduo não ativo, incluindo aminoácidos naturais e não naturais, de tal modo que tenha pouco ou nenhum efeito sobre a polaridade ou carga do resíduo de aminoácido naquela posição. Por exemplo, uma substituição conservadora resulta da substituição de um resíduo não polar em um polipeptídeo por qualquer outro resíduo não polar. Além disso, qualquer resíduo nativo no polipeptídeo pode também ser substituído por alanina, de acordo com os métodos de “mutagênese através de varredura por alanina (alanine scanning)”. Os aminoácidos naturais são caracterizados com base em suas cadeias laterais como segue: básicos: arginina, lisina, histidina; ácidos: ácido glutâmico, ácido aspártico; polares sem carga: glutamina, asparagina, serina, treonina, tirosina; e não polares: fenilalanina, triptofano, cisteína, glicina, alanina, valina, prolina, metionina, leucina, norleucina, isoleucina. As regras gerais para substituições de aminoácidos são apresentadas na Tabela abaixo.
Substituições conservadoras de aminoácidos Resíduos Substituições Substituição originais exemplares preferida Ala Val, Leu, Ile Val Arg Lys, Gln, Asn Lys Asn Gln Gln Asp Glu Glu Cys Ser, Ala Ser Gln Asn Asn Glu Asp Asn Gly Pro, Ala Ala His Asn, Gln, Lys, Arg Arg Ile Leu, Val, Met, Ala, Leu Leu Phe, Norleucine Norleucine, Ile, Leu Lys Val, Arg, Met, 1,4 Ala, Phe Arg Met Diaminobutyric Leu, Phe, Ile Leu Phe Acid, Leu, Val,Gln, Ile,Asn Ala, Arg Pro Ala Tyr Gly Ser Thr, Ala, Cys Thr Thr Ser Ser Trp Tyr, Phe Tyr
Resíduos Substituições Substituição originais exemplares preferida Tyr Trp, Phe, Thr, Ser Phe Val Ile, Met, Leu, Phe, Leu Ala, Norleucine Os novos capsídeos da invenção podem ser codificados por polinucleotídeos que são substancialmente equivalentes à sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-7. Os polinucleotídeos de acordo com a invenção podem ter, p. ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% ou 89%, mais tipicamente pelo menos 90%, 91%, 92%, 93% ou 94% e ainda mais tipicamente pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com as sequências de polinucleotídeos que codificam as sequências de aminoácidos de polipeptídeos modificados da invenção.
Estão incluídos no âmbito das sequências de ácido nucleico da invenção fragmentos de sequências de ácido nucleico que hibridizam sob condições rigorosas com as sequências de nucleotídeos que codificam os novos capsídeos da invenção, em que o fragmento é maior do que aproximadamente 5 nucleotídeos, de preferência 7 nucleotídeos, mais preferivelmente maior do que 9 nucleotídeos e, o mais preferível, maior do que 17 nucleotídeos. Contemplam-se fragmentos de, p. ex., 15, 17, 20 nucleotídeos ou mais que sejam seletivos (ou seja, hibridizam especificamente com qualquer um dentre os polinucleotídeos da invenção). Sondas capazes de hibridizar especificamente com um polinucleotídeo podem diferenciar sequências de polinucleotídeos da invenção de outras sequências de polinucleotídeos na mesma família de genes ou podem diferenciar genes de outros genes bacterianos e são, preferivelmente, baseadas em sequências únicas de nucleotídeos.
O termo “rigoroso” é usado para se referir a condições que são comumente entendidas na técnica como rigorosas. O rigor da hibridização é determinado principalmente pela temperatura, força iônica e a concentração de agentes desnaturantes tais como formamida. Exemplos de condições rigorosas para hibridização e lavagem são cloreto de sódio 0,015 M, citrato de sódio 0,0015M a 65-68 ºC ou cloreto de sódio 0,015 M, citrato de sódio 0,0015M e formamida 50% a 42 ºC. Ver Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edição, Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N.Y. 1989). Condições mais rigorosas (como temperatura mais alta, força iônica menor, teor maior de formamida ou outro agente desnaturante) podem também ser utilizadas, no entanto, a taxa de hibridização será afetada. Em casos em que a hibridização de desoxioligoligonucleotídeos está relacionada, as condições rigorosas adicionais exemplares de hibridização incluem lavagem em 6xSSC pirofosfato de sódio 0,05% a 37 ºC (para oligos de 14 bases), 48 ºC (para oligos de 17 bases), 55 ºC (para oligos de 20 bases) e 60 ºC. (para oligos de 23 bases).
Outros agentes podem ser incluídos nos tampões de hibridização e lavagem com a finalidade de reduzir hibridização inespecífica e/ou de fundo. Os exemplos são albumina sérica bovina 0,1%, polivinilpirrolidona 0,1%, pirofosfato de sódio 0,1%, dodecilsulfato de sódio 0,1%, NaDodSO4 (SDS), ficoll, solução de Denhardt, DNA do esperam de salmão sonicado (ou outro
DNA não complementar) e sulfato de dextrano, embora outros agentes adequados possam também ser usados. A concentração e tipos desses aditivos podem ser alterados sem afetar substancialmente o rigor das condições de hibridização. Os experimentos de hibridização são normalmente realizados em pH 6,8-7,4, no entanto, em condições típicas de força iônica, a taxa de hibridização é quase independente do pH. Ver Anderson et al., Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, Capítulo 4, IRL Press Limited (Oxford, Inglaterra). As condições de hibridização podem ser ajustadas pelo técnico no assunto a fim de acomodar essas variáveis e permitir que DNAs com diferentes afinidades de sequência formem híbridos.
Como aqui descrito, os vetores da invenção que contêm ou compreendem as proteínas do capsídeo de AAV da invenção são especialmente bem adequados para o uso em aplicações nas quais os anticorpos neutralizantes diminuem a eficácia de vetores com base em outros sorotipos de AAV, bem como outros vetores virais. Os vetores rAAV da invenção são especialmente vantajosos na readministração de rAAV e repetição da terapia gênica.
São igualmente incluídos na invenção fragmentos dos ácidos nucleicos que codificam as proteínas do capsídeo de AAV da invenção, as suas fitas complementares, o cDNA e o RNA complementar ao mesmo. Os fragmentos adequados têm pelo menos 15 nucleotídeos de comprimento, e abrangem fragmentos funcionais, ou seja, fragmentos que são de interesse biológico. Tais fragmentos incluem as sequências que codificam as três proteínas variáveis (VP) do capsídeo que são variantes de splicing alternativo: VP1, VP2 e VP3. Outros fragmentos adequados dos ácidos nucleicos que codificam os capsídeos de AAV da invenção incluem o fragmento que contém o códon de partida para a proteína do capsídeo, e os fragmentos que codificam as regiões variáveis da proteína do capsídeo VP1, os quais são aqui descritos.
A invenção não se limita às sequências de aminoácidos do capsídeo de AAV, peptídeos e proteínas expressas a partir das sequências de ácido nucleico de AAV da invenção e abrange sequências de aminoácidos, peptídeos e proteínas gerados por outros métodos conhecidos na técnica, incluindo, p. ex., por síntese química, por outras técnicas sintéticas ou por outros métodos. Por exemplo, as sequências de qualquer um dos capsídeos aqui descritos podem ser rapidamente geradas utilizando uma variedade de técnicas.
Técnicas de produção adequadas são bem conhecidas pelos técnicos no assunto. Ver, p. ex., Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, N.Y.). Alternativamente, peptídeos podem igualmente ser sintetizados pelos métodos bem conhecidos de síntese de peptídeos em fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149 (1962); Stewart e Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman, (San Francisco, 1969) pág. 27-62. Esses e outros métodos adequados de produção fazem parte do conhecimento dos técnicos no assunto e não constituem uma limitação da presente invenção.
O capsídeo de AAV é composto por três proteínas, VP1, VP2 e VP3, que são variantes de splicing alternativo. A sequência completa do capsídeo é referida como VP1 e abrange as variantes de splicing referidas como VP2 e VP3. A invenção também provê outros fragmentos funcionais das proteínas do capsídeo de AAV da invenção. Outros fragmentos desejáveis da proteína do capsídeo incluem as regiões variáveis (VR), as regiões constantes que estão localizadas entre as regiões variáveis, o domínio GBS e a alça GH. Outros fragmentos desejáveis da proteína do capsídeo incluem os próprios HPV.
Desenvolveu-se um algoritmo para determinar áreas de divergência de sequência em AAV2. (Chiorini et al, J. Virol, 73:1309-19 (1999); Rutledge et al, J. Virol., 72:309-319 (1998)). Com o uso desse algoritmo e/ou das técnicas de alinhamento aqui descritas, a VR das novas sequências do capsídeo de AAV são determinadas. Com o alinhamento aqui fornecido realizado utilizando o programa Clustal X com configurações padrão, ou usando outros programas de alinhamento comercial ou publicamente disponíveis, o técnico no assunto pode determinar rapidamente fragmentos correspondentes dos novos capsídeos de AAV da invenção.
Adequadamente, fragmentos de uma proteína do capsídeo de AAV têm pelo menos 8 aminoácidos de comprimento, pelo menos 9 aminoácidos de comprimento, pelo menos 10 aminoácidos de comprimento, pelo menos 20 aminoácidos de comprimento, 30 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 50 aminoácidos de comprimento, pelo menos 75 aminoácidos de comprimento, pelo menos 100 aminoácidos de comprimento ou 200 aminoácidos de comprimento ou 250 aminoácidos de comprimento ou 300 aminoácidos de comprimento ou 350 aminoácidos de comprimento ou 400 aminoácidos de comprimento. No entanto, fragmentos de outros comprimentos desejados podem ser rapidamente utilizados. Todos os fragmentos da invenção retêm a atividade biológica de uma proteína do capsídeo de AAV. Tais fragmentos podem ser produzidos por recombinação ou por outros meios adequados, p. ex., síntese química.
As sequências, proteínas e fragmentos da invenção podem ser produzidos por qualquer meio adequado, incluindo produção recombinante, síntese química ou outros meios sintéticos. Tais métodos de produção fazem parte do conhecimento dos técnicos no assunto e não constituem uma limitação da presente invenção.
Além de e incluindo as sequências de ácido nucleico fornecidas nas figuras e na Listagem de Sequências, a presente invenção inclui moléculas de ácido nucleico e sequências que são desenhadas para expressar as sequências de aminoácidos, proteínas e peptídeos das proteínas do capsídeo de AAV da invenção. Assim, a invenção inclui sequências de ácido nucleico que codificam as sequências de aminoácidos seguintes do capsídeo de AAV e proteínas artificiais do capsídeo de AAV geradas utilizando essas sequências e/ou fragmentos únicos das mesmas.
Produção de AAV com as proteínas do capsídeo da invenção A invenção abrange sequências de proteínas do capsídeo de AAV os ácidos nucleicos que codificam essas proteínas que são livres de DNA e/ou material celular com os quais esses vírus estão associados na natureza. Em outro aspecto, a presente invenção provê moléculas que utilizam as novas sequências de AAV da invenção, incluindo fragmentos das mesmas, para a produção de moléculas úteis na entrega de um gene heterólogo ou outras sequências de ácido nucleico a uma célula alvo.
Em outro aspecto, a presente invenção provê moléculas que utilizam as sequências de proteínas do capsídeo de AAV da invenção, incluindo fragmentos das mesmas, para a produção de vetores virais úteis na entrega de um gene heterólogo ou outras sequências de ácido nucleico a uma célula alvo.
As moléculas da invenção que contêm sequências de ácido nucleico do capsídeo de AAV incluem qualquer elemento genético (vetor) que pode ser entregue para uma célula hospedeira, p. ex., DNA naked, um plasmídeo, fago, transposon, cosmídeo, epissoma, uma proteína em um veículo de entrega não viral (p. ex., um transportador à base de lipídio), vírus etc. que transferem as sequências ali carregadas. O vetor selecionado pode ser entregue por qualquer método adequado, incluindo transfecção, eletroporação, entrega de lipossomos, técnicas de fusão à membrana, pellets revestidos com DNA em alta velocidade, infecção viral e fusão com protoplastos. Os métodos usados para gerar qualquer modalidade desta invenção são conhecidos pelos técnicos no assunto da manipulação de ácidos nucleicos e incluem engenharia genética, engenharia recombinante e técnicas sintéticas. Ver, p. ex., Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
Em uma modalidade, os vetores da invenção contêm, no mínimo, sequências que codificam o capsídeo de AAV da invenção ou um fragmento das mesmas. Em outra modalidade, os vetores da invenção contêm, no mínimo, sequências que codificam uma proteína rep de AAV ou um fragmento das mesmas. Opcionalmente, tais vetores podem conter ambas as proteínas cap e rep de AAV. Em vetores nos quais ambas rep e cap de AVV são providas, as sequências de rep e cap de AAV podem ser ambas da mesma origem de sorotipo de AAV. Alternativamente, a presente invenção provê vetores nos quais as sequências de rep são de um sorotipo de AAV que difere daquele que está fornecendo as sequências de cap. Em uma modalidade, as sequências de rep e cap são expressas a partir de fontes separadas (p. ex., vetores separados, ou uma célula hospedeira e um vetor). Em outra modalidade, essas sequências de rep são fundidas na mesma fase (in frame) que as sequências de cap de um sorotipo diferente de AAV para formar um vetor AAV quimérico.
Assim, em uma modalidade, os vetores aqui descritos contêm sequências de ácidos nucleicos que codificam uma proteína intacta do capsídeo de AAV de qualquer uma dentre sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 1-7. Em outro exemplo, pode ser desejável alterar o códon de partida da proteína VP3 para GTG. Alternativamente, o rAAV pode conter uma ou mais das regiões variáveis de uma ou mais das proteínas do capsídeo de AAV da invenção, ou outros fragmentos. Essas modificações podem ser para aumentar a expressão, o rendimento e/ou para melhorar a purificação nos sistemas selecionados para expressão, ou para outra finalidade desejada (p. ex., para mudar o tropismo ou alterar epítopos de anticorpos neutralizantes).
Os vetores aqui descritos, p. ex., um plasmídeo, são úteis para uma variedade de propósitos, mas são especialmente bem adequados para uso na produção de um rAAV contendo um capsídeo que compreende sequências de AAV ou um fragmento das mesmas. Esses vetores, incluindo rAAV, seus elementos, construção e usos são descritos detalhadamente no presente.
VP1 de novas proteínas do capsídeo Novas proteínas VP1 do capsídeo de AAV foram isoladas do fígado de babuínos.
A sequência de VP1 de um novo capsídeo de AAV isolado de babuíno (indicada como Bba.45) é apresentada como SEQ ID NO:1 (aminoácidos 1-742) e as localizações das regiões variáveis associadas e regiões GBS e da alça GH são definidas na Tabela 2 abaixo. A proteína VP2 do capsídeo abrange os aminoácidos 138- 742 de SEQ ID NO:1 e a proteína VP3 do capsídeo abrange os aminoácidos 206-742 de SEQ ID NO:1.
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANRQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKG EPVNEADAAALEHDKAYDQQLKSGDNPYLKYNHADAEFQQRLATDTSFGGNLGKAVFQAKKR ILEPLGLVEEGVKTAPGKKRPLEKTPNRPTNPDSGKAPAKKKQKDGETADSARRALDFEDSG AGDGPPEGSSSGEMSHDAEMRAAPGGNAVEAGQGADGVGNASGDWHCDSTWSEGRVTTTSTR TWVLPTYNNHLYLRIGTTANSNTYNGFSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGLRPKS MRVKIFNIQVREVTTSNGETTVANNLTSTVQIFADSTYELPYVMDAGQEGSLPPFPNDVFMV PQYGYCGVVTGENQNQTDRNAFYCLEYFPSQMLRTGNNFEISYQFEKVPFHSMYAHSQSLDR MMNPLLDQYLWHLQSTTTGNSLNQGTATTTYGKITTGDFAYYRKNWLPGACIKQQKFSKNAS QNYKIPASGGDALLKYDTHTTLNGRWSNMAPGPPMATAGAGDSDFSNSQLIFAGPNQSGNTT TSSNNLLFTSEEEIATTNPRDTDMFGQIADNNQNATTAPHIANLDAMGIVPGMVWQNRDIYY QGPIWAKVPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIFIKNTPVPANPNTTFSAARINSFLTQYST
GQVAVQIDWEIQKEHSKRWNPEVQFTSNYGTQNSMLWAPDNAGNYHEPRAIGSRFLTHHL A sequência de VP1 de um novo capsídeo de AAV isolado de babuíno (indicado como Bba.46) é apresentada como SEQ ID NO:2 (aminoácidos 1-742) e as localizações das regiões variáveis associadas e regiões GBS e da alça GH são definidas na Tabela 2 abaixo. A proteína VP2 do capsídeo abrange os aminoácidos 138- 742 de SEQ ID NO:2 e a proteína VP3 do capsídeo abrange os aminoácidos 206-742 de SEQ ID NO:2.
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKG EPVNEADAAALEHDKAYDQQLKSGDNPYLKYNHADAEFQQRLATDTSFGGNLGKAVFQAKKR ILEPLGLVEEGVKTAPGKKRPLEKTPNRPTNPDSGKAPAKKKQKDGETADSARRTLDFEDSG AGDGPPEGSSSGEMSHDAEMRAAPGGNAVEAGQGADGVGNASGDWHCDSTWSEGRVTTTSTR TWVLPTYNNHLYLRIGTTANSNTYNGFSTPWGCFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGLRPKS MRVKIFNIQVKEVTTSNGETTVANNLTSTVQIFADSTYELPYVMDAGQEGSLPPFPNDVFMV PQYGYCGVVTGENQNQTDRNAFYCLEYFPSQMLRTGNNFEISYQFEKVPFHSMYAHSQSLDR MMNPLLDQYLWHLQSTTTGNSLNQGAATTTYGKITTGDFAYYRKNWLPGACIKQQKFSKNAS QNYKIPASGGDALLKYDTHTTLNGRWSNMAPGPPMATAGAGDSDFSNSQLIFAGPNQSGNTT TSSNNLLFTSEEEIATTNPRDTDMFGQIADNNQNATTAPHIANLDAMGIVPGMVWQNRDIYY QGPIWAKVPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIFIKNTPVPANPNTTFSAARINSFLTQYST
GQVAVQIDWEIQKEHSKRWNPEVQFTSNYGTQNSMLWAPDNAGNYHEPRAIGSRFLTHHL A sequência de VP1 de um novo capsídeo de AAV isolado de babuíno (indicado como Bba.47) é apresentada como SEQ ID NO:3 (aminoácidos 1-742) e as localizações das regiões variáveis associadas e regiões GBS e da alça GH são definidas na Tabela 2 abaixo. A proteína VP2 do capsídeo abrange os aminoácidos 138-
742 de SEQ ID NO:3 e a proteína VP3 do capsídeo abrange os aminoácidos 206-742 de SEQ ID NO:3.
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKG EPVNEADAAALEHDKAYDQQLKSGDNPYLKYNHADAEFQQRLATDTSFGGNLGKAVFQAKKR ILEPLGLVEEGVKTAPGKKRPLEKTPNRPTNPDSGKAPAKKKQKDGETADSARRTLDFEDSG AGDGPPEGSSSGEMSHDAEMRAAPGGNAVEAGQGADGVGNASGDWHCDSTWSEGRVTTTSTR TWVLPTYNNHLYLRIGTTANSNTYNGFSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGLRPKS MRVKIFNIQVKEVTTSNGETTVANNLTSTVQIFADSTYELPYVMDAGQEGSLPPFPNDVFMV PQYGYCGVVTGENQNQTDRNAFYCLEYFPSQMLRTGNNFEISYQFEKVPFHSMYAHSQSLDR MMNPLLDQYLWHLQSTTTGNSLNQGTATTTYGKITTGDFAYYRKNWLPGACIKQQKFSKNAS QNYKIPASGGDALLKYDTHTTLNGRWSNMAPGPPMATAGAGDSDFSNSQLIFAGPNQSGNTT TSSNNLLFTSEEEIATTNPRDTDMFGQIADNNQNATTAPHIANLDAMGIVPGMVWQNRDIYY QGPIWAKVPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIFIKNTPVPANPNTTFSAARINSFLTQYST
GQVAVQIDWEIQKEHSKRWNPEVQFTSNYGTQNSMLWAPDNAGNYHEPRAIGSRFLTHHL A sequência de VP1 de um novo capsídeo de AAV isolado de babuíno (indicado como Bba.48) é apresentada como SEQ ID NO:4 (aminoácidos 1-742) e as localizações das regiões variáveis associadas e regiões GBS e da alça GH são definidas na Tabela 2 abaixo. A proteína VP2 do capsídeo abrange os aminoácidos 138- 742 de SEQ ID NO:4 e a proteína VP3 do capsídeo abrange os aminoácidos 206-742 de SEQ ID NO:4.
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKG EPVNEADAAALEHDKAYDQQLKSGDNPYLKYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKR ILEPLGLVEEGVKTAPGKKRPLEKTPNRPTNPDSGKAPAKKKQKDGETADSARRTLDFEDSG AGDGPPEGSSSGEMSHDAEMRAAPGGNAVEAGQGADGVGNASGDWHCDSTWSEGRVTTTSTR TWVLPTYNNHLYLRIGTTANSNTYNGFSTPWGYFDFNRFHCRFSPRDWQRLINNNWGLRPKS MRVKIFNIQVKEVTTSNGETTVANNLTSTVQIFADSTYELPYVMDAGQEGSLPPFPNDVFMV PQYGYCGVVTGENQNQTDRNAFYCLEYFPSQMLRTGNNFEISYQFEKVPFHSMYAHSQSLDR MMNPLLDQYLWHLQSTTTGNSLNQGTAITTYGKITTGDFAYYRKNWLPGACIKQQKFSKNAS QNYKIPASGGDALLKYDTHTTLNGRWSNMAPGPPMATAGAGDSDFSNSQLIFAGPNQSGNTT TSSNNLLFTSEEEIATTNPRDTDMFGQIADNNQNAATAPHIANLDAMGIVPGMVWQNRDIYY QGPIWAKVPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIFIKNTPVPANPNTTFSAARINSFLTQYST
GQVAVQIDWEIQKEHSKRWNPEVQFTSNYGTQNSMLWAPDNAGNYHEPRAIGSRFLTHHL A sequência de VP1 de um novo capsídeo de AAV isolado de babuíno (indicado como Bba.49) é apresentada como SEQ ID NO:5 (aminoácidos 1-742) e as localizações das regiões variáveis associadas e regiões GBS e da alça GH são definidas na Tabela 2 abaixo. A proteína VP2 do capsídeo abrange os aminoácidos 138- 742 de SEQ ID NO:5 e a proteína VP3 do capsídeo abrange os aminoácidos 206-742 de SEQ ID NO:5.
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKG EPVNEADAAALEHDKAYDQQLKSGDNPYLKYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKR ILEPLGLVEEGVKTAPGKKRPLEKTPNRPTNPDSGKAPAKKKQKDGETADSARRTLDFEDSG AGDGPPEGSSSGEMSHDAEMRAAPGGNAVEAGQGADGVGNASGDWHCDSTWSEGRVTTTSTR TWVLPTYNNHLYLRIGTTANSNTYNGFSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGLRPKS MRVKIFNIQVKEVTTSNGETTVANNLTSTVQIFADSTYELPYVMDAGQEGSLPPFPNDVFMV PQYGYCGVVTGENQNQTDRNAFYCLEYFPSQMLRTGNNFEISYQFEKVPFHSMYAHSQSLDR MMNPLLDQYLWHLQSTTTGNSLNQGTAITTYGKITTGDFAYYRKNWLPGAGIKQQKFSKNAS QNYKIPASGGDALLKYDTHTTLNGRWSNMAPGPPMATAGAGDSDFSNSQLIFAGPNQSGNTT TSSNNLLFTSEEEIATTNPRDTDMFGQIADNNQNATTAPHIANLDAMGIVPGMVWQNRDIYY QGPIWAKVPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIFIKNTPVPANPNTTFSAARINSFLTQYST
GQVAVQIDWEIQKEHSKRWNPEVQFTSNYGTQNSMLWAPDNAGNYHEPRAIGSRFLTHHL A sequência de VP1 de um novo capsídeo de AAV isolado de babuíno (indicado como Bba.50) é apresentada como SEQ ID NO:6
(aminoácidos 1-742) e as localizações das regiões variáveis associadas e regiões GBS e da alça GH são definidas na Tabela 2 abaixo. A proteína VP2 do capsídeo abrange os aminoácidos 138- 742 de SEQ ID NO:6 e a proteína VP3 do capsídeo abrange os aminoácidos 206-742 de SEQ ID NO:6.
MAADGYLPDWLEDNLSESIREWWALKPGAPRPKANQQHQDDARGLVLPGYKYLGPGNGLDKG EPVNEADAAALEHDKAYDQQLKSGDNPYLKYNHADAEFQQRLATDTSFGGNLGKAVFQAKKR ILEPLGLVEEGVKTAPGRKRPLEKTPNRPTNPDSGKAPAKKKQKDGETADSARRTLDFEDSG AGDGPPEGSSSGEMSHDAEMRAAPGGNAVEAGQGADGVGNASGDWHCDSTWSEGRVTTTSTR TWVLPTYNNHLYLRIGTTANSNTYNGFSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGLRPKS MRVKIFNIQVKEVTTSNGETTVANNLTSTVQIFADSTYELPYVMDAGQEGSLPPFPNDVFMV PQYGYCGVVTGENQNQTDRNAFYCLEYFPSQMLRTGNNFEISYQFEKVPLHSMYAHSQSLDR MMNPLLDQYLWHLQSTTTGNSLNQGTATTTYGKITTGDFAYYRKNWLPGACIKQQKFSKNAS QNYKIPASGEDALLKYDTHTTLNGRWSNMAPGPPMATAGAGDSDFSNSQLIFAGPNQSGNTT TSSNNLLFTSEEEIATTNPRDTDMFGQIADNNQNATTAPHIANLDAMGIVPGMVWQNRDIYY QGPIWAKVPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIFIKNTPVPANPNTTFSAARINSFLTQYST
GQVAVQIDWEIQKEHSKRWNPEVQFTSNYGTQNSMLWAPDNAGNYHEPRAIGSRFLTHHL A sequência de VP1 de um novo capsídeo de AAV isolado de babuíno (indicado como Bba.51) é apresentada como SEQ ID NO:7 (aminoácidos 1-742) e as localizações das regiões variáveis associadas e regiões GBS e da alça GH são definidas na Tabela 2 abaixo. A proteína VP2 do capsídeo abrange os aminoácidos 138- 742 de SEQ ID NO:7 e a proteína VP3 do capsídeo abrange os aminoácidos 206-742 de SEQ ID NO:7.
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKG EPVNEADAAALEHDKAYDQQLKSGDNPYLKYNHADAEFQQRLATDTSFGGNLGKAVFQAKKR ILEPLGLVEEGVKTAPGKKRPLEKTPNRPTNPDSGKAPAKKKQKDGETADSARRTLDFEDSG AGDGPPEGSSSGEMSHDAEMRAAPGGNAVEAGQGADGVGNASGDWHCDSTWSEGRVTTTSTR TWVLPTYNNHLYLRIGTTANSNTYNGFSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGLRPKS MRVKIFNIQVKEVTTSNGETTVANNLTSTVQIFADSTYELPYVMDAGQEGSLPPFPNDVFMV PQYGYCGVVTGENQNQTDRNAFYCLEYFPSQMLRTGNNFEISYQFEKVPFHSMYAHSQSLDR MMNPLLDQYLWHLQSTTTGNSLNQGTATTTYGKITTGDFAYYRKNWLPGACIKQQKFSKNAS QNYKIPASGGDALLKYDTHTTLNGRWSNMAPGPPMATAGAGDSDFSNSQLIFAGPNQSGNTT TSSNNLLFTSEEEIATTNPRDTDMFGQIADNNQNATTAPHIANLDAMGIVPGMVWQNRDIYY QGPIWAKVPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIFIKNTPVPANPNTTFSAARINSFLTQYST
GQVAVQIDWEIQKEHSKRWNPEVQFTSNYGTQNSMLWAPDNAGNYHEPRAIGSRFLTHHL As sequências de ácidos nucleicos correspondentes que codificam as proteínas do capsídeo citadas acima são SEQ ID NO:8 / Bba.45; SEQ ID NO:9 / Bba.46; SEQ ID NO:10 / Bba.47; SEQ ID NO:11 / Bba.48; SEQ ID NO:12 / Bba.49; SEQ ID NO:13 / Bba.50; e SEQ ID NO:14 /Bba.51.
SEQ ID NO:8 (Bba.45)
ATGGCTGCTGACGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAAGGCATTCGCGA GTGGTGGGCGCTGAAACCTGGAGCCCCACAGCCCAAGGCAAATCGACAACATCAAGACAACG CTCGGGGTCTTGTGCTTCCGGGTTACAAATACTTGGGACCCGGTAACGGACTCGACAAGGGA GAGCCGGTCAACGAGGCAGACGCCGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCT CAAGTCGGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCGGACGCCGAGTTCCAGCAGCGCT TGGCGACCGACACCTCTTTTGGGGGCAACCTCGGCAAGGCAGTCTTCCAGGCCAAAAAGAGG ATTCTCGAGCCTCTGGGTCTGGTTGAAGAGGGCGTTAAAACGGCTCCTGGAAAGAAACGCCC ATTAGAAAAGACTCCAAATCGGCCGACCAACCCGGACTCTGGGAAGGCCCCGGCCAAGAAAA AGCAAAAAGACGGCGAGACAGCCGACTCTGCTAGAAGGGCACTCGACTTTGAAGACTCTGGA GCAGGAGACGGACCCCCTGAGGGATCATCTTCCGGAGAAATGTCTCATGATGCTGAGATGCG TGCGGCGCCAGGCGGAAATGCTGTCGAGGCGGGACAAGGTGCCGATGGAGTGGGTAATGCCT CCGGTGATTGGCATTGCGATTCCACCTGGTCAGAGGGCCGAGTCACCACCACCAGCACCCGA ACCTGGGTCCTGCCCACCTACAACAACCACCTGTACCTGCGAATCGGAACAACGGCCAACAG CAACACCTACAATGGATTCTCCACCCCCTGGGGATACTTTGACTTTAACCGCTTCCACTGCC ACTTTTCCCCACGCGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGACTCAGGCCGAAATCG ATGCGTGTTAAAATCTTCAACATCCAGGTCAGGGAGGTCACTACGTCAAACGGCGAGACTAC GGTCGCTAATAACCTTACCAGCACGGTTCAGATCTTTGCGGATTCAACGTATGAACTCCCAT ACGTGATGGACGCCGGTCAGGAGGGGAGCCTTCCTCCGTTCCCCAACGACGTGTTTATGGTT CCCCAATACGGGTACTGCGGAGTCGTCACTGGAGAAAACCAGAACCAAACAGACAGAAATGC CTTTTACTGTCTGGAGTACTTTCCATCCCAAATGCTAAGAACTGGCAACAACTTTGAAATCA GTTACCAATTTGAAAAAGTTCCTTTCCATTCAATGTACGCGCACAGCCAGAGCCTGGACAGA ATGATGAATCCTTTGCTGGATCAGTACCTGTGGCATCTGCAATCGACCACTACCGGAAATTC CCTTAATCAAGGAACAGCTACCACCACGTACGGGAAAATTACCACTGGGGACTTTGCCTACT ACAGGAAAAACTGGTTACCTGGAGCCTGCATTAAACAACAAAAATTTTCAAAGAATGCCAGT CAAAACTACAAGATTCCCGCCAGCGGGGGAGACGCCCTTTTAAAGTATGACACGCATACCAC TTTAAATGGGCGATGGAGTAACATGGCTCCTGGTCCTCCAATGGCCACCGCAGGTGCCGGGG ACTCGGATTTTAGCAACAGCCAGCTGATCTTTGCCGGACCCAATCAGAGCGGTAACACGACC ACGTCTTCAAACAATTTGTTGTTTACCTCAGAAGAGGAGATTGCCACAACAAACCCACGAGA CACGGACATGTTTGGACAGATTGCAGATAATAATCAAAATGCCACCACCGCCCCTCACATCG CTAACCTGGACGCTATGGGAATTGTTCCCGGAATGGTCTGGCAAAACAGAGACATCTACTAC CAGGGCCCTATTTGGGCCAAGGTCCCTCACACGGACGGACACTTTCACCCTTCGCCGCTGAT GGGAGGATTTGGACTGAAACACCCGCCTCCGCAGATTTTCATCAAAAACACCCCCGTACCCG CCAATCCCAATACTACCTTTAGCGCTGCAAGGATCAATTCTTTTTTGACGCAGTACAGCACC GGACAAGTCGCCGTTCAGATCGACTGGGAAATTCAGAAGGAGCACTCCAAACGCTGGAATCC CGAAGTCCAATTTACTTCAAACTACGGCACTCAAAATTCTATGCTGTGGGCTCCCGACAACG
CCGGCAACTACCACGAACCCCGGGCTATTGGGTCCCGTTTCCTCACCCACCACTTGTAA SEQ ID NO:9 (Bba.46)
ATGGCTGCTGACGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAAGGCATTCGCGA GTGGTGGGCGCTGAAACCTGGAGCCCCACAGCCCAAGGCAAATCAACAACATCAAGACAACG CTCGGGGTCTTGTGCTTCCGGGTTACAAATACTTGGGACCCGGTAACGGACTCGACAAGGGA GAGCCGGTCAACGAGGCAGACGCCGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCT CAAGTCGGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCGGACGCCGAGTTCCAGCAGCGCT TGGCGACCGACACCTCTTTTGGGGGCAACCTCGGCAAGGCAGTCTTCCAGGCCAAAAAGAGG ATTCTCGAGCCTCTGGGTCTGGTTGAAGAGGGCGTTAAAACGGCTCCTGGAAAGAAACGCCC ATTAGAAAAGACTCCAAATCGGCCGACCAACCCGGACTCTGGGAAGGCCCCGGCCAAGAAAA AGCAAAAAGACGGCGAGACAGCCGACTCTGCTAGAAGGACACTCGACTTTGAAGACTCTGGA GCAGGAGACGGACCCCCTGAGGGATCATCTTCCGGAGAAATGTCTCATGACGCTGAGATGCG TGCGGCGCCAGGCGGAAATGCTGTCGAGGCGGGACAAGGTGCCGATGGAGTGGGTAATGCCT CCGGTGATTGGCATTGCGATTCCACCTGGTCAGAGGGCCGAGTCACCACCACCAGCACCCGA ACCTGGGTCCTGCCCACCTACAACAACCACCTGTACCTGCGAATCGGAACAACGGCCAACAG CAACACCTACAATGGATTCTCCACCCCCTGGGGATGCTTTGACTTTAACCGCTTCCACTGCC ACTTTTCCCCACGCGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGACTCAGGCCGAAATCG ATGCGTGTTAAAATCTTCAACATCCAGGTCAAGGAGGTCACTACGTCAAACGGCGAGACTAC GGTCGCTAATAACCTTACCAGCACGGTTCAGATCTTTGCGGATTCAACGTATGAACTCCCAT ACGTGATGGACGCCGGTCAGGAGGGGAGCCTTCCTCCGTTCCCCAACGACGTGTTTATGGTT CCCCAATACGGGTACTGCGGAGTCGTCACTGGAGAAAACCAGAACCAAACAGACAGAAATGC CTTTTACTGTCTGGAGTACTTTCCATCCCAAATGCTAAGAACTGGCAACAACTTTGAAATCA GTTACCAATTTGAAAAAGTTCCTTTCCATTCAATGTACGCGCACAGCCAGAGCCTGGACAGA ATGATGAATCCTTTGCTGGATCAGTACCTGTGGCATCTGCAATCGACCACTACCGGAAATTC CCTTAATCAAGGAGCAGCTACCACCACGTACGGGAAAATTACCACTGGGGACTTTGCCTACT ACAGGAAAAACTGGTTGCCTGGAGCCTGCATTAAACAACAAAAATTTTCAAAGAATGCCAGT CAAAACTACAAGATCCCCGCCAGCGGGGGAGACGCCCTTTTAAAGTATGACACGCATACCAC TTTAAATGGGCGATGGAGTAACATGGCTCCTGGTCCTCCAATGGCCACCGCAGGTGCCGGGG ACTCGGATTTTAGCAACAGCCAGCTGATCTTTGCCGGACCCAATCAGAGCGGTAACACGACC ACGTCTTCAAACAATTTGTTGTTTACCTCAGAAGAGGAGATTGCCACAACAAACCCACGAGA CACGGACATGTTTGGACAGATTGCAGATAATAATCAAAATGCCACCACCGCCCCTCACATCG CTAACCTGGACGCTATGGGAATTGTTCCCGGAATGGTCTGGCAAAACAGAGACATCTACTAC CAGGGCCCTATTTGGGCCAAGGTCCCTCACACGGACGGACACTTTCACCCTTCGCCGCTGAT GGGAGGATTTGGACTGAAACACCCGCCTCCGCAGATTTTCATCAAAAACACCCCCGTACCCG CCAATCCCAATACTACCTTTAGCGCTGCAAGGATCAATTCTTTTTTGACGCAGTACAGCACC GGACAAGTCGCCGTTCAGATCGACTGGGAAATTCAGAAGGAGCACTCCAAACGCTGGAATCC CGAAGTCCAATTTACTTCAAACTACGGCACTCAAAATTCTATGCTGTGGGCTCCCGACAACG
CCGGCAACTACCACGAACCCCGGGCTATTGGGTCCCGTTTCCTCACCCACCACTTGTAA SEQ ID NO:10 (Bba.47)
ATGGCTGCTGACGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAAGGCATTCGCGA GTGGTGGGCGCTGAAACCTGGAGCCCCACAGCCCAAGGCAAATCAACAACATCAAGACAACG CTCGGGGTCTTGTGCTTCCGGGTTACAAATACTTGGGACCCGGTAACGGACTCGACAAGGGA GAGCCGGTCAACGAGGCAGACGCCGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCT CAAGTCGGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCGGACGCCGAGTTCCAGCAGCGCT TGGCGACCGACACCTCTTTTGGGGGCAACCTCGGCAAGGCAGTCTTCCAGGCCAAAAAGAGG ATTCTCGAGCCTCTGGGTCTGGTTGAAGAGGGCGTTAAAACGGCTCCTGGAAAGAAACGCCC ATTAGAAAAGACTCCAAATCGGCCGACCAACCCGGACTCTGGGAAGGCCCCGGCCAAGAAAA AGCAAAAAGACGGCGAGACAGCCGACTCTGCTAGAAGGACACTCGACTTTGAAGACTCTGGA GCAGGAGACGGACCTCCTGAGGGATCATCTTCCGGAGAAATGTCTCATGATGCTGAGATGCG TGCGGCGCCAGGCGGAAATGCTGTCGAGGCGGGACAAGGTGCCGATGGAGTGGGTAATGCCT CCGGTGATTGGCATTGCGATTCCACCTGGTCAGAGGGCCGAGTCACCACCACCAGCACCCGA ACCTGGGTCCTGCCCACCTACAACAACCACCTGTACCTGCGAATCGGAACAACGGCCAACAG CAACACCTACAATGGATTCTCCACCCCCTGGGGATACTTTGACTTTAACCGCTTCCACTGCC ACTTTTCCCCACGCGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGACTCAGGCCGAAATCG ATGCGTGTTAAAATCTTCAACATCCAGGTCAAGGAGGTCACTACGTCAAACGGCGAGACTAC GGTCGCTAATAACCTTACCAGCACGGTTCAGATCTTTGCGGATTCAACGTATGAACTCCCAT ACGTGATGGACGCCGGTCAGGAGGGGAGCCTTCCTCCGTTCCCCAACGACGTGTTTATGGTT CCCCAATACGGGTACTGCGGAGTCGTCACTGGAGAAAACCAGAACCAAACAGACAGAAATGC CTTTTACTGTCTGGAGTACTTTCCATCCCAAATGCTAAGAACTGGCAACAACTTTGAAATCA GTTACCAATTTGAAAAAGTTCCTTTCCATTCAATGTACGCGCACAGCCAGAGCCTGGACAGA ATGATGAATCCTTTGCTGGATCAGTACCTGTGGCATCTGCAATCGACCACTACCGGAAATTC CCTTAATCAAGGAACAGCTACCACCACGTACGGGAAAATTACCACTGGGGACTTTGCCTACT ACAGGAAAAACTGGTTGCCTGGAGCCTGCATTAAACAACAAAAATTTTCAAAGAATGCCAGT CAAAACTACAAGATTCCCGCCAGCGGGGGAGACGCCCTTTTAAAGTATGACACGCATACCAC TTTAAATGGGCGATGGAGTAACATGGCTCCTGGTCCTCCAATGGCCACCGCAGGTGCCGGGG ACTCGGATTTTAGCAACAGCCAGCTGATCTTTGCCGGACCCAATCAGAGCGGTAACACGACC ACGTCTTCAAACAATTTGTTGTTTACCTCAGAAGAGGAGATTGCCACAACAAACCCACGAGA CACGGACATGTTTGGGCAGATTGCAGATAATAATCAAAATGCCACCACCGCCCCTCACATCG CTAACCTGGACGCTATGGGAATTGTTCCCGGAATGGTCTGGCAAAACAGAGACATCTACTAC CAGGGCCCTATTTGGGCCAAGGTCCCTCACACGGACGGACACTTTCACCCTTCGCCGCTGAT GGGAGGATTTGGACTGAAACACCCGCCTCCGCAGATTTTCATCAAAAACACCCCCGTACCCG CCAATCCCAATACTACCTTTAGCGCTGCAAGGATCAATTCTTTTTTGACGCAGTACAGCACC GGACAAGTCGCCGTTCAGATCGACTGGGAAATTCAGAAGGAGCACTCCAAACGCTGGAATCC CGAAGTCCAATTTACTTCAAACTACGGCACTCAAAATTCTATGCTGTGGGCTCCCGACAACG
CCGGCAACTACCACGAACCCCGGGCTATTGGGTCCCGTTTCCTCACCCACCACTTGTAA SEQ ID NO:11 (Bba.48)
ATGGCTGCTGACGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAAGGCATTCGCGA GTGGTGGGCGCTGAAACCTGGAGCCCCACAGCCCAAGGCAAATCAACAACATCAAGACAACG CTCGGGGTCTTGTGCTTCCGGGTTACAAATACTTGGGACCCGGTAACGGACTCGACAAGGGA GAGCCGGTCAACGAGGCAGACGCCGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCT CAAGTCGGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCGGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTC TTCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAAAAGAGG ATTCTCGAGCCTCTGGGTCTGGTTGAAGAGGGCGTTAAAACGGCTCCTGGAAAGAAACGCCC ATTAGAAAAGACTCCAAATCGGCCGACCAACCCGGACTCTGGGAAGGCCCCGGCCAAGAAAA AGCAAAAAGACGGCGAGACAGCCGACTCTGCTAGAAGGACACTCGACTTTGAAGACTCTGGA GCAGGAGACGGACCCCCTGAGGGATCATCTTCCGGAGAAATGTCTCATGATGCTGAGATGCG TGCGGCGCCAGGCGGAAATGCTGTCGAGGCGGGACAAGGTGCCGATGGAGTGGGTAATGCCT CCGGTGATTGGCATTGCGATTCCACCTGGTCAGAGGGCCGAGTCACCACCACCAGCACCCGA ACCTGGGTCCTGCCCACCTACAACAACCACCTGTACCTGCGAATCGGAACAACGGCCAACAG CAACACCTACAATGGATTCTCCACCCCCTGGGGATACTTTGACTTTAACCGCTTCCACTGCC GCTTTTCCCCGCGCGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGACTCAGGCCGAAATCG ATGCGTGTTAAAATCTTCAACATCCAGGTCAAGGAGGTCACTACGTCAAACGGCGAGACTAC GGTCGCTAATAACCTTACCAGCACGGTTCAGATCTTTGCGGATTCAACGTATGAACTCCCAT ACGTGATGGACGCCGGTCAGGAGGGGAGCCTTCCTCCGTTCCCCAACGACGTGTTTATGGTT CCCCAATACGGGTACTGCGGAGTCGTCACTGGAGAAAACCAGAACCAAACAGACAGAAATGC CTTTTACTGTCTGGAGTACTTTCCATCCCAAATGCTAAGAACTGGCAACAACTTTGAAATCA GTTACCAATTTGAAAAAGTTCCTTTCCATTCAATGTACGCGCACAGCCAGAGCCTGGACAGA ATGATGAATCCTTTGCTGGATCAGTACCTGTGGCATCTGCAATCGACCACTACCGGAAATTC CCTTAATCAAGGAACAGCTATCACCACGTACGGGAAAATTACCACTGGGGACTTTGCCTACT ACAGGAAAAACTGGTTGCCTGGAGCCTGCATTAAACAACAAAAATTTTCAAAGAATGCCAGT CAAAACTACAAGATTCCCGCCAGCGGGGGAGACGCCCTTTTAAAGTATGACACGCATACCAC TTTAAATGGGCGATGGAGTAACATGGCTCCTGGTCCTCCAATGGCCACCGCAGGTGCCGGGG ACTCGGATTTTAGCAACAGCCAGCTGATCTTTGCCGGACCCAATCAGAGCGGTAACACGACC ACGTCTTCAAACAATTTGTTGTTTACCTCAGAAGAGGAGATTGCCACAACAAACCCACGAGA CACGGACATGTTTGGACAGATTGCAGATAATAATCAAAATGCCGCCACCGCCCCTCACATCG CTAACCTGGACGCTATGGGAATTGTTCCCGGAATGGTCTGGCAAAACAGAGACATCTACTAC CAGGGCCCTATTTGGGCCAAGGTCCCTCACACGGACGGACACTTTCACCCTTCGCCGCTGAT GGGAGGATTTGGACTGAAACACCCGCCTCCGCAGATTTTCATCAAAAACACCCCCGTACCCG CCAATCCCAATACTACCTTTAGCGCTGCAAGGATCAATTCTTTTTTGACGCAGTACAGCACC GGACAAGTCGCCGTTCAGATCGACTGGGAAATTCAGAAGGAGCACTCCAAACGCTGGAATCC CGAAGTCCAATTTACTTCAAACTACGGCACTCAAAATTCTATGCTGTGGGCTCCCGACAACG
CCGGCAACTACCACGAACCCCGGGCTATTGGGTCCCGTTTCCTCACCCACCACTTGTAA SEQ ID NO:12 (Bba.49)
ATGGCTGCTGACGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAAGGCATTCGCGA GTGGTGGGCGCTGAAACCTGGAGCCCCACAGCCCAAGGCAAATCAACAACATCAAGACAACG CTCGGGGTCTTGTGCTTCCGGGTTACAAATACTTGGGACCCGGTAACGGACTCGACAAGGGA GAGCCGGTCAACGAGGCAGACGCCGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCT CAAGTCGGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCGGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTC TTCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAAAAGAGG ATTCTCGAGCCTCTGGGTCTGGTTGAAGAGGGCGTTAAAACGGCTCCTGGAAAGAAACGCCC ATTAGAAAAGACTCCAAATCGGCCGACCAACCCGGACTCTGGGAAGGCCCCGGCCAAGAAAA AGCAAAAAGACGGCGAGACAGCCGACTCTGCTAGAAGGACACTCGACTTTGAAGACTCTGGA GCAGGAGACGGACCCCCTGAGGGATCATCTTCCGGAGAAATGTCTCATGATGCTGAGATGCG TGCGGCGCCAGGCGGAAATGCTGTCGAGGCGGGACAAGGTGCCGATGGAGTGGGTAATGCCT CCGGTGATTGGCATTGCGATTCCACCTGGTCAGAGGGCCGAGTCACCACCACCAGCACCCGA ACCTGGGTCCTGCCCACCTACAACAACCACCTGTACCTGCGAATCGGAACAACGGCCAACAG CAACACCTACAATGGATTCTCCACCCCCTGGGGATACTTTGACTTTAACCGCTTCCACTGCC ACTTTTCCCCACGCGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGACTCAGGCCGAAATCG ATGCGTGTTAAAATCTTCAACATCCAGGTCAAGGAGGTCACTACGTCAAACGGCGAGACTAC GGTCGCTAATAACCTTACCAGCACGGTTCAGATCTTTGCGGATTCAACGTATGAACTCCCAT ACGTGATGGACGCCGGTCAGGAGGGGAGCCTTCCTCCGTTCCCCAACGACGTGTTTATGGTT CCCCAATACGGGTACTGCGGAGTCGTCACTGGAGAAAACCAGAACCAAACAGACAGAAATGC CTTTTACTGTCTGGAGTACTTTCCATCCCAAATGCTAAGAACTGGCAACAACTTTGAAATCA GTTACCAATTTGAAAAAGTTCCTTTCCATTCAATGTACGCGCACAGCCAGAGCCTGGACAGA ATGATGAATCCTTTGCTGGATCAGTACCTGTGGCATCTGCAATCGACCACTACCGGAAATTC CCTTAATCAAGGAACAGCTATCACCACGTACGGGAAAATTACCACTGGGGACTTTGCCTACT ACAGGAAAAACTGGTTGCCTGGAGCCGGCATTAAACAACAAAAATTTTCAAAGAATGCCAGT CAAAACTACAAGATTCCCGCCAGCGGGGGAGACGCCCTTTTAAAGTATGACACGCATACCAC TTTAAATGGGCGATGGAGTAACATGGCTCCTGGTCCTCCAATGGCCACCGCAGGTGCCGGGG ACTCGGATTTTAGCAACAGCCAGCTGATCTTTGCCGGACCCAATCAGAGCGGTAACACGACC ACGTCTTCAAACAATTTGTTGTTTACCTCAGAAGAGGAGATTGCCACAACAAACCCACGAGA CACGGACATGTTTGGACAGATTGCAGATAATAATCAAAATGCCACCACCGCCCCTCACATCG CTAACCTGGACGCTATGGGAATTGTTCCCGGAATGGTCTGGCAAAACAGAGACATCTACTAC CAGGGCCCTATTTGGGCCAAGGTCCCTCACACGGACGGACACTTTCACCCTTCGCCGCTGAT GGGAGGATTTGGACTGAAACACCCGCCTCCGCAGATTTTCATCAAAAACACCCCCGTACCCG CCAATCCCAATACTACCTTTAGCGCTGCAAGGATCAATTCTTTTTTGACGCAGTACAGCACC GGACAAGTCGCCGTTCAGATCGACTGGGAAATTCAGAAGGAGCACTCCAAACGCTGGAATCC CGAAGTCCAATTTACTTCAAACTACGGCACTCAAAATTCTATGCTGTGGGCTCCCGACAACG
CCGGCAACTACCACGAACCCCGGGCTATTGGGTCCCGTTTCCTCACCCACCACTTGTAA SEQ ID NO:13 (Bba.50)
ATGGCTGCTGACGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAAAGCATTCGCGA GTGGTGGGCGCTGAAACCTGGAGCCCCACGGCCCAAGGCAAATCAACAACATCAAGACGACG CTCGGGGTCTTGTGCTTCCGGGTTACAAATACTTGGGACCCGGTAACGGACTCGACAAGGGA GAGCCGGTCAACGAGGCAGACGCCGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCT CAAGTCGGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCGGACGCCGAGTTCCAGCAGCGCT TGGCGACCGACACCTCTTTTGGGGGCAACCTCGGCAAGGCAGTCTTCCAGGCCAAAAAGAGG ATTCTCGAGCCTCTGGGTCTGGTTGAAGAGGGCGTTAAAACGGCTCCTGGAAGGAAACGCCC ATTAGAAAAGACTCCAAATCGGCCGACCAACCCGGACTCTGGGAAGGCCCCGGCCAAGAAAA AGCAAAAAGACGGCGAGACAGCCGACTCTGCTAGAAGGACACTCGACTTTGAAGACTCTGGA GCAGGAGACGGACCCCCTGAGGGATCATCTTCCGGAGAAATGTCTCATGATGCTGAGATGCG TGCGGCGCCAGGCGGAAATGCTGTCGAGGCGGGACAAGGTGCCGATGGAGTGGGTAATGCCT CCGGTGATTGGCATTGCGATTCCACCTGGTCAGAGGGCCGAGTCACCACCACCAGCACCCGA ACCTGGGTCCTGCCCACCTACAACAACCACCTGTACCTGCGAATCGGAACAACGGCCAACAG CAACACCTACAATGGATTCTCCACCCCCTGGGGATACTTTGACTTTAACCGCTTCCACTGCC ACTTTTCCCCACGCGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGACTCAGGCCGAAATCG ATGCGTGTTAAAATCTTCAACATCCAGGTCAAGGAGGTCACTACGTCAAACGGCGAGACTAC GGTCGCTAATAACCTTACCAGCACGGTTCAGATCTTTGCGGATTCAACGTATGAACTCCCAT ACGTGATGGACGCCGGTCAGGAGGGGAGCCTTCCTCCGTTCCCCAACGACGTGTTTATGGTT CCCCAATACGGGTACTGCGGAGTCGTCACTGGAGAAAACCAGAACCAAACAGACAGAAATGC CTTTTACTGTCTGGAGTACTTTCCATCCCAAATGCTAAGAACTGGCAACAACTTTGAAATCA GTTACCAATTTGAAAAAGTTCCTCTCCATTCAATGTACGCGCACAGCCAGAGCCTGGACAGA ATGATGAATCCTTTGCTGGATCAGTACCTGTGGCATCTGCAATCGACCACTACCGGAAATTC CCTTAATCAAGGAACAGCTACCACCACGTACGGGAAAATTACCACTGGGGACTTTGCCTACT ACAGGAAAAACTGGTTGCCTGGAGCCTGCATTAAACAACAAAAATTTTCAAAGAATGCCAGT CAAAACTACAAGATTCCCGCCAGCGGGGAAGACGCCCTTTTAAAGTATGACACGCATACCAC TTTAAATGGGCGATGGAGTAACATGGCTCCTGGTCCTCCAATGGCCACCGCAGGTGCCGGGG ACTCGGATTTTAGCAACAGCCAGCTGATCTTTGCCGGACCCAATCAGAGCGGTAACACGACC ACGTCTTCAAACAATTTGTTGTTTACCTCAGAAGAGGAGATTGCCACAACAAACCCACGAGA CACGGACATGTTTGGACAGATTGCAGATAATAATCAAAATGCCACCACCGCCCCTCACATCG CTAACCTGGACGCTATGGGAATTGTTCCCGGAATGGTCTGGCAAAACAGAGACATCTACTAC CAGGGCCCTATCTGGGCCAAGGTCCCTCACACGGACGGACACTTTCACCCTTCGCCGCTGAT GGGAGGATTTGGACTGAAACACCCGCCTCCGCAGATTTTCATCAAAAACACCCCCGTACCCG CCAATCCCAATACTACCTTTAGCGCTGCAAGGATCAATTCTTTTTTGACGCAGTACAGCACC GGACAAGTCGCCGTTCAGATCGACTGGGAAATTCAGAAGGAGCACTCCAAACGCTGGAATCC CGAAGTCCAATTTACTTCAAACTACGGCACTCAAAATTCTATGCTGTGGGCTCCCGACAACG
CCGGCAACTACCACGAACCCCGGGCTATTGGGTCCCGTTTCCTCACCCACCACTTGTAA SEQ ID NO:14 (Bba.51)
ATGGCTGCTGACGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAAGGCATTCGCGA GTGGTGGGCGCTGAAACCTGGAGCCCCACAGCCCAAGGCAAATCAACAACATCAAGACAACG CTCGGGGTCTTGTGCTTCCGGGTTACAAATACTTGGGACCCGGTAACGGACTCGACAAGGGA GAGCCGGTCAACGAGGCAGACGCCGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCT CAAGTCGGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCGGACGCCGAGTTCCAGCAGCGCT TGGCGACCGACACCTCTTTTGGGGGCAACCTCGGCAAGGCAGTCTTCCAGGCCAAAAAGAGG ATTCTCGAGCCTCTGGGTCTGGTTGAAGAGGGCGTTAAAACGGCTCCTGGAAAGAAACGCCC ATTAGAAAAGACTCCAAATCGGCCGACCAACCCGGACTCTGGGAAGGCCCCGGCCAAGAAAA AGCAAAAAGACGGCGAGACAGCCGACTCTGCTAGAAGGACACTCGACTTTGAAGACTCTGGA GCAGGAGACGGACCCCCTGAGGGATCATCTTCCGGAGAAATGTCTCATGATGCTGAGATGCG TGCGGCGCCAGGCGGAAATGCTGTCGAGGCGGGACAAGGTGCCGATGGAGTGGGTAATGCCT CCGGTGATTGGCATTGCGATTCCACCTGGTCAGAGGGCCGAGTCACCACCACCAGCACCCGA ACCTGGGTCCTGCCCACCTACAACAACCACCTGTACCTGCGAATCGGAACAACGGCCAACAG CAACACCTACAATGGATTCTCCACCCCCTGGGGATACTTTGACTTTAACCGCTTCCACTGCC ACTTTTCCCCACGCGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGACTCAGGCCGAAATCG ATGCGTGTTAAAATCTTCAACATCCAGGTCAAGGAGGTCACTACGTCAAACGGCGAGACTAC GGTCGCTAATAACCTTACCAGCACGGTTCAGATCTTTGCGGATTCAACGTATGAACTCCCAT ACGTGATGGACGCCGGTCAGGAGGGGAGCCTTCCTCCGTTCCCCAACGACGTGTTTATGGTT CCCCAATACGGGTACTGCGGAGTCGTCACTGGAGAAAACCAGAACCAAACAGACAGAAATGC CTTTTACTGTCTGGAGTACTTTCCATCCCAAATGCTAAGAACTGGCAACAACTTTGAAATCA GTTACCAATTTGAAAAAGTTCCTTTCCATTCAATGTACGCGCACAGCCAGAGCCTGGACAGA ATGATGAATCCTTTGCTGGATCAGTACCTGTGGCATCTGCAATCGACCACTACCGGAAATTC CCTTAATCAAGGAACAGCTACCACCACGTACGGGAAAATTACCACTGGGGACTTTGCCTACT ACAGGAAAAACTGGTTGCCTGGAGCCTGCATTAAACAACAAAAATTTTCAAAGAATGCCAGT CAAAACTACAAGATTCCCGCCAGCGGGGGAGACGCCCTTTTAAAGTATGACACGCATACCAC TTTAAATGGGCGATGGAGTAACATGGCTCCTGGTCCTCCAATGGCCACCGCAGGTGCCGGGG ACTCGGATTTTAGCAACAGCCAGCTGATCTTTGCCGGACCCAATCAGAGCGGTAACACGACC ACGTCTTCAAACAATTTGTTGTTTACCTCAGAAGAGGAGATTGCCACAACAAACCCACGAGA CACGGACATGTTTGGACAGATTGCAGATAATAATCAAAATGCCACCACCGCCCCTCACATCG CTAACCTGGACGCTATGGGAATTGTTCCCGGAATGGTCTGGCAAAACAGAGACATCTACTAC CAGGGCCCTATTTGGGCCAAGGTCCCTCACACGGACGGACACTTTCACCCTTCGCCGCTGAT GGGAGGATTTGGACTGAAACACCCGCCTCCGCAGATTTTCATCAAAAACACCCCCGTACCCG CCAATCCCAATACTACCTTTAGCGCTGCAAGGATCAATTCTTTTTTGACGCAGTACAGCACC GGACAAGTCGCCGTTCAGATCGACTGGGAAATTCAGAAGGAGCACTCCAAACGCTGGAATCC CGAAGTCCAATTTACTTCAAACTACGGCACTCAAAATTCTATGCTGTGGGCTCCCGACAACG
CCGGCAACTACCACGAACCCCGGGCTATTGGGTCCCGTTTCCTCACCCACCACTTGTAA Na Tabela 2 imediatamente abaixo, “VR” refere-se à região variável e os números referem-se aos resíduos de aminoácido que cada região variável ou as regiões GBS e da alça GH abrangem na sequência de aminoácidos.
Tabela 2
AAV VRI VRII VRIII VRIV GBS VRV VRVI VRVII AAVBba.45 265- 325- 381- 452- 468- 490- 534- 550- 269 330 386 462 478 512 544 564
AAVBba.46 265- 325- 381- 452- 468- 490- 534- 550- 269 330 386 462 478 512 544 564 AAVBba.47 265- 325- 381- 452- 468- 490- 534- 550- 269 330 386 462 478 512 544 564 AAVBba.48 265- 325- 381- 452- 468- 490- 534- 550- 269 330 386 462 478 512 544 564 AAVBba.49 265- 325- 381- 452- 468- 490- 534- 550- 269 330 386 462 478 512 544 564 AAVBba.50 265- 325- 381- 452- 468- 490- 534- 550- 269 330 386 462 478 512 544 564 AAVBba.51 265- 325- 381- 452- 468- 490- 534- 550- 269 330 386 462 478 512 544 564 Transgene O transgene é uma sequência de ácido nucleico, heteróloga às sequências do vetor que flanqueiam o transgene, que codifica um polipeptídeo, proteína ou outro produto de interesse. A sequência de ácido nucleico de codificação é operacionalmente ligada a componentes reguladores de maneira que permite a transcrição, tradução e/ou expressão dos transgene em uma célula hospedeira.
A composição da sequência do transgene dependerá do uso para o qual se fará do vetor resultante. Por exemplo, um tipo de sequência de transgene inclui uma sequência repórter, a qual, quando expressão, produz um sinal detectável. Tais sequências repórteres incluem, entre outros, sequências de DNA que codificam β-lactamase, β-galactosidase (LacZ), fosfatase alcalina, timidina quinase, proteína verde fluorescente (GFP),
cloranfenicol acetiltransferase (CAT), luciferase, proteínas ligadas à membrana incluindo, por exemplo, CD2, CD4, CD8, a proteína hemaglutinina do vírus Influenza, e outras bem conhecidas na técnica, contra as quais existem anticorpos de alta afinidade direcionados às mesmas ou podem ser produzidas por meios convencionais, e proteínas de fusão compreendendo uma proteína ligada à membrana adequadamente fundida a um domínio tag de um antígeno de, entre outros, hemaglutinina ou Myc.
Essas sequências de codificação, quando associadas com elementos reguladores que direcionam a expressão, fornecem sinais detectáveis por meios convencionais, incluindo ensaios enzimáticos, radiográficos, colorimétricos, de fluorescência ou outros espectrográficos, ensaios de separação de células ativadas por fluorescência e ensaios imunológicos, incluindo ensaio imunoenzimático de absorção (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e imuno-histoquímica. Por exemplo, quando a sequência do marcador é o gene de LacZ, a presença do vetor carregando o sinal é detectada por ensaios para atividade de beta-galactosidase. Quando o transgene á a proteína verde fluorescente ou luciferase, o vetor carregando o sinal pode ser medido visualmente pela produção de cor ou luz em um luminômetro.
No entanto, desejavelmente, o transgene é uma sequência não marcadora que codifica um produto que é útil na biologia e na medicina, tal como proteínas, peptídeos, RNA, enzimas, mutantes negativos dominantes ou RNAs catalíticos. As moléculas desejáveis de RNA incluem tRNA, dsRNA, RNA ribossomal, RNAs catalíticos, siRNA, pequeno RNA em grampo de cabelo (hairpin), RNA trans-splicing e RNAs antisense. Um exemplo de sequência útil de RNA é uma sequência que inibe ou extingue a expressão de uma sequência de ácido nucleico alvo no animal tratado. Tipicamente, as sequências de alvos adequados incluem alvos oncológicos e doenças virais. Ver, para exemplos de tais alvos, os alvos oncológicos e vírus identificados abaixo na seção relativa a imunógenos.
O transgene pode ser utilizado para corrigir ou melhorar deficiências gênicas, as quais podem incluir deficiências nas quais genes normais são expressos em níveis inferiores aos normais ou deficiências nas quais o produto funcional do gene não é expresso. Um tipo preferido de sequência do transgene codifica uma proteína ou polipeptídeo terapêutico que é expresso em uma célula hospedeira. A invenção inclui ainda o uso de múltiplos transgenes, p. ex., para corrigir ou melhorar um defeito gênico causado por uma proteína com múltiplas subunidades. Em certas situações, um transgene diferente pode ser utilizado para codificar cada subunidade de uma proteína, ou para codificar peptídeos ou proteínas diferentes. Isso é desejável quando o tamanho do DNA codificador de proteína é grande, p. ex., de uma imunoglobulina, do fator de crescimento derivado de plaquetas ou de uma proteína distrofina. Para que a célula produza a proteína de múltiplas subunidades, uma célula é infectada com o vírus recombinante contendo cada uma das diferentes subunidades. Alternativamente, diferentes subunidades de uma proteína podem ser codificadas pelo mesmo transgene. Nesse caso, um único transgene inclui o DNA que codifica cada uma das subunidades, com o DNA para cada subunidade separado por um sítio interno de entrada do ribossomo (IRES). Isso é desejável quando o tamanho do DNA que codifica cada uma das subunidades é pequeno, p. ex., o tamanho total do DNA que codifica as subunidades e os IRES é inferior a cinco quilobases. Como alternativa a um IRES, o DNA pode ser separado por sequências que codificam um peptídeo 2A, o qual é capaz de clivagem própria em um evento pós-traducional. Ver, p. ex., Donnelly et al, J. Gen. Virol., 78(Pt 1):13-21 (January 1997); Furler, et al, Gene Ther., 8(11):864-873 (June 2001); Klump et al., Gene Ther., 8(10):811-817 (May 2001). Esse peptídeo 2A é significativamente menor do que um IRES, tornando-o bem adequado para uso quando o espaço é um fator de limitação. Mais frequentemente, quando o transgene é grande, consiste em múltiplas subunidades ou dois transgenes são entregues juntos, o rAAV que carrega o(s) transgene(s) desejado(s) ou subunidades são coadministrados para permitir a concatamerização deles in vivo e a formação de um único genoma do vetor. Em tal modalidade, um primeiro AAV pode carregar um cassete de expressão que expressa um único transgene e um segundo AAV pode carregar um cassete de expressão que expressa um transgene diferente para co-expressão na célula hospedeira. No entanto, o transgene selecionado pode codificar qualquer produto biologicamente ativo ou outro produto, p. ex., um produto desejável para estudo.
Transgenes adequados podem ser rapidamente selecionados pelo técnico no assunto. A seleção do transgene não é considerada uma limitação desta invenção.
Em algumas modalidades, o transgene é uma proteína heteróloga, e essa proteína heteróloga é uma proteína terapêutica. As proteínas terapêuticas exemplares incluem, entre outras, fatores do sangue, tais como β-globina, hemoglobina,
ativador do plasminogênio tecidual e fatores de coagulação; fatores estimuladores de colônias (CSF); interleucinas, como IL- 1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 etc.; fatores de crescimento, como fator de crescimento de queratinócitos (KGF), fator de células-tronco (SCF), fator de crescimento de fibroblastos (FGF, como FGF básico e FGF ácido), fator de crescimento de hepatócitos (HGF), fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGFs), proteína óssea morfogenética (BMP), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento e diferenciação-9 (GDF-9), fator de crescimento derivado de hepatoma (HDGF), miostatina (GDF-8), fator de crescimento nervoso (NGF), neurotrofinas, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), trombopoietina (TPO), fator de crescimento transformador alfa (TGF-α), fator de crescimento transformador beta (TGF-β) e similares; receptores solúveis, como receptores solúveis de TNF-α, receptores solúveis de receptores de VEGF, receptores solúveis de interleucinas (p. ex., receptores solúveis de IL-1 e receptores solúveis tipo II de IL-1), receptores solúveis γ/δ células T, fragmentos de ligação a ligantes de um receptor solúvel e similares; enzimas, como α-glicosidase, imiglucarase, β-glucocerebrosidase e alglucerase; ativadores de enzimas, como ativador do plasminogênio tecidual; quimiocinas, como 1P-10, monocina induzida por interferon-gama (Mig), Groα/IL-8, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, MCP-1, PF-4 e similares; agentes angiogênicos, como fatores de crescimento endotelial vascular (VEGFs, p. ex., VEGF121, VEGF165, VEGF-C, VEGF-2), fator de crescimento derivado de glioma, angiogenina, angiogenina-2; e similares; agentes anti-angiogênicos, como um receptor solúvel de VEGF; vacina de proteína; peptídeos neuroativos, como fator de crescimento nervoso (NGF), bradicinina, colecistoquinina, gastina, secretina, oxitocina, hormônio liberador de gonadotropina, beta- endorfina encefalina, substância P, somatostatina, prolactina, galanina, hormônio liberador do hormônio de crescimento, bombesina, dinorfina, varfarina, neurotensina, motilina, tirotropina, neuropeptídeo Y, hormônio luteinizante, calcitonina, insulina, glucagons, vasopressina, angiotensina II, hormônio liberador de tirotropina, peptídeo vasoativo intestinal, um peptídeo do sono e similares; agentes trombolíticos; peptídeo natriurético atrial; relaxina; proteína ácida fibrilar glial; hormônio estimulante de folículos (FSH); antitripsina alfa-1 humana; fator inibidor de leucemia (LIF); fatores teciduais, hormônio luteinizante; fatores ativadores de macrófagos; fator de necrose tumoral (TNF); fator quimiotático de neutrófilos (NCF); inibidores teciduais de metaloproteinases; peptídeo vasoativo intestinal; angiogenina; angiotropina; fibrina; hirudina; antagonistas do receptor de IL-1; e similares.
Alguns outros exemplos não limitantes da proteína de interesse incluem fator neurotrófico ciliar (CNTF); fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF); neurotrofinas 3 e 4/5 (NT-3 e 4/5); fator neurotrófico de células gliais (GDNF); descarboxilase de aminoácidos aromáticos (AADC); proteínas de coagulação relacionadas à hemofilia, como Fator VIII, Fator IX, Fator X; distrofina, mini-distrofina ou microdistrofina; lipase ácida lisossomal; fenilalanina hidroxilase (PAH); enzimas relacionadas a doenças de armazenamento do glicogênio, como glicose-6-fosfatase, maltase ácida, enzima de desramificação do glicogênio, glicogênio fosforilase muscular, glicogênio fosforilase hepática, fosfofrutoquinase muscular, fosforilase quinase (p. ex., PHKA2), transportador de glicose (p. ex., GLUT2), aldolase A, β-enolase e glicogênio sintase; enzimas lisossomais (p. ex., beta-N-acetilhexosaminidase A); e quaisquer variantes dos mesmos.
Elementos reguladores de controle O vetor AAV também inclui elementos ou sequências convencionais de controle que são operacionalmente ligados ao transgene de maneira a permitir a transcrição, tradução e/ou a expressão do transgene em uma célula transfectada com o vetor plasmidial ou infectada com o vírus produzido pela invenção. Neste relatório descritivo, as sequências “operacionalmente ligadas” incluem sequências de controle da expressão que são contíguas ao gene de interesse e sequências de controle da expressão que atuam em in trans ou a uma distância para controlar o gene de interesse.
As sequências de controle da expressão incluem sequências adequadas de início da transcrição, terminação, promotor e intensificador (enhancer); sinais eficientes para processamento do RNA como sinais de splicing e poliadenilação (poliA); sequências que estabilizam mRNA citoplasmático; sequências que aumentam a eficiência da tradução (ou seja, sequência consenso de Kozak); sequências que aumentam a estabilidade da proteína; e, quando desejado, sequências que aumentam a secreção do produto codificado. Um grande número de sequências de controle da expressão, incluindo promotores que são nativos, constitutivos, induzíveis e/ou específicos dos tecidos, é conhecido na técnica e pode ser utilizado.
Os exemplos de promotores constitutivos incluem, entre outros, o promotor LTR do vírus retroviral do sarcoma de Rous (RSV) (opcionalmente com o intensificador do RSV), o promotor do citomegalovírus (CMV) (opcionalmente com o intensificador do CMV) (ver, p. ex., Boshart et al, Cell, 41:521- 530 (1985)), o promotor SV40, o promotor da dihidrofolato redutase, o promotor da β-actina, o promotor da fosfoglicerol quinase (PGK) e o promotor EF1 [Invitrogen]. Os promotores induzíveis permitem regular a expressão do gene e podem ser regulados por compostos fornecidos de modo exógeno, fatores ambientais como temperatura, ou a presença de um estado fisiológico específico, p. ex., fase aguda, um estado de diferenciação em particular da célula, ou somente em células que estão replicando. Promotores induzíveis e sistemas induzíveis são disponibilizados por vários fornecedores comerciais, incluindo, entre outros, Invitrogen, Clontech e Ariad. Muitos outros sistemas foram descritos e podem ser rapidamente selecionados pelo técnico no assunto. Os exemplos de promotores induzíveis regulados por compostos fornecidos de modo exógeno incluem o promotor da metalotionina (MT) de ovelha induzido pelo zinco, o promotor do vírus do tumor mamário de camundongo (MMTV) induzido por dexametasona (Dex), o sistema promotor de T7 polimerase [WO 98/10088]; o promotor ecdisona insetos [No et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)], o sistema reprimível pela tetraciclina [Gossen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)], o sistema induzível pela tetraciclina [Gossen et al, Science, 268:1766-1769 (1995), ver também Harvey et al, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)], o sistema induzível por RU486 [Wang et al, Nat. Biotech., 15:239- 243 (1997) e Wang et al, Gene Ther., 4:432-441 (1997)] e o sistema induzível pela rapamicina [Magari et al, J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)]. Outros tipos de promotores induzíveis que podem ser úteis nesse contexto são aqueles que são regulados por um estado fisiológico específico, p. ex., temperatura, fase aguda, um estado de diferenciação em particular da célula ou somente em células que estão replicando.
Em outra modalidade, será utilizado o promotor nativo para o transgene. O promotor nativo pode ser preferido quando se deseja que a expressão do transgene imite a expressão nativa. O promotor nativo pode ser usado quando a expressão do transgene deva ser regulada temporariamente ou durante o desenvolvimento, ou de maneira tecido-específica ou em resposta a estímulos transcricionais específicos. Em uma modalidade adicional, outros elementos nativos de controle da expressão, tais como elementos intensificadores, sítios de poliadenilação ou sequências consenso de Kozak podem igualmente ser usados para simular a expressão nativa.
Outra modalidade do transgene inclui um gene operacionalmente ligado a um promotor tecido-específico. Por exemplo, se for desejada a expressão no músculo esquelético, um promotor ativo músculo deve ser utilizado. Esses incluem os promotores de genes que codificam β-actina esquelética, a cadeia leve 2A de miosina, distrofina, creatina quinase muscular, bem como promotores musculares sintéticas com atividades maiores do que promotores naturais (ver Li et al., Nat. Biotech., 17:241-
245 (1999)). Os exemplos de promotores que são tecido- específicos são conhecidos para o fígado (albumina, Miyatake et al., J. Virol., 71:5124-32 (1997); promotor central do vírus da hepatite B, Sandig et al., Gene Ther., 3:1002-9 (1996); alfa- fetoproteína (AFP), Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7:1503- 14 (1996)), osteocalcina óssea (Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)); sialoproteína óssea (Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)), linfócitos (CD2, Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998); cadeia pesada de imunoglobulinas; cadeia do receptor de células T), promotor neuronal, como promotor da enolase neurônio-específica (NSE) (Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)), gene da cadeia leve de neurofilamenos (Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)) e o gene vgf neurônio- específico (Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)), entre outros.
Opcionalmente, plasmídeos carregando transgenes terapeuticamente úteis podem igualmente incluir marcadores selecionáveis ou genes repórteres podem incluir sequências que codificam de resistência à geneticina, higromicina ou à purimicina, entre outros. Tais repórteres selecionáveis ou genes de marcadores (de preferência localizados fora do genoma viral a serem resgatados pelo método da invenção) podem ser utilizados para sinalizar a presença dos plasmídeos em células bacterianas, como de resistência à ampicilina. Outros componentes do plasmídeo podem incluir uma origem de replicação. A seleção desses e de outros promotores e elementos do vetor são convencionais e muitas de tais sequências estão disponíveis [ver, p. ex., Sambrook et al, e referências citadas no mesmo].
Métodos para a produção de AAVs recombinantes A presente invenção provê materiais e métodos para produzir AAVs recombinantes em células de insetos ou de mamíferos. Em algumas modalidades, a construção viral compreende ainda um promotor e um sítio de restrição a jusante (downstream) do promotor para permitir a inserção de um polinucleotídeo codificador de uma ou mais proteínas de interesse, em que o promotor e o sítio de restrição estão localizados a jusante da ITR 5' de AAV e a montante (upstream) da ITR 3' de AAV. Em algumas modalidades, a construção viral compreende ainda um elemento regulador pós-transcrição a jusante do sítio de restrição e a montante da ITR 3' de AAV. Em algumas modalidades, a construção viral compreende ainda um polinucleotídeo inserido no sítio de restrição e operacionalmente ligado com o promotor, em que o polinucleotídeo compreende a região de codificação de uma proteína de interesse. Conforme será apreciado pelo técnico no assunto, qualquer um dentre os vetores AAV revelados no presente pedido de patente pode ser utilizado no método como a construção viral para produção do AAV recombinante.
Em algumas modalidades, as funções auxiliares são fornecidas por um ou mais plasmídeos auxiliares ou vírus auxiliares que compreendem genes auxiliares de adenovírus ou baculovírus. Exemplos não limitantes dos genes auxiliares de adenovírus ou baculovírus incluem, entre outros, E1A, E1B, E2A, E4 e VA, os quais podem fornecer funções auxiliares ao empacotamento de AAV.
Vírus auxiliares de AAV são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, vírus da família Adenoviridae e da família Herpesviridae. Os exemplos de vírus auxiliares de AAV incluem, entre outros, o vírus auxiliar SAdV-13 e vírus auxiliares semelhantes ao SAdV-13 descritos na Publicação U.S. No 20110201088 (cujo conteúdo é aqui incorporado por referência), os vetores auxiliares pHELP (Applied Viromics). O técnico no assunto apreciará que qualquer vírus auxiliar ou plasmídeo auxiliar que possa fornecer função auxiliar adequada ao AAV pode ser usado nesse caso.
Em algumas modalidades, os genes cap de AAV estão presentes em um plasmídeo. O plasmídeo pode compreender ainda um gene rep de AAV. Os genes cap e/ou o gene rep de qualquer sorotipo de AAV (incluindo, entre outros, AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13 e quaisquer variantes dos mesmos) podem ser usados para produzir o AAV recombinante. Em algumas modalidades, os genes cap de AAV codificam um capsídeo do sorotipo 1, sorotipo 2, sorotipo 4, sorotipo 5, sorotipo 6, sorotipo 7, sorotipo 8, sorotipo 9, sorotipo 10, sorotipo 11, sorotipo 12, sorotipo 13 ou de uma variante dos mesmos.
Em algumas modalidades, a célula de inseto ou de mamífero pode ser transfectada com o plasmídeo auxiliar ou o vírus auxiliar, a construção viral e com o plasmídeo que codifica os genes cap de AAV; e o vírus AAV recombinante pode ser coletado em vários momentos após a co-transfecção. Por exemplo, o vírus AAV recombinante pode ser coletado em aproximadamente 12 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 36 horas,
aproximadamente 48 horas, aproximadamente 72 horas, aproximadamente 96 horas, aproximadamente 120 horas ou um prazo entre qualquer um desses momentos após a co-transfecção.
O AAV recombinante pode também ser produzido utilizando quaisquer métodos convencionais conhecidos na técnica, adequados para produzir AAV recombinantes infecciosos. Em alguns casos, um AAV recombinante pode ser produzido utilizando uma célula de inseto ou de mamífero que expressa estavelmente alguns dos componentes necessários para a produção da partícula de AAV. Por exemplo, um plasmídeo (ou múltiplos plasmídeos) compreendendo os genes rep e cap de AAV e um marcador selecionável, como um gene de resistência à neomicina, pode ser integrado no genoma da célula. A célula de inseto ou de mamífero pode então ser co-infectada com um vírus auxiliar (p. ex., adenovírus ou baculovírus proporcionando as funções auxiliares) e o vetor viral compreendendo a ITR 5' e 3' de AAV (e a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína heteróloga, se desejado). As vantagens desse método são que as células são selecionáveis e adequadas para produção em grande escala do AAV recombinante. Como outro exemplo não limitante, pode-se utilizar adenovírus ou baculovírus, em vez de plasmídeos, para introduzir os genes rep e cap em células do empacotamento. Como ainda outro exemplo não limitante, ambos, o vetor viral contendo as ITRs 5' e 3' de AAV e os genes rep-cap, podem ser integrados estavelmente no DNA de células produtoras, e as funções auxiliares podem ser fornecidas por um adenovírus do tipo selvagem para a produção do AAV recombinante.
Tipos de células usados na produção de AAV As partículas virais compreendendo os vetores AAV da invenção podem ser produzidas utilizando qualquer tipo de célula de invertebrado que permita a produção de AAV ou de produtos biológicos e que possa ser mantido em cultura. Por exemplo, a linhagem da célula de inseto usada pode ser de Spodoptera frugiperda, as linhagens de células Sf9, SF21, SF900+ de drosófila, linhagens de células de mosquito, p. ex., linhagens de células derivadas de Aedes albopictus, linhagens de células de bicho da seda, p. ex. linhagens de células de Bombyxmori, linhagens de células de Trichoplusia ni como células High Five ou linhagens celulares de Lepidoptera como linhagens de células de Ascalapha odorata. As células preferidas de insetos são células das espécies de insetos que são suscetíveis à infecção por baculovírus, incluindo High Five, Sf9, Se301, SeIZD2109, SeUCR1, Sf900+, Sf21, BTI-TN-5B1-4, MG-1, Tn368, HzAm1, BM-N, Ha2302, Hz2E5 e Ao38.
Os baculovírus são vírus de DNA com envelope de artrópodes, sendo dois de seus membros vetores de expressão bem conhecidos para a produção de proteínas recombinantes em culturas de células. Os baculovírus possuem genomas circulares de fita dupla (80-200 kbp) que podem ser criados para permitir a entrega de grande teor genômico a células específicas. Os vírus usados como um vetor são geralmente o nucleopoliedrovírus multicapsídeo que infecta Autographa californica (AcMNPV) ou Bombyx mori (BmNPV) (Kato et al., 2010).
Os baculovírus são comumente usados na infecção de células de insetos para a expressão de proteínas recombinantes. Em particular, a expressão de genes heterólogos em insetos pode ser realizada como descrito em , por exemplo Patente U.S. No 4 745 051; Friesen et al (1986); EP 127,839; EP 155,476; Vlak et al. (1988); Miller et al. (1988); Carbonell et al. (1988); Maeda et al. (1985); Lebacq-Verheyden et al. (1988); Smith et al. (1985); Miyajima et al. (1987); e Martin et al.(1988). Inúmeras cepas e variantes de baculovírus e células hospedeiras de insetos permissivas correspondentes que podem ser utilizadas para a produção de proteínas são descritas em Luckow et al (1988), Miller et al. (1986); Maeda et al. (1985) e McKenna (1989).
Em outro aspecto da invenção, os métodos da invenção são também realizados com qualquer tipo de célula de mamífero que permita a replicação de AAV ou a geração de produtos biológicos, e que possa ser mantido em cultura. As células preferidas de mamíferos usadas podem ser células HEK293, HeLa, CHO, NS0, SP2/0, PER.C6, Vero, RD, BHK, HT 1080, A549, Cos-7, ARPE-19 e MRC-5.
Produção de proteínas heterólogos in vitro Como um exemplo não limitante, o AAV recombinante aqui revelados pode ser utilizado para produzir uma proteína de interesse in vitro, por exemplo, em uma cultura celular. Como um exemplo não limitante, em algumas modalidades, um método para produzir uma proteína de interesse in vitro, em que o método inclui fornecer um AAV recombinante compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica a proteína heteróloga; e colocar o
AAV recombinante em contato com uma célula em uma cultura celular, pelo qual o AAV recombinante expressa a proteína de interesse na célula. O tamanho da sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de interesse pode variar. Por exemplo, a sequência de nucleotídeos pode ter pelo menos aproximadamente 1,4 kb, pelo menos aproximadamente 1,5 kb, pelo menos aproximadamente 1,6 kb, pelo menos aproximadamente 1,7 kb, pelo menos aproximadamente 1,8 kb, pelo menos aproximadamente 2,0 kb, pelo menos aproximadamente 2,2 kb, pelo menos aproximadamente 2,4 kb, pelo menos aproximadamente 2,6 kb, pelo menos aproximadamente 2,8 kb, pelo menos aproximadamente 3,0 kb, pelo menos aproximadamente 3,2 kb, pelo menos aproximadamente 3,4 kb, pelo menos aproximadamente 3,5 kb de comprimento, pelo menos aproximadamente 4,0 kb de comprimento, pelo menos aproximadamente 5,0 kb de comprimento, pelo menos aproximadamente 6,0 kb de comprimento, pelo menos aproximadamente 7,0 kb de comprimento, pelo menos aproximadamente 8,0 kb de comprimento, pelo menos aproximadamente 9,0 kb de comprimento, ou pelo menos aproximadamente 10,0 kb de comprimento. Em algumas modalidades, o nucleotídeo tem pelo menos aproximadamente 1,4 kb de comprimento.
Produção de proteínas heterólogas in vivo O AAV recombinante aqui revelado pode ser usado para produzir uma proteína de interesse in vivo, por exemplo, em um animal tal como um mamífero. Algumas modalidades provêm um método para produzir uma proteína de interesse in vivo, em que o método inclui fornecer um AAV recombinante compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de interesse; e administrar o AAV recombinante ao indivíduo, pelo qual o AAV recombinante expressa a proteína de interesse no indivíduo. O indivíduo pode ser, em algumas modalidades, um mamífero não humano, por exemplo, um macaco, um cão, um gato, um camundongo ou uma vaca. O tamanho da sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de interesse pode variar. Por exemplo, a sequência de nucleotídeos pode ter pelo menos aproximadamente 1,4 kb, pelo menos aproximadamente 1,5 kb, pelo menos aproximadamente 1,6 kb, pelo menos aproximadamente 1,7 kb, pelo menos aproximadamente 1,8 kb, pelo menos aproximadamente 2,0 kb, pelo menos aproximadamente 2,2 kb, pelo menos aproximadamente 2,4 kb, pelo menos aproximadamente 2,6 kb, pelo menos aproximadamente 2,8 kb, pelo menos aproximadamente 3,0 kb, pelo menos aproximadamente 3,2 kb, pelo menos aproximadamente 3,4 kb, pelo menos aproximadamente 3,5 kb de comprimento, pelo menos aproximadamente 4,0 kb de comprimento, pelo menos aproximadamente 5,0 kb de comprimento, pelo menos aproximadamente 6,0 kb de comprimento, pelo menos aproximadamente 7,0 kb de comprimento, pelo menos aproximadamente 8,0 kb de comprimento, pelo menos aproximadamente 9,0 kb de comprimento, ou pelo menos aproximadamente 10,0 kb de comprimento, Em algumas modalidades, o nucleotídeo tem pelo menos aproximadamente 1,4 kb de comprimento.
Usos terapêuticos O AAV recombinante produzido pelos métodos descritos pode ser utilizado para expressar uma ou mais proteínas terapêuticas no tratamento de várias doenças ou transtornos.
Exemplos não limitantes das doenças incluem câncer como carcinoma, sarcoma, leucemia, linfoma; e doenças autoimunes como esclerose múltipla.
Exemplos não limitantes de carcinomas incluem carcinoma esofágico; carcinoma hepatocelular; carcinoma basocelular; carcinoma de células escamosas (vários tecidos); carcinoma de bexiga, incluindo carcinoma de células transicionais; carcinoma broncogênico; carcinoma de cólon; carcinoma colorretal; carcinoma gástrico; carcinoma pulmonar, incluindo carcinoma de pequenas células e carcinoma de não pequenas células do pulmão; carcinoma adrenocortical; carcinoma de tireoide; carcinoma pancreático; carcinoma de mama; carcinoma de ovário; carcinoma de próstata; adenocarcinoma; carcinoma de glândulas sudoríparas; carcinoma de glândulas sebáceas; carcinoma papilar; adenocarcinoma papilar; cistadenocarcinoma; carcinoma medular; carcinoma de células renais; carcinoma medular; carcinoma de células renais; carcinoma ductal in situ ou carcinoma de ductos biliares; coriocarcinoma; seminoma; carcinoma embrionário; tumor de Wilm; carcinoma cervical; carcinoma uterino; carcinoma testicular; carcinoma osteogênico; carcinoma epitelial; e carcinoma nasofaríngeo.
Exemplos não limitantes de sarcomas incluem fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, cordoma, sarcoma osteogênico, osteossarcoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma, linfangioendoteliossarcoma, sinovioma, mesotelioma, sarcoma de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma e outros sarcomas de tecidos moles.
Exemplos não limitantes de tumores sólidos incluem glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma,
neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma e retinoblastoma. Exemplos não limitantes de leucemias incluem síndromes mieloproliferativas crônicas; leucemias mielogênicas agudas; leucemias linfocítica crônicas (LLC), incluindo LLC de células B, LLC de células T, leucemia pró-linfocítica e leucemia de células cabeludas; e leucemias linfoblásticas agudas. Exemplos de linfomas incluem, entre outros, linfomas de células B, como linfoma de Burkitt; linfoma de Hodgkin; e similares. Outros exemplos não limitantes das doenças que podem ser tratadas utilizando os vetores AAV, vírus recombinantes e os métodos aqui descritos incluem transtornos genéticos como anemia falciforme, fibrose cística, deficiência 1 de lipase ácida lisossomal (LAL), doença de Tay-Sachs, fenilcetonúria, mucopolissacaridoses, doenças de armazenamento do glicogênio (GSD, p. ex., GSD tipos I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII e XIV), galactossemia, distrofia muscular (p. ex., distrofia muscular de Duchenne), doença de Wilson, angioedema hereditário (AEH), deficiência de alfa 1 antitripsina, doença de Fabry, doença de Gaucher e hemofilia como hemofilia A (hemofilia clássica) e hemofilia B (doença de Christmas). Além disso, os vetores AAV, vírus recombinantes e os métodos aqui descritos podem ser usados para outros transtornos que podem ser tratados pela expressão local de um transgene no fígado ou pela expressão de uma proteína secretada no fígado ou por um hepatócito.
A quantidade da proteína heteróloga expressa no indivíduo (p. ex., o soro do indivíduo) pode variar. Por exemplo, em algumas modalidades, a proteína pode ser expressa no soro do indivíduo na quantidade de pelo menos aproximadamente 9 µg/mL,
pelo menos aproximadamente 10 µg/mL, pelo menos aproximadamente 50 µg/mL, pelo menos aproximadamente 100 µg/mL, pelo menos aproximadamente 200 µg/mL, pelo menos aproximadamente 300 µg/mL, pelo menos aproximadamente 400 µg/mL, pelo menos aproximadamente 500 µg/mL, pelo menos aproximadamente 600 µg/mL, pelo menos aproximadamente 700 µg/mL, pelo menos aproximadamente 800 µg/mL, pelo menos aproximadamente 900 µg/mL ou pelo menos aproximadamente 1000 µg/mL. Em algumas modalidades, a proteína de interesse é expressa no soro do indivíduo na quantidade de aproximadamente 9 µg/mL, aproximadamente 10 µg/mL, aproximadamente 50 µg/mL, aproximadamente 100 µg/mL, aproximadamente 200 µg/mL, aproximadamente 300 µg/mL, aproximadamente 400 µg/mL, aproximadamente 500 µg/mL, aproximadamente 600 µg/mL, aproximadamente 700 µg/mL, aproximadamente 800 µg/mL, aproximadamente 900 µg/mL, aproximadamente 1000 µg/mL, aproximadamente 1500 µg/mL, aproximadamente 2000 µg/mL, aproximadamente 2500 µg/mL, ou um intervalo entre quaisquer dois desses valores. O técnico no assunto entenderá que o nível de expressão no qual uma proteína de interesse é necessário para que o método seja eficaz pode variar dependendo de fatores não limitantes tais como a proteína de interesse em particular e o indivíduo que recebe o tratamento, e uma quantidade eficaz da proteína pode ser rapidamente determinada pelo técnico no assunto usando métodos convencionais conhecidos na técnica sem a indevida experimentação.
Exemplos Exemplo 1. Isolamento de novas proteínas naturais do capsídeo
Novas proteínas naturais do capsídeo foram isoladas do fígado de babuínos. O tecido hepático congelado foi obtido do Texas Biomedical ou do New England Primate Research Center. DNA genômico foi preparado a partir do tecido hepático utilizando o kit DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen no de catálogo 69504).
A reação em cadeia da polimerase foi realizada no DNA genômico utilizando os primers seguintes: primer rep-1397-F (5’-GTGCCCTTTTACGGCTGCGTGAACTGGACCAATGAAAACTTTCC- 3’SEQ ID NO:21) e primer cap-2872-R (5’- CCGACGGAGTGGGCAATGCCTCAGGAAATTGGCATTG CGATTCC- 3’ SEQ ID NO:22) sob as seguintes condições: incubação inicial: 97 ºC, 120 segundos, etapa de desnaturação: 97 ºC, 15 segundos, etapa de anelamento: 58 ºC, 60 ºC ou 62 ºC, 15 segundos, etapa de extensão 72 ºC, 240 segundos. As etapas de desnaturação, anelamento e extensão foram realizadas por 35 ciclos. Em seguida, a reação foi incubada a 72 ºC, 7 minutos e armazenada a 4 ºC até que analisada. Os produtos da PCR foram separados por eletroforese em géis de agarose 1%, isolados com o kit Gel Extraction (Qiagen, número de catálogo 28704) e clonados em pCR4-TOPO-TA (Invitrogen, no de catálogo 450030) de acordo com as instruções do fabricante. Depois da transformação de E. coli, células NEB5β, o DNA foi preparado a partir de colônias resistentes à ampicilina e sequenciado desde ambas as extremidades para determinar se a inserção codificada uma sequência relacionada a AAV.
Se as inserções no pCR4-TOPO TA fossem relacionadas a sequências de AAV, primers sequência-específicos eram desenhados na porção rep da sequência para realizar uma “PCR em volta do epissoma” (a seguir “ATE PCR”) a fim de obter um gene completo do capsídeo. ATE PCR baseia-se na noção de que genomas persistentes de AAV formam epissomas circulares em tecidos de animais. Assim, é possível utilizar um conjunto “divergente” de primers correspondente a uma sequência no gene rep para realizar reações em cadeia da polimerase e isolar a maior parte ou toda de qualquer sequência de AAV que possa existir naquele epissoma, mas, em particular, se poderia isolar um gene completo contíguo do capsídeo. Multímeros de epissomas podem formar-se, por exemplo por recombinação homóloga e, nesse caso, é possível isolar mais de um gene do capsídeo (que normalmente não são os mesmos) a partir de uma única reação ATE PCR.
Uma ATE PCR foi realizada em uma instrução padrão de reações em cadeia da polimerase, utilizando um programa em duas etapas como segue: incubação inicial: 95 ºC, 240 segundos; etapa de desnaturação: 95 ºC, 30 segundos; etapa de anelamento / extensão: 72 ºC, 300 segundos. As etapas de desnaturação e anelamento / extensão combinados foram realizados por 40 ciclos. A reação foi então incubada a 72 ºC, 7 minutos e armazenada a 4 ºC até que analisada. Os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese em géis de agarose 1%. Os produtos da PCR que tinham o comprimento de multímeros de um genoma de AAV (~4,5 quilobases) foram retirados do gel, purificados utilizando o kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen, catálogo no 28704) e clonados em pCR4- TOPO-TA (Invitrogen, catálogo no 450030) de acordo com as instruções do fabricante. Depois da transformação de E. coli, células NEB5β, o DNA foi preparado a partir de colônias resistentes à ampicilina, e a sequência inteira da inserção foi determinada.
Se o programa em duas etapas descrito acima não gerasse os produtos de PCR do tamanho correto, o programa seguinte em três etapas era utilizado: Incubação inicial: 95 ºC, 240 segundos, etapa de desnaturação: 95 ºC, 30 segundos, etapa de anelamento: 62 ºC, 64 ºC, 66 ºC ou 68 ºC, 30 segundos, etapa de extensão: 72 ºC, 300 segundos. As etapas de desnaturação, anelamento e extensão foram realizadas por 40 ciclos. Em seguida, a reação foi incubada a 72 ºC, 7 minutos e armazenada a 4 ºC até que analisada como acima.
Uma vez determinadas sequências inseridas completas no pCR4-TOPO TA, elas foram identificadas como genes do capsídeo de AAV utilizando o algoritmo BLAST (disponível no site da Internet do NCBI). A sua relação com AAVs conhecidos foi determinada utilizando vários programas de alinhamento de sequências de nucleotídeos ou sequência de aminoácidos tia como Clustal Omega (disponível no site da Internet do EBI) ou Vector NTI (Invitrogen, Inc.).
Para produzir AAV, genes exclusivos do capsídeo de AAV foram subclonados em um plasmídeo de expressão (pAAV-RC; Agilent, Inc.), a seguir, transfectados em células 293 juntamente com um vetor (pAAV luciferase) e plasmídeo de adenovírus auxiliar (pHELPER; Agilent, Inc.). A produção de AAV foi permitida por 3 dias e, então, foram obtidos lisados brutos por congelamento-descongelamento das células três vezes. Os resíduos foram separados em pellets e o sobrenadante (AAV bruto) foi titulada por Q-PCR para determinar um título genômico (o qual confirma que o capsídeo é capaz de montagem e empacotamento do DNA) e então usado para avaliar a transdução pelos AAVs em várias células.
As sequências de aminoácidos de VP1 das novas proteínas identificadas do capsídeo de AAV derivadas de tecidos de mamíferos são aqui descritas como SEQ ID NOS:1-7. As localizações das regiões VP2 e VP3 associadas são igualmente aqui descritas. A presente invenção é direcionada a (i) proteínas isoladas do capsídeo de AAV tendo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências de VP1 do capsídeo de SEQ ID NOS:1-7, ou as regiões VP2 ou VP3 de qualquer uma das sequências do capsídeo SEQ ID NOS:1-7, ou (ii) proteínas isoladas do capsídeo de AAV compreendendo ou consistindo em qualquer uma das sequências de VP1 do capsídeo de SEQ ID NOS:1-7, ou as regiões VP2 ou VP3 de qualquer uma das sequências do capsídeo de SEQ ID NOS:1-7. A invenção é também direcionada a uma partícula de AAV que compreende qualquer uma das proteínas do capsídeo de AAV descritas acima, em que a partícula de AAV compreende ainda quer (i) um ácido nucleico tendo repetições terminais invertidas de AAV e um transgene compreendendo um gene heterólogo operacionalmente ligado a sequências reguladoras que direcionam a expressão do gene heterólogo em uma célula hospedeira, ou (ii) um ácido nucleico compreendendo um gene heterólogo operacionalmente ligado a sequências reguladoras que controlam a expressão do gene heterólogo em uma célula hospedeira.
A neutralização das novas partículas de AAV da presente invenção por anticorpos no soro humano foi também investigada. Células HEK293T foram semeadas com densidade de
5x104 células/poço e incubadas durante a noite. rAAVs purificados foram diluídos até um título final de 2x106 vg/uL e misturados com diluições seriadas (0–10mg/mL) de IVIG por 1 hora. Os AAVs recombinantes foram adicionados a células HEK293T com MOI de 1000 e incubados a 37 ºC. Setenta e duas horas após a infecção, a neutralização por IVIG foi analisada com base na leitura de unidades relativas de luciferase (RLU). Não se usou etoposídeo nesse estudo. Os resultados são fornecidos na Tabela 3. Como esperado, a transdução de AAV2 (controle positivo) foi abolida pela adição de IVIG humana (não mostrado). Em contraste, alguns dos novos AAVs testados exibiram propriedades de resistência a IVIG.
Tabela 3: Dados de neutralização de IVIG Além disso, o ensaio de neutralização de IVIG foi repetido para comparar a neutralização das partículas de AAV recombinante tendo os capsídeos listados na Tabela 3 (indicado como “novos capsídeos”, com a neutralização de partículas de AAV recombinante endo os capsídeos controle: AAV5, AAV8 e AAV9. Como mostrado na Figura 2, o AAV tendo os capsídeos aqui revelados exibiram propriedades de resistência a IVIG.
A fim de determinar a infectividade em tecidos específicos dos capsídeos de AAV aqui revelados, foram gerados AAV que compreendiam cada um dos capsídeos e expressavam o transgene de luciferase (AAV-RSV-egfp-T2A-Fluc2). Camundongos Balb/C machos foram adquiridos do Charles River Breeding Laboratories. Uma dose de 2 x 1013 vg/kg do vetor AAV-RSV-egfp- T2A-Fluc2 foi injetada na veia do rabo de camundongos com oito semanas de idade. Em 3 e 5 semanas após a injeção, foi obtida a imagem bioluminescente in vivo utilizando um dispositivo para imagem in vivo (IVIS Lumina LT adquirido da PerkinElmer Inc., Waltham, MA). Resumidamente, os camundongos foram anestesiados com isofluorano 2% e oxigênio. 150 µL de Substrato Bioluminescente RediJect D-Luciferin 30 mg/mL foram injetados por via intraperitoneal. Dez minutos após a injeção, os animais foram visualizados com o dispositivo para imagem in vivo usando sua câmera com dispositivo acoplado de carga (CCD) refrigerado. As imagens foram obtidas na posição dorsal dos animais. A anestesia foi mantida por toda a sessão de imagens por liberação de isofluorano-oxigênio no compartimento de imagem à prova de luz.
Os camundongos foram sacrificados após as sessões de imagem em 5 semanas após a injeção de AAV. Vários órgãos foram coletados e visualizados utilizando o dispositivo para imagem. As condições de medição foram as mesmas que aquelas usadas para a imagem in vivo. Para imagem, uma fotografia em escala de cinza dos animais foi adquirida, seguida por aquisição de bioluminescência da imagem. Os dados das imagens foram processados e analisados com o software Living Image versão 4.5.2 (PerkinsElmer Waltham, MA). Regiões de interesse (ROIs) foram traçadas em volta de cada animal bem como de cada órgão individual para quantificar o fluxo total (TF) (fótons/segundo) liberado por atividade de luciferase. A atividade do fluxo total é um substituto para infectividade do AAV de cada sistema de órgãos e é mostrada para cada capsídeo de AAV na Figura 1. Os dados demonstram que os novos capsídeos produzem AAV recombinante com alto grau de especificidade por células hepáticas.
Realizaram-se experimentos adicionais como descrito acima utilizando AAV tendo os seguintes capsídeos aqui revelados (Bba.45, Bba.46, Bba.47, Bba.49, Bba.50 e Bba.51), e a transdução foi comparada com aquela de AAV com os seguintes capsídeos controle: AAV5, AAV8 e AAV9. Como mostrado na Figura 3, o AAV com os novos capsídeos exibiu um aumento em eficiência da transdução quando comparados aos AAV com os capsídeos de AAV5 ou AAV12. Por exemplo, os novos capsídeos exibem um aumento de 10- 40% vezes em eficiência da transdução em comparação ao AAV com o capsídeo de AAV5. Além disso, a Figura 4 demonstra que os AAV com os novos capsídeos exibem um grau significativamente maior de especificidade por células hepáticas em comparação ao AAV5. Além disso, os AAV com os novos capsídeos exibiram transdução de células hepáticas semelhante àquela observada com o AAV tendo capsídeos de AAV8 ou AAV9.
Exemplo 2. Avaliação da biodistribuição e atividade de novas proteínas naturais do capsídeo Para avaliar a biodistribuição e atividade dos capsídeos de AAV aqui revelados, foram gerados AAV que compreendiam os capsídeos e o transgene da subunidade beta de coriogonadotropina (cyno-CG-Beta) sob o promotor ApoE-hAAT (AAV- ApoE-hAAT-Cyno-CG-Beta). Camundongos C57BL/6J machos foram adquiridos do Jackson Laboratories Uma dose de 2 x 1013 vg/kg de AAV-ApoE-hAAT-Cyno-CG-Beta foi injetada na veia do rabo de camundongos com oito semanas de idade. Esse estudo foi realizado com AAV tendo as seguintes proteínas do capsídeo: Bba-45, Bba- 46, Bba-47, Bba-49, Bba-50 (indicados coletivamente como “novos capsídeos”) e AAV5, AAV8, AAV-Rh10 e AAV-anc80L65 (indicados coletivamente como “capsídeos controle”). O veículo controle foi a administração sem um vetor AAV.
Em 5 semanas após a injeção, a expressão do transgene cyno-CG foi avaliada medindo-se o nível plasmático da proteína bCG por espectrometria de massa. Como mostrado na Figura 5, o AAV com os novos capsídeos expressaram o transgene em um nível semelhante à expressão no AAV com o capsídeo de AAV5. No entanto, a expressão da proteína bCG no fígado foi aumentada em camundongos injetados com AAV tendo os novos capsídeos quando comparados a camundongos injetados com AAV tendo o capsídeo de AAV5 (Figura 6). O número de cópias de DNA e RNA do transgene cyno-CG no fígado de camundongos injetados com AAV tendo os novos capsídeos não foram significativamente diferentes daqueles de camundongos injetados com AAV tendo o capsídeo de AAV5 (Figuras 7A-7C). Os dados de DNA e RNA correlacionaram-se bem com os dados da proteína bCG (ver a Figura 8A-8B).
Os novos capsídeos Bba-45 a Bba-50 não levaram a níveis significativamente maiores de transdução ou transcritos quando comparados aos capsídeos controle (AAV5, AAV8, AAV-Rh10 e AAV-anc80L65). No entanto, na comparação de todos os novos capsídeos, Bba-49 alcançou os níveis maiores de transcritos e de transdução. O capsídeo Bba-49 alcançou níveis de transcritos (RNA) quase 2 vezes maiores quando comparado ao capsídeo de AAV5, mas essa diferença não é significativa (Figura7B). As razões Bba-49/AAV5 são apresentadas na Tabela 4.
Tabela 4 Razão entre Bba49 e AAV5 Proteína 2,23 RNA 1,98 DNA 0,90 A expressão do transgene bCG em hepatócitos foi avaliada por imuno-histoquímica. Todos os novos capsídeos resultaram em um percentual maior de hepatócitos expressando bCG do que o capsídeo de AAV5. Além disso, a transdução de hepatócitos pelo AAV com os novos capsídeos foi semelhante à dos capsídeos controle, AAV8, AAV-Rh10 e AAV-anc80L65 (Figuras 9 e 10).
Foram gerados AAV que compreendiam o capsídeo Bba- 49, o promotor ApoE-hAAT e o transgene de alanina glioxalato amino transferase (AGXT). Uma dose de 1E14 vg/kg de AAV-AGXT foi injetada na veia do rabo de camundongos -AGXT/-/-C57BL/6J machos com 3 a 4 semanas de idade. A transdução dos hepatócitos foi comparada à do AAV com o capsídeo de AAV5 proveniente de várias fontes. A expressão do transgene AGXT em hepatócitos foi avaliada por imuno-histoquímica. Como mostrado na Figura 11, o capsídeo Bba-49 resultou em um percentual maior de hepatócitos expressando AGXT do que o capsídeo de AAV5 testado. O AAV.Bba-
49. AGXT transduziu aproximadamente 96% dos hepatócitos.

Claims (32)

REIVINDICAÇÕES
1. Vírus adeno-associado (AAV), caracterizado pelo fato de que compreende uma proteína da capsídeo, em que a proteína do capsídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica a (i) qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7, (ii) a região VP2 de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7 ou (iii) a região VP3 de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7, e de que compreende ainda um transgene compreendendo um gene heterólogo operacionalmente ligado a uma sequência reguladora que controla a expressão do gene heterólogo em uma célula hospedeira.
2. AAV de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína do capsídeo compreende a sequência de aminoácidos de (i) qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7, (ii) a região VP2 de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7 ou (iii) a região VP3 de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7.
3. Vírus adeno-associado (AAV), caracterizado pelo fato de que compreende uma proteína do capsídeo, em que a proteína do capsídeo compreende um fragmento funcional de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 1-7, e de que compreende ainda um transgene compreendendo um gene heterólogo operacionalmente ligado a uma sequência reguladora que controla a expressão do gene heterólogo em uma célula hospedeira.
4. AAV de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o capsídeo compreende uma ou mais das regiões variáveis (VR), das regiões constantes que estão localizadas entre as regiões variáveis, o domínio GBS e a alça GH da sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1-7.
5. Vírus adeno-associado, caracterizado pelo fato de que compreende uma proteína do capsídeo, em que a proteína do capsídeo compreende uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de nucleotídeos que hibridiza com (i) uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 8-14, (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica a região VP2 da sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1-7 ou (iii) uma sequência de nucleotídeos que codifica a região VP3 da sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1-7, e de que compreende ainda um transgene compreendendo um gene heterólogo operacionalmente ligado a uma sequência reguladora que controla a expressão do gene heterólogo em uma célula hospedeira.
6. AAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda repetições terminais invertidas de AAV.
7. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o AAV conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e um veículo fisiologicamente compatível.
8. Método para a entrega de um transgene a uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende colocar a célula em contato com o AAV conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
9. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o AAV conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 para a entrega de um transgene a uma célula.
10. Uso do AAV conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para a entrega de um transgene a uma célula.
11. Método, composição ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula hepática.
12. Método para o tratamento de um indivíduo que sofre de um transtorno ou doença associada com a atividade anormal de uma proteína endógena, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um AAV que compreende uma proteína do capsídeo, em que a proteína do capsídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica a (i) qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7, (ii) a região VP2 de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7 ou (iii) a região VP3 de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7, e em que o AAV compreende um transgene que codifica uma cópia biologicamente ativa da proteína.
13. Método para o tratamento de um indivíduo que sofre de um transtorno ou doença associada com a atividade anormal de uma proteína endógena, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um AAV conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o transtorno ou doença é associado com a atividade anormal de um gene endógeno expresso em uma célula hepática.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que o transtorno ou doença é selecionado a partir do grupo que consiste em hemofilia A, hemofilia B, doença de Wilson, angioedema hereditário (AEH), deficiência de alfa-1 antitripsina e galactosemia.
16. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína do capsídeo de vírus adeno-associado (AAV) tendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica a (i) qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7, (ii) a região VP2 de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7 ou (iii) a região VP3 de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7.
17. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína do capsídeo de vírus adeno-associado (AAV), em que a sequência de nucleotídeos hibridiza com (i) uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 8-14, (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica a região VP2 de qualquer uma dentre
SEQ ID NOS:1-7 ou (iii) uma sequência de nucleotídeos que codifica a região VP3 de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7.
18. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína do capsídeo, em que a proteína do capsídeo compreende um fragmento funcional de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 1-7.
19. Vetor de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o capsídeo compreende uma ou mais das regiões variáveis (VR), das regiões constantes que estão localizadas entre as regiões variáveis, o domínio GBS e a alça GH da sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1-7.
20. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico está operacionalmente ligado a um elemento regulador heterólogo que controla a expressão da proteína do capsídeo em uma célula hospedeira.
21. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor conforme definido em qualquer uma das reivindicações 16 a
20.
22. Uso de um AAV conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o tratamento de um transtorno ou doença.
23. Uso de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o transtorno ou doença é associado com a atividade anormal de uma proteína endógena e ainda em o AAV compreende um transgene que codifica uma cópia biologicamente ativa da proteína.
24. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 ou 23, caracterizado pelo fato de que o transtorno ou doença é selecionado a partir do grupo que consiste em hemofilia A, hemofilia B, doença de Wilson, angioedema hereditário (AEH), deficiência de alfa-1 antitripsina e galactosemia.
25. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um AAV conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 para o tratamento de uma doença ou transtorno.
26. Composição de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que o transtorno ou doença é associado com a atividade anormal de uma proteína endógena e ainda em que o AAV compreende um transgene que codifica uma cópia biologicamente ativa da proteína.
27. Composição de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o transtorno ou doença é selecionado a partir do grupo que consiste em hemofilia A, hemofilia B, doença de Wilson, angioedema hereditário (AEH), deficiência de alfa-1 antitripsina e galactosemia.
28. Método para a produção de um vírus adeno-associado (AAV) conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar uma célula para produção viral na qual tenha sido introduzido um primeiro vetor de ácido nucleico que compreende sequências de repetições terminais invertidas 5' e 3' de AAV flanqueando um transgene compreendendo um gene heterólogo operacionalmente ligado a sequências reguladoras que controlam a expressão do gene heterólogo em uma célula hospedeira, e um segundo vetor de ácido nucleico que compreende sequências de ácidos nucleicos de rep e cap de AAV, em que a dita sequência de ácido nucleico de cap codifica um capsídeo de AAV e é pelo menos 95% idêntica a qualquer uma dentre SEQ ID NOS:1-7; e (b) recuperar o AAV do sobrenadante da cultura de células para produção viral.
29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a célula para produção viral é uma célula de mamífero.
30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a célula de mamífero é selecionada a partir do grupo que consiste em células HEK293, HeLa, CHO, NS0, SP2/0, PER.C6, Vero, RD, BHK, HT 1080, A549, Cos-7, ARPE-19 e MRC-5.
31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a célula de mamífero é uma célula HEK293.
32. Vírus adeno-associado (AAV), caracterizado pelo fato de que é produzido pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 28 a 31.
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