KR20210010496A - 신규 간 표적화 아데노-연관 바이러스 벡터 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규 아데노-연관 바이러스(AAV) 캡시드 단백질, 신규 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 입자, 이들 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이들 캡시드 단백질을 발현하는 AAV 벡터에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 신규 캡시드 단백질을 발현하는 본원에 기재된 AAV 벡터를 제조하는 방법 및 이의 연관된 치료 용도에 관한 것이다.

Description

신규 간 표적화 아데노-연관 바이러스 벡터
본 출원은 그 전체가 본원에 참고로 포함되는, 2018년 5월 14일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/671,265호의 우선권을 주장한다.
전자적으로 제출된 자료의 참고에 의한 포함
본 출원은 2019년 5월 10일자로 생성되고, 크기가 68,361 바이트이고, 파일명이 53120_Seqlisting.txt로 표시되고 그 전체가 참고로 포함되는 컴퓨터-판독가능한 형태의 서열 목록을 본 발명의 별도 부분으로서 포함한다.
발명의 분야
본 발명은 신규 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus)(AAV) 캡시드 단백질에 관한 것이며, AAV 입자는 신규 캡시드 단백질, 이들 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이들 캡시드 단백질을 발현하는 AAV 벡터를 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 신규 캡시드 단백질을 발현하는 본원에 기재된 AAV 벡터를 제조하는 방법 및 이의 연관된 치료 용도에 관한 것이다.
AAV는 145 뉴클레오티드 역위 말단 반복부(inverted terminal repeat)(ITR)를 포함하는, 길이가 약 4.7 kb인 단일-가닥 DNA 게놈인 복제-결함성 파르보바이러스이다. AAV 혈청형 2(AAV2) 게놈의 뉴클레오티드 서열은 Ruffing et al., J. Gen. Virol., 75: 3385-3392 (1994)에 의해 교정된 Srivastava et al., J. Virol., 45: 555-564 (1983)에 제시되어 있다. 바이러스 DNA 복제(rep), 이입(encapsidation)/패키징 및 숙주 세포 염색체 통합을 지시하는 cis-작용 서열은 ITR 내에 함유된다. 3 개 AAV 프로모터, p5, p19, 및 p40(이의 상대적 맵(map) 위치에 대해 명명됨)은 rep 및 cap 유전자를 코딩하는 2 개 AAV 내부 개방 판독 프레임의 발현을 구동한다. (뉴클레오티드 2107 및 2227의) 단일 AAV 인트론의 차등 스플라이싱과 결합된 2 개 rep 프로모터(p5 및 p19)는 rep 유전자로부터 4 개 rep 단백질(rep 78, rep 68, rep 52, 및 rep 40)의 생산을 야기한다. rep 단백질은 궁극적으로 바이러스 게놈 복제를 담당하는 다중 효소 특성을 보유한다. cap 유전자는 p40 프로모터로부터 발현되고 이는 3 개 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및 VP3를 코딩한다. 선택적 스플라이싱 및 비-컨센서스 번역 개시 부위는 3 개의 관련된 캡시드 단백질의 생산을 담당한다. 단일 컨센서스 폴리아데닐화 부위는 AAV 게놈의 맵 위치 95에 위치한다. AAV의 생애 주기 및 유전학은 Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992)에 검토되어 있다.
AAV가 인간 세포를 감염시킬 때, 바이러스 게놈은 염색체 19 내로 통합되어, 세포의 잠복 감염을 야기할 수 있다. 감염성 바이러스의 생산은 세포가 헬퍼 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스)로 감염되지 않는 경우, 발생하지 않는다. 아데노바이러스의 경우에, 유전자 E1A, E1B, E2A, E4 및 VA는 헬퍼 기능을 제공한다. 헬퍼 바이러스로 감염시, AAV 프로바이러스는 구제되고 증폭되며, AAV 및 아데노바이러스 둘 다가 생산된다.
AAV는 예를 들어, 유전자 요법에서 이를 면역원성 펩티드/폴리펩티드를 발현하기 위한 백신 벡터로서 및 외부 DNA를 세포로 전달하기 위한 벡터로서 매력적이 되게 하는 고유한 특징을 보유한다. 배양액에서 세포의 AAV 감염은 비-세포변성이고, 인간 및 다른 동물의 자연 감염은 조용하고 무증상이다. 또한, AAV는 많은 포유동물 세포를 감염시켜, 생체내(in vivo)에서 많은 상이한 조직을 표적화할 수 있게 한다. AAV 프로바이러스 게놈은 플라스미드에서 클로닝된 DNA로서 감염성이며, 이는 재조합 게놈의 구축을 실현가능하게 한다. 또한, AAV 복제, 게놈 이입 및 통합을 지시하는 신호가 AAV 게놈의 ITR 내에 함유되기 때문에, 내부 약 4.3 kb의 게놈(복제 및 구조적 캡시드 단백질, rep-cap을 코딩함)의 일부 또는 전부는 외부 DNA, 예컨대 프로모터, 관심 DNA 및 폴리아데닐화 신호를 함유하는 유전자 카세트로 치환될 수 있다. rep 및 cap 단백질은 트랜스(trans)로 제공될 수 있다. AAV의 다른 유의미한 특징은 그것이 극히 안정적이고 왕성한 바이러스라는 것이다. 이는 비활성 아데노바이러스에 사용되는 조건(수시간 동안 56℃ 내지 65℃)을 용이하게 견뎌, rAAV-벡터의 냉각 보존을 덜 위태롭게 한다. AAV는 또한 동결건조될 수 있다. 마지막으로, AAV-감염된 세포는 중복감염에 대해 저항성이 아니다.
AAV는 수많은 포유동물 유전자 요법 적용에서 사용되며, 유전자 요법 적용에서 사용되는 새롭고/새롭거나 변형된 AAV 벡터 및 연관된 바이러스에 대한 필요성이 있다. 본 발명은 본 발명의 신규 AAV 캡시드 단백질을 발현하는 신규 AAV 벡터, 및 상기 벡터 또는 캡시드 단백질을 포함하는 신규 비-천연 발생 AAV 비리온을 제공한다.
본 발명은 신규 VP1, VP2 또는 VP3 캡시드 단백질일 수 있는 신규 AAV 캡시드 단백질, 이들 캡시드 단백질을 포함하는 비-천연 발생 AAV 바이러스, 및 유전자 요법 적용을 위한 이러한 AAV 바이러스의 용도 및 유전자 요법 적용을 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 다양한 포유동물 조직으로부터 단리되고 확인되었다. 특정 신규 포유동물-유래된 AAV 캡시드 VP1 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1-7로서 기재되어 있으며, 각각의 VP2 및 VP3 서열의 연관된 위치가 또한 본원에 기재되어 있다. 종합적으로, 신규 캡시드 단백질은 본원에서 "본 발명의 AAV 캡시드 단백질"로서 지칭된다.
일 실시양태에서, 본 발명은 (i) 서열번호 1-7 중 어느 하나, (ii) 서열번호 1-7 중 어느 하나의 VP2 영역, 또는 (iii) 서열번호 1-7 중 어느 하나의 VP3 영역과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질을 갖고, 트랜스유전자를 추가로 갖고, 트랜스유전자가 숙주 세포에서 이종 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 이종 유전자로 구성된 아데노-연관 바이러스(AAV)를 제공한다. 다른 실시양태에서, 캡시드 단백질은 (i) 서열번호 1-7 중 어느 하나, (ii) 서열번호 1-7 중 어느 하나의 VP2 영역, 또는 (iii) 서열번호 1-7 중 어느 하나의 VP3 영역의 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, AAV는 AAV 역위 말단 반복부 서열을 갖는다. 추가 실시양태에서, AAV는 생리학적 양립성 담체와 혼합된다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 세포를 본원에 개시된 임의의 AAV와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에 트랜스유전자를 전달하는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 AAV의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, AAV가 단백질의 생물학적 활성 복제물을 코딩하는 트랜스유전자를 갖는, 내인성 단백질의 비정상적 활성과 연관된 장애 또는 질환으로부터 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 간 세포에 트랜스유전자를 전달하는 단계를 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 세포, 예컨대 간 세포에 트랜스유전자를 전달하기 위한 본 발명의 임의의 AAV를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 세포에 트랜스유전자를 전달하기 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 임의의 AAV의 용도를 제공한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 단리된 아데노-연관 바이러스(AAV) 캡시드 단백질을 제공하며, 캡시드 단백질은 (i) 서열번호 1-7 중 어느 하나의 VP1 아미노산 서열 또는 서열번호 1-7 중 어느 하나의 VP2 또는 VP3 영역과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열 또는 (ii) 서열번호 1-7 중 어느 하나를 포함하는 VP1 아미노산 서열 또는 서열번호 1-7 중 어느 하나의 VP2 또는 VP3 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 캡시드 단백질은 이종 아미노산 서열에 연결된다. 또한, 본 발명은 임의의 이들 캡시드 단백질을 갖거나 포함하는 비-천연 발생 AAV 입자를 제공한다. 특정 실시양태에서, 임의의 상기 기재된 VP1, VP2 또는 VP3 캡시드 단백질을 포함하는 비-천연 발생 AAV 입자는 AAV 역위 말단 반복부를 갖는 핵산 및 숙주 세포에서 이종 유전자의 발현을 지시하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 이종 유전자를 포함하는 트랜스유전자를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 VP1, VP2 또는 VP3 캡시드 서열을 포함하는 비-천연 발생 AAV 입자는 숙주 세포에서 트랜스유전자 발현을 제어하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 이종 트랜스유전자를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이종 유전자" 또는 "이종 조절 서열"은 언급된 유전자 또는 조절 서열이 AAV 벡터 또는 입자에서 자연적으로 존재하지 않고 이에 인공적으로 도입된다는 것을 의미한다. 용어 "트랜스유전자"는 이종 유전자 및 숙주 세포에서 이종 유전자의 발현을 제어하는 이종 유전자에 작동가능하게 연결된 조절 서열 둘 다를 포함하는 핵산을 지칭한다.
또한, 본 발명은 아데노-연관 바이러스(AAV) 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 캡시드 단백질은 (i) 서열번호 1-7 중 어느 하나의 VP1 아미노산 서열 또는 서열번호 1-7 중 어느 하나의 VP2 또는 VP3 영역과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 또는 (ii) 서열번호 1-7 중 어느 하나를 포함하는 VP1 아미노산 서열 또는 서열번호 1-7 중 어느 하나의 VP2 또는 VP3 영역을 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 이종 조절 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 이와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 비-천연 발생이라는 것이 이해된다. 또한, 본 발명은 이종 조절 서열에 작동가능하게 연결된 임의의 이들 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAV 벡터 및 약학 조성물을 포함하여, 이들 AAV 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 이종 트랜스유전자 서열을 포함하는 단리된 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 제공하며, 캡시드 단백질은 (i) 서열번호 1-7 중 어느 하나의 VP1 아미노산 서열 또는 서열번호 1-7 중 어느 하나의 VP2 또는 VP3 영역과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 또는 (ii) 서열번호 1-7 중 어느 하나를 포함하는 VP1 아미노산 서열 또는 서열번호 1-7 중 어느 하나의 VP2 또는 VP3 영역을 포함한다. 또한, 본 발명은 약학 조성물을 포함하여, 이들 AAV 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 캡시드 단백질을 포함하고, 캡시드 단백질이 서열번호 1-7 중 어느 하나의 기능성 단편을 포함하고, 숙주 세포에서 이종 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 이종 유전자를 포함하는 트랜스유전자를 추가로 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV)를 제공한다. 예를 들어, 기능성 단편은 서열번호 1-7 중 어느 하나의 아미노산 서열의 가변 영역(variable region)(VR), 가변 영역 사이에 위치한 불변 영역, GBS 도메인, 및 GH 루프 중 하나 이상을 포함한다. 또한, 본 발명은 약학 조성물을 포함하여, 이들 AAV 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 캡시드 단백질을 포함하고, 캡시드 단백질이 (i) 서열번호 1-7 중 어느 하나의 아미노산 서열, (ii) 서열번호 1-7 중 어느 하나의 아미노산 서열의 VP2 영역, 또는 서열번호 1-7 중 어느 하나의 아미노산 서열의 VP3 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 하이브리드화되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하고, 숙주 세포에서 이종 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 이종 유전자를 포함하는 트랜스유전자를 추가로 포함하는 아데노-연관 바이러스를 제공한다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 엄격한 조건 하에서 본 발명의 캡시드 단백질 또는 캡시드 단백질의 기능성 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 하이브리드화된다. 또한, 본 발명은 약학 조성물을 포함하여, 이들 AAV 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
"가변 영역"은 AAV 캡시드 단백질의 VP1 서열 내의 9 개 가변 영역을 지칭한다. 가변 영역(VR)은 본원에서 VR I, VR II, VR III VR IV, VR V, VR VI, VR VII, VR VIII 및 VR IX로서 지칭되고, 다양한 VP1 서열에서 이의 각각의 위치가 본원에 기재된다. VR은 AAV VP1 캡시드 서열 내에서 최고 서열 및 구조적 변이를 나타내며, 또한 수용체 부착, 트랜스유전자의 전사 활성화, 조직 형질도입 및 항원성의 역할을 가질 수 있다.
"글리칸 결합 서열(glycan binding sequence)(GBS)" 또는 'GBS 도메인" 또는 "GBS 영역"은 바이러스 캡시드의 글리칸 결합 특이성을 지배하는 VR IV와 VR V 사이에 위치한 아미노산 서열을 지칭한다. 다양한 AAV VP1 아미노산 서열에서 GBS 영역의 위치가 본원에 기재되며, 다른 AAV VP1 아미노산 서열로부터의 것은 당업계에 알려져 있고/있거나 일상적으로 확인될 수 있다.
"GH 루프"는 캡시드 단백질의 내부 β-배럴 내의 β-가닥 G 및 β-가닥 H 측면에 있는 루프 서열을 지칭한다. "GH 루프" 서열은 포함된 GBS 서열 및 공여체로부터의 모든 산재된 보존 백본 서열을 포함하는 가변 영역 VR IV 내지 VR VIII을 포함한다. 다양한 AAV VP1 아미노산 서열에서 GH 루프 영역의 위치가 본원에 기재되며, 다른 AAV VP1 아미노산 서열로부터의 것은 일상적으로 확인될 수 있다.
VR, GBS 및 GH 루프 영역의 본원에 기재된 위치와 관련하여, 상기 영역의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치는 이들이 본원에 명확하게 기재된 바와 같이(특히, 표 2에서), 상기 영역의 아미노산 위치로부터 최대 1 아미노산, 2 아미노산, 3 아미노산, 4 아미노산 또는 5 아미노산 만큼 달라질 수 있다. 본원에 정의된 바와 같이 N-말단 및/또는 C-말단 단부 상에서 최대 5 아미노산 달라지는 치환된 VR, GBS 및/또는 GH 루프 영역(들)을 포함하는 신규 캡시드 서열은 본 발명에 의해 포함된다.
본 발명은 본 발명의 임의의 AAV 벡터로 형질주입되었던 세포를 배양하는 단계 및 형질주입된 세포의 상청액으로부터 재조합 AAV 입자를 회수하는 단계를 포함하는, 재조합 아데노-연관 바이러스(AAV) 입자를 생산하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 임의의 바이러스 벡터 또는 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 입자 및 이들 바이러스 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
본 발명의 일 실시양태는 숙주 세포에서 이종 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 이종 유전자를 갖는 트랜스유전자 측면에 있는 5' 및 3' AAV 역위 말단 반복부 서열을 갖는 제1 핵산 벡터, 및 AAV rep 및 cap 핵산 서열을 갖고, 상기 cap 핵산 서열이 서열번호 1-7 중 어느 하나와 적어도 95% 동일한 AAV 캡시드를 코딩하는 제2 핵산 벡터가 도입되었던 바이러스 생산 세포를 배양하는 것; 및 바이러스 생산 세포 배양액의 상청액으로부터 AAV를 회수하는 것에 의해 본원에 기재된 임의의 재조합 AAV를 생산하는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 바이러스 생산 세포는 포유동물이다. 바람직한 실시양태에서, 곤충 세포는 HEK293 세포이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 AAV 벡터 또는 바이러스의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 장애 또는 질환을 앓는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 장애 또는 질환의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 임의의 AAV 벡터 또는 바이러스의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 질환 또는 장애의 치료를 위한 본 발명의 임의의 AAV 벡터 또는 바이러스를 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 대상체에서의 질환 또는 장애는 내인성 단백질의 비정상적 활성과 연관된다. 본원에 사용된 바와 같이, "내인성 단백질"은 질환 또는 장애를 앓는 대상체의 게놈에 의해 코딩된 단백질 또는 유전자 생산물을 의미한다.
"AAV 비리온" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "AAV 벡터 입자" 또는 "AAV 바이러스"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡시드로 싸여진 폴리뉴클레오티드 AAV 벡터로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다. 입자가 이종 폴리뉴클레오티드(즉, 포유동물 세포로 전달될 트랜스유전자와 같은 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 경우, 이는 통상적으로 "AAV 벡터 입자" 또는 간단하게 "AAV 벡터"로서 지칭된다. 따라서, AAV 벡터 입자의 생산은 필수적으로 AAV 벡터의 생산을 포함하며, 이는 이러한 벡터가 AAV 벡터 입자 내에 함유되기 때문이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 임의의 AAV 벡터를 포함하는 세포, 및 본 발명의 이들 세포에 의해 생산된 바이러스 입자를 제공한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "역위 말단 반복부(ITR)"는 DNA 복제의 원점 및 바이러스 게놈에 대한 패키징 신호로서 cis로 기능하는 AAV 게놈의 5' 및 3' 말단에서 발견되는 당업계-인식된 영역을 지칭한다. AAV ITR은 AAV rep 코딩 영역과 함께 플라스미드 벡터로부터의 효율적인 삭제 및 구제, 및 2 개의 측면에 있는 ITR 사이에 삽입된 뉴클레오티드 서열의 숙주 세포 게놈 내로의 통합을 제공한다. 특정 AAV-연관 ITR의 서열은 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Yan et al., J. Virol. 79(1):364-379 (2005)에 의해 개시되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 어구 "생산적 AAV 감염을 생성하기 위한 헬퍼 기능"은 발현되어, AAV 유전자 생산물을 제공하고, 결국 생산적 AAV 복제를 위해 트랜스로 기능할 수 있는 AAV-유래된 코딩 서열을 지칭한다. 따라서, AAV 헬퍼 기능은 rep 및 cap 영역을 포함한다. rep 발현 생산물은 특히 DNA 복제의 AAV 원점의 인식, 결합 및 니킹(nicking); DNA 헬리카제 활성; 및 AAV(또는 다른 이종) 프로모터로부터의 전사의 변형을 포함한 많은 기능을 보유하는 것으로 나타났다. cap 발현 생산물은 필요한 패키징 기능을 공급한다. AAV 헬퍼 기능은 본원에서 AAV 벡터로부터 결여된 트랜스로의 AAV 기능을 보완하기 위해 사용된다. 또한, 생산적 AAV 감염을 생성하기 위한 헬퍼 기능은 바큘로바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스, 또는 백시니아 바이러스로부터의 특정 헬퍼 기능을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 바이러스 구조체는 AAV rep 및 cap 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "AAV rep 유전자"는 바이러스 게놈을 복제하고 잠복 감염 동안 바이러스 게놈을 숙주 게놈 내로 삽입하기 위해 필요한 바이러스의 복제 단백질을 코딩하는 AAV 게놈의 당업계-인식된 영역을 지칭한다. AAV rep 코딩 영역의 추가 기재에 대해, 예를 들어 Muzyczka et al., Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129 (1992); Kotin et al., Human Gene Therapy 5:793-801 (1994)을 참고하며, 이의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 본원에 사용된 바와 같은 rep 코딩 영역은 상기 기재된 AAV 혈청형과 같은 임의의 바이러스 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 상기 영역은 야생형 유전자 전부를 포함할 필요는 없지만, 예를 들어 rep 유전자가 적합한 수용체 세포에서 발현될 때, 소망하는 기능적 특징을 함유하는 한, 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "AAV cap 유전자"는 바이러스 게놈을 패키징하기 위해 필요한 바이러스의 외피 단백질을 코딩하는 AAV 게놈의 당업계-인식된 영역을 지칭한다. cap 코딩 영역의 추가 기재에 대해, 예를 들어 Muzyczka et al., Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129 (1992); Kotin et al., Human Gene Therapy 5:793-801 (1994)을 참고하며, 이의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 본원에 사용된 바와 같은 AAV cap 코딩 영역은 상기 기재된 바와 같은 임의의 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 상기 영역은 야생형 cap 유전자 전부를 포함할 필요는 없지만, 예를 들어 유전자가 AAV 벡터와 함께 숙주 세포 내에 존재할 때, 충분한 패키징 기능을 제공하는 한, 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있다.
용어 "형질주입"은 세포에 의한 외부 DNA의 흡수를 지칭하기 위해 사용된다. 세포는 외인성 DNA가 세포막 내부로 도입되었을 때 "형질주입"되었다. 다수의 형질주입 기술은 일반적으로 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, Graham et al., Virology 52:456 (1973); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier (1986); Chu et al., Gene 13:197 (1981)을 참고하며, 이의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 이러한 기술은 하나 이상의 외인성 DNA 모이어티, 예컨대 뉴클레오티드 통합 벡터 및 다른 핵산 분자를 적합한 숙주 세포 내로 도입하기 위해 사용될 수 있다. 상기 용어는 화학적, 전기적, 및 바이러스-매개된 형질주입 절차를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원은 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 AAV 입자를 기재한다. 일부 실시양태에서, AAV 입자는 이의 게놈 내에 이종 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다.
용어 "이종 단백질 또는 펩티드"는 태그, 예컨대 몇가지 나열하면, 헥사히스티딘, FLAG, myc, 폴리히스티딘, 또는 표지 또는 면역원, 아쥬반트, 선택 마커, 치료 단백질 또는 표적화 단백질 또는 펩티드를 포함하는 야생형 AAV에 의해 발현되지 않는 임의의 단백질을 지칭한다.
본원에 기재된 예시적 이종 단백질은, 비제한적으로, β-글로빈, 헤모글로빈, 조직 플라스미노겐 활성제, 및 응고 인자; 집락 자극 인자(CSF); 인터류킨, 예컨대 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 등; 성장 인자, 예컨대 케라티노사이트 성장 인자(KGF), 줄기 세포 인자(SCF), 섬유아세포 성장 인자(FGF, 예컨대 염기성 FGF 및 산성 FGF), 간세포 성장 인자(HGF), 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 골 형성 단백질(BMP), 표피 성장 인자(EGF), 성장 분화 인자-9(GDF-9), 간암 유래된 성장 인자(HDGF), 마이오스타틴(GDF-8), 신경 성장 인자(NGF), 뉴로트로핀, 혈소판-유래된 성장 인자(PDGF), 트롬보포이에틴(TPO), 형질전환 성장 인자 알파(TGF-α), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β) 등; 가용성 수용체, 예컨대 가용성 TNF-α 수용체, 가용성 인터류킨 수용체(예를 들어, 가용성 IL-1 수용체 및 가용성 II 형 IL-1 수용체), 가용성 γ/Δ T 세포 수용체, 가용성 수용체의 리간드-결합 단편 등; 효소, 예컨대 α-글루코시다아제, 이미글루세라아제, β-글루코세레브로시다아제, 및 알글루세라아제; 효소 활성제, 예컨대 조직 플라스미노겐 활성제; 케모카인, 예컨대 1P-10, 인터페론-감마에 의해 유도된 모노카인(Mig), Groα/IL-8, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, MCP-1, PF-4 등; 혈관형성제, 예컨대 혈관 내피 성장 인자(VEGF, 예를 들어 VEGF121, VEGF165, VEGF-C, VEGF-2), 신경교종-유래된 성장 인자, 안지오제닌, 안지오제닌-2 등; 항-혈관형성제, 예컨대 가용성 VEGF 수용체; 단백질 백신; 신경자극성 펩티드, 예컨대 신경 성장 인자(NGF), 브라디키닌, 콜레시스토키닌, 가스틴, 세크레틴, 옥시토신, 성선자극호르몬-방출 호르몬, 베타-엔도르핀, 엔케팔린, P 물질, 소마토스타틴, 프롤락틴, 갈라닌, 성장 호르몬-방출 호르몬, 봄베신, 다이놀핀, 와파린, 뉴로텐신, 모틸린, 티로트로핀, 신경펩티드 Y, 황체형성 호르몬, 칼시토닌, 인슐린, 글루카곤, 바소프레신, 안지오텐신 II, 티로트로핀-방출 호르몬, 혈관작용 장 펩티드, 슬립 펩티드(sleep peptide) 등; 혈전용해제; 심방 나트륨이뇨 펩티드; 릴랙신; 신경교 섬유질 산성 단백질; 여포 자극 호르몬(FSH); 인간 알파-1 항트립신; 백혈병 억제 인자(LIF); 조직 인자, 황체형성 호르몬; 대식세포 활성 인자; 종양 괴사 인자(TNF); 호중구 주화성 인자(NCF); 금속단백분해효소의 조직 억제제; 혈관작용 장 펩티드; 안지오제닌; 안지오트로핀; 피브린; 히루딘; IL-1 수용체 길항제; 섬모 향신경성 인자(CNTF); 뇌-유래된 향신경성 인자(BDNF); 뉴로트로핀 3 및 4/5(NT-3 및 4/5); 신경아교세포 유래된 향신경성 인자(GDNF); 방향족 아미노산 탈탄산효소(AADC); Factor VIII, Factor IX, Factor X; 디스트로핀 또는 니니-디스트로핀(nini-dystrophin); 리소좀 산 리파아제; 페닐알라닌 하이드록실라아제(PAH); 당원병-관련된 효소, 예컨대 글루코오스-6-포스파타아제, 산 말타아제, 글리코겐 가지절단 효소, 근육 글리코겐 포스포릴라아제, 간 글리코겐 포스포릴라아제, 근육 포스포프룩토키나아제, 포스포릴라아제 키나아제, 글루코오스 수송체, 알돌라아제 A, β-에놀라아제, 글리코겐 합성효소; 및 리소좀 효소를 포함한다.
도 1은 지정된 신규 캡시드 단백질을 갖는 AAV의 감염성의 상대적 조직 특이성을 나타내는 표의 세트이다. 데이터는 각각의 조직에서의 총 플럭스(Total Flux)(광자/초/cm2/라디안)로서 제시된다. 각각의 조직에 대해, 상부 열은 평균 플럭스를 나타내고 하부 열은 표준 편차를 나타낸다.
도 2는 신규 캡시드인 Bba-45, Bba-46, Bba-47, Bba-50 및 Bba-51 및 대조군 캡시드인 AAV5, AAV8 및 AAV9에 대한 IVIG 중화 에세이로부터의 데이터를 제공한다. 이 에세이는 신규 캡시드가 IVIG 저항성을 나타내었다는 것을 입증한다.
도 3은 신규 캡시드인 Bba-45, Bba-46, Bba-47, Bba-50 및 Bba-51 및 대조군 캡시드인 AAV5, AAV8 및 AAV9에 대한 형질도입 데이터를 제공한다. 이 데이터는 다중 실험에서 생성되었으며 각각의 캡시드에 대한 다중 데이터 포인트는 상이한 실험을 나타낸다. 신규 캡시드를 갖는 AAV는 AAV5와 비교하여 상당히 높은 정도의 간 세포에 대한 특이성을 갖는다. 데이터는 각각의 기관계의 AAV 감염성에 대한 대용물인 총 플럭스 활성으로서 나타내었다.
도 4는 신규 캡시드인 Bba-45, Bba-46, Bba-47, Bba-50 및 Bba-51 및 대조군 캡시드인 AAV5, AAV8 및 AAV9에 대한 다중 조직에서의 형질도입 데이터를 제공한다. 이 데이터는 신규 캡시드를 갖는 AAV가 AAV5와 비교하여 상당히 높은 정도의 간 세포에 대한 특이성을 갖는다는 것을 입증한다.
도 5는 신규 캡시드인 Bba-45, Bba-46, Bba-47, Bba-49 및 Bba-50 및 대조군 캡시드인 AAV8, AAV-rh10 및 AAV-anc80L65의 주사 후 혈장 bCG 단백질 수준을 제공한다.
도 6은 신규 캡시드인 Bba-45, Bba-46, Bba-47, Bba-49 및 Bba-50 및 대조군 캡시드인 AAV8, AAV-rh10 및 AAV-anc80L65의 주사 후 간 및 혈장에서의 bCG 단백질 수준을 제공한다.
도 7a-7c는 신규 캡시드인 Bba-45, Bba-46, Bba-47, Bba-49 및 Bba-50 및 대조군 캡시드인 AAV8, AAV-rh10 및 AAV-anc80L65의 주사 후 간에서의 bCG DNA(패널 a), bCG RNA(패널 b) 및 bCG 단백질(패널 c)의 수준을 제공한다.
도 8a-8b는 신규 캡시드인 Bba-45, Bba-46, Bba-47, Bba-49 및 Bba-50 및 대조군 캡시드인 AAV8, AAV-rh10 및 AAV-anc80L65의 주사 후 간에서의 bCG DNA 및 bCG RNA 수준이 간에서의 bCG 단백질 수준과 상관관계가 있다는 것을 입증한다.
도 9는 면역조직화학에 의해 결정된 바와 같은 신규 캡시드인 Bba-45, Bba-46, Bba-47, Bba-49 및 Bba-50 및 대조군 캡시드인 AAV8, AAV-rh10 및 AAV-anc80L65의 주사 후 AAV에 의해 형질도입된 간세포의 퍼센트를 제공한다.
도 10은 신규 캡시드인 Bba-45, Bba-46, Bba-47, Bba-49 및 Bba-50 및 대조군 캡시드인 AAV8, AAV-rh10 및 AAV-anc80L65의 주사 후 간세포의 면역조직화학 염색을 나타내는 예시적 사진을 제공한다.
도 11은 다양한 공급원으로부터의 신규 캡시드 Bba-49 및 AAV5 캡시드를 갖는 AAV에 의해 형질도입된 간세포의 퍼센트를 제공한다. 이들 AAV는 -AGXT 트랜스유전자로 간세포를 형질도입하였다. AAV.Bba-49. AGXT는 약 96%의 간세포를 형질도입하였다.
본 발명은 신규 AAV 캡시드 단백질, 상기 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 및 상기 신규 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 바이러스를 제공한다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 다양한 포유동물 조직으로부터 단리되고 확인되었다. 신규 AAV 캡시드 VP1 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1-7로서 기재되어 있으며, 연관된 VP2 및 VP3 영역의 위치가 본원에 개시되어 있다.
AAV 벡터
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "AAV"는 아데노-연관 바이러스에 대한 표준 약어이다. 아데노-연관 바이러스는 특정 기능이 헬퍼 바이러스를 공동-감염시킴으로써 제공되는 세포에서만 성장하는 단일-가닥 DNA 파르보바이러스이다. 최근에는 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 특징지어진 적어도 13 개 혈청형의 AAV가 있다. AAV의 일반 정보 및 검토는 예를 들어, Carter, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pp. 169-228 (1989), 및 Berns, Virology, pp. 1743-1764, Raven Press, (New York, 1990)에서 찾아볼 수 있다. 그러나, 이들 동일한 원리는 추가 AAV 혈청형에 적용가능할 것으로 완전히 예상되며, 이는 다양한 혈청형은 유전자 수준에서도 구조적 및 기능적 둘 다로 매우 밀접하게 관련되어 있다는 것이 잘 알려져 있기 때문이다(예를 들어, Blacklowe, pp. 165-174 of Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed. (1988); and Rose, Comprehensive Virology 3:1-61 (1974) 참고). 예를 들어, 모든 AAV 혈청형은 상동성 rep 유전자에 의해 매개된 매우 유사한 복제 특성을 명확하게 나타내며; 모두 AAV6에서 발현된 것과 같은 3 개의 관련 캡시드 단백질을 보유한다. 관련성의 정도는 게놈의 길이에 따른 혈청형 사이의 광범위한 교차-하이브리드화를 밝히는 이질듀플렉스 분석; 및 "역위 말단 반복부 서열"(ITR)에 상응하는 말단에서 유사한 자가-아닐링 절편의 존재에 의해 추가로 제시된다. 또한, 유사한 감염성 패턴은 각각의 혈청형에서의 복제 기능이 유사한 조정 제어 하에 있다는 것을 제시한다.
본원에 사용된 바와 같은 "AAV 벡터"는 AAV 말단 반복부 서열(ITR)의 측면에 있는 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드(또는 트랜스유전자)를 포함하는 벡터를 지칭한다. 이러한 AAV 벡터는 rep 및 cap 유전자 생산물을 코딩하고 발현하는 벡터로 형질감염되었던 숙주 세포에 존재할 때 감염성 바이러스 입자 내로 복제되고 패키징될 수 있다.
"AAV 비리온" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "AAV 벡터 입자" 또는 "AAV 바이러스"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡시드로 싸여진 폴리뉴클레오티드 AAV 벡터로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다. 입자가 이종 폴리뉴클레오티드(즉, 포유동물 세포로 전달될 트랜스유전자와 같은 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 경우, 이는 통상적으로 "AAV 벡터 입자" 또는 간단하게 "AAV 벡터"로서 지칭된다. 따라서, AAV 벡터 입자의 생산은 필수적으로 AAV 벡터의 생산을 포함하며, 이는 이러한 벡터가 AAV 벡터 입자 내에 함유되기 때문이다.
AAV "rep" 및 "cap" 유전자는 각각 복제 및 이입 단백질을 코딩하는 유전자이다. AAV rep 및 cap 유전자는 현재까지 시험된 모든 AAV 혈청형에서 발견되어 왔으며, 본원 및 원용된 참고문헌에 기재되어 있다. 야생형 AAV에서, rep 및 cap 유전자는 일반적으로 바이러스 게놈에서 서로 인접하여 발견되고(즉, 이들은 전사 유닛과 접하거나 중첩되는 바와 같이 함께 "결합"됨), 이들은 일반적으로 AAV 혈청형 사이에 보존된다. 또한, AAV rep 및 cap 유전자는 개별적으로 및 집합적으로 "AAV 패키징 유전자"로 지칭된다. 본 발명에 따른 AAV cap 유전자는 rep 및 아데노 헬퍼 기능의 존재 하에 AAV 벡터를 패키징할 수 있는 Cap 단백질을 코딩하고, 표적 세포 수용체와 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, AAV cap 유전자는 특정 AAV 혈청형, 예를 들어 표 1에 나타낸 혈청형으로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질을 코딩한다.
Figure pct00001
AAV의 생산을 위해 이용되는 AAV 서열은 임의의 AAV 혈청형의 게놈으로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, AAV 혈청형은 아미노산 및 핵산 수준에서 상당한 상동성의 게놈 서열을 갖고, 유사한 유전적 기능 세트를 제공하며, 본질적으로 물리적으로 및 기능적으로 동등한 비리온을 생산하고, 사실상 동일한 메커니즘에 의해 복제되고 조립된다. AAV 혈청형의 게놈 서열 및 게놈 유사성의 논의에 대해, 예를 들어 GenBank 등록 번호 U89790; GenBank 등록 번호 J01901; GenBank 등록 번호 AF043303; GenBank 등록 번호 AF085716; Chlorini et al., J. Vir. 71:6823-33(1997); Srivastava et al., J. Vir. 45:555-64 (1983); Chlorini et al., J. Vir. 73:1309-1319 (1999); Rutledge et al., J. Vir. 72:309-319 (1998); 및 Wu et al., J. Vir. 74: 8635-47 (2000)을 참고한다.
모든 알려진 AAV 혈청형의 게놈 조직은 매우 유사하다. AAV의 게놈은 길이가 약 5,000 뉴클레오티드(nt) 미만인 선형, 단일-가닥 DNA 분자이다. 역위 말단 반복부(ITR)는 비-구조적 복제(Rep) 단백질 및 구조적(VP) 단백질에 대한 고유한 코딩 뉴클레오티드 서열의 측면에 있다. VP 단백질은 캡시드를 형성한다. 말단 145 nt는 자가-상보성이고 T-형상 헤어핀을 형성하는 에너지 안정적인 분자내 듀플렉스가 형성될 수 있도록 조직된다. 이들 헤어핀 구조는 바이러스 DNA 복제를 위한 원점으로서 기능하여, 세포 DNA 중합효소 복합체에 대한 프라이머로서 제공된다. Rep 유전자는 Rep 단백질, Rep78, Rep68, Rep52, 및 Rep40을 코딩한다. Rep78 및 Rep68은 p5 프로모터로부터 전사되고, Rep 52 및 Rep40은 p19 프로모터로부터 전사된다. cap 유전자는 VP 단백질, VP1, VP2, 및 VP3를 코딩한다. cap 유전자는 p40 프로모터로부터 전사된다.
일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 특정 세포 유형, 예컨대 Sf9 또는 HEK 세포에서의 발현을 위해 조절 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 곤충 숙주 세포 또는 포유동물 숙주 세포에서 외부 유전자를 발현하기 위해 당업자에게 알려진 기술이 사용되어 본 발명을 실시할 수 있다. 곤충 세포에서 폴리펩티드의 분자 조작 및 발현을 위한 방법론은 예를 들어, Summers and Smith. A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bull. No. 7555, College Station, Tex. (1986); Luckow. 1991. In Prokop et al., Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors' Recombinant DNA Technology and Applications, 97-152 (1986); King, L. A. and R. D. Possee, The baculovirus expression system, Chapman and Hall, United Kingdom (1992); O'Reilly, D. R., L. K. Miller, V. A. Luckow, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York (1992); W.H. Freeman and Richardson, C. D., Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, volume 39 (1995); 미국 특허 제4,745,051호; US2003148506호; 및 WO 03/074714호에 기재되어 있다. AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전사를 위해 특히 적합한 프로모터는 예를 들어, 다면체 프로모터이다. 그러나, 곤충 세포에서 활성인 다른 프로모터, 예를 들어 p10, p35 또는 IE-1 프로모터가 당업계에 알려져 있으며, 상기 참고문헌에 기재된 추가 프로모터가 또한 고려된다.
이종 단백질의 발현을 위한 곤충 세포의 사용은 핵산, 예컨대 벡터, 예를 들어 곤충-세포 양립성 벡터를 이러한 세포 내로 도입하는 방법 및 배양액에서 이러한 세포를 유지하는 방법과 같이 잘 기록되어 있다. 예를 들어, METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, ed. Richard, Humana Press, NJ (1995); O'Reilly et al., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS, A LABORATORY MANUAL, Oxford Univ. Press (1994); Samulski et al., J. Vir. 63:3822-8 (1989); Kajigaya et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88:4646-50 (1991); Ruffing et al., J. Vir. 66:6922-30 (1992); Kirnbauer et al., Vir. 219:37-44 (1996); Zhao et al., Vir. 272:382-93 (2000); 및 Samulski et al., 미국 특허 제6,204,059호를 참고한다. 일부 실시양태에서, 곤충 세포에서 AAV를 코딩하는 핵산 구조체는 곤충 세포-양립성 벡터이다. 본원에 사용된 바와 같은 "곤충 세포-양립성 벡터" 또는 "벡터"는 곤충 또는 곤충 세포의 생산적 형질전환 또는 형질주입이 가능한 핵산 분자를 지칭한다. 예시적 생물학적 벡터는 플라스미드, 선형 핵산 분자, 및 재조합 바이러스를 포함한다. 임의의 벡터는 그것이 곤충 세포-양립성인 한 이용될 수 있다. 벡터는 곤충 세포의 게놈 내로 통합될 수 있지만, 곤충 세포에서 벡터의 존재가 영구적일 필요는 없으며 일시적 에피솜 벡터가 또한 포함된다. 벡터는 임의의 알려진 수단에 의해, 예를 들어 세포의 화학적 처리, 전기천공, 또는 감염에 의해 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 바큘로바이러스, 바이러스 벡터, 또는 플라스미드이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 벡터는 바큘로바이러스이며, 즉 구조체는 바큘로바이러스 벡터이다. 바큘로바이러스 벡터 및 이를 사용하기 위한 방법이 곤충 세포의 분자 조작에 대해 상기 원용된 참고문헌에 기재되어 있다.
바큘로바이러스는 절지동물의 외피 DNA 바이러스이고, 이중 2 개 멤버는 세포 배양액에서 재조합 단백질을 생산하기 위한 잘 알려진 발현 벡터이다. 바큘로바이러스는 특정 세포에 큰 게놈 함량을 전달하게 조작될 수 있는 원형 이중-가닥 게놈(80-200 kbp)을 갖는다. 벡터로서 사용되는 바이러스는 일반적으로 오토그라파 캘리포니카 다중캡시드 핵다각체병바이러스(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus)(AcMNPV) 또는 봄빅스 모리(Bombyx mori)(Bm)NPV이다(Kato et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 85(3):459-470 (2010)). 바큘로바이러스는 재조합 단백질의 발현을 위한 곤충 세포의 감염을 위해 일반적으로 사용된다. 특히, 곤충에서 이종 유전자의 발현은 예를 들어, 미국 특허 제4,745,051호; Friesen et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 131:31-49. (1986); EP 127,839호; EP 155,476호; Miller et al., Ann. Rev. of Microbiol. 42: 177-199 (1988); Carbonell et al., Gene 73(2):409-18 (1988); Maeda et al., Nature 315(6020):592-4 (1985); Lebacq-Verheyden et al., Mol. Cell. Biol. 8(8):3129-35 (1988); Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 82(24):8404-8 (1985); Miyajima et al., Gene 58(2-3):273-81 (1987); 및 Martin et al., DNA 7(2):99-106 (1988)에 기재된 바와 같이 달성될 수 있다. 단백질 생산을 위해 사용될 수 있는 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체 및 상응하는 허용성 곤충 숙주 세포가 Luckow et al., Nature Biotechnology 6:47-55 (1988), 및 Maeda et al., Nature 315(6020):592-4 (1985)에 기재되어 있다.
신규 AAV 캡시드 단백질
제1 양태에서, 본 발명은 다양한 포유동물 조직으로부터 단리된 신규 AAV 캡시드 단백질을 제공한다. 신규 AAV VP1 캡시드 단백질은 서열번호 1-7로서 제공되고 연관된 VP2 및 VP3 영역의 위치가 본원에 기재된다. 또한, 본 발명은 이들 신규 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 신규 AAV 캡시드 단백질(본원에서 종합적으로 "본 발명의 AAV 캡시드 단백질"로서 지칭됨)의 아미노산 서열, 및 본 발명의 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 또한, 본 발명의 이들 AAV 캡시드 핵산 및 아미노산 서열의 단편이 제공된다. 이들 서열 각각은 다양한 벡터 시스템 및 숙주 세포에서 용이하게 이용될 수 있다. 캡시드 VP1 단백질의 바람직한 단편은 VP2, VP3 및 가변 영역, GBS 도메인 및 GH 루프, 및 이들 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이들 단편은 다양한 벡터 시스템 및 숙주 세포에서 용이하게 이용될 수 있다. 이러한 단편은 단독으로, 다른 AAV 서열 또는 단편과 조합되어, 또는 다른 AAV 또는 비-AAV 바이러스 서열로부터의 요소와 조합되어 사용될 수 있다. 특정 바람직한 일 실시양태에서, 벡터는 본 발명의 AAV 캡시드 서열을 함유한다.
본 발명의 AAV 캡시드 서열 및 이의 단편은 rAAV의 생산에 유용하며, 또한 안티센스 전달 벡터, 유전자 요법 벡터, 또는 백신 벡터로서 유용하다. 본 발명은 본 발명의 신규 AAV 캡시드 서열을 함유하는 핵산 분자, 유전자 전달 벡터, 및 숙주 세포를 추가로 제공한다.
적합한 단편은 본원에 제공된 정보를 사용하여 결정될 수 있다. 정렬은 인터넷 상의 웹 서버를 통해 접속가능한 "Clustal W"와 같은 임의의 다양한 공개적으로 또는 상업적으로 이용가능한 다중 서열 정렬 프로그램을 사용하여 수행된다. 대안적으로, Vector NTI가 또한 이용된다. 또한, 상기 기재된 프로그램에 함유된 것을 포함하여, 뉴클레오티드 서열 동일성을 측정하기 위해 사용될 수 있는 당업계에 알려진 다수의 알고리즘이 있다. 다른 예로서, 폴리뉴클레오티드 서열은 GCG 버전 6.1의 프로그램인 FASTA를 사용하여 비교될 수 있다. FASTA는 의문 서열과 검색 서열 사이의 최고 중첩 영역의 정렬 및 퍼센트 서열 동일성을 제공한다. 예를 들어, 핵산 서열 사이의 퍼센트 서열 동일성은 본원에 참고로 포함되는 GCG Version 6.1에서 제공된 바와 같은 기본 파라미터(default parameter)(6의 글자 크기 및 스코어링 매트릭스에 대한 NOPAM 인자)를 갖는 FASTA를 사용하여 결정될 수 있다. 아미노산에 대해 유사한 프로그램, 예를 들어 "Clustal X" 프로그램이 이용가능하다. 사용될 수 있는 추가 서열 정렬 도구는 (단백질 서열 정렬; (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)) 및 (핵산 정렬; (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html))에 의해 제공된다. 일반적으로, 임의의 이들 프로그램은 기본 설정으로 사용되지만, 당업자는 필요에 따라 이들 설정을 변경할 수 있다. 대안적으로, 당업자는 적어도 언급된 알고리즘 및 프로그램에 의해 제공된 것과 같은 동일성 또는 정렬의 수준을 제공하는 다른 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다.
용어 "상당한 동일성", "상당한 상동성" 또는 "상당한 유사성"은 핵산, 또는 이의 단편을 지칭할 때, 선택적으로 다른 핵산(또는 이의 상보성 가닥)과 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 정렬될 때, 정렬된 서열의 적어도 약 95 내지 99%의 뉴클레오티드 서열 동일성, 예컨대 95% 동일성, 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성 및 99% 동일성이 있다는 것을 나타낸다. 바람직하게는, 상동성은 비교되는 2 개 서열의 전장, 또는 이의 개방 판독 프레임, 또는 길이가 적어도 15 뉴클레오티드인 다른 적합한 단편 상에 있다. 적합한 단편의 예가 본원에 기재되어 있다. 또한, 본 발명의 AAV 캡시드를 코딩하는 핵산 및 이의 상보성 가닥의 천연 변이체 및 조작된 변형이 본 발명의 핵산 핵산 서열에 포함된다. 이러한 변형은 예를 들어, 당업계에 알려진 표지, 메틸화, 및 축퇴 뉴클레오티드를 이용한 하나 이상의 자연 발생 뉴클레오티드의 치환을 포함한다.
용어 "상당한 동일성", "상당한 상동성" 또는 "상당한 유사성"은 아미노산 또는 이의 단편을 지칭할 때, 선택적으로 다른 아미노산(또는 이의 상보성 가닥)과 적절한 아미노산 삽입 또는 결실로 정렬될 때, 정렬된 서열의 적어도 약 95 내지 99%의 아미노산 서열 동일성, 예컨대 95% 동일성, 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성 및 99% 동일성이 있다는 것을 나타낸다. 바람직하게는, 상동성은 비교되는 2 개 서열의 전장, 또는 이의 단백질, 예를 들어 cap 단백질, rep 단백질, 또는 길이가 적어도 8 아미노산, 또는 더욱 바람직하게는 적어도 15 아미노산인 이의 단편 상에 있다. 적합한 단편의 예가 본원에 기재되어 있다.
용어 "고도로 보존된"은 적어도 80% 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 동일성, 및 더욱 바람직하게는, 97% 초과의 동일성을 의미한다. 동일성은 당업자에 의해 알려진 알고리즘 및 컴퓨터 프로그램에 재분류함으로써 당업자에 의해 용이하게 결정된다.
핵산 서열 또는 아미노산 서열의 맥락에서 용어 "퍼센트 서열 동일성" 또는 "동일한"은 최대 대응성으로 정렬되었을 때 동일한 2 개 서열에서의 잔기를 지칭한다. 서열 동일성 비교의 길이는 비교되는 2 개 서열의 전장, 유전자 코딩 서열의 전장, 또는 적어도 약 500 내지 5000 뉴클레오티드의 단편 상에 있을 수 있는 것이 바람직하다. 그러나, 예를 들어, 적어도 약 9 뉴클레오티드, 보통 적어도 약 20 내지 24 뉴클레오티드, 적어도 약 28 내지 32 뉴클레오티드, 적어도 약 36 이상의 뉴클레오티드의 작은 단편 사이의 동일성이 또한 바람직할 수 있다. 유사하게는, "퍼센트 서열 동일성"은 단백질의 전장 상의 아미노산 서열, 또는 이의 단편에 대해 용이하게 결정될 수 있다. 적합하게는, 단편은 길이가 적어도 약 8 아미노산이고, 최대 약 700 아미노산일 수 있다. 적합한 단편의 예가 본원에 기재되어 있다.
본 발명의 신규 캡시드는 폴리펩티드의 생물학적 및/또는 면역원성 활성에 영향을 주지 않는 하나 이상의 추가 적보존 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 용어 "적보존 아미노산 치환"은 해당 위치의 아미노산의 극성 또는 전하에 대한 영향이 거의 없거나 없는, 자연 발생 및 비자연 발생 아미노산을 포함하는, 비활성 잔기를 갖는 천연 아미노산 잔기의 치환을 지칭한다. 예를 들어, 적보존 치환은 임의의 다른 비-극성 잔기를 갖는 폴리펩티드에서 비-극성 잔기의 치환으로부터 야기된다. 또한, 폴리펩티드에서 임의의 천연 잔기는 또한 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"의 방법에 따라 알라닌으로 치환될 수 있다. 자연 발생 아미노산은 다음과 같이 이의 측쇄를 기본으로 하여 특징지어진다: 염기성: 아르기닌, 라이신, 히스티딘; 산성: 글루탐산, 아스파르트산; 비전하 극성: 글루타민, 아스파라긴, 세린, 트레오닌, 티로신; 및 비-극성: 페닐알라닌, 트립토판, 시스테인, 글리신, 알라닌, 발린, 프롤린, 메티오닌, 류신, 노르류신, 이소류신. 아미노산 치환의 일반 법칙이 하기 표에 기재되어 있다.
Figure pct00002
본 발명의 신규 캡시드는 서열번호 1-7의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열과 상당히 동등한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 본 발명의 변형된 폴리펩티드 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%, 더욱 통상적으로 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94% 및 더욱 더 통상적으로 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다.
본 발명의 신규 캡시드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 엄격한 조건 하에서 하이브리드화되는 핵산 서열 단편이 본 발명의 핵산 서열의 범위 내에 포함되며, 상기 단편은 약 5 뉴클레오티드, 바람직하게는 7 뉴클레오티드를 초과하고, 더욱 바람직하게는 9 뉴클레오티드를 초과하고 가장 바람직하게는 17 뉴클레오티드를 초과한다. 예를 들어, 선택적인(즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나에 특이적으로 하이브리드화되는) 15, 17, 또는 20 뉴클레오티드 또는 그 이상의 단편이 고려된다. 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 하이브리드화될 수 있는 프로브는 동일한 패밀리의 유전자에서 다른 폴리뉴클레오티드 서열로부터 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열을 구별할 수 있거나 다른 세균 유전자로부터 유전자를 구별할 수 있으며, 이는 바람직하게는 고유한 뉴클레오티드 서열을 기본으로 한다.
용어 "엄격한"은 당업계에서 엄격한 것으로서 일반적으로 이해되는 조건을 지칭하기 위해 사용된다. 하이브리드화 엄격도는 주로 온도, 이온 강도, 및 포름아미드와 같은 변성제의 농도에 의해 결정된다. 하이브리드화 및 세척을 위한 엄격한 조건의 예는 65-68℃의 0.015 M 염화나트륨, 0.0015M 소듐 시트레이트 또는 42℃의 0.015 M 염화나트륨, 0.0015M 소듐 시트레이트, 및 50% 포름아미드이다. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.sup.nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N.Y. 1989)를 참고한다. 또한, 더욱 엄격한 조건(예컨대, 높은 온도, 낮은 이온 강도, 높은 포름아미드, 또는 다른 변성제)이 사용될 수 있으나, 하이브리드화의 비율이 영향을 받을 것이다. 예를 들어, 데옥시올리고뉴클레오티드의 하이브리드화가 우려되는 경우, 추가의 예시적인 엄격한 하이브리드화 조건은 37℃(14-염기 올리고에 대해), 48℃(17-염기 올리고에 대해), 55℃(20-염기 올리고에 대해), 및 60℃(23-염기 올리고에 대해)의 6xSSC 0.05% 소듐 파이로포스페이트에서의 세척을 포함한다.
비-특이적 및/또는 배경 하이브리드화를 감소시킬 목적으로 다른 약제가 하이브리드화 및 세척 버퍼에 포함될 수 있다. 예는 0.1% 소 혈청 알부민, 0.1% 폴리비닐-피롤리돈, 0.1% 소듐 파이로포스페이트, 0.1% 소듐 도데실설페이트, NaDodSO4(SDS), 피콜, 덴하르트 용액(Denhardt's solution), 초음파처리된 연어 정자 DNA(또는 다른 비-상보성 DNA), 및 덱스트란 설페이트이지만, 다른 적합한 약제가 또한 사용될 수 있다. 이들 첨가제의 농도 및 유형은 하이브리드화 조건의 엄격도에 상당히 영향을 주지 않으면서 변화될 수 있다. 하이브리드화 실험은 보통 pH 6.8-7.4에서 수행되지만, 통상적 이온 강도 조건에서, 하이브리드화의 비율은 pH에 거의 독립적이다. Anderson et al., Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, Ch. 4, IRL Press Limited (Oxford, England) 참고. 하이브리드화 조건은 이들 변수를 수용하고 상이한 서열 관련성의 DNA가 하이브리드를 형성하게 하기 위해 당업자에 의해 조정될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 AAV 캡시드 단백질을 함유하거나 포함하는 본 발명의 벡터는 중화 항체가 다른 AAV 혈청형 기반 벡터뿐 아니라, 다른 바이러스 벡터의 유효성을 약화시키는 적용에서 사용하기에 특히 적절하다. 본 발명의 rAAV 벡터는 rAAV 재투여 및 반복 유전자 요법에서 특히 유리하다.
또한, 본 발명의 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산의 단편, 이의 상보성 가닥, cDNA 및 이에 대해 상보적인 RNA가 본 발명 내에 포함된다. 적합한 단편은 길이가 적어도 15 뉴클레오티드이고, 기능성 단편, 즉 생물학적 관심 단편을 포함한다. 이러한 단편은 대안적 스플라이스 변이체인 캡시드의 3 개 가변 단백질(VP)인 VP1, VP2 및 VP3를 코딩하는 서열을 포함한다. 본 발명의 AAV 캡시드를 코딩하는 핵산의 다른 적합한 단편은 캡시드 단백질에 대한 출발 코돈을 함유하는 단편, 및 본원에 기재된 VP1 캡시드 단백질의 가변 영역을 코딩하는 단편을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 AAV 핵산 서열로부터 발현된 AAV 캡시드 아미노산 서열, 펩티드 및 단백질에 제한되지 않고 예를 들어, 화학적 합성, 다른 합성 기술, 또는 다른 방법에 의한 것을 포함하여, 당업계에 알려진 다른 방법에 의해 생성된 아미노산 서열, 펩티드 및 단백질을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 캡시드의 서열은 다양한 기술을 사용하여 용이하게 생성될 수 있다.
적합한 생산 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, N.Y.)를 참고한다. 대안적으로, 펩티드는 또한 잘 알려진 고상 펩티드 합성법에 의해 합성될 수 있다(Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149 (1962); Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis Freeman, (San Francisco, 1969) pp. 27-62). 이들 및 다른 적합한 생산 방법은 당업자에게 알려져 있으며 이는 본 발명의 제한이 아니다.
AAV 캡시드는 대안적 스플라이스 변이체인 3 개 단백질, VP1, VP2 및 VP3로 구성된다. 전장 캡시드 서열은 VP1로서 지칭되며, 이는 VP2 및 VP3로서 지칭되는 스플라이싱된 변이체를 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 AAV 캡시드 단백질의 다른 기능성 단편을 제공한다. 캡시드 단백질의 다른 바람직한 단편은 가변 영역(VR), 가변 영역 사이에 위치한 불변 영역, GBS 도메인, 및 GH 루프를 포함한다. 캡시드 단백질의 다른 바람직한 단편은 그 자체가 HPV를 포함한다.
AAV2에서의 서열 분기의 영역을 결정하기 위한 알고리즘이 개발되어 왔다(Chiorini et al, J. Virol, 73:1309-19 (1999); Rutledge et al, J. Virol., 72:309-319 (1998)). 본원에 기재된 이 알고리즘 및/또는 정렬 기술을 사용하여, 신규 AAV 캡시드 서열의 VR이 결정된다. 기본 설정의 Clustal X 프로그램을 사용하거나, 기본 설정의 다른 상업적으로 또는 공개적으로 이용가능한 정렬 프로그램을 사용하여 수행된 본원에 제공된 정렬을 사용하여, 당업자는 본 발명의 신규 AAV 캡시드의 상응하는 단편을 용이하게 결정할 수 있다.
적합하게는, AAV 캡시드 단백질의 단편은 길이가 적어도 8 아미노산이거나, 길이가 적어도 9 아미노산이거나, 길이가 적어도 10 아미노산이거나, 길이가 적어도 20 아미노산이거나, 길이가 30 아미노산이거나 길이가 적어도 50 아미노산이거나, 길이가 적어도 75 아미노산이거나, 길이가 적어도 100 아미노산이거나 길이가 200 아미노산이거나 길이가 250 아미노산이거나 길이가 300 아미노산이거나 길이가 350 아미노산이거나 길이가 400 아미노산이다. 그러나, 다른 소망하는 길이의 단편이 용이하게 이용될 수 있다. 본 발명의 모든 단편은 캡시드 AAV 단백질의 생물학적 활성을 함유한다. 이러한 단편은 재조합적으로 또는 다른 적합한 수단, 예를 들어 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다.
본 발명의 서열, 단백질, 및 단편은 재조합 생산, 화학적 합성, 또는 다른 합성 수단을 포함한 임의의 적합한 수단에 의해 생산될 수 있다. 이러한 생산 방법은 당업자에게 알려져 있으며 이는 본 발명의 제한이 아니다.
도면 및 서열 목록에서 제공된 핵산 서열을 포함하는 것과 함께, 본 발명은 본 발명의 AAV 캡시드 단백질의 아미노산 서열, 단백질 및 펩티드를 발현하도록 설계된 핵산 분자 및 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명은 다음 AAV 캡시드 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열 및 이들 서열 및/또는 이의 고유한 단편을 사용하여 생성된 인공 AAV 캡시드 단백질을 포함한다.
본 발명의 캡시드 단백질을 이용한 AAV의 생산
본 발명은 AAV 캡시드 단백질 서열 및 이들 바이러스가 자연에서 연관된 DNA 및/또는 세포 물질이 없는 이들 단백질을 코딩하는 핵산을 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명은 표적 세포에 대한 이종 유전자 또는 다른 핵산 서열의 전달에 유용한 분자의 생산을 위해, 이의 단편을 포함한 본 발명의 신규 AAV 서열을 이용하는 분자를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 표적 세포에 대한 이종 유전자 또는 다른 핵산 서열의 전달에 유용한 바이러스 벡터의 생산을 위해, 이의 단편을 포함한 본 발명의 AAV 캡시드 단백질 서열을 이용하는 분자를 제공한다.
AAV 캡시드 핵산 서열을 함유하는 본 발명의 분자는 이에 수반되는 서열을 전달하는 비-바이러스 전달 비히클(예를 들어, 액체-계 담체), 바이러스 등에 숙주 세포에 전달될 수 있는 임의의 유전자 요소(벡터), 예를 들어 네이키드(naked) DNA, 플라스미드, 파지, 트랜스포손, 코스미드, 에피솜, 단백질을 포함한다. 선택된 벡터는 형질주입, 전기천공, 리포솜 전달, 막 융합 기술, 고속 DNA-코팅된 펠릿, 바이러스 감염 및 원형질체 융합을 포함한 임의의 적합한 방법에 의해 전달될 수 있다. 본 발명의 임의의 실시양태를 구축하기 위해 사용되는 방법은 핵산 조작에 숙달된 당업자에게 알려져 있으며 유전자 조작, 재조합 조작, 및 합성 기술을 포함한다. 예를 들어, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y를 참고한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 본 발명의 AAV 캡시드를 코딩하는 서열 또는 이의 단편을 최소로 함유한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 AAV rep 단백질을 코딩하는 서열 또는 이의 단편을 최소로 함유한다. 선택적으로, 이러한 벡터는 AAV cap 및 rep 단백질 둘 다를 함유할 수 있다. AAV rep 및 cap 둘 다가 제공되는 벡터에서, AAV rep 및 AAV cap 서열은 둘 다 동일한 AAV 혈청형 기원의 것일 수 있다. 대안적으로, 본 발명은 rep 서열이 cap 서열을 제공하는 것과 상이한 AAV 혈청형으로부터의 것인 벡터를 제공한다. 일 실시양태에서, rep 및 cap 서열은 별도의 공급원(예를 들어, 별도의 벡터, 또는 숙주 세포 및 벡터)으로부터 발현된다. 다른 실시양태에서, 이들 rep 서열은 상이한 AAV 혈청형의 cap 서열에 프레임으로 융합되어, 키메라 AAV 벡터를 형성한다.
따라서, 일 실시양태에서, 본원에 기재된 벡터는 서열번호 1-7의 아미노산 서열 중 어느 하나의 온전한 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유한다. 다른 예에서, VP3 단백질의 출발 코돈을 GTG로 변경하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, rAAV는 본 발명의 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질의 하나 이상의 가변 영역, 또는 다른 단편을 함유할 수 있다. 이들 변형은 선택된 발현 시스템에서 발현, 수율을 증가시키기 위한 것, 및/또는 정재를 개선하기 위한 것, 또는 다른 소망하는 목적을 위한 것(예를 들어, 굴성을 변화시키거나 중화 항체 에피토프를 변경하기 위한 것)일 수 있다.
본원에 기재된 벡터, 예를 들어 플라스미드는 다양한 목적을 위해 유용하지만, AAV 서열 또는 이의 단편을 포함하는 캡시드를 함유하는 rAAV의 생산에 사용하기에 특히 잘 맞는다. rAAV를 포함한 이들 벡터, 이의 요소, 구축물, 및 용도가 본원에 상세히 기재된다.
신규 캡시드 단백질의 VP1
신규 AAV VP1 캡시드 단백질을 개코원숭이 간으로부터 단리하였다.
개코원숭이로부터 단리된 신규 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bba.45로서 나타냄)은 서열번호 1(아미노산 1-742)로서 기재되어 있고 연관된 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치는 하기 표 2에 정의되어 있다. VP2 캡시드 단백질은 서열번호 1의 아미노산 138-742에 걸쳐 있고 VP3 캡시드 단백질은 서열번호 1의 아미노산 206-742에 걸쳐 있다.
Figure pct00003
개코원숭이로부터 단리된 신규 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bba.46으로서 나타냄)은 서열번호 2(아미노산 1-742)로서 기재되어 있고 연관된 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치는 하기 표 2에 정의되어 있다. VP2 캡시드 단백질은 서열번호 2의 아미노산 138-742에 걸쳐 있고 VP3 캡시드 단백질은 서열번호 2의 아미노산 206-742에 걸쳐 있다.
Figure pct00004
개코원숭이로부터 단리된 신규 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bba.47로서 나타냄)은 서열번호 3(아미노산 1-742)으로서 기재되어 있고 연관된 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치는 하기 표 2에 정의되어 있다. VP2 캡시드 단백질은 서열번호 3의 아미노산 138-742에 걸쳐 있고 VP3 캡시드 단백질은 서열번호 3의 아미노산 206-742에 걸쳐 있다.
Figure pct00005
개코원숭이로부터 단리된 신규 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bba.48로서 나타냄)은 서열번호 4(아미노산 1-742)로서 기재되어 있고 연관된 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치는 하기 표 2에 정의되어 있다. VP2 캡시드 단백질은 서열번호 4의 아미노산 138-742에 걸쳐 있고 VP3 캡시드 단백질은 서열번호 4의 아미노산 206-742에 걸쳐 있다.
Figure pct00006
개코원숭이로부터 단리된 신규 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bba.49로서 나타냄)은 서열번호 5(아미노산 1-742)로서 기재되어 있고 연관된 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치는 하기 표 2에 정의되어 있다. VP2 캡시드 단백질은 서열번호 5의 아미노산 138-742에 걸쳐 있고 VP3 캡시드 단백질은 서열번호 5의 아미노산 206-742에 걸쳐 있다.
Figure pct00007
개코원숭이로부터 단리된 신규 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bba.50으로서 나타냄)은 서열번호 6(아미노산 1-742)으로서 기재되어 있고 연관된 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치는 하기 표 2에 정의되어 있다. VP2 캡시드 단백질은 서열번호 6의 아미노산 138-742에 걸쳐 있고 VP3 캡시드 단백질은 서열번호 6의 아미노산 206-742에 걸쳐 있다.
Figure pct00008
개코원숭이로부터 단리된 신규 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bba.51로서 나타냄)은 서열번호 7(아미노산 1-742)로서 기재되어 있고 연관된 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치는 하기 표 2에 정의되어 있다. VP2 캡시드 단백질은 서열번호 7의 아미노산 138-742에 걸쳐 있고 VP3 캡시드 단백질은 서열번호 7의 아미노산 206-742에 걸쳐 있다.
Figure pct00009
상기 언급된 캡시드 단백질을 코딩하는 상응하는 핵산 서열은 서열번호 8 / Bba.45; 서열번호 9 / Bba.46; 서열번호 10 / Bba.47; 서열번호 11 / Bba.48; 서열번호 12 / Bba.49; 서열번호 13 / Bba.50; 및 서열번호 14 /Bba.51이다.
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
바로 아래의 표 2에서, "VR"은 가변 영역을 지칭하고 수는 아미노산 잔기를 지칭하고 각각의 가변 영역 또는 GBS 및 GH 루프 영역은 아미노산 잔기 서열에 걸쳐 있다.
Figure pct00017
트랜스유전자
트랜스유전자는 트랜스 유전자 측면에 있는 벡터 서열에 대해 이종성인 핵산 서열이며, 이는 관심 폴리펩티드, 단백질, 또는 다른 생산물을 코딩한다. 핵산 코딩 서열은 숙주 세포에서 트랜스유전자 전사, 번역, 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 조절 성분에 작동가능하게 연결된다.
트랜스유전자 서열의 성분은 생성된 벡터가 놓여질 용도에 의존할 것이다. 예를 들어, 트랜스유전자 서열의 하나의 유형은 발현시 검출가능한 신호를 생산하는 리포터 서열을 포함한다. 이러한 리포터 서열은, 비제한적으로, β-락타마아제, β-갈락토시다아제(LacZ), 알칼리 포스파타아제, 티미딘 키나아제, 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein)(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(chloramphenicol acetyltransferase)(CAT), 루시페라아제, 예를 들어 CD2, CD4, CD8, 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질, 및 이에 지시된 고친화도 항체가 존재하거나 종래 수단에 의해 생산될 수 있는 당업계에 잘 알려진 다른 것을 포함한 막 결합 단백질, 및 특히 헤마글루티닌 또는 Myc로부터의 항원 태그 도메인에 적절하게 융합된 막 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함한다.
이들 코딩 서열은 이의 발현을 구동하는 조절 요소와 연관될 때, 효소, 방사선, 비색, 형광 또는 다른 분광 에세이, 형광 활성화 세포 분류 에세이 및 효소-연결된 면역흡착 에세이(enzyme linked immunosorbent assay)(ELISA), 방사면역에세이(radioimmunoassay)(RIA) 및 면역조직화학을 포함한 면역학적 에세이를 포함한 종래의 수단에 의해 검출가능한 신호를 제공한다. 예를 들어, 마커 서열이 LacZ 유전자인 경우, 신호를 수반하는 벡터의 존재는 베타-갈락토시다아제 활성에 대한 에세이에 의해 검출된다. 트랜스유전자가 녹색 형광 단백질 또는 루시페라아제인 경우, 신호를 수반하는 벡터는 루미노미터에서의 색 또는 빛 생산에 의해 시각적으로 측정될 수 있다.
그러나, 바람직하게는, 트랜스유전자는 단백질, 펩티드, RNA, 효소, 우성 음성 돌연변이, 또는 촉매 RNA와 같은 생물학 및 의학에 유용한 생산물을 코딩하는 비-마커 서열이다. 바람직한 RNA 분자는 tRNA, dsRNA, 리보솜 RNA, 촉매 RNA, siRNA, 소 헤어핀 RNA, 트랜스-스플라이싱 RNA, 및 안티센스 RNA를 포함한다. 유용한 RNA 서열의 하나의 예는 치료된 동물에서 표적화된 핵산 서열의 발현을 억제하거나 없애는 서열이다. 통상적으로, 적합한 표적 서열은 종양학적 표적 및 바이러스 질환을 포함한다. 이러한 표적의 예에 대해, 면역원과 관련된 섹션에서 하기에 나타낸 종약학적 표적 및 바이러스를 참고한다.
트랜스유전자는 정상 유전자가 정상 수준 미만으로 발현되는 결함 또는 기능성 유전자 생산물이 발현되지 않는 결함을 포함할 수 있는 유전자 결함을 교정하거나 개선하기 위해 사용될 수 있다. 트랜스유전자 서열의 바람직한 유형은 숙주 세포에서 발현되는 치료 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩한다. 본 발명은 예를 들어, 다중-서브유닛 단백질에 의해 야기된 유전자 결손을 교정하거나 개선하기 위해 다중 트랜스유전자를 사용하는 것을 추가로 포함한다. 특정 상황에서, 상이한 트랜스유전자가 사용되어, 단백질의 각각의 서브유닛을 코딩하거나, 상이한 펩티드 또는 단백질을 코딩할 수 있다. 이는 단백질 서브유닛을 코딩하는 DNA의 크기가 클 때, 예를 들어 면역글로불린, 혈소판-유래된 성장 인자, 또는 디스트로핀 단백질에 대해 바람직하다. 세포에 대해 다중-서브유닛 단백질을 생산하기 위해, 세포는 각각의 상이한 서브유닛을 함유하는 재조합 바이러스로 감염된다. 대안적으로, 단백질의 상이한 서브유닛은 동일한 트랜스유전자에 의해 코딩될 수 있다. 이 경우에, 단일 트랜스유전자는 내부 리보자임 출입 부위(internal ribozyme entry site)(IRES)에 의해 분리된 각각의 서브유닛에 대한 DNA와 함께, 각각의 서브유닛을 코딩하는 DNA를 포함한다. 이는 각각의 서브유닛을 코딩하는 DNA의 크기가 작을 때, 예를 들어, 서브유닛 및 IRES를 코딩하는 DNA가 5 킬로베이스(kilobase) 미만일 때 바람직하다. IRES에 대한 대체물로서, DNA는 번역후 이벤트에서 자가-절단되는 2A 펩티드를 코딩하는 서열에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, Donnelly et al, J. Gen. Virol., 78(Pt 1):13-21 (January 1997); Furler, et al, Gene Ther., 8(11):864-873 (June 2001); Klump et al., Gene Ther., 8(10):811-817 (May 2001)을 참고한다. 이 2A 펩티드는 IRES에 비해 상당히 작아, 공간이 제한 인자일 때, 이를 사용하기에 적합하게 한다. 더욱 자주, 트랜스유전자가 크거나, 다중-서브유닛으로 구성되거나, 2 개 트랜스유전자가 공동-전달될 때, 소망하는 트랜스유전자(들) 또는 서브유닛을 수반하는 rAAV가 공동-투여되어, 생체내에서 이를 콘카테머화되게(concatamerize) 하여, 단일 벡터 게놈을 형성한다. 이러한 실시양태에서, 제1 AAV는 단일 트랜스유전자를 발현하는 발현 카세트를 수반할 수 있고 제2 AAV는 숙주 세포에서의 공동-발현을 위해 상이한 트랜스유전자를 발현하는 발현 카세트를 수반할 수 있다. 그러나, 선택된 트랜스유전자는 임의의 생물학적 활성 생산물 또는 다른 생산물, 예를 들어 연구를 위해 바람직한 생산물을 코딩할 수 있다.
적합한 트랜스유전자는 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 트랜스유전자의 선택은 본 발명의 제한으로 고려되지 않는다.
일부 실시양태에서, 트랜스유전자는 이종 단백질이고, 이 이종 단백질은 치료 단백질이다. 예시적 치료 단백질은, 비제한적으로, 혈액 인자, 예컨대 β-글로빈, 헤모글로빈, 조직 플라스미노겐 활성제, 및 응고 인자; 집락 자극 인자(CSF); 인터류킨, 예컨대 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 등; 성장 인자, 예컨대 케라티노사이트 성장 인자(KGF), 줄기 세포 인자(SCF), 섬유아세포 성장 인자(FGF, 예컨대 염기성 FGF 및 산성 FGF), 간세포 성장 인자(HGF), 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 골 형성 단백질(BMP), 표피 성장 인자(EGF), 성장 분화 인자-9(GDF-9), 간암 유래된 성장 인자(HDGF), 마이오스타틴(GDF-8), 신경 성장 인자(NGF), 뉴로트로핀, 혈소판-유래된 성장 인자(PDGF), 트롬보포이에틴(TPO), 형질전환 성장 인자 알파(TGF-α), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β) 등; 가용성 수용체, 예컨대 가용성 TNF-α 수용체, 가용성 VEGF 수용체, 가용성 인터류킨 수용체(예를 들어, 가용성 IL-1 수용체 및 가용성 II 형 IL-1 수용체), 가용성 γ/δ T 세포 수용체, 가용성 수용체의 리간드-결합 단편 등; 효소, 예컨대 α-글루코시다아제, 이미글루세라아제, β-글루코세레브로시다아제, 및 알글루세라아제; 효소 활성제, 예컨대 조직 플라스미노겐 활성제; 케모카인, 예컨대 1P-10, 인터페론-감마에 의해 유도된 모노카인(Mig), Groα/IL-8, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, MCP-1, PF-4 등; 혈관형성제, 예컨대 혈관 내피 성장 인자(VEGF, 예를 들어 VEGF121, VEGF165, VEGF-C, VEGF-2), 신경교종-유래된 성장 인자, 안지오제닌, 안지오제닌-2 등; 항-혈관형성제, 예컨대 가용성 VEGF 수용체; 단백질 백신; 신경자극성 펩티드, 예컨대 신경 성장 인자(NGF), 브라디키닌, 콜레시스토키닌, 가스틴, 세크레틴, 옥시토신, 성선자극호르몬-방출 호르몬, 베타-엔도르핀, 엔케팔린, P 물질, 소마토스타틴, 프롤락틴, 갈라닌, 성장 호르몬-방출 호르몬, 봄베신, 다이놀핀, 와파린, 뉴로텐신, 모틸린, 티로트로핀, 신경펩티드 Y, 황체형성 호르몬, 칼시토닌, 인슐린, 글루카곤, 바소프레신, 안지오텐신 II, 티로트로핀-방출 호르몬, 혈관작용 장 펩티드, 슬립 펩티드 등; 혈전용해제; 심방 나트륨이뇨 펩티드; 릴랙신; 신경교 섬유질 산성 단백질; 여포 자극 호르몬(FSH); 인간 알파-1 항트립신; 백혈병 억제 인자(LIF); 조직 인자, 황체형성 호르몬; 대식세포 활성 인자; 종양 괴사 인자(TNF); 호중구 주화성 인자(NCF); 금속단백분해효소의 조직 억제제; 혈관작용 장 펩티드; 안지오제닌; 안지오트로핀; 피브린; 히루딘; IL-1 수용체 길항제 등을 포함한다. 관심 단백질의 일부 다른 비-제한적인 예는 섬모 향신경성 인자(CNTF); 뇌-유래된 향신경성 인자(BDNF); 뉴로트로핀 3 및 4/5(NT-3 및 4/5); 신경아교세포 유래된 향신경성 인자(GDNF); 방향족 아미노산 탈탄산효소(AADC); 혈우병 관련된 응고 단백질, 예컨대 Factor VIII, Factor IX, Factor X; 디스트로핀, 미니-디스트로핀, 또는 마이크로디스트로핀; 리소좀 산 리파아제; 페닐알라닌 하이드록실라아제(PAH); 당원병-관련된 효소, 예컨대 글루코오스-6-포스파타아제, 산 말타아제, 글리코겐 가지절단 효소, 근육 글리코겐 포스포릴라아제, 간 글리코겐 포스포릴라아제, 근육 포스포프룩토키나아제, 포스포릴라아제 키나아제(예를 들어, PHKA2), 글루코오스 수송체(예를 들어, GLUT2), 알돌라아제 A, β-에놀라아제, 및 글리코겐 합성효소; 리소좀 효소(예를 들어, 베타-N-아세틸헥소사미니다아제 A); 및 이의 임의의 변이체를 포함한다.
조절 제어 요소
또한, AAV 벡터는 플라스미드 벡터로 형질주입되거나 본 발명에 의해 생산된 바이러스로 감염된 세포에서 이의 전사, 번역 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 트랜스유전자에 작동가능하게 연결된 종래의 제어 요소 또는 서열을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "작동가능하게 연결된" 서열은 관심 유전자와 인접한 발현 제어 서열 및 트랜스로 또는 관심 유전자를 제어하기 위한 거리에서 작용하는 발현 제어 서열 둘 다를 포함한다.
발현 제어 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적 RNA 처리 신호, 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화(polyA) 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율성을 향상시키는 서열(즉, 코자크(Kozak) 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 소망하는 경우, 코딩된 생산물의 분비를 향상시키는 서열을 포함한다. 천연, 구성적, 유도성 및/또는 조직-특이적인 프로모터를 포함하여, 아주 많은 발현 제어 서열이 당업계에 알려져 있으며 이용될 수 있다.
구성적 프로모터의 예는, 비제한적으로, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus)(RSV) LTR 프로모터(선택적으로 RSV 인핸서를 가짐), 거대세포바이러스(cytomegalovirus)(CMV) 프로모터(선택적으로 CMV 인핸서를 가짐)(예를 들어, Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985) 참고), SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나아제(PGK) 프로모터, 및 EF1 프로모터[Invitrogen]를 포함한다. 유도성 프로모터는 유전자 발현을 조절하게 하고 외인성으로 공급된 화합물, 환경 인자, 예컨대 온도, 또는 세포의 특정 생리학적 상태, 예를 들어 급성 단계, 특정 분화 상태의 존재에 의해, 또는 세포 복제 시에만 조절될 수 있다. 유도성 프로모터 및 유도성 시스템은, 비제한적으로, Invitrogen, Clontech 및 Ariad를 포함한 다양한 상업적 공급원으로부터 이용가능하다. 많은 다른 시스템이 기재되어 왔으며 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 외인성으로 공급된 화합물에 의해 조절되는 유도성 프로모터의 예는 아연-유도성 양 메탈로티오닌(MT) 프로모터, 덱사메타손(Dex)-유도성 마우스 유방암 바이러스(MMTV) 프로모터, T7 중합효소 프로모터 시스템[WO 98/10088호]; 에크디손 곤충 프로모터[No et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)], 테트라사이클린-억제성 시스템[Gossen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)], 테트라사이클린-유도성 시스템[Gossen et al, Science, 268:1766-1769 (1995), 및 Harvey et al, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998) 참고], RU486-유도성 시스템[Wang et al, Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) 및 Wang et al, Gene Ther., 4:432-441 (1997)] 및 라파마이신-유도성 시스템[Magari et al, J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)]을 포함한다. 본 맥락에서 유용할 수 있는 유도성 프로모터의 다른 유형은 세포의 특정 생리학적 상태, 예를 들어 온도, 급성 단계, 특정 분화 상태에 의해, 또는 세포 복제시에만 조절되는 것이다.
다른 실시양태에서, 트랜스유전자에 대한 천연 프로모터가 사용될 것이다. 천연 프로모터는 트랜스 유전자의 발현이 천연 발현을 모방하기를 소망할 때 바람직할 수 있다. 천연 프로모터는 트랜스유전자의 발현이 일시적으로 또는 발전적으로, 또는 조직-특이적 방식으로, 또는 특정 전사 자극에 반응하여 조절되어야 할 때 사용될 수 있다. 추가 실시양태에서, 다른 천연 발현 제어 요소, 예컨대 인핸서 요소, 폴리아데닐화 부위 또는 코자크 컨센서스 서열이 또한 천연 발현을 모방하기 위해 사용될 수 있다.
트랜스 유전자의 다른 실시양태는 조직-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자를 포함한다. 예를 들어, 골격근에서의 발현을 소망하는 경우, 근육에서 활성인 프로모터가 사용되어야 한다. 이들은 골 β-액틴, 미오신 경쇄 2A, 디스트로핀, 근육 크레아틴 키나아제를 코딩하는 유전자로부터의 프로모터뿐 아니라, 천연-발생 프로모터에 비해 높은 활성을 갖는 합성 근육 프로모터를 포함한다(예를 들어, Li et al., Nat. Biotech., 17:241-245 (1999) 참고). 조직-특이적인 프로모터의 예는 특히 간(알부민, Miyatake et al., J. Virol., 71:5124-32 (1997); B형 간염 바이러스 코어 프로모터, Sandig et al., Gene Ther., 3:1002-9 (1996); 알파-페토프로테인(AFP), Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)), 뼈 오스테오칼신(Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)); 뼈 시알로프로테인(Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)), 림프구(CD2, Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998); 면역글로불린 중쇄; T 세포 수용체 쇄), 뉴런, 예컨대 뉴런-특이적 에놀라아제(NSE) 프로모터(Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)), 신경미세섬유 경쇄 유전자(Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)), 및 뉴런-특이적 vgf 유전자(Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995))에 대해 알려져 있다.
선택적으로, 치료적으로 유용한 트랜스유전자를 수반하는 플라스미드는 또한 선택가능한 마커를 포함할 수 있거나 리포터 유전자는 특히 제네티신, 하이그로마이신 또는 푸리마이신(purimycin) 저항성을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 선택가능한 리포터 또는 마커 유전자(바람직하게는 본 발명의 방법에 의해 구제될 바이러스 게놈의 외부에 위치함)는 암피실린 저항성과 같이 세균 세포에서 플라스미드의 존재를 시그널링하기 위해 사용될 수 있다. 플라스미드의 다른 성분은 복제 원점을 포함할 수 있다. 이들 및 다른 프로모터 및 벡터 요소의 선택은 관습적이고 많은 이러한 서열이 이용가능하다[예를 들어, Sambrook et al, 및 본원에 원용된 참고문헌 참고].
재조합 AAV를 생산하기 위한 방법
본 발명은 곤충 또는 포유동물 세포에서 재조합 AAV를 생산하기 위한 물질 및 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 구조체는 프로모터 및 프로모터의 후방에 제한 부위를 추가로 포함하여, 하나 이상의 관심 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하게 하며, 프로모터 및 제한 부위는 5' AAV ITR의 후방 및 3' AAV ITR의 전방에 위치한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 구조체는 제한 부위의 후방 및 3' AAV ITR의 전방에 전사후 조절 요소를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 구조체는 제한 부위에 삽입되고 프로모터와 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 폴리뉴클레오티드는 관심 단백질의 코딩 영역을 포함한다. 당업자는 본 출원에 개시된 AAV 벡터 중 어느 하나가 바이러스 구조체로서 재조합 AAV를 생산하기 위한 방법에서 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
일부 실시양태에서, 헬퍼 기능은 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스 헬퍼 유전자를 포함하는 하나 이상의 헬퍼 플라스미드 또는 헬퍼 바이러스에 의해 제공된다. 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스 헬퍼 유전자의 비-제한적인 예는, 비제한적으로, E1A, E1B, E2A, E4 및 VA를 포함하고, 이는 AAV 패키징에 대한 헬퍼 기능을 제공할 수 있다.
AAV의 헬퍼 바이러스는 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 아데노비리데(Adenoviridae) 패밀리 및 헤르페스비리데(Herpesviridae) 패밀리로부터의 바이러스를 포함한다. AAV의 헬퍼 바이러스의 예는, 비제한적으로, 미국 특허 공개 제20110201088호(이의 개시 내용은 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 SAdV-13 헬퍼 바이러스 및 SAdV-13-유사 헬퍼 바이러스, 헬퍼 벡터 pHELP(Applied Viromics)를 포함한다. 당업자는 AAV에 적절한 헬퍼 기능을 제공할 수 있는 AAV의 임의의 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 플라스미드가 본원에 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
일부 실시양태에서, AAV cap 유전자는 플라스미드 내에 존재한다. 플라스미드는 AAV rep 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 임의의 AAV 혈청형(비제한적으로, AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13 및 이의 임의의 변이체를 포함함)으로부터의 cap 유전자 및/또는 rep 유전자가 본원에 사용되어, 재조합 AAV를 생산할 수 있다. 일부 실시양태에서, AAV cap 유전자는 혈청형 1, 혈청형 2, 혈청형 4, 혈청형 5, 혈청형 6, 혈청형 7, 혈청형 8, 혈청형 9, 혈청형 10, 혈청형 11, 혈청형 12, 혈청형 13 또는 이의 변이체로부터의 캡시드를 코딩한다.
일부 실시양태에서, 곤충 또는 포유동물 세포는 헬퍼 플라스미드 또는 헬퍼 바이러스, AAV cap 유전자를 코딩하는 바이러스 구조체 및 플라스미드로 형질주입될 수 있고; 재조합 AAV 바이러스는 공동-형질주입 후 다양한 시점에 수집될 수 있다. 예를 들어, 재조합 AAV 바이러스는 공동-형질주입 후 약 12 시간, 약 24 시간, 약 36 시간, 약 48 시간, 약 72 시간, 약 96 시간, 약 120 시간, 또는 임의의 이들 2 개 시점 사이의 시간에 수집될 수 있다.
또한, 재조합 AAV는 감염성 재조합 AAV를 생산하기에 적합한 당업계에 알려진 임의의 종래 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 일부 사례에서, 재조합 AAV는 AAV 입자 생산을 위해 필요한 성분 중 일부를 안정적으로 발현하는 곤충 또는 포유동물 세포를 사용함으로써 생산될 수 있다. 예를 들어, AAV rep 및 cap 유전자, 및 선택가능한 마커, 예컨대 네오마이신 저항성 유전자를 포함하는 플라스미드(또는 다중 플라스미드)가 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다. 그 다음에, 곤충 또는 포유동물 세포는 헬퍼 바이러스(예를 들어, 헬퍼 기능을 제공하는 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스) 및 5' 및 3' AAV ITR(및 소망하는 경우, 이종 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)을 포함하는 바이러스 벡터로 공동-감염될 수 있다. 이 방법의 이점은 세포가 선택가능하고 재조합 AAV의 대규모 생산에 적합하다는 것이다. 다른 비-제한적인 예로서, 플라스미드보다는 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스가 사용되어, rep 및 cap 유전자를 패키징 세포 내로 도입할 수 있다. 또 다른 비-제한적인 예로서, 5' 및 3' AAV LTR을 함유하는 바이러스 벡터 및 rep-cap 유전자 둘 다는 생산자 세포의 DNA 내로 안정적으로 통합될 수 있고, 헬퍼 기능이 야생형 아데노바이러스에 의해 제공되어, 재조합 AAV를 생산할 수 있다.
AAV 생산에 사용된 세포 유형
본 발명의 AAV 벡터를 포함하는 바이러스 벡터는 AAV 또는 생물학적 생산물을 생산하게 하고 배양액에서 유지될 수 있는 임의의 무척추동물 세포 유형을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 사용된 곤충 세포주는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)로부터의 것, 예컨대 Sf9, SF21, SF900+, 초파리 세포주, 모기 세포주, 예를 들어 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus) 유래된 세포주, 가잠(domestic silkworm) 세포주, 예를 들어 봄빅스모리 세포주, 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 세포주, 예컨대 하이 파이브 세포주 또는 레피도프테라(Lepidoptera) 세포주, 예컨대 아스칼라파 오도라타(Ascalapha odorata) 세포주일 수 있다. 바람직한 곤충 세포는 하이파이브, Sf9, Se301, SeIZD2109, SeUCR1, Sf900+, Sf21, BTI-TN-5B1-4, MG-1, Tn368, HzAm1, BM-N, Ha2302, Hz2E5 및 Ao38을 포함하여, 바큘로바이러스 감염에 민감한 곤충 종으로부터의 세포이다.
바큘로바이러스는 절지동물의 외피 DNA 바이러스이고, 이중 2 개 멤버는 세포 배양액에서 재조합 단백질을 생산하기 위한 잘 알려진 발현 벡터이다. 바큘로바이러스는 특정 세포에 큰 게놈 함량을 전달하게 조작될 수 있는 원형 이중 가닥 게놈(80-200 kbp)을 갖는다. 벡터로서 사용되는 바이러스는 일반적으로 오토그라파 캘리포니카 다중캡시드 핵다각체병바이러스(AcMNPV) 또는 봄빅스 모리(Bm-NPV)이다(Kato et al., 2010).
바큘로바이러스는 재조합 단백질의 발현을 위한 곤충 세포의 감염을 위해 일반적으로 사용된다. 특히, 곤충에서 이종 유전자의 발현은 예를 들어, 미국 특허 제4,745,051호; Friesen et al (1986); EP 127,839호; EP 155,476호; Vlak et al. (1988); Miller et al. (1988); Carbonell et al. (1988); Maeda et al. (1985); Lebacq-Verheyden et al. (1988); Smith et al. (1985); Miyajima et al. (1987); 및 Martin et al.(1988)에 기재된 바와 같이 달성될 수 있다. 단백질 생산을 위해 사용될 수 있는 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체 및 상응하는 허용성 곤충 숙주 세포는 Luckow et al (1988), Miller et al. (1986); Maeda et al. (1985) 및 McKenna (1989)에 기재되어 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명의 방법은 또한 AAV를 복제하게 하거나 생물학적 생산물을 생산하게 하고, 배양액에서 유지될 수 있는 임의의 포유동물 세포 유형으로 수행된다. 사용되는 바람직한 포유동물 세포는 HEK293, HeLa, CHO, NS0, SP2/0, PER.C6, Vero, RD, BHK, HT 1080, A549, Cos-7, ARPE-19, 및 MRC-5 세포일 수 있다.
시험관내(in vitro) 이종 단백질의 생산
비-제한적인 예로서, 본원에 개시된 재조합 AAV는 시험관내에서, 예를 들어 세포 배양액에서 관심 단백질을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 일 비-제한적인 예로서, 일부 실시양태에서, 시험관내에서 관심 단백질을 생산하기 위한 방법은 이종 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 AAV를 제공하는 단계; 및 재조합 AAV를 세포 배양액에서 세포와 접촉시켜, 재조합 AAV가 세포에서 관심 단백질을 발현하는 단계를 포함한다. 관심 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 크기는 달라질 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 적어도 약 1.4 kb, 적어도 약 1.5 kb, 적어도 약 1.6 kb, 적어도 약 1.7 kb, 적어도 약 1.8 kb, 적어도 약 2.0 kb, 적어도 약 2.2 kb, 적어도 약 2.4 kb, 적어도 약 2.6 kb, 적어도 약 2.8 kb, 적어도 약 3.0 kb, 적어도 약 3.2 kb, 적어도 약 3.4 kb, 적어도 약 3.5 kb 길이, 적어도 약 4.0 kb 길이, 적어도 약 5.0 kb 길이, 적어도 약 6.0 kb 길이, 적어도 약 7.0 kb 길이, 적어도 약 8.0 kb 길이, 적어도 약 9.0 kb 길이, 또는 적어도 약 10.0 kb 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드는 적어도 약 1.4 kb 길이이다.
생체내 이종 단백질의 생산
본원에 개시된 재조합 AAV는 생체내에서, 예를 들어 포유동물과 같은 동물에서 관심 단백질을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태는 생체내에서 관심 단백질을 생산하기 위한 방법을 제공하며, 방법은 관심 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 AAV를 제공하는 단계; 및 재조합 AAV를 대상체에게 투여하여, 재조합 AAV가 대상체에서 관심 단백질을 발현하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 포유동물, 예를 들어 원숭이, 개, 고양이, 마우스, 또는 소일 수 있다. 관심 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 크기는 달라질 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 적어도 약 1.4 kb, 적어도 약 1.5 kb, 적어도 약 1.6 kb, 적어도 약 1.7 kb, 적어도 약 1.8 kb, 적어도 약 2.0 kb, 적어도 약 2.2 kb, 적어도 약 2.4 kb, 적어도 약 2.6 kb, 적어도 약 2.8 kb, 적어도 약 3.0 kb, 적어도 약 3.2 kb, 적어도 약 3.4 kb, 적어도 약 3.5 kb 길이, 적어도 약 4.0 kb 길이, 적어도 약 5.0 kb 길이, 적어도 약 6.0 kb 길이, 적어도 약 7.0 kb 길이, 적어도 약 8.0 kb 길이, 적어도 약 9.0 kb 길이, 또는 적어도 약 10.0 kb 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드는 적어도 약 1.4 kb 길이이다.
치료 용도
기재된 방법에 의해 생산된 재조합 AAV는 다양한 질환 또는 장애를 치료하기 위한 하나 이상의 치료 단백질을 발현하기 위해 사용될 수 있다. 질환의 비-제한적인 예는 암, 예컨대 암종, 육종, 백혈병, 림프종; 및 자가면역 질환, 예컨대 다발성 경화증을 포함한다. 암종의 비-제한적인 예는 식도 암종; 간세포 암종; 기저 세포 암종, 편평세포 암종(다양한 조직); 이행 세포 암종을 포함한 방광 암종; 기관지 암종; 결장 암종; 결직장 암종; 위 암종; 폐의 소세포 암종 및 비-소세포 암종을 포함한 폐 암종; 부신피질 암종; 갑상선 암종; 췌장 암종; 유방 암종; 난소 암종; 전립선 암종; 선암종; 땀샘 암종; 피지샘 암종; 유두상 암종; 유두상 선암종; 낭샘암종; 속질 암종; 신장 세포 암종; 관상피내암 또는 담도암; 융모막암종; 정상피종; 배아 암종; 빌름스 종양(Wilm's tumor); 자궁경부 암종; 자궁 암종; 고환 암종; 골형성 암종; 상피 암종; 및 비인두 암종을 포함한다. 육종의 비-제한적인 예는 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 척색종, 골형성 육종, 골육종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 윤활막종, 중피종, 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 평활근육종, 횡문근육종, 및 다른 연조직 육종을 포함한다. 고형 종양의 비-제한적인 예는 신경교종, 별아교세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 속귀신경집종, 핍지교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 및 망막모세포종을 포함한다. 백혈병의 비-제한적인 예는 만성 골수증식 증후군; 급성 골수성 백혈병; B-세포 CLL, T-세포 CLL 전림프모구 백혈병, 및 모발상 세포 백혈병을 포함한 만성 림프구 백혈병; 및 급성 림프모구 백혈병을 포함한다. 림프종의 예는, 비제한적으로, B-세포 림프종, 예컨대 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma); 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma) 등을 포함한다. 본원에 개시된 AAV 벡터, 재조합 바이러스 및 방법을 사용하여 치료될 수 있는 질환의 다른 비-제한적인 예는 겸상 적혈구 빈혈증, 낭포성 섬유증, 리소좀 산 리파아제(LAL) 결핍증 1, 테이-삭스병(Tay-Sachs disease), 페닐케톤뇨증, 뮤코다당증, 당원 저장증(Glycogen storage disease)(GSD, 예를 들어 GSD I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, 및 XIV 형), 갈락토스혈증, 근디스트로피(예를 들어, 뒤센(Duchenne) 근디스트로피), 및 혈우병, 예컨대 A형 혈우병(전형적 혈우병) 및 B형 혈우병(크리스마스병), 윌슨병(Wilson's disease), 파브리병(Fabry Disease), 고쉐병(Gaucher Disease), 유전성 혈관부종(hereditary angioedema)(HAE), 및 알파 1 항트립신 결핍을 포함한 유전적 장애를 포함한다. 또한, 본원에 개시된 AAV 벡터, 재조합 바이러스 및 방법은 간에서 트랜스유전자의 국부적 발현에 의해 또는 간 또는 간세포로부터 분비된 단백질의 발현에 의해 치료될 수 있는 다른 장애에 대해 사용될 수 있다.
대상체(예를 들어, 대상체의 혈청)에서 발현된 이종 단백질의 양은 달라질 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 단백질은 대상체의 혈청에서 적어도 약 9 ㎍/mL, 적어도 약 10 ㎍/mL, 적어도 약 50 ㎍/mL, 적어도 약 100 ㎍/mL, 적어도 약 200 ㎍/mL, 적어도 약 300 ㎍/mL, 적어도 약 400 ㎍/mL, 적어도 약 500 ㎍/mL, 적어도 약 600 ㎍/mL, 적어도 약 700 ㎍/mL, 적어도 약 800 ㎍/mL, 적어도 약 900 ㎍/mL, 또는 적어도 약 1000 ㎍/mL의 양으로 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심 단백질은 대상체의 혈청에서 약 9 ㎍/mL, 약 10 ㎍/mL, 약 50 ㎍/mL, 약 100 ㎍/mL, 약 200 ㎍/mL, 약 300 ㎍/mL, 약 400 ㎍/mL, 약 500 ㎍/mL, 약 600 ㎍/mL, 약 700 ㎍/mL, 약 800 ㎍/mL, 약 900 ㎍/mL, 약 1000 ㎍/mL, 약 1500 ㎍/mL, 약 2000 ㎍/mL, 약 2500 ㎍/mL, 또는 이들 값 중 임의의 2 개 사이의 범위의 양으로 발현된다. 당업자는 관심 단백질이 방법에 대해 효과적이기 위해 필요한 발현 수준이 비-제한적 인자, 예컨대 특정 관심 단백질 및 치료받는 대상체에 따라 달라질 수 있으며, 단백질의 유효량이 과도한 실험 없이 당업계에 알려진 종래 방법을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
실시예
실시예 1
천연-발생 캡시드 단백질의 단리
신규 천연-발생 캡시드 단백질을 개코원숭이 간으로부터 단리시켰다. 냉동 간 조직을 Texas Biomedical 또는 New England Primate Research Center로부터 얻었다. 게놈 DNA를 DNeasy 혈액 & 조직 키트(Qiagen catalog #69504)를 사용하여 간 조직으로부터 제조하였다.
중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)(PCR)을 다음 프라이머를 사용하여 게놈 DNA 상에서 수행하였다: 다음 조건 하의 프라이머 rep-1397-F (5'-GTGCCCTTTTACGGCTGCGTGAACTGGACCAATGAAAACTTTCC- 3'서열번호 21) 및 프라이머 cap-2872-R(5'-CCGACGGAGTGGGCAATGCCTCAGGAAATTGGCATTG CGATTCC- 3' 서열번호 22): 초기 항온처리: 97℃, 120 초, 변성 단계: 97℃, 15 초, 아닐링 단계: 58℃, 60℃, 또는 62℃, 15초, 연장 단계: 72℃, 240 초. 변성, 아닐링, 및 연장 단계를 35 사이클 동안 수행하였다. 그 다음에, 반응물을 72℃에서 7분 항온처리하고 분석될 때까지 4℃에서 저장하였다. PCR 생산물을 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동에 의해 분리하고, 겔 추출 키트(Qiagen catalog #28704)를 사용하여 단리시키고, 제조사의 지시에 따라 pCR4-TOPO-TA(Invitrogen catalog # 450030) 내로 클로닝하였다. E. coli, NEB5α 세포의 형질전환 후, DNA를 암피실린 저항성 집락으로부터 제조하고 양측 단부로부터 서열결정하여, 삽입물이 AAV-관련된 서열을 코딩하였는지를 결정하였다.
pCR4-TOPO TA에서의 삽입물이 AAV 서열과 관련되어 있는 경우, 서열-특이적 프라이머를 서열의 rep 부분에 대해 "에피솜 둘레 PCR(around the episome PCR)"(이하에서, "ATE PCR")을 수행하여, 완전 캡시드 유전자를 얻도록 설계하였다. ATE PCR은 영구적 AAV 게놈이 동물 조직에서 원형 에피솜을 형성한다는 개념을 기본으로 한다. 따라서, 당업자는 rep 유전자에서의 서열에 상응하는 프라이머의 "분기" 세트를 사용하여, 중합효소 연쇄 반응을 수행하여, 에피솜에 존재할 수 있는 임의의 AAV 서열 대부분 또는 전부를 단리시킬 수 있지만, 특히 당업자는 완전 인접 캡시드 유전자를 단리시킬 수 있다. 에피솜의 다합체는 예를 들어, 상동 재조합에 의해 형성될 수 있으며, 상기 경우에, 단일 ATE PCR 반응으로부터 하나를 초과하는 캡시드 유전자(보통 동일하지 않음)를 단리시키는 것이 가능하다.
ATE PCR을 다음과 같은 2-단계 프로그램을 사용하여 표준 중합효소 연쇄 반응 기구에서 수행하였다: 초기 항온처리: 95℃, 240 초, 변성 단계: 95℃, 30 초, 아닐링/연장 단계: 72℃, 300 초. 변성 및 조합된 아닐링/연장 단계를 40 사이클 동안 수행하였다. 그 다음에, 반응물을 72℃에서 7분 항온처리하고 분석될 때까지 4℃에서 저장하였다. PCR 생산물을 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동하였다. AAV 게놈의 다합체의 길이(~4.5 킬로베이스)인 PCR 생산물을 겔로부터 잘라내고, QIAquick 겔 추출 키트(Qiagen catalog #28704)를 사용하여 정제하고, 제조사의 지시에 따라 pCR4-TOPO-TA(Invitrogen catalog # 450030) 내로 클로닝하였다. E. coli, NEB5α 세포의 형질전환 후, DNA를 암피실린 저항성 집락으로부터 제조하고 삽입물의 전체 서열을 결정하였다.
상기 기재된 2-단계 프로그램이 정확한 크기의 PCR 생산물을 생산하지 않은 경우, 다음 3-단계 프로그램을 사용하였다: 초기 항온처리: 95℃, 240 초, 변성 단계: 95℃, 30 초, 아닐링 단계: 62℃, 64℃, 66℃, 또는 68℃, 30 초. 연장 단계: 72℃, 300 초. 변성, 아닐링, 및 연장 단계를 40 사이클 동안 수행하였다. 그 다음에, 반응물을 상기 기재된 바와 같이 72℃에서 7분 항온처리하고 분석될 때까지 4℃에서 저장하였다.
pCR4-TOPO TA에서 완전 삽입물 서열이 결정되면, BLAST 알고리즘(NCBI 웹사이트에서 이용가능함)을 사용하여 이들을 AAV 캡시드 유전자인지 확인하였다. 알려진 AAV와의 이의 관련성을 다양한 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 정렬 프로그램, 예컨대 Clustal Omega(EBI 웹사이트에서 이용가능함) 또는 Vector NTI(Invitrogen, Inc.)를 사용하여 결정하였다.
AAV를 생산하기 위해, 고유한 AAV 캡시드 유전자를 발현 플라스미드(pAAV-RC; Agilent, Inc.) 내로 서브클로닝한 다음에, 벡터(pAAV 루시페라아제) 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드(pHELPER; Agilent, Inc.)와 함께 293 세포 내로 형질주입하였다. AAV 생산을 3 일 동안 발생하게 한 다음에, 세포를 3 회 동결-융해함으로써 미가공 용해물을 제조하였다. 잔해를 펠릿화하고 상청액(미가공 AAV)을 Q-PCR에 의해 적정하여, 게놈 역가를 결정한 다음에(이는 캡시드가 조립 및 DNA 패키징이 가능한지 확인함), 다양한 세포에 대해 AAV에 의한 형질도입을 평가하기 위해 사용하였다.
확인된 신규 포유동물 조직-유래된 AAV 캡시드 단백질의 VP1 아미노산 서열은 본원에서 서열번호 1-7로서 기재된다. 또한, 연관된 VP2 및 VP3 영역의 위치가 본원에 기재된다. 본 발명은 (i) 서열번호 1-7의 임의의 VP1 캡시드 서열, 또는 서열번호 1-7의 임의의 캡시드 서열의 VP2 또는 VP3 영역과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 단리된 AAV 캡시드 단백질, 또는 (ii) 서열번호 1-7의 임의의 VP1 캡시드 서열, 또는 서열번호 1-7의 임의의 캡시드 서열의 VP2 또는 VP3 영역을 포함하거나 이로 구성된 단리된 AAV 캡시드 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 임의의 상기 기재된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 입자에 관한 것이며, AAV 입자는 (i) AAV 역위 말단 반복부 및 숙주 세포에서 이종 유전자의 발현을 지시하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 이종 유전자를 포함하는 트랜스유전자를 갖는 핵산, 또는 (ii) 숙주 세포에서 이종 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 이종 유전자를 포함하는 핵산을 추가로 포함한다.
또한, 인간 혈청에서 항체에 의한 본 발명의 신규 AAV 입자의 중화를 조사하였다. HEK293T 세포를 5x104 세포/웰의 밀도로 시딩하고 밤새 항온처리하였다. 정제된 rAAV를 2x106 vg/uL의 최종 역가로 희석하고 1 시간 동안 IVIG의 연속 희석(0 - 10mg/mL)으로 혼합하였다. 재조합 AAV를 1000의 MOI를 사용하여 HEK293T 세포 상에 첨가하고 37℃에서 항온처리하였다. 감염 72 시간 후, IVIG 중화를 상대적 루시페라아제 단위(relative luciferase unit) 판독을 기본으로 하여 분석하였다. 에토포시드를 본 연구에서 사용하지 않았다. 결과는 표 3에 제공된다. 예상된 바와 같이, AAV2 형질도입(양성 대조군)은 인간 IVIG의 첨가에 의해 폐지되었다(나타내지 않음). 반대로, 시험된 신규 AAV 중 일부는 IVIG 저항성을 나타내었다.
Figure pct00018
또한, IVIG 중화 에세이를 반복하여, 표 3에 열거된 캡시드("신규 캡시드"로서 나타냄)를 갖는 재조합 AAV 입자의 중화를 대조군 캡시드를 갖는 재조합 AAV 입자 AAV5, AAV8 및 AAV9의 중화와 비교하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 본원에 개시된 캡시드를 갖는 AAV는 IVIG 저항성을 나타내었다.
본원에 개시된 AAV 캡시드의 조직 특이적 감염성을 결정하기 위해, 각각의 캡시드를 포함하고 루시페라아제 트랜스유전자를 발현하는 AAV를 생성하였다(AAV-RSV-egfp-T2A-Fluc2). 수컷 Balb/C 마우스를 Charles River Breeding Laboratories로부터 구매하였다. 2 x 1013 vg/kg 용량의 AAV-RSV-egfp-T2A-Fluc2 벡터를 8 주령 마우스의 꼬리 정맥 내로 주사하였다. 주사 후 3 및 5 주에, 생체내 생물발광 영상화를 생체내 영상화 장치(PerkinElmer Inc., Waltham, MA로부터 얻은 IVIS Lumina LT)를 사용하여 수행하였다. 간략하게는, 마우스를 2% 이소플루오레인 및 산소로 마취하였다. 30 mg/mL의 RediJect D-루시페린 생물발광 기재 150 μL를 복강내로 주사하였다. 기재 주사 10 분 후, 동물을 생체내 영상화 장치로 이의 냉각된 전하-결합 소자(charge-coupled device)(CCD) 카메라를 사용하여 영상화하였다. 이미지를 동물의 앙와위(dorsal position)에서 얻었다. 마취를 차광 영상화 챔버에서 이소플루오레인-산소 전달에 의한 전체 영상화 기간에 걸쳐 유지하였다.
마우스를 AAV 주사 후 5 주에 영상화 기간 후 희생시켰다. 다양한 장기를 수집하고 영상화 장치를 사용하여 영상화하였다. 측정 조건은 생체내 영상화를 위해 사용된 것과 동일하였다. 영상화 동안, 동물의 회식조 사진을 획득한 후, 생물발광 이미지를 획득하였다. 이미지 데이터를 생활 이미지 소프트웨어 버전 4.5.2(PerkinsElmer Waltham, MA)를 사용하여 가공하고 분석하였다. 관심 영역(ROI)을 각각의 동물뿐 아니라, 개별 장기를 둘러 추적하여, 루시페라아제 활성에 의해 방출되는 총 플럭스(TF)(광자/초)를 정량화하였다. 총 플럭스 활성은 각각의 기관계의 AAV 감염성에 대한 대용물이며 도 1에 각각의 AAV 캡시드에 대해 나타내었다. 데이터는 신규 캡시드가 간 세포에 대해 높은 정도의 특이성을 갖는 재조합 AAV를 생산한다는 것을 입증한다.
추가 실험을 본원에 개시된 다음 캡시드(Bba.45, Bba.46, Bba.47, Bba.49, Bba.50 및 Bba.51)를 갖는 AAV를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 수행하였으며, 형질도입을 다음 대조군 캡시드를 갖는 AAV인 AAV5, AAV8 및 AAV9와 비교하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 신규 캡시드를 갖는 AAV는 AAV5 또는 AAV12로부터의 캡시드를 갖는 AAV와 비교하여 형질도입 효율성에서 증가를 나타낸다. 예를 들어, 신규 캡시드는 AAV5 캐시드를 갖는 AAV와 비교하여 형질도입 효율성에서 10-40% 배수 증가를 갖는다. 또한, 도 4는 신규 캡시드를 갖는 AAV가 AAV5와 비교하여 간 세포에 대해 상당히 높은 정도의 특이성을 갖는다는 것을 입증한다. 또한, 신규 캡시드를 갖는 AAV는 AAV8 또는 AAV9 캡시드를 갖는 AAV로 관찰된 것과 유사한 간 세포의 형질도입을 나타내었다.
실시예 2
신규의 생물-분포 및 활성 평가
천연-발생 캡시드 단백질
본원에 개시된 AAV 캡시드의 생물-분포 및 활성을 평가하기 위해, ApoE-hAAT 프로모터 하에 캡시드, 융모생식샘자극호르몬 서브유닛 베타(cyno-CG-Beta) 트랜스유전자를 포함하는 AAV를 생성하였다(AAV-ApoE-hAAT-Cyno-CG-Beta). 수컷 C57BL/6J 마우스를 Jackson Laboratories로부터 구매하였다. 2 x 1013 vg/kg 용량의 AAV-ApoE-hAAT-Cyno-CG-Beta를 8 주령 마우스의 꼬리 정맥 내로 주사하였다. 본 연구를 다음 캡시드 단백질 Bba-45, Bba-46, Bba-47, Bba-49, Bba-50(종합적으로 "신규 캡시드"로서 나타냄) 및 AAV5, AAV8, AAV-Rh10 및 AAV-anc80L65(종합적으로 "대조군 캡시드"로서 나타냄)를 갖는 AAV로 수행하였다. 비히클 대조군은 AAV 벡터 없는 투여였다.
주사 후 5 주에, cyno-CG 트랜스유전자의 발현을 질량 분석을 사용하여 bCG 단백질의 혈장 수준을 측정함으로써 평가하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 신규 캡시드를 갖는 AAV는 AAV5 캡시드를 갖는 AAV에서의 발현과 유사한 수준의 트랜스유전자를 발현하였다. 그러나, 간에서 bCG 단백질의 발현은 AAV5 캡시드를 갖는 AAV로 주사된 마우스와 비교하여, 신규 캡시드를 갖는 AAV로 주사된 마우스에서 증가하였다(도 6). 신규 캡시드를 갖는 AAV로 주사된 마우스의 간에서 cyno-CG 트랜스유전자의 DNA 및 RNA 복제물의 수는 AAV5 캡시드를 갖는 AAV로 주사된 마우스에 비해 상당히 상이하지 않았다(도 7a-7c). DNA 및 RNA 데이터는 bCG 단백질 데이터와 잘 연관되어 있었다(도 8a-8b 참고).
신규 캡시드 Bba-45 내지 Bba-50은 대조군 캡시드(AAV5, AAV8, AAV-Rh10 및 AAV-anc80L65)와 비교하여 상당히 높은 형질도입 또는 전사 수준을 야기하지 않았다. 그러나, 신규 캡시드 전부와 비교하였을 때, Bba-49는 최고 전사 및 형질도입 수준을 달성하였다. Bba-49 캡시드는 AAV5 캡시드와 비교하여 약 2-배 높은 전사 수준(RNA)을 달성하였으나, 이 차이는 유의미하지 않다(도 7b). Bba-49 대 AAV5의 비를 표 4에 기재하였다:
Figure pct00019
간세포에서 트랜스유전자 bCG의발현을 면역조직화학을 사용하여 평가하였다. 신규 캡시드 전부는 AAV5 캡시드에 비해 높은 퍼센트의 간세포 발현을 야기하였다. 또한, 신규 캡시드를 갖는 AAV에 의한 간세포의 형질도입은 대조군 캡시드, AAV8, AAV-Rh10 및 AAV-anc80L65와 유사하였다(도 9 및 10).
Bba-49 캡시드, ApoE-hAAT 프로모터, 알라닌 글리옥살레이트 아미노 트랜스퍼라아제(AGXT) 트랜스유전자를 포함하는 AAV를 생성하였다. 1E14 vg/kg 용량의 AAV-AGXT를 3 내지 4 주령 -AGXT/-/-C57BL/6J 수컷 마우스의 꼬리 정맥 내로 주사하였다. 간세포의 형질도입을 다양한 공급원으로부터의 AAV5 캡시드를 갖는 AAV와 비교하였다. 간세포에서 트랜스유전자 AGXT의 발현을 면역조직화학을 사용하여 평가하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, Bba-49 캡시드는 시험된 AAV5 캡시드와 비교하여, 높은 퍼센트의 AGXT를 발현하는 간세포를 야기하였다. AAV.Bba-49. AGXT는 약 96%의 간세포를 형질도입하였다.
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atggtctggc aaaacagaga catctactac 1860 cagggcccta tttgggccaa ggtccctcac acggacggac actttcaccc ttcgccgctg 1920 atgggaggat ttggactgaa acacccgcct ccgcagattt tcatcaaaaa cacccccgta 1980 cccgccaatc ccaatactac ctttagcgct gcaaggatca attctttttt gacgcagtac 2040 agcaccggac aagtcgccgt tcagatcgac tgggaaattc agaaggagca ctccaaacgc 2100 tggaatcccg aagtccaatt tacttcaaac tacggcactc aaaattctat gctgtgggct 2160 cccgacaacg ccggcaacta ccacgaaccc cgggctattg ggtcccgttt cctcacccac 2220 cacttgtaa 2229 <210> 10 <211> 2229 <212> DNA <213> Papio <220> <221> misc_feature <223> Bba.47 <400> 10 atggctgctg acggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctctctga aggcattcgc 60 gagtggtggg cgctgaaacc tggagcccca cagcccaagg caaatcaaca acatcaagac 120 aacgctcggg gtcttgtgct tccgggttac aaatacttgg gacccggtaa cggactcgac 180 aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240 cagcagctca agtcgggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgcgga cgccgagttc 300 cagcagcgct tggcgaccga cacctctttt gggggcaacc tcggcaaggc agtcttccag 360 gccaaaaaga ggattctcga gcctctgggt ctggttgaag agggcgttaa aacggctcct 420 ggaaagaaac gcccattaga aaagactcca aatcggccga ccaacccgga ctctgggaag 480 gccccggcca agaaaaagca aaaagacggc gagacagccg actctgctag aaggacactc 540 gactttgaag actctggagc aggagacgga cctcctgagg gatcatcttc cggagaaatg 600 tctcatgatg ctgagatgcg tgcggcgcca ggcggaaatg ctgtcgaggc gggacaaggt 660 gccgatggag tgggtaatgc ctccggtgat tggcattgcg attccacctg gtcagagggc 720 cgagtcacca ccaccagcac ccgaacctgg gtcctgccca cctacaacaa ccacctgtac 780 ctgcgaatcg gaacaacggc caacagcaac acctacaatg gattctccac cccctgggga 840 tactttgact ttaaccgctt ccactgccac ttttccccac gcgactggca gcgactcatc 900 aacaacaact ggggactcag gccgaaatcg atgcgtgtta aaatcttcaa catccaggtc 960 aaggaggtca ctacgtcaaa cggcgagact acggtcgcta ataaccttac cagcacggtt 1020 cagatctttg cggattcaac gtatgaactc ccatacgtga tggacgccgg tcaggagggg 1080 agccttcctc cgttccccaa cgacgtgttt atggttcccc aatacgggta ctgcggagtc 1140 gtcactggag aaaaccagaa ccaaacagac agaaatgcct tttactgtct ggagtacttt 1200 ccatcccaaa tgctaagaac tggcaacaac tttgaaatca gttaccaatt tgaaaaagtt 1260 cctttccatt caatgtacgc gcacagccag agcctggaca gaatgatgaa tcctttgctg 1320 gatcagtacc tgtggcatct gcaatcgacc actaccggaa attcccttaa tcaaggaaca 1380 gctaccacca cgtacgggaa aattaccact ggggactttg cctactacag gaaaaactgg 1440 ttgcctggag cctgcattaa acaacaaaaa ttttcaaaga atgccagtca aaactacaag 1500 attcccgcca gcgggggaga cgccctttta aagtatgaca cgcataccac tttaaatggg 1560 cgatggagta acatggctcc tggtcctcca atggccaccg caggtgccgg ggactcggat 1620 tttagcaaca gccagctgat ctttgccgga cccaatcaga gcggtaacac gaccacgtct 1680 tcaaacaatt tgttgtttac ctcagaagag gagattgcca caacaaaccc acgagacacg 1740 gacatgtttg ggcagattgc agataataat caaaatgcca ccaccgcccc tcacatcgct 1800 aacctggacg ctatgggaat tgttcccgga atggtctggc aaaacagaga catctactac 1860 cagggcccta tttgggccaa ggtccctcac acggacggac actttcaccc ttcgccgctg 1920 atgggaggat ttggactgaa acacccgcct ccgcagattt tcatcaaaaa cacccccgta 1980 cccgccaatc ccaatactac ctttagcgct gcaaggatca attctttttt gacgcagtac 2040 agcaccggac aagtcgccgt tcagatcgac tgggaaattc agaaggagca ctccaaacgc 2100 tggaatcccg aagtccaatt tacttcaaac tacggcactc aaaattctat gctgtgggct 2160 cccgacaacg ccggcaacta ccacgaaccc cgggctattg ggtcccgttt cctcacccac 2220 cacttgtaa 2229 <210> 11 <211> 2229 <212> DNA <213> Papio <220> <221> misc_feature <223> Bba.48 <400> 11 atggctgctg acggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctctctga aggcattcgc 60 gagtggtggg cgctgaaacc tggagcccca cagcccaagg caaatcaaca acatcaagac 120 aacgctcggg gtcttgtgct tccgggttac aaatacttgg gacccggtaa cggactcgac 180 aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240 cagcagctca agtcgggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgcgga cgccgagttt 300 caggagcgtc ttcaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360 gccaaaaaga ggattctcga gcctctgggt ctggttgaag agggcgttaa aacggctcct 420 ggaaagaaac gcccattaga aaagactcca aatcggccga ccaacccgga ctctgggaag 480 gccccggcca agaaaaagca aaaagacggc gagacagccg actctgctag aaggacactc 540 gactttgaag actctggagc aggagacgga ccccctgagg gatcatcttc cggagaaatg 600 tctcatgatg ctgagatgcg tgcggcgcca ggcggaaatg ctgtcgaggc gggacaaggt 660 gccgatggag tgggtaatgc ctccggtgat tggcattgcg attccacctg gtcagagggc 720 cgagtcacca ccaccagcac ccgaacctgg gtcctgccca cctacaacaa ccacctgtac 780 ctgcgaatcg gaacaacggc caacagcaac acctacaatg gattctccac cccctgggga 840 tactttgact ttaaccgctt ccactgccgc ttttccccgc gcgactggca gcgactcatc 900 aacaacaact ggggactcag gccgaaatcg atgcgtgtta aaatcttcaa catccaggtc 960 aaggaggtca ctacgtcaaa cggcgagact acggtcgcta ataaccttac cagcacggtt 1020 cagatctttg cggattcaac gtatgaactc ccatacgtga tggacgccgg tcaggagggg 1080 agccttcctc cgttccccaa cgacgtgttt atggttcccc aatacgggta ctgcggagtc 1140 gtcactggag aaaaccagaa ccaaacagac agaaatgcct tttactgtct ggagtacttt 1200 ccatcccaaa tgctaagaac tggcaacaac tttgaaatca gttaccaatt tgaaaaagtt 1260 cctttccatt caatgtacgc gcacagccag agcctggaca gaatgatgaa tcctttgctg 1320 gatcagtacc tgtggcatct gcaatcgacc actaccggaa attcccttaa tcaaggaaca 1380 gctatcacca cgtacgggaa aattaccact ggggactttg cctactacag gaaaaactgg 1440 ttgcctggag cctgcattaa acaacaaaaa ttttcaaaga atgccagtca aaactacaag 1500 attcccgcca gcgggggaga cgccctttta aagtatgaca cgcataccac tttaaatggg 1560 cgatggagta acatggctcc tggtcctcca atggccaccg caggtgccgg ggactcggat 1620 tttagcaaca gccagctgat ctttgccgga cccaatcaga gcggtaacac gaccacgtct 1680 tcaaacaatt tgttgtttac ctcagaagag gagattgcca caacaaaccc acgagacacg 1740 gacatgtttg gacagattgc agataataat caaaatgccg ccaccgcccc tcacatcgct 1800 aacctggacg ctatgggaat tgttcccgga atggtctggc aaaacagaga catctactac 1860 cagggcccta tttgggccaa ggtccctcac acggacggac actttcaccc ttcgccgctg 1920 atgggaggat ttggactgaa acacccgcct ccgcagattt tcatcaaaaa cacccccgta 1980 cccgccaatc ccaatactac ctttagcgct gcaaggatca attctttttt gacgcagtac 2040 agcaccggac aagtcgccgt tcagatcgac tgggaaattc agaaggagca ctccaaacgc 2100 tggaatcccg aagtccaatt tacttcaaac tacggcactc aaaattctat gctgtgggct 2160 cccgacaacg ccggcaacta ccacgaaccc cgggctattg ggtcccgttt cctcacccac 2220 cacttgtaa 2229 <210> 12 <211> 2229 <212> DNA <213> Papio <220> <221> misc_feature <223> Bba. 49 <400> 12 atggctgctg acggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctctctga aggcattcgc 60 gagtggtggg cgctgaaacc tggagcccca cagcccaagg caaatcaaca acatcaagac 120 aacgctcggg gtcttgtgct tccgggttac aaatacttgg gacccggtaa cggactcgac 180 aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240 cagcagctca agtcgggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgcgga cgccgagttt 300 caggagcgtc ttcaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360 gccaaaaaga ggattctcga gcctctgggt ctggttgaag agggcgttaa aacggctcct 420 ggaaagaaac gcccattaga aaagactcca aatcggccga ccaacccgga ctctgggaag 480 gccccggcca agaaaaagca aaaagacggc gagacagccg actctgctag aaggacactc 540 gactttgaag actctggagc aggagacgga ccccctgagg gatcatcttc cggagaaatg 600 tctcatgatg ctgagatgcg tgcggcgcca ggcggaaatg ctgtcgaggc gggacaaggt 660 gccgatggag tgggtaatgc ctccggtgat tggcattgcg attccacctg gtcagagggc 720 cgagtcacca ccaccagcac ccgaacctgg gtcctgccca cctacaacaa ccacctgtac 780 ctgcgaatcg gaacaacggc caacagcaac acctacaatg gattctccac cccctgggga 840 tactttgact ttaaccgctt ccactgccac ttttccccac gcgactggca gcgactcatc 900 aacaacaact ggggactcag gccgaaatcg atgcgtgtta aaatcttcaa catccaggtc 960 aaggaggtca ctacgtcaaa cggcgagact acggtcgcta ataaccttac cagcacggtt 1020 cagatctttg cggattcaac gtatgaactc ccatacgtga tggacgccgg tcaggagggg 1080 agccttcctc cgttccccaa cgacgtgttt atggttcccc aatacgggta ctgcggagtc 1140 gtcactggag aaaaccagaa ccaaacagac agaaatgcct tttactgtct ggagtacttt 1200 ccatcccaaa tgctaagaac tggcaacaac tttgaaatca gttaccaatt tgaaaaagtt 1260 cctttccatt caatgtacgc gcacagccag agcctggaca gaatgatgaa tcctttgctg 1320 gatcagtacc tgtggcatct gcaatcgacc actaccggaa attcccttaa tcaaggaaca 1380 gctatcacca cgtacgggaa aattaccact ggggactttg cctactacag gaaaaactgg 1440 ttgcctggag ccggcattaa acaacaaaaa ttttcaaaga atgccagtca aaactacaag 1500 attcccgcca gcgggggaga cgccctttta aagtatgaca cgcataccac tttaaatggg 1560 cgatggagta acatggctcc tggtcctcca atggccaccg caggtgccgg ggactcggat 1620 tttagcaaca gccagctgat ctttgccgga cccaatcaga gcggtaacac gaccacgtct 1680 tcaaacaatt tgttgtttac ctcagaagag gagattgcca caacaaaccc acgagacacg 1740 gacatgtttg gacagattgc agataataat caaaatgcca ccaccgcccc tcacatcgct 1800 aacctggacg ctatgggaat tgttcccgga atggtctggc aaaacagaga catctactac 1860 cagggcccta tttgggccaa ggtccctcac acggacggac actttcaccc ttcgccgctg 1920 atgggaggat ttggactgaa acacccgcct ccgcagattt tcatcaaaaa cacccccgta 1980 cccgccaatc ccaatactac ctttagcgct gcaaggatca attctttttt gacgcagtac 2040 agcaccggac aagtcgccgt tcagatcgac tgggaaattc agaaggagca ctccaaacgc 2100 tggaatcccg aagtccaatt tacttcaaac tacggcactc aaaattctat gctgtgggct 2160 cccgacaacg ccggcaacta ccacgaaccc cgggctattg ggtcccgttt cctcacccac 2220 cacttgtaa 2229 <210> 13 <211> 2229 <212> DNA <213> Papio <220> <221> misc_feature <223> Bba.50 <400> 13 atggctgctg acggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctctctga aagcattcgc 60 gagtggtggg cgctgaaacc tggagcccca cggcccaagg caaatcaaca acatcaagac 120 gacgctcggg gtcttgtgct tccgggttac aaatacttgg gacccggtaa cggactcgac 180 aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240 cagcagctca agtcgggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgcgga cgccgagttc 300 cagcagcgct tggcgaccga cacctctttt gggggcaacc tcggcaaggc agtcttccag 360 gccaaaaaga ggattctcga gcctctgggt ctggttgaag agggcgttaa aacggctcct 420 ggaaggaaac gcccattaga aaagactcca aatcggccga ccaacccgga ctctgggaag 480 gccccggcca agaaaaagca aaaagacggc gagacagccg actctgctag aaggacactc 540 gactttgaag actctggagc aggagacgga ccccctgagg gatcatcttc cggagaaatg 600 tctcatgatg ctgagatgcg tgcggcgcca ggcggaaatg ctgtcgaggc gggacaaggt 660 gccgatggag tgggtaatgc ctccggtgat tggcattgcg attccacctg gtcagagggc 720 cgagtcacca ccaccagcac ccgaacctgg gtcctgccca cctacaacaa ccacctgtac 780 ctgcgaatcg gaacaacggc caacagcaac acctacaatg gattctccac cccctgggga 840 tactttgact ttaaccgctt ccactgccac ttttccccac gcgactggca gcgactcatc 900 aacaacaact ggggactcag gccgaaatcg atgcgtgtta aaatcttcaa catccaggtc 960 aaggaggtca ctacgtcaaa cggcgagact acggtcgcta ataaccttac cagcacggtt 1020 cagatctttg cggattcaac gtatgaactc ccatacgtga tggacgccgg tcaggagggg 1080 agccttcctc cgttccccaa cgacgtgttt atggttcccc aatacgggta ctgcggagtc 1140 gtcactggag aaaaccagaa ccaaacagac agaaatgcct tttactgtct ggagtacttt 1200 ccatcccaaa tgctaagaac tggcaacaac tttgaaatca gttaccaatt tgaaaaagtt 1260 cctctccatt caatgtacgc gcacagccag agcctggaca gaatgatgaa tcctttgctg 1320 gatcagtacc tgtggcatct gcaatcgacc actaccggaa attcccttaa tcaaggaaca 1380 gctaccacca cgtacgggaa aattaccact ggggactttg cctactacag gaaaaactgg 1440 ttgcctggag cctgcattaa acaacaaaaa ttttcaaaga atgccagtca aaactacaag 1500 attcccgcca gcggggaaga cgccctttta aagtatgaca cgcataccac tttaaatggg 1560 cgatggagta acatggctcc tggtcctcca atggccaccg caggtgccgg ggactcggat 1620 tttagcaaca gccagctgat ctttgccgga cccaatcaga gcggtaacac gaccacgtct 1680 tcaaacaatt tgttgtttac ctcagaagag gagattgcca caacaaaccc acgagacacg 1740 gacatgtttg gacagattgc agataataat caaaatgcca ccaccgcccc tcacatcgct 1800 aacctggacg ctatgggaat tgttcccgga atggtctggc aaaacagaga catctactac 1860 cagggcccta tctgggccaa ggtccctcac acggacggac actttcaccc ttcgccgctg 1920 atgggaggat ttggactgaa acacccgcct ccgcagattt tcatcaaaaa cacccccgta 1980 cccgccaatc ccaatactac ctttagcgct gcaaggatca attctttttt gacgcagtac 2040 agcaccggac aagtcgccgt tcagatcgac tgggaaattc agaaggagca ctccaaacgc 2100 tggaatcccg aagtccaatt tacttcaaac tacggcactc aaaattctat gctgtgggct 2160 cccgacaacg ccggcaacta ccacgaaccc cgggctattg ggtcccgttt cctcacccac 2220 cacttgtaa 2229 <210> 14 <211> 2229 <212> DNA <213> Papio <220> <221> misc_feature <223> Bba.51 <400> 14 atggctgctg acggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctctctga aggcattcgc 60 gagtggtggg cgctgaaacc tggagcccca cagcccaagg caaatcaaca acatcaagac 120 aacgctcggg gtcttgtgct tccgggttac aaatacttgg gacccggtaa cggactcgac 180 aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240 cagcagctca agtcgggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgcgga cgccgagttc 300 cagcagcgct tggcgaccga cacctctttt gggggcaacc tcggcaaggc agtcttccag 360 gccaaaaaga ggattctcga gcctctgggt ctggttgaag agggcgttaa aacggctcct 420 ggaaagaaac gcccattaga aaagactcca aatcggccga ccaacccgga ctctgggaag 480 gccccggcca agaaaaagca aaaagacggc gagacagccg actctgctag aaggacactc 540 gactttgaag actctggagc aggagacgga ccccctgagg gatcatcttc cggagaaatg 600 tctcatgatg ctgagatgcg tgcggcgcca ggcggaaatg ctgtcgaggc gggacaaggt 660 gccgatggag tgggtaatgc ctccggtgat tggcattgcg attccacctg gtcagagggc 720 cgagtcacca ccaccagcac ccgaacctgg gtcctgccca cctacaacaa ccacctgtac 780 ctgcgaatcg gaacaacggc caacagcaac acctacaatg gattctccac cccctgggga 840 tactttgact ttaaccgctt ccactgccac ttttccccac gcgactggca gcgactcatc 900 aacaacaact ggggactcag gccgaaatcg atgcgtgtta aaatcttcaa catccaggtc 960 aaggaggtca ctacgtcaaa cggcgagact acggtcgcta ataaccttac cagcacggtt 1020 cagatctttg cggattcaac gtatgaactc ccatacgtga tggacgccgg tcaggagggg 1080 agccttcctc cgttccccaa cgacgtgttt atggttcccc aatacgggta ctgcggagtc 1140 gtcactggag aaaaccagaa ccaaacagac agaaatgcct tttactgtct ggagtacttt 1200 ccatcccaaa tgctaagaac tggcaacaac tttgaaatca gttaccaatt tgaaaaagtt 1260 cctttccatt caatgtacgc gcacagccag agcctggaca gaatgatgaa tcctttgctg 1320 gatcagtacc tgtggcatct gcaatcgacc actaccggaa attcccttaa tcaaggaaca 1380 gctaccacca cgtacgggaa aattaccact ggggactttg cctactacag gaaaaactgg 1440 ttgcctggag cctgcattaa acaacaaaaa ttttcaaaga atgccagtca aaactacaag 1500 attcccgcca gcgggggaga cgccctttta aagtatgaca cgcataccac tttaaatggg 1560 cgatggagta acatggctcc tggtcctcca atggccaccg caggtgccgg ggactcggat 1620 tttagcaaca gccagctgat ctttgccgga cccaatcaga gcggtaacac gaccacgtct 1680 tcaaacaatt tgttgtttac ctcagaagag gagattgcca caacaaaccc acgagacacg 1740 gacatgtttg gacagattgc agataataat caaaatgcca ccaccgcccc tcacatcgct 1800 aacctggacg ctatgggaat tgttcccgga atggtctggc aaaacagaga catctactac 1860 cagggcccta tttgggccaa ggtccctcac acggacggac actttcaccc ttcgccgctg 1920 atgggaggat ttggactgaa acacccgcct ccgcagattt tcatcaaaaa cacccccgta 1980 cccgccaatc ccaatactac ctttagcgct gcaaggatca attctttttt gacgcagtac 2040 agcaccggac aagtcgccgt tcagatcgac tgggaaattc agaaggagca ctccaaacgc 2100 tggaatcccg aagtccaatt tacttcaaac tacggcactc aaaattctat gctgtgggct 2160 cccgacaacg ccggcaacta ccacgaaccc cgggctattg ggtcccgttt cctcacccac 2220 cacttgtaa 2229

Claims (32)

  1. 캡시드 단백질을 포함하고, 캡시드 단백질이 (i) 서열번호 1-7 중 어느 하나, (ii) 서열번호 1-7 중 어느 하나의 VP2 영역, 또는 (iii) 서열번호 1-7 중 어느 하나의 VP3 영역과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 숙주 세포에서 이종 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 이종 유전자를 포함하는 트랜스유전자를 추가로 포함하는, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus)(AAV).
  2. 제1항에 있어서,
    캡시드 단백질이 (i) 서열번호 1-7 중 어느 하나, (ii) 서열번호 1-7 중 어느 하나의 VP2 영역, 또는 (iii) 서열번호 1-7 중 어느 하나의 VP3 영역의 아미노산 서열을 포함하는 AAV.
  3. 캡시드 단백질을 포함하고, 캡시드 단백질이 서열번호 1-7 중 어느 하나의 기능성 단편을 포함하고, 숙주 세포에서 이종 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 이종 유전자를 포함하는 트랜스유전자를 추가로 포함하는, 아데노-연관 바이러스(AAV).
  4. 제3항에 있어서,
    캡시드 단백질이 서열번호 1-7 중 어느 하나의 아미노산 서열의 가변 영역(variable regions)(VR), 가변 영역 사이에 위치한 불변 영역, GBS 도메인, 및 GH 루프 중 하나 이상을 포함하는 AAV.
  5. 캡시드 단백질을 포함하고, 캡시드 단백질이 (i) 서열번호 8-14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열, (ii) 서열번호 1-7 중 어느 하나의 아미노산 서열의 VP2 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 (iii) 서열번호 1-7 중 어느 하나의 아미노산 서열의 VP3 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 하이브리드화되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하고, 숙주 세포에서 이종 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 이종 유전자를 포함하는 트랜스유전자를 추가로 포함하는, 아데노-연관 바이러스.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 역위 말단 반복부(inverted terminal repeat)를 추가로 포함하는 AAV.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 AAV 및 생리학적 양립성 담체를 포함하는 조성물.
  8. 세포를 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 AAV와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에 트랜스유전자를 전달하는 방법.
  9. 트랜스유전자를 세포에 전달하기 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 AAV를 포함하는 조성물.
  10. 트랜스 유전자를 세포에 전달하기 위한 의약의 제조를 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 AAV의 용도.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포가 간 세포인 방법, 조성물 또는 용도.
  12. 캡시드 단백질을 포함하는 AAV의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 캡시드 단백질이 (i) 서열번호 1-7 중 어느 하나, (ii) 서열번호 1-7 중 어느 하나의 VP2 영역, 또는 (iii) 서열번호 1-7 중 어느 하나의 VP3 영역과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, AAV가 단백질의 생물학적 활성 복제물을 코딩하는 트랜스유전자를 포함하는, 내인성 단백질의 비정상적 활성과 연관된 장애 또는 질환을 앓는 대상체를 치료하는 방법.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 AAV의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 내인성 단백질의 비정상적 활성과 연관된 장애 또는 질환을 앓는 대상체를 치료하는 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    장애 또는 질환이 간 세포에서 발현된 내인성 유전자의 비정상적 활성과 연관된 것인 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    장애 또는 질환이 A형 혈우병, B형 혈우병, 윌슨병(Wilson's disease), 유전성 혈관부종(hereditary angioedema)(HAE), 알파 1 항트립신 결핍, 및 갈락토스혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 장애 또는 질환인 방법.
  16. (i) 서열번호 1-7 중 어느 하나, (ii) 서열번호 1-7 중 어느 하나의 VP2 영역, 또는 (iii) 서열번호 1-7 중 어느 하나의 VP3 영역과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 아데노-연관 바이러스(AAV) 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  17. 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 뉴클레오티드 서열이 (i) 서열번호 8-14 중 어느 하나의 핵산 서열, (ii) 서열번호 1-7 중 어느 하나의 VP2 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 (iii) 서열번호 1-7 중 어느 하나의 VP3 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 하이브리드화되는, 벡터.
  18. 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 캡시드 단백질이 서열번호 1-7 중 어느 하나의 기능성 단편을 포함하는, 벡터.
  19. 제18항에 있어서,
    캡시드 단백질이 서열번호 1-7 중 어느 하나의 아미노산 서열의 가변 영역(VR), 가변 영역 사이에 위치한 불변 영역, GBS 도메인, 및 GH 루프 중 하나 이상을 포함하는 것인 벡터.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산 서열이 숙주 세포에서 캡시드 단백질의 발현을 제어하는 이종 조절 요소에 작동가능하게 연결된 것인 벡터.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 세포.
  22. 장애 또는 질환의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 AAV의 용도.
  23. 제22항에 있어서,
    장애 또는 질환이 내인성 단백질의 비정상적 활성과 연관되고, AAV가 단백질의 생물학적 활성 복제물을 코딩하는 트랜스유전자를 포함하는 것인 용도.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서,
    장애 또는 질환이 A형 혈우병, B형 혈우병, 윌슨병, 유전성 혈관부종(HAE), 알파 1 항트립신 결핍, 및 갈락토스혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 장애 또는 질환인 용도.
  25. 질환 또는 장애의 치료를 위한 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 AAV를 포함하는 조성물.
  26. 제25항에 있어서,
    장애 또는 질환이 내인성 단백질의 비정상적 활성과 연관되고, AAV가 단백질의 생물학적 활성 복제물을 코딩하는 트랜스유전자를 포함하는 조성물.
  27. 제26항에 있어서,
    장애 또는 질환이 A형 혈우병, B형 혈우병, 윌슨병, 유전성 혈관부종(HAE), 알파 1 항트립신 결핍, 및 갈락토스혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 장애 또는 질환인 조성물.
  28. (a) 숙주 세포에서 이종 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 이종 유전자를 포함하는 트랜스유전자 측면에 있는 5' 및 3' AAV 역위 말단 반복부 서열을 포함하는 제1 핵산 벡터, 및 AAV rep 및 cap 핵산 서열을 포함하고, 상기 cap 핵산 서열이 서열번호 1-7 중 어느 하나와 적어도 95% 동일한 AAV 캡시드를 코딩하는 제2 핵산 벡터가 도입되었던 바이러스 생산 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 바이러스 생산 세포 배양액의 상청액으로부터 AAV를 회수하는 단계
    를 포함하는,
    제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 아데노-연관 바이러스(AAV)를 생산하는 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    바이러스 생산 세포가 포유동물 세포인 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    포유동물 세포가 HEK293, HeLa, CHO, NS0, SP2/0, PER.C6, Vero, RD, BHK, HT 1080, A549, Cos-7, ARPE-19, 및 MRC-5 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    포유동물 세포가 HEK293 세포인 방법.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 아데노-연관 바이러스(AAV).
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