KR20230145357A - rAAV 및 rBV 생산을 위한 형질전환 시약으로서의 히스티딘이풍부한 펩티드 - Google Patents

rAAV 및 rBV 생산을 위한 형질전환 시약으로서의 히스티딘이풍부한 펩티드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아데노 관련 바이러스 및 바큘로바이러스를 제조하고 사용하기 위한 방법, 조성물, 및 키트를 제공한다. 아데노 관련 바이러스 및 바큘로바이러스 입자를 생산하는 방법은 히스티딘 풍부 펩티드 및 다른 양이온성 펩티드를 형질감염 시약으로 사용하는 것을 포함한다. 아데노 관련 바이러스는 특히 유전자 치료 및/또는 진단에 사용하기 위해 캡시드로 위형화된다. 바큘로바이러스는 또한 아데노 관련 바이러스를 제조하는 데 사용된다.

Description

rAAV 및 rBV 생산을 위한 형질감염 시약으로서 히스티딘 풍부 펩티드의 용도
본 발명은 형질감염 시약으로서 히스티딘 풍부 펩티드 (HRP)를 사용하여 재조합 아데노 관련 바이러스 (rAAV) 및 재조합 바큘로바이러스 (rBV) 입자를 생산하는 방법 및 공정에 관한 것이다.
본 발명은 아데노 관련 바이러스 (AAV) 생산을 개선하는 방법에 관한 것이다. AAV는 20-25 nm (4.7 kb)의 단일 가닥 DNA 게놈을 갖는 외피가 없는 바이러스이다. AAV는 약 4.7-킬로베이스 (kb)의 선형 단일 가닥 DNA (ssDNA) 게놈을 가지며, 말단에 2개의 145개 뉴클레오티드 길이 역위 말단 반복 (ITR)이 있다. 바이러스는 중합효소를 암호화하지 않으므로 게놈 복제를 위해 세포 중합효소에 의존한다. ITR은 비구조 단백질과 구조 단백질을 각각 암호화하는 rep (복제) 및 cap (캡시드)의 두 바이러스 유전자 측면에 있다. rep 유전자는 두 개의 프로모터와 대체 스플라이싱을 통해, Rep78, Rep68, Rep52, 및 Rep40이라 불리는 4개의 조절 단백질을 암호화한다. 이 단백질은 AAV 게놈 복제 및 패키징에 관여한다. cap 유전자는 대체 스플라이싱 및 번역 개시를 통해, 각각 분자량이 87, 72 및 62 kDa인 3개의 캡시드 단백질 VP1 (비리온 단백질 1), VP2 및 VP3를 생성한다. 이 캡시드 단백질은 60개의 서브유닛으로 구성된 구형에 가까운 단백질 껍질로 조립된다.
AAV는 스스로 복제할 수 없으며 헬퍼 바이러스, 전형적으로 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스와의 공동-감염이 필요하다. AAV가 인간 세포 단독으로 감염되면, 유전자 발현 프로그램이 자동 억제되어 세포의 잠복 감염이 발생한다. 그러나 잠복기 감염된 세포가 헬퍼 바이러스, 예를 들어 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스와 동시 감염되면, AAV 유전자 발현이 활성화되어 숙주 세포 염색체에서 프로바이러스 DNA가 절단되어, 바이러스 게놈이 복제 및 패키징된다.
포유류 또는 곤충 세포에서 바이러스 벡터를 생산하려면 바이러스 벡터 생산에 관여하는 관심 유전자 및 필수 단백질을 코딩하는 외래 핵산의 전달이 필요하다. 외래 핵산을 세포로 수동적으로 흡수하는 것은 가능한 감염으로부터 세포를 보호하기 위해 제한된다. 따라서 핵산의 촉진된 전달이 필요하다. 가장 일반적으로 형질감염 시약은 핵산을 세포로 이동시키는 데 사용된다. 바이러스 벡터의 대규모 제조를 위한 형질감염 시약의 선택은 효율성, 안전성, 일관성, 확장성 및 비용에 따라 결정된다.
적합한 형질감염 시약은 대규모 바이러스 벡터 생산을 위한 성공적인 후보가 되기 위해 몇 가지 기준을 충족해야 한다: 1) 바람직하게는 플라스미드, 박미드 또는 임의의 다른 형태의 형태로 제공된 외래 핵산에 결합하고; 2) 외래 DNA와 형질감염 시약의 복합체는 바람직하게는 10분 이상 동안 안정하고; 3) 외래 DNA: 형질감염 시약의 복합체가 세포 표면에 결합하고 세포에 의해 흡수되고; 4) 형질감염 시약은 바람직하게는 외래 DNA 또는 외래 DNA:형질감염 시약 복합체의 엔도솜 방출을 위한 방법을 제공하고; 5) 외래 DNA 또는 외래 DNA: 형질감염 시약 복합체는 바람직하게는 세포의 핵에 도달할 수 있고; 6) 외래 DNA 또는 외래 DNA:형질감염 시약 복합체는 바람직하게는 단백질의 전사 및 유전자의 복제에 이용 가능하고; 7) 형질감염 시약 및 외래 DNA:형질감염 시약 복합체는 바람직하게는 세포에 의해 잘 용인되고; 8) 외래 DNA 또는 외래 DNA:형질감염 시약 복합체는 바람직하게는 선택한 생산 배지와 호환 가능하고; 그리고 9) 형질감염 시약은 바람직하게는 생산 세포를 효율적으로 형질감염시킬 수 있다.
현재 상업적으로 이용 가능한 형질감염 시약은 위에서 언급한 기준 중 하나 이상이 부족하다. 예를 들어, PEIPRO® (GMP 등급, PolyPlus), 선형 폴리에틸렌이민 (들) (PEI)를 포함하는 바이러스 벡터 및 백신의 생산을 위해 선택되는 널리 사용되는 형질감염 시약은 DNA:PEI 복합체의 낮은 안정성으로 알려졌다 (Sang Y. 등 Salt ions and related parameters affect PEI-DNA particle size and transfection efficiency in Chinese hamster ovary cells Cytotechnology 2015, 67(1):67-74; Han X. 등, The heterogeneous nature of polyethylenimine-DNA complex formation affects transient gene expression Cytotechnology 2009, 60(1-3):63).
다양한 생산 시스템의 경우, 형질감염 시약은 생물학적 물질의 생산 규모 조정에 직접적인 영향을 미친다. 이를 위해 PEI와 같은 형질감염 시약은 생산 규모를 확장할 수 없다. 예를 들어, 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포 배양 생산은 500 리터 (L) 이하의 부피로 제한된다는 것에 주목한다.
또한, 지질 기반 형질감염 시약은 DNA와 복합체를 형성하기 전에 희석된 형태에서 불안정하다. 또한, 곤충 및 포유류 세포에 사용되는 형질감염 시약 (예를 들어, CELLFECTIN®, TRANSIT®, 및 FECTOVIR®)은 임상 목적으로 사용되는 rAAV 생산에 바람직한 우수의약품 제조관리 기준 (GMP) 등급에서 아직 사용할 수 없다.
따라서 GMP 환경에서 바이러스 벡터의 대규모 제조에 적합한 더 나은 형질감염 시약이 필요하다.
다양한 구현예에서, 재조합 아데노 관련 바이러스 (rAAV) 및 재조합 바큘로바이러스 (rBV)를 제조하는 방법이 개시된다. 또한, 다양한 구현예에서, rAAV를 생성하기 위한 요소를 안정적으로 발현하는 세포를 생성하는 방법이 개시된다. 상기 방법은 형질감염 시약으로서 양이온성 펩티드의 사용을 포함하며, 여기서 펩티드는 pH 6 내지 8 (예를 들어, 7.4) 범위에서 양전하를 띤다. 일부 예시적인 양이온성 펩티드는 데옥시리보핵산 (DNA)과 정전기적으로 상호작용할 수 있고 DNA가 세포 내로 전달되도록 세포막을 관통할 수 있는 히스티딘 풍부 펩티드 (HRP)를 포함한다. 따라서, HRP는 플라스미드 및 박미드를 세포에 전달하기 위한 형질감염 시약으로 사용될 수 있다.
다양한 구현예의 rAAV 생산 방법은 HRP와 같은 양이온성 펩티드를 사용하여 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터로 세포를 공동-형질감염시키는 단계, 형질감염된 세포를 배양하여 rAAV를 생성하는 단계, 및 선택적으로, rAAV를 회수하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 상기 rAAV 생산 방법은 형질감염 시약을 사용하여 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터로 500 리터 (L) 초과의 배양 부피에 현탁된 세포를 일시적으로 동시-형질감염시키는 단계, 형질감염된 세포를 배양하여 rAAV를 생성하는 단계, 및 선택적으로, rAAV를 회수하는 단계를 포함한다.
다양한 구현예의 rBV 생산 방법은 HRP와 같은 양이온성 펩티드를 사용하여 이종 뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 박미드로 세포를 형질감염시키는 단계, 형질감염된 세포를 배양하여 rBV를 생성하는 단계 및 선택적으로, rBV를 회수하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 상기 rBV 생산 방법은 HRP와 같은 양이온성 펩티드를 사용하여 이종 뉴클레오티드 서열로 세포를 형질감염시키는 단계, 형질감염된 세포를 배양하여 rBV를 생성하는 단계, 및 선택적으로, rBV를 회수하는 단계를 포함한다. 상기 세포는 바큘로바이러스 게놈의 적어도 일부를 가지고 있다. 배양 단계 동안, 이종 뉴클레오티드 서열과 바큘로바이러스 게놈의 적어도 일부가 결합하여 rBV를 생성할 수 있는 바큘로바이러스 게놈을 형성한다.
다른 구현예에서, 상기 rBV 생산 방법은 HRP와 같은 양이온성 펩티드를 사용하여 세포를 원형 또는 선형의 완전 또는 부분 바큘로바이러스 게놈, 및 바큘로바이러스 게놈에 상동인 영역 또는 영역들을 함유하는 이종 뉴클레오티드 서열 (전달 벡터에 통합될 수 있음)로 공동-형질감염시키는 단계, 형질감염된 세포를 배양하여 rBV를 생성하는 단계, 및 선택적으로, rBV를 회수하는 단계를 포함한다. 배양 단계 동안, 완전 또는 부분 바큘로바이러스 게놈 및 이종 뉴클레오티드 서열은 상동 영역을 통해 재조합되어 rBV를 생성할 수 있고 이종 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부를 보유할 수 있는 재조합 바큘로바이러스 게놈을 형성한다.
다양한 구현예의 rBV 생산 방법은 HRP와 같은 양이온성 펩티드를 사용하여 rAAV 게놈 벡터를 제공하거나 Rep 또는 Cap 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 박미드로 세포를 형질감염시키는 단계, 형질감염된 세포를 배양하여 rBV를 생성하는 단계, 및 선택적으로, rBV를 회수하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 상기 rBV 생산 방법은 HRP와 같은 양이온성 펩티드를 사용하여 AAV 게놈 벡터를 제공하거나 Rep 또는 Cap 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 세포를 형질감염시키는 단계, 형질감염된 세포를 배양하여 rBV를 생성하는 단계, 및 선택적으로, rBV를 회수하는 단계를 포함한다. 상기 세포는 바큘로바이러스 게놈의 적어도 일부를 가지고 있다. 배양 단계 동안, 뉴클레오티드 서열 및 바큘로바이러스 게놈의 적어도 일부가 결합하여 rBV를 생성할 수 있는 바큘로바이러스 게놈을 형성한다.
다른 구현예에서, 상기 rBV 생산 방법은 HRP와 같은 양이온성 펩티드를 사용하여 세포를 원형 또는 선형의 완전 또는 부분 바큘로바이러스 게놈, 및 rAAV 벡터 게놈 또는 AAV rep 및/또는 cap 유전자를 함유하고, 또한 바큘로바이러스 게놈에 상동인 영역 또는 영역들을 함유하는 이종 뉴클레오티드 서열 (전달 벡터에 혼입될 수 있음)로 공동-형질감염시키는 단계, 형질감염된 세포를 배양하여 rBV를 생성하는 단계, 및 선택적으로, rBV를 회수하는 단계를 포함한다. 배양 단계 동안, 완전 또는 부분 바큘로바이러스 게놈 및 이종 뉴클레오티드 서열은 상동 영역을 통해 재조합되어 rBV를 생성할 수 있고 이종 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부를 보유할 수 있는 재조합 바큘로바이러스 게놈을 형성한다.
다양한 구현예의 세포 생성 방법은 HRP와 같은 양이온성 펩티드를 사용하여 rAAV 생산에 사용되는 요소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 벡터로 세포를 형질감염시키는 단계 및 뉴클레오티드 서열을 갖는 게놈을 갖는 형질감염된 세포를 단리하는 단계를 포함한다.
다양한 구현예에서, 다음 서열 번호 중 어느 하나와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 임의의 구현예의 양이온성 펩티드: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 또는 124.
다양한 구현예에서, 다음 서열 번호 중 어느 하나와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 갖는 양이온성 펩티드가 개시된다: 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 121, 122, 123, 또는 124. 다른 구현예에서, 다음 서열 번호의 아미노산 서열을 갖는 양이온성 펩티드가 개시된다: 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 121, 122, 123, 또는 124.
다양한 구현예에서, 다음 서열 번호 중 어느 하나와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 양이온성 펩티드를 포함하는 조성물이 개시된다: 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 121, 122, 123, 124, 또는 이들의 조합. 다른 구현예에서, 다음 서열 번호의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 양이온성 펩티드를 포함하는 조성물이 개시된다: 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 121, 122, 123, 124, 또는 이들의 조합.
도 1은 Ambr15 소형생물반응기 (15 밀리리터 (mL) 부피)에서 배양된 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포에서 생성된 Bba41 캡시드의 역가 및 형질감염 후 24시간 및 66시간에 상이한 히스티딘 풍부 펩티드 (HRP) 및 PEIPRO®의 형질감염 효율을 개시한다. Bba41 캡시드를 생산하고 녹색 형광 단백질 (GFP) 발현 카세트를 함유하는 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위해 세포를 플라스미드로 형질감염시켰다. GFP 단백질을 발현하는 세포를 확인하기 위해 유동 세포측정법을 사용하여 형질감염 효율을 측정하였다. AAV 역가는 디지털 액적 중합효소 연쇄 반응 (ddPCR)을 사용하여 정량화되었다.
도 2는 Bba41 캡시드를 생산하고 GFP 발현 카세트를 함유하는 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위해 플라스미드를 형질감염시킬 때 진탕 플라스크 (30 mL 작업 부피)에서 형질감염 24시간 후 HEK293 세포에서 LAH4 펩티드의 형질감염 효율을 보여준다. GFP 단백질을 발현하는 세포를 확인하기 위해 유동 세포측정법을 사용하여 형질감염 효율을 측정하였다.
도 3은 상이한 LAH4 펩티드 농도 및 복합체화 부피를 사용하여 Bba41 캡시드를 생성하고 GFP 발현 카세트를 함유하는 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위해 플라스미드로 진탕 플라스크 (30 mL 작업 부피)에서 형질감염 24시간 후 HEK293 세포의 GFP 형광 강도를 보여준다. GFP 단백질을 발현하는 세포를 확인하기 위해 유동 세포측정법을 사용하여 형질감염 효율을 측정하였다.
도 4는 상이한 LAH4 펩티드 농도 및 복합체화 부피를 사용하여 Bba41 캡시드를 생성하고 GFP 발현 카세트를 함유하는 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위해 플라스미드로 진탕 플라스크 (30 mL 작업 부피)에서 형질감염 72시간 후 HEK293 세포에서 생성된 Bba41 캡시드의 역가를 보여준다. AAV 역가는 ddPCR을 사용하여 정량화되었다.
도 5a, 5b, 및 5c는 상이한 LAH4 펩티드 농도 및 복합체화 부피를 사용하여 Bba41 캡시드를 생성하고 GFP 발현 카세트를 함유하는 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위해 플라스미드로 형질감염된 진탕 플라스크 (30 mL 작업 부피)에서 HEK293 세포의 세포 밀도를 보여준다. 형질감염 후 0시간, 24시간, 48시간 및 72시간에 세포 밀도를 평가하였다. 세포 밀도는 자동 세포 계수기 및 트리판 블루 배제를 사용하여 정량화되었다.
도 6a, 6b, 및 6c는 상이한 LAH4 펩티드 농도 및 복합체화 부피를 사용하여 Bba41 캡시드를 생성하고 GFP 발현 카세트를 함유하는 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위해 플라스미드로 형질감염된 진탕 플라스크 (30 mL 작업 부피)에서 HEK293 세포의 생존력을 보여준다. 형질감염 후 0시간, 24시간, 48시간 및 72시간에 생존력을 평가하였다. 세포 생존력은 자동 세포 계수기 및 트리판 블루 배제를 사용하여 정량화되었다.
도 7은 상이한 HRP 및 PEIPRO®를 사용하여 Bba41 캡시드를 생성하고 GFP 발현 카세트를 함유하는 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위해 진탕 플라스크 (30 mL 작업 부피)에서 배양되고 플라스미드로 형질감염된 HEK293 세포에서 생성된 Bba41 캡시드의 역가를 개시한다. 상이한 HRP 및 PEIPRO®는 플라스미드와 혼합하고 형질감염 전에 상이한 시간 동안 배양하였다. AAV 역가는 ddPCR을 사용하여 정량화되었다.
도 8a는 Bba41 캡시드를 생성하고 GFP 발현 카세트를 함유하는 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위해 플라스미드를 형질감염시킬 때 형질감염 24시간 후 진탕 플라스크 (30 mL 작업 부피)에서 배양된 HEK293 세포에서 상이한 HRP 및 PEIPRO®의 형질감염 효율을 보여준다. 상이한 HRP 및 PEIPRO®는 플라스미드와 혼합하고 형질감염 전에 상이한 시간 동안 배양하였다. GFP 단백질을 발현하는 세포를 확인하기 위해 유동 세포측정법을 사용하여 형질감염 효율을 측정하였다.
도 8b는 Bba41 캡시드를 생성하고 GFP 발현 카세트를 함유하는 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위해 플라스미드를 형질감염시킬 때 형질감염 48시간 후 진탕 플라스크 (30 mL 작업 부피)에서 배양된 HEK293 세포에서 상이한 HRP의 형질감염 효율을 보여준다. 상이한 HRP는 플라스미드와 혼합하고 형질감염 전에 상이한 시간 동안 배양하였다. GFP 단백질을 발현하는 세포를 확인하기 위해 유동 세포측정법을 사용하여 형질감염 효율을 측정하였다.
도 9는 LAH4 펩티드 및 PEIPRO®를 사용하여 AAV9 캡시드를 생성하고 관심 유전자를 함유하는 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위해 플라스미드로 형질감염된 1.6 L 진탕 플라스크 (500 mL 작업 부피)의 HEK293 세포에서 생성된 AAV9 캡시드의 역가를 보여준다. AAV 역가는 ddPCR을 사용하여 정량화되었다.
도 10a는 AAV9 캡시드를 생성하고 GFP 발현 카세트를 함유하는 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위해 플라스미드를 형질감염시킬 때 형질감염 48시간 후 Ambr15 소형생물반응기 (15 mL 부피)에서 HEK293 세포에서 LAH4 펩티드의 상이한 복합체화 부피의 형질감염 효율을 보여준다. GFP 단백질을 발현하는 세포를 확인하기 위해 유동 세포측정법을 사용하여 형질감염 효율을 측정하였다.
도 10b는 AAV9 캡시드를 생성하고 GFP 발현 카세트를 함유하는 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위해 플라스미드를 형질감염시킬 때 형질감염 24시간 후 Ambr15 소형생물반응기 (15 mL 부피)에서 HEK293 세포에서 LAH4 펩티드의 상이한 복합체화 부피의 형질감염 효율을 보여준다. GFP 단백질을 발현하는 세포를 확인하기 위해 유동 세포측정법을 사용하여 형질감염 효율을 측정하였다.
도 10c는 Ambr15 소형생물반응기 (15 mL 부피)에서 HEK293 세포에서 생성되고 LAH4 펩티드의 상이한 복합체화 부피를 사용하여 AAV9 캡시드를 생성하고 GFP 발현 카세트를 함유하는 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위해 플라스미드로 형질감염된 AAV9 캡시드의 역가를 보여준다. AAV 역가는 ddPCR을 사용하여 정량화되었다.
도 10d는 Ambr15 소형생물반응기 (15 mL 부피)에서 LAH4 펩티드의 상이한 복합체화 부피를 사용하여 AAV9 캡시드를 생성하고 GFP 발현 카세트를 함유하는 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위해 플라스미드로 형질감염된 HEK293 세포의 생존력을 보여준다. 세포 생존력은 자동 세포 계수기 및 트리판 블루 배제를 사용하여 정량화되었다.
도 10e는 AAV9 캡시드를 생성하고 GFP 발현 카세트를 함유하는 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위해 플라스미드를 형질감염시킬 때 형질감염 48시간 후 Ambr15 소형생물반응기 (15 mL 부피)의 HEK293 세포에서 LAH4 펩티드의 형질감염 효율을 보여주며, 여기서 LAH4 펩티드 및 플라스미드를 혼합하고 형질감염 전에 상이한 시간 동안 배양하였다. GFP 단백질을 발현하는 세포를 확인하기 위해 유동 세포측정법을 사용하여 형질감염 효율을 측정하였다.
도 10f는 AAV9 캡시드를 생성하고 GFP 발현 카세트를 함유하는 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위해 플라스미드로 형질감염시켰을 때 형질감염 24시간 후 Ambr15 소형생물반응기 (15 mL 부피)의 HEK293 세포에서 LAH4 펩티드의 형질감염 효율을 보여주며, 여기서 LAH4 펩티드 및 플라스미드를 혼합하고 형질감염 전에 상이한 시간 동안 배양하였다. GFP 단백질을 발현하는 세포를 확인하기 위해 유동 세포측정법을 사용하여 형질감염 효율을 측정하였다.
도 10g는 LAH4 펩티드를 사용하여 HEK293 세포로 rAAV를 생성하고 GFP 발현 카세트를 함유하는 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위해 플라스미드로 형질감염시켰을 때 Ambr15 소형생물반응기 (15 mL 부피)에서 HEK293 세포에서 생성된 AAV9 캡시드의 역가를 개시하여, 여기서 LAH4 펩티드 및 플라스미드를 혼합하고 형질감염 전에 상이한 시간 동안 배양하였다. AAV 역가는 ddPCR을 사용하여 정량화되었다.
도 10h는 Ambr15 소형생물반응기 (15 mL 부피)에서 LAH4 펩티드를 사용하여 AAV9 캡시드를 생성하고 GFP 발현 카세트를 함유하는 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위해 플라스미드로 형질감염된 HEK293 세포의 생존력을 보여주며, 여기서 LAH4 펩티드 및 플라스미드를 혼합하고 형질감염 전에 상이한 시간 동안 배양하였다. 세포 생존력은 자동 세포 계수기 및 트리판 블루 배제를 사용하여 정량화되었다.
도 11은 3 L 생물반응기에서 HEK293 세포에서 생성되고 LAH4 펩티드를 사용하여 AAV9 캡시드를 생성하고 관심 유전자를 함유하는 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위해 플라스미드로 형질감염된 AAV9 캡시드의 역가를 보여준다. AAV 역가는 ddPCR을 사용하여 정량화되었다.
도 12는 상이한 농도에서 상이한 HRP (His-PTD4-LAH4, PTD4-LAH4, LAH4(W), 및 AAV2 VP1-2 BR3-스페이서-LAH4)의 형질감염 효율을 보여준다. 96 딥 웰 플레이트의 웰 (0.5 mL)에 있는 HEK293 세포는 상이한 농도의 상이한 HRP를 사용하여 rAAV를 생산하고 GFP 발현 카세트를 함유하는 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위해 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후, GFP 단백질을 발현하는 세포를 확인하기 위해 유동 세포측정법을 사용하여 형질감염 효율을 측정하였다.
도 13은 상이한 농도에서 상이한 HRP (His-PTD4-LAH4-L1-F4, PTD4-LAH4-L1-F4, LAH4-L1-F4(W), AAV2 VP1-2 BR3-스페이서-LAH4-L1-F4 및 SV40-T-NLS-스페이서-LAH4-L1-F4)의 형질감염 효율을 보여준다. 96 딥 웰 플레이트의 웰 (0.5 mL)의 HEK293 세포를 상이한 농도의 상이한 HRP를 사용하여 rAAV를 생성하고 GFP 발현 카세트를 함유하는 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위해 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후, GFP 단백질을 발현하는 세포를 확인하기 위해 유동 세포측정법을 사용하여 형질감염 효율을 측정하였다.
도 14는 상이한 농도에서 상이한 HRP (His-PTD4-LAH4, PTD4-LAH4, LAH4(W), 및 AAV2 VP1-2 BR3-스페이서-LAH4)의 AAV9 캡시드 역가를 보여준다. 96 딥 웰 플레이트의 웰 (0.5 mL)의 HEK293 세포를 상이한 농도의 상이한 HRP를 사용하여 rAAV를 생성하고 GFP 발현 카세트를 함유하는 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위해 플라스미드로 형질감염시켰다. 미리 결정된 시간 후, AAV9 캡시드를 배양물로부터 분리하고 역가를 ddPCR을 사용하여 정량화했다.
도 15는 상이한 농도에서 상이한 (His-PTD4-LAH4-L1-F4, PTD4-LAH4-L1-F4, LAH4-L1-F4(W), 및 SV40-T-NLS-스페이서-LAH4-L1-F4)의 AAV9 캡시드 역가를 보여준다. 96 딥 웰 플레이트의 웰 (0.5 mL)의 HEK293 세포를 상이한 농도의 상이한 HRP를 사용하여 rAAV를 생성하고 GFP 발현 카세트를 함유하는 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위해 플라스미드로 형질감염시켰다. 미리 결정된 시간 후, AAV9 캡시드를 배양물로부터 분리하고 역가를 ddPCR을 사용하여 정량화했다.
도 16은 LAH4 펩티드를 사용하여 대규모 (예를 들어, 100 L)에서 HEK293 세포의 AAV9 캡시드 역가를 보여준다. 100 L 생물반응기의 HEK293 세포를 rAAV를 생산하고 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위해 플라스미드로 형질감염시켰다. 미리 결정된 시간 후, AAV9 캡시드를 배양물로부터 분리하고 AAV 역가를 ddPCR을 사용하여 정량화했다.
도 17은 형질감염 24시간 후 상이한 HRP 및 대조군 형질감염 시약 (CELLFECTIN®, Thermo Fisher)을 사용하여 GFP 발현 카세트를 갖는 플라스미드로 초기 형질감염되었을 때 GFP를 발현하는 Sf9 세포의 백분율을 보여준다. GFP 단백질을 발현하는 세포를 식별하는 유동 세포측정법을 사용하여 형질감염 효율을 측정하였다.
도 18은 상이한 HRP 및 대조군 형질감염 시약을 사용하여 rAAV를 생성하기 위한 박미드를 형질감염시킴으로써 Sf9 세포에서 생성된 rBV의 역가를 보여준다.
도 19는 HRP 및 대조군 형질감염 시약을 사용하여 생성된 rBV 및 관심 유전자를 갖는 AAV 게놈 벡터를 제공하는 rBV로 감염된 Sf9 세포에서 생성된 rAAV의 역가를 보여준다. AAV 역가는 ddPCR을 사용하여 정량화되었다.
필요에 따라, 본 개시내용의 상세한 구현예가 본원에 개시된다; 그러나 개시된 구현예는 단지 예시적인 것이며 다양하고 대안적인 형태로 구현될 수 있음을 이해해야 한다.
실시예에서, 또는 달리 명시적으로 지시된 경우를 제외하고, 물질의 양 또는 반응 및/또는 사용 조건을 나타내는 이 명세서의 모든 수치 양은 단어 "약"에 의해 수정되는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, "약 X"를 참조하는 설명은 "X"에 대한 설명을 포함한다. 한 예에서, 용어 "약"은 당업계의 정상적인 허용 범위 내, 예를 들어 평균의 2 표준 편차 내로 이해된다. 다른 예에서, "약"은 ±0.0001%, ±0.0005%, ±0.001%, ±0.005%, ±0.01%, ±0.05%, ±0.1%, ±0.5%, ±1%, ±5%, 또는 ±10%의 가변성을 지칭한다. 추가 예에서, "약"은 ±9%, ±8%, ±7%, ±6%, ±5%, ±4%, ±3%, 또는 ±2% 내로 이해될 수 있다.
문맥상 달리 명확하지 않은 한, 본원에 제공된 모든 수치는 약이라는 용어로 수정된다. 모든 범위에는 범위의 종점이 포함된다. 두문자어 또는 기타 약어의 첫 번째 정의는 동일한 약어의 모든 후속 사용에 적용되며 처음에 정의된 약어의 일반 문법 변형에 준용하여 적용된다; 달리 명시되지 않는 한, 속성의 측정은 동일한 속성에 대해 이전에 또는 나중에 참조된 것과 동일한 기술로 결정된다.
달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
또한, 특정 구성요소 및/또는 조건이 물론 달라질 수 있기 때문에 본 개시내용은 아래에 설명된 특정 실시예 및 방법에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 단지 특정한 구현예를 설명하기 위해 사용된 것으로 어떠한 방식으로든 한정하려는 의도가 아니다.
간행물이 참조되는 본 출원 전반에 걸쳐, 전체적으로 이들 간행물의 개시내용은 본 발명이 속하는 최신 기술을 보다 완전하게 설명하기 위해 본 출원에 참조로 포함된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 달리 나타내지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다는 것이 또한 바람직하다. 예를 들어, 단수의 구성 요소에 대한 언급은 복수의 구성 요소를 포함하도록 의도된다.
용어 "또는" 및 "및"은 상호교환적으로 사용될 수 있으며 "및/또는"을 의미하는 것으로 이해될 수 있다.
용어 "포함하는"은 "포함하는", "갖는", "함유하는" 또는 "특징을 갖는"과 동의어이다. 이러한 용어는 포괄적이고 제한이 없으며 추가, 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
문구 "로 구성되는"은 청구범위에 명시되지 않은 요소, 단계 또는 성분을 제외한다. 이 문구가 전문 바로 다음이 아니라 청구범위 본문의 절에 나타날 때 해당 절에 명시된 요소만 제한한다; 다른 요소는 전체적으로 청구범위에서 제외되지 않는다.
문구 "로 본질적으로 구성되는"은 청구 범위를 지정된 물질 또는 단계와 청구된 주제의 기본적이고 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것으로 제한한다.
용어 "포함하는", "로 구성되는" 및 "로 본질적으로 구성되는"은 대체적으로 사용될 수 있다. 이 세 가지 용어 중 하나가 사용되는 경우, 현재 개시되고 청구되는 주제는 다른 두 용어 중 하나의 사용을 포함할 수 있다.
본 발명에 따라, 본 발명자들은 놀랍게도 히스티딘 풍부 펩티드 (HRP)로 확인된 양이온성 펩티드뿐만 아니라 다른 양이온성 펩티드가 세포를 효과적으로 형질감염시켜 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포와 같은 상이한 세포 유형에서 더 큰 역가의 재조합 아데노 관련 바이러스 (rAAV)를 생산할 수 있음을 발견했다. 이를 위해, HRP를 형질감염 시약으로 사용하면 현재 최신 기술로는 해결되지 않았으며 업계에서 오랫동안 필요로 여겨져 온 생물학적 물질 (예를 들어, 재조합 단백질, 안티센스 올리고뉴클레오티드와 같은 뉴클레오티드, 작은 간섭 리보핵산 (siRNA), 마이크로RNA (miRNA), 생물학적 제형, 및 rAAV 및 재조합 렌티바이러스와 같은 유전자 요법 벡터)의 생산 규모의 한계를 예기치 않게 해결한다. 또한, 곤충 세포 생산을 포함한 일부 생산 유형의 경우, HRP는 우수의약품 제조관리 기준 (GMP)에 따라 제조되는 반면, 다른 형질감염 시약은 GMP 등급으로 생성될 수 없거나 생성되지 않는다. HRP는 또한 생분해성이며 세포 생존 능력에 대한 손상/영향이 없는 것으로 제한된다.
본원에 기술된 방법은 단계(들)로 개시되고 기술될 수 있지만, 이러한 방법에 따라 일부 단계가 다른 순서로 및/또는 본원에 기술되고/되거나 당업계에 공지된 다른 단계(들)와 동시에 발생할 수 있으므로 방법이 반드시 단계 순서에 의해 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
다양한 구현예의 rAAV 생산 방법은 양이온성 펩티드/HRP를 사용하여 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터로 세포를 공동-형질감염시키는 단계, 형질감염된 세포를 배양하여 rAAV를 생성하는 단계, 및 rAAV를 회수하는 단계를 포함한다. 용어 "양이온성 펩티드/HRP"는 HRP뿐만 아니라 다른 기술된 양이온성 펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 양이온성 펩티드는 다음 서열 번호 중 어느 하나와 적어도 85%, 90%, 95%, 99%, 99%+, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 또는 124. 2개 이상의 뉴클레오티드 또는 펩티드 아미노산 서열과 관련하여 용어 "퍼센트 동일성", "동일한 퍼센트", 또는 "과 % 동일한"은 최대 일치를 위해 비교하고 정렬할 때 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 백분율을 지칭한다. 예를 들어, 퍼센트 동일성은 기본 설정을 사용하여 NCBI blastp (아미노산)를 사용하여 결정된다.
다른 예에서, 다음 서열의 아미노산 서열을 갖는 양이온성 펩티드: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 또는 124는 보존된 아미노산 교환과 같은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 또는 55개의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 보존된 아미노산 교환의 예시적인 예는 아미노산 측쇄의 구조적 및/또는 기능적 특성을 유지하는 아미노산 치환이며, 예를 들어, 방향족 아미노산이 다른 방향족 아미노산으로 치환되고, 산성 아미노산이 다른 산성 아미노산으로 치환되고, 염기성 아미노산이 또 다른 염기성 아미노산으로 치환되고, 지방족 아미노산이 또 다른 지방족 아미노산으로 치환된다. 일부 구현예에서, 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 전하를 갖는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 전하를 갖는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당업계에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄 (예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 표준화되고 허용되는 기능적으로 동등한 아미노산 치환이 표 1에 제시되어 있다. 대조적으로, 비보존적 아미노산 교환의 예는 아미노산 측쇄의 구조적 및/또는 기능적 특성을 유지하지 않는 아미노산 치환이며, 예를 들어, 방향족 아미노산은 염기성, 산성 또는 지방족 아미노산으로 치환되고, 산성 아미노산은 방향족, 염기성 또는 지방족 아미노산으로 치환되고, 염기성 아미노산은 산성, 방향족 또는 지방족 아미노산으로 치환되고, 지방족 아미노산은 방향족, 산성 또는 염기성 아미노산으로 치환된다.
표 1. 보존적 아미노산 치환
다른 구현예에서, rAAV 생산 방법은 형질감염 시약을 사용하여 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터로 500리터 (L) 이상의 부피에 현탁된 세포를 일시적으로 공동-형질감염시키는 단계, 형질감염된 세포를 배양하여 rAAV를 생성하는 단계, 및 선택적으로, rAAV를 회수하는 단계를 포함한다. 이전에 언급된 바와 같이, 500L 초과 규모에서 rAAV 또는 다른 생물학적 생산에 대한 능력을 제한하는 배양으로 최신 기술의 한계를 해결한다. 예를 들어, HEK293 세포를 사용하는 rAAV 또는 다른 생물학적 생산에 대한 최신 기술은 500 L 이하로 제한된다. 따라서, 본 출원에 기술된 바와 같은 본 발명은 현 기술 상태의 한계를 극복한다.
다양한 구현예의 rBV 생산 방법은 양이온성 펩티드/HRP를 사용하여 바큘로바이러스 게놈 및 이종 뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 박미드로 세포를 형질감염시키는 단계, 형질감염된 세포를 배양하여 rBV를 생성하는 단계 및 선택적으로, rBV를 회수하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, rBV 생산 방법은 HRP와 같은 양이온성 펩티드를 사용하여 이종 뉴클레오티드 서열로 세포를 형질감염시키는 단계, 형질감염된 세포를 배양하여 rBV를 생성하는 단계, 및 선택적으로, rBV를 회수하는 단계를 포함한다. 세포는 바큘로바이러스 게놈의 적어도 일부를 갖는다. 배양 단계 동안, 이종 뉴클레오티드 서열 및 바큘로바이러스 게놈의 적어도 일부 일부가 결합하여 rBV를 생성할 수 있는 바큘로바이러스 게놈을 형성한다.
다른 구현예에서, rBV 생산 방법은 HRP와 같은 양이온성 펩티드를 사용하여 바큘로바이러스 게놈에 상동성인 영역 또는 영역들을 함유하는, 이종 뉴클레오티드 서열 (전달 벡터에 통합될 수 있음)을 갖는 원형 또는 선형의 완전 또는 부분 바큘로바이러스 게놈으로 세포를 공동-형질감염시키는 단계, 형질감염된 세포를 배양하여 rBV를 생성하는 단계, 및 선택적으로, rBV를 회수하는 단계를 포함한다. 배양 단계 동안, 완전 또는 부분 바큘로바이러스 게놈 및 이종 뉴클레오티드 서열은 상동 영역을 통해 재조합되어 rBV를 생성할 수 있는 재조합 바큘로바이러스 게놈을 형성하고, 이종 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부를 보유한다.
다양한 구현예의 rBV 생산 방법은 양이온성 펩티드/HRP를 사용하여 AAV 게놈 벡터를 제공하거나 Rep 또는 Cap 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 박미드로 세포를 형질감염시키는 단계, 형질감염된 세포를 배양하여 rBV를 생성하는 단계, 및 선택적으로, rBV를 회수하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, rBV 생산 방법은 HRP와 같은 양이온성 펩티드를 사용하여 AAV 게놈 벡터를 제공하거나 Rep 또는 Cap 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 세포를 형질감염시키는 단계, 형질감염된 세포를 배양하여 rBV를 생성하는 단계, 및 선택적으로, rBV를 회수하는 단계를 포함한다. 세포는 바큘로바이러스 게놈의 적어도 일부를 갖는다. 배양 단계 동안, 뉴클레오티드 서열 및 바큘로바이러스 게놈의 적어도 일부가 결합하여 rBV를 생성할 수 있는 바큘로바이러스 게놈을 형성한다.
다른 구현예에서, rBV 생산 방법은 원형 또는 선형의, 완전 또는 부분 바큘로바이러스 게놈, 및 HRP와 같은 양이온성 펩티드를 사용하여 rAAV 벡터 게놈 또는 AAV rep 및/또는 cap 유전자를 함유하는, 그리고 또한 바큘로바이러스 게놈에 상동성인 영역 또는 영역들을 함유하는 이종 뉴클레오티드 서열 (전달 벡터에 통합될 수 있음)로 세포를 공동-형질감염시키는 단계, 형질감염된 세포를 배양하여 rBV를 생성하는 단계, 및 선택적으로, rBV를 회수하는 단계를 포함한다. 배양 단계 동안, 완전 또는 부분 바큘로바이러스 게놈 및 이종 뉴클레오티드 서열은 상동 영역을 통해 재조합되어 rBV를 생성할 수 있는 재조합 바큘로바이러스 게놈을 형성하고, 이종 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부를 보유한다.
다양한 구현예의 세포 생성 방법은 양이온성 펩티드/HRP를 사용하여 rAAV를 생성하는 데 사용되는 요소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 벡터로 세포를 형질감염시키는 단계 및 뉴클레오티드 서열을 갖는 게놈을 갖는 형질감염된 세포를 단리하는 단계를 포함한다.
rAAV 생산 방법의 다양한 구현예에서, 임의의 구현예의 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터는 적어도 1개의 세포에 공동-형질감염된다. 다양한 구현예에서, 임의의 구현예의 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터는 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99%+, 또는 적어도 100%의 세포에 공동-형질감염된다. 추가 구현예에서, 하나 이상의 벡터로 형질감염된 세포의 백분율은 상기 제공된 임의의 두 백분율 사이의 범위이다.
rAAV 생산 방법의 다양한 구현예에서, 양이온성 펩티드/HRP를 사용하여 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터로 형질감염된 세포의 백분율은 폴리에틸렌이민 또는 이의 유도체를 포함하는 형질감염 시약(들)을 사용하여 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터로 형질감염된 세포의 백분율보다 크고, 여기서 형질감염 조건은 하나 이상의 벡터로 형질감염된 세포의 백분율을 최대화하기 위해 또는 대안적으로 동일한 유사한 형질감염 조건 하에서 최적화된다.
rAAV 생산 방법의 다양한 구현예에서, 임의의 구현예의 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터 및 임의의 구현예의 양이온성 펩티드/HRP 및 형질감염 시약 중 하나는 세포가 배양 중인 부피의 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만인 부피에 있는 세포에 첨가된다. 다양한 구현예에서, 임의의 구현예의 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터 및 임의의 구현예의 양이온성 펩티드/HRP 및 형질감염 시약 중 하나는 세포가 배양 중인 부피의 0%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 또는 10%인 부피에 있는 세포에 첨가된다. 추가 구현예에서, 하나 또는 벡터와 양이온성 펩티드/HRP 및 형질감염 시약 중 적어도 하나의 혼합물의 부피는 상기 제공된 임의의 두 백분율 사이의 범위인 세포가 배양 중인 부피의 분율이다.
rAAV 생산 방법의 다양한 구현예에서, 임의의 구현예의 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터 및 임의의 구현예의 양이온성 펩티드/HRP 및 형질감염 시약 중 하나는 공동-형질감염 단계 전에 함께 혼합된다. 혼합물은 더 큰 세포 배양 부피에서 세포의 형질감염을 허용하는 장기간 동안 안정하다. 다양한 구현예에서, 하나 이상의 벡터와 임의의 구현예의 펩티드/HRP 및 형질감염 시약의 혼합물은 공동-형질감염 단계 전에 적어도 1분, 적어도 5분, 적어도 10분, 적어도 20분, 적어도 50분, 적어도 100분, 적어도 200분, 적어도 500분, 적어도 1000분, 또는 적어도 2000분 동안 배양된다. 다양한 구현예에서, 하나 이상의 벡터와 임의의 구현예의 펩티드/HRP 및 형질감염 시약의 혼합물은 공동-형질감염 단계 전에 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 11분, 12분, 13분, 14분, 15분, 16분, 17분, 18분, 19분, 20분, 21분, 22분, 23분, 24분, 25분, 26분, 27분, 28분, 29분, 30분, 31분, 32분, 33분, 34분, 35분, 36분, 37분, 38분, 39분, 40분, 41분, 42분, 43분, 44분, 45분, 46분, 47분, 48분, 49분, 50분, 51분, 52분, 53분, 54분, 55분, 56분, 57분, 58분, 59분, 60분, 61분, 62분, 63분, 64분, 65분, 66분, 67분, 68분, 69분, 70분, 71분, 72분, 73분, 74분, 75분, 76분, 77분, 78분, 79분, 80분, 81분, 82분, 83분, 84분, 85분, 86분, 87분, 88분, 89분, 90분, 91분, 92분, 93분, 94분, 95분, 96분, 97분, 98분, 99분, 100분, 101분, 102분, 103분, 104분, 105분, 106분, 107분, 108분, 109분, 110분, 111분, 112분, 113분, 114분, 115분, 116분, 117분, 118분, 119분, 120분, 120분, 130분, 140분, 150분, 160분, 170분, 180분, 190분, 200분, 210분, 220분, 230분, 240분, 250분, 260분, 270분, 280분, 290분, 300분, 310분, 320분, 330분, 340분, 350분, 360분, 370분, 380분, 390분, 400분, 410분, 420분, 430분, 440분, 450분, 460분, 470분, 480분, 490분, 500분, 510분, 520분, 530분, 540분, 550분, 560분, 570분, 580분, 590분, 600분, 700분, 800분, 900분, 1000분, 1500분, 또는 2000분 동안 배양된다. 다양한 구현예에서, 배양 시간은 상기 제공된 임의의 두 시간 사이의 범위이다.
rAAV 생산 방법의 다양한 구현예에서, 양이온성 펩티드/HRP를 사용하여 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터로 형질감염된 세포의 백분율은 폴리에틸렌 이민 또는 이의 유도체를 포함하는 형질감염 시약(들)을 사용하여 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터로 형질감염된 세포의 백분율보다 크고, 여기서 양이온성 펩티드/HRP 및 폴리에틸렌 이민 또는 이의 유도체를 포함하는 형질감염 시약(들)은 공동-형질감염 단계 이전에 동일한 시간 동안 하나 이상의 벡터와 혼합 및 배양된다. 다양한 구현예에서, 양이온성 펩티드/HRP를 사용하여 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터로 형질감염된 세포의 백분율은 폴리에틸렌 이민 또는 이의 유도체를 포함하는 형질감염 시약(들)을 사용하여 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터로 형질감염된 세포의 백분율보다 적어도 1%, 적어도 10%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 500%, 적어도 1000%, 적어도 5000%, 또는 적어도 10000% 더 크고, 여기서 양이온성 펩티드/HRP 및 폴리에틸렌 이민 또는 이의 유도체를 포함하는 형질감염 시약(들)은 공동-형질감염 단계 이전에 동일한 시간 동안 하나 이상의 벡터와 혼합 및 배양된다.
rAAV 생산 방법의 다양한 구현예에서, 양이온성 펩티드/HRP를 사용하여 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터로 형질감염된 세포는 폴리에틸렌 이민 또는 이의 유도체를 포함하는 형질감염 시약(들)을 사용하여 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터로 형질감염된 세포의 비 생산성보다 더 큰 비 생산성 (벡터 게놈 (vg)/세포)을 가지며, 여기서 형질감염 조건은 하나 이상의 벡터로 형질감염된 세포의 백분율을 최대화하기 위해 또는 대안적으로, 동일한 형질감염 조건하에서 최적화된다. 비 생산성은 디지털 액적 중합효소 연쇄 반응 (ddPCR)을 사용하여 평가할 수 있으며 최종 역가 (수확 유체의 벡터 게놈 (vg)/mL)를 최대 생존 세포 밀도 (세포 수/mL)로 나누어 계산할 수 있다. 다양한 구현예에서, 양이온성 펩티드/HRP를 사용하여 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터로 형질감염된 세포의 비 생산성은 폴리에틸렌 이민 또는 이의 유도체를 포함하는 형질감염 시약(들)을 사용하여 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터로 형질감염된 세포의 비 생산성보다 적어도 1%, 적어도 10%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 500%, 적어도 1000%, 적어도 5000%, 적어도 10000%, 적어도 3 로그, 적어도 4 로그, 또는 적어도 5 로그 더 크고, 여기서 형질감염 조건은 하나 이상의 벡터로 형질감염된 세포의 백분율을 최대화하기 위해 또는 대안적으로, 동일한 형질감염 조건하에서 최적화된다.
다양한 구현예에서, 양이온성 펩티드/HRP를 사용하여 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터로 형질감염된 세포의 비 생산성은 적어도 1 x 102 벡터 게놈 (vg/세포, 적어도 1 x 103 vg/세포, 적어도 1 x 104 vg/세포, 적어도 1 x 105 vg/세포, 적어도 1 x 106 vg/세포, 또는 적어도 1 x 107 vg/세포이다.
rAAV 생산 방법의 다양한 구현예에서, 양이온성 펩티드/HRP를 사용하여 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터 벡터로 형질감염된 세포는 폴리에틸렌 이민 또는 이의 유도체를 포함하는 형질감염 시약(들)을 사용하여 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터로 형질감염된 세포의 rAAV 역가보다 더 큰 rAAV 역가를 생성하고, 여기서 세포 배양 부피를 포함하는 형질감염 조건은 하나 이상의 벡터로 형질감염된 세포의 백분율을 최대화하기 위해 또는 대안적으로, 동일한 형질감염 조건하에서 최적화된다.
rAAV 생산 방법의 다양한 구현예에서, 양이온성 펩티드/HRP를 사용하여 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터로 형질감염된 세포에 의해 생성된 rAAV 역가는 폴리에틸렌 이민 또는 이의 유도체를 포함하는 형질감염 시약(들)을 사용하여 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터로 형질감염된 세포에 의해 생성된 rAAV 역가보다 적어도 1%, 적어도 10%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 500%, 적어도 1000%, 적어도 5000%, 적어도 10000%, 또는 적어도 3 로그 더 크고, 여기서 세포 배양 부피를 포함하는 형질감염 조건은 하나 이상의 벡터로 형질감염된 세포의 백분율을 최대화하기 위해 또는 대안적으로, 동일한 형질감염 조건 하에서 최적화된다.
rAAV 생산 방법의 다양한 구현예에서, 양이온성 펩티드/HRP를 사용하여 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터로 형질감염된 세포에 의해 생성된 rAAV 역가는 적어도 0.1 x 1010 vg/mL, 적어도 0.5 x 1010 vg/mL, 적어도 1 x 1010 vg/mL, 적어도 1 x 1011 vg/mL, 적어도 1 x 1012 vg/mL, 적어도 1 x 1013 vg/mL, 또는 적어도 1 x 1014 vg/mL이다.
rAAV 생산 방법의 다양한 구현예에서, 임의의 구현예의 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터 대 임의의 구현예의 양이온성 펩티드/HRP 및 형질감염 시약 중 하나의 중량비는 50:1, 49:1, 48:1, 47:1, 46:1, 45:1, 44:1, 43:1, 42:1, 41:1, 40:1, 39:1, 38:1, 37:1, 36:1, 35:1, 34:1, 33:1, 32:1, 31:1, 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 또는 1:50이다. 다양한 구현예에서, 임의의 구현예의 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터 대 임의의 구현예의 양이온성 펩티드/HRP 및 형질감염 시약 중 하나의 중량비는 상기 제공된 임의의 두 중량비 사이의 범위이다.
rAAV 생산 방법의 다양한 구현예에서, 세포 배양물 중 양이온성 펩티드/HRP의 농도는 적어도 0.001 마이크로그램 (μg)/mL, 적어도 0.01 μg/ mL, 적어도 0.1 μg/mL, 적어도 0.5 μg/mL, 적어도 1 μg/mL, 적어도 10 μg/mL, 적어도 50 μg/mL, 적어도 100 μg/mL, 1-200 μg/mL, 5-50 μg/mL, 10-150 μg/mL, 또는 100-200 μg/mL이다. 다양한 구현예에서, 세포 배양물 중 양이온성 펩티드 또는 HRP의 농도는 1 μg/mL, 1.5 μg/mL, 2 μg/mL, 2.5 μg/mL, 3 μg/mL, 3.5 μg/mL, 4 μg/mL, 4.5 μg/mL, 5 μg/mL, 5.5 μg/mL, 6, μg/mL, 6.5 μg/mL, 7 μg/mL, 7.5 μg/mL, 8 μg/mL, 8.5 μg/mL, 9 μg/mL, 9.5 μg/mL, 10 μg/mL, 10.5 μg/mL, 11 μg/mL, 11.5 μg/mL, 12 μg/mL, 12.5 μg/mL, 13 μg/mL, 13.5 μg/mL, 14 μg/mL, 14.5 μg/mL, 15 μg/mL, 15.5 μg/mL, 16 μg/mL, 16.5 μg/mL, 17 μg/mL, 17.5 μg/mL, 18 μg/mL, 18.5 μg/mL, 19 μg/mL, 19.5 μg/mL, 20 μg/mL, 20.5 μg/mL, 21 μg/mL, 21.5 μg/mL, 22 μg/mL, 22.5 μg/mL, 23 μg/mL, 23.5 μg/mL, 24 μg/mL, 24.5 μg/mL, 25 μg/mL, 26 μg/mL, 27 μg/mL, 28 μg/mL, 29 μg/mL, 30 μg/mL, 31 μg/mL, 32 μg/mL, 33 μg/mL, 34 μg/mL, 35 μg/mL, 36 μg/mL, 37 μg/mL, 38 μg/mL, 39 μg/mL, 40 μg/mL, 41 μg/mL, 42 μg/mL, 43 μg/mL, 44 μg/mL, 45 μg/mL, 46 μg/mL, 47 μg/mL, 48 μg/mL, 49 μg/mL, 50 μg/mL, 51 μg/mL, 52 μg/mL, 53 μg/mL, 54 μg/mL, 55 μg/mL, 56 μg/mL, 57 μg/mL, 58 μg/mL, 59 μg/mL, 60 μg/mL, 61 μg/mL, 62 μg/mL, 63 μg/mL, 64 μg/mL, 65 μg/mL, 66 μg/mL, 67 μg/mL, 68 μg/mL, 69 μg/mL, 70 μg/mL, 71 μg/mL, 72 μg/mL, 73 μg/mL, 74 μg/mL, 75 μg/mL, 76 μg/mL, 77 μg/mL, 78 μg/mL, 79 μg/mL, 80 μg/mL, 81 μg/mL, 82 μg/mL, 83 μg/mL, 84 μg/mL, 85 μg/mL, 86 μg/mL, 87 μg/mL, 88 μg/mL, 89 μg/mL, 90 μg/mL, 91 μg/mL, 92 μg/mL, 93 μg/mL, 94 μg/mL, 95 μg/mL, 96 μg/mL, 97 μg/mL, 98 μg/mL, 99 μg/mL, 100 μg/mL, 101 μg/mL, 102 μg/mL, 103 μg/mL, 104 μg/mL, 105 μg/mL, 106 μg/mL, 107 μg/mL, 108 μg/mL, 109 μg/mL, 110 μg/mL, 111 μg/mL, 112 μg/mL, 113 μg/mL, 114 μg/mL, 115 μg/mL, 116 μg/mL, 117 μg/mL, 118 μg/mL, 119 μg/mL, 120 μg/mL, 121 μg/mL, 122 μg/mL, 123 μg/mL, 124 μg/mL, 125 μg/mL, 126 μg/mL, 127 μg/mL, 128 μg/mL, 129 μg/mL, 130 μg/mL, 131 μg/mL, 132 μg/mL, 133 μg/mL, 134 μg/mL, 135 μg/mL, 136 μg/mL, 137 μg/mL, 138 μg/mL, 139 μg/mL, 140 μg/mL, 141 μg/mL, 142 μg/mL, 143 μg/mL, 144 μg/mL, 145 μg/mL, 146 μg/mL, 147 μg/mL, 148 μg/mL, 149 μg/mL, 150 μg/mL, 151 μg/mL, 152 μg/mL, 153 μg/mL, 154 μg/mL, 155 μg/mL, 156 μg/mL, 157 μg/mL, 158 μg/mL, 159 μg/mL, 160 μg/mL, 161 μg/mL, 162 μg/mL, 163 μg/mL, 164 μg/mL, 165 μg/mL, 166 μg/mL, 167 μg/mL, 168 μg/mL, 169 μg/mL, 170 μg/mL, 171 μg/mL, 172 μg/mL, 173 μg/mL, 174 μg/mL, 175 μg/mL, 176 μg/mL, 177 μg/mL, 178 μg/mL, 179 μg/mL, 180 μg/mL, 181 μg/mL, 182 μg/mL, 183 μg/mL, 184 μg/mL, 185 μg/mL, 186 μg/mL, 187 μg/mL, 188 μg/mL, 189 μg/mL, 190 μg/mL, 191 μg/mL, 192 μg/mL, 193 μg/mL, 194 μg/mL, 195 μg/mL, 196 μg/mL, 197 μg/mL, 198 μg/mL, 199 μg/mL, 또는 200 μg/mL이다. 다양한 구현예에서, 세포 배양물 중 양이온성 펩티드/HRP의 농도는 상기 제공된 임의의 두 농도 사이의 범위이다.
rAAV 생산 방법의 다양한 구현예에서, 세포 배양물 중 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터의 농도는 적어도 0.0001 μg/ml, 적어도 0.001 μg/ml, 적어도 0.01 μg/ml, 적어도 0.1 μg/ml, 적어도 0.5 μg/ml, 적어도 1, μg/ml, 0.1-15 μg/ml, 또는 0.5-200 μg/ml이다. 다양한 구현예에서, 세포 배양물 중 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터의 농도는 0.0001 μg/ml, 0.001 μg/ml, 0.01 μg/ml, 0.05 μg/ml, 0.1 μg/ml, 0.5 μg/ml, 1 μg/ml, 1.5 μg/ml, 2 μg/ml, 2.5 μg/ml, 3 μg/ml, 3.5 μg/ml, 4 μg/ml, 4.5 μg/ml, 5 μg/ml, 5.5 μg/ml, 6, μg/ml, 6.5 μg/ml, 7 μg/ml, 7.5 μg/ml, 8 μg/ml, 8.5 μg/ml, 9 μg/ml, 9.5 μg/ml, 10 μg/ml, 10.5 μg/ml, 11 μg/ml, 11.5 μg/ml, 12 μg/ml, 12.5 μg/ml, 13 μg/ml, 13.5 μg/ml, 14 μg/ml, 14.5 μg/ml, 15 μg/ml, 15.5 μg/ml, 16 μg/ml, 16.5 μg/ml, 17 μg/ml, 17.5 μg/ml, 18 μg/ml, 18.5 μg/ml, 19 μg/ml, 19.5 μg/ml, 20 μg/ml, 20.5 μg/ml, 21 μg/ml, 21.5 μg/ml, 22 μg/ml, 22.5 μg/ml, 23 μg/ml, 23.5 μg/ml, 24 μg/ml, 24.5 μg/ml, 25 μg/ml, 26 μg/mL, 27 μg/mL, 28 μg/mL, 29 μg/mL, 30 μg/mL, 31 μg/mL, 32 μg/mL, 33 μg/mL, 34 μg/mL, 35 μg/mL, 36 μg/mL, 37 μg/mL, 38 μg/mL, 39 μg/mL, 40 μg/mL, 41 μg/mL, 42 μg/mL, 43 μg/mL, 44 μg/mL, 45 μg/mL, 46 μg/mL, 47 μg/mL, 48 μg/mL, 49 μg/mL, 50 μg/mL, 51 μg/mL, 52 μg/mL, 53 μg/mL, 54 μg/mL, 55 μg/mL, 56 μg/mL, 57 μg/mL, 58 μg/mL, 59 μg/mL, 60 μg/mL, 61 μg/mL, 62 μg/mL, 63 μg/mL, 64 μg/mL, 65 μg/mL, 66 μg/mL, 67 μg/mL, 68 μg/mL, 69 μg/mL, 70 μg/mL, 71 μg/mL, 72 μg/mL, 73 μg/mL, 74 μg/mL, 75 μg/mL, 76 μg/mL, 77 μg/mL, 78 μg/mL, 79 μg/mL, 80 μg/mL, 81 μg/mL, 82 μg/mL, 83 μg/mL, 84 μg/mL, 85 μg/mL, 86 μg/mL, 87 μg/mL, 88 μg/mL, 89 μg/mL, 90 μg/mL, 91 μg/mL, 92 μg/mL, 93 μg/mL, 94 μg/mL, 95 μg/mL, 96 μg/mL, 97 μg/mL, 98 μg/mL, 99 μg/mL, 100 μg/mL, 101 μg/mL, 102 μg/mL, 103 μg/mL, 104 μg/mL, 105 μg/mL, 106 μg/mL, 107 μg/mL, 108 μg/mL, 109 μg/mL, 110 μg/mL, 111 μg/mL, 112 μg/mL, 113 μg/mL, 114 μg/mL, 115 μg/mL, 116 μg/mL, 117 μg/mL, 118 μg/mL, 119 μg/mL, 120 μg/mL, 121 μg/mL, 122 μg/mL, 123 μg/mL, 124 μg/mL, 125 μg/mL, 126 μg/mL, 127 μg/mL, 128 μg/mL, 129 μg/mL, 130 μg/mL, 131 μg/mL, 132 μg/mL, 133 μg/mL, 134 μg/mL, 135 μg/mL, 136 μg/mL, 137 μg/mL, 138 μg/mL, 139 μg/mL, 140 μg/mL, 141 μg/mL, 142 μg/mL, 143 μg/mL, 144 μg/mL, 145 μg/mL, 146 μg/mL, 147 μg/mL, 148 μg/mL, 149 μg/mL, 150 μg/mL, 151 μg/mL, 152 μg/mL, 153 μg/mL, 154 μg/mL, 155 μg/mL, 156 μg/mL, 157 μg/mL, 158 μg/mL, 159 μg/mL, 160 μg/mL, 161 μg/mL, 162 μg/mL, 163 μg/mL, 164 μg/mL, 165 μg/mL, 166 μg/mL, 167 μg/mL, 168 μg/mL, 169 μg/mL, 170 μg/mL, 171 μg/mL, 172 μg/mL, 173 μg/mL, 174 μg/mL, 175 μg/mL, 176 μg/mL, 177 μg/mL, 178 μg/mL, 179 μg/mL, 180 μg/mL, 181 μg/mL, 182 μg/mL, 183 μg/mL, 184 μg/mL, 185 μg/mL, 186 μg/mL, 187 μg/mL, 188 μg/mL, 189 μg/mL, 190 μg/mL, 191 μg/mL, 192 μg/mL, 193 μg/mL, 194 μg/mL, 195 μg/mL, 196 μg/mL, 197 μg/mL, 198 μg/mL, 199 μg/mL, 또는 200 μg/mL이다. 다양한 구현예에서, 세포 배양물 중 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터의 농도는 상기 제공된 임의의 두 농도 사이의 범위이다.
rAAV 생산 방법의 다양한 구현예에서, 임의의 구현예의 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터는 AAV 게놈 벡터, AAV 헬퍼 벡터, 및 비-AAV 헬퍼 기능 제공 뉴클레오티드를 갖는 벡터를 포함한다. 예시 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터는 세포로 형질감염될 때 Rep 및 Cap 단백질을 발현하고, AAV 게놈 벡터의 생성을 제공하고, rAAV를 생성하기 위해 바이러스 헬퍼 기능 (예를 들어, 전사 인자 등)을 제공하는 플라스미드 또는 코스미드 형태의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
rAAV 생산 방법 및 세포 생성 방법의 다양한 구현예에서, 세포는 포유동물 세포와 같은 진핵 세포이다. 포유동물 세포의 예는 인간 세포를 포함한다. 포유동물 세포의 다른 예는 HEK293, HeLa, CHO, NS0, SP2/0, PER.C6, Vero, RD, BHK, HT 1080, A549, Cos-7, ARPE-19, 또는 MRC-5 세포를 포함한다.
rBV 생산 방법의 다양한 구현예에서, 임의의 구현예의 재조합 박미드 및 임의의 구현예의 양이온성 펩티드/HRP는 형질감염 단계 전에 함께 혼합된다.
rBV 생산 방법의 다양한 구현예에서, 회수 단계는 바큘로바이러스 감염된 곤충 세포 (BIIC)를 회수하는 것을 포함한다. rBV 생산 방법의 다양한 구현예에서, 회수 단계는 BIIC를 회수하는 것을 포함하고 회수된 BIIC는 배양물에서 이전에 바큘로바이러스로 감염되지 않은 세포와 함께 배양되어 rAAV를 생성한다.
rBV 생산 방법 및 세포 생성 방법의 다양한 구현예에서, 세포는 스포도프테라 프루기페르다, 아에데스 알보픽투스, 밤빅스모리, 트리초플러시아 니, 아스칼라파 오도라타, 드로소필리아, 아노펠레,　큐렉스, 또는 아에데스로부터 유래된 곤충 세포이다. 곤충 세포의 예는 Sf9, 하이 파이브, Se301, SeIZD2109, SeUCR1, Sf900+, Sf21, BTI-TN-5B1-4, MG-1, Tn368, HzAm1, BM-N, Ha2302, Hz2E5 또는 Ao38 세포를 포함한다.
rAAV 또는 rBV 생산 방법의 다양한 구현예에서, 세포 배양물은 적어도 1 mL, 적어도 10 mL, 적어도 20 mL, 적어도 50 mL, 적어도 100 mL, 적어도 500 mL, 적어도 1 리터 (L), 적어도 10 L, 적어도 50 L, 적어도 100L, 적어도 250 L, 적어도 500 L, 적어도 1000 L, 적어도 1500 L, 적어도 2000 L, 또는 적어도 2500 L의 부피를 갖는 진탕 플라스크 또는 생물반응기에서 생성된다. 다양한 구현예에서, 세포 배양물 부피는 1 mL, 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL, 100 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL, 500 mL, 600 mL, 700 mL, 800 mL, 900 mL, 1 L, 2 L, 3 L, 4 L, 5 L, 6L, 7L, 8 L, 9 L, 10 L, 11 L, 12 L, 13 L, 14 L, 15 L, 16 L, 17 L, 18 L, 19 L, 20 L, 21 L, 22 L, 23 L, 24 L, 25 L, 26 L, 27 L, 28 L, 29 L, 30 L, 31 L, 32 L, 33 L, 34 L, 35 L, 36 L, 37 L, 38 L, 39 L, 40 L, 41 L, 42 L, 43 L, 44 L, 45 L, 46 L, 47 L, 48 L, 49 L, 50 L, 51 L, 52 L, 53 L, 54 L, 55 L, 56 L, 57 L, 58 L, 59 L, 60 L, 61 L, 62 L, 63 L, 64 L, 65 L, 66 L, 67 L, 68 L, 69 L, 70 L, 71 L, 72 L, 73 L, 74 L, 75 L, 76 L, 77 L, 78 L, 79 L, 80 L, 81 L, 82 L, 83 L, 84 L, 85 L, 86 L, 87 L, 88 L, 89 L, 90 L, 91 L, 92 L, 93 L, 94 L, 95 L, 96 L, 97 L, 98 L, 99 L, 100 L, 110 L, 120 L, 130 L, 140 L, 150 L, 160 L, 170 L, 180 L, 190 L, 200 L, 210 L, 220 L, 230 L, 240 L, 250 L, 260 L, 270 L, 280 L, 290 L, 300 L, 310 L, 320 L, 330 L, 340 L, 350 L, 360 L, 370 L, 380 L, 390 L, 400 L, 410 L, 420 L, 430 L, 440 L, 450 L, 460 L, 470 L, 480 L, 490 L, 500 L, 510 L, 520 L, 530 L, 540 L, 550 L, 560 L, 570 L, 580 L, 590 L, 600 L, 610 L, 620 L, 630 L, 640 L, 650 L, 660 L, 670 L, 680 L, 690 L, 700 L, 710 L, 720 L, 730 L, 740 L, 750 L, 760 L, 770 L, 780 L, 790 L, 800 L, 810 L, 820 L, 830 L, 840 L, 850 L, 860 L, 870 L, 880 L, 890 L, 900 L, 910 L, 920 L, 930 L, 940 L, 950 L, 960 L, 970 L, 980 L, 990 L, 1000 L, 1010 L, 1020 L, 1030 L, 1040 L, 1050 L, 1060 L, 1070 L, 1080 L, 1090 L, 1100 L, 1110 L, 1120 L, 1130 L, 1140 L, 1150 L, 1160 L, 1170 L, 1180 L, 1190 L, 1200 L, 1210 L, 1220 L, 1230 L, 1240 L, 1250 L, 1260 L, 1270 L, 1280 L, 1290 L, 1300 L, 1310 L, 1320 L, 1330 L, 1340 L, 1350 L, 1360 L, 1370 L, 1380 L, 1390 L, 1400 L, 1410 L, 1420 L, 1430 L, 1440 L, 1450 L, 1460 L, 1470 L, 1480 L, 1490 L, 1500 L, 1510 L, 1520 L, 1530 L, 1540 L, 1550 L, 1560 L, 1570 L, 1580 L, 1590 L, 1600 L, 1610 L, 1620 L, 1630 L, 1640 L, 1650 L, 1660 L, 1670 L, 1680 L, 1690 L, 1700 L, 1710 L, 1720 L, 1730 L, 1740 L, 1750 L, 1760 L, 1770 L, 1780 L, 1790 L, 1800 L, 1810 L, 1820 L, 1830 L, 1840 L, 1850 L, 1860 L, 1870 L, 1880 L, 1890 L, 1900 L, 1910 L, 1920 L, 1930 L, 1940 L, 1950 L, 1960 L, 1970 L, 1980 L, 1990 L, 2000 L, 2010 L, 2020 L, 2030 L, 2040 L, 2050 L, 2060 L, 2070 L, 2080 L, 2090 L, 2100 L, 2110 L, 2120 L, 2130 L, 2140 L, 2150 L, 2160 L, 2170 L, 2180 L, 2190 L, 2200 L, 2210 L, 2220 L, 2230 L, 2240 L, 2250 L, 2260 L, 2270 L, 2280 L, 2290 L, 2300 L, 2310 L, 2320 L, 2330 L, 2340 L, 2350 L, 2360 L, 2370 L, 2380 L, 2390 L, 2400 L, 2410 L, 2420 L, 2430 L, 2440 L, 2450 L, 2460 L, 2470 L, 2480 L, 2490 L, 2500 L, 2510 L, 2520 L, 2530 L, 2540 L, 2550 L, 2560 L, 2570 L, 2580 L, 2590 L, 2600 L, 2610 L, 2620 L, 2630 L, 2640 L, 2650 L, 2660 L, 2670 L, 2680 L, 2690 L, 2700 L, 2710 L, 2720 L, 2730 L, 2740 L, 2750 L, 2760 L, 2770 L, 2780 L, 2790 L, 2800 L, 2810 L, 2820 L, 2830 L, 2840 L, 2850 L, 2860 L, 2870 L, 2880 L, 2890 L, 2900 L, 2910 L, 2920 L, 2930 L, 2940 L, 2950 L, 2960 L, 2970 L, 2980 L, 2990 L, 또는 3000 L이다. 추가 구현예에서, 배양물 부피는 상기 제공된 임의의 두 부피 사이 범위이다.
다양한 구현예에서, 완전 또는 부분 바큘로바이러스 게놈은 이종 서열과의 재조합 시, rBV를 생성할 수 있는 원형 또는 선형 바큘로바이러스 게놈이다. 한 구현예에서, 방법은 상동성 영역 또는 영역들을 보유하는 이종 서열과의 재조합 빈도가 낮기 때문에 원형 바큘로바이러스 게놈을 이용한다. 또 다른 구현예에서, 방법은 비-재조합 바큘로바이러스의 생성을 감소시키고 상기 이종 서열과의 재조합 빈도를 증가시켜 재조합 바큘로바이러스의 생성 가능성을 향상시키는 선형화된 바큘로바이러스 게놈을 이용한다. 추가 구현에서, 상기 방법은 하나 이상의 필수 바큘로바이러스 유전자 또는 그 부분이 결여된 선형화된 바큘로바이러스 게놈을 이용함으로써, 비-재조합 바큘로바이러스의 생성을 방지한다. 필수 유전자의 보완은 바큘로바이러스 게놈의 상기 이종 서열과의 재조합 및 원형화 시 발생하여 높은 빈도로 재조합 바큘로바이러스의 생성을 보장한다.
다양한 구현예에서, 이종 뉴클레오티드 서열 또는 rAAV 게놈 벡터를 제공하거나 Rep 또는 Cap 단백질을 암호화하고 바큘로바이러스 게놈에 상동인 영역 또는 영역들을 보유하는 뉴클레오티드 서열은 선형 또는 원형 형태로 존재하거나 전달 벡터 내에 통합된다.
다양한 구현예에서, 완전 또는 부분 바큘로바이러스 게놈 및 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 또는 rAAV 게놈 벡터를 제공하거나 Rep 또는 Cap 단백질을 암호화하고 바큘로바이러스 게놈에 상동인 영역 또는 영역들을 보유하는 뉴클레오티드 서열의 세포로의 공동-형질 감염은 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 또는 AAV 게놈 벡터를 제공하거나 Rep 또는 Cap 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 완전 또는 부분 바큘로바이러스 게놈으로의 상동 재조합을 초래한다.
다양한 구현예에서, 완전 또는 부분 바큘로바이러스 게놈 및 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 또는 rAAV 게놈 벡터를 제공하거나 Rep 또는 Cap 단백질을 암호화하고, 바큘로바이러스 게놈에 상동인 영역 또는 영역들을 보유하는 뉴클레오티드 서열의 세포로의 공동-감염은 원형화된 재조합 바큘로바이러스 게놈이 형성되도록 완전 또는 부분, 선형 바큘로바이러스 게놈 및 적어도 하나의 상기 이종 뉴클레오티드 또는 AAV 게놈 벡터를 제공하거나 Rep 또는 Cap 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 말단의 이종 재조합을 초래한다.
세포 생성 방법의 다양한 구현예에서, 벡터는 발현 제어 요소가 rAAV를 생성하기 위한 요소의 발현을 제어하도록 뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 요소를 포함한다.
세포 생성 방법의 다양한 구현예에서, 벡터는 선택 요소를 암호화는 뉴클레오티드를 포함한다. 방법은 단리 단계 이전에 선택 요소 (예를 들어, 항생제 내성 단백질)에 특이적인 선택 압력 (예를 들어, 항생제)을 적용하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 방법은 단리 단계 이전에 선택 요소 (예를 들어, 형광 단백질)를 확인 (예를 들어, 유세포 분석을 통해 세포에 형광 파장을 방출)하는 단계를 포함한다.
세포 생성 방법의 다양한 구현예에서, rAAV를 생산하기 위한 요소는 AAV 헬퍼 기능을 제공하는 요소 또는 AAV 비-헬퍼 기능을 제공하는 요소이다.
다양한 구현예에서, 임의의 구현예의 양이온성 펩티드/HRP의 적어도 일부는 형태의 측면에 위치한 소수성 아미노산 잔기 및 형질감염 동안 형태의 반대 측면에 위치한 극성 아미노산 잔기를 포함하는 α-나선 형태를 갖는다. 예를 들어, 선형 양이온성 펩티드/HRP는 세포막이 존재할 때 α-나선 형태로 형성될 수 있다.
다양한 구현예에서, 극성 아미노산 잔기는 히스티딘 잔기(들) (His 또는 H)를 포함한다. 극성 아미노산 잔기의 다른 글루타민 (Gln 또는 Q), 아스파라긴 (Asn 또는 N), 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T), 티로신 (Tyr 또는 Y), 및 시스테인 (Cys 또는 C)을 포함한다.
다양한 구현예에서, 소수성 아미노산 잔기는 알라닌 잔기(들) (Ala 또는 A) 또는 류신 잔기(들) (Leu 또는 L)를 포함한다. 소수성 아미노산 잔기의 다른 예는 메티오닌 (Met 또는 M), 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 발린 (Val 또는 V), 프롤린 (Pro 또는 P), 또는 글리신 (Gly 또는 G)을 포함한다.
다양한 구현예에서, 임의의 구현예의 양이온성 펩티드/HRP는 리신 또는 아르기닌 잔기와 같은 중성 pH (예를 들어, pH 7.4)에서 양전하를 띤 아미노산 잔기를 갖는 N-말단 또는 C-말단 단부를 갖는다. 예를 들어, 양전하를 띤 아미노산은 양이온성 펩티드/HRP의 N-말단 또는 C-말단에 위치할 수 있다.
다양한 구현예에서, 임의의 구현예의 양이온성 펩티드/HRP는 티로신 (Tyr 또는 Y) 또는 트립토판 (Trp 또는 W)을 포함한다.
다양한 구현예에서, 임의의 구현예의 양이온성 펩티드/HRP는 적어도 5개 아미노산 잔기, 적어도 10개 아미노산 잔기, 적어도 15개 아미노산 잔기, 적어도 19개 아미노산 잔기, 적어도 20개 아미노산 잔기, 적어도 21개 아미노산 잔기, 적어도 25개 아미노산 잔기, 적어도 30개 아미노산 잔기, 적어도 35개 아미노산 잔기, 적어도 40개 아미노산 잔기, 적어도 45개 아미노산 잔기, 또는 적어도 50개 아미노산 잔기를 포함한다. 다양한 구현예에서, 양이온성 펩티드/HRP의 길이는 10개 아미노산 잔기, 11개 아미노산 잔기, 12개 아미노산 잔기, 13개 아미노산 잔기, 14개 아미노산 잔기, 15개 아미노산 잔기, 16개 아미노산 잔기, 17개 아미노산 잔기, 18개 아미노산 잔기, 19개 아미노산 잔기, 20개 아미노산 잔기, 21개 아미노산 잔기, 22개 아미노산 잔기, 23개 아미노산 잔기, 24개 아미노산 잔기, 25개 아미노산 잔기, 26개 아미노산 잔기, 27개 아미노산 잔기, 28개 아미노산 잔기, 29개 아미노산 잔기, 30개 아미노산 잔기, 31개 아미노산 잔기, 32개 아미노산 잔기, 33개 아미노산 잔기, 34개 아미노산 잔기, 35개 아미노산 잔기, 36개 아미노산 잔기, 37개 아미노산 잔기, 38개 아미노산 잔기, 39개 아미노산 잔기, 40개 아미노산 잔기, 41개 아미노산 잔기, 42개 아미노산 잔기, 43개 아미노산 잔기, 44개 아미노산 잔기, 45개 아미노산 잔기, 46개 아미노산 잔기, 47개 아미노산 잔기, 48개 아미노산 잔기, 49개 아미노산 잔기, 50개 아미노산 잔기, 51개 아미노산 잔기, 52개 아미노산 잔기, 53개 아미노산 잔기, 54개 아미노산 잔기, 55개 아미노산 잔기, 56개 아미노산 잔기, 57개 아미노산 잔기, 58개 아미노산 잔기, 59개 아미노산 잔기, 60개 아미노산 잔기, 61개 아미노산 잔기, 62개 아미노산 잔기, 63개 아미노산 잔기, 64개 아미노산 잔기, 65개 아미노산 잔기, 66개 아미노산 잔기, 67개 아미노산 잔기, 68개 아미노산 잔기, 69개 아미노산 잔기, 70개 아미노산 잔기, 71개 아미노산 잔기, 72개 아미노산 잔기, 73개 아미노산 잔기, 74개 아미노산 잔기, 75개 아미노산 잔기, 76개 아미노산 잔기, 77개 아미노산 잔기, 78개 아미노산 잔기, 79개 아미노산 잔기, 80개 아미노산 잔기, 81개 아미노산 잔기, 82개 아미노산 잔기, 83개 아미노산 잔기, 84개 아미노산 잔기, 85개 아미노산 잔기, 86개 아미노산 잔기, 87개 아미노산 잔기, 88개 아미노산 잔기, 89개 아미노산 잔기, 90개 아미노산 잔기, 91개 아미노산 잔기, 92개 아미노산 잔기, 93개 아미노산 잔기, 94개 아미노산 잔기, 95개 아미노산 잔기, 96개 아미노산 잔기, 97개 아미노산 잔기, 98개 아미노산 잔기, 99개 아미노산 잔기, 또는 100개 아미노산 잔기이다. 다양한 구현예에서, 양이온성 펩티드/HRP의 길이는 상기 제공된 임의의 두 길이 사이의 범위이다.
다양한 구현예에서, 임의의 구현예의 양이온성 펩티드/HRP/형질감염 시약은 우수의약품 제조관리 기준에 따라 제조된다.
다양한 구현예에서, 임의의 구현예의 양이온성 펩티드/HRP 및 형질감염 시약은 생분해성이다. 용어 "생분해성"은 화학적 (pH, 가수분해, 효소 작용) 및/또는 일단 세포 배양에 첨가되고 세포 배양의 생리학적 환경에 노출되면 물리적 과정에 의해 분해되거나 침식될 수 있는 물질을 지칭한다. 이 과정의 동역학은 몇 분에서 며칠이 걸릴 수 있다.
아데노 관련 바이러스
다양한 구현예에서, 임의의 구현예의 방법에 의해 생산된 rAAV 캡시드가 개시된다. rAAV 캡시드는 동일한 조건에서 생산된 rAAV 캡시드의 VP1, VP2, 또는 VP3 단백질의 농도보다 더 높은 VP1, VP2, 또는 VP3 단백질 농도를 갖는다.
다양한 구현예에서, 임의의 구현예의 방법에 의해 생산된 rAAV 캡시드가 개시된다.
rAAV 및 rAAV 캡시드는 예를 들어 US 9,504,762, WO 2018/022608, WO 2019/222136, 및 US 2019/0376081에 교시된 바와 같이 공지된 방법에 개시된 또는 공지된 방법에 따라 제조될 수 있는 rAAV 입자를 포함하며, 이의 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
"AAV"는 아데노 관련 바이러스의 표준 약어이다. 아데노 관련 바이러스는 캡시드에 의해 캡슐화된 게놈을 갖는 단일 가닥 DNA 파보바이러스이다. 현재 특성화된 AAV의 13가지 혈청형이 있다. AAV의 일반 정보 및 검토는 예를 들어, Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pp. 169-228; 및 Berns, 1990, Virology, pp. 1743-1764, Raven Press, (New York)에서 찾을 수 있다. 그러나, 다양한 혈청형이 유전적 수준에서도 구조적으로나 기능적으로 매우 밀접하게 관련되어 있다는 것이 잘 알려졌기 때문에 이러한 동일한 원칙이 추가 AAV 혈청형에 적용될 것으로 완전히 예상된다. (예를 들어, Blacklowe, 1988, Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed.의 pp. 165-174; 및 Rose, Comprehensive Virology 3:1-61 (1974) 참조). 예를 들어, 모든 AAV 혈청형은 분명히 상동성 rep 유전자에 의해 매개되는 매우 유사한 복제 특성을 나타내고; 모두 3개의 관련된 캡시드 단백질을 가지고 있다. 관련성의 정도는 게놈의 길이를 따라 혈청형 사이의 광범위한 교차 혼성화를 나타내는 이종이중체 분석; 및 역위 말단 반복 (ITR)에 해당하는 말단에 유사한 자체 어닐링 세그먼트의 존재에 의해 추가로 제안된다. 유사한 감염성 패턴은 또한 각 혈청형의 복제 기능이 유사한 규제 제어하에 있음을 시사한다.
본원에서 사용된 "AAV 바이러스 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡시드화된 AAV 게놈으로 구성된 감염성 바이러스 입자를 지칭한다. "재조합 AAV" 또는 "rAAV", "rAAV 비리온" 또는 "rAAV 바이러스 입자" 또는 "rAAV 벡터 입자" 또는 "AAV 바이러스"는 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 캡시드 또는 Cap 단백질 및 캡시드화된 rAAV 벡터 게놈 (vg)으로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다. 입자가 이종 폴리뉴클레오티드 (즉, 포유동물 세포에 전달될 이식유전자와 같은 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 경우, 이는 전형적으로 "rAAV 벡터 입자" 또는 단순히 "rAAV 벡터"로 지칭된다. 따라서, AAV 벡터 입자의 생산에는 반드시 rAAV 벡터의 생산이 포함되는데, 이러한 벡터는 rAAV 벡터 입자 내에 함유되어 있기 때문이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이종 유전자", "이종 서열", "이종", "이종 조절 서열", "이종 이식유전자", 또는 "이식유전자"는 참조 유전자 또는 조절 서열이 AAV 벡터 또는 입자에 자연적으로 존재하지 않고 그 안에 인공적으로 도입되었음을 의미한다. 예를 들어, 이들 용어는 숙주 세포에서 이 유전자의 발현을 제어하는 이종 유전자에 작동 가능하게 연결된 이종 유전자 및 이종 조절 서열을 모두 포함하는 핵산을 지칭한다. 본원의 이식유전자는 생체분자 (예를 들어, 치료용 생체분자), 예를 들어 단백질 (예를 들어, 효소), 폴리펩티드, 펩티드, RNA (예를 들어, tRNA, dsRNA, 리보솜 RNA, 촉매 RNA, siRNA, miRNA, 프리-miRNA, lncRNA, snoRNA, 작은 헤어핀 RNA, 트랜스-스플라이싱 RNA, 및 안티센스 RNA), 유전자 또는 염기 편집 시스템의 하나 이상의 구성요소, 예를 들어, CRISPR 유전자 편집 시스템, 안티센스 올리고뉴클레오티드 (AON), 안티센스 올리고뉴클레오티드 (AON)-매개 엑손 건너뛰기, 넌센스 매개 붕괴 (NMD)를 유발하는 포이즌 엑손(들), 또는 우성 음성 돌연변이를 암호화할 수 있는 것으로 고려된다.
용어 "재조합"은 재조합 DNA 기술을 사용하여 형성된 핵산 분자 또는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 재조합 핵산 분자는 핵산 서열과 서열 요소를 조합하여 형성할 수 있다. 재조합 단백질은 재조합 핵산 분자를 수용한 세포에 의해 생성되는 단백질일 수 있다.
용어 "암호화하다, "암호화된" 및 "암호화하는"은 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로 역할을 하기 위한 유전자, 상보적 DNA (cDNA), 또는 메신저 RNA (mRNA)와 같은 핵산 분자 내 뉴클레오티드의 특정 서열에 내재된 속성을 지칭한다. 따라서, 해당 유전자에 의해 생성된 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하는 경우 유전자는 단백질을 암호화한다. 유전자 또는 cDNA의 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 일반적으로 서열 목록에 제공되는 코딩 가닥 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로 사용되는 비코딩 가닥 모두 단백질 또는 해당 유전자 또는 cDNA의 다른 산물을 암호화하는 것으로 언급될 수 있다.
"캡시드"는 rAAV 벡터 게놈이 패키징된 구조를 지칭한다. 캡시드는 VP1 단백질 또는 VP3 단백질을 포함하지만, 보다 전형적으로는, 천연 AAV에서 발견되는 VP1, VP2, 및 VP3 단백질 세 가지 모두를 포함한다. 캡시드 단백질의 서열은 rAAV 비리온의 혈청형을 결정한다. rAAV 비리온은 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV-rh.10 (AAVrh10), AAV-DJ (AAVDJ), AAV-DJ8 (AAVDJ8), AAV-1, AAV-2, AAV-2G9, AAV-3, AAV3a, AAV3b, AAV3-3, AAV4, AAV4-4, AAV-5, AAV-6, AAV6.1, AAV6.2, AAV6.1.2, AAV-7, AAV7.2, AAV8, AAV9, AAV9.11, AAV9.13, AAV9.16, AAV9.24, AAV9.45, AAV9.47, AAV9.61, AAV9.68, AAV9.84, AAV9.9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV16.3, AAV24.1, AAV27.3, AAV42.12, AAV42-1b, AAV42-2, AAV42-3a, AAV42-3b, AAV42-4, AAV42-5a, AAV42-5b, AAV42-6b, AAV42-8, AAV42-10, AAV42-11, AAV42-12, AAV42-13, AAV42-15, AAV42-aa, AAV43-1, AAV43-12, AAV43-20, AAV43-21, AAV43-23, AAV43-25, AAV43-5, AAV44.1, AAV44.2, AAV44.5, AAV223.1, AAV223.2, AAV223.4, AAV223.5, AAV223.6, AAV223.7, AAV1-7/rh.48, AAV1-8/rh.49, AAV2-15/rh.62, AAV2-3/rh.61, AAV2-4/rh.50, AAV2-5/rh.51, AAV3.1/hu.6, AAV3.1/hu.9, AAV3-9/rh.52, AAV3-11/rh.53, AAV4-8/r11.64, AAV4-9/rh.54, AAV4-19/rh.55, AAV5-3/rh.57, AAV5-22/rh.58, AAV7.3/hu.7, AAV16.8/hu.10, AAV16.12/hu.11, AAV29.3/bb.1, AAV29.5/bb.2, AAV106.1/hu.37, AAV114.3/hu.40, AAV127.2/hu.41, AAV127.5/hu.42, AAV128.3/hu.44, AAV130.4/hu.48, AAV145.1/hu.53, AAV145.5/hu.54, AAV145.6/hu.55, AAV161.10/hu.60, AAV161.6/hu.61, AAV33.12/hu.17, AAV33.4/hu.15, AAV33.8/hu.16, AAV52/hu.19, AAV52.1/hu.20, AAV58.2/hu.25, AAVA3.3, AAVA3.4, AAVA3.5, AAVA3.7, AAVC1, AAVC2, AAVC5, AAVF3, AAVF5, AAVH2, AAVrh.72, AAVhu.8, AAVrh.68, AAVrh.70, AAVpi.1, AAVpi.3, AAVpi.2, AAVrh.60, AAVrh.44, AAVrh.65, AAVrh.55, AAVrh.47, AAVrh.69, AAVrh.45, AAVrh.59, AAVhu.12, AAVH6, AAVLK03, AAVH-1/hu.1, AAVH-5/hu.3, AAVLG-10/rh.40, AAVLG-4/rh.38, AAVLG-9/hu.39, AAVN721-8/rh.43, AAVCh.5, AAVCh.5R1, AAVcy.2, AAVcy.3, AAVcy.4, AAVcy.5, AAVCy.5R1, AAVCy.5R2, AAVCy.5R3, AAVCy.5R4, AAVcy.6, AAVhu.1, AAVhu.2, AAVhu.3, AAVhu.4, AAVhu.5, AAVhu.6, AAVhu.7, AAVhu.9, AAVhu.10, AAVhu.11, AAVhu.13, AAVhu.15, AAVhu.16, AAVhu.17, AAVhu.18, AAVhu.20, AAVhu.21, AAVhu.22, AAVhu.23.2, AAVhu.24, AAVhu.25, AAVhu.27, AAVhu.28, AAVhu.29, AAVhu.29R, AAVhu.31, AAVhu.32, AAVhu.34, AAVhu.35, AAVhu.37, AAVhu.39, AAVhu.40, AAVhu.41, AAVhu.42, AAVhu.43, AAVhu.44, AAVhu.44R1, AAVhu.44R2, AAVhu.44R3, AAVhu.45, AAVhu.46, AAVhu.47, AAVhu.48, AAVhu.48R1, AAVhu.48R2, AAVhu.48R3, AAVhu.49, AAVhu.51, AAVhu.52, AAVhu.54, AAVhu.55, AAVhu.56, AAVhu.57, AAVhu.58, AAVhu.60, AAVhu.61, AAVhu.63, AAVhu.64, AAVhu.66, AAVhu.67, AAVhu.14/9, AAVhu.t 19, AAVrh.2, AAVrh.2R, AAVrh.8, AAVrh.8R, AAVrh.12, AAVrh.13, AAVrh.13R, AAVrh.14, AAVrh.17, AAVrh.18, AAVrh.19, AAVrh.20, AAVrh.21, AAVrh.22, AAVrh.23, AAVrh.24, AAVrh.25, AAVrh.31, AAVrh.32, AAVrh.33, AAVrh.34, AAVrh.35, AAVrh.36, AAVrh.37, AAVrh.37R2, AAVrh.38, AAVrh.39, AAVrh.40, AAVrh.46, AAVrh.48, AAVrh.48.1, AAVrh.48.1.2, AAVrh.48.2, AAVrh.49, AAVrh.51, AAVrh.52, AAVrh.53, AAVrh.54, AAVrh.56, AAVrh.57, AAVrh.58, AAVrh.61, AAVrh.64, AAVrh.64R1, AAVrh.64R2, AAVrh.67, AAVrh.73, AAVrh.74, AAVrh8R, AAVrh8R A586R 돌연변이, AAVrh8R R533A 돌연변이, AAAV, BAAV, 염소 AAV, 소 AAV, AAVhE1.1, AAVhEr1.5, AAVhER1.14, AAVhEr1.8, AAVhEr1.16, AAVhEr1.18, AAVhEr1.35, AAVhEr1.7, AAVhEr1.36, AAVhEr2.29, AAVhEr2.4, AAVhEr2.16, AAVhEr2.30, AAVhEr2.31, AAVhEr2.36, AAVhER1.23, AAVhEr3.1, AAV2.5T, AAV-PAEC, AAV-LK01, AAV-LK02, AAV-LK03, AAV-LK04, AAV-LK05, AAV-LK06, AAV-LK07, AAV-LK08, AAV-LK09, AAV-LK10, AAV-LK11, AAV-LK12, AAV-LK13, AAV-LK14, AAV-LK15, AAV-LK16, AAV-LK17, AAV-LK18, AAV- LK19, AAV-PAEC2, AAV-PAEC4, AAV-PAEC6, AAV-PAEC7, AAV-PAEC8, AAV-PAEC11, AAV-PAEC12, AAV-2-프리-miRNA-101 , AAV-8h, AAV-8b, AAV-h, AAV-b, AAV SM 10-2 , AAV 셔플 100-1 , AAV 셔플 100-3, AAV 셔플 100-7, AAV 셔플 10-2, AAV 셔플 10-6, AAV 셔플 10-8, AAV 셔플 100-2, AAV SM 10-1, AAV SM 10-8 , AAV SM 100-3, AAV SM 100-10, BNP61 AAV, BNP62 AAV, BNP63 AAV, AAVrh.50, AAVrh.43, AAVrh.62, AAVrh.48, AAVhu.19, AAVhu.11, AAVhu.53, AAV4-8/rh.64, AAVLG-9/hu.39, AAV54.5/hu.23, AAV54.2/hu.22, AAV54.7/hu.24, AAV54.1/hu.21, AAV54.4R/hu.27, AAV46.2/hu.28, AAV46.6/hu.29, AAV128.1/hu.43, 진정형 AAV (ttAAV), UPENN AAV10, 또는 일본 AAV10 혈청형, AAV_po.6, AAV_po., AAV_po.5, AAV_LK03, AAV_ra.1, AAV_bat_YNM, AAV_bat_Brazil, AAV_mo.1, AAV_avian_DA-1, 또는 AAV_mouse_NY1, Bba21, Bba26, Bba27, Bba29, Bba30, Bba31, Bba32, Bba33, Bba34, Bba35, Bba36, Bba37, Bba38, Bba41, Bba42, Bba43, Bba44, Bce14, Bce15, Bce16, Bce17, Bce18, Bce20, Bce35, Bce36, Bce39, Bce40, Bce41, Bce42, Bce43, Bce44, Bce45, Bce46, Bey20, Bey22, Bey23, Bma42, Bma43, Bpo1, Bpo2, Bpo3, Bpo4, Bpo6, Bpo8, Bpo13, Bpo18, Bpo20, Bpo23, Bpo24, Bpo27, Bpo28, Bpo29, Bpo33, Bpo35, Bpo36, Bpo37, Brh26, Brh27, Brh28, Brh29, Brh30, Brh31, Brh32, Brh33, Bfm17, Bfm18, Bfm20, Bfm21, Bfm24, Bfm25, Bfm27, Bfm32, Bfm33, Bfm34, Bfm35, AAV-rh10, AAV-rh39, AAV-rh43, AAVanc80L65, 또는 이들의 임의의 변이체를 포함하는 다수의 AAV 혈청형으로부터 유래된 것을 포함한다. 예를 들어, 비천연 혼합 혈청형의 개시에 대해서는 미국 특허 번호 8,318,480 참조). 예시적인 캡시드는 또한 국제 출원 공개 번호 WO 2018/022608 및 WO 2019/222136에서 제공되며, 이들은 그 전체가 본원에 포함된다. 캡시드 단백질은 또한 돌연변이, 키메라 또는 셔플 단백질을 포함하는 천연 VP1, VP2 및 VP3의 변이체일 수 있다. 캡시드 단백질은 rh.10 또는 AAV의 다양한 클레이드 내의 다른 하위 유형의 단백질일 수 있고; 예를 들어, 미국 특허 번호 7,906,111에 다양한 클레이드 및 하위 유형이 개시되어 있다. 다양한 구현예에서, AAV 바이러스 입자의 캡시드는 AAV-1 (Genbank 수탁 번호 AAD27757.1), AAV-2 (NCBI 참조 서열 번호 YP_680426.1), AAV-3 (NCBI 참조 서열 번호 NP_043941.1), AAV-3B (Genbank 수탁 번호 AAB95452.1), AAV-4 (NCBI 참조 서열 번호 NP_044927.1), AAV-5 (NCBI 참조 서열 번호 YP_068409.1), AAV-6 (Genbank 수탁 번호 AAB95450.1), AAV-7 (NCBI 참조 서열 번호 YP_077178.1), AAV-8 (NCBI 참조 서열 번호 YP_077179.1), AAV-9 (Genbank 수탁 번호 AAS99264.1), AAV-10 (Genbank 수탁 번호 AAT46337.1), AAV-11 (Genbank 수탁 번호 AAT46339.1), AAV-12 (Genbank 수탁 번호 ABI16639.1), AAV-13 (Genbank 수탁 번호 ABZ10812.1), 또는 WO 2018/022608 및 WO 2019/222136 에 개시된 임의의 아미노산 서열로부터의 아미노산 서열의 일부와 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VP1, VP2, 또는 VP3 단백질을 갖는다. 상이한 혈청형의 AAV 단백질의 구축 및 용도는 Chao 등, Mol. Ther. 2:619-623, 2000; Davidson 등, PNAS 97:3428-3432, 2000; Xiao 등, J. Virol. 72:2224-2232, 1998; Halbert 등, J. Virol. 74:1524-1532, 2000; Halbert 등, J. Virol. 75:6615-6624, 2001; 및 Auricchio 등, Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081, 2001에 개시되어 있다.
한 구현예에서, rAAV 입자는 AAV 캡시드로 위형화되고, 여기서 VP1 단백질은 서열 번호 2-76 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 서열 번호 2-76 중 어느 하나의 전체 길이에 걸쳐 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
AAV 바이러스 입자는 "위형" 또는 "하이브리드" AAV 바이러스 입자일 수 있다. AAV 바이러스 입자와 관련하여 용어 "하이브리드" 및 "위형"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되며 Rep 단백질, 역위 말단 반복 서열 (ITR) 및/또는 캡시드 단백질이 상이한 혈청형임을 나타내기 위한 것이다. 예를 들어, 미국 특허 번호 9,737,618; 및 Gao, G. 등, Clades of Adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues, J. Virol., 78(12):6381-8 (2004)에 개시된 바와 같이 예를 들어, 인간, 개코원숭이, 돼지, 마모셋, 침팬지, 붉은털원숭이, 피그테일 및/또는 시노몰구스 마카크에서 다수의 대체 캡시드 변이체가 확인되었고, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 위형 AAV 바이러스 입자의 생산은 예를 들어, WO 2018/022608 및 WO 2001/83692에 개시되어 있고, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. AAV 바이러스 입자 변이체의 다른 유형, 예를 들어 캡시드 돌연변이를 갖는 AAV 바이러스 입자도 고려된다. 예를 들어, Marsic 등, Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014) 참조, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 예를 들어, 제한 없이, ITR 및/또는 Rep 단백질은 예를 들어, Bba21, Bba26, Bba27, Bba29, Bba30, Bba31, Bba32, Bba33, Bba34, Bba35, Bba36, Bba37, Bba38, Bba41, Bba42, Bba43, Bba44, Bce14, Bce15, Bce16, Bce17, Bce18, Bce20, Bce35, Bce36, Bce39, Bce40, Bce41, Bce42, Bce43, Bce44, Bce45, Bce46, Bey20, Bey22, Bey23, Bma42, Bma43, Bpo1, Bpo2, Bpo3, Bpo4, Bpo6, Bpo8, Bpo13, Bpo18, Bpo20, Bpo23, Bpo24, Bpo27, Bpo28, Bpo29, Bpo33, Bpo35, Bpo36, Bpo37, Brh26, Brh27, Brh28, Brh29, Brh30, Brh31, Brh32, Brh33, Bfm17, Bfm18, Bfm20, Bfm21, Bfm24, Bfm25, Bfm27, Bfm32, Bfm33, Bfm34, 또는 Bfm35 또는 이들의 변이체와 같이 개시되고 지정된 캡시드 서열과 같이 예를 들어, 포유동물에서 발견되는 AAV의 서열로부터 유래된 캡시드 단백질의 것일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "AAV 벡터 게놈", "벡터 게놈", 또는 "rAAV 벡터 게놈"은 단일 가닥 핵산을 지칭한다. rAAV 바이러스 입자는 캡시드 내에 캡시드화된 rAAV 벡터 게놈을 갖는다. rAAV 벡터 게놈은 AAV 5' 역위 말단 반복 (ITR) 서열 및 AAV 바이러스 게놈에 이종인 전사 조절 요소, 예를 들어, 하나 이상의 프로모터 및/또는 인핸서 및, 선택적으로, 폴리아데닐화 서열 및/또는 조절 요소에 또는 조절 요소와 단백질 코딩 서열 사이 또는 단백질 코딩 서열의 엑손 사이에 삽입된 하나 이상의 인트론에 작동 가능하게 연결된 단백질 코딩 서열 (바람직하게는 기능적 치료 단백질 코딩 서열; 예를 들어, FVIII, FIX, 및 PAH) 측면에 있는 AAV 3' ITR을 갖는다. rAAV 벡터 게놈은 rAAV 바이러스 입자에 존재하는 핵산을 지칭하며 본원에 개시된 핵산 서열의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥일 수 있다. 이러한 단일 가닥 핵산의 크기는 염기로 제공된다. 본원에서 사용되는 용어 "역위 말단 반복" 및 "ITR"은 바이러스 DNA 복제의 기점 및 패키징 신호로서 시스에서 기능하는 rAAV 게놈의 5' 및 3' 말단에서 발견되는 당해 분야에서 인식되는 영역을 지칭한다. AAV ITR은 Rep 단백질과 함께 숙주 세포 게놈으로의 2개의 측면 ITR 사이에 삽입된 뉴클레오티드 서열의 효율적인 절단 및 구조 및 통합을 제공한다. 특정 AAV 관련 ITR의 서열은 Yan 등, J. Virol. 79(1):364-379 (2005)로 개시된다. ITR은 또한 (헤어핀의 아암을 형성하는) AA' 역위 반복 사이의 서열이 역상보체에 존재하는 "플립" 또는 "플롭" 구성에서 발견된다 (Wilmott, Patrick, 등　Human gene therapy methods　30.6 (2019): 206-213). 상이한 혈청형의 AAV 벡터 게놈의 구축 및 용도는 Chao 등, Mol. Ther. 2:619-623, 2000; Davidson 등, PNAS 97:3428-3432, 2000; Xiao 등, J. Virol. 72:2224-2232, 1998; Halbert 등, J. Virol. 74:1524-1532, 2000; Halbert 등, J. Virol. 75:6615-6624, 2001; 및 Auricchio 등, Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081, 2001에서 논의된다. 광범위한 작제물 이용가능성 및 광범위한 특성화로 인해, 하기 개시된 예시적인 AAV 벡터 게놈은 혈청형 2로부터 유래된다.
용어 "치료학적으로 유효한 AAV", "치료학적으로 유효한 AAV 입자", "치료학적 AAV", "치료학적으로 유효한 rAAV", "치료학적으로 유효한 rAAV 입자", "치료학적 rAAV", 및 "치료학적으로 유효한 rAAV"는 감염된 세포가 (예를 들어, 전사 및/또는 번역에 의해) 관심 요소 (예를 들어, 뉴클레오티드 서열, 단백질 등)를 발현하도록 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 AAV를 지칭한다. 이 정도로, 치료학적으로 유효한 rAAV 입자는 상이한 특성을 갖는 캡시드 또는 벡터 게놈 (vgs)을 갖는 AAV 입자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 치료학적으로 유효한 rAAV 입자는 번역 후 변형이 상이한 캡시드를 가질 수 있다. 다른 예에서, 치료학적으로 유효한 AAV 입자는 상이한 크기/길이, 플러스 또는 마이너스 가닥 서열, 상이한 플립/플롭 ITR 구성 플립/플롭, 플롭/플립, 플립/플립, 플롭/플롭 등), 다른 수의 ITR (1, 2, 3 등), 또는 절단을 갖는 vgs를 함유할 수 있다. 예를 들어, rAAV 감염된 세포에서 5' 말단 절단 및 3' 말단 절단을 갖는 핵산 사이의 중복 상동 재조합이 발생하여 큰 단백질을 암호화하는 "완전한" 핵산이 생성되어, 기능적 전장 유전자를 재구성한다. 다른 예에서, 5' 말단 절단 및 3' 말단 절단을 갖는 상보적 핵산 서열은 "완전한" 핵산이 제2 가닥 합성 동안 형성되도록 각각과 상호작용한다. "완전한" 핵산은 큰 단백질을 암호화하여, 기능적 전장 유전자를 재구성한다. 치료학적으로 효과적인 rAAV 입자는 무거운 캡시드, 전체 캡시드 또는 부분적으로 전체 캡시드라고도 한다.
용어 "절단" 및 "절단하다"는 rAAV 로부터 수용자 세포로의 유전 물질 (예를 들어, 벡터 게놈)의 전달 및 수용자 세포에서 rAAV 유전 물질로부터의 이식유전자 발현을 지칭한다. 유전 물질의 전달은 수용자 세포를 감염시키는 rAAV 입자를 통해 매개된다. 이를 위해, 용어 "효능"은 rAAV 입자에 의해 감염된 수용자 세포 또는 수용자 세포에서의 이식유전자 발현 수준을 지칭한다. 따라서, 더 큰 효능을 갖는 rAAV는 rAAV에 의해 감염된 수용자 세포가 더 큰 이식유전자 발현을 갖는다는 것을 강조한다.
용어 "치료학적 유효량"은 질환, 장애 또는 병태를 앓고 있거나 이에 걸리기 쉬운 대상체에게 투여될 때 질환, 장애 또는 병태의 증상(들)을 치료, 진단, 예방 또는 이의 개시를 지연시키기에 충분한 치료제의 양을 의미한다. 치료학적 유효량이 전형적으로 적어도 하나의 단위 용량을 포함하는 투여 요법을 통해 투여됨을 당업자는 이해할 것이다. 용어 "치료학적으로 유효한"은 치료제의 치료학적 유효량이 질환, 장애 또는 병태를 앓고 있거나 이에 걸리기 쉬운 대상체에게 투여될 때, 질환, 장애 또는 병태의 증상(들)의 증상(들)을 치료, 진단, 예방 또는 이의 개시를 지연시키기에 충분하도록 충분히 작용하는 치료제의 임의의 요소 또는 조성물을 지칭한다. 예를 들어 이전에 언급된 바와 같이, 치료학적으로 유효한 rAAV는 감염된 세포가 (예를 들어, 전사 및/또는 번역에 의해) 관심 요소 (예를 들어, 뉴클레오티드 서열, 단백질 등)를 발현하도록 세포를 감염시킬 수 있다. 치료학적으로 유효한 rAAV는 치료학적으로 유효한 rAAV에 의해 감염된 세포에 의해 사용되어 복제, 전사 또는 번역과 같은 다양한 방법에 의해 관심 요소 (예를 들어, 뉴클레오티드 서열, 단백질 등)를 생성하기 위해 사용되는 치료학적으로 유효한 뉴클레오티드 서열을 생성하는 데 사용되는 벡터 게놈을 갖는다. "치료제"는 치료학적으로 유효한 rAAV 또는 치료학적 rAAV 바이러스를 포함한다는 것이 또한 주목된다.
예를 들어, 치료 단백질을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 rAAV 비리온, rAAV 바이러스 입자, rAAV 벡터 입자, 또는 rAAV 바이러스를 지칭하는 "치료적 rAAV 바이러스"는 생체 내에서 단백질을 대체하거나 보충하는 데 사용될 수 있다. "치료적 단백질"은 상응하는 내인성 단백질의 활성 손실 또는 감소를 대체하거나 보상하는 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드다. 예를 들어, 기능성 페닐알라닌 수산화효소 (PAH)는 페닐케톤뇨증 (PKU)에 대한 치료적 단백질이다. 따라서, 예를 들어 재조합 rAAV PAH 바이러스는 PKU를 앓고 있는 대상체의 치료를 위한 약제에 사용될 수 있다. 약제는 정맥 내 (IV) 투여에 의해 투여될 수 있고 약제의 투여는 대상체에서 신경전달물질 대사산물 또는 신경전달물질 수준을 변경하기에 충분한 대상체의 혈류에서 PAH 단백질의 발현을 초래한다. 선택적으로, 약제는 또한 rAAV PAH 바이러스의 투여와 관련된 임의의 간독성의 예방 및/또는 치료를 위한 예방적 및/또는 치료적 코르티코스테로이드를 포함할 수 있다. 예방적 또는 치료적 코르티코스테로이드 치료를 포함하는 약제는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 mg/일 이상의 코르티코스테로이드를 포함할 수 있다. 예방적 또는 치료적 코르티코스테로이드 치료를 포함하는 약제는 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10주 이상의 연속 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. PKU 요법은 또한 선택적으로 티로신 보충제를 포함할 수 있다.
AAV 캡시드에 통합된 이식유전자는 제한되지 않으며 치료 목적의 임의의 이종 유전자일 수 있다. 이식유전자는 폴리펩티드, 단백질 또는 기타 관심 산물을 암호화하는 이식유전자 측면의 벡터 서열에 대해 이종인 핵산 서열이다. 핵산 코딩 서열은 이식유전자 전사, 번역 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 허용하는 방식으로 조절 구성 요소에 작동 가능하게 연결된다.
이식유전자 서열의 조성은 생성된 벡터가 사용될 용도에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 이식유전자 서열의 한 유형은 발현시 검출 가능한 신호를 생성하는 리포터 서열을 포함한다. 이러한 리포터 서열은 제한 없이, b-락타마제, b-갈락토시다제 (LacZ), 알칼리 포스파타제, 티미딘 키나제, 녹색 형광 단백질 (GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 루시퍼라제, 예를 들어, CD2, CD4, CD8를 포함하는 막 결합 단백질, 인플루엔자 혈구응집소 단백질, 및 이에 대한 고친화성 항체가 존재하거나 통상적인 수단에 의해 생성될 수 있는 당업계에 잘 알려진 다른 것들, 및 무엇보다도 헤마글루티닌 또는 Myc로부터의 항원 태그 도메인에 적절하게 융합된 막 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다.
이러한 코딩 서열은 발현을 유도하는 조절 요소와 관련될 때, 효소, 방사선, 비색, 형광 또는 기타 분광 분석, 형광 활성화 세포 분류 분석 및 효소 결합 면역흡착 분석 (ELISA), 방사면역분석 (RIA) 및 면역조직화학을 포함하는 면역학적 분석을 포함하는 통상적인 수단에 의해 검출 가능한 신호를 제공한다. 예를 들어, 마커 서열이 LacZ 유전자인 경우, 신호를 전달하는 벡터의 존재는 베타-갈락토시다아제 활성에 대한 분석으로 검출된다. 이식유전자가 녹색 형광 단백질 또는 루시페라제인 경우, 신호를 전달하는 벡터는 광도계에서 색상 또는 광 생성에 의해 시각적으로 측정될 수 있다.
그러나 이식유전자는 전형적으로 단백질, 펩티드, RNA, 효소, 우성 음성 돌연변이, 또는 촉매 RNA와 같이 생물학 및 의학에서 유용한 산물을 암호화하는 비-마커 서열이다. 바람직한 RNA 분자는 tRNA, dsRNA, 리보솜 RNA, 촉매 RNA, siRNA, 작은 헤어핀 RNA, 트랜스-스플라이싱 RNA, 및 안티센스 RNA를 포함한다. 유용한 RNA 서열의 한 처리된 동물에서 표적 핵산 서열의 발현을 억제하거나 소멸시키는 서열이다. 전형적으로, 적합한 표적 서열은 종양학적 표적 및 바이러스성 질환을 포함한다. 이러한 표적의 예는 면역원과 관련된 섹션에서 아래에 확인된 종양학적 표적 및 바이러스를 참조.
이식유전자는 정상 유전자가 정상 수준 미만으로 발현되는 결함 또는 기능적 유전자 산물이 발현되지 않는 결함을 포함할 수 있는 유전자 결함을 교정하거나 개선하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 유형의 이식유전자 서열은 숙주 세포에서 발현되는 치료 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화한다. 벡터는 예를 들어, 다중-서브유닛 단백질에 의해 야기된 유전자 결함을 교정하거나 개선하기 위해 이식유전자를 추가로 포함할 수 있다. 특정 상황에서, 단백질의 각 서브유닛을 암호화하거나 상이한 펩티드 또는 단백질을 암호화하기 위해 상이한 이식유전자가 사용될 수 있다. 이는 면역글로불린, 혈소판 유래 성장 인자 또는 디스트로핀 단백질과 같이 단백질 서브유닛을 암호화하는 DNA의 크기가 클 때 바람직하다. 세포가 다중 서브유닛 단백질을 생산하기 위해서는, 각각의 상이한 서브유닛을 포함하는 재조합 바이러스로 세포를 감염시킨다. 대안적으로, 단백질의 상이한 서브유닛은 동일한 이식유전자에 의해 암호화될 수 있다. 이 경우, 단일 이식유전자는 내부 리보자임 진입 부위 (IRES)에 의해 분리된 각 서브유닛에 대한 DNA와 함께 각 서브유닛을 암호화하는 DNA를 포함한다. 이는 각각의 서브유닛을 암호화하는 DNA의 크기가 작을 때, 예를 들어, 서브유닛과 IRES를 암호화하는 DNA의 총 크기가 5킬로베이스 (Kb) 미만일 때 바람직하다. 또한, 더 긴 게놈 (즉, > 5 (Kb))은 이 표적 세포에서 부분 게놈의 재조합으로 인해 가능할 수 있음이 주목된다. IRES에 대한 대안으로서, DNA는 2A 펩티드를 암호화하는 서열에 의해 분리될 수 있으며, 이는 번역 후 사건에서 자가 절단된다. 예를 들어, Donnelly 등, J. Gen. Virol., 78(Pt 1): 13-21 (1997년 1월); Furler, 등, Gene Ther., 8(1 1):864-873 (2001년 6월); Klump 등, Gene Ther., 8(lO):8 11-817 (2001년 5월) 참조. 이 2A 펩티드는 IRES보다 훨씬 작기 때문에 공간이 제한 요인일 때 사용하기에 매우 적합하다. 더 자주, 이식유전자가 크거나, 다중 서브유닛으로 구성되거나, 2개의 이식유전자가 공동 전달되는 경우, 원하는 이식유전자(들) 또는 서브유닛을 보유하는 rAAV가 공동 투여되어 단일 벡터 게놈을 형성하기 위해 생체 내에서 연쇄체화될 수 있다. 이러한 구현예에서, 제1 AAV는 단일 이식유전자를 발현하는 발현 카세트를 보유할 수 있고 제2 AAV는 숙주 세포에서 공동-발현을 위해 상이한 이식유전자를 발현하는 발현 카세트를 보유할 수 있다. 그러나 선택된 이식유전자는 임의의 생물학적 활성 산물 또는 다른 산물, 예를 들어, 연구에 바람직한 산물을 암호화할 수 있다.
적합한 이식유전자는 당업자에 의해 쉽게 선택될 수 있다. 이식유전자의 선택은 본 발명의 제한으로 간주되지 않는다. 이식유전자는 이종 단백질일 수 있고, 이 이종 단백질은 치료 단백질일 수 있다. 예시적인 치료 단백질은 b-글로빈, 헤모글로빈, 조직 플라스미노겐 활성제 및 응고 인자와 같은 혈액 인자; 콜로니 자극 인자 (CSF); IL-l, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 등과 같은 인터루킨; 케라티노사이트 성장 인자 (KGF), 줄기 세포 인자 (SCF), 섬유아세포 성장 인자 (FGF, 예를 들어 염기성 FGF 및 산성 FGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 인슐린 유사 성장 인자 (IGF), 골형성 단백질 (BMP), 표피 성장 인자 (EGF), 성장 분화 인자-9 (GDF-9), 간암 유래 성장 인자 (HDGF), 미오스타틴 (GDF-8), 신경 성장 인자 (NGF), 뉴로트로핀, 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 트롬보포이에틴 (TPO), 형질 전환 성장 인자 알파 (TGF-a.), 형질 전환 성장 인자 베타 (TGF-.b.) 등과 같은 성장 인자; 가용성 TNF-a. 수용체, 가용성 VEGF 수용체, 가용성 인터루킨 수용체 (예를 들어, 가용성 IL-l 수용체 및 가용성 II형 IL-l 수용체), 가용성 g/d T 세포 수용체, 가용성 수용체의 리간드-결합 단편 등과 같은 가용성 수용체; α-글루코시다제, 이미글루카라제 , b-글루코세레브로시다제 및 알글루세라제와 같은 효소; 조직 플라스미노겐 활성화제와 같은 효소 활성화제; 케모카인, 예를 들어 1P-10, 인터페론-감마 (Mig), Groa/IL-8, RANTES, MIP-la, MIR- 1b., MCP-l, PF-4 등에 의해 유도된 모노카인; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF, 예를 들어, VEGF121, VEGF165, VEGF-C, VEGF-2), 신경아교종 유래 성장 인자, 안지오게닌, 안지오게닌-2 등과 같은 혈관신생제; 가용성 VEGF 수용체와 같은 항혈관신생제; 단백질 백신; 신경 성장 인자 (NGF), 브래디키닌, 콜레시스토키닌, 가스틴, 세크레틴, 옥시토신, 고나도트로핀 방출 호르몬, 베타-엔돌핀, 엔케팔린, 물질 P, 소마토스타틴, 프로락틴, 갈라닌, 성장 호르몬 방출 호르몬, 봄베신, 디노르핀, 와파린, 뉴로텐신, 모틸린, 갑상선자극호르몬, 신경펩티드 Y, 황체형성 호르몬, 칼시토닌, 인슐린, 글루카곤, 바소프레신, 안지오텐신 II, 갑상선자극호르몬 방출 호르몬, 혈관활성 장 펩티드, 수면 펩티드 등과 같은 신경활성 펩티드; 혈전용해제; 심방 나트륨 이뇨 펩티드; 릴렉신; 신경교 섬유질 산성 단백질; 여포 자극 호르몬 (FSH); 인간 알파-1 항트립신; 백혈병 억제 인자 (LIF); 조직 인자, 황체 형성 호르몬; 대식세포 활성화 인자; 종양 괴사 인자 (TNF); 호중구 화학주성 인자 (NCF); 메탈로프로테이나제의 조직 억제형; 혈관활성 장 펩티드; 안지오게닌; 안지오트로핀; 피브린; 히루딘; IF-l 수용체 길항제; 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 관심 단백질의 일부 다른 비제한적 예는 섬모 신경영양 인자 (CNTF); 뇌유래신경영양인자 (BDNF); 뉴로트로핀 3 및 4/5 (NT-3 및 4/5); 신경아교세포 유래 신경영양 인자 (GDNF); 방향족 아미노산 데카르복실라제 (AADC); 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X와 같은 혈우병 관련 응고 단백질; C1-억제형과 같은 유전성 혈관부종 관련 단백질; 디스트로핀, 미니-디스트로핀 또는 마이크로디스트로핀; 리소좀 산 리파아제; 페닐알라닌 수산화효소 (PAH); 글루코스-6-포스파타제, 산성 말타제, 글리코겐 탈분지 효소, 근육 글리코겐 포스포릴라제, 간 글리코겐 포스포릴라제, 근육 포스포프럭토키나제, 포스포릴라제 키나제 (예를 들어, PHKA2), 글루코스 수송체 (예를 들어, GFUT2), 알돌라제 A, b-에놀라제, 및 글리코겐 신타제와 같은 글리코겐 축적 질환 관련 효소; 리소좀 효소 (예를 들어, 베타-N-아세틸헥소사미니다제 A); 및 이들의 임의의 변이를 포함한다. 다른 이식유전자는 심장 미오신 결합 단백질 C, β-미오신 중쇄, 심장 트로포닌 T, 심장 트로포닌 I, 미오신 심실 필수 경쇄 1, 미오신 심실 조절 경쇄 2, 심장 α 액틴 (ACTC), α-트로포미오신, 티틴, 4-1/2 LIM 단백질 1을 암호화하는 이식유전자, 및 국제 출원 공개 번호 WO 2014/170470의 미국 특허 번호에 개시된 다른 이식유전자를 포함한다. AAV 벡터는 또한 플라스미드 벡터로 형질감염되거나 바이러스로 감염된 세포에서 그의 전사, 번역 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 이식유전자에 작동 가능하게 연결된 통상적인 제어 요소 또는 서열을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "작동 가능하게 연결된" 서열은 관심 유전자 (GOI)와 인접하는 발현 제어 서열 및 관심 유전자를 제어하기 위해 트랜스로 또는 일정 거리에서 작용하는 발현 제어 서열 모두를 포함한다. 적합한 유전자는 Anguela 등 "Entering the Modern Era of Gene Therapy", Annual Rev. of Med. Vol. 70, 페이지 272-288 (2019) 및 Dunbar 등, "Gene Comes of Age", Science, Vol. 359, 6372호, eaan4672 (2018)에 논의된 이러한 유전자를 포함한다.
발현 제어 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 (폴리A) 신호와 같은 효율적인 RNA 처리 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열 (예를 들어, 코작 공통 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 바람직한 경우, 암호화된 산물의 분비를 향상시키는 서열을 포함한다. 천연, 구성적, 유도성 및/또는 조직 특이적 프로모터를 포함하는 다수의 발현 제어 서열이 당업계에 공지되어 있고 이용될 수 있다.
구성적 프로모터의 예는 제한 없이, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터 (선택적으로 RSV 인핸서 포함), 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 (선택적으로 CMV 인핸서 포함) (예를 들어, Boshart 등, Cell, 41:521-530 (1985) 참조), SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, b-액틴 프로모터, 포스포 글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터, 및 EF1 프로모터 [Invitrogen]를 포함한다. 유도성 프로모터는 유전자 발현의 조절을 허용하고 외인성으로 공급된 화합물, 온도와 같은 환경적 요인, 또는 특정 생리학적 상태, 예를 들어, 급성기, 세포의 특정 분화 상태, 또는 복제 세포에서 만의 존재에 의해 조절될 수 있다. 유도성 프로모터 및 유도성 시스템은 제한 없이, Invitrogen, Clontech 및 Ariad를 포함하는 다양한 상업적 공급원에서 구할 수 있다. 많은 다른 시스템이 설명되었고 당업자에 의해 쉽게 선택될 수 있다. 외인성 공급 화합물에 의해 조절되는 유도성 프로모터의 예는 아연 -유도성 양 메탈로티오닌 (MT) 프로모터, 덱사메타손 (Dex)-유도성 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, T7 중합효소 프로모터 시스템 [WO 98/10088]; 엑디손 곤충 프로모터 [No 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)], 테트라사이클린 억제 시스템 [Gossen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)], 테트라사이클린 유도 시스템 [Gossen 등, Science, 268:1766-1769 (1995), 또한 Harvey 등, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998) 참조], RU486-유도성 시스템 [Wang 등, Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) 및 Wang 등, Gene Ther., 4:432-441 (1997)] 및 라파마이신 유도 시스템 [Magari 등, J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)]을 포함한다. 이와 관련하여 유용할 수 있는 다른 유형의 유도성 프로모터는 특정 생리학적 상태, 예를 들어, 온도, 급성기, 세포의 특정 분화 상태 또는 복제 세포에서만 조절되는 것들이다.
선택적으로, 이식유전자에 대한 천연 프로모터를 사용할 수 있다. 천연 프로모터는 도입유전자의 발현이 천연 발현을 모방하는 것이 바람직할 때 바람직할 수 있다. 천연 프로모터는 이식유전자의 발현이 바람직하게는 일시적으로 또는 발달적으로, 또는 조직-특이적 방식으로, 또는 특정 전사 자극에 반응하여 조절될 때 사용될 수 있다. 추가 구현예에서, 인핸서 요소, 폴리아데닐화 부위 또는 코작 공통 서열과 같은 다른 천연 발현 제어 요소가 또한 천연 발현을 모방하는데 사용될 수 있다.
이식유전자는 또한 조직 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 골격근에서의 발현을 원하는 경우, 근육에서 활성화된 프로모터를 사용해야 한다. 여기에는 골격 b-액틴, 미오신 경쇄 2A, 디스트로핀, 근육 크레아틴 키나제를 암호화하는 유전자의 프로모터뿐만 아니라 자연 발생 프로모터보다 활성이 더 높은 합성 근육 프로모터가 포함된다 (Li 등, Nat. Biotech., 17:241-245 (1999) 참조). 조직-특이적 프로모터의 예는 그 중에서도 간 (알부민, Miyatake 등, J. Virol., 71:5124-32 (1997); B형 간염 바이러스 코어 프로모터, Sandig 등, Gene Ther., 3:1002-9 (1996); 알파-태아단백질 (AFP), Arbuthnot 등, Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)), 뼈 오스테오칼신 (Stein 등, Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)); 뼈 시알로프로테인 (Chen 등, J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)), 림프구 (CD2, Hansal 등, J. Immunol., 161:1063-8 (1998); 면역글로불린 중쇄; T 세포 수용체 사슬), 뉴런-특이적 에놀라제 (NSE) 프로모터와 같은 뉴런 (Andersen 등, Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)), 신경필라멘트 경쇄 유전자 (Piccioli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)), 및 뉴런 특이적 vgf 유전자 (Piccioli 등, Neuron, 15:373-84 (1995))에 대해 공지되어 있다.
재조합 AAV는 예를 들어, 세포 배양에서 시험관 내 관심 단백질을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, AAV는 시험관 내 관심 단백질을 생산하는 방법에 사용될 수 있으며, 여기서 방법은 이종 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 AAV를 제공하는 단계; 및 재조합 AAV를 세포 배양물에서 세포와 접촉시켜, 재조합 AAV가 세포에서 관심 단백질을 발현시키는 단계를 포함한다. 관심 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 크기는 다양할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 적어도 약 0.1 킬로베이스 (kb), 적어도 약 0.2 kb, 적어도 약 0.3 kb, 적어도 약 0.4 kb, 적어도 약 0.5 kb, 적어도 약 0.6 kb, 적어도 약 0.7 kb, 적어도 약 0.8 kb, 적어도 약 0.9 kb, 적어도 약 1 kb, 적어도 약 1.1 kb, 적어도 약 1.2 kb, 적어도 약 1.3 kb, 적어도 약 1.4 kb, 적어도 약 1.5 kb, 적어도 약 1.6 kb, 적어도 약 1.7 kb, 적어도 약 1.8 kb, 적어도 약 2.0 kb, 적어도 약 2.2 kb, 적어도 약 2.4 kb, 적어도 약 2.6 kb, 적어도 약 2.8 kb, 적어도 약 3.0 kb, 적어도 약 3.2 kb, 적어도 약 3.4 kb, 적어도 약 3.5 kb 길이, 적어도 약 4.0 kb 길이, 적어도 약 5.0 kb 길이, 적어도 약 6.0 kb 길이, 적어도 약 7.0 kb 길이, 적어도 약 8.0 kb 길이, 적어도 약 9.0 kb 길이, 또는 적어도 약 10.0 kb 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드는 적어도 약 1.4 kb 길이이다.
재조합 AAV는 또한 예를 들어 포유동물과 같은 동물에서 생체 내 관심 단백질을 생산하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예는 관심 단백질을 생체 내에서 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 방법은 관심 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 AAV를 제공하는 단계; 및 대상체에 재조합 AAV를 투여함으로써 재조합 AAV가 대상체에서 관심 단백질을 발현시키는 단계를 포함한다. 대상체는 일부 구현예에서, 비-인간 포유동물, 예를 들어, 원숭이, 개, 고양이, 마우스 또는 소일 수 있다. 관심 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 크기는 다양할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 적어도 약 0.1 kb, 적어도 약 0.2 kb, 적어도 약 0.3 kb, 적어도 약 0.4 kb, 적어도 약 0.5 kb, 적어도 약 0.6 kb, 적어도 약 0.7 kb, 적어도 약 0.8 kb, 적어도 약 0.9 kb, 적어도 약 1 kb, 적어도 약 1.1 kb, 적어도 약 1.2 kb, 적어도 약 1.3 kb, 적어도 약 1.4 kb, 적어도 약 1.5 kb, 적어도 약 1.6 kb, 적어도 약 1.7 kb, 적어도 약 1.8 kb, 적어도 약 2.0 kb, 적어도 약 2.2 kb, 적어도 약 2.4 kb, 적어도 약 2.6 kb, 적어도 약 2.8 kb, 적어도 약 3.0 kb, 적어도 약 3.2 kb, 적어도 약 3.4 kb, 적어도 약 3.5 kb 길이, 적어도 약 4.0 kb 길이, 적어도 약 5.0 kb 길이, 적어도 약 6.0 kb 길이, 적어도 약 7.0 kb 길이, 적어도 약 8.0 kb 길이, 적어도 약 9.0 kb 길이, 또는 적어도 약 10.0 kb 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드는 적어도 약 1.4 kb 길이이다.
특히 흥미로운 것은 다양한 질환 또는 장애를 치료하기 위해 하나 이상의 치료 단백질을 발현하기 위한 재조합 AAV의 용도이다. 질환의 비-제한적 예는 암종, 육종, 백혈병, 림프종과 같은 암; 및 다발성 경화증과 같은 자가면역 질환을 포함한다. 암종의 비-제한적 예는 식도 암종; 간세포 암종; 기저 세포 암종, 편평 세포 암종 (다양한 조직); 전이 세포 암종을 포함하는 방광 암종; 기관지 암종; 결장 암종; 결장직장 암종; 위 암종; 폐의 소세포 암종 및 비소세포 암종을 포함하는 폐 암종; 부신피질 암종; 갑상선 암종; 췌장 암종; 유방 암종; 난소 암종; 전립선 암종; 선암종; 땀샘 암종; 피지선 암종; 유두상 암종; 유두 선암종; 낭선암종; 수질 암종; 신장 세포 암종; 제자리 관 암종 또는 담관 암종; 융모막암종; 정상피종; 배아 암종; 윌름 종양; 자궁경부 암종; 자궁 암종; 고환 암종; 골형성 암종; 상피 암종; 및 비인두 암종울 포함한다. 육종의 비-제한적 예는 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 척색종, 골 육종, 골육종, 혈관육종, 내피 육종, 림프관육종, 림프관 내피 육종, 윤활막종, 중피종, 유잉 육종, 평활근육종, 횡문근육종, 및 기타 연조직 육종을 포함한다. 고형 종양의 비-제한적 예는 신경아교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종 및 망막모세포종을 포함한다. 백혈병의 비-제한적 예는 만성 골수 증식 증후군; 급성 골수성 백혈병; B-세포 CLL, T-세포 CLL 전림프구성 백혈병 및 털세포 백혈병을 포함하는 만성 림프구성 백혈병; 및 급성 림프구성 백혈병을 포함한다. 림프종의 예는 버킷 림프종과 같은 B-세포 림프종; 호지킨 림프종; 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 개시된 rAAV 및 방법을 사용하여 치료할 수 있는 질환의 다른 비-제한적 예는 겸상 적혈구 빈혈, 낭포성 섬유증, 리소좀 산 리파제 (LAL) 결핍 1, 테이-삭스병, 페닐케톤뇨증, 점액다당류증, 글리코겐 축적 질환 (GSD, 예를 들어, GSD 유형 I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, 및 XIV), 갈락토오스혈증, 근이영양증 (예를 들어, 뒤센 근이영양증), 심근병증 (예를 들어, 비대성 심근병증, 확장성 심근병증, 부정맥성 우심실 심근병증 등) 및 혈우병 A형 (고전적 혈우병) 및 혈우병 B (크리스마스병)와 같은 혈우병, 윌슨병, 파브리병, 고셔병 유전성 혈관부종 (HAE), 및 알파 1 항트립신 결핍을 포함하는 유전 장애를 포함한다. 또한, 본원에 개시된 rAAV 및 방법은 간에서 이식유전자의 국소 발현 또는 간 또는 간세포로부터의 분비 단백질의 발현에 의해 치료될 수 있는 다른 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다.
대상체 (예를 들어, 대상체의 혈청)에서 발현되는 이종 단백질의 양은 다양할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서 단백질은 적어도 약 9 밀리그램 (mg)/mL, 적어도 약 10 mg/mL, 적어도 약 11 mg/mL, 적어도 약 12 mg/mL, 적어도 약 13 mg/mL, 적어도 약 14 mg/mL, 적어도 약 15 mg/mL, 적어도 약 16 mg/mL, 적어도 약 17 mg/mL, 적어도 약 18 mg/mL, 적어도 약 19 mg/mL, 적어도 약 20 mg/mL, 적어도 약 21 mg/mL, 적어도 약 22 mg/mL, 적어도 약 23 mg/mL, 적어도 약 24 mg/mL, 적어도 약 25 mg/mL, 적어도 약 26 mg/mL, 적어도 약 27 mg/mL, 적어도 약 28 mg/mL, 적어도 약 29 mg/mL, 적어도 약 30 mg/mL, 적어도 약 31 mg/mL, 적어도 약 32 mg/mL, 적어도 약 33 mg/mL, 적어도 약 34 mg/mL, 적어도 약 35 mg/mL, 적어도 약 36 mg/mL, 적어도 약 37 mg/mL, 적어도 약 38 mg/mL, 적어도 약 39 mg/mL, 적어도 약 40 mg/mL, 적어도 약 41 mg/mL, 적어도 약 42 mg/mL, 적어도 약 43 mg/mL, 적어도 약 44 mg/mL, 적어도 약 45 mg/mL, 적어도 약 46 mg/mL, 적어도 약 47 mg/mL, 적어도 약 48 mg/mL, 적어도 약 49 mg/mL, 또는 적어도 약 50 mg/mL 또는 이들 값 중 임의의 두 값 사이의 범위의 양으로 대상체의 혈청에서 발현될 수 있다. 관심 단백질은 약 9 pg/mL, 약 10 pg/mL, 약 50 pg/mL, 약 100 pg/mL, 약 200 pg/mL, 약 300 pg/mL, 약 400 pg/mL, 약 500 pg/mL, 약 600 pg/mL, 약 700 pg/mL, 약 800 pg/mL, 약 900 pg/mL, 약 1000 pg/mL, 약 1500 pg/mL, 약 2000 pg/mL, 약 2500 pg/mL, 또는 이들 값 중 임의의 두 값 사이의 범위의 양으로 대상체의 혈청에서 발현될 수 있다. 당업자는 관심 단백질이 치료 효능을 위해 필요한 발현 수준이 비제한적 요인, 예를 들어 관심 특정 단백질 및 치료를 받는 대상체, 및 단백질의 유효량에 따라 달라질 수 있고 과도한 실험 없이 당업계에 공지된 통상적인 방법을 사용하여 숙련된 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있음을 이해할 것이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에게 투여하기에 유용한 본 발명의 AAV 바이러스 입자의 약학 제형에 관한 것이다.
한 구현예에서, 본 발명의 약학 제형은 본원에 개시된 AAV 바이러스 입자를 포함하는 액체 제형이며, 여기서 제형 중 AAV 바이러스 입자의 농도는 광범위하게 변할 수 있다. AAV 바이러스 입자 및 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 용량 단위 형태로 제형화될 수 있다. 본원에 사용된 용량 단위 형태는 치료될 개체를 위한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 활성 화합물의 미리 결정된 양을 함유한다. 용량 단위 형태는 원하는 효과(들)를 생성하는 데 필요한 AAV 바이러스 입자의 양에 따라 다르다. 필요한 양은 단일 투여량으로 제형화되거나 다중 용량 단위로 제형화될 수 있다. 투여량은 적합한 AAV 바이러스 입자 농도로 조정될 수 있고, 선택적으로 하나 이상의 다른 작용제와 조합되고, 사용을 위해 포장될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 약학 조성물은 예방적 또는 치료학적 유효량, 즉 문제의 질환 상태의 증상을 예방, 감소 또는 개선하기에 충분한 양 또는 원하는 이점을 부여하기에 충분한 양을 제공하기에 충분한 유전 물질을 포함할 것이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 바이러스 입자 함유 약학 제형은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하여 대상체에 대한 저장 및/또는 투여에 유리한 특성을 갖는 제형을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 약학 제형은 적어도 2주, 바람직하게는 적어도 4주, 더욱 바람직하게는 적어도 6주 및 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 8주의 기간 동안, 안정성에 감지할 수 있는 변화 없이 < 65℃에서 보관될 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "안정한"은 제형에 존재하는 AAV 바이러스 입자가 저장 동안 본질적으로 그의 물리적 안정성, 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 유지함을 의미한다. 본 발명의 다른 구현예에서, 약학 제형에 존재하는 AAV 바이러스 입자는 -65℃에서 결정된 시간 동안 저장 동안 대상체에서 그의 생물학적 활성의 적어도 약 80%, 더욱 바람직하게는 대상체에서 그의 생물학적 활성의 적어도 약 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%를 유지한다.
일부 구현예에서, 약 0.1 mg/ml 내지 약 3 mg/mL, 약 0.5 mg/ml 내지 약 2.5 mg/mL, 약 1 mg/ml 내지 약 2 mg/ml, 또는 약 1.4 mg/ml 내지 약 1.6 mg/ml의 농도의 이염기성 인산나트륨. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 AAV 바이러스 입자 제형은 약 1.42 mg/ml의 (건조된) 이염기성 인산나트륨을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 바이러스 입자 제형에서 용도를 찾을 수 있는 또 다른 완충제는 일부 구현예에서, 약 0.1 mg/ml 내지 약 3 mg/mL, 약 0.5 mg/ml 내지 약 2.5 mg/mL, 약 1 mg/ml 내지 약 2 mg/ml, 또는 약 1.3 mg/ml 내지 약 1.5 mg/ml의 농도에서 사용되는 일염기성 일수화물인 인산나트륨이다. 한 구현예에서, 본 발명의 AAV 바이러스 입자 제형은 약 1.38 mg/ml의 인산나트륨, 일염기성 일수화물을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 바이러스 입자 제형은 약 1.42 mg/ml의 이염기성 인산나트륨, 및 약 1.38 mg/ml의 인산나트륨, 일염기성 일수화물을 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명의 AAV 바이러스 입자 제형은 염화나트륨과 같은 하나 이상의 등장화제를 바람직하게는 약 1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml, 예를 들어, 약 1 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 약 5 mg/ml 내지 약 15 mg/ml, 또는 약 8 mg/ml 내지 약 20 mg/ml의 농도로 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 제형은 약 8.18 mg/ml 염화나트륨을 포함한다. 당업계에 공지된 다른 완충제 및 등장화제가 적합하고 본 개시내용의 제형에 사용하기 위해 통상적으로 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 바이러스 입자 제형은 하나 이상의 증량제를 포함할 수 있다. 예시적인 증량제는 만니톨, 수크로스, 덱스트란, 락토스, 트레할로즈 및 포비돈 (PVP K24)을 제한 없이 포함한다. 특정 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제형은 만니톨을 포함하며, 약 5 mg/ml 내지 약 40 mg/ml, 또는 약 10 mg/ml 내지 약 30 mg/ml, 또는 약 15 mg/ml 내지 약 25 mg/ml의 양으로 존재할 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 만니톨은 약 20 mg/ml의 농도로 존재한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 AAV 바이러스 입자 제형은 비-이온성 계면활성제일 수 있는 하나 이상의 계면활성제를 포함할 수 있다.
예시적인 계면활성제는 이온성 계면활성제, 비-이온성 계면활성제 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 계면활성제는 제한 없이, TWEEN 80 (폴리소르베이트 80, 또는 이의 화학명 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노 올레이트로도 알려짐), 도데실황산나트륨, 스테아르산나트륨, 암모늄 라우릴 설페이트, TRITON AG 98 (Rhone-Poulenc), 폴록사머 407, 폴록사머 188 등, 및 이들의 조합일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 제형은 폴록사머 188을 포함하며, 이는 약 0.1 mg/ml 내지 약 4 mg/ml, 또는 약 0.5 mg/ml 내지 약 3 mg/ml, 약 1 mg/ml 내지 약 3 mg/mL, 약 1.5 mg/ml 내지 약 2.5 mg/ml, 또는 약 1.8 mg/ml 내지 약 2.2 mg/ml의 농도로 존재할 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 폴록사머 188은 약 2.0 mg/ml의 농도로 존재한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 약학 제형은 약 1.42 mg/ml의 인산나트륨, 이염기성, 약 1.38 mg/ml의 인산나트륨, 일염기성 일수화물, 약 8.18 mg/ml 염화나트륨, 약 20 mg/ml 만니톨 및 약 2 mg/ml 폴록사머 188을 포함하는 액체 용액으로 제형화된 AAV 바이러스 입자를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 AAV 바이러스 입자-함유 제형은 안정하고 품질, 효능 또는 순도에서 허용할 수 없는 변화 없이 연장된 기간 동안 저장될 수 있다.
한 구현예에서, 제형은 적어도 1개월, 예를 들어, 적어도 1개월, 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 적어도 24개월, 또는 그 이상 동안 약 5℃ (예를 들어, 2℃ 내지 8℃)의 온도에서 안정하다.
또 다른 구현예에서, 제형은 적어도 6개월, 예를 들어, 적어도 6개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 적어도 24개월, 적어도 36개월, 또는 그 이상 동안 약 -20℃ 이하의 온도에서 안정하다.
일부 구현예에서, 제형은 적어도 6개월, 예를 들어, 적어도 6개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 적어도 24개월, 적어도 36개월, 또는 그 이상 동안 약 -40℃ 이하의 온도에서 안정하다.
다른 구현예에서, 제형은 적어도 6개월, 예를 들어, 적어도 6개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 적어도 24개월, 적어도 36개월, 또는 그 이상 동안 약 -60 ℃ 이하의 온도에서 안정하다.
한 구현예에서, 본 발명은 관심 세포, 조직 및/또는 기관의 효율적인 형질도입 및/또는 유전자 요법에서의 사용을 위한 본 발명의 AAV 바이러스 입자의 용도를 제공한다.
한 구현예에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 AAV 바이러스 입자를 포함하는 조성물을 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 관심 세포, 조직 및/또는 기관의 효율적인 형질도입 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 AAV 바이러스 입자는 대상체의 관심 세포, 조직 및/또는 기관의 형질도입에 사용된다.
다른 구현예에서, 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 관심 있는 세포, 조직 및/또는 기관의 형질도입 방법이 제공되며, 상기 방법은 유효량의 본 발명의 AAV 바이러스 입자를 포함하는 조성물을 세포 내로 도입하는 것을 포함한다.
한 구현예에서, 대상체의 예방적 또는 치료적 치료 방법이 제공된다.
또 다른 구현예에서, 대상체는 예방적 또는 치료적 치료를 필요로 한다.
일부 구현예에서, 대상체는 병태 또는 질환을 포함하고, 여기서 대상체는 상기 병태 또는 질환에 대한 치료가 필요하다.
다른 구현예에서, 대상체는 포유동물이다.
다른 구현예에서, 대상체는 설치류가 아닌 포유동물, 영장류, 인간, 가축, 말, 양, 염소, 돼지, 개 또는 고양이이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 바이러스 입자는 다양한 공지된 투여 기술을 통해 대상체에게 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, AAV 바이러스 입자는 단일 볼루스로서 또는 적어도 약 1, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150, 180, 210 또는 240분, 또는 그 이상일 수 있는 장기간에 걸쳐 정맥 내 주사에 의해 투여된다.
한 구현예에서, 대상체의 뇌척수액 (CSF)을 포함하는 세포 (예를 들어, 뇌실막 세포)가 상기 AAV 바이러스 입자에 의해 형질도입된다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 입자로 형질도입된 세포 (예를 들어, 뇌실막 세포)는 이식유전자(들)을 상기 포유동물의 CSF로 발현 및 분비한다.
또 다른 구현예에서, AAV 바이러스 입자의 투여는 대상체의 대수조, 심실내 공간, 뇌실, 지주막하 공간, 척수강내 공간 및/또는 뇌실막으로의 투여를 포함한다.
다른 구현예에서, AAV 바이러스 입자의 투여는 상기 대상체의 뇌척수액 (CSF)에 대한 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 바이러스 입자의 투여는 상기 대상체의 뇌실막 세포를 AAV 바이러스 입자와 접촉시키는 것을 포함한다.
한 구현예에서, AAV 바이러스 입자의 투여는 상기 대상체의 연막 세포, 내피 세포 또는 수막 세포를 상기 AAV 바이러스 입자와 접촉시키는 것을 포함한다.
또 다른 구현예에서, AAV 바이러스 입자의 투여는 AAV 바이러스 입자를 상기 대상체의 뇌 또는 척수의 조직 또는 유체에 주사하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 바이러스 입자의 투여는 AAV 바이러스 입자를 상기 대상체의 뇌 척수액에 주사하는 것을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법 및 조성물과 함께 사용하기 위한 키트를 제공한다. 조성물 및 바이러스 제형이 키트에 제공될 수 있다. 키트는 또한 적절한 용기와 선택적으로 하나 이상의 추가 제제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 용기는 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기 및/또는 다른 용기이다. 다른 구현예에서, 키트는 AAV 바이러스 입자, 약학적으로 허용 가능한 담체, 및 예를 들어 AAV 바이러스 입자의 투여를 지시하기 위한 그의 사용을 위한 지침 자료를 포함한다.
아데노 관련 바이러스 생산 방법
본 개시내용은 포유동물 및 곤충 세포와 같은 세포에서 rAAV 비리온을 생산하기 위한 재료 및 방법을 제공한다.
다양한 구현예에서, 임의의 구현예의 방법은 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터를 갖는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터는 AAV 헬퍼 기능을 제공하는 적어도 하나의 핵산 분자, 또는 비-AAV 헬퍼 기능을 제공하는 적어도 하나의 핵산 분자, 또는 AAV 게놈 벡터를 생성하는 적어도 하나의 핵산 분자, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 임의의 구현예의 방법은 rAAV의 생산을 허용하는 조건하에서 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 방법은 선택적으로 rAAV를 회수하는 것을 포함한다. 예를 들어, AAV 바이러스 입자는 약 12시간, 약 24시간, 약 36시간, 약 48시간, 약 72시간, 약 96시간, 약 120시간, 약 144시간, 약 168시간, 약 192시간, 약 216시간, 약 240 시간, 또는 공동-형질감염 후 임의의 이들 두 시점 사이의 시간에 수집될 수 있다.
일부 구현예에서, AAV 바이러스 입자의 생산을 위한 배양물은 다음 중 하나 이상을 포함한다: 숙주 세포, 야생형 또는 돌연변이 아데노바이러스 (예를 들어 온도 민감성 아데노바이러스), 헤르페스 바이러스, 바큘로바이러스에 의해 제공되는 적합한 헬퍼 바이러스 기능, 또는 헬퍼 기능을 제공하는 플라스미드 작제물, AAV rep 및 cap 유전자 및 유전자 산물, AAV ITR 서열 측면에 있는 이식유전자 (예를 들어 진단 및/또는 치료용 이식유전자(들)), AAV 바이러스 입자 생산을 지원하는 적합한 배지 및 배지 구성 요소.
일부 구현예에서, 곤충 또는 포유동물 세포는 헬퍼 플라스미드 또는 헬퍼 바이러스, 바이러스 작제물 및 AAV cap 유전자를 암호화하는 플라스미드로 형질감염될 수 있으며; rAAV 입자는 공동-형질감염 후 다양한 시점에서 수집될 수 있다.
일부 구현예에서, 신규한 rAAV 바이러스 입자는 곤충 세포 (예를 들어, Sf9)에서 생산된다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 입자는 Rep 및 Cap 유전자와 함께 이식유전자를 포함하는 AAV 게놈 벡터를 숙주 세포에 제공함으로써 제조된다. 일부 구현예에서, AAV 게놈 벡터는 이식유전자, AAV Rep 유전자 및 AAV Cap 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 바이러스 입자는 2개 이상의 벡터를 숙주 세포에 제공함으로써 제조된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 이식유전자를 포함하는 AAV 게놈 벡터가 AAV Rep 유전자 및 AAV Cap 유전자를 포함하는 벡터 (예를 들어, 플라스미드 또는 바큘로바이러스)와 함께 세포 내로 도입 (예를 들어, 형질감염 또는 형질도입)된다. 일부 구현예에서, 이식유전자를 포함하는 AAV 게놈 벡터, AAV Rep 유전자를 포함하는 벡터 (예를 들어, 플라스미드 또는 바큘로바이러스), 및 AAV Cap 유전자를 포함하는 벡터 (예를 들어, 플라스미드 또는 바큘로바이러스)로 형질감염되거나 형질도입된 세포.
다양한 구현예에서, 임의의 구현예의 방법은 숙주 세포를 rBV 로 감염시키는 단계를 포함한다. rBV는 Rep 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자, 캡시드 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자, 및 AAV 게놈 벡터를 생성하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함한다. 임의의 구현예의 방법은 rAAV의 생산을 허용하는 조건하에서 세포를 배양하는 것을 추가로 포함한다. 이 방법은 선택적으로 rAAV를 회수하는 단계를 포함한다.
AAV 바이러스 입자를 생성하는 다수의 방법이 있다: 예를 들어, AAV 헬퍼 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 또는 백시니아 바이러스) 중 하나와의 공동감염과 함께 벡터 및 AAV 헬퍼 서열을 사용한 형질감염 또는 재조합 AAV 벡터, AAV 헬퍼 벡터, 벡터 및 보조 기능 벡터로 형질감염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. AAV 바이러스 입자를 제조하는 방법은 예를 들어, 미국 특허 번호 US6204059, US5756283, US6258595, US6261551, US6270996, US6281010, US6365394, US6475769, US6482634, US6485966, US6943019, US6953690, US7022519, US7238526, US7291498 및 US7491508, US5064764, US6194191, US6566118, US8137948; 또는 국제 공개 번호 WO1996039530, WO1998010088, WO1999014354, WO1999015685, WO1999047691, WO2000055342, WO2000075353, WO2001023597, WO2015191508, WO2019217513, WO2018022608, WO2019222136, WO2020232044, WO2019222132; Methods In Molecular Biology, ed. Richard, Humana Press, NJ (1995); O'Reilly 등, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, Oxford Univ. Press (1994); Samulski 등, J. Vir.63:3822-8 (1989); Kajigaya 등, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88: 4646-50 (1991); Ruffing 등, J. Vir.66:6922-30 (1992); Kimbauer 등, Vir., 219:37-44 (1996); Zhao 등, Vir.272:382-93 (2000)에 기술되어 있고; 각각의 내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다. AAV 바이러스 입자를 생성하는 방법에 대한 자세한 설명은 예를 들어, 미국 특허 번호 6,001,650, 6,004,797, 및 9,504,762 참조, 각각의 내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다. 한 구현예에서, 삼중 형질감염 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,001,650 참조, 본원에 그 전체가 참조로 포함됨)을 사용하여 AAV 바이러스 입자를 생산한다. 이 방법은 감염성 헬퍼 바이러스를 사용할 필요가 없으므로 검출 가능한 헬퍼 바이러스 없이 AAV 바이러스 입자를 생성할 수 있다. 이는 AAV 바이러스 입자 생산을 위한 3개의 벡터, 즉 AAV 헬퍼 기능 벡터, 보조 기능 벡터, 및 AAV 바이러스 입자 발현 벡터를 사용하여 달성된다. 당업자는 그러나 이들 벡터에 의해 암호화되는 핵산 서열이 다양한 조합으로 2개 이상의 벡터에 제공될 수 있음을 인식할 것이다. 다른 구현예에서, 숙주 세포는 헬퍼 플라스미드 또는 헬퍼 바이러스, 바이러스 작제물 및 AAV cap 유전자를 암호화하는 플라스미드로 형질감염될 수 있으며; AAV 바이러스 입자는 공동-형질감염 후 다양한 시점에서 수집될 수 있다.
예를 들어, 야생형 AAV 및 헬퍼 바이러스가 AAV 바이러스 입자를 생산하는 데 필요한 복제 기능을 제공하는 데 사용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,139,941 참조, 그 전체가 본원에 참조로 포함됨). 대안적으로, 잘 알려진 헬퍼 바이러스 중 하나에 의한 감염과 함께 헬퍼 기능 유전자를 함유하는 플라스미드는 복제 기능의 공급원으로서 사용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,622,856 및 미국 특허 번호 5,139,941 참조, 둘 모두 그 전체가 본원에 참조로 포함됨). 유사하게, 보조 기능 유전자를 포함하는 플라스미드는 필요한 복제 기능을 제공하기 위해 야생형 AAV에 의한 감염과 함께 사용될 수 있다. 본원에 기술되고/되거나 당업계에 잘 알려진 다른 접근법이 또한 AAV 바이러스 입자를 생산하기 위해 당업자에 의해 사용될 수 있다.
다양한 구현예에서, 임의의 구현예의 배양 단계는 적어도 20 밀리리터(들) (mL), 적어도 50 mL, 적어도 100 mL, 적어도 500 mL, 적어도 1 리터 (L), 적어도 10 L, 적어도 50 L, 적어도 100L, 적어도 250 L, 적어도 500 L, 적어도 1000 L, 적어도 1500 L, 적어도 2000 L, 또는 적어도 2500 L의 부피에서 발생한다.
예에서, 배양 단계는 진탕 플라스크 또는 진탕 플라스크들에서 발생할 수 있다. 다양한 구현예에서, 임의의 구현예의 배양 단계는 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL, 100 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL, 500 mL, 600 mL, 700 mL, 800 mL, 900 mL, 1 L, 2 L, 3 L, 4 L, 또는 5 L의 부피에서 발생한다. 다른 구현예에서, 배양 단계의 부피는 상기 제공된 임의의 두 부피 사이의 범위이다.
다른 예에서, 배양 단계는 생물반응기 또는 생물 반응기들에서 발생할 수 있다. 다양한 구현예에서, 임의의 구현예의 배양 단계는 1 L, 2 L, 3 L, 4 L, 5 L, 6L, 7L, 8 L, 9 L, 10 L, 11 L, 12 L, 13 L, 14 L, 15 L, 16 L, 17 L, 18 L, 19 L, 20 L, 21 L, 22 L, 23 L, 24 L, 25 L, 26 L, 27 L, 28 L, 29 L, 30 L, 31 L, 32 L, 33 L, 34 L, 35 L, 36 L, 37 L, 38 L, 39 L, 40 L, 41 L, 42 L, 43 L, 44 L, 45 L, 46 L, 47 L, 48 L, 49 L, 50 L, 51 L, 52 L, 53 L, 54 L, 55 L, 56 L, 57 L, 58 L, 59 L, 60 L, 61 L, 62 L, 63 L, 64 L, 65 L, 66 L, 67 L, 68 L, 69 L, 70 L, 71 L, 72 L, 73 L, 74 L, 75 L, 76 L, 77 L, 78 L, 79 L, 80 L, 81 L, 82 L, 83 L, 84 L, 85 L, 86 L, 87 L, 88 L, 89 L, 90 L, 91 L, 92 L, 93 L, 94 L, 95 L, 96 L, 97 L, 98 L, 99 L, 100 L, 110 L, 120 L, 130 L, 140 L, 150 L, 160 L, 170 L, 180 L, 190 L, 200 L, 210 L, 220 L, 230 L, 240 L, 250 L, 260 L, 270 L, 280 L, 290 L, 300 L, 310 L, 320 L, 330 L, 340 L, 350 L, 360 L, 370 L, 380 L, 390 L, 400 L, 410 L, 420 L, 430 L, 440 L, 450 L, 460 L, 470 L, 480 L, 490 L, 500 L, 510 L, 520 L, 530 L, 540 L, 550 L, 560 L, 570 L, 580 L, 590 L, 600 L, 610 L, 620 L, 630 L, 640 L, 650 L, 660 L, 670 L, 680 L, 690 L, 700 L, 710 L, 720 L, 730 L, 740 L, 750 L, 760 L, 770 L, 780 L, 790 L, 800 L, 810 L, 820 L, 830 L, 840 L, 850 L, 860 L, 870 L, 880 L, 890 L, 900 L, 910 L, 920 L, 930 L, 940 L, 950 L, 960 L, 970 L, 980 L, 990 L, 1000 L, 1010 L, 1020 L, 1030 L, 1040 L, 1050 L, 1060 L, 1070 L, 1080 L, 1090 L, 1100 L, 1110 L, 1120 L, 1130 L, 1140 L, 1150 L, 1160 L, 1170 L, 1180 L, 1190 L, 1200 L, 1210 L, 1220 L, 1230 L, 1240 L, 1250 L, 1260 L, 1270 L, 1280 L, 1290 L, 1300 L, 1310 L, 1320 L, 1330 L, 1340 L, 1350 L, 1360 L, 1370 L, 1380 L, 1390 L, 1400 L, 1410 L, 1420 L, 1430 L, 1440 L, 1450 L, 1460 L, 1470 L, 1480 L, 1490 L, 1500 L, 1510 L, 1520 L, 1530 L, 1540 L, 1550 L, 1560 L, 1570 L, 1580 L, 1590 L, 1600 L, 1610 L, 1620 L, 1630 L, 1640 L, 1650 L, 1660 L, 1670 L, 1680 L, 1690 L, 1700 L, 1710 L, 1720 L, 1730 L, 1740 L, 1750 L, 1760 L, 1770 L, 1780 L, 1790 L, 1800 L, 1810 L, 1820 L, 1830 L, 1840 L, 1850 L, 1860 L, 1870 L, 1880 L, 1890 L, 1900 L, 1910 L, 1920 L, 1930 L, 1940 L, 1950 L, 1960 L, 1970 L, 1980 L, 1990 L, 2000 L, 2010 L, 2020 L, 2030 L, 2040 L, 2050 L, 2060 L, 2070 L, 2080 L, 2090 L, 2100 L, 2110 L, 2120 L, 2130 L, 2140 L, 2150 L, 2160 L, 2170 L, 2180 L, 2190 L, 2200 L, 2210 L, 2220 L, 2230 L, 2240 L, 2250 L, 2260 L, 2270 L, 2280 L, 2290 L, 2300 L, 2310 L, 2320 L, 2330 L, 2340 L, 2350 L, 2360 L, 2370 L, 2380 L, 2390 L, 2400 L, 2410 L, 2420 L, 2430 L, 2440 L, 2450 L, 2460 L, 2470 L, 2480 L, 2490 L, 2500 L, 2510 L, 2520 L, 2530 L, 2540 L, 2550 L, 2560 L, 2570 L, 2580 L, 2590 L, 2600 L, 2610 L, 2620 L, 2630 L, 2640 L, 2650 L, 2660 L, 2670 L, 2680 L, 2690 L, 2700 L, 2710 L, 2720 L, 2730 L, 2740 L, 2750 L, 2760 L, 2770 L, 2780 L, 2790 L, 2800 L, 2810 L, 2820 L, 2830 L, 2840 L, 2850 L, 2860 L, 2870 L, 2880 L, 2890 L, 2900 L, 2910 L, 2920 L, 2930 L, 2940 L, 2950 L, 2960 L, 2970 L, 2980 L, 2990 L, 또는 3000 L의 부피에서 발생한다. 다른 구현예에서, 배양 단계의 부피는 상기 제공된 임의의 2개 부피 사이의 범위이다.
용어 "벡터"는 플라스미드, 파지, 트랜스포손, 코스미드, 박미드, 미니 플라스미드 (예를 들어, 박테리아 요소가 없는 플라스미드), 도기본 DNA (예를 들어, 최소, 폐쇄 선형 작제물), 염색체, 바이러스, 비리온 (예를 들어, 바큘로바이러스)) 등과 같은 임의의 유전 요소를 지칭하며, 적절한 제어 요소와 결합될 때 복제가 가능하고 세포 간에 유전자 서열을 전달할 수 있는 것으로 이해된다. 본원에서 사용되는 "포유류 세포-적합성 벡터" 또는 "벡터"는 포유동물 또는 포유동물 세포의 생산적 형질전환 또는 형질감염이 가능한 핵산 분자를 지칭한다. 본원에서 사용되는 "곤충 세포-적합성 벡터" 또는 "벡터"는 곤충 또는 곤충 세포의 생산적 형질전환 또는 형질감염이 가능한 핵산 분자를 지칭한다. 예시적인 생물학적 벡터는 플라스미드, 선형 핵산 분자, 및 재조합 바이러스를 포함한다. 곤충 세포와 호환되는 한 모든 벡터를 사용할 수 있다. 벡터는 곤충 세포 게놈에 통합될 수 있지만 곤충 세포 내 벡터의 존재는 영구적일 필요는 없으며 일시적인 에피솜 벡터도 포함된다. 벡터는 예를 들어 세포의 화학적 처리, 전기천공 또는 감염과 같은 공지된 수단에 의해 도입될 수 있다. 벡터 및 이들의 사용 방법은 세포의 분자 공학에 대한 상기 인용된 참고문헌에 기재되어 있다.
세포가 rAAV 벡터 게놈을 생성하는 벡터는 하나 이상의 관심 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 삽입을 허용하기 위해 프로모터 및 프로모터 다운스트림의 제한 부위를 함유할 수 있으며, 여기서 프로모터 및 제한 부위는 5' AAV ITR의 다운스트림 및 3' AAV ITR의 업스트림에 위치한다. 벡터는 또한 제한 부위의 다운스트림 및 3' AAV ITR의 업스트림에 전사후 조절 요소를 함유할 수 있다. 바이러스 작제물은 제한 부위에 삽입되고 프로모터와 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 관심 단백질의 코딩 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 작제물은 하나 이상의 관심 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 삽입을 허용하기 위해 프로모터 및 프로모터의 다운스트림에 제한 부위를 추가로 포함하고, 여기서 프로모터 및 제한 부위는 5' AAV ITR의 다운스트림 및 3' AAV ITR의 업스트림에 위치한다. 일부 구현예에서, 바이러스 작제물은 제한 부위의 다운스트림 및 3' AAV ITR의 업스트림에 전사후 조절 요소를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 작제물은 제한 부위에 삽입되고 프로모터와 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 관심 단백질의 코딩 영역을 포함한다. 당업자가 인식하는 바와 같이, 본 출원에 개시된 AAV 벡터 중 임의의 하나는 rAAV 비리온을 생산하기 위한 바이러스 작제물로서 방법에서 사용될 수 있다.
용어 "AAV 헬퍼"는 생산적인 AAV 복제를 위해 차례로 기능하는 AAV 유전자 산물을 제공하기 위해 발현될 수 있는 AAV 유래 코딩 서열을 지칭한다. 따라서, AAV 헬퍼 기능은 주요 AAV 오픈 리딩 프레임 (ORF), rep 및 cap을 모두 포함한다. Rep 발현 산물은 무엇보다도 다음을 포함하는 많은 기능을 갖는 것으로 나타났다: DNA 복제의 AAV 기원의 인식, 결합 및 닉킹; DNA 헬리카제 활성; 및 AAV (또는 다른 이종) 프로모터로부터의 전사 조절. 캡시드 (Cap) 발현 산물은 필요한 패키징 기능을 제공한다. AAV 헬퍼 기능은 AAV 벡터 게놈에서 누락된 트랜스 AAV 기능을 보완하기 위해 본원에서 사용된다.
생산을 위해, AAV 헬퍼 기능을 가진 세포는 캡시드를 형성하기에 충분한 재조합 캡시드 단백질을 생산한다. 여기에는 적어도 VP1 및 VP3 단백질이 포함되지만, 보다 전형적으로는, 천연 AAV에서 발견되는 VP1, VP2 및 VP3 단백질 세 가지 모두가 포함된다. 캡시드 단백질의 서열은 숙주 세포에 의해 생성된 AAV 비리온의 혈청형을 결정한다. 본 발명에 유용한 캡시드는 1, 2, 3, 3B, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 혼합 혈청형을 포함하는 다수의 AAV 혈청형으로부터 유도된 것들을 포함한다 (예를 들어, 비천연 혼합 혈청형의 개시내용에 대해 미국 특허 번호 8,318,480 참조). 캡시드 단백질은 또한 돌연변이, 키메라 또는 셔플 단백질을 포함하는, 천연 VP1, VP2 및 VP3의 변이체일 수 있다. 캡시드 단백질은 rh.10 또는 AAV의 다양한 클레이드 내의 다른 하위 유형의 단백질일 수 있다; 예를 들어, 미국 특허 번호 7,906,111에 다양한 클레이드 및 하위유형이 개시되어 있다. 광범위한 구조 이용가능성 및 광범위한 특성화 때문에, 하기 개시된 예시적인 AAV 벡터는 혈청형 2로부터 유래된다. AAV 벡터의 구축 및 용도 및 상이한 혈청형의 AAV 단백질은 Chao 등, Mol. Ther. 2:619-623, 2000; Davidson 등, PNAS 97:3428-3432, 2000; Xiao 등, J. Virol. 72:2224-2232, 1998; Halbert 등, J. Virol. 74:1524-1532, 2000; Halbert 등, J. Virol. 75:6615-6624, 2001; 및 Auricchio 등, Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081, 2001에서 논의된다.
다양한 구현예에서, VP 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 적합한 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 다양한 구현예에서, Rep 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 진핵 프로모터와 같은 적합한 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 SV40 프로모터, CMV 프로모터, RSV 프로모터, UBC 프로모터, EF1A 프로모터, PGK 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, b-액틴 프로모터, TRE (Tet, Tet-On, Tet-Off) 프로모터, 큐메이트 제어 시스템 (CuR/CuO) (US2004/0205834 참조), 온도-유도 HSP70 프로모터, p5 프로모터, p10 프로모터, p19 프로모터, 및 p40 프로모터와 같은 진핵 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 또 다른 예에서, 뉴클레오티드 서열은 폴리헤드린 (Polh) 프로모터, ΔIE1 프로모터, p5 프로모터, p10 프로모터, p19 프로모터, p40 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 39K 프로모터, p6.9 프로모터, 및 orf46 프로모터와 같은 바큘로바이러스 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
생산을 위해, AAV 헬퍼 기능을 가진 세포는 Rep 단백질을 생산하여 rAAV 생산을 촉진한다. 적어도 하나의 큰 Rep 단백질 (Rep78 또는 Rep68)과 적어도 하나의 작은 Rep 단백질 (Rep52 및 Rep40)이 세포에서 발현될 때 감염성 입자가 생성될 수 있음이 밝혀졌다. 특정 구현예에서 Rep 78, Rep68, Rep52 및 Rep 40의 4개 모두가 발현된다. 대안적으로, Rep78 및 Rep52, Rep78 및 Rep40, Rep 68 및 Rep52, 또는 Rep68 및 Rep40이 발현된다. 아래 예는 Rep78/Rep52 조합의 사용을 입증한다. Rep 단백질은 AAV-2 또는 다른 혈청형에서 파생될 수 있다. 다양한 구현예에서, Rep 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 적합한 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 다양한 구현예에서, Rep 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 진핵 프로모터와 같은 적합한 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 SV40 프로모터, CMV 프로모터, RSV 프로모터, UBC 프로모터, EF1A 프로모터, PGK 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, b-액틴 프로모터, TRE (Tet, Tet-On, Tet-Off) 프로모터, 큐메이트 제어 시스템 (CuR/CuO) (US2004/0205834 참조), 및 온도-유도 HSP70 프로모터, p5 프로모터, p10 프로모터, p19 프로모터, 및 p40 프로모터와 같은 진핵 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 다른 예에서, 뉴클레오티드 서열은 폴리헤드린 (Polh) 프로모터, ΔIE1 프로모터, p5 프로모터, p10 프로모터, p19 프로모터, p40 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 39K 프로모터, p6.9 프로모터, 및 orf46 프로모터와 같은 바큘로바이러스 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, AAV cap 유전자는 플라스미드 또는 박미드에 존재한다. 플라스미드는 cap 유전자와 동일한 혈청형에 상응하거나 상응하지 않을 수 있는 AAV rep 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 임의의 AAV 혈청형의 cap 유전자 및/또는 rep 유전자.
AAV 헬퍼 기능을 가진 세포는 또한 캡시드 조립을 돕는, 조립 활성화 단백질 (AAP)을 생산할 수 있다. 다양한 구현예에서, AAP를 암호화하는 뉴클레오티드 적합한 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 진핵 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 다른 예에서, 뉴클레오티드 서열은 폴리헤드린 (Polh) 프로모터, ΔIE1 프로모터, p5 프로모터, p10 프로모터 p19 프로모터, p40 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 39K 프로모터, p6.9 프로모터, 및 orf46 프로모터와 같은 바큘로바이러스 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
용어 "비-AAV 헬퍼 기능"은 AAV가 복제에 의존하는 비-AAV 유래 바이러스 및/또는 세포 기능을 지칭한다. 따라서, 용어는 AAV 유전자 전사의 활성화, 단계 특이적 AAV mRNA 스플라이싱, AAV DNA 복제, Cap 발현 산물의 합성 및 AAV 캡시드 조립과 관련된 모이어티를 포함하여 AAV 복제에 필요한 단백질 및 RNA를 포착한다. 바이러스 기반 보조 기능은 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 (단순 헤르페스 바이러스 1형 제외) 및 백시니아 바이러스와 같은 알려진 헬퍼 바이러스에서 파생될 수 있다.
용어 "비-AAV 헬퍼 기능 벡터"는 일반적으로 보조 기능을 제공하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 지칭한다. 보조 기능 벡터는 적합한 숙주 세포로 형질감염될 수 있으며, 여기서 벡터는 숙주 세포에서 AAV 비리온 생산을 지원할 수 있다. 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 또는 백시니아 바이러스 입자와 같이 자연에 존재하는 감염성 바이러스 입자는 용어에서 명시적으로 제외된다. 따라서, 보조 기능 벡터는 플라스미드, 파지, 트랜스포손 또는 코스미드의 형태일 수 있다. 특히, 아데노바이러스 유전자의 완전 보체는 보조 헬퍼 기능에 필요하지 않다는 것이 입증되었다. 예를 들어, DNA 복제 및 후기 유전자 합성이 불가능한 아데노바이러스 돌연변이는 AAV 복제를 허용하는 것으로 나타났다. Ito 등, (1970) J. Gen. Virol. 9:243; Ishibashi 등, (1971) Virology 45:317. 유사하게, E2B 및 E3 영역 내의 돌연변이는 AAV 복제를 지원하는 것으로 나타났으며, 이는 E2B 및 E3 영역이 보조 기능 제공에 관여하지 않을 가능성이 있음을 나타낸다. Carter 등, (1983) Virology 126:505. 그러나 E1 영역에 결함이 있거나 E4 영역이 삭제된 아데노바이러스는 AAV 복제를 지원할 수 없다. 따라서, E1A 및 E4 영역은 직접 또는 간접적으로 AAV 복제에 필요할 수 있다. Laughlin 등, (1982). J. Virol. 41:868; Janik 등, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1925; Carter 등, (1983) Virology 126:505. 다른 특성화된 Ad 돌연변이는 다음을 포함한다: E1B (Laughlin 등 (1982), 상기; Janik 등 (1981), 상기; Ostrove 등, (1980) Virology 104:502); E2A (Handa 등, (1975) J. Gen. Virol. 29:239; Strauss 등, (1976) J. Virol. 17:140; Myers 등, (1980) J. Virol. 35:665; Jay 등, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2927; Myers 등, (1981) J. Biol. Chem. 256:567); E2B (Carter, Adeno-Associated Virus Helper Functions, I CRC Handbook of Parvoviruses (P. Tijssen ed., 1990)); E3 (Carter 등 (1983), 상기); 및 E4 (Carter 등 (1983), 상기; Carter (1995)). E1B 코딩 영역에서 돌연변이를 갖는 아데노바이러스에 의해 제공되는 보조 기능에 대한 연구는 상충되는 결과를 낳았지만, Samulski 등, (1988) J. Virol. 62:206-210, 최근 E1B55k는 AAV 비리온 생산에 필요한 반면, E1B19k는 그렇지 않다고 보고되었다. 또한, 국제 공개 WO 97/17458 및 Matshushita 등, (1998) Gene Therapy 5:938-945는 다양한 Ad 유전자를 암호화하는 보조 기능 벡터를 기술한다. 특히 바람직한 보조 기능 벡터는 아데노바이러스 VA RNA 코딩 영역, 아데노바이러스 E4 ORF6 코딩 영역, 아데노바이러스 E2A 72 kD 코딩 영역, 아데노바이러스 E1A 코딩 영역, 및 온전한 E1B55k 코딩 영역이 결여된 아데노바이러스 E1B 영역을 포함한다. 이러한 벡터는 국제 공개 번호 WO 01/83797에 기재되어 있다.
이종 단백질의 발현을 위한 곤충 세포의 사용은 벡터, 예를 들어, 곤충-세포 적합성 벡터와 같은 핵산을 이러한 세포에 도입하는 방법 및 이러한 세포를 배양에서 유지하는 방법과 같이 잘 문서화되어 있다. (예를 들어, METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, ed. Richard, Humana Press, N J (1995); O'Reilly 등, BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS, A LABORATORY MANUAL, Oxford Univ. Press (1994); Samulski 등, J. Vir. (1989) vol. 63, pp.3822-3828; Kajigaya 등, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA (1991) vol. 88, pp. 4646-4650; Ruffing 등, J. Vir. (1992) vol. 66, pp. 6922-6930; Kirnbauer 등, Vir. (1996) vol. 219, pp. 37-44; Zhao 등, Vir. (2000) vol. 272, pp. 382-393; 및 미국 특허 번호 6,204,059 참조). 일부 구현예에서, 곤충 세포에서 AAV를 암호화하는 핵산 작제물은 곤충 세포-적합성 벡터이다. "발현 벡터"는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용 요소를 포함한다; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포 또는 시험관 내 발현 시스템에 의해 공급될 수 있다. 발현 벡터는 코스미드, 플라스미드 (예를 들어, 네이키드 또는 리포솜에 포함됨), 인공 염색체, 및 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스와 같은 당업계에 공지된 모든 것들을 포함한다. 본원에서 사용되는 "곤충 세포-적합성 벡터" 또는 "벡터"는 곤충 또는 곤충 세포의 생산적 형질전환 또는 형질감염이 가능한 핵산 분자를 지칭한다. 예시적인 생물학적 벡터는 플라스미드, 선형 핵산 분자, 및 재조합 바이러스를 포함한다. 곤충 세포 적합성인 한 모든 벡터를 사용할 수 있다. 벡터는 곤충 세포 게놈에 통합될 수 있지만 곤충 세포 내 벡터의 존재는 영구적일 필요는 없으며 일시적인 에피솜 벡터도 포함된다. 벡터는 예를 들어 세포의 화학적 처리, 전기천공, 또는 감염과 같은 공지된 수단에 의해 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 바큘로바이러스, 바이러스 벡터, 또는 플라스미드이다. 더 바람직한 구현예에서, 벡터는 바큘로바이러스이고, 즉 작제물은 바큘로바이러스 벡터이다. 바큘로바이러스 벡터 및 이의 사용 방법은 곤충 세포의 분자 공학에 대한 상기 인용된 참고문헌에 기재되어 있다.
바큘로바이러스 셔틀 벡터 또는 박미드는 바큘로바이러스 생성에 사용된다. 박미드는 대장균과 같은 박테리아에서 큰 플라스미드로 번식한다. 곤충 세포에 형질 감염되면, 박미드는 바큘로바이러스를 생성한다.
일부 구현예에서, 배양 배지는 감염 또는 형질감염 배지 (예를 들어, AAV 바이러스 입자를 생산하는 숙주 세포가 유전자로 감염되거나 형질감염되는 배지 (감염 또는 형질감염 배지)이다.
또 다른 구현예에서, 배양 배지는 생산자 배지 (예를 들어, 숙주 세포가 AAV 바이러스 입자를 생산하는 배지)이다. 이러한 배지는 변형 이글 배지 (MEM), 둘베코 벼형 이글 배지 (DMEM), 미국 특허 번호 6,566,118에 기재된 것과 같은 맞춤 제제, 및 미국 특허 번호 6,723,551에 기재된 Sf-900 II SFM 배지를 포함하는 Life Technologies에 의해 생산된 배지를 제한 없이, 포함하며, 이들 각각은 특히 AAV 바이러스 입자의 생산에 사용하기 위한 맞춤형 배지 제제와 관련하여 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
rAAV 입자는 또한 다양한 구현예에서 개시된 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 일부 예에서, rAAV 입자는 rAAV 입자 생산에 필요한 일부 구성 요소를 안정적으로 발현하는 곤충 또는 포유동물 세포를 사용하여 생산할 수 있다. 예를 들어, AAV rep 및 cap 유전자 및 네오마이신 내성 유전자와 같은 선별 마커를 포함하는 플라스미드 (또는 다중 플라스미드)는 세포의 게놈으로 통합될 수 있다. 또 다른 예에서, 네오마이신 내성 유전자와 같은 선별 마커를 포함하는 플라스미드 (또는 다중 플라스미드)는 세포의 게놈으로 통합될 수 있다. 그런 다음 곤충, 진균 또는 포유류 세포는 헬퍼바이러스 (예를 들어, 헬퍼 기능을 제공하는 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스) 및 5' 및 3' AAV ITR을 포함하는 바이러스 벡터 (및 바람직한 경우, 이종 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열)로 공동 감염될 수 있다. 이 방법의 장점은 세포가 선택 가능하고 rAAV의 대규모 생산에 적합하다는 것이다. 다른 비제한적 예로서, 패키징 세포에 숙주 조절 유전자, rep 유전자 및 cap 유전자를 도입하기 위해 플라스미드보다는 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스를 사용할 수 있다.
숙주 세포
숙주 세포는 AAV 바이러스 입자의 생산을 허용하고 배양에서 유지될 수 있는 임의의 무척추동물 또는 척추동물 세포 유형일 수 있다.
한 구현예에서, 숙주 세포는 곤충 세포 또는 포유동물 세포이다.
또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 곤충 세포이다.
또 다른 구현예에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다.
또 다른 구현예에서, 포유동물 세포는 HEK293, HeLa, CHO, NSO, SP2/0, PER.C6, Vera, RD, BHK, HT 1080, A549, Cos-7, ARPE-19 또는 MRC-5 세포이다.
일부 구현예에서, 곤충 세포는 스포돕테라 프루기페르다, 예를 들어 Sf9, Sf21, Sf900+, 초파리 세포주, 모기 세포주, 예를 들어, 아에데스 알보픽투스 유래 세포주, 국내 누에 세포주, 예를 들어, 봄믹스모리 세포주, 하이 파이브 세포와 같은 트리코프루시아 니 세포주 또는 아스칼라파 오도라타 세포주와 같은 나비목 세포주로부터 유래한다. 바람직한 곤충 세포는 하이 파이브, Sf9, Se301, SeIZD2109, SeUCRl, Sf900+, Sf21, BTI-TN-5B 1-4, MG-1, Tn368, HzAml, BM-N, Ha2302, Hz2E5 및 Ao38을 포함하는 바큘로바이러스 감염에 민감한 곤충 종으로부터의 세포이다.
AAV 혈청형
표 2에 나타낸 바와 같이 특성화된 적어도 13개의 AAV 혈청형이 있다. 본 발명은 이러한 특정 AAV 혈청형을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
표 2. AAV 혈청형.
AAV의 일반 정보 및 검토는 예를 들어, Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pp. 169-228, 및 Berns, 1990, Virology, pp. 1743-1764, Raven Press, (New York)에서 찾을 수 있다. 그러나 다양한 혈청형이 유전적 수준에서도 구조적으로나 기능적으로 매우 밀접하게 관련되어 있다는 것이 잘 알려졌기 때문에 이러한 동일한 원칙이 추가 AAV 혈청형에 적용될 것으로 완전히 예상된다. (예를 들어, Blacklowe, 1988, Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed.의 pp. 165-174; 및 Rose, Comprehensive Virology 3:1-61 (1974) 참조). 예를 들어, 모든 AAV 혈청형은 분명히 상동성 rep 유전자에 의해 매개되는 매우 유사한 복제 특성을 나타내고; 그리고 모두 AAV-6에서 발현되는 것과 같은 3개의 관련 캡시드 단백질을 가지고 있다. 관련성의 정도는 게놈의 길이를 따라 혈청형 사이의 광범위한 교차 혼성화를 나타내는 이종이중체 분석에 의해 추가로 제안된다; ITR에 해당하는 말단에 유사한 자체 어닐링 세그먼트가 존재한다. 유사한 감염성 패턴은 또한 각 혈청형의 복제 기능이 유사한 조절 제어하에 있음을 시사한다.
AAV "rep" 및 "cap" 유전자는 각각 복제 및 캡슐화 단백질을 암호화하는 유전자이다. AAV rep 및 cap 유전자는 조사된 모든 AAV 혈청형에서 발견되었으며 본원 및 인용된 참조문헌에 기술되어 있다. 야생형 AAV에서, rep 및 cap 유전자는 일반적으로 바이러스 게놈에서 서로 인접하여 발견되며 (즉, 이들은 인접하거나 중복되는 전사 단위로서 함께 "결합"되며), 일반적으로 AAV 혈청형 사이에서 보존된다. AAV rep 및 cap 유전자는 또한 개별적으로 그리고 총칭하여 "AAV 패키징 유전자"라고 한다. 본 발명에 따른 AAV cap 유전자는 rep 및 아데노 헬퍼 기능의 존재하에 AAV 벡터를 패키징할 수 있고 표적 세포 수용체에 결합할 수 있는 Cap 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, AAV cap 유전자는 특정 AAV 혈청형, 예를 들어 표 2에 나타낸 혈청형으로부터 유래거나; 또는 포유동물 예를 들어, 인간, 개코원숭이, 돼지, 마모셋, 침팬지, 또는 마카크 (예를 들어, 레수스 (마카카 물라타), 시노몰구스 ("긴 꼬리") (M. 파시큘라리스), 또는 피그테일 (M. 네메스트리나))에서 발견되는 AAV의 대체 캡시드 변이체 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질을 암호화한다.
AAV 생산에 사용되는 AAV 서열은 임의의 AAV 혈청형의 게놈으로부터 유래될 수 있다. AAV 혈청형은 아미노산 및 핵산 수준에서 상당한 상동성의 게놈 서열을 가질 수 있고, 유사한 유전적 기능 세트를 제공하고, 본질적으로 물리적 및 기능적으로 동등한 비리온을 생성하고, 실질적으로 동일한 메커니즘에 의해 복제 및 조립할 수 있다. 예를 들어, GenBank 수탁 번호 U89790; GenBank 수탁 번호 J01901; GenBank 수탁 번호 AF043303; GenBank 수탁 번호 AF085716; Chlorini 등, J. Vir. 71: 6823-33 (1997); Srivastava 등, J. Vir. 45:555-64 (1983); Chlorini 등, J. Vir. 73:1309-1319 (1999); Rutledge 등, J. Vir. 72:309-319 (1998); 및 Wu 등, J. Vir. 74: 8635-47 (2000) 참조, 이는 AAV 혈청형의 게놈 서열 및/또는 게놈 유사성에 대한 논의를 위해 본원에 참조로 포함된다.
많은 알려진 AAV 혈청형의 게놈 조직은 매우 유사할 수 있다. AAV의 게놈은 길이가 약 5,000개 뉴클레오티드 (nt) 미만인 선형, 단일 가닥 DNA 분자이다. 역위 말단 반복 (ITR)은 비-구조적 복제 (Rep) 단백질 및 구조적 (VP) 단백질에 대한 고유한 코딩 뉴클레오티드 서열 측면에 있다. VP 단백질은 캡시드를 형성한다. 말단 145 nt는 자기 상보적이며 T자형 헤어핀을 형성하는 에너지적으로 안정한 분자 내 듀플렉스가 형성될 수 있도록 구성된다. 이러한 헤어핀 구조는 세포 DNA 중합효소 복합체의 프라이머 역할을 하는 바이러스 DNA 복제의 기점으로서 기능을 한다. Rep 유전자는 Rep 단백질, Rep78, Rep68, Rep52, 및 Rep40을 암호화한다. Rep78 및 Rep68은 p5 프로모터로부터 전사되고, Rep 52 및 Rep40은 p19 프로모터로부터 전사된다. cap 유전자는 VP 단백질, VP1, VP2, 및 VP3를 암호화한다. cap 유전자는 p40 프로모터로부터 전사된다.
다양한 구현예에서, AAV 헬퍼 기능을 제공하는 벡터는 캡시드 단백질, Rep 단백질, 또는 AAP 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열(들)을 포함한다. 임의의 AAV 혈청형 (AAV1 (NCBI 참조 서열 번호/Genbank 수탁 번호 NC_002077.1), AAV2 (NCBI 참조 서열 번호/Genbank 수탁 번호 NC_001401.2), AAV3 (NCBI 참조 서열 번호/Genbank 수탁 번호 NC_001729.1), AAV3B (NCBI 참조 서열 번호/Genbank 수탁 번호 AF028705.1), AAV4 (NCBI 참조 서열 번호/Genbank 수탁 번호 NC_001829.1), AAV5 (NCBI 참조 서열 번호/Genbank 수탁 번호 NC_006152.1), AAV6 (NCBI 참조 서열 번호/Genbank 수탁 번호 AF028704.1), AAV7 (NCBI 참조 서열 번호/Genbank 수탁 번호 NC_006260.1), AAV8 (NCBI 참조 서열 번호/Genbank 수탁 번호 NC_006261.1), AAV9 (NCBI 참조 서열 번호/Genbank 수탁 번호 AX753250.1), AAV10 (NCBI 참조 서열 번호/Genbank 수탁 번호 AY631965.1), AAV11 (NCBI 참조 서열 번호/Genbank 수탁 번호 AY631966.1), AAV12 (NCBI 참조 서열 번호/Genbank 수탁 번호 DQ813647.1), AAV13 (NCBI 참조 서열 번호/Genbank 수탁 번호 EU285562.1)을 포함하지만, 이제 제한되지 않음)의 cap 유전자, rep 유전자, 및/또는 AAP 유전자는 AAV-rh.10 (AAVrh10), AAV-DJ (AAVDJ), AAV-DJ8 (AAVDJ8), AAV-1, AAV-2, AAV-2G9, AAV-3, AAV3a, AAV3b, AAV3-3, AAV4, AAV4-4, AAV-5, AAV-6, AAV6.1, AAV6.2, AAV6.1.2, AAV-7, AAV7.2, AAV8, AAV9, AAV9.11, AAV9.13, AAV9.16, AAV9.24, AAV9.45, AAV9.47, AAV9.61, AAV9.68, AAV9.84, AAV9.9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV16.3, AAV24.1, AAV27.3, AAV42.12, AAV42-1b, AAV42-2, AAV42-3a, AAV42-3b, AAV42-4, AAV42-5a, AAV42-5b, AAV42-6b, AAV42-8, AAV42-10, AAV42-11, AAV42-12, AAV42-13, AAV42-15, AAV42-aa, AAV43-1, AAV43-12, AAV43-20, AAV43-21, AAV43-23, AAV43-25, AAV43-5, AAV44.1, AAV44.2, AAV44.5, AAV223.1, AAV223.2, AAV223.4, AAV223.5, AAV223.6, AAV223.7, AAV1-7/rh.48, AAV1-8/rh.49, AAV2-15/rh.62, AAV2-3/rh.61, AAV2-4/rh.50, AAV2-5/rh.51, AAV3.1/hu.6, AAV3.1/hu.9, AAV3-9/rh.52, AAV3-11/rh.53, AAV4-8/r11.64, AAV4-9/rh.54, AAV4-19/rh.55, AAV5-3/rh.57, AAV5-22/rh.58, AAV7.3/hu.7, AAV16.8/hu.10, AAV16.12/hu.11, AAV29.3/bb.1, AAV29.5/bb.2, AAV106.1/hu.37, AAV114.3/hu.40, AAV127.2/hu.41, AAV127.5/hu.42, AAV128.3/hu.44, AAV130.4/hu.48, AAV145.1/hu.53, AAV145.5/hu.54, AAV145.6/hu.55, AAV161.10/hu.60, AAV161.6/hu.61, AAV33.12/hu.17, AAV33.4/hu.15, AAV33.8/hu.16, AAV52/hu.19, AAV52.1/hu.20, AAV58.2/hu.25, AAVA3.3, AAVA3.4, AAVA3.5, AAVA3.7, AAVC1, AAVC2, AAVC5, AAVF3, AAVF5, AAVH2, AAVrh.72, AAVhu.8, AAVrh.68, AAVrh.70, AAVpi.1, AAVpi.3, AAVpi.2, AAVrh.60, AAVrh.44, AAVrh.65, AAVrh.55, AAVrh.47, AAVrh.69, AAVrh.45, AAVrh.59, AAVhu.12, AAVH6, AAVLK03, AAVH-1/hu.1, AAVH-5/hu.3, AAVLG-10/rh.40, AAVLG-4/rh.38, AAVLG-9/hu.39, AAVN721-8/rh.43, AAVCh.5, AAVCh.5R1, AAVcy.2, AAVcy.3, AAVcy.4, AAVcy.5, AAVCy.5R1, AAVCy.5R2, AAVCy.5R3, AAVCy.5R4, AAVcy.6, AAVhu.1, AAVhu.2, AAVhu.3, AAVhu.4, AAVhu.5, AAVhu.6, AAVhu.7, AAVhu.9, AAVhu.10, AAVhu.11, AAVhu.13, AAVhu.15, AAVhu.16, AAVhu.17, AAVhu.18, AAVhu.20, AAVhu.21, AAVhu.22, AAVhu.23.2, AAVhu.24, AAVhu.25, AAVhu.27, AAVhu.28, AAVhu.29, AAVhu.29R, AAVhu.31, AAVhu.32, AAVhu.34, AAVhu.35, AAVhu.37, AAVhu.39, AAVhu.40, AAVhu.41, AAVhu.42, AAVhu.43, AAVhu.44, AAVhu.44R1, AAVhu.44R2, AAVhu.44R3, AAVhu.45, AAVhu.46, AAVhu.47, AAVhu.48, AAVhu.48R1, AAVhu.48R2, AAVhu.48R3, AAVhu.49, AAVhu.51, AAVhu.52, AAVhu.54, AAVhu.55, AAVhu.56, AAVhu.57, AAVhu.58, AAVhu.60, AAVhu.61, AAVhu.63, AAVhu.64, AAVhu.66, AAVhu.67, AAVhu.14/9, AAVhu.t 19, AAVrh.2, AAVrh.2R, AAVrh.8, AAVrh.8R, AAVrh.12, AAVrh.13, AAVrh.13R, AAVrh.14, AAVrh.17, AAVrh.18, AAVrh.19, AAVrh.20, AAVrh.21, AAVrh.22, AAVrh.23, AAVrh.24, AAVrh.25, AAVrh.31, AAVrh.32, AAVrh.33, AAVrh.34, AAVrh.35, AAVrh.36, AAVrh.37, AAVrh.37R2, AAVrh.38, AAVrh.39, AAVrh.40, AAVrh.46, AAVrh.48, AAVrh.48.1, AAVrh.48.1.2, AAVrh.48.2, AAVrh.49, AAVrh.51, AAVrh.52, AAVrh.53, AAVrh.54, AAVrh.56, AAVrh.57, AAVrh.58, AAVrh.61, AAVrh.64, AAVrh.64R1, AAVrh.64R2, AAVrh.67, AAVrh.73, AAVrh.74, AAVrh8R, AAVrh8R A586R 돌연변이, AAVrh8R R533A 돌연변이, AAAV, BAAV, 염소 AAV, 소 AAV, AAVhE1.1, AAVhEr1.5, AAVhER1.14, AAVhEr1.8, AAVhEr1.16, AAVhEr1.18, AAVhEr1.35, AAVhEr1.7, AAVhEr1.36, AAVhEr2.29, AAVhEr2.4, AAVhEr2.16, AAVhEr2.30, AAVhEr2.31, AAVhEr2.36, AAVhER1.23, AAVhEr3.1, AAV2.5T, AAV-PAEC, AAV-LK01, AAV-LK02, AAV-LK03, AAV-LK04, AAV-LK05, AAV-LK06, AAV-LK07, AAV-LK08, AAV-LK09, AAV-LK10, AAV-LK11, AAV-LK12, AAV-LK13, AAV-LK14, AAV-LK15, AAV-LK16, AAV-LK17, AAV-LK18, AAV- LK19, AAV-PAEC2, AAV-PAEC4, AAV-PAEC6, AAV-PAEC7, AAV-PAEC8, AAV-PAEC11, AAV-PAEC12, AAV-2-프리-miRNA-101 , AAV-8h, AAV-8b, AAV-h, AAV-b, AAV SM 10-2 , AAV 셔플 100-1 , AAV 셔플 100-3, AAV 셔플 100-7, AAV 셔플 10-2, AAV 셔플 10-6, AAV 셔플 10-8, AAV 셔플 100-2, AAV SM 10-1, AAV SM 10-8 , AAV SM 100-3, AAV SM 100-10, BNP61 AAV, BNP62 AAV, BNP63 AAV, AAVrh.50, AAVrh.43, AAVrh.62, AAVrh.48, AAVhu.19, AAVhu.11, AAVhu.53, AAV4-8/rh.64, AAVLG-9/hu.39, AAV54.5/hu.23, AAV54.2/hu.22, AAV54.7/hu.24, AAV54.1/hu.21, AAV54.4R/hu.27, AAV46.2/hu.28, AAV46.6/hu.29, AAV128.1/hu.43, 진정형 AAV (ttAAV), UPENN AAV10, 또는 일본 AAV10 혈청형, AAV_po.6, AAV_po., AAV_po.5, AAV_LK03, AAV_ra.1, AAV_bat_YNM, AAV_bat_Brazil, AAV_mo.1, AAV_avian_DA-1, 또는 AAV_mouse_NY1, Bba21, Bba26, Bba27, Bba29, Bba30, Bba31, Bba32, Bba33, Bba34, Bba35, Bba36, Bba37, Bba38, Bba41, Bba42, Bba43, Bba44, Bce14, Bce15, Bce16, Bce17, Bce18, Bce20, Bce35, Bce36, Bce39, Bce40, Bce41, Bce42, Bce43, Bce44, Bce45, Bce46, Bey20, Bey22, Bey23, Bma42, Bma43, Bpo1, Bpo2, Bpo3, Bpo4, Bpo6, Bpo8, Bpo13, Bpo18, Bpo20, Bpo23, Bpo24, Bpo27, Bpo28, Bpo29, Bpo33, Bpo35, Bpo36, Bpo37, Brh26, Brh27, Brh28, Brh29, Brh30, Brh31, Brh32, Brh33, Bfm17, Bfm18, Bfm20, Bfm21, Bfm24, Bfm25, Bfm27, Bfm32, Bfm33, Bfm34, Bfm35, AAV-rh10, AAV-rh39, AAV-rh43, AAVanc80L65, 또는 이들의 변이체)은 재조합 AAV를 생산하기 위해 본원에서 사용될 수 있다. 예시적인 캡시드는 또한 국제 출원 번호 WO 2018/022608 및 WO 2019/222136에 제공되며, 이들은 그 전체가 본원에 포함된다. 위에서 제공된 각각의 NCBI 참조 서열 번호 또는 Genbank 수탁 번호는 또한 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, AAV cap 유전자는 혈청형 1, 혈청형 2, 혈청형 3, 혈청형 3B, 혈청형 4, 혈청형 5, 혈청형 6, 혈청형 7, 혈청형 8, 혈청형 9, 혈청형 10, 혈청형 11, 혈청형 12, 혈청형 13, 또는 이의 변이체로부터의 캡시드를 암호화한다.
캡시드, Rep, 및 AAP 유전자에 더하여, 구현예는 헬퍼 단백질을 발현하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 제한 없이, 다양한 조합의 숙주 세포에서 발현될 수 있는 헬퍼 유전자 산물은 스포도프테라 프루기페르다 FKBP46, 인간 FKBP52, 아데노바이러스 E1A, E1B, E2A, E4 및 VA, 단순포진 헤르페스 바이러스 UL29, UL30, UL42, Ul5, UL8, UL52, 및 UL9을 포함한다. 한 구현예에서, 세포는 적어도 하나의 면역필린 유사체 (즉, 면역필린 또는 유사한 단백질) 및 적어도 하나의 헬퍼 바이러스 유전자 산물을 발현한다.
일부 구현예에서, 3개의 AAV 캡시드 단백질, 즉 VP1, VP2, 및 VP3는 대체 전사 mRNA 스플라이싱 및 대체 번역 시작 코돈 용법을 사용하여 cap 오픈 리딩 프레임 (ORF)으로부터 중첩 방식으로 생산된다. 예를 들어, VP1은 mRNA의 ATG 시작 코돈 (아미노산 M1)에서 번역될 수 있는 반면, VP2 및 VP3는 예를 들어, VP2 생산을 위한 상이한 시작 코돈 및 VP3의 생산을 위한 다음으로 이용 가능한 번역초과 번역을 사용하여 더 짧은 mRNA로부터 발생할 수 있다.
Cap 단백질은 VP1 및 VP3, 또는 VP1, VP2, 및 VP3일 수 있다. VP1, VP2 또는 VP3 유전자는 AAV 혈청형 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV-rh.10 (AAVrh10), AAV-DJ (AAVDJ), AAV-DJ8 (AAVDJ8), AAV-1, AAV-2, AAV-2G9, AAV-3, AAV3a, AAV3b, AAV3-3, AAV4, AAV4-4, AAV-5, AAV-6, AAV6.1, AAV6.2, AAV6.1.2, AAV-7, AAV7.2, AAV8, AAV9, AAV9.11, AAV9.13, AAV9.16, AAV9.24, AAV9.45, AAV9.47, AAV9.61, AAV9.68, AAV9.84, AAV9.9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV16.3, AAV24.1, AAV27.3, AAV42.12, AAV42-1b, AAV42-2, AAV42-3a, AAV42-3b, AAV42-4, AAV42-5a, AAV42-5b, AAV42-6b, AAV42-8, AAV42-10, AAV42-11, AAV42-12, AAV42-13, AAV42-15, AAV42-aa, AAV43-1, AAV43-12, AAV43-20, AAV43-21, AAV43-23, AAV43-25, AAV43-5, AAV44.1, AAV44.2, AAV44.5, AAV223.1, AAV223.2, AAV223.4, AAV223.5, AAV223.6, AAV223.7, AAV1-7/rh.48, AAV1-8/rh.49, AAV2-15/rh.62, AAV2-3/rh.61, AAV2-4/rh.50, AAV2-5/rh.51, AAV3.1/hu.6, AAV3.1/hu.9, AAV3-9/rh.52, AAV3-11/rh.53, AAV4-8/r11.64, AAV4-9/rh.54, AAV4-19/rh.55, AAV5-3/rh.57, AAV5-22/rh.58, AAV7.3/hu.7, AAV16.8/hu.10, AAV16.12/hu.11, AAV29.3/bb.1, AAV29.5/bb.2, AAV106.1/hu.37, AAV114.3/hu.40, AAV127.2/hu.41, AAV127.5/hu.42, AAV128.3/hu.44, AAV130.4/hu.48, AAV145.1/hu.53, AAV145.5/hu.54, AAV145.6/hu.55, AAV161.10/hu.60, AAV161.6/hu.61, AAV33.12/hu.17, AAV33.4/hu.15, AAV33.8/hu.16, AAV52/hu.19, AAV52.1/hu.20, AAV58.2/hu.25, AAVA3.3, AAVA3.4, AAVA3.5, AAVA3.7, AAVC1, AAVC2, AAVC5, AAVF3, AAVF5, AAVH2, AAVrh.72, AAVhu.8, AAVrh.68, AAVrh.70, AAVpi.1, AAVpi.3, AAVpi.2, AAVrh.60, AAVrh.44, AAVrh.65, AAVrh.55, AAVrh.47, AAVrh.69, AAVrh.45, AAVrh.59, AAVhu.12, AAVH6, AAVLK03, AAVH-1/hu.1, AAVH-5/hu.3, AAVLG-10/rh.40, AAVLG-4/rh.38, AAVLG-9/hu.39, AAVN721-8/rh.43, AAVCh.5, AAVCh.5R1, AAVcy.2, AAVcy.3, AAVcy.4, AAVcy.5, AAVCy.5R1, AAVCy.5R2, AAVCy.5R3, AAVCy.5R4, AAVcy.6, AAVhu.1, AAVhu.2, AAVhu.3, AAVhu.4, AAVhu.5, AAVhu.6, AAVhu.7, AAVhu.9, AAVhu.10, AAVhu.11, AAVhu.13, AAVhu.15, AAVhu.16, AAVhu.17, AAVhu.18, AAVhu.20, AAVhu.21, AAVhu.22, AAVhu.23.2, AAVhu.24, AAVhu.25, AAVhu.27, AAVhu.28, AAVhu.29, AAVhu.29R, AAVhu.31, AAVhu.32, AAVhu.34, AAVhu.35, AAVhu.37, AAVhu.39, AAVhu.40, AAVhu.41, AAVhu.42, AAVhu.43, AAVhu.44, AAVhu.44R1, AAVhu.44R2, AAVhu.44R3, AAVhu.45, AAVhu.46, AAVhu.47, AAVhu.48, AAVhu.48R1, AAVhu.48R2, AAVhu.48R3, AAVhu.49, AAVhu.51, AAVhu.52, AAVhu.54, AAVhu.55, AAVhu.56, AAVhu.57, AAVhu.58, AAVhu.60, AAVhu.61, AAVhu.63, AAVhu.64, AAVhu.66, AAVhu.67, AAVhu.14/9, AAVhu.t 19, AAVrh.2, AAVrh.2R, AAVrh.8, AAVrh.8R, AAVrh.12, AAVrh.13, AAVrh.13R, AAVrh.14, AAVrh.17, AAVrh.18, AAVrh.19, AAVrh.20, AAVrh.21, AAVrh.22, AAVrh.23, AAVrh.24, AAVrh.25, AAVrh.31, AAVrh.32, AAVrh.33, AAVrh.34, AAVrh.35, AAVrh.36, AAVrh.37, AAVrh.37R2, AAVrh.38, AAVrh.39, AAVrh.40, AAVrh.46, AAVrh.48, AAVrh.48.1, AAVrh.48.1.2, AAVrh.48.2, AAVrh.49, AAVrh.51, AAVrh.52, AAVrh.53, AAVrh.54, AAVrh.56, AAVrh.57, AAVrh.58, AAVrh.61, AAVrh.64, AAVrh.64R1, AAVrh.64R2, AAVrh.67, AAVrh.73, AAVrh.74, AAVrh8R, AAVrh8R A586R 돌연변이, AAVrh8R R533A 돌연변이, AAAV, BAAV, 염소 AAV, 소 AAV, AAVhE1.1, AAVhEr1.5, AAVhER1.14, AAVhEr1.8, AAVhEr1.16, AAVhEr1.18, AAVhEr1.35, AAVhEr1.7, AAVhEr1.36, AAVhEr2.29, AAVhEr2.4, AAVhEr2.16, AAVhEr2.30, AAVhEr2.31, AAVhEr2.36, AAVhER1.23, AAVhEr3.1, AAV2.5T, AAV-PAEC, AAV-LK01, AAV-LK02, AAV-LK03, AAV-LK04, AAV-LK05, AAV-LK06, AAV-LK07, AAV-LK08, AAV-LK09, AAV-LK10, AAV-LK11, AAV-LK12, AAV-LK13, AAV-LK14, AAV-LK15, AAV-LK16, AAV-LK17, AAV-LK18, AAV- LK19, AAV-PAEC2, AAV-PAEC4, AAV-PAEC6, AAV-PAEC7, AAV-PAEC8, AAV-PAEC11, AAV-PAEC12, AAV-2-프리-miRNA-101 , AAV-8h, AAV-8b, AAV-h, AAV-b, AAV SM 10-2 , AAV 셔플 100-1 , AAV 셔플 100-3, AAV 셔플 100-7, AAV 셔플 10-2, AAV 셔플 10-6, AAV 셔플 10-8, AAV 셔플 100-2, AAV SM 10-1, AAV SM 10-8 , AAV SM 100-3, AAV SM 100-10, BNP61 AAV, BNP62 AAV, BNP63 AAV, AAVrh.50, AAVrh.43, AAVrh.62, AAVrh.48, AAVhu.19, AAVhu.11, AAVhu.53, AAV4-8/rh.64, AAVLG-9/hu.39, AAV54.5/hu.23, AAV54.2/hu.22, AAV54.7/hu.24, AAV54.1/hu.21, AAV54.4R/hu.27, AAV46.2/hu.28, AAV46.6/hu.29, AAV128.1/hu.43, 진정형 AAV (ttAAV), UPENN AAV10, 또는 일본 AAV10 혈청형, AAV_po.6, AAV_po., AAV_po.5, AAV_LK03, AAV_ra.1, AAV_bat_YNM, AAV_bat_Brazil, AAV_mo.1, AAV_avian_DA-1, 또는 AAV_mouse_NY1, Bba21, Bba26, Bba27, Bba29, Bba30, Bba31, Bba32, Bba33, Bba34, Bba35, Bba36, Bba37, Bba38, Bba41, Bba42, Bba43, Bba44, Bce14, Bce15, Bce16, Bce17, Bce18, Bce20, Bce35, Bce36, Bce39, Bce40, Bce41, Bce42, Bce43, Bce44, Bce45, Bce46, Bey20, Bey22, Bey23, Bma42, Bma43, Bpo1, Bpo2, Bpo3, Bpo4, Bpo6, Bpo8, Bpo13, Bpo18, Bpo20, Bpo23, Bpo24, Bpo27, Bpo28, Bpo29, Bpo33, Bpo35, Bpo36, Bpo37, Brh26, Brh27, Brh28, Brh29, Brh30, Brh31, Brh32, Brh33, Bfm17, Bfm18, Bfm20, Bfm21, Bfm24, Bfm25, Bfm27, Bfm32, Bfm33, Bfm34, Bfm35, AAV-rh10, AAV-rh39, AAV-rh43, 또는 AAVanc80L65의 캡시드 단백질을 발현할 수 있다. 또 다른 구현예에서, VP1, VP2, 또는 VP3 유전자는 VP1, VP2, 및 VP3 유전자 모두가 동일한 혈청형에서 유래하지 않은 혼합 혈청형의 캡시드를 발현한다. 예시적인 캡시드는 그 전체가 본원에 포함된 국제 출원 번호 WO 2018/022608에 제공되어 있다.
바큘로바이러스 비리온
일부 구현예에서, 바큘로바이러스 시스템이 사용된다.
바큘로바이러스는 절지동물의 외피 DNA 바이러스이며, 이의 두 구성원은 세포 배양에서 재조합 단백질을 생산하는 것으로 잘 알려졌다. 바큘로바이러스는 특정 세포에 큰 게놈 내용물을 전달할 수 있도록 조작할 수 있는 원형 이중 가닥 게놈 (80-200 kbp)을 가지고 있다. 벡터로 사용되는 바이러스는 일반적으로 오토그라파 칼리포니카 멀티캡시드 핵다각체 바이러스 (AcMNPV) 또는 봄빅스 모리 (Bm)NPV)이다.
바큘로바이러스는 일반적으로 재조합 단백질의 발현을 위한 곤충 세포의 감염에 사용된다. 특히, 곤충에서 이종 유전자의 발현은 예를 들어 미국 특허 번호 4,745,051; Friesen 등 (1986); EP 127,839; 및 EP 155,476에 기재된 바와 같이 달성될 수 있다. 단백질 생산에 사용될 수 있는 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체 및 상응하는 허용 곤충 숙주 세포가 당업계에 공지되어 있다.
예를 들어, 시판되는 Bac-to-Bac® 시스템 (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) (카탈로그 번호 10359016)은 재조합 단백질 발현을 위한 발현 벡터를 포함한다. pFastBac™ 1 벡터 (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)는 높은 수준의 단백질 발현을 위한 강력한 폴리헤드린 프로모터와 단순화된 클로닝을 위한 대규모 다중 클로닝 부위를 가지고 있다. pFastBac™ 듀얼 (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)은 곤충 세포에서 2개의 단백질을 동시에 발현하기 위한 단일 벡터에서 2개의 강력한 프로모터, 폴리헤드린 프로모터 및 p10 프로모터를 특징으로 하는 단일 벡터이다.
간단히 설명하자면, Bac-to-Bac®과 같은 바큘로바이러스 시스템은 곤충 세포에서의 상동 재조합보다는 대장균에서 부위 특이적 전위에 의한 재조합 바큘로바이러스의 생성에 의존한다. 예를 들어, 관심 유전자를 pFastBac™ 벡터에 클로닝하고 DH10Bac™ 적격 대장균 (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)으로 형질전환할 수 있다. DH10Bac™은 lacZ-미니-attTn7 융합이 있는 부모 박미드를 함유한다. 헬퍼 플라스미드에 의해 제공되는 전위 단백질의 존재하에 pFastBac™ 벡터와 부모 박미드 요소 사이에서 전위가 발생한다. 전위가 성공하면, 발현 카세트는 lacZ 유전자를 방해하고 새로운 발현 박미드는 흰색 박테리아 콜로니로 시각화될 수 있다. 새로운 발현 박미드는 단리되고 임의의 구현예의 형질감염 시약을 사용하여 예를 들어, Sf9 또는 Sf21 세포를 형질감염시키는 데 사용될 수 있다. 적절한 배양 시간이 지나면, 재조합 바큘로바이러스를 단리할 수 있다. 재조합 바큘로바이러스는 세포를 감염시켜 AAV 바이러스 입자를 생산하고/하거나 관심 유전자(들)을 발현하는 데 사용될 수 있다.
AAV 바이러스 입자의 정제
다른 구현예에서, AAV 바이러스 입자는 컬럼 크로마토그래피, CsCl 구배 등과 같은 다양한 통상적인 정제 방법을 사용하여 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 예를 들어, 음이온 교환 컬럼, 친화성 컬럼 및/또는 양이온 교환 컬럼에 대한 정제와 같은 복수의 컬럼 정제 단계가 사용될 수 있다. 예를 들어, 국제 공개 번호 WO 02/12455 참조. 추가로, 감염을 이용하여 보조 기능을 발현시키면 공지된 방법으로 잔류 헬퍼 바이러스를 불활성화시킬 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스는 예를 들어, 20분 이상 동안 대략 60℃의 온도로 가열함으로써 불활성화될 수 있다. 헬퍼 아데노바이러스가 열에 불안정한 반면 AAV는 극도로 열에 안정하기 때문에 이 처리는 헬퍼 바이러스만 효과적으로 비활성화한다.
한 구현예에서, AAV 바이러스 스톡은 이어서 예를 들어 컬럼 크로마토그래피 기술을 사용하여 빈 캡시드를 제거하기 위해 처리된다.
또 다른 구현예에서, AAV 바이러스 입자 제제는 형질감염된 세포를 용해시켜 조 세포 용해물을 얻음으로써 얻어진다. 그런 다음 조 세포 용해물은 여과, 원심분리 등과 같은 당업계에 잘 알려진 기술에 의해 세포 파편을 제거하기 위해 정화되어 정화된 세포 용해물을 제공할 수 있다. 그런 다음 AAV 바이러스 입자 및 AAV 빈 캡시드 둘 모두를 함유할 수 있는 조 세포 용해물 또는 정화된 세포 용해물은 비분리 조건하에서 제1 양이온 교환 매트릭스에 적용될 수 있으며, 여기서 제1 양이온 교환 컬럼은 AAV 바이러스 입자를 추가로 분리하는 기능을 하고 세포 및 기타 성분의 입자 및 AAV 빈 캡시드는 세포 용해물 제제에 존재한다. 세포 용해물의 초기 정제를 수행하는 방법은 알려졌다. 하나의 대표적인 방법이 미국 특허 번호 6,593,123에 기재되어 있고, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
분석 기술
일반적으로, vg 및 캡시드 (cp) 역가는 각각의 vg 및 캡시드를 측정하기에 적합한 임의의 방식으로 평가될 수 있다. 예를 들어, 정량적 중합효소 연쇄 반응 (qPCR)이 vg 역가를 측정하기 위해 사용될 수 있고 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)이 Cp 역가를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, SEC (크기 배제 크로마토그래피)-HPLC가 vg 및 cp 역가를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 또한, RP (역상)-HPLC 또는 모세관 전기영동 분석을 사용하여 VP 비율에 대한 공정 매개변수의 잠재적 영향을 평가할 수 있다.
qPCR은 Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR 시스템과 같은 표준 qPCR 시스템을 사용하는 정량적 중합효소 연쇄 반응 (qPCR)에 의한 vg 정량화에 사용될 수 있다. 대안적으로, 디지털 액적 PCR (ddPCR)은 Vg 정량화를 위해 사용될 수 있다. 프라이머 및 프로브는 AAV의 DNA를 표적으로 하도록 설계되어 PCR 중에 축적될 때 정량화할 수 있다. ddPCR의 예는 Pasi, K. John, 등 "Multiyear Follow-Up of AAV5-hFVIII-SQ Gene Therapy for Hemophilia A."　New England Journal of Medicine　382.1 (2020): 29-40; Regan, John F., 등 "A Rapid Molecular Approach for Chromosomal Phasing."　PloS one　10.3 (2015): e0118270; 및 Furuta-Hanawa, Birei, Teruhide Yamaguchi, and Eriko Uchida. "Two-Dimensional Droplet Digital PCR as a Tool for Titration and Integrity Evaluation of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors"　Human gene therapy methods　30.4 (2019): 127-136에 기재되어 있다. vg 정량화를 위한 다른 시스템은 SEC, SEC-HPLC, 및 크기 교환 크로마토그래피 다각도 광산란을 포함하며, 이들 모두는 WO 2021/062164에 기재되어 있고, 이는 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
캡시드 ELISA (cp-ELISA) 검정은 예를 들어, AAV5 또는 AAV9 캡시드 ELISA 방법을 사용하여 온전한 캡시드를 측정하고 상업적으로 이용 가능한 키트 (예를 들어, Progen PRAAV5)를 활용할 수 있다. 이 키트 ELISA는 조립된 AAV5 또는 기타 캡시드의 구조적 에피토프에 특이적인 단클론 항체를 사용한다. 캡시드는 플레이트 결합 단일클론 항체에 포획된 후 검출 항체의 후속 결합이 뒤따를 수 있다. 검정 신호는 접합된 스트렙타비딘 퍼옥시다제를 첨가한 후 비색 TMB 기질 용액 및 황산을 첨가하여 반응을 종료함으로써 생성될 수 있다. 시험 샘플의 역가는 표적 캡시드 표준의 4개 매개변수 보정 곡선에서 보간된다. 캡시드 역가를 정량화하기 위한 또 다른 시스템은 SEC-MALS이고, 이는 WO 2021/062164에 기재되어 있다.
rBV의 역가는 초점/바이러스 플라크 검정을 사용하여 결정할 수 있다. 이 검정은 먼저 rBV를 함유하는 용액의 일련의 희석액으로 세포를 감염시키는 단계를 포함한다. 미리 결정된 시간 동안 감염이 발생한 후, rBV를 배양물에서 제거하고 세포를 미리 결정된 시간 동안 배양한다. 미리 결정된 시간이 경과한 후, 플라크 배지 (예를 들어, 아가로스 함유)를 배양물에 첨가하고 경화시킨다. 세포는 미리 결정된 시간 동안 더 배양되도록 하고 플라크의 수는 미리 결정된 시간 후에 계수된다. 역가는 다음 공식을 사용하여 계산된다: 역가 (플라크 형성 단위/mL) = 플라크 수 x 희석 계수 x (1/(mL의 접종원/웰)
양이온성 펩티드 및 히스티딘 풍부 펩티드
방법은 형질감염 시약으로서 양이온성 펩티드의 사용을 포함하며, 여기서 펩티드는 pH 6 내지 8 (예를 들어, 7.4) 범위에서 양전하를 띤다. 적합한 형질감염 시약은 대규모 바이러스 벡터 생산을 위한 성공적인 후보가 되기 위해 몇 가지 기준을 충족해야 한다: 1) 바람직하게는 플라스미드, 박미드 또는 임의의 다른 형태의 형태로 제공되는 외래 핵산에 결합한다; 2) 외래 DNA와 형질감염 시약의 복합체는 바람직하게는 10분 이상 동안 안정하다; 3) 외래 DNA:형질감염 시약의 복합체는 세포 표면에 결합하고 세포에 의해 흡수된다; 4) 형질감염 시약은 바람직하게는 외래 DNA 또는 외래 DNA: 형질감염 시약 복합체의 엔도좀 방출을 위한 방법을 제공한다; 5) 외래 DNA 또는 외래 DNA: 형질감염 시약 복합체는 바람직하게는 세포의 핵에 도달할 수 있다; 6) 외래 DNA 또는 외래 DNA:형질감염 시약 복합체는 바람직하게는 단백질의 전사 및 유전자의 복제에 이용 가능하다; 7) 형질감염 시약 및 외래 DNA: 형질감염 시약 복합체는 바람직하게는 세포에 의해 잘 허용된다; 8) 외래 DNA 또는 외래 DNA:형질감염 시약 복합체는 바람직하게는 선택한 생산 배지와 호환 가능하다; 그리고 9) 형질감염 시약은 바람직하게는 확장 가능한 방식으로 생산 세포를 형질감염시킬 수 있다.
양이온성 펩티드의 예는 히스티딘 풍부 펩티드 (HRP)를 포함한다. HRP는 다양한 유형의 카고(cargo)를 세포로 전달하는 데 사용되었다 (Moulay G. 등, Histidine-rich designer peptides of the LAH4 family promote cell delivery of a multitude of cargo. Journal of Peptide Science, 2017, 23(4):320-328).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드," "펩티드," 및 "단백질"은 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합, 즉 펩티드 동배체에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 중합체를 의미하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 폴리펩티드는 일반적으로 펩티드, 글리코펩티드 또는 올리고머라고 하는 짧은 사슬과 일반적으로 단백질이라고 하는 긴 사슬 모두를 지칭한다. 폴리펩티드는 20개의 유전자 암호화 아미노산 이외의 아미노산을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 번역 후 처리와 같은 자연적 과정에 의해 또는 당업계에 잘 알려진 화학적 변형 기술에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함한다.
그러나 HRP는 이전에 포유류 또는 곤충 세포에서 바이러스 벡터 생산을 위한 형질감염 시약으로 사용된 적이 없다.
HRP는 약 20개의 아미노산 길이이며 세포막에 대한 결합을 용이하게 하는 소수성 아미노산 잔기, 물에 대한 용해성을 용이하게 하는 친수성 잔기 및 여러 히스티딘 잔기 (패밀리의 잘 특성화된 구성원에 대한 4개의 히스티딘 잔기, LAH4)를 함유한다. 중성 pH의 히스티딘은 양전하를 띠고 음전하 카고에 결합할 수 있다. 이것은 카고:펩티드 복합체의 전체 전하를 양성으로 만든다. (+/-) 3.6의 양전하 비율이 LAH4와 주어진 플라스미드에 대해 나타났다 [4]. 카고:펩티드 복합체의 이러한 양전하는 일반적으로 음전하로 간주되는 세포 원형질막에 대한 결합을 촉진한다. 수용체 매개 세포 내 이입이 세포 표면의 당단백질을 통해 일어날 수 있다는 보고도 있다 (Kichler A. 등, Cationic amphipathic histidine-rich peptides for gene delivery, Biochimica et biophysica acta 2006, 1758(3):301-307). 세포 내 이입된 DNA:펩티드 복합체는 세포 내 이입 경로를 따라 초기 엔도솜에서 후기 엔도솜으로 이동한다. 경로를 따라 pH는 더 산성이 되고 히스티딘은 더 양성자화되어 이들의 순 전하를 +5에서 +9로 변경한다 (LAH4 펩티드의 경우). 이로 인해 펩티드의 약 절반이 DNA:펩티드 복합체에서 분리된다. 방출된 자유 펩티드는 엔도솜 막을 불안정하게 만들고 DNA 함유 복합체가 세포질로 빠져나가도록 한다.
HRP는 길이가 약 10-50개의 아미노산인 히스티딘-펩티드이다. 적합한 HRP는 pH 7.4에서 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 공칭 전하 및 pH 5에서 6, 7, 8, 9 또는 10의 공칭 전하를 갖는다. HRP는 추가로 pH 7에서 0.02-0.4의 소수성 모멘트를 갖고, 예를 들어, pH 7에서 소수성 모멘트는 0.03, 0.04, 0.05. 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.10, 0.11, 0.12, 0.13. 0.14, 0.15, 0.16, 0.17, 0.18, 0.19, 0.20, 0.21, 0.22, 0.23, 0.24, 0.25, 0.26, 0.27, 0.28, 0.29, 0.30, 0.31, 0.32, 0.33, 0.34, 0.35, 0.36, 0.37, 0.38, 0.39, 0.40, 0.41, 0.42, 0.43, 0.44, 0.45, 0.46, 0.47, 0.48, 0.,49, 0.50일 수 있고; 20-160, 예를 들어, 대략, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160의 극각일 수 있다. 바람직한 HRP는 4개의 히스티딘이 산재된 알라닌과 류신으로 만들어진 코어를 갖는다.
다양한 예에서, HRP의 적어도 일부는 세포막이 존재할 때 그리고 쉬퍼-에드먼슨의 바퀴 표현에 따라 표현될 때 α-나선 형태를 형성한다 (Schiffer M, Edmundson AB. Biophys J. 1967 Mar;7(2):121-35). α-나선은 나선의 한쪽에 소수성 아미노산 잔기의 클러스터를 포함하고 나선의 다른 쪽에 2~4개의 히스티딘 잔기를 포함하는 양친매성 나선일 수 있으며, 쉬퍼-에드먼슨의 바퀴 표현에서 60°와 180° 사이에 포함된 친수성 각도를 정의한다. α-나선은 또한 나선의 한쪽에 소수성 아미노산 잔기의 클러스터와 나선의 다른 쪽에 연속적인 알라닌 잔기를 포함하는 무극성 나선일 수 있으며, 상기 연속적인 알라닌 잔기는 쉬퍼-에드먼슨의 바퀴 표현에서 60 내지 180°의 각도를 정의한다. 다른 예에서, HRP의 부분 N-말단 및 C-말단은 pH 7.4에서 양전하를 띤 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 예를 들어, LAH4 펩티드 (서열 번호 1)는 N-말단 및 C- 말단에 리신 또는 아르기닌 잔기를 갖는다. 국제 공개 WO 2013/001041 참조, 이는 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
DNA 형질감염을 목적으로, 예시적인 HRP의 특성은 상대적으로 짧고, DNA와 정전기적 상호작용을 허용하지만 양전하 밀도가 제한된 존재하는 양이온성 잔기가 존재하고, 수용액에서 가용성이고, 막과 상호작용 및 불안정화할 수 있는 펩티드를 포함한다. 국제 공개 WO 2002/096928; Kichler, Antoine, A. James Mason, and Burkhard Bechinger.　Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes　1758.3 (2006): 301-307; Kichler, Antoine, 등　Journal of Molecular Medicine　85.2 (2007): 191-201 참조. 이들 참고문헌 모두 그 전체가 참조로 포함된다.
다양한 구현예에서, 양이온성 펩티드 또는 HRP는 공유 변형을 포함한다. 공유 변형의 예는 아실화, 아세틸화, 비-펩티드 거대 분자 담체 그룹에 대한 (예를 들어, N-말단에 대한) 연결; 아미드화, 비-펩티드 거대 분자 담체 그룹에 대한 (예를 들어, C-말단에 대한) 연결; (예를 들어, 아미노산 측쇄의) 글리코실화; 펩티드의 세포로의 흡수를 촉진할 수 있는 어댑터 단백질에 대한 연결 또는 지질, 지방산, 단실, 카르보벤족실 또는 t-부틸옥시카보닐 그룹과 같은 소수성 그룹에 대한 연결; 산화, 황화, 에스테르화, 락톤 형성 및/또는 인산화를 포함한다. 다른 구현예에서, 양이온성 펩티드는 양이온성 펩티드의 정량화를 허용하는 마커를 포함한다. 예를 들어, 양이온성 펩티드 티로신 (Tyr 또는 Y) 또는 트립토판 (Trp 또는 W)을 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서 기술된 바와 같은 양이온성 펩티드는 HRP에 제한되지 않으며 또한 다양한 구현예에서 또한 설명된 다른 양이온성 펩티드를 포함한다는 것이 주목된다. 예를 들어, 다양한 양이온성 펩티드 또는 HRP가 표 3에 개시되어 있다.
표 3: 양이온성 펩티드 및 히스티딘 풍부 펩티드
형질감염 시약으로 사용될 수 있는 양이온성 펩티드 및 HRP의 다른 예는 국제 공개 WO 2017/175072, 미국 특허 번호 8,652,483, 및 Mello, Lucas R., 등 "Self-assembly and intracellular delivery of DNA by a truncated fragment derived from the Trojan peptide Penetratin."　Soft matter　16.20 (2020): 4746-4755에 개시되어 있다. 이들 참고문헌 모두 그 전체가 참조로 포함된다.
형질감염 과정의 효율은 여러 가지 방법, 예를 들어 외래 DNA와 함께 전달된 유전자로부터 단백질을 생산하는 세포의 %, 형질 감염 후 세포에서 검출된 외래 DNA의 카피 수, 전달된 유전자에서 생성된 단백질의 효소 활성 및 기타 방법으로 표현될 수 있다. 예를 들어, 형질감염 효율은 GFP에 대한 유전자를 운반하는 플라스미드의 형질감염 후 주어진 시점에서 % 녹색 형광 단백질 양성 (GFP+) 세포로 결정될 수 있다.
HRP는 sf9 세포와 같은 곤충 세포에서 AAV의 산물로 형질감염을 개선하기 위해 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 관심 유전자를 함유하는 박미드가 생성된 후 바큘로바이러스 감염된 곤충 세포 (BIIC)를 생성하기 위해 박미드로부터의 플라스미드가 HRP 형질감염 시약과 함께 사용될 수 있다. 확장이 필요한 경우 이전에 동결 보존된 BIIC를 곤충 세포 및 생산된 치료 유전자를 포함하는 AAV 캡시드로 확장할 수 있다. 따라서, 곤충 세포의 경우 BIIC 생성의 업스트림 단계에서 형질감염 시약을 사용할 수 있다.
HRP는 또한 포유동물 세포로의 형질감염을 개선하기 위해 사용될 수 있다. 이 경우, HRP는 플라스미드와 함께 HEK293 세포와 같은 포유류 세포를 형질감염시킨다.
HRP는 안정 시간이 길고 낮은 형질감염 부피에 적합하다는 장점이 있다. 이와 관련하여 HRP는 1% 형질감염 부피로 사용될 수 있으며 적어도 60분 동안 안정적이다. PEI 및 FECTOVIR®과 같은 다른 많은 다른 형질감염 시약과 달리, GMP 등급의 HRP도 상업적으로 이용 가능하다. 또한, 세포에 잔존하는 것으로 추정되는 PEI 및 FECTOVIR®과 달리, HRP는 세포 내에서 분해되어 세포독성이 낮다. HRP는 적어도 70% 및 최대 90% 이상의 높은 형질감염 효율로 고밀도 세포 배양, 예를 들어, 2-8 x 106 세포/ml에서 형질감염에 사용될 수 있다. 따라서, 형질감염 효율은 약 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90%이다. 10분 초과, 또는 15분 초과, 20분 초과, 25분 초과 동안 안정한 HRP 형질감염 시약 벡터/형질감염 시약을 사용하는 본 발명의 형질감염 방법으로. HRP 형질감염 시약이 제공하는 한 가지 이점은 사용할 수 있는 적은 부피이다. 이와 관련하여, rAAV 생산을 위한 벡터 및 형질감염 시약은 배양 부피의 < 15%, 배양 부피의 < 10%, 배양 부피의 < 5%인 부피로 함께 혼합된다. 따라서, rAAV 생산을 위한 벡터 및 형질감염 시약은 배양 부피의 < 15%, < 14%, < 13%, < 12%, < 11%, < 10%, < 9%, < 8%, < 7%, < 6%, 또는 < 5%인 부피로 함께 혼합된다.
양이온성 펩티드 또는 HRP는 적어도 0.001 μg/mL, 적어도 0.01 μg/mL, 적어도 0.1 μg/mL, 적어도 0.5 μg/mL, 적어도 1 μg/mL, 적어도 10 μg/mL, 적어도 50 μg/mL, 적어도 100 μg/mL, 1-200 μg/mL, 5-50 μg/mL, 10-150 μg/mL, 또는 100-200 μg/mL의 농도로 세포 배양물에 첨가될 수 있다.
앞서 언급한 바와 같이, HRP는 또한 GMP 등급으로 제조된다. 문구 "우수의약품 제조관리 기준" 또는 "GMP"는 미국 식품의약국 (FDA)이 인간이 사용할 제품을 생산하기 위해 수립한 일련의 방법, 프로토콜 및 절차를 지칭한다. 약어 "cGMP"는 현재 FDA에서 승인한 프로토콜 및 절차를 구체적으로 지정한다 (예를 들어, 연방 규정집 코드 21, 파트 211 하). 임의의 구현예의 양이온성 펩티드/HRP 및 형질감염 시약은 또한 생분해성이며 세포 생존력에 제한적으로 영향을 미치지 않는다.
본 발명은 처음으로 HRP가 포유동물 세포에서 rAAV 생산 및 곤충 세포에서 rBV 생성을 위한 형질감염제로서 유용할 수 있음을 발견하였다. 본 발명은 청구범위에 기술된 본 발명의 범위를 제한하지 않는 하기 실시예에서 추가로 기술될 것이다.
실시예
실시예 1: Bba41 캡시드의 생성
Bba41 캡시드는 Ambr15 소형생물반응기 (15 mL 부피)에서 배양된 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포에서 생산되었다. 모든 형질감염 시약, 양이온성 펩티드, 및 HRP는 GMP 조건에서 만들 수 있는 고체상 펩티드 합성을 사용하여 합성적으로 생성되었다. HEK293 세포를 PEIPRO® 및 LAH4, LAH4-L1, LAH4-L1-F4, 및 LAH4-L1-F2D를 포함하는 상이한 HRP를 사용하여 Bba41 캡시드를 생성하고 GFP 발현 카세트를 함유하는 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위해 플라스미드로 형질감염시켰다. PEIPRO®는 양이온 중합체인 선형 폴리에틸렌이민 (PEI) 기반 형질감염 시약이다. PEIPRO®는 벡터 생산에 최적화되어 있으며 업계에서 신뢰할 수 있는 바이러스 벡터 생산 및 높은 감염 역가 수율을 생성하기 위한 표준 형질감염 시약으로 간주된다. 역가는 ddPCR을 사용하여 결정되었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 상이한 HRP로 형질감염된 HEK293 세포는 PEIPRO®로 형질감염된 HEK293 세포 (~ 0.6 x 10e11 vg/mL)와 비교하여 실질적으로 더 큰 역가의 Bba41 캡시드 (> 2.3 x 10e11 벡터 게놈(들) (vg)/밀리리터 (mL))을 생산하였다. GFP 강도는 attune 유세포 분석기로 측정했다. 도 1은 또한 PEIPRO®로 형질감염된 HEK293 세포 (~44 %)와 비교하여 형질감염 24시간 후 상이한 HRP로 형질감염되었을 때 더 많은 백분율의 HEK293 세포 (~58% 내지 ~74 %) GFP 발현을 나타냈다는 것을 보여준다. 형질감염 후 66시간에, GFP 발현을 나타내는 HRP 형질감염된 HEK293 세포의 백분율은 증가하였고 (~83% 내지 98%) PEIPRO® 형질감염된 HEK293 세포보다 더 높게 유지되었다 (~ 77%).
진탕 플라스크 (30 mL 작업 부피)에서, Bba41 캡시드는 LAH4 펩티드의 상이한 농도 및 상이한 복합체화 부피를 사용하여 Bba41 캡시드를 생성하고 GFP 발현 카세트를 함유하는 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위해 플라스미드로 형질감염된 HEK293 세포에서 생산되었다. 형질감염 전, 플라스미드를 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 및 13 마이크로그램 (μg)/mL 농도의 LAH4 펩티드와 혼합했다. LAH4/플라스미드 혼합물은 HEK293 세포 배양 부피의 0%, 1%, 및 10%인 부피를 가졌다. 예를 들어, HEK293 세포 배양에 0% 복합체화 부피를 추가하면 LAH4 펩티드와 플라스미드가 서로 독립적으로 배양에 직접 추가되었음을 나타낸다. 역가는 ddPCR을 사용하여 결정되었고 GFP 강도는 attune 유세포 분석기로 측정했다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 5-13 μg/ml 농도의 LAH4 펩티드는 0%, 1%, 및 10% 복합체화 부피에서 고효율로 HEK293 세포를 형질감염시킬 수 있었다. 도 3은 또한 상이한 LAH4 펩티드 농도 및 복합체화 부피로 형질감염되었을 때 높은 GFP 형광을 나타내는 형질감염된 HEK293 세포를 보여준다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 0%, 1%, 및 10% 복합체화 부피에서 5-13 μg/ml 농도의 LAH4 펩티드로 형질감염시키면 ~1.25 x 10e11 내지 ~2.8 x 10e11 vg/mL 범위인 높은 rAAV 역가를 생성했다.
도 5a, 5b, 및 5c에 나타낸 바와 같이, 0%, 1%, 및 10% 복합체화 부피에서 5-13 μg/ml 농도의 LAH4 펩티드를 사용한 형질감염은 다른 시점에서 유사한 세포 밀도를 가졌다. 도 6a, 6b, 및 6c는 또한 0%, 1%, 및 10% 복합체화 부피에서 5-13 μg/ml 농도의 LAH4 펩티드를 사용한 형질감염이 상이한 시점에서 유사한 생존력을 가짐을 보여준다. 도 5a, 5b, 및 5c에 표시된 생존력은 형질감염에 사용된 농도의 HRP가 세포독성을 유발하지 않는다는 것을 강조한다.
진탕 플라스크 (30 mL 작업 부피)에서, 다양한 HRP를 사용하여 HEK293 세포에서 Bba41 캡시드를 생산했다. LAH4, LAH4-L1, LAH4-L1-F4, 및 LAH4-L1-F2D를 포함하는 상이한 HRP를 사용하여 Bba41 캡시드를 생성하고 GFP 발현 카세트를 함유하는 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위해 HEK293 세포를 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 전에, 상이한 HRP 및 플라스미드를 함께 혼합하고 10 및 60분 동안 배양하였다. 역가는 ddPCR을 사용하여 결정되었고 GFP 강도는 attune 유세포 분석기로 측정했다. 도 7은 형질감염 전 HEK293 세포에서 생산된 Bba41 캡시드의 역가, PEIPRO® 및 플라스미드를 함께 혼합하고 10, 20 및 30분 동안 배양한 것을 보여준다. 상이한 HRP을 사용하여 생산된 Bba41 캡시드의 역가 (6 x 10e11 vg/mL 초과)는 PEIPRO®를 사용하여 생산된 Bba41 캡시드의 역가 (1.25 x 10e11 vg/mL 미만) 보다 실질적으로 더 컸다. Bba41 캡시드 역가는 또한 10 및 60분의 복합체화 시간에서 상이한 HRP를 사용할 때 높게 유지되었다.
도 8a 및 8b의 경우, 형질감염 효율은 GFP를 발현하는 세포의 백분율에 의해 결정되었다. 도 8a에 나타낸 바와 같이, 형질감염 24시간 후 상이한 HRP의 형질감염 효율은 PEIPRO®의 형질감염 효율보다 실질적으로 더 높았다. 형질감염 24시간 후 상이한 HRP의 형질감염 효율은 또한 10 및 60분의 복합체화 시간에서 높게 유지되었다. 도 8b는 형질감염 48시간 후 상이한 HRP의 형질감염 효율이 10 및 60분의 복합체화 시간에서 높게 유지 (> 85%)됨을 추가로 보여준다.
도 1, 2, 3, 4, 5a-5c, 6a-6c, 7, 8a, 및 8b는 HRP가 바이러스 벡터를 생성하기 위한 최적 표준 형질감염 시약으로 간주되는 PEI와 비교하여 HEK293 세포와 같은 일시적으로 형질감염된 세포에서 더 나은 형질감염 효율을 나타냄을 강조한다. HRP는 또한 PEI와 비교하여 더 높은 역가의 Bba41 캡시드를 생성하고 플라스미드와 혼합하고 장기간 배양할 때 향상된 안정성을 나타낸다. PEI는 플라스미드와 혼합될 때 오랜 시간 동안 안정적으로 유지되지 않는다. 이 정도로, HRP는 더 큰 부피의 세포를 형질 감염시킬 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터의 현재 HEK293 세포 생산의 주요 제한은 생산을 500리터 (L) 초과로 확장할 수 없다는 것이다.
HRP가 500 L 초과의 HEK293 세포 배양 부피를 형질감염시키는 능력을 시험하기 위해, Bba41 캡시드는 생물반응기를 사용하여 상이한 부피로 배양된 HEK293 세포에서 생산된다. 생물반응기는 100 L, 500 L, 750 L, 1000 L 및 2000 L 부피의 배양물을 포함한다. 형질감염 전, 상이한 농도의 상이한 HRP를 플라스미드와 혼합하여 상이한 중량비로 Bba41 캡시드를 생산한다. HRP/플라스미드는 세포 배양에 추가하기 전에 상이한 기간 동안 배양된다. 각각의 상이한 부피의 생물반응기 배양물에 대해, Bba41 캡시드가 생성된다.
실시예 2: AAV9 캡시드의 생성
1.6 L 진탕 플라스크 (500 mL 작업 부피)에서, AAV9 캡시드를 생산하고 LAH4 펩티드 및 PEIPRO®을 사용하여 관심 유전자가 있는 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위한 플라스미드로 형질감염된 HEK293 세포에서 AAV9 캡시드를 생산하였다. 역가는 ddPCR를 사용하여 결정되었다. 도 9는 AAV9 캡시드 역가를 보여준다. TRM1, TRM2, 및 TRM3는 세포 배양 배지가 LAH4 펩티드로 형질감염되기 전에 교체된 삼중 배양이다. CCM1, CCM2, 및 CCM3는 세포 배양 배지가 LAH4 펩티드로 형질감염되기 전에 교체되지 않은 삼중 배양이다. CTL1, CTL2, 및 CTL3는 HEK293 세포가 PEIPRO®로 형질감염된 삼중 배양이다. 도 9에 나타낸 바와 같이, LAH4 펩티드 (예를 들어, TRM1-3 및 CCM1-3)로 형질감염된 배양물은 PEIPRO® (예를 들어, CTL1-3)로 형질감염된 배양물에서 생산된 AAV9 캡시드 역가 (2.2 x 10e10vg/mL 미만)보다 실질적으로 더 큰 AAV9 캡시드 역가 (6 x 10e10 vg/mL 내지 ~1.2 x 10e11 vg/mL)를 생성했다.
Ambr15 소형생물반응기 (15 mL 부피)에서, AAV9 캡시드를 생산하고 LAH4 펩티드의 상이한 복합체화 부피를 사용하여 GFP 발현 카세트를 함유하는 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위한 플라스미드로 형질감염된 HEK293 세포에서 AAV9 캡시드를 생산하였다. 형질감염 전, 플라스미드를 LAH4 펩티드의 농도와 혼합하고 10분 및 60분 동안 배양하였다. LAH4/플라스미드 혼합물의 부피는 HEK293 세포 배양 부피의 1% 및 10%였다. 역가는 ddPCR을 사용하여 결정되었고 GFP 강도는 attune 유세포 분석기로 측정되었다.
도 10a, 10b, 10e, 및 10f의 경우, 형질감염 효율은 GFP를 발현하는 세포의 백분율에 의해 결정되었다. 도 10a에 나타낸 바와 같이, LAH 펩티드 및 플라스미드의 1% 및 10% 복합체화 부피로 형질감염된 HEK293 세포는 48시간에 87.5% 및 95% 초과의 높은 평균 형질감염 효율을 초래하였다. 도 10b에 나타낸 바와 같이, LAH 펩티드 및 플라스미드의 1% 및 10% 복합체화 부피로 형질감염된 HEK293 세포는 24시간에 ~67.5% 초과 및 70% 초과인 높은 평균 형질감염 효율을 초래하였다. 10 및 60분 복합체화 시간에 대해, 도 10e는 LAH4 펩티드/플라스미드 혼합물로 형질감염된 HEK293 세포가 48시간에 ~90%의 높은 평균 형질감염 효율을 초래함을 나타내고 도 10f는 LAH4 펩티드/플라스미드 혼합물로 형질감염된 HEK293 세포가 24시간에~70% 및 ~67.5%의 높은 평균 형질감염 효율을 초래함을 나타냈다.
도 10c에 나타낸 바와 같이, LAH 펩티드 및 플라스미드의 1% 및 10% 복합체화 부피로 형질감염된 HEK293 세포는 ~5 x 10e11 내지 ~2 x 10e12 vg/mL 범위의 높은 역가의 AAV9 캡시드를 생산했다. 10 및 60분 복합체화 시간에 대해, 도 10g는 두 복합체화 시간에 대해 ~1 x 10e12 vg/mL 범위의 평균 역가로 높은 AAV9 캡시드 역가를 생성하는 LAH4 펩티드/플라스미드 혼합물로 형질감염된 HEK293 세포를 나타낸다.
도 10d에 나타낸 바와 같이, LAH 펩티드 및 플라스미드의 1% 및 10% 복합체화 부피로 형질감염된 HEK293 세포의 평균 생존력은 75% 초과 및 ~72.5% 세포 생존력으로 높았다. 10 및 60분 복합체화 시간에 대해, 도 10h는 또한 LAH4 펩티드 및 플라스미드 혼합물로 형질감염된 HEK293 세포의 평균 생존율이 ~72.5% 및 75% 초과 세포 생존력으로 높다는 것을 보여준다. 도 10d 및 10h에 나타낸 생존력은 형질감염에 사용된 농도의 HRP가 세포독성을 유도하지 않는다는 것을 강조한다.
LAH4 펩티드를 형질감염 시약으로 사용하여 AAV9 캡시드의 추가 3L 생물반응기 생산을 준비했다. HEK293 세포를 AAV9 캡시드를 생산하고 LAH4 펩티드를 사용하여 관심 유전자를 갖는 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위해 플라스미드로 형질감염시켰다. 역가는 ddPCR을 사용하여 결정되었다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 추가 생산의 역가는 1 x 10e12 vg/mL 초과 내지 ~2.2 x 10e12 vg/mL 범위의 높은 AAV9 캡시드 역가를 생성했다.
도 9, 10a-10h, 및 11은 HRP가 높은 형질감염 효율을 나타내고 높은 역가의 AAV9 캡시드를 생성함을 강조한다. HRP는 또한 높은 역가의 AAV9 캡시드를 생성하고 플라스미드와 혼합하고 장기간 배양할 때 향상된 안정성을 나타냈다. PEI는 플라스미드와 혼합될 때 오랜 시간 동안 안정적으로 유지되지 않는다. 이 정도로, HRP는 더 큰 부피의 세포를 형질 감염시킬 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터의 현재 HEK293 생산의 주요 제한은 500 L 초과 규모 생산을 할 수 없다는 것이다.
추가 HRP가 구축되었다. LAH4 및 LAH4-L1-L4 펩티드에 다른 요소가 추가되었다.
예를 들어, 세포 결합 및 침투를 강화하기 위한 단백질 전달 도메인 4 (PDT4)가 LAH4 및 LAH4-L1-L4 펩티드에 추가되었다 (His-PTD4-LAH4 및 서열 번호 93; PTD4-LAH4 및 서열 번호 94; His-PTD4-LAH4-L1-F4 및 서열 번호 97; PTD4-LAH4-L1-F4 및 서열 번호 98).
향상된 엔도좀 탈출을 위한 히스티딘 잔기를 LAH4 및 LAH4-L1-L4 펩티드 (His-PTD4-LAH4 및 서열 번호 93; His-페네트라틴-LAH4 및 서열 번호 95; His-PTD4-LAH4-L1-F4 및 서열 번호 97; His-페네트라틴-LAH4-L1-F4 및 서열 번호 99; His-페네트라틴-LAH4-2 및 서열 번호 121; His-페네트라틴-LAH4-L1-F4-2 및 서열 번호 123)에 추가하였다.
스톡 용액 정량화를 위한 N 말단의 트립토판 잔기를 LAH4 및 LAH4-L1-L4 펩티드 (LAH4(W) 및 서열 번호 101; LAH4-L1-F4(W) 및 서열 번호 102)에 추가하였다.
향상된 세포 및 DNA 결합 및 세포 침투를 위한 페네트라틴을 LAH4 및 LAH4-L1-L4 펩티드 (His-페네트라틴-LAH4 및 서열 번호 95; 페네트라틴-LAH4 및 서열 번호 96; His-페네트라틴-LAH4-L1-F4 및 서열 번호 99; 페네트라틴-LAH4-L1-F4 및 서열 번호 100; His-페네트라틴-LAH4-2 및 서열 번호 121; 페네트라틴-LAH4-2 및 서열 번호 122; His-페네트라틴-LAH4-L1-F4-2 및 서열 번호 123; 페네트라틴-LAH4-L1-F4-2 및 서열 번호 124)에 추가하였다.
플라스미드의 향상된 핵 전달을 위한 시미안 바이러스 40 (SV40) 핵 국소화 신호 (NLS)를 LAH4 및 LAH4-L1-L4 펩티드 (SV40 T NLS-스페이서-LAH4 및 서열 번호 103; SV40 T NLS-스페이서-LAH4-L1-F4 및 서열 번호 104)에 추가하였다.
플라스미드의 향상된 핵 전달을 위한 뉴클레오플라스민 NLS를 LAH4 및 LAH4-L1-L4 펩티드 (뉴클레오플라스민 NLS-스페이서-LAH4 및 서열 번호 105; 뉴클레오플라스민 NLS-스페이서-LAH4-L1-F4 및 서열 번호 106)에 추가하였다.
플라스미드의 향상된 전달을 위한 AAV2 VP1-2 BR3를 LAH4 및 LAH4-L1-L4 펩티드 (AAV2 VP1-2 BR3-스페이서-LAH4 및 서열 번호 107; AAV2 VP1-2 BR3-스페이서-LAH4-L1-F4 및 서열 번호 108)에 추가하였다.
이들 펩티드를 화학적으로 합성하고 GFP 및 다양한 치료용 이식유전자를 포함하는 플라스미드로 HEK293 세포를 다양한 농도로 형질감염시켰다. 특히, His-PTD4-LAH4, PTD4-LAH4, LAH4(W), AAV2 VP1-2 BR3-스페이서-LAH4, His-PTD4-LAH4-L1-F4, PTD4-LAH4-L1-F4, LAH4-L1-F4(W), SV40 T NLS-스페이서-LAH4-L1-F4, 및 AAV2 VP1-2 BR3-스페이서-LAH4-L1-F4를 사용하여 rAAV를 생산하고 상이한 농도에서 상이한 HRP를 사용하여 GFP 발현 카세트를 함유하는 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위한 플라스미드가 있는 96 딥 웰 플레이트의 웰 (0.5 mL)에서 HEK293 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 후 24시간에, GFP 단백질을 발현하는 세포를 확인하여 형질감염 효율을 측정하였다. 4',6-디아미디노-2- 페닐인돌 (DAPI) 염색을 사용하여, 변형된 펩티드의 세포독성을 반영하기 위해 세포 집단에서 온전한 원형질막 (DAPI 음성)을 갖는 세포의 백분율을 모니터링했다. GFP 단백질을 발현하는 세포를 게이팅하기 위해 유동 세포측정법을 사용하여, 형질감염 효율은 온전한 원형질막을 갖는 세포 집단에서 GFP를 발현하는 양성 세포의 백분율로 표현하였다. 도 12 및 13에 나타낸 바와 같이, 상이한 HRP는 HEK293 세포의 최대 ~80%까지 형질감염되었다. 세포 생존력 측정은 상이한 HRP가 독성 효과가 없는 것으로 제한되었음을 보여주었다. 따라서, 상이한 펩티드는 LAH4 및 LAH4-L1-F4 펩티드와 유사하거나 동등한 형질감염 효율을 나타냈다.
미리 결정된 시간에, AAV 캡시드를 배양물로부터 단리하였다. AAV9 캡시드 역가는 벡터 게놈에 대한 ddPCR 및 프라이머를 사용하여 정량화되었다. 도 14 및 15에 나타낸 바와 같이, 상이한 HRP로 형질감염된 HEK293 세포는 10e11 vg/mL 규모에서 역가를 생성하였다.
실시예 3: 히스티딘 풍부 펩티드의 형질감염 효율
서론
이 연구의 목표는 LAH4 펩티드의 두 가지 특성에 대한 지식의 현재 격차를 해소하여 생명공학 산업에서 대규모 일시적 형질감염을 위한 형질감염 시약으로 사용하는 것이다. 두 가지 특성은 다음과 같다: 1) 형질감염 전 DNA:LAH4 복합체의 안정성; 2) 포유동물 세포에 의한 형질감염 후 LAH4 펩티드의 자연 제거.
LAH4 펩티드는 대규모 (100 L 이상) 일시적인 형질감염을 위해 1시간 이상 동안 플라스미드와 함께 배양되도록 허용되었는데 이는 이러한 배양 시간이 형질감염 복합체의 안정성을 개선하여 공정이 강력하고 재현 가능하도록 하기 때문이다. LAH4: DNA 복합체는 적어도 1시간 동안 안정한 것으로 밝혀졌다. 후속 연구에서, LAH:DNA 복합체의 안정성은 주변광에 노출되거나 노출되지 않은 상태에서 2-8 ℃ 및/또는 실온에서 보관될 때 최대 1주 동안 평가된다.
결과
생물공정 중 형질전환 시약과 같은 보조 물질의 제거가 강조된다. 우리는 LAH4가 형질감염 과정이 완료된 후 세포 프로테아제에 의해 크게 분해된다는 가설을 세웠다. LAH4의 생분해성 특성을 입증하기 위해, 세포 용해물의 복잡한 매트릭스에서 LAH4 펩티드를 검출하는 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC/MS) 방법을 개발했다. 상이한 농도의 LAH4 펩티드를 3 L 및 100 L의 세포 배양 부피 (즉, 생물반응기)에 첨가하였다. 형질감염 후 4시간에, LAH4 펩티드 농도는 초기 LAH4 펩티드 농도에 비해 ~45% 내지 ~85%까지 감소했다. 형질감염 후 24시간에, LAH4 펩티드 농도는 초기 LAH4 펩티드 농도에 비해 ~83% 내지 ~97%까지 감소했다. 형질감염 후 48 시간에, LAH4 펩티드 농도는 초기 LAH4 펩티드 농도에 비해 ~93% 내지 ~99%까지 감소했다. 형질감염 후 72시간에, LAH4 펩티드 농도는 초기 LAH4 펩티드 농도에 비해 ~96% 내지 ~99%까지 감소했다. 데이터는 초기 LAH4 펩티드 농도에 비해 형질감염 후 72시간까지 LAH4 펩티드의 95% 초과 제거를 나타낸다.
재료 및 방법
세포 배양: 현탁 HEK293 세포를 세포 배양 배지에 제공된 제조사 지침에 따라 배양했다. 소규모 형질감염 연구를 위해 HEK293 세포를 형질감염 당일에 125 ml 에를렌마이어 진탕 플라스크에 예정된 세포 밀도 범위로 접종한다.
형질감염: 동일한 배치의 LAH4 일회용 분취량으로 -20℃에서 보관한다. LAH4는 실온에서 해동되고 GFP 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA와 혼합된다. DNA:LAH4 복합체는 실온 또는 2-8℃에서 지정된 시간 동안 형질감염 전에 증발을 방지하기 위해 닫힌 캡 튜브에 보관된다.
LAH4:DNA 복합체의 안정성: LAH4:DNA 복합체의 생물물리학적 특성화를 수행한다. 방법에는 크기 및 전하 측정이 포함될 수 있다.
형질감염 효율: 형질감염 효율은 유세포 분석기를 사용하여 형질감염 후 24 및 48시간 후에 측정하고 온전한 원형질막이 있는 단일 세포 집단에서 % GFP+ 세포로 표시된다.
세포에서 LAH4 검출: 형질감염 후 상이한 시점에서 샘플을 수집하고 LC/MS 분석을 사용하여 분석한다.
실시예 4: 대규모 HEK293 세포에서 AAV9 캡시드의 생성
500 L 초과 HEK293 세포 배양 부피를 형질감염시키는 HRP의 능력을 시험하기 위해, AAV9 캡시드는 생물반응기를 사용하여 상이한 부피로 배양된 HEK293 세포에서 생산된다. 생물반응기는 100 L, 500 L, 750 L, 1000 L 및 2000 L 부피의 배양물을 포함한다. 형질감염 전, 상이한 농도의 상이한 HRP를 플라스미드와 혼합하여 상이한 중량비로 AAV9 캡시드를 생산한다. HRP/플라스미드는 세포 배양에 추가하기 전에 여러 기간 동안 배양된다. 상이한 부피의 각각의 생물반응기 배양물에 대해, AAV9 캡시드가 생성된다. 다른 예에서, LAH4 펩티드는 2개의 별도의 100 L 생물반응기 생산에서 현탁 상태의 HEK293 세포를 형질감염시키는 데 사용되었다. 특히 도 16에 나타낸 바와 같이, 2개의 100 L 생산에서 > 1.4 x 10e12 vg/mL 및 > 1 x 10e12 vg/mL 역가가 생성되었다. 따라서, 본 발명은 플라스미드/HEK293 시스템을 사용하여 rAAV의 대규모 생산을 가능하게 한다. 따라서, 생성된 역가는 플라스미드/HEK293 시스템이 이제 실행 가능한 대규모 rAAV 생산 시스템이 되도록 강력하고 경제적으로 실행 가능하다.
실시예 5: Sf9 세포에서 rBV 및 AAV5 캡시드의 생성
이전에 강조한 바와 같이, rAAV는 캡시드 및 Rep 단백질을 암호화하고/하거나 발현 카세트를 갖는 AAV 게놈 벡터를 제공하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 바큘로바이러스 (rBV)로 세포를 감염시킴으로써 곤충 세포 (예를 들어, Sf9 세포)에서 생산될 수 있다. rBV를 생성하기 위해, Sf9 세포와 같은 곤충 세포는 캡시드 및 Rep 단백질을 암호화하고/하거나 발현 카세트를 갖는 AAV 게놈 벡터를 제공하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 바큘로바이러스 게놈으로 형질감염된다. 재조합 바큘로바이러스 게놈 (즉, 박미드)을 생성하기 위해, 이종 뉴클레오티드 서열을 바큘로바이러스 게놈으로 삽입할 수 있는 상이한 벡터 시스템 (예를 들어, Bac-to-Bac™ 바큘로바이러스 발현 시스템, ThermoFisher Scientific)이 존재한다.
LAH4, LAH4-L1, LAH5, LAH4-L1-F2D와 같은 상이한 HRP 및 대조군 형질감염 시약 (CELLFECTIN®, Thermo Fisher)을 사용하여 Sf9 세포에서 GFP 발현 카세트로 플라스미드를 형질감염시켰다. 도 17에 나타낸 바와 같이, 상이한 HRP로 형질감염된 Sf9 세포의 15% 내지 50% 초과가 GFP를 발현하였다. 상이한 HRP의 형질감염 효율은 대조군 형질감염 시약의 형질감염 효율과 유사하였다.
AAV5 캡시드는 Sf9 세포에서도 생산되었다. AAV5 캡시드를 생산하기 위해, Sf9 세포를 대조군 형질감염 시약 및 상이한 HRP를 사용하여 AAV5 캡시드를 생성하거나 AAV 게놈 벡터를 제공하기 위한 뉴클레오티드 서열을 갖는 박미드로 형질감염시켰다. 도 18은 형질감염에서 생성된 rBV 역가를 나타낸다. 배양에서, 초기 박미드 형질감염에서 생성된 rBV는 이후에 더 많은 rBV를 생성하는 다른 Sf9 세포를 감염시킨다. 도 18에 나타낸 바와 같이, LAH4, LAH5, 및 LAH4-L1-F4 형질감염된 Sf9 세포로부터의 rBV 역가는 대조군 시약으로 형질감염된 Sf9 세포로부터의 rBV 역가와 유사하였다.
상이한 rBV를 수집하고 순수 Sf9 세포를 추가로 감염시켜 AAV5 캡시드를 생성하는데 사용하였으며, 여기서 rBV는 AAV5 캡시드를 생성하기 위한 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 역가는 ddPCR을 사용하여 결정되었다. 도 19에 나타낸 바와 같이, LAH4-L1-F4 형질감염된 Sf9 세포로부터 생산된 rBV는 대조군 시약으로 형질감염된 Sf9 세포에서 생성된 rBV 와 유사한 AAV5 캡시드 역가를 생성하였다. LAH4-L1-F4를 사용하여 생성된 AAV5 캡시드는 대조군 형질감염 시약을 사용하여 생성된 AAV5 캡시드와 동일한 VP1 캡시드 단백질 농도 및 캡시드 대 벡터 게놈의 비율을 가졌다.
AAV5 캡시드의 대규모 생산을 생성하기 위해, 상이한 부피의 Sf9 세포를 AAV5 캡시드를 생성하기 위한 상이한 HRP 및 박미드로 형질감염시켰다. 형질감염에서 생성된 rBV는 100 L, 500 L, 750 L, 1000 L 및 2000 L의 부피로 배양물을 감염시켜 AAV5 캡시드를 생성한다.
예시적인 구현예가 위에서 기술되었지만, 이러한 구현예가 본 발명의 모든 가능한 형태를 설명하는 것은 아니다. 오히려, 본 명세서에 사용된 단어는 제한이 아닌 설명을 위한 단어이며, 본 발명의 사상 및 범위에서 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변경이 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 다양한 구현예의 특징이 결합되어 본 발명의 추가 구현예를 형성할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> BIOMARIN PHARMACEUTICALS INC. PEREVOSHCHIKOVA, Irina, et al. <120> USE OF HISTIDINE RICH PEPTIDES AS A TRANSFECTION REAGENT FOR rAAV AND rBV PRODUCTION <130> 6439-0123PWO1 <160> 124 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: LAH4 peptide <400> 1 Lys Lys Ala Leu Leu Ala Leu Ala Leu His His Leu Ala His Leu Ala 1 5 10 15 Leu His Leu Ala Leu Ala Leu Lys Lys Ala 20 25 <210> 2 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: LAH4-L1 peptide <400> 2 Lys Lys Ala Leu Leu Ala His Ala Leu His Leu Leu Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 Leu His Leu Ala His Ala Leu Lys Lys Ala 20 25 <210> 3 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: LAH5 peptide <400> 3 Lys Lys Ala Leu Leu Ala Leu Ala Leu His His Leu Ala His Leu Ala 1 5 10 15 His His Leu Ala Leu Ala Leu Lys Lys Ala 20 25 <210> 4 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: LAH4-L1-F4 peptide <400> 4 Lys Lys Ala Leu Leu Ala His Phe Phe His Leu Leu Ala Leu Leu Ala 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Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Ala Leu Leu Ala His Phe Phe His 20 25 30 Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu His Phe Phe His Ala Leu Lys Lys Ala 35 40 45 <210> 82 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 82 Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Lys Lys Ala Leu Leu Ala His Phe Phe His Leu Leu Ala Leu Leu Ala 20 25 30 Leu His Phe Phe His Ala Leu Lys Lys Ala 35 40 <210> 83 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 83 His His His His His His Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg 1 5 10 15 Arg Met Lys Trp Lys Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Ala 20 25 30 Leu Leu Ala His Phe Phe His Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu His Phe 35 40 45 Phe His Ala Leu Lys Lys Ala 50 55 <210> 84 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 84 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Ala Leu Leu Ala His Phe Phe 20 25 30 His Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu His Phe Phe His Ala Leu Lys Lys 35 40 45 Ala <210> 85 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 85 Lys Lys Trp Ala Leu Leu Ala Leu Ala Leu His His Leu Ala His Leu 1 5 10 15 Ala Leu His Leu Ala Leu Ala Leu Lys Lys Ala 20 25 <210> 86 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 86 Lys Lys Trp Ala Leu Leu Ala His Phe Phe His Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 10 15 Ala Leu His Phe Phe His Ala Leu Lys Lys Ala 20 25 <210> 87 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 87 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Ala Leu 1 5 10 15 Leu Ala Leu Ala Leu His His Leu Ala His Leu Ala Leu His Leu Ala 20 25 30 Leu Ala Leu Lys Lys Ala 35 <210> 88 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 88 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Ala Leu 1 5 10 15 Leu Ala His Phe Phe His Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu His Phe Phe 20 25 30 His Ala Leu Lys Lys Ala 35 <210> 89 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 89 Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Ala Leu Leu Ala Leu Ala Leu His His 20 25 30 Leu Ala His Leu Ala Leu His Leu Ala Leu Ala Leu Lys Lys Ala 35 40 45 <210> 90 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 90 Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Ala Leu Leu Ala His Phe Phe His Leu 20 25 30 Leu Ala Leu Leu Ala Leu His Phe Phe His Ala Leu Lys Lys Ala 35 40 45 <210> 91 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 91 Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Trp Ala 1 5 10 15 Leu Leu Ala Leu Ala Leu His His Leu Ala His Leu Ala Leu His Leu 20 25 30 Ala Leu Ala Leu Lys Lys Ala 35 <210> 92 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 92 Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Ala Leu 1 5 10 15 Leu Ala His Phe Phe His Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu His Phe Phe 20 25 30 His Ala Leu Lys Lys Ala 35 <210> 93 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 93 His His His His His His Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg 1 5 10 15 Ala Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Ala Leu Leu Ala Leu Ala Leu His 20 25 30 His Leu Ala His Leu Ala Leu His Leu Ala Leu Ala Leu Lys Lys Ala 35 40 45 <210> 94 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 94 Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Lys Lys Ala Leu Leu Ala Leu Ala Leu His His Leu 20 25 <210> 95 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 95 His His His His His His Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg 1 5 10 15 Arg Met Lys Trp Lys Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Ala 20 25 30 Leu Leu Ala Leu Ala Leu His His Leu Ala His Leu Ala Leu His Leu 35 40 45 Ala Leu Ala Leu Lys Lys Ala 50 55 <210> 96 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 96 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Ala Leu Leu Ala Leu Ala Leu 20 25 30 His His Leu Ala His Leu Ala Leu His Leu Ala Leu Ala Leu Lys Lys 35 40 45 Ala <210> 97 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 97 His His His His His His Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg 1 5 10 15 Ala Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Ala Leu Leu Ala His Phe Phe His 20 25 30 Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu His Phe Phe His Ala Leu Lys Lys Ala 35 40 45 <210> 98 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 98 Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Lys Lys Ala Leu Leu Ala His Phe Phe His Leu Leu Ala Leu Leu Ala 20 25 30 Leu His Phe Phe His Ala Leu Lys Lys Ala 35 40 <210> 99 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 99 His His His His His His Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg 1 5 10 15 Arg Met Lys Trp Lys Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Ala 20 25 30 Leu Leu Ala His Phe Phe His Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu His Phe 35 40 45 Phe His Ala Leu Lys Lys Ala 50 55 <210> 100 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 100 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Ala Leu Leu Ala His Phe Phe 20 25 30 His Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu His Phe Phe His Ala Leu Lys Lys 35 40 45 Ala <210> 101 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 101 Lys Lys Trp Ala Leu Leu Ala Leu Ala Leu His His Leu Ala His Leu 1 5 10 15 Ala Leu His Leu Ala Leu Ala Leu Lys Lys Ala 20 25 <210> 102 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 102 Lys Lys Trp Ala Leu Leu Ala His Phe Phe His Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 10 15 Ala Leu His Phe Phe His Ala Leu Lys Lys Ala 20 25 <210> 103 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 103 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Ala Leu 1 5 10 15 Leu Ala Leu Ala Leu His His Leu Ala His Leu Ala Leu His Leu Ala 20 25 30 Leu Ala Leu Lys Lys Ala 35 <210> 104 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 104 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Ala Leu 1 5 10 15 Leu Ala His Phe Phe His Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu His Phe Phe 20 25 30 His Ala Leu Lys Lys Ala 35 <210> 105 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 105 Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Ala Leu Leu Ala Leu Ala Leu His His 20 25 30 Leu Ala His Leu Ala Leu His Leu Ala Leu Ala Leu Lys Lys Ala 35 40 45 <210> 106 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 106 Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Ala Leu Leu Ala His Phe Phe His Leu 20 25 30 Leu Ala Leu Leu Ala Leu His Phe Phe His Ala Leu Lys Lys Ala 35 40 45 <210> 107 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 107 Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Trp Ala 1 5 10 15 Leu Leu Ala Leu Ala Leu His His Leu Ala His Leu Ala Leu His Leu 20 25 30 Ala Leu Ala Leu Lys Lys Ala 35 <210> 108 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 108 Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Ala Leu 1 5 10 15 Leu Ala His Phe Phe His Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu His Phe Phe 20 25 30 His Ala Leu Lys Lys Ala 35 <210> 109 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 109 Lys Lys Ala Leu Leu Ala His Ala Leu Ala His Leu Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 Leu His Leu Ala Leu His Leu Lys Lys Ala 20 25 <210> 110 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 110 Lys Lys Ala Leu Leu Ala Leu Ala Leu His His Leu Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 Leu His Leu Ala His Ala Leu Lys Lys Ala 20 25 <210> 111 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 111 Lys Lys Ala Leu Leu Ala Leu Ala Leu His His Leu Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 His His Leu Ala Leu Ala Leu Lys Lys Ala 20 25 <210> 112 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 112 Lys Lys Ala Leu Leu His Leu Ala Leu Leu His Ala Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 His His Leu Ala Leu Ala Leu Lys Lys Ala 20 25 <210> 113 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 113 Lys Lys Ala Leu Leu His Leu Ala Leu Leu His Ala Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 His Leu Ala Ala Leu His Leu Lys Lys Ala 20 25 <210> 114 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 114 Lys Lys Ala Leu Leu His Leu Ala Leu Leu Leu Ala Ala Leu His Ala 1 5 10 15 His Leu Ala Ala Leu His Leu Lys Lys Ala 20 25 <210> 115 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 115 Lys Lys Ala Leu Leu Ala His Ala Leu His Leu Leu Ala Ala Leu Ala 1 5 10 15 Leu His Leu Ala His Leu Leu Lys Lys Ala 20 25 <210> 116 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 116 Lys Lys Ala Leu Leu Leu Ala Ala Leu His His Leu Ala Ala Leu Ala 1 5 10 15 Leu His Leu Ala His Leu Leu Lys Lys Ala 20 25 <210> 117 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 117 Lys Lys Ala Leu Leu Leu Ala Ala Leu His His Leu Leu Ala Leu Ala 1 5 10 15 His His Leu Ala Ala Leu Leu Lys Lys Ala 20 25 <210> 118 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 118 Lys Lys Ala Leu Leu His Ala Ala Leu Ala His Leu Leu Ala Leu Ala 1 5 10 15 His His Leu Leu Ala Leu Leu Lys Lys Ala 20 25 <210> 119 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 119 Lys Lys Ala Leu Leu His Ala Leu Leu Ala His Leu Ala Ala Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Leu Leu Ala His Leu Lys Lys Ala 20 25 <210> 120 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 120 Lys Lys Ala Leu Leu His Ala Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala His Leu 1 5 10 15 His Ala Leu Leu Ala His Leu Lys Lys Ala 20 25 <210> 121 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 121 His His His His His His Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg 1 5 10 15 Arg Met Lys Trp Lys Lys Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Ala Leu Leu 20 25 30 Ala Leu Ala Leu His His Leu Ala His Leu Ala Leu His Leu Ala Leu 35 40 45 Ala Leu Lys Lys Ala 50 <210> 122 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 122 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Ala Leu Leu Ala Leu Ala Leu His His 20 25 30 Leu Ala His Leu Ala Leu His Leu Ala Leu Ala Leu Lys Lys Ala 35 40 45 <210> 123 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 123 His His His His His His Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg 1 5 10 15 Arg Met Lys Trp Lys Lys Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Ala Leu Leu 20 25 30 Ala His Phe Phe His Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu His Phe Phe His 35 40 45 Ala Leu Lys Lys Ala 50 <210> 124 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 124 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Ala Leu Leu Ala His Phe Phe His Leu 20 25 30 Leu Ala Leu Leu Ala Leu His Phe Phe His Ala Leu Lys Lys Ala 35 40 45

Claims (57)

  1. 재조합 아데노 관련 바이러스 (rAAV)를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:
    양이온성 펩티드를 사용하여 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터로 세포를 공동-형질감염시키는 단계로서, 여기서 공동-형질감염 단계 동안 양이온성 펩티드의 적어도 일부는 입체형태의 측면에 위치한 소수성 아미노산 잔기 및 입체형태의 반대편에 위치한 극성 아미노산 잔기를 포함하는 α-나선 형태를 가지는, 단계;
    형질감염된 세포를 배양하여 rAAV를 생성하는 단계; 및
    rAAV를 회수하는 단계.
  2. 재조합 아데노 관련 바이러스 (rAAV)를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:
    형질감염 시약을 사용하여 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터로 세포를 공동-형질감염시키는 단계로서, 여기서 형질감염 시약은 히스티딘 풍부 펩티드 (HRP)를 포함하는, 단계;
    형질감염된 세포를 배양하여 rAAV를 생성하는 단계; 및
    rAAV를 회수하는 단계.
  3. 재조합 아데노 관련 바이러스 (rAAV)를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:
    rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터로, 형질감염 시약을 사용하여 500리터 (L) 초과 배양 부피에 현탁된 세포를 일시적으로 공동-형질감염시키는 단계;
    형질감염된 세포를 배양하여 rAAV를 생성하는 단계; 및
    rAAV를 회수하는 단계.
  4. 재조합 바큘로바이러스 (rBV)를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:
    양이온성 펩티드를 사용하여 이종 뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 박미드(들)로 세포를 형질감염시키는 단계로서, 여기서 형질감염 단계 동안 양이온성 펩티드의 적어도 일부는 입체형태의 측면에 위치한 소수성 아미노산 잔기 및 입체형태의 반대편에 위치한 극성 아미노산 잔기를 포함하는 α-나선 형태를 가지는, 단계;
    형질감염된 세포를 배양하여 rBV를 생성하는 단계; 및
    선택적으로, rBV를 회수하는 단계.
  5. 재조합 바큘로바이러스 (rBV)를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:
    형질감염 시약을 사용하여 바큘로바이러스 게놈 및 이종 뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 박미드(들)로 세포를 형질감염시키는 단계로서, 여기서 형질감염 시약은 히스티딘 풍부 펩티드 (HRP)를 포함하며;
    형질감염된 세포를 배양하여 rBV를 생성하는 단계; 및
    선택적으로, rBV를 회수하는 단계.
  6. 재조합 바큘로바이러스 (rBV)를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:
    양이온성 펩티드를 사용하여 이종 뉴클레오티드 서열로 세포를 형질감염시키는 단계로서, 여기서 세포는 바큘로바이러스 게놈의 적어도 일부를 갖고 형질감염 단계 동안 양이온성 펩티드의 적어도 일부는 입체형태의 측면에 위치한 소수성 아미노산 잔기 및 입체형태의 반대편에 위치한 극성 아미노산 잔기를 포함하는 α-나선 형태를 가지는, 단계;
    형질감염된 세포를 배양하여 rBV를 생성하는 단계로서, 여기서 이종 뉴클레오티드 서열 및 바큘로바이러스 게놈의 적어도 일부가 결합하여 rBV를 생성할 수 있는 바큘로바이러스 게놈을 형성하는, 단계; 및
    선택적으로, rBV를 회수하는 단계.
  7. 재조합 바큘로바이러스 (rBV)를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:
    형질감염 시약을 사용하여 이종 뉴클레오티드 서열로 세포를 형질감염시키는 단계로서, 여기서 세포는 바큘로바이러스 게놈의 적어도 일부를 갖고 형질감염 시약은 히스티딘 풍부 펩티드 (HRP)를 포함하는, 단계;
    형질감염된 세포를 배양하여 rBV를 생성하는 단계로서, 여기서 이종 뉴클레오티드 서열 및 바큘로바이러스 게놈의 적어도 일부가 결합하여 rBV를 생성할 수 있는 바큘로바이러스 게놈을 형성하는, 단계; 및
    선택적으로, rBV를 회수하는 단계.
  8. 재조합 바큘로바이러스 (rBV)를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:
    양이온성 펩티드를 사용하여 AAV 게놈 벡터를 제공하거나 Rep 또는 Cap 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 박미드로 세포를 형질감염시키는 단계로서, 여기서 형질감염 단계 동안 양이온성 펩티드의 적어도 일부는 입체형태의 측면에 위치한 소수성 아미노산 잔기 및 입체형태의 반대편에 위치한 극성 아미노산 잔기를 포함하는 α-나선 형태를 가지는, 단계;
    형질감염된 세포를 배양하여 rBV를 생성하는 단계; 및
    선택적으로, rBV를 회수하는 단계.
  9. 재조합 바큘로바이러스 (rBV)를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:
    형질감염 시약을 사용하여 AAV 게놈 벡터를 제공하거나 Rep 또는 Cap 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 박미드로 세포를 형질감염시키는 단계로서, 여기서 형질감염 시약은 히스티딘 풍부 펩티드 (HRP)를 포함하는, 단계;
    형질감염된 세포를 배양하여 rBV를 생성하는 단계; 및
    선택적으로, rBV를 회수하는 단계.
  10. 재조합 바큘로바이러스 (rBV)를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:
    양이온성 펩티드를 사용하여 AAV 게놈 벡터를 제공하거나 Rep 또는 Cap 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 세포를 형질감염시키는 단계로서, 여기서 세포는 바큘로바이러스 게놈의 적어도 일부를 갖고 형질감염 단계 동안 양이온성 펩티드의 적어도 일부는 입체형태의 측면에 위치한 소수성 아미노산 잔기 및 입체형태의 반대편에 위치한 극성 아미노산 잔기를 포함하는 α-나선 형태를 가지는, 단계;
    형질감염된 세포를 배양하여 rBV를 생성하는 단계로서, 여기서 뉴클레오티드 서열 및 바큘로바이러스 게놈의 적어도 일부가 결합하여 rBV를 생성할 수 있는 바큘로바이러스 게놈을 형성하는, 단계; 및
    선택적으로, rBV를 회수하는 단계.
  11. 재조합 바큘로바이러스 (rBV)를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:
    형질감염 시약을 사용하여 AAV 게놈 벡터를 제공하거나 Rep 또는 Cap 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 세포를 형질감염시키는 단계로서, 여기서 세포는 바큘로바이러스 게놈의 적어도 일부를 갖고 형질감염 시약은 히스티딘 풍부 펩티드 (HRP)를 포함하는, 단계;
    형질감염된 세포를 배양하여 rBV를 생성하는 단계로서, 여기서 뉴클레오티드 서열 및 바큘로바이러스 게놈의 적어도 일부가 결합하여 rBV를 생성할 수 있는 바큘로바이러스 게놈을 형성하는, 단계; 및
    선택적으로, rBV를 회수하는 단계.
  12. 재조합 아데노 관련 바이러스 (rAAV)를 생성하기 위한 요소를 발현할 수 있는 세포를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:
    양이온성 펩티드를 사용하여 rAAV를 생성하는 데 사용되는 요소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 벡터로 세포를 형질감염시키는 단계로서, 여기서 형질감염 단계 동안 양이온성 펩티드의 적어도 일부는 입체형태의 측면에 위치한 소수성 아미노산 잔기 및 입체형태의 반대편에 위치한 극성 아미노산 잔기를 포함하는 α-나선 형태를 가지는, 단계; 및
    상기 뉴클레오티드 서열을 갖는 게놈을 갖는 형질감염된 세포를 단리하는 단계.
  13. 재조합 아데노 관련 바이러스 (rAAV)를 생성하기 위한 요소를 발현할 수 있는 세포를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:
    형질감염 시약을 사용하여 rAAV 생산에 사용되는 요소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 벡터로 세포를 형질감염시키는 단계로서, 여기서 형질감염 시약은 히스티딘 풍부 펩티드 (HRP)를 포함하는 단계; 및
    상기 뉴클레오티드 서열을 갖는 게놈을 갖는 형질감염된 세포를 단리하는 단계.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 벡터가 적어도 70%의 세포에 공동-형질감염되는, 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터 및 양이온성 펩티드를 세포가 배양되는 부피의 10% 미만의 부피로 세포에 첨가하는, 방법.
  16. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터 및 형질감염 시약을 세포가 배양되는 부피의 10% 미만의 부피로 세포에 첨가하는, 방법.
  17. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터가 AAV 게놈 벡터, AAV 헬퍼 벡터, 및 비-AAV 헬퍼 기능 벡터를 포함하는, 방법.
  18. 제1항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항 또는 제12항에 있어서, 상기 극성 아미노산 잔기가 히스티딘 잔기를 포함하는, 방법.
  19. 제1항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항 또는 제12항에 있어서, 상기 소수성 아미노산 잔기가 알라닌 잔기를 포함하는, 방법.
  20. 제1항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항 또는 제12항에 있어서, 상기 소수성 아미노산 잔기가 류신 잔기를 포함하는, 방법.
  21. 제1항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항 또는 제12항에 있어서, 상기 양이온성 펩티드는 pH 7.4에서 양전하를 띠는 아미노산 잔기를 포함하는 N-말단 단부를 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  22. 제1항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항 또는 제12항에 있어서, 상기 양이온성 펩티드는 pH 7.4에서 양전하를 띠는 리신 또는 아르기닌 잔기를 포함하는 N-말단 단부를 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  23. 제1항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항 또는 제12항에 있어서, 상기 양이온성 펩티드는 pH 7.4에서 양전하를 띠는 아미노산 잔기를 포함하는 C-말단 단부를 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  24. 제1항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항 또는 제12항에 있어서, 상기 양이온성 펩티드는 pH 7.4에서 양전하를 띠는 리신 또는 아르기닌 잔기를 포함하는 C-말단 단부를 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  25. 제1항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항 또는 제12항에 있어서, 상기 펩티드가 19개 이상의 아미노산을 포함하는, 방법.
  26. 제2항, 제5항, 제7항, 제9항, 제11항 또는 제13항에 있어서, 상기 HRP가 19개 이상의 아미노산을 포함하는, 방법.
  27. 제1항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항 또는 제12항에 있어서, 상기 양이온성 펩티드가 50개 이상의 아미노산을 포함하는, 방법.
  28. 제2항, 제5항, 제7항, 제9항, 제11항 또는 제13항에 있어서, 상기 HRP가 19개 이상의 아미노산을 포함하는, 방법.
  29. 제1항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항 또는 제12항에 있어서, 상기 양이온성 펩티드는 우수의약품 제조관리 기준에 따라 제조되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  30. 제1항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항 또는 제12항에 있어서, 상기 양이온성 펩티드가 생분해성인, 방법.
  31. 제2항, 제5항, 제7항, 제9항, 제11항 또는 제13항에 있어서, 상기 HRP가 우수의약품 제조관리 기준에 따라 제조되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  32. 제2항, 제5항, 제7항, 제9항, 제11항 또는 제13항에 있어서, 상기 HRP가 생분해성인, 방법.
  33. 제3항에 있어서, 상기 형질감염 시약이 우수의약품 제조관리 기준에 따라 제조되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  34. 제3항에 있어서, 상기 형질감염 시약이 생분해성인, 방법.
  35. 제1항, 제2항, 제3항, 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 세포가 포유동물 세포인, 방법.
  36. 제1항, 제2항, 제3항, 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 세포가 HEK293, HeLa, CHO, NS0, SP2/0, PER.C6, Vero, RD, BHK, HT 1080, A549, Cos-7, ARPE-19, 또는 MRC-5 세포인, 방법.
  37. 제4항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 스포도프테라 프루기페르다, 아에데스 알보픽투스, 밤빅스모리, 트리초플러시아 니, 아스칼라파 오도라타, 드로소필리아, 아노펠레,　큐렉스, 또는 아에데스로부터 유래된 곤충 세포인, 방법.
  38. 제4항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 Sf9, 하이 파이브, Se301, SeIZD2109, SeUCR1, Sf900+, Sf21, BTI-TN-5B1-4, MG-1, Tn368, HzAm1, BM-N, Ha2302, Hz2E5 또는 Ao38 세포인, 방법.
  39. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생물반응기 부피가 적어도 500L인, 방법.
  40. 제4항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 적어도 250L 부피를 갖는 생물반응기 내에 있는 것인, 방법.
  41. 제1항에 있어서, 상기 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터 및 양이온성 펩티드는 공동-형질감염 단계 전에 함께 혼합되는, 방법.
  42. 제2항에 있어서, 상기 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터 및 HRP가 공동-형질감염 단계 전에 함께 혼합되는, 방법.
  43. 제3항에 있어서, 상기 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터 및 형질감염 시약은 공동-형질감염 단계 전에 함께 혼합되는, 방법.
  44. 제4항 또는 제8항에 있어서, 상기 재조합 박미드 및 양이온성 펩티드는 형질감염 단계 전에 함께 혼합되는, 방법.
  45. 제5항 또는 제9항에 있어서, 상기 재조합 박미드 및 HRP는 형질감염 단계 전에 함께 혼합되는, 방법.
  46. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 회수된 rBV는 배양물에서 이전에 바큘로바이러스로 감염되지 않은 세포에 첨가되어 rAAV를 생성하는, 방법.
  47. 제4항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 회수 단계가 바큘로바이러스 감염 곤충 세포 (BIIC)를 회수하는 것을 포함하는, 방법.
  48. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 회수 단계가 바큘로바이러스 감염 곤충 세포 (BIIC)를 회수하는 것을 포함하고 회수된 BIIC는 배양물에서 이전에 바큘로바이러스로 감염되지 않은 세포와 배양되어 rAAV를 생성하는, 방법.
  49. 재조합 아데노 관련 바이러스 (rAAV)를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:
    양이온성 펩티드를 사용하여 rAAV 생산을 위한 하나 이상의 벡터로 세포를 공동-형질감염시키는 단계로서, 여기서 양이온성 펩티드는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 또는 124 중 어느 하나와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계;
    형질감염된 세포를 배양하여 rAAV를 생성하는 단계; 및
    rAAV를 회수하는 단계.
  50. 재조합 바큘로바이러스 (rBV)를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:
    양이온성 펩티드를 사용하여 이종 뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 박미드로 세포를 형질감염시키는 단계로서, 여기서 양이온성 펩티드는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 또는 124 중 어느 하나와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계;
    형질감염된 세포를 배양하여 rBV를 생성하는 단계; 및
    선택적으로, rBV를 회수하는 단계.
  51. 재조합 바큘로바이러스 (rBV)를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:
    양이온성 펩티드를 사용하여 이종 뉴클레오티드 서열을 갖는 세포로 형질감염시키는 단계로서, 여기서 세포는 바큘로바이러스 게놈의 적어도 일부를 갖고 양이온성 펩티드는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 또는 124 중 어느 하나와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    형질감염된 세포를 배양하여 rBV를 생성하는 단계로서, 여기서 이종 뉴클레오티드 서열 및 바큘로바이러스 게놈의 적어도 일부가 결합하여 rBV를 생성할 수 있는 바큘로바이러스 게놈을 형성하는, 단계; 및
    선택적으로, rBV를 회수하는 단계.
  52. 재조합 아데노 관련 바이러스 (rAAV)를 생성하기 위한 요소를 발현할 수 있는 세포를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:
    양이온성 펩티드를 사용하여 AAV 게놈 벡터를 제공하거나 Rep 또는 Cap 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 세포에 형질감염시키는 단계로서, 여기서 양이온성 펩티드는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 또는 124 중 어느 하나와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계; 및
    상기 뉴클레오티드 서열을 갖는 게놈을 갖는 형질감염된 세포를 단리하는 단계.
  53. 재조합 바큘로바이러스 (rBV)를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:
    양이온성 펩티드를 사용하여 AAV 게놈 벡터를 제공하거나 Rep 또는 Cap 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 세포를 형질감염시키는 단계로서, 여기서 세포는 바큘로바이러스 게놈의 적어도 일부를 갖고 양이온성 펩티드는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 또는 124 중 어느 하나와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계;
    형질감염된 세포를 배양하여 rBV를 생성하는 단계로서, 여기서 뉴클레오티드 서열 및 바큘로바이러스 게놈의 적어도 일부가 결합하여 rBV를 생성할 수 있는 바큘로바이러스 게놈을 형성하는, 단계; 및
    선택적으로, rBV를 회수하는 단계.
  54. 서열 번호 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 121, 122, 123, 또는 124 중 어느 하나와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 양이온성 펩티드.
  55. 제54항의 양이온성 펩티드를 포함하는 조성물.
  56. 서열 번호 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 121, 122, 123, 또는 124의 아미노산 서열을 포함하는 양이온성 펩티드.
  57. 제56항의 양이온성 펩티드를 포함하는 조성물.
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