KR102604510B1 - 신규 아데노-관련 바이러스 캡시드 단백질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 아데노-관련 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질에 관한 것으로, 상기 AAV 입자는 신규한 캡시드 단백질, 이들 캡시드 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 이들 캡시드 단백질을 발현하는 AAV 벡터를 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 신규한 캡시드 단백질을 발현하는 본원에 기재된 AAV 벡터의 제조 방법, 및 이의 치료 용도와 관련된다.

Description

신규 아데노-관련 바이러스 캡시드 단백질
본 출원은 그 전체가 본원에 참고로 인용된 미국 가출원 제62/366,383호 (2017년 7월 26일자 출원)의 우선권 이점을 주장한다.
발명의 분야
본 발명은 신규한 아데노-관련 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질, 신규 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 입자, 이들 캡시드 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 이들 캡시드 단백질을 발현하는 AAV 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 신규한 캡시드 단백질을 발현하는 본원에 기술된 AAV 벡터의 제조 방법 및 이의 관련 치료 용도에 관한 것이다.
아데노-관련 바이러스 (AAV)는 복제-결여 파보바이러스이며, 이의 단일-가닥 DNA 게놈은 145개 뉴클레오타이드 역전된 말단 반복부 (ITR)를 포함하며, 약 4.7 kb 길이이다. AAV 혈청형 2 (AAV2) 게놈의 뉴클레오타이드 서열은 하기에 의하여 제시된다: Srviastava et al., J. virol., 45: 555-564 (1983) (Ruffing et al., J. Gen. virol., 75: 3385-3392 (1994)에 의하여 수정됨). 바이러스 DNA 복제 (rep), 캡시드화/패키징 및 숙주 세포 염색체 통합을 지시하는 시스-작용 서열이 ITR 내 포함된다. 3개 AAV 프로모터 (이들의 상대적 맵 위치에 대하여 p5, p19, 및 p40으로 칭명됨)는 rep 및 cap 유전자를 암호화하는 2개의 AAV 내부 개방 판독 프레임의 발현을 구동한다. 단일 AAV 인트론 (뉴클레오타이드 2107 및 2227에서의)의 차등적인 스플라이싱과 함께 2개의 rep 프로모터 (p5 및 p19)에 의해 rep 유전자 유래의 4개의 rep 단백질 (rep78, rep68, rep52 및 rep40)이 생성된다. Rep 단백질은 바이러스 게놈 복제에 궁극적인 원인으로 작용하는 다중 효소 특성을 갖는다. cap 유전자는 p40 프로모터로부터 발현되며, 이는 3개의 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3을 암호화한다. 대안적 스플라이싱 및 비-공통 번역 개시 부위는 3개의 관련 캡시드 단백질의 생산에 관여한다. 단일 공통 폴리아데닐화 부위는 AAV 게놈의 맵 위치 95에 위치한다. AAV의 생애 주기 및 유전학은 문헌[Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992)]에서 검토된다.
AAV가 인간 세포에 감염되면, 바이러스 게놈은 염색체 19에 통합되어 세포의 잠재 감염(latent infection)을 일으킬 수 있다. 세포가 헬퍼 바이러스 (예를 들어, 아데노 바이러스 또는 헤르페스 바이러스)에 감염되지 않으면, 감염 바이러스가 생성되지 않는다. 아데노 바이러스의 경우, 유전자 E1A, E1B, E2A, E4 및 VA는 헬퍼 기능을 제공한다. 헬퍼 바이러스에 감염되면, AAV 프로바이러스는 회복되고 증폭되며, AAV 및 아데노 바이러스 둘 다 생성된다.
AAV는, 예를 들어, 유전자 요법에서 세포에 외래 DNA를 전달하기 위한 벡터로서, 그리고 면역원성 펩타이드/폴리펩타이드를 발현하기 위한 백신 벡터로서, 이를 적당한 후보로 만드는 고유 특성을 갖는다. 배양중인 세포의 AAV 감염은 비-세포변성적이며, 인간과 기타 동물의 자연적 감염은 침묵성이고 무증상성이다. 더욱이, AAV는 다수의 포유동물 세포에 감염되어, 생체내 다수의 상이한 조직들을 표적화할 가능성을 갖게 한다. AAV 프로바이러스 게놈은 플라스미드 내 클로닝된 DNA로서 감염되며, 이는 재조합 게놈의 작제를 실현가능하도록 한다. 또한, AAV 복제, 게놈 캡시드화, 및 통합을 지시하는 신호가 AAV 게놈의 ITR 내에 포함되기 때문에, (복제 및 구조 캡시드 단백질, rep-cap을 암호화하는) 게놈의 내부 약 4.3kb의 일부 또는 전부가 외래 DNA, 예컨대 프로모터, 관심 DNA, 및 폴리아데닐화 신호를 함유하는 유전자 카세트에 의해 대체될 수 있다. rep 및 cap 단백질은 트랜스 방식으로 제공될 수 있다. AAV의 또 다른 중요한 특징은, 이것이 매우 안정적이며 왕성한 바이러스라는 것이다. 이는 아데노바이러스를 비활성화시키는 조건 (수 시간 동안 56℃ 내지 65℃)을 용이하게 견딜 수 있게 하여, rAAV-벡터의 저온 보존의 중요성을 감소시킨다. AAV는 심지어 동결건조될 수도 있다. 마지막으로, AAV-감염된 세포는 중복감염(superinfection)에 내성을 갖지 않는다.
AAV 벡터는 수많은 포유동물 유전자 치료 응용 분야에서 사용되며, 유전자 치료 응용 분야에서 그 용도를 찾을 수 있는 새로운 및/또는 변형된 AAV 벡터 및 관련 바이러스에 대한 필요성이 있다. 본 발명은 본 발명의 신규한 AAV 캡시드 단백질 또는 기능성 키메라 조작된 AAV 캡시드 단백질, 및 이들 벡터 또는 캡시드 단백질을 포함하는 신규한 비-자연발생적 AAV 비리온을 발현하는 신규한 AAV 벡터를 제공한다.
발명의 개요
본 발명은 신규한 AAV 캡시드 단백질, 및 상기 AAV 바이러스의 유전자 치료 용도, 및 유전자 치료용 약제의 제조를 위한 용도를 제공하며, 상기 AAV 캡시드 단백질은 신규한 VP1, VP2 또는 VP3 캡시드 단백질, 이들 캡시드 단백질 중 어느 것을 포함하는 비-자연발생적 AAV 바이러스일 수 있다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 다양한 포유동물 조직들로부터 단리 및 식별되었다. 특정의 신규 포유동물 유래 AAV 캡시드 VP1 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 15 내지 89로서 제시되고, 또한 각각의 VP2 및 VP3 서열의 관련 위치도 본 명세서에 기재되어 있다. 또한, 본 발명은 하나의 AAV 캡시드 서열로부터 유래된 골격 아미노산 서열 및 적어도 하나의 상이한 AAV 캡시드 서열로부터 유래된 캡시드 단백질 서열의 단편을 갖는 신규한 조작된 키메라 AAV 캡시드 단백질을 제공한다. 예시적인 조작된 키메라 AAV 캡시드 VP1 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 90 내지 157로서 제시된다. 종합적으로, 신규 캡시드 단백질은 본원에서 "본 발명의 AAV 캡시드 단백질"로 지칭된다. 본원에 기술된 어느 조성물에 관하여 사용될 때 "비-천연발생적(non-naturally occurring)"이란 용어는 상기 조성물이 천연 생성물이 아니라 오히려 재조합 또는 다른 수단에 의해 인위적으로 합성됨을 의미한다.
일 구현예에서, 본 발명은 캡시드 단백질을 갖는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 및 벡터를 제공하며, 상기 캡시드 단백질은 (i) 서열 번호 15-89 중 어느 하나, (ⅱ) 서열 번호 15-89 중 어느 하나의 VP2 영역, 또는 (ⅲ) 서열 번호 15-89 중 어느 하나의 VP3 영역과 적어도 95% 일치하는 아미노산 서열 및 추가로 전이유전자를 갖고, 상기 전이유전자는 숙주 세포 내 이종 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 이종 유전자로 구성된다. 또 다른 구현예에서, 캡시드 단백질은 (i) 서열 번호 15 내지 89 중 어느 하나, (ⅱ) 서열 번호 15 내지 89 중 어느 하나의 VP2 영역, 또는 (ⅲ) 서열 번호 15 내지 89 중 어느 하나의 VP3 영역의 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 구현예에서, AAV는 AAV 역전된 말단 반복 서열을 갖는다. 추가의 구현예에서, AAV는 생리학적으로 양립가능한 담체와 혼합된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 키메라 캡시드 단백질이 가변 영역 I, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, V, Ⅵ, Ⅶ 및 Ⅷ을 갖는 수령체 골격 AAV 캡시드의 VP1 아미노산 서열을 갖는 키메라 캡시드 단백질을 갖는 벡터 및 AAV를 제공하며, 단, 상기 가변 영역 I, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, V, Ⅵ, Ⅶ, Ⅷ 및 Ⅸ 중 하나 이상이 하나 이상의 공여체 AAV 캡시드로부터의 상응하는 가변 영역으로 대체된다. 또 다른 구현예에서, 수령체 캡시드의 하나의 가변 영역만이 공여체 캡시드로부터의 상응하는 가변 영역으로 대체된다. 추가의 구현예에서, 수령체 캡시드의 둘 이상의 가변 영역은 단일 공여체 AAV 캡시드의 상응하는 가변 영역으로 대체된다. 또 다른 구현예에서, 수령체 AAV 캡시드의 2개 이상의 가변 영역은 2개 이상의 공여체 AAV 캡시드로부터의 상응하는 가변 영역으로 대체된다. 또 다른 구현예에서, 수령체 AAV 캡시드의 9개의 가변 영역 모두가 단일 공여체 캡시드의 상응하는 가변 영역으로 대체된다. 또 다른 구현예에서, 수령체 AAV 캡시드는 GBS 영역 또는 GH 루프 영역을 갖고, GBS 영역 또는 GH 루프 영역은 하나 이상의 공여체 AAV 캡시드로부터의 상응하는 영역으로 대체된다. 또 다른 구현예에서, 수령체 AAV 캡시드의 모든 9개의 가변 영역 및 GBS 영역은 하나 이상의 공여체 AAV 캡시드로부터의 상응하는 가변 영역 및 GBS 영역으로 대체된다. 또 다른 구현예에서, 수령체 AAV 캡시드의 모든 9개의 가변 영역 및 GBS 영역은 둘 이상의 공여체 AAV 캡시드로부터의 상응하는 영역 및 GBS 영역으로 대체된다. 또 다른 구현예에서, 수령체 AAV 캡시드의 GH 루프는 공여체 AAV 캡시드로부터의 상응하는 GH 루프 영역으로 대체된다. 또 다른 구현예에서, 수령체 AAV 캡시드의 모든 9개의 가변 영역 및 GH 루프 영역은 하나 이상의 공여체 AAV 캡시드로부터의 상응하는 가변 영역 및 GH 루프 영역으로 대체된다. 일 구현예에서, 수령체 AAV 캡시드 서열은 서열 번호 1 내지 14 중 어느 하나이고, 공여체 AAV 캡시드 서열은 서열 번호 1 내지 14 중 어느 하나로부터 선택되며, 수령체 AAV 캡시드 및 공여체 AAV 캡시드는 서로 상이하다. 또 다른 구현예에서, 수령체 AAV 캡시드 서열은 서열 번호 1 내지 89 중 어느 하나이고, 공여체 AAV 캡시드 서열은 서열 번호 1 내지 89 중 어느 하나로부터 선택되며, 수령체 AAV 캡시드 및 공여체 AAV 캡시드는 서로 상이하다. 또 다른 구현예에서, 키메라 캡시드는 서열 번호 90 내지 157 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 어느 AAV와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에 전이유전자를 전달하는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 AAV의 유효량을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 내인성 단백질의 비정상 활성과 관련된 장애 또는 질환으로부터 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 AAV는 단백질의 생물학적 활성 사본을 암호화하는 전이유전자를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 근육 세포에 전이유전자를 전달하는 단계를 포함한다. 추가의 구현예에서, 질환은 뒤센 근이영양증 (Duchenne dystrophy)이고, 전이유전자는 마이크로디스트로핀 (microdystrophin)을 암호화한다.
일 구현예에서, 본 발명은 세포에 전이유전자를 전달하기 위한, 본원에 개시된 벡터 또는 AAV를 포함하는 조성물을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 내인성 단백질의 비정상적인 활성과 관련된 장애 또는 질환의 치료를 위한, 본원에 개시된 유효량의 벡터 또는 AAV를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 AAV의 벡터는 단백질의 생물학적 활성 사본을 암호화하는 전이유전자를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 근육 세포에 전이유전자를 전달한다. 추가의 구현예에서, 질환은 뒤센 근이영양증이고, 전이유전자는 마이크로디스트로핀을 암호화한다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 벡터 또는 AAV의, 내인성 단백질의 비정상적인 활성과 관련된 장애 또는 질환을 앓고 있는 피험체를 치료하는데 효과적인 약제의 제조를 위한 용도를 제공하며, 여기서 상기 벡터 또는 AAV는 단백질의 생물학적 활성 사본을 암호화하는 전이유전자를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 약제는 근육 세포에 전이유전자를 전달한다. 추가의 구현예에서, 질환은 뒤센 근이영양증이고, 전이유전자는 마이크로디스트로핀을 암호화한다.
본 발명은 AAV 캡시드 단백질의 생물학적 활성을 보유하는 본 발명의 어느 AAV 캡시드 단백질의 단편을 제공한다. 예시적인 단편은 캡시드 단백질의 VP2 및 VP3 스플라이싱 변이체, 및 캡시드 단백질의 가변 영역 (VR) 및/또는 캡시드 단백질의 글리칸 결합 서열 (GBS) 및/또는 GH 루프 중 하나 이상을 포함하는 단편을 포함한다. 본 발명은 또한, 캡시드 단백질 단편, 및 구체적으로 정의된 캡시드 단백질 단편에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 서열 동일성을 갖는, 캡시드 단백질 단편을 포함하는 신규한 비-자연발생적 AAV 입자를 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은, 단리된 아데노-관련 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질을 제공하며, 여기서 상기 캡시드 단백질은 하기를 포함한다: (i) 서열 번호 15-89 중 어느 하나의 VP1 아미노산 서열 또는 서열 번호 15-89 중 어느 하나의 VP2 또는 VP3 영역에 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 아미노산 서열, 또는 (ⅱ) 서열 번호 15-89 중 어느 하나를 포함하는 VP1 아미노산 서열 또는 서열 번호 15-89 중 어느 하나의 VP2 또는 VP3 영역. 특정 구현예에서, 캡시드 단백질은 이종 아미노산 서열에 연결된다. 본 발명은 또한 이들 캡시드 단백질 중 어느 것을 갖거나 포함하는 비-자연발생적 AAV 입자를 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 기재된 VP1, VP2 또는 VP3 캡시드 단백질 중 어느 것을 포함하는 비-자연발생적 AAV 입자는 숙주 세포에서 이종 유전자의 발현을 지시하는 조절 유전자에 작동가능하게 연결된 이종 유전자를 포함하는 이식 유전자 및 AAV 역전 말단 반복부를 갖는 핵산을 포함한다. 기타 구현예에서, 본원에 기재된 어느 VP1, VP2 또는 VP3 캡시드 서열을 포함하는 비-자연발생적 AAV 입자는 숙주 세포에서 전이유전자 발현을 조절하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 이종 전이유전자를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "이종 유전자(heterologues gene)" 또는 "이종 조절 서열"은 언급된 유전자 또는 조절 서열이 자연적으로 AAV 벡터 또는 입자에 존재하지 않고 인위적으로 도입됨을 의미한다. 용어 "전이유전자(transgene)"는 이종 유전자와 숙주 세포에서 그 유전자의 발현을 조절하는 이종 유전자에 작동가능하게 연결된 조절 서열 모두를 포함하는 핵산을 지칭한다.
본 발명은 또한, 아데노-관련 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하며, 여기서 상기 캡시드 단백질은 (i) 서열 번호 15-89 중 어느 하나의 VP1 아미노산 서열 또는 서열 번호 15-89 중 어느 하나의 VP2 또는 VP3 영역에 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 아미노산 서열, 또는 (ⅱ) 서열 번호 15-89 중 어느 하나를 포함하는 VP1 아미노산 서열 또는 서열 번호 15-89 중 어느 하나의 VP2 또는 VP3 영역을 포함하며, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드는 이종 조절 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 이와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 자연 발생하지 않는 것으로 이해된다. 본 발명은 또한 이종 조절 서열에 작동가능하게 연결된 이들 폴리뉴클레오타이드 서열 중 어느 것을 포함하는 AAV 벡터 및 이들 AAV 벡터를 포함하는 조성물(약학적 조성물을 포함)을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 캡시드 단백질 및 이종 전이유전자 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터를 제공하며, 여기에서 상기 캡시드 단백질은 (i) 서열 번호 15-89 중 어느 하나의 VP1 아미노산 서열 또는 서열 번호 15-89 중 어느 하나의 VP2 또는 VP3 영역과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 아미노산 서열, 또는 (ⅱ) 서열 번호 15-89 중 어느 하나의 VP1 아미노산 서열 또는 서열 번호 15-89 중 어느 하나의 VP2 또는 VP3 영역을 포함한다. 본 발명은 또한 이들 AAV 벡터를 포함하는 조성물(약학적 조성물을 포함)을 제공한다.
본 발명은 또한, AAV VP1 캡시드 서열이 9개의 상이한 가변 영역, GBS 영역 및 GH 루프 영역을 포함하며, 하나의 AAV VP1 캡시드 서열 내 이들 영역 중 하나 이상을 적어도 제2의 상이한 AAV VP1 캡시드 서열 유래의 상응한 영역(들)로 대체함으로서, 이의 관련 AAV가 작용성이 되고 세포를 형질도입하고, 그리고 이종 전이유전자를 전달할 수 있고, 그리고 키메라 AAV로 재조합 가공될 수 있는 고유 특성을 갖는, 신규한 키메라 AAV 캡시드를 생성할 수 있다는, 본원에 기술된 신규한 발견을 기반으로 한다. 다양한 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역과 관련하여, 용어 "상응하는(corresponding)"은 2개의 상이한 AAV 캡시드 서열들 사이의 동일한 영역을 의미한다. 예를 들어, 제1 AAV 캡시드 서열에서 VR I에 "상응"하는 영역은 제2 상이한 AAV 캡시드 서열에서 동일한 영역 (즉, VR I 영역)이다. AAV 캡시드 서열과 관련하여 용어 "키메라"는 관심있는 AAV 캡시드 서열이 2개 이상의 상이한 AAV 캡시드 서열로부터 유래된 아미노산 서열들을 포함한다는 사실을 지칭한다.
이와 같이, 본 발명은 또한 단리된, 비-자연발생적 키메라 아데노-관련 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질을 제공하며, 여기서 상기 키메라 캡시드 단백질은, 제1 AAV 캡시드 서열과 상이한 제2 AAV 캡시드 서열 유래의 가변 영역으로 대체된 적어도 하나의 가변 영역을 갖는 제1 AAV 캡시드 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 제1 AAV 캡시드 서열 (본 명세서에서 "수령체"로 지칭됨)은 하나 이상의 가변 영역이 제2의 AAV 캡시드 서열 (본원에서 "공여체"로 지칭됨)로부터의 하나 이상의 가변 영역에 의해 교환되거나 치환되는 골격 아미노산 서열을 제공한다. 제2 AAV 캡시드 서열은 제1 AAV 캡시드 서열과는 상이하고, 그리고 골격 또는 수령체 캡시드 서열의 서열로 치환되거나 삽입되는 가변 영역(들)의 서열을 제공할 것이다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 어느 키메라 캡시드 단백질을 포함하는 비-자연발생적 AAV 바이러스 또는 AAV 입자를 제공한다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 어느 키메라 캡시드 단백질을 포함하는 비-자연발생적 AAV 입자는 또한 숙주 세포에서 전이유전자 발현을 조절하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 이종 전이유전자를 포함한다.
공여체 AAV 캡시드 서열로부터 수령체 골격 캡시드 서열로 교환될 수 있는 "가변 영역(variable region)"은 AAV 캡시드 단백질의 VP1 서열 내의 9개의 가변 영역을 지칭한다. 가변 영역 (VR)은 본원에서 VR I, VR Ⅱ, VR Ⅲ VR Ⅳ, VR V, VR Ⅵ, VR Ⅶ, VR Ⅷ 및 VR Ⅸ로 언급되며, 다양한 VP1 서열에서 이들 각각의 위치가 본원에서 기재된다. VR은 AAV VP1 캡시드 서열 내에서 가장 빈번한(highest) 서열 및 구조적 변이를 나타내며 수용체 부착, 전이유전자의 전사 활성화, 조직 형질도입 및 항원성에서도 역할을 할 수 있다.
"글리칸 결합 서열 (GBS)" 또는 "GBS 도메인" 또는 "GBS 영역"은 바이러스 캡시드의 글리칸 결합 특이성을 제어하는, VR Ⅳ 및 VR V 사이에 위치하는 아미노산 서열을 지칭한다. 다양한 AAV VP1 아미노산 서열에서의 GBS 영역의 위치가 본원에 기재되어 있고, 다른 AAV VP1 아미노산 서열 유래의 것들이 당업계에 공지되어 있고 및/또는 통상적으로 식별될 수 있다.
"GH 루프"는 캡시드 단백질의 내부 β-배럴 내에서 β-가닥 G 및 β-가닥 H가 측면에 위치하는 루프 서열을 지칭한다. "GH 루프" 서열은 포함된 GBS 서열 및 공여체로부터의 산재된 모든 보존된 골격 서열을 포함하는, 가변 영역 VR Ⅳ 내지 VR Ⅷ를 포함한다. 다양한 AAV VP1 아미노산 서열에서의 GH 루프 영역의 위치가 본원에 기재되어 있고, 다른 AAV VP1 아미노산 서열로부터의 것들이 통상적으로 식별될 수 있다.
본원에서 기술된 VR, GBS 및 GH 루프 영역의 위치와 관련하여, 이들 영역의 N 말단 및/또는 C 말단의 위치는 본원 (특히 표 2)에서 명백하게 기술된 바와 같이 이들 아미노산 위치로부터 최대 1개 아미노산, 2개 아미노산, 3개 아미노산, 4개 아미노산 또는 5개 아미노산이 가변될 수 있다. 본원에서 정의된 N- 말단 및/또는 C- 말단상의 최대 5개의 아미노산이 가변될 수 있는 치환된 VR, GBS 및/또는 GH 루프 영역을 포함하는 신규한 캡시드 서열이 본 발명에 포함된다.
일 구현예에서, 본 발명은 단리된 비-자연발생적 키메라 아데노-관련 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질을 제공하며, 여기서 상기 키메라 캡시드 단백질은 적어도 제2의 상이한 AAV 캡시드 서열로부터 유래된 적어도 하나의 가변 영역으로 치환된 적어도 하나의 가변 영역을 갖는 제1 AAV 캡시드 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 비-자연발생적 캡시드 단백질은 VP1 캡시드 단백질이다. 기타 구현예에서, 키메라 캡시드 단백질은 제1 수령체 AAV 캡시드 서열과 상이한 AAV 캡시드 서열로부터의 GBS 도메인 및/또는 GH 루프 영역을 추가로 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 키메라 AAV 캡시드 단백질은 제1 AAV 캡시드 서열 (수령체) 및 제2 상이한 AAV 캡시드 서열 (공여체)로부터의 적어도 하나의 치환된 가변 영역에서 유래된 골격 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 본 발명의 키메라 AAV 캡시드 단백질은, 제1 수령체 캡시드 서열과 상이한 하나 이상의 공여체 AAV 캡시드(들)로부터의 가변 영역(들)으로 각각 치환된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 9개 모두의 가변 영역을 갖는다. 기타 구현예에서, 본 발명의 AAV 캡시드 단백질은 수령체 캡시드 서열과는 상이한 공여 캡시드 서열로부터 유래된 GBS 도메인 또는 GH 루프 영역 서열을 갖는다. 대안적으로, 본 발명의 키메라 AAV 캡시드는 제1 AAV 캡시드 서열과 상이한 동일한 AAV 캡시드 서열로부터의 적어도 하나의 치환 가변 영역 및 GBS를 갖는다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 어느 키메라 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 비-자연발생적 AAV 입자를 제공한다. 이러한 AAV는 또한 숙주 세포에서 전이유전자의 발현을 조절하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 이종 전이유전자를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 단리된 AAV 캡시드 단백질을 제공하며, 여기서 상기 캡시드 단백질은 제1 AAV 캡시드 서열로부터의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제1 AAV 캡시드 서열은 제1 AAV 캡시드 서열과 상이한 적어도 하나의 AAV 캡시드 서열로부터의 각각의 가변 영역으로 치환된 적어도 2개의 가변 영역, 또는 제1 AAV 캡시드 서열과 상이한 적어도 하나의 AAV 캡시드 서열로부터의 각각의 가변 영역으로 치환된 적어도 3개의 가변 영역, 제1 AAV 캡시드 서열과 상이한 적어도 하나의 AAV 캡시드 서열로부터의 각각의 가변 영역으로 치환된 적어도 4개의 가변 영역, 또는 제1 AAV 캡시드 서열과는 상이한 적어도 하나의 AAV 캡시드 서열로부터의 각각의 가변 영역으로 치환된 적어도 5개의 가변 영역, 또는 제1 AAV 캡시드 서열과 상이한 적어도 하나의 AAV 캡시드 서열로부터의 각각의 가변 영역으로 치환된 적어도 6개의 가변 영역, 또는 상기 제1 AAV 캡시드 서열과 상이한 적어도 하나의 AAV 캡시드 서열로부터의 각각의 가변 영역으로 치환된 적어도 7개의 가변 영역, 또는 제1 AAV 캡시드 서열과 상이한 적어도 하나의 AAV 캡시드 서열로부터의 각각의 가변 영역으로 치환된 적어도 8개의 가변 영역, 또는 제1 AAV 캡시드 서열과 상이한 적어도 하나의 AAV 캡시드 서열로부터의 각각의 가변 영역으로 치환된 적어도 2개의 가변 영역을 갖는다. 예를 들어, 치환된 가변 영역(들)은 동일한 AAV 캡시드 서열로부터 유래되거나, 또는 치환된 가변 영역은 제1 AAV 캡시드 서열과 상이한 2개 이상의 상이한 AAV 캡시드 서열들로부터 유래한다. 또한, 본 발명의 이들 AAV 캡시드 단백질 중 어느 것에서, GBS 및/또는 GH 루프는 또한 치환되며, 제1 AAV 캡시드 서열과는 상이한 어느 AAV 공여체 캡시드 서열로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 어느 키메라 AAV 캡시드에서, 제1/수령체 AAV 캡시드 서열 및 제2/공여체 AAV 캡시드 서열은 예를 들어 하기 AAV 서열과 관련된 캡시드 서열을 포함하는 어느 공지되거나 본원에 기재된 AAV 캡시드 서열일 수 있다: AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-3B, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV- 12, AAV-13, AAVbo, AAVmo, AAV6.2, AAVRH.8, AAV4.10, AAVanc80L65 또는 AAVanc110 또는 어느 다른 AAV 혈청형 또는 본원에 기재된 캡시드 서열. 위형 rAAV의 생산은 예를 들어 WO 01/83692에 개시되어 있다. 다른 유형의 rAAV 변이체, 예를 들어 캡시드 돌연변이를 갖는 rAAV가 또한 고려된다. 예를 들어 하기를 참고한다: Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014).
특정 구현예에서, 본 발명의 키메라 AAV 캡시드 단백질은 서열 번호 90 내지 157 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있는데, 이들은 수령체 골격 서열에서 각각의 가변 영역(들)에 대해 교환된 공여체 AAV 혈청형으로부터의 하나 이상의 가변 영역을 각각 갖는다.
본 발명의 어느 키메라 AAV 캡시드 단백질에서, 골격 서열 또는 제1 AAV 캡시드 서열로부터의 아미노산 서열은 서열 번호 1-73 중 어느 것의 아미노산 서열로부터 유래한다. 또한, 본 발명의 어느 키메라 AAV 캡시드 단백질에서, 제2의 AAV 혈청형으로부터의 공여체 서열 또는 아미노산 서열은 서열 번호 1-73 중 어느 것의 하나 이상의 가변 영역, GBS 도메인 및/또는 GH 루프의 아미노산 서열로부터 유래된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 조작된 키메라 AAV 캡시드 단백질 중 어느 것을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 또한, 본 발명은 이들 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 AAV 벡터, 및 본 발명의 키메라 AAV 캡시드 단백질 중 어느 것을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 AAV 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 이들 AAV 벡터를 포함하는 조성물(약학적 조성물을 포함)을 제공한다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 어느 비-자연발생적 천연 키메라 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 바이러스를 제공한다.
본 발명은 하기 단계들을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스 (AAV) 입자의 생산 방법을 제공한다: 본 발명의 어느 AAV 벡터로 형질 감염된 세포를 배양하는 단계, 및 상기 형질전환된 세포의 상청액 유래의 재조합 AAV 입자를 회수하는 단계. 또한, 본 발명은 본 발명의 바이러스 벡터 또는 캡시드 단백질 중 어느 것을 포함하는 바이러스 입자 및 이들 바이러스 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
본 발명의 일 구현예는, 숙주 세포 내 이종 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 이종 유전자를 갖는 전이유전자에 측접한 5’ 및 3’ AAV 역전 말단 반복 서열을 갖는 제1 핵산 벡터, 및 AAV rep 및 cap 핵산 서열을 갖는 제2 핵산 벡터를 도입한 바이러스 생산 세포를 배양함에 의하여, 그리고 바이러스 생산 세포 배양물의 상청액으로부터 AAV를 회수함에 의하여, 본원에 기술된 재조합 AAV 중 어느 것을 생산하는 방법이 제공되며, 상기 cap 핵산 서열은 서열 번호 15-157 중 어느 것과 적어도 95% 일치하는 AAV 캡시드를 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 바이러스 생산 세포는 곤충 세포이다. 바람직한 구현예에서, 곤충 세포는 Sf9 세포이다. 추가의 구현예에서, 제1 핵산 벡터를 함유하는 배큘로바이러스에 의한 바이러스 생산 세포의 감염에 의해, 제1 핵산 벡터가 바이러스 생산 세포 내로 도입된다. 또 다른 구현예에서, 제1 및 제2 핵산 벡터는 제1 핵산 벡터를 함유하는 제1 배큘로바이러스 및 제2 핵산 벡터를 함유하는 제2 배큘로바이러스에 의한 바이러스 생산 세포의 감염에 의해 바이러스 생산 세포 내로 도입된다. 추가의 구현예에서, 본 발명은 본원에 제공된 제조 방법에 의해 제조된 AAV를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 AAV 벡터 또는 바이러스의 어느 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 장애 또는 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 어느 AAV 벡터 또는 바이러스의, 장애 또는 질환의 치료용 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 질환 또는 장애의 치료를 위한 본 발명의 어느 AAV 벡터 또는 바이러스 중 어느 것을 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 피험체의 질환 또는 장애는 내인성 단백질의 비정상적인 활성과 관련된다. 본원에 사용된 "내인성 단백질"은 질환 또는 장애를 앓고 있는 피험체의 게놈에 의해 암호화되는 단백질 또는 유전자 생성물을 의미한다.
"AAV 비리온(virion)" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "AAV 벡터 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡시드화된 폴리뉴클레오타이드 AAV 벡터로 이루어진 바이러스 입자를 의미한다. 입자가 이종 폴리뉴클레오타이드 (즉, 포유동물 세포에 전달되는 전이유전자와 같은 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오타이드)를 포함하는 경우, 이는 통상 "AAV 벡터 입자" 또는 간단히 "AAV 벡터 ". 따라서, AAV 벡터 입자의 생산은 반드시 AAV 벡터의 생산을 포함하는데, 이는 그러한 벡터가 AAV 벡터 입자 내에 함유되어 있기 때문이다.
본 발명은 또한 본 발명의 AAV 벡터들 중 어느 것을 포함하는 세포, 및 본 발명의 이들 세포에 의해 생성된 바이러스 입자를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "역전된 말단 반복부 (inverted terminal repeat, ITR)"는 AAV 게놈의 5 '및 3' 말단에서 발견되는 당업계에 인정되는 영역을 의미하며, 이는 DNA 복제 기원으로서 시스(cis) 방식으로, 그리고 바이러스 게놈에 대한 패키징 신호로서 작용한다. AAV rep 암호화 영역과 함께, AAV ITR은 플라스미드 벡터로부터 효율적인 절단 및 탈출을 제공하고, 두 개의 인접한 ITR 사이에 삽입된 뉴클레오타이드 서열을 숙주 세포 게놈에 통합시킨다. 특정 AAV- 관련 ITR의 서열은 문헌 [Yan et al., J. virol. 79 (1) : 364-379 (2005)]에 기재되어 있고, 이는 전체가 참고로서 본원에 포함되었다.
본원에 사용된 "생산적 AAV 감염을 생성시키기 위한 헬퍼(helper) 작용"이라는 어구는, AAV 유전자 생성물을 제공하도록 발현될 수 있는 AAV-유래 암호화 서열을 지칭하며, AAV 유전자 생성물은 차례로 생산적 AAV 복제에 대하여 트랜스(trans) 방식으로 작용한다. 따라서 AAV 헬퍼 기능에는 rep 및 cap 영역이 포함된다. rep 발현 생성물은 그 중에서도, DNA 복제의 AAV 기원의 인식, 결합 및 니킹 (nicking), DNA 헬리카제 활성; 및 AAV (또는 다른 이종성) 프로모터로부터의 전사 조절을 포함하는 많은 작용을 갖는 것으로 나타났다. cap 발현 제품은 필요한 패키징 작용을 제공한다. AAV 헬퍼 기능은 본원에서 AAV 벡터로부터 누락된 AAV 작용을 트랜스 방식으로 보완하기 위해 사용된다. 생산적 AAV 감염을 유발하는 헬퍼 기능에는 또한 배큘로바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스 또는 우두 바이러스로부터의 특정 헬퍼 기능이 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 작제물은 AAV rep 및 cap 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "AAV rep 유전자"는 바이러스 게놈을 복제하고 잠재적 감염 동안 숙주 게놈에 바이러스 게놈을 삽입하는데 필요한 바이러스의 복제 단백질을 암호화하는 AAV 게놈의 당업계에서 인정된 영역을 지칭한다. AAV rep 암호화 영역의 추가 설명을 위해, 예를 들어, 문헌 [Muzyczka et al., Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129 (1992); Kotin et al., Human Gene Therapy 5:793-801 (1994)]를 참고하며, 이들의 개시 내용은 본원에 참고로 포함된다. 본원에서 사용되는 rep 암호화 영역은 어느 바이러스 혈청형, 예를 들어 상기 기재된 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 상기 영역은 모든 야생형 유전자를 포함할 필요는 없지만, 적절한 수령체 세포에서 발현될 때 rep 유전자가 원하는 작용적 특성을 보유하는 한, 예를 들어 뉴클레오타이드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "AAV cap 유전자"는 바이러스 게놈을 패키징하기 위해 필요한 바이러스의 코트(coat) 단백질을 암호화하는 AAV 게놈의 당업계에서 인정된 영역을 지칭한다. cap 암호화 영역의 추가적인 기술을 위하여, 예를 들어, 문헌 [Muzyczka et al., Current Topics in Microbiol . and Immunol. 158:97-129 (1992); Kotin et al., Human Gene Therapy 5:793-801 (1994)]을 참조하며, 이들의 개시 내용은 본원에 참고로 포함된다. 본원에 사용된 AAV cap 암호화 영역은 상기 한 바와 같이 어느 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 상기 영역은 모든 야생형 cap 유전자를 포함할 필요는 없지만, 유전자가 AAV 벡터와 함께 숙주 세포에 존재할 때 충분한 패키징 작용을 제공하는 한, 예를 들어 뉴클레오타이드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있다.
"형질 감염(transfection)"이라는 용어는 세포에 의한 외래 DNA의 흡수를 의미한다. 외인성 DNA가 세포막 내부에 도입되면 세포가 "형질 감염"되었다. 다수의 형질 감염 기술이 당업계에 일반적으로 공지되어있다. 예를 들어, 문헌 [Graham et al., vi rology 52 : 456 (1973)]; Sambrook 등, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier (1986); Chu et al., Gene 13 : 197 (1981)]를 참고하며, 이들의 개시 내용은 본원에 참고로 인용되어있다. 이러한 기술은 적합한 숙주 세포 내로 하나 이상의 외인성 DNA 모이어티, 예컨대 뉴클레오타이드 통합 벡터 및 다른 핵산 분자를 도입하는데 사용될 수 있다. 이 용어는 화학적, 전기적 및 바이러스 매개 형질 감염 과정을 포함한다.
바이러스성 작제물은, 일부 구현예에서, 어느 세포 유형에서 생산적 형질전환, 형질 감염 또는 감염이 가능한 배큘로바이러스 벡터의 형태이다. 일부 구현예에서, 바이러스 작제물은 이종 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 AAV 입자가 본원에 기술된다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 그의 게놈에 이종 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 포함한다.
"이종 단백질 또는 펩타이드"라는 용어는 몇몇을 예를 들자면, 헥사히스티딘, FLAG, myc, 폴리히스티딘 또는 표지 또는 면역원, 보조제, 선택 마커, 치료용 단백질 또는 표적 단백질 또는 펩타이드와 같은 태그를 포함하는, 야생형 AAV에 의해 발현되지 않는 어느 단백질을 지칭한다.
본원에 기술된 예시적 이종 단백질은 비제한적으로 하기를 포함한다: β-글로빈, 헤모글로빈, 조직 플라스미노겐 활성인자, 및 응집 인자; 콜로니 자극 인자 (CSF); 인터류킨, 예컨대 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 등; 성장 인자, 예컨대 각질세포 성장 인자 (KGF), 줄기 세포 인자 (SCF), 섬유아세포 성장 인자 (FGF, 예컨대 염기성 FGF 및 산성 FGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 골 형태형성 단백질 (BMP), 표피 성장 인자 (EGF), 성장 분화 인자-9 (GDF-9), 간암 유래 성장 인자 (HDGF), 미오스타틴 (GDF-8), 신경 성장 인자 (NGF), 뉴로트로핀, 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 트롬보포이에틴 (TPO), 형질전환 성장 인자 알파 (TGF-α), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 등; 가용성 수용체, 예컨대 가용성 TNF-α 수용체, 가용성 인터류킨 수용체 (예컨대, 가용성 IL-1 수용체 및 가용성 유형 Ⅱ IL-1 수용체), 가용성 γ/△ T 세포 수용체, 가용성 수용체의 리간드-결합 단편 등; 효소, 예컨대 α-글루코시다제, 이미글루카라제, β-글루코세레브로시다아제, 및 알글루세라제; 효소 활성인자, 예컨대 조직 플라스미노겐 활성인자; 케모카인, 예컨대 1P-10, 인터페론-감마에 의하여 유래된 모노카인(Mig), Groα/IL-8, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, MCP-1, PF-4 등; 혈관형성 제제, 예컨대 혈관 내피 성장 인자 (VEGF, 예컨대, VEGF121, VEGF165, VEGF-C, VEGF-2), 신경교종-유래 성장 인자, 안지오제닌, 안지오제닌-2; 등; 항-혈관형성 제제, 예컨대 가용성 VEGF 수용체; 단백질 백신; 신경활성 펩타이드, 예컨대 신경 성장 인자 (NGF), 브라디키닌, 콜레시스토키닌, 가스트린, 세크레틴, 옥시토신, 고나도트로핀-방출 호르몬, 베타-엔도르핀, 엔케팔린, 물질 P, 소마토스타틴, 프로락틴, 갈라닌, 성장 호르몬-방출 호르몬, 봄베신, 다이노르핀, 와파린, 뉴로텐신, 모틸린, 티로트로핀, 신경펩티드 Y, 황체형성 호르몬, 칼시토닌, 인슐린, 글루카곤, 바소프레신, 안지오텐신 Ⅱ, 티로트로핀-방출 호르몬, 혈관활성 장관 펩타이드, 수면(sleep) 펩타이드, 등; 혈전용해성 제제; 심방 나트륨이뇨 펩타이드; 릴렉신; 신경교섬유 산성 단백질; 여포 자극 호르몬 (FSH); 인간 알파-1 항트립신; 백혈병 억제성 인자 (LIF); 조직 인자, 황체형성 호르몬; 대식세포 활성화 인자; 종양 괴사 인자 (TNF); 호중구 화학주성 인자 (NCF); 메탈로프로테이나제(metalloproteinase)의 조직 억제제; 혈관활성 장관 펩타이드; 안지오제닌; 안지오트로핀; 피브린; 히루딘; IL-1 수용체 길항제; 모양체 신경영양 인자 (CNTF); 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF); 뉴로트로핀 3 및 4/5 (NT-3 및 4/5); 신경아교세포 유래 신경영양 인자 (GDNF); 방향족 아미노산 데카르복실라제 (AADC); 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ, 인자 X; 디스트로핀 또는 니니(nini)-디스트로핀; 리소좀 산 리파제; 페닐알라닌 하이드록실라제 (PAH); 글리코겐 저장 질환-관련 효소, 예컨대 글루코스-6-포스파타제, 산 말타제, 글리코겐 탈분지화 효소, 근육 글리코겐 포스포릴라제, 간 글리코겐 포스포릴라제, 근육 포스포프룩토키나제, 포스포릴라제 키나제, 글루코스 수송체, 알돌라제 A, β-에놀라제, 글리코겐 신타제; 및 리소좀 효소.
본 발명은 신규한 AAV 캡시드 단백질, 이들 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산, 및 이들 신규한 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 바이러스를 제공한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 여러 포유동물 조직으로부터 단리 및 식별되었다. 신규한 AAV 캡시드 VP1 단백질의 아미노산 서열을 서열 번호 15 내지 89로 기재하고, 관련 VP2 및 VP3 영역의 위치를 본 명세서에 개시한다. 또한, 본 발명은, 일 AAV 캡시드 서열로부터 유래된 골격 아미노산 서열, 및 적어도 하나의 다른 상이한 AAV 캡시드 서열, 예컨대 VR, GBS 및/또는 GH 루프 유래의 캡시드 단백질의 단편을 갖는 신규한 조작된 키메라 AAV 캡시드 단백질을 제공한다. 예시적인 조작된 키메라 AAV 캡시드 VP1 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 90 내지 157로서 제시된다.
AAV 벡터
본 명세서에 사용된 용어 "AAV"는 아데노-관련 바이러스에 대한 표준 약어이다. 아데노-관련 바이러스는 단일 가닥 DNA 파보바이러스로서, 공동-감염성 헬퍼 바이러스에 의해 특정 작용이 제공되는 세포에서만 성장한다. 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 특성화된 AAV의 적어도 13개의 혈청형이 존재한다. AAV에 대한 일반적인 정보 및 리뷰는 예를 들어, 문헌 [Carter, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pp. 169-228 (1989), and Berns, virology, pp. 1743-1764, Raven Press, (New York, 1990)]에서 찾을 수 있다. 그러나 다양한 혈청형이 유전적 수준에서도 구조적으로나 기능적으로 모두 매우 밀접하게 관련되어 있다는 것이 잘 알려져 있기 때문에 이러한 동일한 원리가 추가적인 AAV 혈청형에 적용될 것으로 충분히 기대된다. (예를 들어, Blacklowe, pp. 165-174 of Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed. (1988); and Rose, Comprehens Ⅳe virology 3:1-61 (1974)를 참고하라). 예를 들어, 모든 AAV 혈청형은 상동 rep 유전자에 의해 매개되는 매우 유사한 복제 성질을 명백히 나타내는 것으로 보이고; 모두 AAV6에서 발현된 것과 같은 3개의 관련된 캡시드 단백질을 가지고 있다. 관련성의 정도는 이종이합체 (heteroduplex) 분석에 의해 추가로 제시되며, 이는 유전체의 길이에 따른 혈청형 간의 광범위한 교차-혼성화; 및 "역전된 말단 반복 서열"(ITR)에 상응하는 말단에서의, 유사 자가-어닐링 분절의 존재를 나타낸다. 유사한 감염 패턴은 또한 각 혈청형의 복제 작용이 유사한 조절 규제하에 있음을 시사한다.
본원에 사용된 "AAV 벡터"는 AAV 말단 반복 서열 (ITR)이 측면에 위치하는 하나 이상의 관심있는 폴리뉴클레오타이드 (또는 전이유전자)를 포함하는 벡터를 지칭한다. 이러한 AAV 벡터는, rep 및 cap 유전자 생성물을 암호화하고 발현하는 벡터로 형질 감염된 숙주 세포에 존재할 때, 복제 및 감염성 바이러스 입자 내로 패키징될 수 있다.
"AAV 비리온" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "AAV 벡터 입자" 또는 "AAV 바이러스"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡시드화된 폴리뉴클레오타이드 AAV 벡터로 이루어진 바이러스 입자를 의미한다. 입자가 이종 폴리뉴클레오타이드 (즉, 포유동물 세포에 전달되는 전이유전자와 같은 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오타이드)를 포함하는 경우, 이는 통상 "AAV 벡터 입자" 또는 간단히 "AAV 벡터"로 지칭된다. 따라서, AAV 벡터 입자의 생산은 반드시 AAV 벡터의 생산을 포함하는데, 이는 그러한 벡터가 AAV 벡터 입자 내에 함유되어 있기 때문이다.
AAV "rep" 및 "cap" 유전자는 복제 및 캡시드화 단백질을 각각 암호화하는 유전자이다. AAV rep 및 cap 유전자는 현재까지 조사된 모든 AAV 혈청형에서 발견되었으며, 본원 및 인용된 참고 문헌에 기술되어 있다. 야생형 AAV에서, rep 및 cap 유전자는 일반적으로 바이러스 게놈에서 서로 인접하여 발견되며, [즉, 인접한 또는 중복되는 전사 단위로 "함께 움직임(coupled)"], 일반적으로 AAV 혈청형 사이에서 보존된다. AAV rep 및 cap 유전자는 또한 개별적으로 및 집합적으로 "AAV 패키징 유전자"라고 불린다. 본 발명에 따른 AAV cap 유전자는 rep 및 아데노 헬퍼 기능의 존재하에 AAV 벡터를 패키징할 수 있는 Cap 단백질을 암호화하고, 표적 세포 수용체에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, AAV cap 유전자는 특정 AAV 혈청형, 예를 들어 표 1에 나타낸 혈청형으로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질을 암호화한다.
표 1. AAV 항원형
AAV의 생산에 사용되는 AAV 서열은 어느 AAV 혈청형의 게놈으로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, AAV 혈청형은 아미노산 및 핵산 수준에서 현저한 상동성을 갖는 게놈 서열을 가지며, 유사한 유전적 세트를 제공하고, 본질적으로 물리적 및 작용적으로 동등한 비리온을 생성하며, 실질적으로 동일한 기전에 의해 복제 및 조립한다. AAV 혈청형의 게놈 서열 및 게놈 유사성에 대한 논의는 예를 들어 하기를 참고한다: 유전자은행 수탁 번호 U89790; 유전자은행 수탁 번호 J01901; 유전자은행 수탁 번호 AF043303; 유전자은행 수탁 번호 AF085716; Chlorini et al., J. vir. 71:6823-33(1997); SrⅣastava et al., J. vir. 45:555-64 (1983); Chlorini et al., J. vir. 73:1309-1319 (1999); Rutledge et al., J. vir. 72:309-319 (1998); 및 Wu et al., J. vir. 74: 8635-47 (2000).
모든 공지된 AAV 혈청형의 게놈 조직은 매우 유사하다. AAV의 게놈은 길이가 약 5,000개 뉴클레오타이드 (nt) 미만인 선형의 단일 가닥 DNA 분자이다. 역전된 말단 반복부 (ITR)는 비-구조적 복제 (Rep) 단백질 및 구조적 (VP) 단백질의 독특한 암호화 뉴클레오타이드 서열의 측면에 위치한다. VP 단백질은 캡시드를 형성한다. 말단부 145nt는 자기 상보적이며, T-자형 헤어핀을 형성하는 에너지적으로 안정한 분자내 이합체가 형성될 수 있도록 조직화된다. 이러한 헤어핀 구조는 바이러스 DNA 복제의 기원으로 작용하여, 세포 DNA 중합 효소 복합체의 프라이머 역할을 한다. Rep 유전자는 Rep 단백질, Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40을 암호화한다. Rep78 및 Rep68은 p5 프로모터로부터 전사되고, Rep 52 및 Rep40은 p19 프로모터로부터 전사된다. cap 유전자는 VP 단백질, VP1, VP2 및 VP3을 암호화한다. cap 유전자는 p40 프로모터에서 전사된다.
일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 Sf9 또는 HEK 세포와 같은 특정 세포 유형에서의 발현을 위한 조절 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 곤충 숙주 세포 또는 포유동물 숙주 세포에서 외래 유전자를 발현시키는 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 본 발명을 실시할 수 있다. 곤충 세포에서 분자 공학 및 폴리펩타이드의 발현을 위한 방법론은 예를 들어, 하기에 기술되어 있다: Summers and Smith. A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bull. No. 7555, College Station, Tex. (1986); Luckow. 1991. In Prokop et al., Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors' Recombinant DNA Technology and Applications, 97-152 (1986); King, L. A. and R. D. Possee, The baculovirus expression system, Chapman and Hall, United Kingdom (1992); O'Reilly, D. R., L. K. Miller, V. A. Luckow, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York (1992); W.H. Freeman and Richardson, C. D., Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, volume 39 (1995); 미국 특허 제4,745,051호; US2003148506; 및 WO 03/074714. AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 전사에 특히 적합한 프로모터는, 예를 들어 다면체(polyhedron) 프로모터이다. 그러나, 곤충 세포에서 활성 인 다른 프로모터가 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 p10, p35 또는 IE-1 프로모터 및 상기 참고 문헌에 기재된 추가적인 프로모터도 또한 고려된다.
이종 단백질의 발현을 위한 곤충 세포의 사용은 벡터와 같은 핵산, 예컨대 벡터, 예를 들어 곤충-세포 양립가능한 벡터를 그러한 세포에 도입하는 방법, 및 배양액 중에서 상기 세포를 유지하는 방법이 잘 기록되어 있다. 예를 들어, 하기를 참고한다: METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, ed. Richard, Humana Press, NJ (1995); O'Reilly et al., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS , A LABORATORY MANUAL, Oxford UnⅣ. Press (1994); Samulski et al., J. vir. 63:3822-8 (1989); Kajigaya et al., Proc . Nat'l . Acad . Sci . USA 88:4646-50 (1991); Ruffing et al., J. vir. 66:6922-30 (1992); Kirnbauer et al., vir . 219:37-44 (1996); Zhao et al., vir . 272:382-93 (2000); 및 Samulski et al., 미국 특허 제6,204,059호. 일부 구현예에서, 곤충 세포에서 AAV를 암호화하는 핵산 작제물은 곤충 세포-양립가능한 벡터이다. 본 명세서에 사용된 "곤충 세포-양립가능한 벡터" 또는 "벡터"는 곤충 또는 곤충 세포의 생산적 형질전환 또는 형질 감염이 가능한 핵산 분자를 말한다. 예시적인 생물학적 벡터는 플라스미드, 선형 핵산 분자 및 재조합 바이러스를 포함한다. 모든 벡터는 곤충 세포-양립가능한 경우 사용될 수 있다. 벡터는 곤충 세포의 게놈에 통합될 수 있지만, 곤충 세포에서 벡터의 존재는 영구적일 필요는 없고 일시적인 에피좀 벡터도 포함된다. 벡터는 공지된 어느 수단, 예를 들어 세포의 화학적 처리, 전기 천공법, 또는 감염에 의해 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 배큘로바이러스, 바이러스 벡터 또는 플라스미드이다. 보다 바람직한 구현예에서, 벡터는 배큘로바이러스이고, 즉 작제물은 배큘로바이러스 벡터이다. 배큘로바이러스 벡터 및 이의 사용 방법은 곤충 세포의 분자 공학에 관한 상기 인용 문헌에 기재되어 있다.
배큘로바이러스는 절지동물의 외피 DNA 바이러스이며, 이의 2개 구성원은 세포 배양에서 재조합 단백질을 생산하기 위한 발현 벡터로 잘 알려져있다. 배큘로바이러스는 순환하는 이중-가닥 게놈 (80-200kbp)를 가지고 있는데 이것은 특정 세포에 큰 게놈 내용물을 전달할 수 있도록 조작될 수 있다. 벡터로 사용되는 바이러스는 일반적으로 오토그라파 칼리포니카 다중캡시드 핵다각체 바이러스(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus; AcMNPV) 또는 봄빅스 모리(Bombyx mori; (Bm) NPV)이다 (Kato et al., Appl . Microbiol . Biotechnol . 85 (3) : 459-470 (2010)). 배큘로바이러스는 재조합 단백질의 발현을 위한 곤충 세포의 감염에 통상 사용된다. 특히, 곤충에서의 이종 유전자의 발현은 예를 들어 하기에서 기술된 바와 같이 달성될 수 있다: 미국 특허 제4,745,051호; Friesen et al., Curr . Top . Microbiol . Immunol . 131:31-49. (1986); EP 127,839; EP 155,476; Miller et al., Ann . Rev . of Microbiol . 42: 177-199 (1988); Carbonell et al., Gene 73(2):409-18 (1988); Maeda et al., Nature 315(6020):592-4 (1985); Lebacq-Verheyden et al., Mol . Cell. Biol . 8(8):3129-35 (1988); Smith et al., Proc. Natl . Acad . Sci . U S A. 82(24):8404-8 (1985); Miyajima et al., Gene 58(2-3):273-81 (1987); 및 Martin et al., DNA 7(2):99-106 (1988). 단백질 생산에 사용될 수 있는 다수의 배큘로바이러스 균주 및 변이체 및 상응하는 허용성 곤충 숙주 세포는 하기에 기술되어 있다: Luckow et al., Nature Biotechnology 6:47-55 (1988), 및 Maeda et al., Nature 315(6020):592-4 (1985).
신규한 AAV 캡시드 단백질
제1 측면에서, 본 발명은 다양한 포유동물 조직으로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드 단백질을 제공한다. 신규한 AAV VP1 캡시드 단백질은 서열 번호 15 내지 89로서 제공되며, 관련 VP2 및 VP3 영역의 위치가 본원에 기재되어 있다. 본 발명은 또한 이들 신규한 AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 발명은 본원에 기술된 조작된 키메라 캡시드 단백질 (총칭하여 본원에서 "본 발명의 AAV 캡시드 단백질"이라 칭함) 및 본 발명의 AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 신규한 AAV 캡시드 단백질의 아미노산 서열을 제공한다. 또한, 이들 AAV 캡시드 핵산 및 본 발명의 아미노산 서열의 단편이 제공된다. 이들 서열 각각은 다양한 벡터 시스템 및 숙주 세포에서 용이하게 이용될 수 있다. 캡시드 VP1 단백질의 바람직한 단편은 VP2, VP3 및 가변 영역, GBS 도메인 및 GH 루프, 및 이들 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이들 단편은 다양한 벡터 시스템 및 숙주 세포에서 용이하게 이용될 수 있다. 그러한 단편은 단독으로, 다른 AAV 서열 또는 단편과 함께, 또는 다른 AAV 또는 비-AAV 바이러스 서열로부터의 요소와 조합하여 사용될 수 있다. 특히 바람직한 일면으로, 벡터는 본 발명의 AAV 캡시드 서열을 함유한다.
본 발명의 AAV 캡시드 서열 및 그의 단편은 rAAV의 생산에 유용하며, 또한 안티센스 전달 벡터, 유전자 치료 벡터, 또는 백신 벡터로서도 유용하다. 본 발명은 또한 본 발명의 신규한 AAV 캡시드 서열을 함유하는 핵산 분자, 유전자 전달 벡터 및 숙주 세포를 제공한다.
적절한 단편은 본원에 제공된 정보를 사용하여 결정할 수 있다. 정렬은 인터넷의 웹 서버를 통해 접근할 수 있는, "Clustal W"와 같이 공공연하게 또는 상업적으로 이용 가능한 여러 서열 정렬 프로그램 중 하나를 사용하여 수행된다. 대안적으로, 벡터 NTI 유틸리티도 사용된다. 상기 기술된 프로그램에 포함된 것을 포함하여, 뉴클레오타이드 서열 동일성을 측정하는데 사용될 수 있는 당업계에 공지된 다수의 알고리즘이 또한 존재한다. 다른 예로서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 GCG 버전 6.1의 프로그램인 FASTA를 사용하여 비교될 수 있다. FASTA는 대상 서열(query)와 검색 서열 사이의 최선의 중첩 영역의 정렬 및 백분율 서열을 제공한다. 예를 들어, 핵산 서열 간의 백분율 서열 동일성은 GCG 버전 6.1에 제공된 바와 같은 디폴트 파라미터 (워드 크기 6 및 스코어링 매트릭스에 대한 NOPAM 인자)를 사용하여 FASTA를 사용하여 계측될 수 있다. 유사한 프로그램, 예를 들어 "Clustal X" 프로그램을 아미노산 서열에 이용 가능하다. 사용할 수 있는 추가 서열 정렬 도구는 [단백질 서열 정렬; (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)] 및 [핵산 정렬; http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html)]에 의하여 제공된다. 일반적으로, 이들 프로그램 중 어느 것은 디폴트 설정으로 사용되지만, 당업자는 필요에 따라 이들 설정을 변경할 수 있다. 대안적으로, 당업자는 적어도 참조된 알고리즘 및 프로그램에 의해 제공되는 것과 동일한 아이덴티티 또는 정렬 수준을 제공하는 다른 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다.
핵산 또는 그의 단편을 언급할 때 용어 "실질적인 동일성(substatial identity)", "실질적인 상동성(substatial homology)" 또는 "실질적인 유사성 (substatial similarity)"은, 다른 핵산 (또는 이의 상보적 가닥)과 적절한 뉴클레오타이드 삽입체 또는 결실체를 최적으로 정렬할 때, 정렬 서열의 적어도 약 95 내지 99% 동일성, 예를 들어 95% 동일성, 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성 및 99% 동일성과 같은 뉴클레오타이드 서열 동일성이 존재한다. 바람직하게는, 상동성은 비교되는 두 서열의 전체 길이, 또는 이의 판독 프레임, 또는 적어도 15개 뉴클레오타이드 길이의 다른 적합한 단편에 걸쳐 있다. 적합한 단편의 예가 본 명세서에 기재되어 있다. 또한 본 발명의 AAV 캡시드 및 그의 상보적 가닥을 암호화하는 핵산의 천연 변이체 및 조작된 변형물도 본 발명의 핵산 서열에 포함된다. 그러한 변형은 예를 들어, 당업계에 공지된 표지, 메틸화, 및 축퇴(degenerate) 뉴클레오타이드에 의한 하나 이상의 자연발생적 뉴클레오타이드의 치환을 포함한다.
아미노산 또는 그의 단편을 언급할 때 "실질적인 동일성", "실질적인 상동성" 또는 "실질적 유사성"이라는 용어는, 다른 아미노산 (또는 상보적 가닥)과 적절한 아미노산 삽입체 또는 결실체를 최적으로 정렬할 때, 정렬 서열의 약 95 내지 99%, 예컨대 95% 동일성, 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성 및 99% 동일성과 같은 아미노산 서열 동일성이 존재한다. 바람직하게는, 상동성은 비교되는 두 서열의 전체 길이, 또는 이의 단백질, 예를 들어, 길이가 적어도 8개 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 15개 아미노산인 cap 단백질, rep 단백질 또는 이의 단편에 걸쳐 있다. 적합한 단편의 예가 본 명세서에 기재되어 있다.
"고도로 보존된(highly conserved)"이란 용어는 80% 이상의 동일성, 바람직하게는 90% 이상의 동일성, 보다 바람직하게는 97% 이상의 동일성을 의미한다. 동일성은 당업자에게 알려진 알고리즘 및 컴퓨터 프로그램에 의지하여 당업자에 의해 쉽게 결정된다.
핵산 서열 또는 아미노산 서열의 문맥에서 "퍼센트 서열 동일성" 또는 "동일"이라는 용어는, 최대 대응을 위해 정렬될 때 두 서열 내의 동일한 잔기를 나타낸다. 서열 동일성 비교의 길이는 비교되는 두 서열의 전체 길이에 대해, 유전자 암호화 서열의 전체 길이 또는 적어도 약 500개 내지 5000개 뉴클레오타이드의 단편이 바람직하다. 그러나, 작은 단편, 예를 들어 적어도 약 9개 뉴클레오타이드, 통상 약 20개 내지 24개 뉴클레오타이드, 약 28개 내지 32개 뉴클레오타이드, 약 36개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드들 사이의 동일성도 또한 바람직할 수 있다. 유사하게, "퍼센트 서열 동일성"은, 단백질의 전체 길이 또는 그의 단편에 대한 아미노산 서열을 용이하게 계측될 수 있다. 적합하게는, 단편은 적어도 약 8개 아미노산 길이이고, 최대 약 700개 아미노산일 수 있다. 적합한 단편의 예가 본 명세서에 기재되어 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 AAV 캡시드 단백질을 함유하거나 포함하는 본 발명의 벡터는 중화 항체가 다른 바이러스 벡터뿐만 아니라 다른 AAV 혈청형 벡터의 유효성을 감소시키는 응용 분야의 용도에 특히 적합하다. 본 발명의 rAAV 벡터는 rAAV 재-투여 및 반복 유전자 치료에서 특히 유리하다.
또한 본 발명에는 AAV 캡시드 단백질, 그의 상보적 가닥, cDNA 및 이에 상보적인 RNA를 암호화하는 핵산의 단편이 포함된다. 적합한 단편은 적어도 15개 길이의 뉴클레오타이드이며, 기능성 단편, 즉 생물학적으로 흥미로운 단편이다. 이러한 단편은 대안적인 스플라이스 변이체인 캡시드의 3가지 가변 단백질 (VP)인 VP1, VP2 및 VP3을 암호화하는 서열을 포함한다. 본 발명의 AAV 캡시드를 암호화하는 핵산의 다른 적합한 단편은 캡시드 단백질의 개시 코돈을 함유하는 단편 및 본원에 기재된 VP1 캡시드 단백질의 가변 영역을 암호화하는 단편을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 AAV 핵산 서열로부터 발현된 AAV 캡시드 아미노산 서열, 펩타이드 및 단백질에 국한되지 않으며, 예를 들어, 화학적 방법 합성, 다른 합성 기술에 의해, 또는 다른 방법에 의해 생산된 아미노산, 펩티드 및 단백질을 포괄한다. 예를 들어, 본원에 기재된 어느 캡시드의 서열은 다양한 기술을 사용하여 용이하게 생성될 수 있다.
적절한 생산 기술은 당업자에게 잘 알려져있다. 예를 들어, 하기를 참고한다: Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, N.Y.). 대안적으로, 펩타이드는 잘 알려진 고체상 펩타이드 합성 방법 [(Merrifield, J. Am . Chem . Soc ., 85: 2149 (1962), Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis Freeman, 1969) pp.27-62]에 의해 합성될 수도 있다. 이들 및 다른 적합한 제조 방법은 당업자의 지식범위 내에 있으며, 본 발명을 제한하지 않는다.
AAV 캡시드는 VP1, VP2 및 VP3의 3가지 단백질로 구성되며, 이들은 선택적 스플라이스 변형체이다. 전체 길이 캡시드 서열은 VP2 및 VP3으로 지칭되는 스플라이싱된 변이체를 포함하는 VP1로 지칭된다. 본 발명은 또한 본 발명의 AAV 캡시드 단백질의 다른 기능성 단편을 제공한다. 캡시드 단백질의 다른 바람직한 단편은 가변 영역 (VR), 상기 가변 영역들 사이에 위치하는 불변 영역, GBS 도메인 및 GH 루프를 포함한다. 캡시드 단백질의 다른 바람직한 단편은 HPV 자체를 포함한다.
AAV2에서 서열 다양성의 영역을 계측하기 위한 알고리즘이 개발되었다. [Chiorini 등, J. virol, 73: 1309-19 (1999), Rutledge et al, J. virol ., 72: 309-319 (1998)]. 본원에 기재된 이러한 알고리즘 및/또는 정렬 기술을 사용하여 신규한 AAV 캡시드 서열의 VR을 계측한다. 본원에서 제공된 정렬을 디폴트 설정으로 Clustal X 프로그램을 사용하여 수행하거나, 또는 디폴트 설정으로 다른 상업적 또는 공공연하게 이용 가능한 정렬 프로그램을 사용하여, 당업자는 본 발명의 신규한 AAV 캡시드의 상응하는 단편을 용이하게 계측할 수 있다.
적절하게는, AAV 캡시드 단백질의 단편은 적어도 8개 아미노산 길이, 또는 적어도 9개 아미노산 길이, 또는 적어도 10개 아미노산 길이, 또는 적어도 20개 아미노산 길이, 또는 30개 아미노산 길이, 또는 적어도 50개 아미노산 길이, 또는 적어도 75개 아미노산 길이, 또는 적어도 100개 아미노산 길이, 또는 200개 아미노산 길이, 또는 250개 아미노산 길이, 또는 300개 아미노산 길이, 또는 350개 아미노산 길이, 또는 400개 아미노산 길이이다. 그러나, 다른 원하는 길이의 단편은 쉽게 이용될 수 있다. 본 발명의 모든 단편은 캡시드 AAV 단백질의 생물학적 활성을 보유한다. 그러한 단편은 재조합적으로 또는 다른 적절한 수단, 예를 들어 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다.
본 발명의 서열, 단백질 및 단편은 재조합 생산, 화학 합성 또는 다른 합성 수단을 포함하는 어느 적합한 수단에 의해 제조될 수 있다. 이러한 제조 방법은 당업자의 지식범위 내에 있으며 본 발명을 제한하지 않는다.
서열 목록에 제공된 핵산 서열을 포함하는 것 이외에, 본 발명은 본 발명의 AAV 캡시드 단백질의 아미노산 서열, 단백질 및 펩타이드를 발현하도록 고안된 핵산 분자 및 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명은 하기 AAV 캡시드 아미노산 서열 및 이들 서열 및/또는 그의 독특한 단편을 사용하여 제조된 인공 AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
인공 캡시드 또는 조작된 캡시드 단백질은, 본 발명의 AAV 캡시드 단백질 서열 (예를 들어, VP1 캡시드 단백질의 단편)을 또 다른 AAV 혈청형 (공지된 것 또는 신규한 것), 비-AAV 바이러스 공급원, 또는 비-바이러스 공급원 유래의 상동한 AAV 혈청형의 비-인접 부분들로부터 수득될 수 있는 이종 서열과 조합하여 사용하여, 어느 적합한 기술에 의하여 생성될 수 있다. 인공 AAV 혈청형은 키메라 AAV 캡시드, 재조합 AAV 캡시드 또는 "인간화된" AAV 캡시드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 캡시드 단백질을 이용한 AAV의 생산
본 발명은 AAV 캡시드 단백질 서열 및 이들 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하며, 이들은 본질적으로 이들 바이러스와 연관된 DNA 및/또는 세포 물질을 함유하지 않는다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 이종 유전자 또는 다른 핵산 서열을 표적 세포로 전달하는데 유용한 분자를 생산하기 위한, 본 발명의 신규한 AAV 서열 (그의 단편 포함)을 이용하는 분자를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 이종 유전자 또는 다른 핵산 서열을 표적 세포로 전달하는데 유용한 바이러스 벡터를 생산하기 위한, 본 발명의 AAV 캡시드 단백질 서열(그의 단편을 포함)을 이용하는 분자를 제공한다.
AAV 캡시드 핵산 서열을 함유하는 본 발명의 분자는 숙주 세포에 전달될 수 있는 어느 유전적 요소 (벡터), 예를 들어, 네이키드 DNA, 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 에피솜, 비-바이러스 전달 비히클 내 단백질 (예컨대, 지질계 담체), 이에 포함된 서열을 전달하는 바이러스 등을 포함할 수 있다. 선택된 벡터는 형질 감염, 전기천공, 리포솜 전달, 막 융합 기술, 고속 DNA 코팅 펠릿, 바이러스 감염 및 원형질체 융합을 포함하는 어느 적합한 방법에 의해 전달될 수 있다. 본 발명의 어느 구현예를 구성하는데 사용되는 방법은 핵산 가공 기술 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며, 유전 공학, 재조합 공학 및 합성 기술을 포함한다. 예를 들어, Sambrook et al, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.를 참고하라.
일 구현예에서, 본 발명의 벡터는 최소한 본 발명의 AAV 캡시드 또는 이의 단편을 암호화하는 서열을 함유한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 벡터는 최소한 AAV rep 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 서열을 함유한다. 선택적으로, 그러한 벡터는 AAV cap 및 rep 단백질을 모두 함유할 수 있다. AAV rep 및 cap이 제공되는 벡터에서, AAV rep 및 AAV cap 서열은 모두 동일한 AAV 혈청형 기원일 수 있다. 대안적으로, 본 발명은 그 내부의 rep 서열이 cap 서열을 제공하는 혈청형과는 상이한 AAV 혈청형으로부터의 벡터를 제공한다. 일 구현예에서, rep 및 cap 서열은 별도의 공급원 (예를 들어, 단리된 벡터, 또는 숙주 세포 및 벡터)으로부터 발현된다. 또 다른 구현예에서, 이들 rep 서열은 키메라 AAV 벡터를 형성하기 위해 상이한 AAV 혈청형의 cap 서열에 프레임에 맞게 융합된다. 선택적으로, 본 발명의 벡터는 AAV 5' ITR 및 AAV 3' ITR에 의해 측접된, 선택된 전이유전자를 포함하는 미니유전자(minigene)를 추가로 함유한다.
따라서, 일 구현예에서, 본원에 기술된 벡터는 아미노산 서열 서열 번호 1-73 중 어느 하나의 손상되지 않은 AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 함유한다. 대안적으로, 이들 벡터는 이종의 AAV 또는 비-AAV 캡시드 단백질 (또는 그의 단편)에 융합된 캡시드의 하나 이상의 단편을 함유하는 인공 캡시드를 암호화하는 서열을 함유한다. 이들 인공 캡시드 단백질은 본 발명의 AAV 캡시드 단백질 또는 다른 AAV 혈청형의 캡시드 중 어느 것의 인접하지 않은 부분으로부터 선택된다. 다른 예에서, VP3 단백질의 개시 코돈을 GTG로 변경시키는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, rAAV는 본 발명의 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질의 하나 이상의 가변 영역, 또는 다른 단편을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 선택된 발현 시스템에서의 발현, 수율의 증가 및/또는 순도를 개선시키거나, 또는 다른 바람직한 목적 (예를 들어, 방향성의 변화 또는 중화 항체 에피토프의 변경)에 대한 것일 수 있다.
본 명세서에 기재된 벡터, 예를 들어, 플라스미드는 다양한 목적에 유용하지만, AAV 서열 또는 그의 단편을 포함하는 캡시드를 함유하는 rAAV의 생산에 사용하기에 특히 적합하다. rAAV를 포함하는 이러한 벡터, 이의 요소, 구성 및 용도는 본원에 자세히 설명되어 있다.
공지된 AAV 캡시드 단백질의 VP1 아미노산 서열
본 발명은, 골격 (또는 수령체) 캡시드 단백질 서열 내 하나 이상의 가변 영역(들), GBS 영역 및/또는 GH 루프가 상이한 AAV 캡시드 서열 공여체 유래의 하나 이상의 가변 영역(들), GBS 영역 및/또는 GH 루프로 치환되는, 조작된 키메라 AAV 캡시드 단백질 (및 상기 캡시드 단백질을 포함하는 AAV)을 또한 제공한다. 수령체 및 공여체 서열은 어느 이전에 공지된 AAV 혈청형 또는 캡시드 서열, 또는 본원에 기재된 어느 신규한 AAV 캡시드 서열로부터 유래할 수 있다. 본 발명의 신규한 조작된 AAV 캡시드 단백질은 하나의 캡시드 서열로부터의 적어도 하나의 가변 영역, GBS 영역 또는 GH 루프 영역을, 수령체 캡시드 서열 내의 각각의 영역(들)로 교환함으로서 생성된다. 이와 관련하여, 수령체 VP1 캡시드 서열 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개 모두의 VR은 하나 이상의 상이한 VP1 캡시드로부터의 각각의 영역(들)에 의하여 대체될 수 있다. 본원에 기술된 VR 영역 교환 방법 (및 이들 키메라 캡시드 서열을 포함하는 모든 관련 AAV 바이러스)에 의해 제조될 수 있는 조작된 키메라 AAV 캡시드 서열의 다양한 조합 중 어느 것 및 모든 것이 본 발명에 의해 고려된다.
AAVbo의 VP1 서열은 서열 번호 1로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치는 하기 표 2에 정의된다.
AAVmo의 VP1 서열은 서열 번호 2로서 기재되며, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치는 하기 표 2에 정의된다.
AAV2의 VP1 서열은 서열 번호 3으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치는 하기 표 2에 정의된다.
AAV4의 VP1 서열은 서열 번호 4로서 제시되고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치는 하기 표 2에 정의된다.
AAV5의 VP1 서열은 서열 번호 5로서 기재되고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치는 하기 표 2에서 정의된다.
AAV6의 VP1 서열은 서열 번호 6으로 기재되고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치는 하기 표 2에 정의된다.
AAV6.2의 VP1 서열은 서열 번호 7로서 제시되고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치는 하기 표 2에 정의된다.
AAV7의 VP1 서열은 서열 번호 8로서 제시되고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치는 하기 표 2에서 정의된다.
AAV8의 VP1 서열은 서열 번호 9로서 제시되고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치는 하기 표 2에 정의된다.
AAV9의 VP1 서열은 서열 번호 10으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치는 하기 표 2에 정의된다.
AAVrh.8의 VP1 서열은 서열 번호 11로서 제시되고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치는 하기 표 2에 정의된다.
AAVrh.10의 VP1 서열은 서열 번호 12로서 제시되고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치는 하기 표 2에서 정의된다.
AAVanc80의 VP1 서열을 서열 번호 13으로 나타내었고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치는 하기 표 2에 정의된다.
AAVanc110의 VP1 서열은 서열 번호 14로서 제시되고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치는 하기 표 2에서 정의된다.
신규한 캡시드 단백질의 VP1
신규한 AAV VP1 캡시드 단백질은 개코원숭이, 게잡이 원숭이(crab-eating macaque), 시노몰구스 원숭이, 마모셋원숭이 및 돼지와 같은 포유동물로부터의 조직으로부터 단리되었다.
개코원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bba.21로 표시됨)을 서열 번호 15 (아미노산 1-742)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 아래의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 15의 아미노산 138-742에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 15의 아미노산 206-742에 걸쳐 있다.
개코원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bba.26로 표시됨)을 서열 번호 16 (아미노산 1-739)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 16의 아미노산 138-739에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 16의 아미노산 206-739에 걸쳐 있다.
개코원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bba.27로 표시됨)을 서열 번호 17 (아미노산 1-739)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 17의 아미노산 138-739에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 17의 아미노산 206-739에 걸쳐 있다.
개코원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bba.29로 표시됨)을 서열 번호 18 (아미노산 1-739)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 18의 아미노산 138-739에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 18의 아미노산 206-739에 걸쳐 있다.
개코원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bba.30으로 표시됨)을 서열 번호 19 (아미노산 1-739)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 19의 아미노산 138-739에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 19의 아미노산 206-739에 걸쳐 있다.
개코원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bba.31로 표시됨)을 서열 번호 20 (아미노산 1-742)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 20의 아미노산 138-742에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 20의 아미노산 206-742에 걸쳐 있다.
개코원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bba.32로 표시됨)을 서열 번호 21 (아미노산 1-742)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 21의 아미노산 138-742에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 21의 아미노산 206-742에 걸쳐 있다.
개코원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bba.33로 표시됨)을 서열 번호 22 (아미노산 1-742)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 22의 아미노산 138-742에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 22의 아미노산 206-742에 걸쳐 있다.
개코원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bba.34로 표시됨)을 서열 번호 23 (아미노산 1-739)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 23의 아미노산 138-739에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 23의 아미노산 206-739에 걸쳐 있다.
개코원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bba.35로 표시됨)을 서열 번호 24 (아미노산 1-739)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 24의 아미노산 138-739에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 24의 아미노산 206-739에 걸쳐 있다.
개코원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bba.36로 표시됨)을 서열 번호 25 (아미노산 1-739)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 25의 아미노산 138-739에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 25의 아미노산 206-739에 걸쳐 있다.
개코원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bba.37로 표시됨)을 서열 번호 26 (아미노산 1-739)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 26의 아미노산 138-739에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 26의 아미노산 206-739에 걸쳐 있다.
개코원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bba.38로 표시됨)을 서열 번호 27 (아미노산 1-739)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 27의 아미노산 138-739에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 27의 아미노산 206-739에 걸쳐 있다.
개코원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bba.41로 표시됨)을 서열 번호 28 (아미노산 1-739)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 28의 아미노산 138-739에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 28의 아미노산 206-739에 걸쳐 있다.
개코원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bba.42로 표시됨)을 서열 번호 29 (아미노산 1-739)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 29의 아미노산 138-739에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 29의 아미노산 206-739에 걸쳐 있다.
개코원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bba.43로 표시됨)을 서열 번호 30 (아미노산 1-739)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 30의 아미노산 138-739에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 30의 아미노산 206-739에 걸쳐 있다.
개코원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bba.44로 표시됨)을 서열 번호 31 (아미노산 1-739)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 31의 아미노산 138-739에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 31의 아미노산 206-739에 걸쳐 있다.
게잡이 원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bce.14로 표시됨)을 서열 번호 32 (아미노산 1-736)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 32의 아미노산 138-736에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 32의 아미노산 203-736에 걸쳐 있다.
게잡이 원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bce.15로 표시됨)을 서열 번호 33 (아미노산 1-736)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 33의 아미노산 138-736에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 33의 아미노산 203-736에 걸쳐 있다.
게잡이 원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bce.16으로 표시됨)을 서열 번호 34 (아미노산 1-736)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 34의 아미노산 138-736에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 34의 아미노산 203-736에 걸쳐 있다.
게잡이 원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bce.17로 표시됨)을 서열 번호 35 (아미노산 1-736)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 35의 아미노산 138-736에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 35의 아미노산 203-736에 걸쳐 있다.
게잡이 원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bce.18로 표시됨)을 서열 번호 36 (아미노산 1-736)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 36의 아미노산 138-736에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 36의 아미노산 203-736에 걸쳐 있다.
게잡이 원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bce.20으로 표시됨)을 서열 번호 37 (아미노산 1-733)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 37의 아미노산 138-733에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 37의 아미노산 203-733에 걸쳐 있다.
게잡이 원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bce.35로 표시됨)을 서열 번호 38 (아미노산 1-730)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 38의 아미노산 138-730에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 38의 아미노산 199-730에 걸쳐 있다.
게잡이 원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bce.36으로 표시됨)을 서열 번호 39 (아미노산 1-730)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 39의 아미노산 138-730에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 39의 아미노산 199-730에 걸쳐 있다.
게잡이 원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bce.39로 표시됨)은 서열 번호 40 (아미노산 1-736)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 40의 아미노산 138-736에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 40의 아미노산 203-736에 걸쳐 있다.
게잡이 원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bce.40으로 표시됨)은 서열 번호 41 (아미노산 1-736)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 41의 아미노산 138-736에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 41의 아미노산 203-736에 걸쳐 있다.
게잡이 원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bce.41로 표시됨)을 서열 번호 42 (아미노산 1-736)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 42의 아미노산 138-736에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 42의 아미노산 203-736에 걸쳐 있다.
게잡이 원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bce.42로 표시됨)은 서열 번호 43 (아미노산 1-736)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 43의 아미노산 138-736에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 43의 아미노산 203-736에 걸쳐 있다.
게잡이 원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bce.43로 표시됨)은 서열 번호 44 (아미노산 1-730)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 44의 아미노산 138-730에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 44의 아미노산 199-730에 걸쳐 있다.
게잡이 원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bce.44로 표시됨)은 서열 번호 45 (아미노산 1-730)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 45의 아미노산 138-730에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 45의 아미노산 199-730에 걸쳐 있다.
게잡이 원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bce.45로 표시됨)은 서열 번호 46 (아미노산 1-730)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 46의 아미노산 138-730에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 46의 아미노산 199-730에 걸쳐 있다.
게잡이 원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bce.46로 표시됨)은 서열 번호 47 (아미노산 1-730)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 47의 아미노산 138-730에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 47의 아미노산 199-730에 걸쳐 있다.
시노몰구스 마카크로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bcy.20으로 표시됨)을 서열 번호 48 (아미노산 1-730)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 48의 아미노산 138-730에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 48의 아미노산 199-730에 걸쳐 있다.
시노몰구스 마카크로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bcy.22로 표시됨)을 서열 번호 49 (아미노산 1-730)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 49의 아미노산 138-730에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 49의 아미노산 199-730에 걸쳐 있다.
시노몰구스 마카크로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bcy.23으로 표시됨)을 서열 번호 50 (아미노산 1-730)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 50의 아미노산 138-730에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 50의 아미노산 199-730에 걸쳐 있다.
마모셋원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bma.42로 표시됨)을 서열 번호 51 (아미노산 1-736)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 51의 아미노산 138-736에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 51의 아미노산 203-736에 걸쳐 있다.
마모셋원숭이로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bma.43으로 표시됨)을 서열 번호 52 (아미노산 1-736)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 52의 아미노산 138-736에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 52의 아미노산 203-736에 걸쳐 있다.
돼지로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bpo.1으로 표시됨)을 서열 번호 53 (아미노산 1-716)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 53의 아미노산 137-716에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 53의 아미노산 184-716에 걸쳐 있다.
돼지로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bpo.2로 표시됨)을 서열 번호 54 (아미노산 1-716)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 54의 아미노산 137-716에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 54의 아미노산 184-716에 걸쳐 있다.
돼지로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bpo.3로 표시됨)을 서열 번호 55 (아미노산 1-716)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 55의 아미노산 137-716에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 55의 아미노산 184-716에 걸쳐 있다.
돼지로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bpo.4로 표시됨)을 서열 번호 56 (아미노산 1-716)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다 . VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 56의 아미노산 137-716에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 56의 아미노산 184-716에 걸쳐 있다.
돼지로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bpo.6으로 표시됨)을 서열 번호 57 (아미노산 1-716)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 57의 아미노산 137-716에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 57의 아미노산 184-716에 걸쳐 있다.
돼지로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bpo.8로 표시됨)을 서열 번호 58 (아미노산 1-716)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 58의 아미노산 137-716에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 58의 아미노산 184-716에 걸쳐 있다.
돼지로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bpo.13으로 표시됨)을 서열 번호 59 (아미노산 1-716)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 59의 아미노산 137-716에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 59의 아미노산 184-716에 걸쳐 있다.
돼지로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bpo.18으로 표시됨)을 서열 번호 60 (아미노산 1-716)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 60의 아미노산 137-716에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 60의 아미노산 184-716에 걸쳐 있다.
돼지로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bpo.20으로 표시됨)을 서열 번호 61 (아미노산 1-716)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 61의 아미노산 137-716에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 61의 아미노산 184-716에 걸쳐 있다.
돼지로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bpo.23으로 표시됨)을 서열 번호 62 (아미노산 1-716)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 62의 아미노산 137-716에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 62의 아미노산 184-716에 걸쳐 있다.
돼지로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bpo.24로 표시됨)을 서열 번호 63 (아미노산 1-716)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 63의 아미노산 137-716에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 63의 아미노산 184-716에 걸쳐 있다.
돼지로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bpo.27로 표시됨)을 서열 번호 64 (아미노산 1-716)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 64의 아미노산 137-716에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 64의 아미노산 184-716에 걸쳐 있다.
돼지로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bpo.28로 표시됨)을 서열 번호 65 (아미노산 1-716)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 65의 아미노산 137-716에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 65의 아미노산 184-716에 걸쳐 있다.
돼지로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bpo.29로 표시됨)을 서열 번호 66 (아미노산 1-716)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 66의 아미노산 137-716에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 66의 아미노산 184-716에 걸쳐 있다.
돼지로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bpo.33로 표시됨)을 서열 번호 67 (아미노산 1-716)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 67의 아미노산 137-716에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 67의 아미노산 184-716에 걸쳐 있다.
돼지로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bpo.35로 표시됨)을 서열 번호 68 (아미노산 1-716)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 68의 아미노산 137-716에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 68의 아미노산 184-716에 걸쳐 있다.
돼지로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bpo.36으로 표시됨)을 서열 번호 69 (아미노산 1-716)로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기의 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 69의 아미노산 137-716에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 69의 아미노산 184-716에 걸쳐 있다.
돼지로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bpo.37로 표시됨)을 서열 번호 70 (아미노산 1-716)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 70의 아미노산 137-716에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 70의 아미노산 184-716에 걸쳐 있다.
레서스 마카크로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Brh.26로 표시됨)을 서열 번호 71 (아미노산 1-736)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 71의 아미노산 138-736에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 71의 아미노산 203-736에 걸쳐 있다.
레서스 마카크로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Brh.27로 표시됨)을 서열 번호 72 (아미노산 1-736)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 72의 아미노산 138-736에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 72의 아미노산 203-736에 걸쳐 있다.
레서스 마카크로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Brh.28로 표시됨)을 서열 번호 73 (아미노산 1-736)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 73의 아미노산 138-736에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 73의 아미노산 203-736에 걸쳐 있다.
레서스 마카크로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Brh.29로 표시됨)을 서열 번호 74 (아미노산 1-736)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 74의 아미노산 138-736에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 74의 아미노산 203-736에 걸쳐 있다.
레서스 마카크로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Brh.30으로 표시됨)을 서열 번호 75 (아미노산 1-736)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 75의 아미노산 138-736에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 75의 아미노산 203-736에 걸쳐 있다.
레서스 마카크로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Brh.31로 표시됨)을 서열 번호 76 (아미노산 1-736)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 76의 아미노산 138-736에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 76의 아미노산 203-736에 걸쳐 있다.
레서스 마카크로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Brh.32로 표시됨)을 서열 번호 77 (아미노산 1-736)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 77의 아미노산 138-736에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 77의 아미노산 203-736에 걸쳐 있다.
레서스 마카크로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Brh.33으로 표시됨)을 서열 번호 78 (아미노산 1-736)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 78의 아미노산 138-736에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 78의 아미노산 203-736에 걸쳐 있다.
포모산 마카크로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bfm.17로 표시됨)을 서열 번호 79 (아미노산 1-737)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 79의 아미노산 138-736에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 79의 아미노산 203-736에 걸쳐 있다.
포모산 마카크로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bfm.18로 표시됨)은 서열 번호 80 (아미노산 1-737)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 80의 아미노산 138-736에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 80의 아미노산 203-736에 걸쳐 있다.
포모산 마카크로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bfm.20으로 표시됨)은 서열 번호 81 (아미노산 1-737)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 81의 아미노산 138-736에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 81의 아미노산 203-736에 걸쳐 있다.
포모산 마카크로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bfm.21로 표시됨)은 서열 번호 82 (아미노산 1-737)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 82의 아미노산 138-736에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 82의 아미노산 203-736에 걸쳐 있다.
포모산 마카크로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bfm.24로 표시됨)은 서열 번호 83 (아미노산 1-737)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 83의 아미노산 138-736에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 83의 아미노산 203-736에 걸쳐 있다.
포모산 마카크로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bfm.25로 표시됨)은 서열 번호 84 (아미노산 1-737)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 84의 아미노산 138-736에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 84의 아미노산 203-736에 걸쳐 있다.
포모산 마카크로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bfm.27로 표시됨)은 서열 번호 85 (아미노산 1-737)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 85의 아미노산 138-736에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 85의 아미노산 203-736에 걸쳐 있다.
포모산 마카크로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bfm.32로 표시됨)을 서열 번호 86 (아미노산 1-737)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 86의 아미노산 138-736에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 86의 아미노산 203-736에 걸쳐 있다.
포모산 마카크로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bfm.33으로 표시됨)은 서열 번호 87 (아미노산 1-737)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 87의 아미노산 138-736에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 87의 아미노산 203-736에 걸쳐 있다.
포모산 마카크로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bfm.34로 표시됨)은 서열 번호 88 (아미노산 1-737)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 88의 아미노산 138-736에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 88의 아미노산 203-736에 걸쳐 있다.
포모산 마카크로부터 단리된 신규한 AAV 캡시드의 VP1 서열(Bfm.35로 표시됨)은 서열 번호 89 (아미노산 1-737)으로 기재하고, 관련 가변 영역 및 GBS 및 GH 루프 영역의 위치를 하기 표 2에 정의한다. VP2 캡시드 단백질은 서열 번호 89의 아미노산 138-736에 걸쳐 있고, VP3 캡시드 단백질은 서열 번호 89의 아미노산 203-736에 걸쳐 있다.
바로 아래의 표 2에서, "VR"은 가변 영역을 나타내며, 숫자는 아미노산 잔기 각각의 가변 영역 또는 GBS 및 GH 루프 영역이 아미노산 서열에 걸쳐있음을 나타낸다.
표 2
전이유전자
전이유전자는 관심있는 폴리펩타이드, 단백질 또는 다른 생성물을 암호화하는, 전이유전자에 측접한 벡터 서열들과는 이종성인 핵산 서열이다. 핵산 암호화 서열은 숙주 세포에서 전이유전자 전사, 번역 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 조절 성분에 작동 가능하게 연결된다.
전이유전자 서열의 조성은 수득된 벡터가 사용될 용도에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 일 유형의 전이유전자 서열은 발현시 검출가능한 신호를 생성하는 리포터 서열을 포함한다. 이러한 리포터 서열은 β-락타마제, β-갈락토시다아제 (LacZ), 알칼리 포스파타제, 티미딘 키나아제, 녹색 형광 단백질 (GFP), 클로람페니콜 아세틸기전달효소 (CAT), 루시퍼라제, 막 결합 단백질 (예를 들어, CD2, CD4, CD8 포함), 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질 및 기타 당업계에 공지된 것들 (이에 대한 고친화성 항체가 존재하거나, 또는 다른 종래의 수단에 의해 생산될 수 있는 것들), 특히 헤마토글루타닌 또는 Myc 유래의, 항원 태그 도메인에 적절하게 융합된 막 결합된 단백질을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
이러한 암호화 서열은, 이의 발현을 구동하는 조절 요소와 연관될 때, 효소, 방사선, 비색계, 형광 또는 기타 분광 분석, 형광 활성화 세포 분류 분석 및 면역학적 검정 [효소 연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 방사면역검정 (RIA) 및 면역조직화학을 포함함]을 포함하는 통상적 수단에 의하여 검출가능한 신호를 제공한다. 예를 들어, 마커 서열이 LacZ 유전자일 경우, 신호를 보유하는 벡터의 존재는 베타-갈락토시다아제 활성에 대한 검정에 의해 검출된다. 전이유전자가 녹색 형광 단백질 또는 루시퍼라제인 경우, 신호를 전달하는 벡터는 발광측정계에서 색 또는 광 생성에 의해 육안으로 측정될 수 있다.
그러나, 바람직하게는, 전이유전자는 단백질, 펩타이드, RNA, 효소, 우성 음성 돌연변이체 또는 촉매 RNA와 같은 생물학 및 의학에 유용한 생성물을 암호화하는 비-마커 서열이다. 바람직한 RNA 분자는 tRNA, dsRNA, 리보솜 RNA, 촉매 RNA, siRNA, 작은 헤어핀 RNA, 트랜스-스플라이싱 RNA 및 안티센스 RNA를 포함한다. 유용한 RNA 서열의 한 예는 치료된 동물에서 표적화된 핵산 서열의 발현을 억제하거나 소멸시키는 서열이다. 전형적으로, 적합한 표적 서열은 종양 표적 및 바이러스성 질환을 포함한다. 그러한 표적의 예시로서, 면역원과 관련된 하기 섹션에서 식별된 종양학적 표적 및 바이러스를 참고한다.
전이유전자는 정상 유전자가 정상 수준보다 적게 발현되는 결핍, 또는 기능성 유전자 생성물이 발현되지 않는 결핍을 포함할 수 있는 유전자 결핍을 교정하거나 개선하는데 사용될 수 있다. 바람직한 유형의 전이유전자 서열은 숙주 세포에서 발현되는 치료용 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화한다. 본 발명은 또한, 예를 들어, 다중-서브유닛 단백질에 의해 야기된 유전자 결함을 보완하거나 개선하기 위해, 다중 전이유전자를 이용하는 것을 포함한다. 특정 상황에서는 단백질의 각 서브유닛을 암호화하거나 다른 펩타이드 또는 단백질을 암호화하기 위해 상이한 전이유전자를 사용할 수 있다. 이것은 단백질 서브유닛를 암호화하는 DNA의 크기가 큰 경우, 예를 들어 면역글로불린, 혈소판-유래 성장인자 또는 디스트로핀 단백질의 경우에 바람직하다. 세포가 다중-서브유닛 단백질을 생산하도록 하기 위하여, 세포는 상이한 서브유닛 각각을 함유하는 재조합 바이러스에 의해 감염된다. 대안적으로, 단백질의 상이한 서브유닛는 동일한 전이유전자에 의해 암호화될 수 있다. 이 경우, 단일 전이유전자는 서브유닛 각각을 암호화하는 DNA를 포함하며, 각 서브유닛의 DNA는 내부 라이보자임 입구 부위 (IRES)에 의해 분리된다. 이것은 서브유닛의 각각을 암호화하는 DNA의 크기가 작은 경우, 예를 들어 서브유닛 및 IRES를 암호화하는 DNA의 전체 크기가 5 킬로베이스 미만인 경우에 바람직한다. IRES의 대안으로서, DNA는 번역 후 사건에서 자가-절단하는 2A 펩타이드를 암호화하는 서열에 의해 분리될 수 있다. 참고: 예컨대, Donnelly et al, J. Gen. virol., 78(Pt 1):13-21 (January 1997); Furler, et al, Gene Ther ., 8(11):864-873 (June 2001); Klump et al., Gene Ther., 8(10):811-817 (May 2001). 이 2A 펩타이드는 IRES보다 현저히 작으므로 공간이, 제한 요소일 때 사용하기에 적합하다. 더욱 종종, 전이유전자가 크거나, 다중-서브유닛으로 구성되거나, 또는 2개의 전이유전자가 공동-전달될 경우, 목적 전이유전자(들) 또는 서브유닛를 갖는 rAAV가 공동-투여되어, 이들로 하여금 생체내 연쇄체화(concatamerize)하도록 하여 단일 벡터 게놈을 형성시킨다. 이러한 구현예에서, 제1 AAV는 단일 전이 유전자를 발현하는 발현 카세트를 보유할 수 있고, 제2 AAV는 숙주 세포에서 공동-발현을 위한 상이한 전이유전자를 발현하는 발현 카세트를 보유할 수 있다. 그러나, 선택된 전이유전자는 어느 생물학적 활성 생성물 또는 다른 생성물, 예를 들어 연구에 바람직한 생성물을 암호화할 수 있다.
적합한 전이유전자는 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 전이유전자의 선택은 본 발명의 제한으로 고려되지 않는다.
일부 구현예에서, 전이유전자는 이종 단백질이며, 그리고 이러한 이종 단백질은 치료용 단백질이다. 예시적 치료 단백질은 혈액 인자, 예컨대 β-글로빈, 헤모글로빈, 조직 플라스미노겐 활성인자, 및 응집 인자; 콜로니 자극 인자 (CSF); 인터류킨, 예컨대 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 등; 성장 인자, 예컨대 각질세포 성장 인자 (KGF), 줄기 세포 인자 (SCF), 섬유아세포 성장 인자 (FGF, 예컨대 염기성 FGF 및 산성 FGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 골 형태형성 단백질 (BMP), 표피 성장 인자 (EGF), 성장 분화 인자-9 (GDF-9), 간암 유래 성장 인자 (HDGF), 미오스타틴 (GDF-8), 신경 성장 인자 (NGF), 뉴로트로핀, 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 트롬보포이에틴 (TPO), 형질전환 성장 인자 알파 (TGF-α), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β) 등; 가용성 수용체, 예컨대 가용성 TNF-α 수용체, 가용성 VEGF 수용체, 가용성 인터류킨 수용체 (예컨대, 가용성 IL-1 수용체 및 가용성 유형 Ⅱ IL-1 수용체), 가용성 γ/δ T 세포 수용체, 가용성 수용체의 리간드-결합 단편, 등; 효소, 예컨대 α-글루코시다제, 이미글루카라제, β-글루코세레브로시다아제, 및 알글루세라제; 효소 활성인자, 예컨대 조직 플라스미노겐 활성인자; 케모카인, 예컨대 1P-10, 인터페론-감마에 의하여 유도된 모노카인(Mig), Groα/IL-8, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, MCP-1, PF-4 등; 혈관형성 제제, 예컨대 혈관 내피 성장 인자 (VEGF, 예컨대, VEGF121, VEGF165, VEGF-C, VEGF-2), 신경교종-유래 성장 인자, 안지오제닌, 안지오제닌-2 등; 항-혈관형성 제제, 예컨대 가용성 VEGF 수용체; 단백질 백신; 신경활성 펩타이드, 예컨대 신경 성장 인자 (NGF), 브라디키닌, 콜레시스토키닌, 가스트린, 세크레틴, 옥시토신, 고나도트로핀-방출 호르몬, 베타-엔도르핀, 엔케팔린, 물질 P, 소마토스타틴, 프로락틴, 갈라닌, 성장 호르몬-방출 호르몬, 봄베신, 다이노르핀, 와파린, 뉴로텐신, 모틸린, 티로트로핀, 신경펩티드 Y, 황체형성 호르몬, 칼시토닌, 인슐린, 글루카곤, 바소프레신, 안지오텐신 Ⅱ, 티로트로핀-방출 호르몬, 혈관활성 장관 펩타이드, 수면 펩타이드 등; 혈전용해성 제제; 심방 나트륨이뇨 펩타이드; 릴렉신; 신경교세포 산성 단백질; 여포 자극 호르몬 (FSH); 인간 알파-1 항트립신; 백혈병 억제성 인자 (LIF); 조직 인자, 황체형성 호르몬; 대식세포 활성화 인자; 종양 괴사 인자 (TNF); 호중구 화학주성 인자 (NCF); 메탈로프로테아나제의 조직 억제제; 혈관활성 장관 펩타이드; 안지오제닌; 안지오트로핀; 피브린; 히루딘; IL-1 수용체 길항제; 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 관심 단백질의 일부 기타 비제한적 예시는 하기를 포함한다: 모양체 신경영양 인자 (CNTF); 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF); 뉴로트로핀 3 및 4/5 (NT-3 및 4/5); 아교 세포 유도 신경영양 인자 (GDNF); 방향족 아미노산 데카르복실라제 (AADC); 혈우병 관련 응고 단백질, 예컨대 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ, 인자 X; 디스트로핀, 미니-디스트로핀, 또는 마이크로디스트로핀; 리소좀 산 리파제; 페닐알라닌 하이드록실라제 (PAH); 글리코겐 저장 질환-관련 효소, 예컨대 글루코스-6-포스파타제, 산 말타제, 글리코겐 탈분지화 효소, 근육 글리코겐 포스포릴라제, 간 글리코겐 포스포릴라제, 근육 포스포프룩토키나제, 포스포릴라제 키나제 (예컨대, PHKA2), 글루코스 수송체 (예컨대, GLUT2), 알도라제 A, β-에놀라제, 및 글리코겐 신타제; 리소좀 효소 (예컨대, 베타-N-아세틸헥소스아미니다제 A); 및 이의 어느 변이체.
일 바람직한 구현예에서, 전이유전자는 디스트로핀 기능을 회복시키는 단백질을 암호화하며, 그리고 뒤센 근이영양증 치료에 유용하다. 뒤센 근이영양증은 단백질 디스트로핀을 암호화하는 X-연관 유전자의 결실이나 돌연변이로 인해 발생하는 퇴행성 근육 질환이다. 기능성 디스트로핀의 부재는 근육 섬유의 퇴행, 염증 및 괴사를 야기한다. 디스트로핀 유전자는 인간 게놈에서 가장 큰 공지된 유전자로, 2.5Mb 초과의 인간 X 염색체를 커버한다. 디스트로핀 유전자는 79개의 엑손을 가지고 있으며, 이의 전사물은 3,685 개의 아미노산으로 구성된 단백질을 암호화하는 11kb RNA 전사체를 생성시킨다. 야생형 디스트로핀을 암호화하는 전이유전자는 공지된 유전자 치료 벡터 시스템의 패킹 한계를 초과한다. 패키징 한계를 극복하기 위하여, 조작된 합성 버전의 디스트로핀이 생성되었다. 본원에 사용된 "마이크로디스트로핀" 또는 "미니디스트로핀"은, 절단체이나 기능성 디스트로핀을 암호화하는 전이유전자를 지칭하며, 이는 WO2016177911, WO2015197869, 및 미국 특허 출원 공개 번호 US2008249052에 기술되었다 (이의 각각은 그 전체가 본원에 참고로 편입됨). 마이크로디스트로핀의 예시적 예시는 하기를 포함한다: MD1 (스펙트린 유사 반복체 4 내지 23가 부재하고, 그리고 C-말단 도메인이 결핍된 마이크로디스트로핀), MD3 (스펙트린-유사 반복체 4-23이 결핍하고, 한편 스펙트린-유사 반복체 1, 2, 3, 및 24를 보유하고, 그리고 추가로 C-말단 도메인의 코일형-코일(coiled coil) 영역 나선 1 및 2를 암호화하는 C-말단 도메인의 엑손 70-75를 보유하는, 코돈 최적화된 마이크로디스트로핀), 및 MD4 (인간 MD3과 동일함, 단, 이는 전체 C-말단 도메인(엑손 70-79 모두)을 보유함).
조절성 조절 요소
AAV 벡터는 또한 플라스미드 벡터로 형질감염되거나 또는 본 발명에 의해 생성된 바이러스에 의해 감염된 세포에서 그의 전사, 번역 및/또는 발현을 허용하는 방식으로, 전이유전자에 작동가능하게 연결된 통상적인 조절 요소를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "작동가능하게 연결된(operably linked)" 서열은 관심 대상의 유전자와 인접한 발현 조절 서열 및 관심 대상의 유전자를 조절하기 위해 트랜스 방식으로 또는 원거리 작용하는 발현 조절 서열을 모두 포함한다.
발현 조절 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 가공 신호, 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화 (polyA) 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 증진시키는 서열[즉, 코작(Kozak) 공통 서열]; 단백질 안정성을 증진시키는 서열; 및 필요 시 암호화된 생성물의 분비를 증진시키는 서열을 포함한다. 천연, 항시성(constitutive), 유도성 및/또는 조직-특이적인 프로모터를 포함하는 매우 다수의 발현 조절 서열이 당업계에 공지되어 있으며, 이용될 수 있다.
항시성 프로모터의 예시는 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스 (선택적으로, RSV 인핸서를 가짐), 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 (선택적으로, CMV 인핸서를 가짐) [예컨대, Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)를 참고하라], SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터, 및 EF1 프로모터 [Invitrogen]를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 유도성 프로모터는 유전자 발현의 조절을 허용하고, 그리고 외인성으로 공급되는 화합물, 환경 인자 예컨대 온도, 또는 특정 생리학적 상태, 예를 들어 급성기, 세포의 특정 분화 상태의 존재에 의해 조절되거나, 또는 오직 복제 세포 내에서만 조절될 수 있다. 유도성 프로모터 및 유도성 시스템은 Invitrogen, Clontech 및 Ariad를 비제한적으로 포함하는, 다양한 상업적 공급원으로부터 이용가능하다. 많은 다른 시스템이 기술되었고, 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 외인성으로 공급된 화합물에 의해 조절되는 유도성 프로모터의 예로는, 아연-유도성 양 메탈로티오닌 (MT) 프로모터, 덱사메타손 (Dex)-유도성 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, T7 폴리머라제 프로모터 시스템 [WO 98/10088] ; 엑디손 곤충 프로모터 [No et al, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 93:3346-3351 (1996)], 테트라사이클린-억제성 시스템 [Gossen et al, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89:5547-5551 (1992)], 테트라사이클린-유도성 시스템 [Gossen et al, Science, 268:1766-1769 (1995) (또한 참고: Harvey et al, Curr . Opin . Chem . Biol., 2:512-518 (1998)], RU486-유도성 시스템 [Wang et al, Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) 및 Wang et al, Gene Ther., 4:432-441 (1997)] 및 라파마이신-유도성 시스템 [Magari et al, J. Clin . Invest., 100:2865-2872 (1997)]를 포함한다. 본 맥락에서 유용할 수 있는 유도성 프로모터의 기타 유형은, 특정 생리학적 상태, 예를 들어 온도, 급성기, 또는 세포의 특정 분화 상태에 의해 조절되거나, 또는 오직 복제 세포 내에서만 조절되는 것들이다.
또 다른 구현예에서, 전이유전자에 대한 천연 프로모터가 사용될 것이다. 전이유전자의 발현이 천연 발현을 모방해야 하는 것이 바람직한 경우, 천연 프로모터가 바람직할 수 있다. 전이유전자의 발현이 일시적으로 또는 발달적으로 또는 조직-특이적인 방식으로 또는 특정 전사 자극에 반응하여 조절되어야 하는 경우 천연 프로모터를 사용할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 천연 발현 조절 요소, 예를 들어 인핸서 요소, 폴리아데닐화 부위 또는 코작 공통 서열이 또한 천연 발현을 모방하기 위해 사용될 수 있다.
전이유전자의 또 다른 구현예는 조직-특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 유전자를 포함한다. 예를 들어 골격근에서 발현이 바람직한 경우, 근육에서 활성화된 프로모터를 사용해야 한다. 이들은 골격성 β-액틴, 미오신 경쇄 2A, 디스트로핀, 근육 크레아틴 키나아제, 뿐만 아니라 자연-발생적 프로모터보다 높은 활성을 갖는 합성 근육 프로모터를 암호화하는 유전자 유래의 프로모터를 포함한다 (참고: Li et al., Nat. Biotech., 17:241-245 (1999)). 조직-특이적인 프로모터의 예시는 그 중에서도, 간 (알부민, Miyatake et al., J. virol., 71:5124-32 (1997); B형 간염 바이러스 코어 프로모터, Sandig et al., Gene Ther., 3:1002-9 (1996); 알파-태아 단백질 (AFP), Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)), 골 오스테오칼신 (Stein et al., Mol . Biol . Rep., 24:185-96 (1997)); 골 시알로당단백질 (Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)), 림프구 (CD2, Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998); 면역글로불린 중쇄; T 세포 수용체 쇄), 신경원, 예컨대 뉴런-특이적 에놀라제 (NSE) 프로모터 (Andersen et al., Cell . Mol . Neurobiol., 13:503-15 (1993)), 신경세사 경-쇄 유전자 (Piccioli et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 88:5611-5 (1991)), 및 뉴런-특이적 vgf 유전자 (Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995))가 알려져있다.
선택적으로, 치료학적으로 유용한 전이유전자를 보유하는 플라스미드는 또한 선택가능한 마커를 포함할 수 있으며, 또는 리포터 유전자는 특히 게네티신, 하이그로마이신 또는 퓨리마이신 저항성을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 그러한 선택가능한 리포터 또는 마커 유전자 (바람직하게는 본 발명의 방법에 의해 구제될 바이러스 게놈 외부에 위치함)는 암피실린 저항성과 같은 박테리아 세포에서 플라스미드의 존재를 신호화하는데 사용될 수 있다. 플라스미드의 다른 성분은 복제 기원을 포함할 수 있다. 이들 및 다른 프로모터 및 벡터 요소의 선택은 통상적이며, 많은 그러한 서열이 이용 가능하다 [예를 들어, Sambrook 등 및 그의 인용 문헌 참조].
재조합 AAV 생산 방법
본 발명은 곤충 또는 포유동물 세포에서 재조합 AAV를 생산하는 물질 및 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 바이러스 작제물은 프로모터 및 상기 프로모터의 다운스트림에서의 제한 효소를 추가로 포함하여, 하나 이상의 관심 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 삽입을 가능하도록 하고, 여기서 프로모터 및 제한 부위는 5 'AAV ITR의 다운스트림에, 그리고 3' AAV ITR의 업스트림에 위치한다. 일부 구현예에서, 바이러스 작제물은, 제한 부위의 다운스트림, 및 3' AAV ITR의 업스트림에 전사후 조절 요소를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 작제물은 제한 효소 부위에 삽입되고 프로모터와 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하며, 여기서 폴리뉴클레오타이드는 목적 단백질의 암호화 영역을 포함한다. 숙련된 당업자가 알 수 있듯이, 본원에 개시된 AAV 벡터 중 어느 하나가 재조합 AAV를 생산하기 위한 바이러스 작제물로서 상기 방법에서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 헬퍼 기능은 아데노 바이러스 또는 배큘로바이러스 헬퍼 유전자를 포함하는 하나 이상의 헬퍼 플라스미드 또는 헬퍼 바이러스에 의해 제공된다. 아데노 바이러스 또는 배큘로바이러스 헬퍼 유전자의 비제한적인 예는 AAV 패키징에 헬퍼 기능을 제공할 수 있는 E1A, E1B, E2A, E4 및 VA를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
AAV의 헬퍼 바이러스는 당업계에 공지되어 있으며, 그리고 예를 들어, 과(family) 아데노비리대(Adenoviridae) 및 과 헤르페스비리대(Herpesviridae) 유래의 바이러스를 포함한다. AAV의 헬퍼 바이러스의 예시는 미국 출원 공개 20110201088 (이의 개시 내용은 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 SAdV-13 헬퍼 바이러스 및 SAdV-13 유사 헬퍼 바이러스, 헬퍼 벡터 pHELP (Applied viromics)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 AAV에 적절한 헬퍼 기능을 제공할 수 있는 AAV의 어느 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 플라스미드를 본원에서 사용할 수 있음을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, AAV cap 유전자는 플라스미드에 존재한다. 플라스미드는 AAV rep 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 어느 AAV 혈청형 (AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13 및 이들의 어느 변이체를 비제한적으로 포함함) 유래의 cap 유전자 및/또는 rep 유전자는 본원에서 재조합 AAV를 생성하는데 사용된다. 일부 구현예에서, AAV cap 유전자는 혈청형 1, 혈청형 2, 혈청형 4, 혈청형 5, 혈청형 6, 혈청형 7, 혈청형 8, 혈청형 9, 혈청형 10, 혈청형 11, 혈청형 12, 혈청형 13 또는 이의 변이체 유래의 캡시드를 암호화한다.
일부 구현예에서, 곤충 또는 포유동물 세포는 헬퍼 플라스미드 또는 헬퍼 바이러스, 바이러스 작제물 및 AAV cap 유전자를 암호화하는 플라스미드로 형질 감염될 수 있으며; 재조합 AAV 바이러스는 공동-형질 감염 후 다양한 시점에서 수집될 수 있다. 예를 들어, 재조합 AAV 바이러스는 공동-형질감염 후 약 12시간, 약 24시간, 약 36시간, 약 48시간, 약 72시간, 약 96시간, 약 120시간, 또는 이들 임의의 두 시점들 사이의 시간에서 수집될 수 있다.
재조합 AAV는 또한 감염성 재조합 AAV를 생산하기에 적합한 당업계에 공지된 어느 통상적인 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 일부 경우에서, AAV 입자 생산에 필요한 일부 구성요소를 안정적으로 발현하는 곤충 또는 포유동물 세포를 사용하여 재조합 AAV를 생산할 수 있다. 예를 들어, AAV rep 및 cap 유전자를 포함하는 플라스미드 (또는 다중 플라스미드), 및 네오마이신 저항성 유전자와 같은 선택가능한 마커가 세포의 게놈에 통합될 수 있다. 곤충 또는 포유동물 세포는 이후 헬퍼 바이러스 (예를 들어, 헬퍼 기능을 제공하는 아데노 바이러스 또는 배큘로바이러스), 및 5 '및 3' AAV ITR을 포함하는 바이러스 벡터 (및 원할 경우, 이종 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열)로 공동-감염될 수 있다. 이 방법의 장점은 세포가 선택 가능하고 재조합 AAV의 대규모 생산에 적합하다는 것이다. 다른 비제한적인 예로서, 플라스미드보다는 아데노 바이러스 또는 배큘로바이러스가 rep 및 cap 유전자를 패키징 세포로 도입시키는데 사용될 수 있다. 또 다른 비제한적 예로서, 5 '및 3' AAV LTR 및 rep-cap 유전자를 함유하는 바이러스 벡터 둘 모두는 생산자 세포의 DNA에 안정적으로 통합될 수 있고, 헬퍼 기능이 야생형 아데노 바이러스에 의하여 제공되어 재조합 AAV를 생산할 수 있다.
AAV 생산에 사용되는 세포 유형
본 발명의 AAV 벡터를 포함하는 바이러스 입자는 AAV 또는 생물학적 생성물의 생산을 허용하고, 배양물에서 유지될 수 있는 어느 무척추 세포 유형을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 곤충 세포주는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda ), 예컨대 Sf9, SF21, SF900+, 초파리(drosophila) 세포주, 모기 세포주, 예컨대, 흰줄숲모기(Aedes albopictus ) 유도 세포주, 국내 누에 세포주, 예컨대 봄빅시모리(Bombyxmori) 세포주, 양배추금무늬나방류(Trichoplusia ni) 세포주, 예컨대 하이 파이브(High Five) 세포, 또는 인시류(Lepidoptera) 세포주, 예컨대 검은마녀나방류(Ascalapha odorata) 세포주 유래의 것일 수 있다. 바람직한 곤충 세포는 하이 파이브 (High Five), Sf9, Se301, SeIZD2109, SeUCR1, Sf900+, Sf21, BTI-TN-5B1-4, MG-1, Tn368, HzAm1, BM-N, Ha2302, Hz2E5 및 Ao38을 포함하는, 배큘로바이러스 감염에 취약한 곤충 종 유래의 세포이다.
배큘로바이러스는 절지동물의 외피 DNA 바이러스이며, 이의 2개 구성원은 세포 배양에서 재조합 단백질을 생산하기 위한 발현 벡터로 잘 알려져 있다. 배큘로바이러스는 순환하는 이중-가닥 게놈 (80-200kbp)를 가지고 있는데, 이것은 특정 세포에 대량의 게놈 함량을 전달할 수 있도록 조작될 수 있다. 벡터로서 사용되는 바이러스는 일반적으로 오토그라파 칼리포니카 멀티캡시드 핵다각체 바이러스 (AcMNPV) 또는 봄빅스 모리 (Bm NPV) (Kato et al., 2010)이다.
배큘로바이러스는 재조합 단백질의 발현을 위한 곤충 세포의 감염에 통상 사용된다. 특히, 곤충에서의 이종 유전자의 발현은 예를 들어 하기에 기술된 바와 같이 달성될 수 있다: 미국 특허 번호 4,745,051; Friesen et al (1986); EP 127,839; EP 155,476; Vlak et al (1988); Miller et al (1988); Carbonell et al (1988); Maeda et al (1985); Lebacq-Verheyden et al (1988); Smith et al (1985); Miyajima et al (1987); 및 Martin et al (1988). 수많은 배큘로바이러스 균주 및 변이체 및 단백질 생산에 사용될 수 있는 상응하는 허용 곤충 숙주 세포는 하기에 기술된다: Luckow et al (1988), Miller et al (1986); Maeda et al (1985) 및 McKenna (1989).
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명의 방법은 또한 AAV의 복제 또는 생물학적 생성물의 생산을 허용하고, 배양물에서 유지될 수 있는 어느 포유동물 세포 유형에 의해 수행된다. 사용된 바람직한 포유동물 세포는 HEK293, HeLa, CHO, NS0, SP2/0, PER.C6, Vero, RD, BHK, HT 1080, A549, Cos-7, ARPE-19 및 MRC-5 세포일 수 있다.
시험관내 이종 단백질의 생산
비제한적인 예로서, 본원에 개시된 재조합 AAV는 시험관내에서, 예를 들어 세포 배양물에서 목적 단백질을 생산하기 위하여 사용될 수 있다. 일 비제한적인 예로서, 일부 구현예에서, 이종 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 AAV를 제공하는 단계; 및 재조합 AAV가 세포 내에서 목적 단백질을 발현시키도록, 재조합 AAV를 세포 배양 물에서 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 시험관내에서 목적 단백질을 생산하는 방법이 제공된다. 관심 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 크기는 가변될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열은, 적어도 약 1.4 kb, 적어도 약 1.5 kb, 적어도 약 1.6 kb, 적어도 약 1.7 kb, 적어도 약 1.8 kb, 적어도 약 2.0 kb, 적어도 약 2.2 kb, 적어도 약 2.4 kb, 적어도 약 2.6 kb, 적어도 약 2.8 kb, 적어도 약 3.0 kb, 적어도 약 3.2 kb, 적어도 약 3.4 kb, 적어도 약 3.5 kb 길이, 적어도 약 4.0 kb 길이, 적어도 약 5.0 kb 길이, 적어도 약 6.0 kb 길이, 적어도 약 7.0 kb 길이, 적어도 약 8.0 kb 길이, 적어도 약 9.0 kb 길이, 또는 적어도 약 10.0 kb 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드는 길이가 약 1.4kb 이상이다.
생체내 이종 단백질의 생산
본원에 개시된 재조합 AAV는 생체내, 예를 들어 포유동물와 같은 동물에서 관심 단백질을 생성시키는데 사용될 수 있다. 일부 구현예는 관심 단백질을 생체내에서 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 관심 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 AAV를 제공하는 단계; 및 재조합 AAV를 피험체에 투여함으로서, 재조합 AAV가 피험체 내 관심 단백질을 발현시키도록 하는 단계를 포함한다. 피험체는, 일부 구현예에서, 비-인간 포유동물, 예를 들어, 원숭이, 개, 고양이, 마우스 또는 소일 수 있다. 관심 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 크기는 가변될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열은, 적어도 약 1.4 kb, 적어도 약 1.5 kb, 적어도 약 1.6 kb, 적어도 약 1.7 kb, 적어도 약 1.8 kb, 적어도 약 2.0 kb, 적어도 약 2.2 kb, 적어도 약 2.4 kb, 적어도 약 2.6 kb, 적어도 약 2.8 kb, 적어도 약 3.0 kb, 적어도 약 3.2 kb, 적어도 약 3.4 kb, 적어도 약 3.5 kb 길이, 적어도 약 4.0 kb 길이, 적어도 약 5.0 kb 길이, 적어도 약 6.0 kb 길이, 적어도 약 7.0 kb 길이, 적어도 약 8.0 kb 길이, 적어도 약 9.0 kb 길이, 또는 적어도 약 10.0 kb 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드는 길이가 적어도 약 1.4kb이다.
치료 용도
기재된 방법에 의해 생성된 재조합 AAV는 다양한 질환 또는 장애를 치료하기 위한 하나 이상의 치료용 단백질을 발현하는데 사용될 수 있다. 상기 질환의 비제한적 예시는 암 예컨대 암종, 육종, 백혈병, 림프종; 및 자가면역 질환 예컨대 다발성 경화증을 포함한다. 암의 비제한적인 예시는 식도 암종; 간세포 암종; 기저 세포 암종, 편평 세포 암종 (다양한 조직); 이행 세포 암을 포함하는 방광 암종; 기관지 암종; 결장 암종; 결장직장 암종; 위 암종; 폐의 소세포 암종 및 비-소세포 암종을 포함하는 폐 암종; 부신피질 암종; 갑상선 암종; 췌장 암종; 유방 암종; 난소 암종; 전립선 암종; 선암종; 땀샘 암종; 피지선 암종; 유두 암종; 유두 선암종; 낭샘 암종; 수질 암종; 신장 세포 암종; 동일계내 유관 암종 또는 담관 암종; 융모막암종; 정상피종; 배아 암종; 윌름 종양; 자궁경부 암종; 자궁 암종; 고환 암종; 골형성 암종; 상피 암종; 및 비인두 암종을 포함한다. 육종의 비제한적 예시는 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 척색종, 골형성성 육종, 골육종, 혈관육종, 내피세포육종, 림프관육종, 림프관내피세포육종, 활막종, 중피종, 유잉(Ewing's) 육종, 평활근육종, 횡문근육종, 및 기타 연조직 육종을 포함한다. 고형 종양의 비제한적 예시는 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경초종, 핍돌기신경교종, 뇌수막종, 흑색종, 신경아세포종, 및 망막아세포종을 포함한다. 백혈병의 비제한적인 예시는 만성 골수증식성 증후군; 급성 골수성 백혈병; 만성 림프성 백혈병 (B-세포 CLL, T-세포 CLL 전림프구성 백혈병 포함), 및 모양 세포 백혈병; 및 급성 림프구성 백혈병을 포함한다. 림프종의 예시는 B-세포 림프종, 예컨대 버킷 림프종; 호지킨 림프종; 등을 포함한다. 본원에 개시된 AAV 벡터, 재조합 바이러스 및 방법을 사용하여 치료될 수 있는 질환의 다른 비제한적 예시는, 겸상 적혈구 빈혈, 낭포성 섬유증, 리소좀성 산성 리파아제 (LAL) 결핍증 1, 테이-삭스 병, 페닐 케톤뇨증 (Phenylketonuria), 뮤코다당증, 글리코겐 저장 질환 (GSD, 예컨대, GSD 유형 I, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, V, Ⅵ, Ⅶ, Ⅷ, Ⅸ, X, XI, XⅡ, XⅢ, 및 XⅣ), 갈락토스혈증, 근이영양증 (예컨대, 뒤센 근이영양증), 및 혈우병 예컨대 혈우병 A (전형적 혈우병) 및 혈우병 B [크리스마스(Christmas) 병]을 포함하는 유전적 장애를 포함한다.
피험체 (예를 들어, 피험체의 혈청)에서 발현된 이종 단백질의 양은 다양할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단백질은 피험체의 혈청에서 적어도 약 9 ㎍/㎖, 적어도 약 10 ㎍/㎖, 적어도 약 50 ㎍/㎖, 적어도 약 100 ㎍/㎖, 적어도 약 200 ㎍/㎖, 적어도 약 300 ㎍/㎖, 적어도 약 400 ㎍/㎖, 적어도 약 500 ㎍/㎖, 적어도 약 600 ㎍/㎖, 적어도 약 700 ㎍/㎖, 적어도 약 800 ㎍/㎖, 적어도 약 900 ㎍/㎖, 또는 적어도 약 1000 ㎍/㎖의 양으로 발현될 수 있다. 일부 구현예에서, 관심 단백질은 피험체의 혈청에서 약 9 ㎍/㎖, 약 10 ㎍/㎖, 약 50 ㎍/㎖, 약 100 ㎍/㎖, 약 200 ㎍/㎖, 약 300 ㎍/㎖, 약 400 ㎍/㎖, 약 500 ㎍/㎖, 약 600 ㎍/㎖, 약 700 ㎍/㎖, 약 800 ㎍/㎖, 약 900 ㎍/㎖, 약 1000 ㎍/㎖, 약 1500 ㎍/㎖, 약 2000 ㎍/㎖, 약 2500 ㎍/㎖, 또는 상기 값 중 어느 2개 사이의 범위의 양으로 발현된다. 숙련된 당업자는, 관심 단백질이 유효한 방법을 위해 요구되는 발현 수준은, 관심 특정 단백질 및 치료를 받는 피험체과 같은 비제한적인 인자에 따라 가변될 수 있고, 유효량의 상기 단백질은 과도한 실험 없이 당업계에 공지된 통상적인 방법을 사용하여 당업자가 용이하게 결정할 수 있다.
실시예
실시예 1
자연-발생 캡시드 단백질의 단리
신규한 자연-발생 캡시드 단백질을 다양한 포유동물의 간 조직으로부터 단리하였다. 신선한 간 조직 (돼지)을 지역 농부들로부터 수득하였다. 냉동 간 조직 [개코원숭이, 시노몰구스 원숭이, 마모셋, 및 게잡이 원숭이(crab-eating macaques)]을 텍사스 바이오 메디컬 (Texas Biomedical)이나 뉴 잉글랜드 영장류 연구소 (New England Primate Research Center)로부터 수득하였다. DNeasy Blood & Tissue 키트 (Qiagen 카탈로그 # 69504)를 사용하여 간 조직으로부터 게놈 DNA를 제조하였다.
폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 (초기 항온처리: 97℃, 120초, 변성 단계: 97℃, 15초, 어닐링 단계: 58℃, 60℃, 또는 62℃, 15초, 신장 단계: 72℃, 240초의 조건 하에서) 하기 프라이머를 사용하여 게놈 DNA 상에서 수행하였다: 프라이머 rep-1397-F (5'-GTGCCCTTTTACGGCTGCGTGAACTGGACCAATGAAAACTTTCC-3', 서열번호 158) 및 프라이머 cap-2872-R (5'-CCGACGGAGTGGGCAATGCCTCAGGAAATTGGCATTGCGATTCC-3', 서열 번호 159). 변성, 어닐링 및 신장 단계를 35개 주기 동안 수행하였다. 이후 반응물을 72℃에서 7분간 항온처리하고, 분석할 때까지 4℃에서 보관했다. PCR 생성물을 1% 아가로스 겔에서 전기 영동에 의해 분리하고, 겔 추출 키트 (Qiagen 카탈로그 #28704)를 사용하여 단리시키고, 그리고 제조사의 설명서에 따라서 pCR4-TOPO-TA (Invitrogen 카탈로그 # 450030)로 클로닝시켰다. 이. 콜라이(E. Coli), NEB5α 세포, DNA의 형질전환 후, DNA를 암피실린 저항성 콜로니로부터 제조하고, 그리고 양 말단으로부터 서열분석하여 삽입물이 AAV-관련 서열을 암호화하는지 여부를 계측하였다.
pCR4-TOPO TA 내의 삽입물이 AAV 서열과 관련될 경우, 서열-특이적 프라이머를 서열의 rep 부분에 설계하여 "어라운드 더 에피솜 PCR (around the episome PCTR)" (이하 "ATE PCR")을 수행하여, 완전한 캡시드 유전자를 수득하였다. ATE PCR은 지속적인 AAV 게놈이 동물 조직에서 원형 에피솜을 형성한다는 개념에 기반한다. 따라서, 에피솜에 존재할 수 있는 어느 AAV 서열의 대부분 또는 전부를 단리하기 위해 rep 유전자의 서열에 상응하는 "분지형" 세트의 프라이머를 사용하여 폴리펩타이드 연쇄 반응을 수행할 수 있었지만, 특히 완전한 연속 캡시드 유전자를 단리할 수 있었다. 에피솜의 다량체는 예를 들어 상동성 재조합에 의해 형성될 수 있으며, 이 경우 단일 ATE PCR 반응 유래의 1개 초과의 캡시드 유전자 (보통 동일하지는 않음)를 단리하는 것이 가능하다.
ATE PCR은 하기와 같은 2-단계 프로그램을 사용하여 표준 폴리머라제 연쇄 반응 장치에서 수행된다: 초기 항온 처리: 95℃, 240초, 변성 단계: 95℃, 30초, 어닐링/신장 단계: 72℃, 300초. 변성 및 조합된 어닐링/신장 단계를 40주기 동안 수행하였다. 이후 반응물을 72℃에서 7분간 항온처리하고, 분석할 때까지 4℃에서 보관했다. PCR 생성물을 1% 아가로스 겔에서 전기 영동하였다. AAV 게놈의 다량체의 길이(~4.5 킬로베이스)인 PCR 생성물을, 겔로부터 절단하고, QIAquick 겔 추출 키트 (Qiagen 카탈로그 #28704)를 사용하여 정제하고, 그리고 제조사의 설명서에 따라 pCR4-TOPO-TA (Invitrogen 카탈로그 # 450030)로 클로닝하였다. 이. 콜라이, NEB5α 세포, DNA의 형질전환한 후, DNA를 암피실린 저항성 콜로니로부터 제조하고, 그리고 삽입물의 전체 서열을 계측하였다.
상기 기술된 2-단계 프로그램이 정확한 크기의 PCR 생성물을 생산하지 않을 경우, 하기 3-단계 프로그램을 사용하였다: 초기 항온처리: 95℃, 240초, 변성 단계: 95℃, 30초, 어닐링 단계: 62℃, 64℃, 66℃, 또는 68℃, 30초, 신장 단계: 72℃, 300초. 변성, 어닐링 및 신장 단계를 40개 주기 동안 수행하였다. 이후 반응물을 72℃에서 7 분간 항온처리하고 상기와 같이 분석할 때까지 4℃에서 보관했다.
일단 pCR4-TOPO TA의 완전한 삽입 서열이 계측되면, 이들은 BLAST 알고리즘 (NCBI 웹 사이트에서 이용 가능)을 사용하여 AAV 캡시드 유전자인 것으로 식별되었다. 공지된 AAV와 이들의 연관관계는 다양한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 정렬 프로그램 예컨대 Clustal Omega (EBI 웹 사이트에서 이용 가능) 또는 벡터 NTI (Invitrogen, Inc.)를 사용하여 계측하였다.
AAV를 생산하기 위하여, 고유의 AAV 캡시드 유전자를 발현 플라스미드 (pAAV-RC; Agilent, Inc.)에 서브클로닝하고, 이후 벡터 (pAAV 루시퍼라제)를 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드 (pHELPER; Agilent, Inc.)와 함께 293 세포에 형질감염시켰다. AAV 생산이 3일 동안 발생하도록 두고, 그리고 이후 미정제 용해물을 세포를 3회 동결-해동함으로서 제조하였다. 잔여물을 펠렛화하고, 상청액 (미정제 AAV)을 Q-PCR로 적정하여 게놈 역가를 계측하고(캡시드가 조립 및 DNA 패키징을 할 수 있음을 확인함), 그리고 이후 다양한 세포에서 AAV에 의한 형질도입을 평가하는데 사용하였다.
식별된 신규한 포유동물 조직-유래의 AAV 캡시드 단백질의 VP1 아미노산 서열은, 본원에 서열 번호 15 내지 89로 기재된다. 관련된 VP2 및 VP3 영역의 위치도 본 명세서에서 설명된다. 본 발명은 하기에 관한 것이다: (i) 서열 번호 15-89의 VP1 캡시드 서열 중 어느 것, 또는 서열 번호 15-89의 캡시드 서열 중 어느 것의 VP2 또는 VP3 영역에 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 단리된AAV 캡시드 단백질, 또는 (ⅱ) 서열 번호 15-89의 VP1 캡시드 서열 중 어느 것, 또는 서열 번호 15-89의 캡시드 서열 중 어느 것의 VP2 또는 VP3 영역을 포함하거나 상기로 구성된 단리된 AAV 캡시드 단백질. 본 발명은 또한, 상기 기술된 AAV 캡시드 단백질 중 어느 것을 포함하는 AAV 입자에 관한 것이며, 여기서 상기 AAV 입자는 하기를 추가로 포함한다: (i) AAV 역전 말단 반복부, 및 숙주 세포 내 이종 유전자의 발현을 유도하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 이종 유전자를 포함하는 전이유전자를 갖는 핵산, 또는 (ⅱ) 숙주 세포 내 이종 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 이종 유전자를 포함하는 핵산.
실시예 2
조작된 키메라 캡시드 단백질의 생성
다양한 AAV 혈청형의 1차 VP1 아미노산 서열의 정렬은, 보존 및 가변 영역이 AAV 캡시드 단백질 내에 존재함을 식별하였다. 이 분석은 캡시드 단백질 아미노산 서열 내에서 9개의 가변 영역 (본원에서 VR I - VR Ⅸ로 나타냄)을 식별하였다. 본 발명에서, 골격 ("수령체") 캡시드 단백질 및/또는 글리칸 결합 서열 (GBS) 영역 또는 GH 루프 영역의 9개 가변 영역들 중 하나 이상은, 상응하는 가변 영역 (들), 수령체와 상이한 아미노산 서열을 갖는 공여체 캡시드 단백질로부터의 GBS 또는 GH 루프 영역에 의하여 치환된다. pHLP19-AAV-BMRNX 발현 플라스미드 벡터를 사용하여 키메라 캡시드 단백질을 생성시켰다. AAV2의 Rep 단백질은 모든 상이한 캡시드 단백질 (VP1, VP2 및 VP3)에 대해 일관되게 사용되었다. 조작된 캡시드 유전자를 플라스미드 내 고유의 SwaI 및 Agel 제한 효소 부위를 사용하여 pHLP19-AAV-BMRNX로 서브클로닝하고, 또한 각 캡시드 유전자의 측면에 위치시켰다.
표 3은 본원에 기술된 바와 같이 생성되고 하기 실시예 3에 기술된 바와 같이 시험된 예시적인 조작된 키메라 캡시드 단백질을 제공한다. "골격 서열(backbone sequence)"은 VR, GBS 및/또는 GH 루프 영역(들)이 치환되거나 교환되는 골격 VP1 캡시드 서열, 즉 "수령체(recipient)"를 지칭한다. "공여체 서열(donor sequence)"은 가변 영역, GBS 및/또는 GH 루프 영역(들)이 얻어지고 수령체 골격 서열, 즉 "공여체"로 교환되는 VP1 캡시드 서열을 지칭한다. "VR" 치환은, 모든 9개의 가변 영역 (VR I - VR Ⅸ)이 공여체로부터 수령체로 교환되어, 수득된 조작된 키메라 캡시드를 생성하는 치환을 지칭한다. "VRGBS" 치환은, 모든 9개의 가변 영역 (VR I-VR Ⅸ) 및 GBS 서열이 공여체로부터 수령체로 교환되어 수득된 조작된 키메라 캡시드를 생성하는 치환을 지칭한다. "GH" 치환은 단지 GH 루프 영역만이 공여체로부터 수령체로 교환되어 수득된 조작된 키메라 캡시드를 생성하는 치환을 지칭한다. "GH 루프(loop)" 서열은 포괄된 GBS 서열 및 공여체 유래의 영역들 사이에 산재된 모든 보존된 서열을 포함하는, 가변 영역 VR Ⅳ 내지 VR Ⅷ를 포함한다. "VRGH" 치환은 모든 9개의 가변 영역 (VR I-VR Ⅸ) 및 GH 루프 서열 (포괄된 GBS 서열 및 공여체 서열 유래의 영역들 사이에 산재된 보존된 서열을 포함함)이 공여체로부터 수령체로 교환되는 치환을 지칭한다. "PHP" 변형은, Deverman et al., Nature Biotechnology 34:204-209 (2016)에 기술된 바와 같이 뇌 조직에 대한 표적화를 증진시키기 위한, 7개의 아미노산 서열 TLAVPFK (서열번호: 160)의 키메라 캡시드 서열로의 삽입을 지칭한다.
표 3:
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실시예 3
조작된 키메라 캡시드 단백질의 분석
DNAseI 저항성 바이러스 역가 분석은 바이러스 패키징 효율 및 조작된 AAV 변이체의 생산을 특성화하기 위해 사용되었다. 5백만개 HEK293 세포를 10cm의 세포 배양 접시에 분주하고 37℃에서 밤새 배양하였다. AAV 플라스미드 형질감염을 ~ 20㎍ 총 DNA를 사용하는 종래의 인산칼슘 형질감염 프로토콜을 사용하여 수행하였다. 세포를 형질감염 72시간 후에 수거하고, 1,000xg에서 15분 동안 원심분리하였다. 용해 완충액을 세포 펠렛에 첨가하고, 샘플은 최종 해동물에서 DNAseI를 첨가하여 3회 동결-해동 주기를 수행한 다음 30분 동안 항온처리하였다. 원심분리 후 상청액에서 미정제 발현된 AAV 바이러스를 수집하여, 세포 파편을 10,000xg에서 30분 동안 제거하였다. EDTA를 첨가하여 DNaseI 활성을 중지시키고, 그리고 이후 발현된 AAV를 15분 동안 95℃로 항온처리하여, DNase를 추가로 불활성화하였다. 정량적 PCR을 제조업체 (Roche)에서 제공한 Fast Expression Taqman PCR 혼합 프로토콜에 따라 LightCyclerⅡ를 사용하여 수행하였다. 바이러스 역가를 계산하고, vg/㎕ 양으로 비교하였다. 각 바이러스 역가를 3회 측정하였다.  이러한 DNaseI 저항성 역가 분석의 결과는 하기 표 4에 제공되며, 최고에서 최저 역가의 순서로 정렬된다.
표 4
표 4의 결과는, 가변하는 역가에도 불구하고, 본 발명의 조작된 키메라 AAV 캡시드를 포함하는 AAV 바이러스가 성공적으로 생산될 수 있음을 입증한다.
다음으로, 본 발명의 조작된 키메라 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 입자의 시험관내 배양된 세포에 대한 형질도입 능력을 계측하였다. HepG2 세포 및 HEK293 세포를 96웰 플레이트에 5×104 세포/웰로 분주하고, 밤새 항온처리하였다. 에토포시드를 감염 당일에 HEK293 및 HepG2 세포에 대해 각각 4 μM 및 20 μM의 최종 농도로 첨가하였다. 상이한 미정제 AAV 입자를 2000 MOI가 되도록 첨가하였고, 감염 후 72시간 동안 상대적 루시퍼라제 단위 (RLU)로 형질도입 데이터를 측정하였다. 형질도입 데이터의 효율은 하기 표 5에 제공되며, 가장 높은 것에서 가장 낮은 형질도입 능력으로 정렬된다. 예상대로, 재조합 AAV2 (양성 대조군)는 두 세포주 모두에 대해 최고의 시험관내 형질도입을 나타내었으며, 시험된 대부분의 조작된 키메라 AAV는 시험관내 형질전환 성질이 양성 (RLU >104) 으로 나타났다. 이러한 결과는 본 발명의 키메라 조작된 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 입자가 성공적으로 생산될 수 있을 뿐만 아니라, 이들 신규한 재조합 AAV 입자가 다양한 효율로 HEK293 또는 HepG2 세포 중 어느 하나를 형질도입할 수 있다는 점에서 기능적이라는 것을 입증한다.
표 5
다음으로, 본 발명의 특정 조작된 AAV 입자가 신경교세포를 형질도입시키는 능력을 조사하였다. 인간 교모세포종 U87MG 세포를 96웰 플레이트에 5×104 세포/웰로 분주하고, 밤새 항온처리하였다. 에토포시드를 감염 당일에 최종 농도 4μM이 되도록 첨가하였다. 상이한 미정제 AAV 입자를 2000 MOI가 되도록 첨가하였고, 감염 72시간 후 RLU 단위로 형질도입 데이터를 측정하였다. 표 6에 나타낸 바와 같이, 조작된 AAV 변이체는 신경교세포를 다양한 효율로 형질도입시키는 능력을 보유하였다.
표 6 : U87MG 신경아교세포 형질도입 데이터 :
인간 혈청 중의 항체에 의한 본 발명의 조작된 AAV 입자의 중화 또한 조사되었다. HEK293T 세포를 5×104 세포/웰의 밀도로 접종하고, 밤새 항온처리하였다. 정제된 rAAV를 2×106 vg/㎕의 최종 역가로 희석하고, 그리고 1시간 동안 일련의 희석된 IVIG (0~10 mg/㎖)와 혼합하였다.  재조합 AAV를, 1000의 MOI를 사용하여 HEK293T 세포 상에 첨가하고, 그리고 37℃에서 항온처리하였다. 감염 72시간 후, ⅣIG 중화는 상대적 루시퍼라제 단위 (RLU) 판독 값에 기초하여 분석하였다. 이 연구에서는 에토포시드가 사용되지 않았다. 결과는 표 7에 제공된다. 예상대로, AAV2 형질 도입 (양성 대조군)은 인간 ⅣIG의 첨가에 의해 폐지되었다. 대조적으로, 시험된 조작된 AAV 중 특정 일부는 ⅣIG 저항성 특성을 나타냈다.
표 7: ⅣIG 중화 데이터:
조작된 AAV 입자 중 일부는 상이한 AAV 캡시드 서열로부터 부여된 GBS 영역으로 치환된 GBS 영역을 갖는다. 글리칸 결합 특성에 대한 이러한 치환의 효과가 조사되었다. 예를 들어, 모든 가변 영역 (VR I 내지 VR Ⅸ)과 AAV9 (AAV8_9VRGBS)의 GBS 영역의 치환을 갖는, AAV8 골격 서열을 갖는 조작된 AAV 변이체에서 갈락토스 결합을 조사하였다. Pro5, Lec1 및 Lec2 세포를 96 웰 플레이트에 5×104 세포/웰로 분주하고, 밤새 항온처리하고, 이후 감염 전에 30분 동안 4℃로 냉각하였다. 재조합 AAV 입자를 10,000의 MOI로 첨가하고, 그리고 추가 2시간 동안 4℃에서 항온처리하였다. DMEM 배지의 2회 세정 후, 세포를 48시간 동안 DMEM, 10% 소 태아 혈청 중 37℃에서 항온처리하고, 그리고 RLU를 측정하였다. 표 8에 나타낸 바와 같이, 이러한 특정 조작된 AAV 변이체는 야생형 AAV9와 유사하게 Lec2에 결합하는 능력을 나타내며, 이는 본 발명의 조작된 키메라 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 바이러스의 글리칸 결합 특성은 골격 서열로 교환된 GBS 영역의 공여체 공급원에 의하여 계측된다는 것을 입증한다.
표 8 : 글리칸 결합 데이터
본원에 개시된 AAV 캡시드의 조직 특이적 감염성을 계측하기 위해, 캡시드 각각을 포함하고 루시퍼라제 전이유전자를 발현하는 AAV가 생성되었다 (AAV-RSV-egfp-T2A-Fluc2). 수컷 Balb/C 마우스는 찰스 리버 브리딩 레보러토리스(Charles River Breeding Laboratories) 사에서 구입하였다. AAV-RSV-egfp-T2A-Fluc2 벡터의 2×1013 vg/kg의 용량을 8주령 마우스의 꼬리 정맥 내로 주사하였다. 주사 3주 및 5주 후에, 생체내 생물발광 영상화를 생체내 영상화 장치 [메사추세스주 월섬 소재의 펄킨 엘머 사(PerkinElmer Inc.)로부터 수득된 ⅣIS 일루미나 LT]를 사용하여 수행하였다. 간단히 말하면, 마우스를 2% 이소플루오란 및 산소로 마취시켰다. RediJect D-루시페린 생물발광 기질(30mg/㎖) 150㎕를 복강 내 주사하였다. 기질 주입 10분 후, 동물을 냉각된 전하 결합 소자 (CCD) 카메라를 사용하여 생체내 영상화 장치로 영상화하였다. 영상은 동물의 배측 (dorsal) 위치에서 촬영되었다. 마취는 라이트-타이트(light-tight) 영상화 챔버에서 이소플루오란-산소 전달에 의해 전체 영상화 세션 동안 유지되었다.
마우스는 AAV 주사 후 5주에 영상화 세션을 한 후 희생되었다. 다양한 기관을 수거하여, 영상화 장치를 사용하여 영상화하였다. 측정 조건은 생체내 영상화에 사용된 것과 동일하였다.
영상화를 위해, 동물의 그레이-스케일(gray-scale) 사진을 획득한 다음 생물발광 영상을 획득하였다. 영상 데이터는 리빙 이미지 소프트웨어 버전 4.5.2 (메사추세스 월섬 소재의 펄킨 엘머 사)를 사용하여 처리 및 분석되었다. 루시퍼라제 활성에 의해 방출되는 총 플럭스 (TF) (광자/초)를 정량화하기 위하여, 관심 영역 (ROI)을 각 동물뿐만 아니라 개별 기관 주위에서 추적하였다. 총 플럭스 활성은 각 기관계의 AAV 감염성의 프록시이며, 표 9에서 각 AAV 캡시드에 대해 표시된다. 다양한 캡시드에 의해 부여된 조직 특이적인 감염성을 추가로 특성화하기 위해, 감염된 마우스로부터의 조직을 수거하고 절편화하였다. GFP를 발현하는 세포의 백분율을 각각에 대해 정량화하였다 (표 10 참조). 이러한 데이터는 특정 캡시드 및 키메라 캡시드를 함유하는 AVV가 상이한 조직 특이성을 나타내며, 예를 들어 일부 AAV는 간에서 보다 활성인 반면, 다른 것들은 근육 조직에서 보다 활성이다. 특히, 데이터는 캡시드 AAVanc110_9VR 및 Bba41이 근육 세포에 대한 고도의 특이성을 갖는 재조합 AAV를 생산한다는 것을 입증한다. 따라서, 캡시드 AAVanc110_9VR 또는 캡시드 Bba41을 포함하는 재조합 AAV는 표적화된 전이유전자의 근육 세포로의 전달에 유용할 것이다.
표 9 : 조직의 총 플럭스 (광자/초/㎠/라디안): AVE/(STD)
*장딴지근(Gast.) = 장딴지근
**사두근(Quad.) = 사두근
표 10
SEQUENCE LISTING <110> BIOMARIN PHARMACEUTICAL INC. <120> NOVEL ADENO-ASSOCIATED VIRUS CAPSID PROTEINS <130> 30610/50821A <150> US-62/366,838 <151> 2016-07-26 <160> 160 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 736 <212> PRT <213> Adeno-Associated Virus <400> 1 Met Ser Phe Val Asp His Pro Pro Asp Trp Leu Glu Ser Ile Gly Asp 1 5 10 15 Gly Phe Arg Glu Phe Leu Gly Leu Glu Ala Gly Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly 35 40 45 Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Asp Pro Val 50 55 60 Asn Phe Ala Asp Glu Val Ala Arg Glu His Asp Leu Ser Tyr Gln Lys 65 70 75 80 Gln Leu Glu Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Asp 85 90 95 Ala Glu Phe Gln Glu Lys Leu Ala Ser Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asn 100 105 110 Leu Gly Lys Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Ile Leu Glu Pro Leu 115 120 125 Gly Leu Val Glu Thr Pro Asp Lys Thr Ala Pro Ala Ala Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Leu Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly 145 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Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg 725 730 735 Asn Leu <210> 154 <211> 738 <212> PRT <213> Adeno-Associated Virus <400> 154 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Ala Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile 145 150 155 160 Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln 165 170 175 Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro 180 185 190 Pro Ala Ala Pro Ser Ser Val Gly Ser Gly Thr Val Ala Ala Gly Gly 195 200 205 Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn 210 215 220 Ala Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val 225 230 235 240 Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His 245 250 255 Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp 260 265 270 Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn 275 280 285 Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn 290 295 300 Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Arg Phe Lys Leu Phe Asn 305 310 315 320 Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala 325 330 335 Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln 340 345 350 Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe 355 360 365 Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn 370 375 380 Asn Gly Ser Gln Ser Val 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Asn Asn Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val 595 600 605 Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile 610 615 620 Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe 625 630 635 640 Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val 645 650 655 Pro Ala Asn Pro Pro Glu Val Phe Thr Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe 660 665 670 Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu 675 680 685 Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr 690 695 700 Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asp Ser Gln 705 710 715 720 Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg 725 730 735 Asn Leu <210> 155 <211> 738 <212> PRT <213> Adeno-Associated Virus <400> 155 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Ala Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile 145 150 155 160 Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln 165 170 175 Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro 180 185 190 Pro Ala Ala Pro Ser Ser Val Gly Ser Gly Thr Val Ala Ala Gly Gly 195 200 205 Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn 210 215 220 Ala Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val 225 230 235 240 Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His 245 250 255 Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp 260 265 270 Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn 275 280 285 Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn 290 295 300 Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Arg Phe Lys Leu Phe Asn 305 310 315 320 Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala 325 330 335 Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln 340 345 350 Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe 355 360 365 Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn 370 375 380 Asn Gly Ser Gln Ser Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr 385 390 395 400 Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr 405 410 415 Ser Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser 420 425 430 Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu 435 440 445 Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gln Gln Leu Leu 450 455 460 Phe Ser Gln Ala Gly Pro Asn Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp 465 470 475 480 Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser 485 490 495 Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His 500 505 510 Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr 515 520 525 His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met 530 535 540 Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Lys Asp Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val 545 550 555 560 Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr 565 570 575 Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Ala Ala 580 585 590 Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val 595 600 605 Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile 610 615 620 Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe 625 630 635 640 Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val 645 650 655 Pro Ala Asn Pro Pro Glu Val Phe Thr Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe 660 665 670 Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu 675 680 685 Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr 690 695 700 Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asp Ser Gln 705 710 715 720 Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg 725 730 735 Asn Leu <210> 156 <211> 737 <212> PRT <213> Adeno-Associated Virus <400> 156 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp Asn 260 265 270 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 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555 560 Ile Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu 565 570 575 Ser Tyr Gly Gln Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Ala Ala Pro 580 585 590 Ile Val Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp 595 600 605 Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro 610 615 620 His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly 625 630 635 640 Met Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro 645 650 655 Ala Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile 660 665 670 Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu 675 680 685 Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser 690 695 700 Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly 705 710 715 720 Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn 725 730 735 Leu <210> 157 <211> 737 <212> PRT <213> Adeno-Associated Virus <400> 157 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His 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Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gln Gln Leu Leu Phe 450 455 460 Ser Gln Ala Gly Pro Asn Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp Leu 465 470 475 480 Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser Gln 485 490 495 Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu 500 505 510 Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr His 515 520 525 Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met Phe 530 535 540 Gly Lys Gln Gly Ala Gly Lys Asp Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val Met 545 550 555 560 Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu 565 570 575 Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Ala Ala Pro 580 585 590 Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp 595 600 605 Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro 610 615 620 His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly 625 630 635 640 Met Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro 645 650 655 Ala Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile 660 665 670 Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu 675 680 685 Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser 690 695 700 Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly 705 710 715 720 Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn 725 730 735 Leu <210> 158 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 158 gtgccctttt acggctgcgt gaactggacc aatgaaaact ttcc 44 <210> 159 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 159 ccgacggagt gggcaatgcc tcaggaaatt ggcattgcga ttcc 44 <210> 160 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 160 Thr Leu Ala Val Pro Phe Lys 1 5

Claims (52)

  1. 캡시드 단백질 및 전이 유전자를 포함하는 아데노-관련 바이러스(AAV)로서, 상기 캡시드 단백질은 (i) 서열 번호 28의 VP1 영역, (ⅱ) 서열 번호 28의 VP2 영역, 또는 (ⅲ) 서열 번호 28의 VP3 영역과 적어도 98% 일치하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 전이 유전자는 숙주 세포에서 이종 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 이종 유전자를 포함하며, 상기 캡시드 단백질은 서열번호 28의 가변 영역(VR) VR-I, VR-Ⅱ, VR-Ⅲ, VR-Ⅳ, VR-V, VR-Ⅵ 및 VR-Ⅸ을 포함하는, 아데노-관련 바이러스 (AAV).
  2. 제1항에 있어서, 상기 캡시드 단백질은 (i) 서열번호 28의 VP1 영역; (ii) 서열번호 28의 VP2 영역; 또는 (iii) 서열번호 28의 VP3 영역과 적어도 99% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는, AAV.
  3. 제1항에 있어서, 상기 캡시드 단백질은 (i) 서열번호 28의 VP1 영역; (ii) 서열번호 28의 VP2 영역; 또는 (iii) 서열번호 28의 VP3 영역과 동일한 아미노산 서열을 포함하는, AAV.
  4. 제1항에 있어서, 상기 AAV는 (i) 서열번호 28의 VP1 영역을 포함하는 캡시드 단백질, (ii) 서열번호 28의 VP2 영역을 포함하는 캡시드 단백질, 및 (iii) 서열번호 28의 VP3 영역을 포함하는 캡시드 단백질을 포함하는, AAV.
  5. 제1항에 있어서, 상기 캡시드 단백질은 서열번호 28의 가변 영역(VR) VR-I 내지 VR-IX를 포함하는, AAV.
  6. 제1항에 있어서, 상기 캡시드 단백질은 서열번호 28의 VP1 영역과 적어도 98% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는, AAV.
  7. 제1항에 있어서, 상기 캡시드 단백질은 서열번호 28의 VP1 영역과 적어도 99% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는, AAV.
  8. 제1항에 있어서, 상기 캡시드 단백질은 서열번호 28의 VP1 영역의 아미노산 서열을 포함하는, AAV.
  9. 제1항에 있어서, 상기 AAV는 AAV 역전된 말단 반복부(ITR)를 추가로 포함하며, 상기 전이유전자는 AAV ITR의 측면에 위치하는, AAV.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 AAV, 및 생리학적으로 양립가능한 담체를 포함하는, 조성물.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 AAV를 포함하는, 전이유전자를 세포에 전달하기 위한 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 세포는 근육 세포인, 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 전이유전자는 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화하는, 조성물.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 상기 핵산 서열은 숙주 세포에서 캡시드 단백질의 발현을 조절하는 이종 조절 서열에 작동가능하게 연결된, 벡터.
  16. 제14항의 벡터를 포함하는, 시험관 내(in vitro) 세포.
  17. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 AAV를 포함하는, 근육 관련 질병 또는 질환 치료용 조성물.
  18. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 AAV를 포함하는, 내인성 단백질의 비정상적인 활성과 연관된 질병 또는 질환 치료용 조성물로서, 상기 전이유전자는 기능성 유전자 생성물(product)을 암호화하는, 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 질병 또는 질환은 뒤센 근이영양증이고, 상기 전이유전자는 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화하는, 조성물.
  20. 아데노-관련 바이러스(AAV) 바이러스 입자를 생산하는 방법으로서,
    (a) 세포 배양액에서 AAV 바이러스 입자를 생산하기 위해 시험관 내 세포를 배양하는 단계로서, 상기 시험관 내 세포는 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산 서열, AAV rep 단백질을 암호화하는 핵산 서열, 및 전이유전자를 포함하는 핵산 서열을 포함하고, 상기 전이유전자는 상기 시험관 내 세포에서 이종 유전자의 발현을 조절하는 이종 조절 서열에 작동가능하게 연결된 이종 유전자를 포함하며, 상기 캡시드 단백질은 (i) 서열 번호 28의 VP1 영역, (ⅱ) 서열 번호 28의 VP2 영역, 또는 (ⅲ) 서열 번호 28의 VP3 영역과 적어도 98% 일치하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 캡시드 단백질은 서열번호 28의 가변 영역(VR) VR-I, VR-Ⅱ, VR-Ⅲ, VR-Ⅳ, VR-V, VR-Ⅵ 및 VR-Ⅸ을 포함하는 단계; 및
    (b) 상기 세포 배양액으로부터 AAV 바이러스 입자를 수집하는 단계;를 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 캡시드 단백질은 (i) 서열번호 28의 VP1 영역; (ii) 서열번호 28의 VP2 영역; 또는 (iii) 서열번호 28의 VP3 영역과 적어도 99% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 AAV 캡시드 단백질은 (i) 서열번호 28의 VP1 영역; (ii) 서열번호 28의 VP2 영역; 또는 (iii) 서열번호 28의 VP3 영역과 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  23. 제20항에 있어서, 상기 시험관 내 세포는 무척추동물 세포, 곤충 세포 또는 포유동물 세포인, 방법.
  24. 제20항에 있어서, 상기 시험관 내 세포는 HEK293, HeLa, CHO, NS0, SP2/0, PER.C6, Vero, RD, BHK, HT-1080, A549, Cos-7, ARPE-19 및 MRC-5로부터 선택된 포유동물 세포인, 방법.
  25. 제20항에 있어서, 상기 시험관 내 세포는 하이 파이브 (High Five), Sf9, Se301, SeIZD2109, SeUCR1, Sf900+, Sf21, Bti-tn-5b1-4, MG-1, Tn368, HzAm1, BM-N, Ha2302, Hz2E5 및 Ao38로부터 선택된 곤충 세포인, 방법.
  26. 제20항에 있어서, 상기 캡시드 단백질은 서열 번호 28의 VP1 영역과 적어도 98% 일치하는, 방법.
  27. 제20항에 있어서, 상기 캡시드 단백질은 서열 번호 28의 VP1 영역과 동일한, 방법.
  28. 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된, 아데노-관련 바이러스 (AAV).
  29. 이종 아미노산 서열에 연결된 AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 시험관 내 세포로서, 상기 캡시드 단백질은 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 것인, 시험관 내 세포.
  30. 제29항에 있어서, 상기 시험관 내 세포는 기능성 AAV rep 유전자를 더 포함하는, 시험관 내 세포.
  31. 제29항에 있어서, 상기 시험관 내 세포는 곤충 세포 또는 포유동물 세포인, 시험관 내 세포.
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