DE3485810T2 - Verfahren zur herstellung eines rekombinanten baculovirus-expressionsvektors. - Google Patents
Verfahren zur herstellung eines rekombinanten baculovirus-expressionsvektors.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten, viralen Expressionsvektors. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zum Einbau eines mit einem Baculovirus-Promotor gekoppelten, ausgewählten Gens in ein Baculovirus-Genom zur Bildung eines rekombinanten Baculovirus-Expressionsvektors, der zur Expression des ausgewählten Gens in eine Insektenzelle befähigt ist.
- Neuere Fortschritte in der rekombinanten DNA-Technologie haben die Isolierung von spezifischen Genen oder Teilen derselben sowie deren Transfer zu Bakterien-, Hefe-, pflanzlichen oder tierischen Zellen und zu den Viren, die diese Organismen infizieren, erleichtert. Das transferierte Genmaterial [oder das modifizierte Gen (die modifizierten Gene)] wird als Replikat der transformierten Zellen oder Viren repliziert und vermehrt. Als Ergebnis übernehmen die transformierten Zellen die Fähigkeit zur Herstellung des Produkts, das durch die transferierten Gensequenzen kodiert wird.
- Der Transfer und die Expression von Genen oder Teilen derselben zwischen Viren, Eukaryonten und Prokaryonten ist möglich, weil die DNA aller lebenden Organismen darin chemisch ähnlich ist, daß sie aus den gleichen vier Nukleotiden besteht. Die grundlegenden Unterschiede liegen in den Sequenzen, mit denen Nukleotide in dem Genom des Organismus vorliegen. Spezifische Nukleotidsequenzen, eingeteilt in Kodons (Nukleotid-Tripletts), kodieren spezifische Aminosäuresequenzen. Die Kodierungs-Beziehung zwischen einer Aminosäuresequenz und einer DNA-Nukleotidsequenz ist jedoch für alle Organismen im wesentlichen die gleiche.
- Genom-DNA ist aus Protein-kodierenden Sequenzen (d.h. "Strukturgenen") und Kontroll-Regionen (die die Transkriptions-Initiation kontrollierenden DNA-Sequenzen werden üblicherweise als "Promotor" bezeichnet), die die Expression des Strukturgens vermitteln, aufgebaut. Im allgemeinen wird die Enzym- RNA-Polymerase von dem Promotor aktiviert, so daß sie entlang des Strukturgens wandert und die kodierte Information in eine Messenger-Ribonukleinsäure (mRNA) transkribiert. Die mRNA enthält Erkennungssequenzen, Signale für Ribosomen-Bindungen und Signale für den Translations-Start und -Stop. Neuere Fortschritte bei der genetischen Analyse der Rolle wichtiger Transkriptions-Signale in den Promotor-Regionen von Genen (die üblicherweise als die 5'-Flankierungs-Regionen von Genen bezeichnet werden) haben die Fähigkeit zur selektiven Entfernung oder Änderung von DNA-Sequenzen, um deren Funktion und Rolle bei der Expression zu untersuchen, und zur Entfernung verschiedener dieser Sequenzen, um deren Funktion in heterologen biologischen Systemen wie einem Rekombinant-DNA-Wirt-Vektor-System zu untersuchen, erleichtert.
- Eukaryontische Promotoren sind üblicherweise durch zwei konservierte Nukleotidsequenzen charakterisiert, deren Stellung und strukturelle Ähnlichkeit mit prokaryontischen Promotor-Sequenzen (Breathnach & Chambon, 50, Ann. Rev. Biochem., 349-383 (1981)) die Beteiligung an der Promotion der Transkription nahelegen. Die erste ist eine an den Nukleinsäuren Adenin und Thymin reiche Sequenz (die Goldberg-Hogness-, "TATA"- oder "ATA"-Box), die 20 bis 30 Basenpaare stromaufwärts der RNA-Initiationsstelle (der cap-Stelle, die die Transkriptions-Startstelle für die mRNA ist) lokalisiert und durch eine Consensus-Sequenz (5'-TATAA-ATA-3') charakterisiert ist. Die zweite Region ist die CCAAT-Box (Efstratadis et al., 21, Cell, 653-668 (1980)), die 70 bis 90 Basenpaare stromaufwärts der cap-Stelle einiger Gene lokalisiert ist und die kanonische Sequenz 5'-GG(C/T)CAATCT-3' aufweist (Benoist et al., 8, Nucleic Acids Res. 127-142 (1980)). Diese Sequenzen können entfernt sowie unter Verwendung von Restriktionsendonuklease- Enzymen und Klonieren zur Herstellung rekombinanter DNA-Moleküle sowie kontrollierter Entfernung oder Änderung der klonierten Nukleotidsequenzen durch in-vitro- oder stellenspezifische Mutagenese modifiziert werden. Restriktionsendonukleasen sind hydrolytische Enzyme, die zur Katalyse der stellenspezifischen Spaltung von DNA-Molekülen befähigt sind. Die Stelle der Restriktionsenzym-Aktivität wird durch die Anwesenheit einer spezifischen Nukleotidsequenz bestimmt und die Erkennungsstelle für eine gegebene Restriktionsendonuklease genannt. Es wurden viele Restriktionsenzyme isoliert und nach ihrer Erkennungsstelle klassifiziert. Einige Restriktionsendonukleasen hydrolysieren die Phosphor-Diester-Bindungen an beiden DNA-Strängen an demselben Punkt, um stumpfe Enden herzustellen, während andere Bindungen hydrolysieren, die durch einige Nukleotide voneinander getrennt sind, um freie einzelsträngige Regionen an dem Ende jedes DNA-Moleküls herzustellen. Diese einzelsträngigen Enden sind selbstkomplementär und können zum Zusammenfügen der hydrolysierten DNA oder einer anderen DNA-Sequenz oder heterologen DNA-Sequenzen mit den gleichen komplementären einzelsträngigen Sequenzen verwendet werden.
- Restriktionsstellen sind relativ selten. Die allgemeine Verwendung von Restriktionsendonukleasen wurde jedoch durch die Zugänglichkeit von chemisch synthetisierten doppelsträngigen Oligonukleotiden mit der gewünschten Restriktionsstellen-Sequenz stark verbessert. Im Grunde genommen kann ein beliebiges in der Natur vorkommendes, kloniertes, genetisch verändertes oder chemisch synthetisiertes Segment von DNA durch Verknüpfen eines Oligonukleotids, das die geeigneten Erkennungsstellen zu den Enden des DNA-Moleküls enthält, mit einem beliebigen anderen Segment gekoppelt werden. Unterwirft man dieses Produkt der Hydrolysewirkung der geeigneten Restriktionsendonuklease, so stellt man die erforderlichen komplementären Enden für das Koppeln der DNA-Moleküle her.
- Erkennungsstellen für spezifische Restriktionsenzyme sind üblicherweise zufällig verteilt. Daher kann eine Spaltung durch ein Restriktionsenzym zwischen benachbarten Kodons, innerhalb eines Kodons oder an einigen zufälligen Stellen in dem Gen stattfinden. Während es viele mögliche Variationen bei diesem Schema gibt, ist es wichtig, festzustellen, daß Verfahren zum Insertieren von DNA-Sequenzen an der richtigen Stelle und in der richtigen Orientierung bezüglich einer Promotor-Region zur Verfügung stehen, um die Expression dieser Sequenzen zu ermöglichen.
- Potentiell kann daher eine beliebige DNA-Sequenz durch Insertieren einer fremden DNA-Sequenz in ein Klonierungsvehikel oder -vektor-Molekül kloniert werden, um ein künstliches rekombinantes Molekül oder eine Zusammensetzung, manchmal Chimäre oder Hybrid-Gen genannt, herzustellen. Für die meisten Zwecke ist das verwendete Klonierungsvehikel eine doppelsträngige, extrachromosomale DNA-Sequenz, die ein intaktes Replikon einschließt, so daß das rekombinante Molekül repliziert werden kann, wenn es durch Transformation in Bakterien-, Hefe-, pflanzliche oder tierische Zellen gebracht wird. Üblicherweise verwendete Klonierungsvehikel werden aus Viren und Plasmiden erhalten, die von Bakterien-, Hefe-, pflanzlichen und tierischen Zellen abgeleitet sind.
- Neueste Fortschritte in der Biochemie und rekombinanten DNA-Technologie haben zur Konstruktion von "heterologe" DNA enthaltenden Klonierungsvehikeln oder -vektoren geführt. Die Bezeichnung "heterolog" bezieht sich auf DNA, die im allgemeinen nicht von der Zelle hergestellte Polypeptide kodiert. Die heterologe DNA kann an selbst-replizierenden Plasmid- oder Virus-Klonierungsvehikeln in das Genom der Zelle eingebaut und in der transformierten Zelle aufrechterhalten werden. Diese transformierten Zellpopulationen stellen eine erneuerbare Quelle von heterologer DNA für weitere Manipulationen, Modifikationen und den Transfer auf andere Vektoren zur Verfügung. Verschiedene, ein fremdes Gen oder fremde Gene tragende Virus-Vektoren replizieren in den transformierten Zellen und lysieren diese. Während der Replikation kann das fremde Gen oder können die fremden Gene in diesem speziellen Zelltyp exprimiert werden oder nicht. Der replizierte Virus kann isoliert und zum Infizieren weiterer Zellen verwendet werden und stellt so eine erneuerbare Quelle des Rekombinants für die weitere Verwendung zur Verfügung.
- Wenn das Gen oder gewünschte Teile desselben auf die gewünschte Weise kloniert und/oder biochemisch modifiziert ist oder andere biochemisch modifizierte oder genomische Gene auf eine solche Weise insertiert wurden, daß sie deren Expression erleichtern, werden dieselben anschließend auf einen Expressionsvektor transferiert. Aufgrund der Art des genetischen Codes lenkt das klonierte oder das Hybrid-Gen oder Teile derselben die Herstellung auf die davon kodierten Aminosäuresequenzen. Die allgemeinen Verfahren zum Konstruieren von Expressionsvektoren mit in richtiger Beziehung zu den Promotor-Regionen lokalisierten, klonierten Genen werden von B. Polisky et al., 73, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 3900 (1976), K. Itakura et al., 198, Science, 1056-1063 (1977), L. Villa-Komaroff et al., 75, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 3727-3731 (1978), und anderen beschrieben.
- Der Begriff "Expression" kann auf die folgende Weise charakterisiert werden. Auch in relativ einfachen prokaryontischen Organismen kann die Zelle viele Proteine herstellen. Zu einem gegebenen Zeitpunkt werden viele Proteine, die die Zelle herstellen kann, nicht hergestellt. Wenn ein spezielles, von einem gegebenen Gen kodiertes Polypeptid von der Zelle hergestellt wird, wird dieses Gen als exprimiert bezeichnet. Um exprimiert zu werden, muß die dieses spezielle Polypeptid kodierende DNA-Sequenz bezüglich der Kontroll-Region des Gens richtig lokalisiert sein. Die Funktion der Kontroll-Region ist die Ermöglichung der Expression des Gens unter seiner Kontrolle, die für die wechselnden Bedürfnisse der Zelle bei einem gegebenen Moment verantwortlich ist.
- Es gelten die folgenden, in der gesamten Beschreibung verwendeten Definitionen:
- Ein Klonierungsvehikel ist eine extrachromosomale Länge von doppelsträngiger DNA, die ein intaktes Replikon umfaßt, das durch Transformation in Zellen oder einem Organismus repliziert werden kann. Im allgemeinen sind Klonierungsvehikel von Viren oder Plasmiden abgeleitet und nehmen im allgemeinen die Form von ringförmiger DNA an.
- Die Bezeichnung Gen bezieht sich auf die DNA-Sequenzen, die für die Übertragung und Herstellung einer einzelnen Proteinkette verantwortlich sind.
- Der Begriff Infektion bezieht sich auf die Invasion durch pathogene, virale Agentien von Zellen, wo die Bedingungen für ihre Replikation und ihr Wachstum vorteilhaft sind.
- Der Begriff Transfektion bezieht sich auf ein Verfahren zum Infizieren von Zellen mit gereinigten Nukleinsäuren durch Fällung von DNAs und Aufnahme in Zellen nach Zugabe von Calciumchlorid zu Lösungen von DNA, die Phosphat oder andere geeignete Agentien wie Dextransulfat enthalten.
- Es wurden eine Anzahl von Wirt-Vektor-Systemen, die das o.g. allgemeine Schema und die o.g. allgemeinen Verfahren nutzbar machen, für die Verwendung bei der kommerziellen oder experimentellen Herstellung von Proteinen durch genetisch modifizierte Organismen entwickelt. Viele dieser Wirt-Vektor-Systeme sind prokaryontische Wirt-Vektor-Systeme, wie die in dem U.S.-Patent Nr. 4 338 397 von Gilbert et al. beschriebenen. Zusätzlich wurden Systeme nutzbar gemacht, die Hefe als Vektor verwenden, wie das von A. Miyanohara et al., 80, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1 (1983), beschriebene, für die Herstellung des Hepatitis-B-Oberflächenantigens verwendete System und das von Pitzeman et al., 219, Science, 620 (1983) beschriebene System für die Herstellung von Human-Interferon in Hefe.
- Der Wert einer Verwendung prokaryontischer Wirt-Vektor-Systeme für die Herstellung gewünschter Proteine wird durch verschiedene, solchen Systemen innewohnende Beschränkungen vermindert. Zum Beispiel kann das mRNA-Transkript oder Proteinprodukt dieser Systeme in dem Prokaryonten unstabil sein. Zusätzlich muß, bevor ein Protein in einer prokaryontischen Zelle hergestellt wird, die in den Mikroorganismus eingeführte DNA-Sequenz frei von störenden DNA-Sequenzen, Nonsens-Sequenzen und Anfangs- oder Endsequenzen, die nicht das aktive eukaryontische Protein einschließende Polypeptidsequenzen kodieren, sein. Weiterhin erfordern einige eukaryontische Proteine eine Modifikation nach der Synthese (d.h. Glykosylierung), um biologisch wirksam zu werden; prokaryontische Zellen sind im allgemeinen nicht zu diesen Modifikationen befähigt.
- Eine weitere mit Hefe oder prokaryontischen Wirt-Vektor-Systemen verbundene Beschränkung umfaßt die mit der Wiedergewinnung von hergestellten Genprodukten aus dem Inneren der Zelle verbundenen Schwierigkeiten. Das U.S.-Patent Nr. 4 336 336 von Silhavy et al. wendet sich insbesondere dem Problem der Wiedergewinnung von Genprodukten zu, wobei ein Verfahren zur Herstellung und Sekretion des Proteins durch ein genetisch modifiziertes Bakterium zur Verfügung gestellt wird.
- Die Verwendung von Viren in eukaryontischen Wirt-Vektor-Systemen war Gegenstand vieler neuerer Untersuchungen und Spekulationen. Virus-Vektor-Systeme weisen jedoch auch viele bedeutsame Nachteile und Begrenzungen auf, die ihre Verwendbarkeit vermindern. Zum Beispiel sind eine Anzahl von eukaryontischen Virus-Vektoren in Säugetiersystemen tumor- oder geschwulstbildend, wobei sie auf diese Weise ein Potential für ernste Gesundheits- und Sicherheitsprobleme erzeugen, die mit den resultierenden Genprodukten und einer unbeabsichtigten Infektion verbunden sind. Weiterhin zeigt in einigen eukaryontischen Wirt-Virus-Vektor-Systemen das Genprodukt selbst eine antivirale Wirksamkeit, wobei es auf diese Weise die Ausbeute des Proteins vermindert. Dies war der Fall bei der durch nur 100 Einheiten Interferon bewirkten 80 %-iger Verminderung der Ausbeute des Affenvirus 40 in dem von D. Gheysen und W. Fiers, 1, J. Molec. Applied Genet., 385-394 (1982), beschriebenen eukaryontischen Wirt-Virus-Vektor-System.
- Ein anderes der Verwendung von eukaryontischen Wirt-Virus-Vektor-Systemen eigenes Problem liegt in der Morphologie von Viren. Weil sie weniger Restriktionsstellen aufweisen, ist es z.B. einfacher, exogene DNA an besonderen Stellen in einfache Viren zu insertieren. Eukaryontische Gene sind jedoch oft zu groß, um in einfache Viren zu passen. Auf diese Weise ist wegen der Morphologie des Virus die Menge von exogener DNA, die in einen einfachen Virus gepackt werden kann, begrenzt. Andererseits ist es schwieriger, exogene DNA an besonderen Stellen in komplexe Viren zu insertieren, weil diese viele Restriktionsstellen aufweisen.
- Die vorliegende Erfindung überwindet viele der oben beschriebenen Nachteile durch Verwendung eines Baculovirus und eines Promotors innerhalb des Baculovirus-Genoms zur Herstellung eines Virus-Expressionsvektors in einem eukaryontischen Wirt-Vektor-System. Es wurde insbesondere festgestellt, daß der Baculovirus Autographa californica (AcMNPV) und dessen mit ihm verbundener Polyhedrin-Promotor zur Herstellung eines rekombinanten Virus-Expressionsvektors verwendet werden kann, der zu extrem hohen Expressionsniveaus eines ausgewählten Gens in einer eukaryontischen Wirtsinsektenzelle befähigt ist. Die resultierenden Genprodukte dieses Systems können effektiv in das Zellmedium sekretiert werden, wobei die meisten mit der Gewinnung von Proteinprodukten verbundenen Schwierigkeiten vermindert werden. Wichtiger ist weiterhin, daß dieses System nicht geschwulst- oder tumorerzeugend bei Säugetieren ist. Die theoretischen Vorteile der Verwendung von Baculoviren in einem eukaryontischen Wirt-Virus-Vektor-System werden ausführlicher von L.K. Miller, "A Virus Vector for Genetic Engineering in Invertebratest" in Panopoulos, N.J. (Hrsg.), Genetic Engineering in the Plant Sciences (New York, Praeger Publishers, 1981), S. 203-224, beschrieben.
- In ihrem größten Umfang stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung eines Virus-Transfer-Vektors, eines rekombinanten Virus-Transfer-Vektors und eines rekombinanten Virus-Expressions-Vektors zur Verfügung. Der resultierende rekombinante Virus-Expressions-Vektor kann ein ausgewähltes Gen in einer Wirtsinsektenzelle exprimieren.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wird Baculovirus-DNA, die ein Baculovirus-Gen oder ein einen Promotor des Baculovirus-Gens einschließendes Teil desselben umfaßt, zum Erhalt eines mindestens den Promotor enthaltenden DNA-Fragments gespalten. Bei dem bevorzugten Verfahren wird das Polyhedrin-Gen und flankierende DNA-Sequenzen eines geeigneten Baculovirus, z.B. des bevorzugten Baculovirus Autographa californica (AcMNPV), umfassende DNA zuerst isoliert. Die gewünschte DNA wird anschließend durch geeignete Restriktionsverfahren gespalten. Dies ergibt DNA-Fragmente, von denen einige den Polyhedrin- Promotor und mindestens eine das Polyhedrin-Protein oder ein Teil desselben kodierende DNA-Sequenz umfassen. Eines dieser DNA-Fragmente ist ein den Polyhedrin-Promotor und das Polyhedrin-Protein kodierende DNA-Sequenzen umfassendes EcoRI-I- Fragment.
- Als nächstes wird durch Insertieren des oben beschriebenen DNA-Fragments in ein geeignetes Klonierungsvehikel, z.B. das Plasmid pUC8, ein Transfervektor hergestellt. Demnach umfaßt der bevorzugte Transfervektor, bezeichnet als Polyhedrin- Transfervektor, ein geeignetes Klonierungsvehikel, das den Polyhedrin-Promotor und eine geeignete Stelle zum Klonieren eines ausgewählten Gens oder eines Teils desselben enthält, so daß das ausgewählte Gen unter der Transkriptions-Kontrolle des Polyhedrin-Promotors ist. Der bevorzugte Transfervektor kann auch das Polyhedrin-Protein oder ein Teil desselben kodierende DNA-Sequenzen enthalten oder nicht.
- Anschließend wird durch Insertieren eines ausgewählten Gens oder eines Teils desselben in die geeignete Klonierungsstelle des oben beschriebenen Transfervektors ein rekombinanter Transfervektor hergestellt. Potentiell kann ein beliebiges Gen oder beliebige Gene in den Transfervektor dieser Erfindung kloniert und mit einer Baculovirus-Promotor-Sequenz verknüpft werden. Zusätzlich können mit geeigneten rekombinanten DNA- Verfahren die das Polyhedrin-Protein kodierenden DNA-Sequenzen aus dem oben beschriebenen bevorzugten Transfervektor entfernt werden, so daß das resultierende, klonierte Genprodukt das ausgewählte Protein selbst sein kann. Wenn keine Kodierungssequenzen für das Polyhedrin-Protein entfernt werden oder mindestens eine Kodierungssequenz für das Polyhedrin-Protein nicht aus dem bevorzugten Transfervektor entfernt wird, ist alternativ das resultierende, klonierte Genprodukt ein Hybrid oder ein fusioniertes Protein, das das ausgewählte Protein und das Polyhedrin-Protein oder ein Teil desselben umfaßt.
- Zur Herstellung des rekombinanten Expressionsvektors wird der rekombinante Transfervektor mit einer geeigneten Baculovirus- DNA in Kontakt gebracht, um eine Rekombination zu bewirken, wobei auf diese Weise das gewünschte genetische Material in das Baculovirus-Genom eingebaut wird. Das bevorzugte Mittel zur Durchführung der Rekombination ist das wohlbekannte Verfahren der Transfektion. Da der Transfektionsvorgang nicht bei 100 % der Viren stattfindet, ist das Ergebnis ein Gemisch von Nicht-Rekombinanten und Rekombinanten.
- Rekombinante Baculovirus-Expressionsvektoren, die das ausgewählte Gen in Wirtsinsektenzellen exprimieren können, werden durch geeignetes Screening oder genetische Selektionsverfahren aus diesem Gemisch von rekombinanten und nicht-rekombinanten Baculoviren selektiert. Ein Mittel zum Selektieren des Expressionsvektors erhält man durch Identifizieren und Isolieren der Viren, denen wegen der Insertions-Inaktivierung des Polyhedrin-Gens Virus-Einschlüsse in den Nuclei der infizierten Zellen fehlen.
- Die vorliegende Erfindung ist ebenfalls auf den mit dem oben beschriebenen Verfahren hergestellten rekombinanten Baculovirus-Expressionsvektor gerichtet. Solch ein Expressionsvektor umfaßt einen infektiösen Baculovirus, der mindestens ein ausgewähltes Gen oder ein Teil desselben, der oder das mit dem Virus-Genom verknüpft und in diesem stabil ist, enthält. Während der Replikation des Expressionsvektors in Insektenzellen oder Insekten kann das ausgewählte Gen entweder unter der Kontrolle der Baculovirus-Transkriptions-Signale oder unter der Kontrolle seines eigenen Promotors exprimiert werden. Ein beispielhafter Baculovirus-Expressionsvektor ist der rekombinante AcMNPV-Virus, der das Gen für β-Interferon enthält und in das AcMNPV-Genom in solch einer Stelle insertiert ist, daß er sich unter der Transkriptions-Kontrolle des Polyhedrin-Promotors befindet. Potentiell kann ein beliebiger Baculovirus- Promotor und eine beliebige Insektenzellinie verwendet werden.
- Die Erfindung ist weiterhin auf den nach den oben beschriebenen Verfahren hergestellten Transfervektor gerichtet. Der bevorzugte Polyhedrin-Transfervektor, der mindestens die Polyhedrin-Promotor-Sequenz und eine geeignete Klonierungsstelle für die Insertion eines ausgewählten Gens oder eines Teils desselben enthält, so daß das ausgewählte Gen sich unter der Transkriptions-Kontrolle des Polyhedrin-Promotors befindet, wird als Zwischenvehikel für die genetische Manipulation von Baculoviren verwendet. Der Polyhedrin-Transfervektor kann keine, alle oder ein Teil der das Polyhedrin-Protein kodierenden DNA-Sequenzen enthalten.
- Die Erfindung ist weiterhin auf den nach den oben beschriebenen Verfahren hergestellten rekombinanten Transfervektor gerichtet. Der bevorzugte rekombinante Transfervektor der Erfindung, der ein ausgewähltes Gen oder ein Teil desselben verknüpft mit dem Polyhedrin-Promotor enthält, wird als Vehikel zum Einschließen gewünschter genetischer Informationen in das Baculovirus-Genom verwendet.
- Die vorliegende Erfindung basiert auf der Verwendung eines Baculovirus-Promotors in einem Wirt-Vektor-System zur Förderung der Expression eines ausgewählten Gens in einer eukaryontischen Wirtsinsektenzelle. Da insbesondere das Polyhedrin- Protein eines der in der größten Menge hergestellten Proteine in einer Virus-infizierten, eukaryontischen Wirtszelle ist, schließt das bevorzugte Verfahren die Inkorporation eines ausgewählten Gens in ein geeignetes Baculovirus-Genom ein, so daß das ausgewählte Gen mit dem Polyhedrin-Promotor verknüpft wird. Solch ein rekombinanter Baculovirus stellt einen effektiven Mechanismus für die Herstellung eines ausgewählten Genprodukts zur Verfügung. Demnach ist die vorliegende Erfindung von großem Nutzen, da extrem hohe Spiegel der gewünschten Genprodukte, z.B. β-Interferon, hergestellt und effizient aus den Wirtsinsektenzellen sekretiert werden.
- Die Fig. 1 zeigt das Schema für die Konstruktion eines Transfervektors, pAc101, das von einem Plaquen-gereinigten Stamm von AcMNPV, M3, dem Plasmid pBR325 und dem Plasmid pUC8 ausgeht.
- Die Fig. 2 zeigt das Schema für die Konstruktion der modifizierten Transfervektoren pAc311, pAc360, pAc373 und pAc380, das mit den Plasmiden pI10, pUC8 und einem synthetischen BamHI-Linker startet, wobei der Ausdruck "Bibliothek" eine Bibliothek von modifizierten pB'Bal-Plasmiden darstellt, die durch Induzieren von Deletions-Mutationen an jeder möglichen Stelle des Polyhedrin-Gens konstruiert werden kann. Die Plasmide pB'Bal 11, pB'Bal 60, pB'Bal 73 und pB'Bal 80 wurden dann zur weiteren Modifikation in den Transfervektoren pAc311, pAc360, pAc373 und pAc380 aus dieser Bibliothek von Mutanten- Plasmiden selektiert.
- Die Fig. 3 zeigt schematisch die Teil-Nukleotidsequenz des Polyhedrin-Gens von AcMNPV und die Sequenz unmittelbar stromaufwärts dieses Gens. Zusätzlich zur Lage der einzigen BamHI- Klonierungsstelle sind die Punkte, an denen zur Konstruktion der Transfervektoren pAc101, pAc311, pAc360, pAc373 und pAc380 die Deletions-Mutationen induziert wurden, mit Pfeilen angezeigt. Die TATA- und CAAT-Boxen des Polyhedrin-Gens sind durch um diese Sequenzen gezogene Rechtecke und die Transkriptions- Startstelle des Gens durch Sternchen angezeigt. Die Fig. 3 zeigt auch die nahe dem Polyhedrin-Gen lokalisierten EcoRV- und HindIII-Restriktionsstellen.
- Die Fig. 4 zeigt das Schema für die Klonierung des bevorzugten IFN-β-Gens in den Transfervektor pAc380 zur Konstruktion des rekombinanten Expressionsvektors pAc380-IFN-β. Die Fig. 4 zeigt auch das Startmaterial-Plasmid pBR13, das das IFN-β-Gen enthält. Das Plasmid p770 enthält die Sequenzen für pUC8 und ein von synthetischen Octanukleotid-BamHI-Linkern flankiertes 767 Basenpaare-HincII-Fragment. Dieses 767 Basenpaare-Fragment enthält die gesamten Kodierungssequenzen für IFN-β.
- Die Fig. 5 zeigt das Schema für die Transfektion des rekombinanten Expressionsvektors pAc380-IFN-β mit Baculoviren in gezüchteten Spodoptera frugiperda-Zellen und die anschließende Infektion von gezüchteten S. frugiperda-Zellen mit den Plaquen-gereinigten, rekombinanten Baculoviren.
- Die Fig. 6 zeigt den rekombinanten Transfervektor pAc380-IFN-β, bei dem das IFN-β-Gen an der BamHI-Klonierungsstelle des EcoRI-Fragments des AcMNPV-Genoms insertiert ist. Die Polyhedrin-Promotor-Sequenz ist dick schwarz angezeigt und die EcoRI-I-Sequenz ist als in das Plasmid pUC8 eingebaut gezeigt.
- Der in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendete Baculovirus ist Autographa californica (AcMNPV). Dieser Baculovirus ist wie folgt charakterisiert.
- In seiner in der Natur vorkommenden, infektiösen Form wird AcMNPV üblicherweise in einem Virus-Einschluß gefunden. Diese Virus-Einschlüsse enthalten üblicherweise verschiedene Viruspartikel eingebettet in einer parakristallinen Proteinmatrix, die eine strukturierte Anordnung von Polyhedrin-Protein-Untereinheiten umfaßt. Ein Einschluß wird von einem geeigneten Wirtsinsekt aufgenommen; wenn dieser das Lumen des Darms erreicht, bewirken die alkalischen Bedingungen die Dissoziation des Einschlusses zur Freisetzung des Virus.
- Die Viren dringen in die Zellen der Darmwand ein, wandern zu dem Nukleus dieser Zellen und vermehren sich. Es werden zwei infektiöse Formen in diesen Zellen hergestellt, die extrazelluläre oder nicht eingeschlossene Virusform und die eingeschlossene Virusform. Der extrazelluläre Virus sprießt aus der Oberfläche der Zelle heraus, um andere Zellen zu infizieren. Etwa zwölf Stunden nach der Infektion gibt es eine Abnahme des Sprießens von extrazellulären Viren, Initiation der Polyhedrin-Herstellung und eine gesteigerte Herstellung von eingeschlossenen Viruspartikeln. In infizierten Zellen und Geweben werden große Anzahlen von Einschlüssen hergestellt, die schließlich das Insekt lysieren. Diese eingeschlossene Form des Virus ist für die Ausbreitung der Infektion auf andere Insekten verantwortlich.
- Das extrazelluläre Virus, das leicht in einem Zellkulturmedium gezüchtet wird, wird in den beispielhaften Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet. Das extrazelluläre und das eingeschlossene Virus weisen dasselbe Genom auf, zeigen aber verschiedene phänotypische Eigenschaften.
- Der strukturelle Hauptbestandteil dieser Einschlüsse, Polyhedrin, ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 29.000. Die Charakterisierung des AcMNPV-Genoms zeigt, daß das Gen für AcMNPV-Polyhedrin sich in der Karte bei einer benachbarten DNA-Sequenz von etwa 1.200 Basenpaaren in dem EcoRI-I- Fragment bei etwa 4.000 Basenpaare stromabwärts des Nullpunkts der DNA-Restriktionskarte befindet, siehe G.E. Smith, J.M. Vlak und M.D. Summers, 45, J. Virol., 215-225 (1983).
- Diese Veröffentlichung beschreibt jedoch nicht die Nukleotidsequenz des Polyhedringens, um einen Fachmann zur Insertion eines heterologen Gens in das Polyhedrin-Gen unter der Transkriptions-Kontrolle des Polyhedrin-Promotors und außerhalb der das Struktur-Polyhedrin-Protein kodierenden Gensequenz zu befähigen. Diese Veröffentlichung beschreibt keine zugängliche, in der Natur vorkommende oder synthetische Restriktionsstelle in der Region vom Transkriptions-Start bis zum ATG- Start des Polyhedrin-Strukturgens. Diese Veröffentlichung gibt auch keine Anleitung zur Erzeugung einer einzelnen Restriktionsstelle in dieser Region.
- Eine Karte des gesamten AcMNPV-Genoms kann in J.M. Vlak und G.E. Smith, 4, J. Virol., 1118-1121 (1982) und die DNA-Sequenz für das Polyhedrin-Gen in Hooft van Iddekinge, G.E. Smith und M.D. Summers, 131, Virology, 561-565 (1983), gefunden werden.
- Die Struktur und Funktion des Polyhedrin-Proteins sind von erheblichem Interesse, da es eines der am höchsten exprimierten der bekannten Eukaryonten-Gene ist. In mit AcMNPV-infizierten Spodoptera frugiperda-Zellen sammelt sich Polyhedrin in so hohen Spiegeln an, daß es 50 % oder mehr der Gesamtmasse des Proteins in einer infizierten Zelle bildet und mehr als 0,2 g des Polyhedrin-Proteins pro Liter der infizierten Zellen hergestellt wird. Das Gen ist auch aus den folgenden Gründen interessant: (1) das Polyhedrin-Gen von AcMNPV enthält DNA-Sequenzen, die unter den Baculoviren in hohem Male konserviert sind, (2) in dieser Region des Genoms findet mit großer Häufigkeit eine Rekombination zwischen nahe verwandten Stämmen statt, wobei auf diese Weise die Segregation und Expression des Polyhedrin-Gens in rekombinanten Nachkommen ermöglicht wird, und (3) die Expression des Gens ist von Wirt, Gewebe und Zellinie abhängig.
- Vom Standpunkt eines Gentechnologen aus ist das Polyhedrin-Gen nutzlos, da der Virus sich in der Zellkultur ohne dieses replizieren kann. Wegen des hohen Expressionsgrades dieses Gens und der Tatsache, daß es nicht essentiell für die Virus- Replikation ist, war die Möglichkeit einer Verwendung des Polyhedrin-Promotors und -Gens von AcMNPV als Teil eines Systems für die Expression eines rekombinanten Gens die Quelle vieler Spekulationen (siehe E.B. Carstens, S.T. Tjia und W. Doerfler, 99, Virology, 386-398 (1979); P. Dobos und M.A. Cochran, 103, Virology, 446-464 (1980); H. A. Wood, 102, Virology, 21-27 (1980); J.E. Maruniak und M.D. Summers, 109, Virology, 25-34 (1981); L.K. Miller, "A Virus Vector for Genetic Engineering in Invertebrates", in: N.J. Panopoulos (Hrsg.), Genetic Engineering in the Plant Sciences (New York, Praeger Publishers, 1981), S. 203-224; L.K. Miller et al., 219, Science, 715-721 (1983); G.E. Smith, M.J. Fraser und M.D. Summers, J. Virol., 584-593 (1983)). Es konnte jedoch vor der vorliegenden Erfindung niemand ein solches System entwickeln.
- Die Experimente der Anmelder zeigen, daß ein anderes Genprodukt, 10K, auch mit einem dem Polyhedrin vergleichbaren hohen Spiegel exprimiert wird (G.E. Smith, J.M. Vlak und M.D. Summers, 45, J. Virol., 215-225 (1983)). Das hergestellte 10K-Protein ist anscheinend nicht strukturell; es wird im späten Stadium der Infektion und in großer Menge hergestellt. Die Lage des 10K-AcMNPV-Protein-Gens wird in der Karte den HindIII-Fragmenten P und Q zugeordnet. Gleich dem Polyhedrin- Promotor und -Strukturgen war dieser Promotor Gegenstand von Spekulationen bezüglich seiner vorteilhaften Verwendung als Teil eines Systems, das AcMNPV bei der Expression eines rekombinanten Gens verwendet. Es wurde jedoch vor der vorliegenden Erfindung kein System entwickelt, das diese vorteilhafte Verwendung dieses Promotors ermöglicht.
- Gemäß dem beispielhaften Verfahren dieser Erfindung werden die speziellen Stämme M3 oder E2 von AcMNPV verwendet. Jedoch werden die Fachleute, die Nutzen aus dieser Erfindung ziehen, erkennen, daß andere Baculoviren und Baculovirus-Stämme zur Herstellung rekombinanter Baculovirus-Transfer- und -Expressions-Vektoren geeignet sind. Insbesondere die nahe verwandten und in der Natur vorkommenden Baculovirus-Stämme Trichoplusia ni MNPV, Rachiplusia ou MNPV, Galleria mellonella MNPV und alle Plaquen-gereinigten Stämme wie die E2-, R9-, S1- und S3-Stämme von AcMNPV, die in diesem Laboratorium charakterisiert und in G.E. Smith und M.D. Summers, 30, J. Virol., 828-838 (1979) und G.E. Smith und M.D. Summers, 33, J. Virol., 311-319 (1980), beschrieben wurden, können mit Vorteil verwendet werden. Weitere Beschreibungen dieser und anderer Stämme befinden sich in G.E. Smith und M.D. Summers, 89, Virology, 517-527 (1978).
- Gemäß den Verfahren dieser Erfindung sind es das Polyhedrin- Strukturgen und der Polyhedrin-Promotor, die vorteilhaft verwendet werden. Dieses Gen wurde durch S1-Nuklease-Experimente kartiert. Die Nukleotidsequenz des 5'-Endes der Polyhedrin-Kodierungsregion und 200 Basen stromaufwärts des Starts der Transkription sind in der Fig. 3 gezeigt. Die in der Fig. 3 angegebene Stelle ist die am häufigsten verwendete Transkriptions-Start-Stelle für Polyhedrin-mRNA.
- Ein ATG-Translations-Start-Signal (bei dem dem A-Rest die Position +1 zugeteilt wird) befindet sich etwa 58 Basen von der Transkriptions-Start-Stelle; die folgenden bis zu und einschließlich der HindIII-Stelle bei 255 befinden sich im offenen Leseraster. Die bei vielen Eukaryonten-Strukturgenen in ähnlichen Positionen gefundenen TATA- und CAAT-Boxen sind zwischen 25 und 35 Basen bzw. zwischen 60 und 70 Basen stromaufwärts der Transkriptions-Startstelle lokalisiert. Zentriert bei 78 und 90 Basen stromaufwärts der Transkriptions-Startstelle befinden sich die direkt wiederholten Sequenzen CACAAACT. Zusätzlich weist das AcMNPV-Polyhedrin-Gen eine dem Translations-Start-Kodon vorausgehende, nicht translatierte 58 Basen-Leader-Sequenz auf; durch geeignete experimentelle Verfahren an AcMNPV-Polyhedrin-mRNA wird nahegelegt, daß es keine dazwischenliegenden Sequenzen gibt. Siehe Smith, Vlak und Summers, s.o., und G.F. Rohrmann et al., 121, Virology, 51-60 (1982).
- Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein Polyhedrin-Gen aufweisende DNA aus dem Baculovirus AcMNPV isoliert und gereinigt. Die Fachleute, die aus dieser Beschreibung Nutzen ziehen, werden bemerken, daß dieses Gen aus einem beliebigen ein Polyhedrin aufweisenden Baculovirus, insbesondere den oben beschriebenen verwandten Stämmen, isoliert werden kann.
- Die gewünschte DNA wird anschließend zur Herstellung eines 7,3-Kilobasen-EcoRI-Fragments oder anderer geeigneter Fragmente, die das Polyhedrin-Gen einschließen, mit EcoRI-Restriktionsendonuklease nach geeigneten Restriktionsverfahren verdaut.
- Das oben beschriebene EcoRI-I-Fragment wird danach zur Herstellung eines Transfervektors in die EcoRI-Stelle eines geeigneten Klonierungsvehikels kloniert. Weil das AcMNPV-Genom keine bekannten speziellen Restriktionsstellen aufweist, in die ausgewählte Gene effektiv auf stellenspezifische Weise eingeführt werden können, ist es erforderlich, chimäre Plasmidvektoren (Transfervektoren) zu konstruieren, die als Zwischenvehikel für den Gentransfer dienen. Daher wird zum Einbau ausgewählter Gene in das Virusgenom angrenzend an die Polyhedrin-Promotor-Sequenz ein Transfervektor konstruiert, bezeichnet als der Polyhedrin-Transfervektor, der das Polyhedrin-Gen, eine Klonierungsstelle, die so lokalisiert ist, dar ein richtig in die Stelle insertiertes Gen sich unter der Kontrolle des Polyhedrin-Promotors befindet, und flankierende, mit jeder Seite des Polyhedrin-Gens verknüpfte Virus-DNA einschließt. Die Konstruktion dieses Transfervektors ist in den Fig. 1 und 2 schematisch gezeigt. Zusätzlich sollte angemerkt werden, daß die Anwesenheit flankierender Virus-DNA eine Rekombination mit dem Wildtyp-Baculovirus fördert, wobei der Transfer eines ausgewählten Gens in ein replizierendes Virusgenom ermöglicht wird.
- Dementsprechend wird das oben beschriebene EcoRI-I-Fragment in die Plasmide pBR325 bzw. pUC8 kloniert bzw. subkloniert. Zwei BamHI-Restriktionsstellen in dem EcoRI-I-Fragment können anschließend entfernt werden, um einen Polyhedrin-Transfervektor, bezeichnet als pAc101, herzustellen, der eine einzelne BamHI-Klonierungsstelle aufweist, die in 3'-Richtung stromabwärts der Polyhedrin-Promotor-Sequenz etwa 220 Basen von der Translations-Start-Stelle des Polyhedrin-Gens lokalisiert ist (siehe Fig. 3). Wenn auch die Plasmide pBR325 und pUC8 die für die Konstruktion des Polyhedrin-Transfervektors verwendeten Plasmide sind, werden die Fachleute erkennen, daß andere geeignete Klonierungsvehikel verwendet werden können, vorausgesetzt das Polyhedrin-Gen und die flankierende Virus-DNA sind funktionsgerecht eingeschlossen.
- Der Polyhedrin-Transfervektor kann anschließend für die Insertion eines ausgewählten Gens durch Deletion einiger oder aller die Polyhedrin-Synthese kodierender Sequenzen nahe der Transkriptions-Start-Stelle oder von etwa -58 bis zu dem Ende des Polyhedrin-Gens modifiziert werden (siehe Fig. 3). Ein DNA-Linker, der ein in der Natur vorkommendes oder synthetisches, die BamHI-Restriktionsstellen-Sequenz aufweisendes Oligonukleotid umfaßt, wird anschließend an der Stelle der Deletion insertiert, um die Verknüpfung von DNA-Segmenten an diese Restriktionsstelle zu ermöglichen. Die Modifikation des Transfervektors ist schematisch in der Fig. 2 gezeigt; das Mittel zum Deletieren von Polyhedrin kodierenden Sequenzen ist die in-vitro-Mutagenese. Die Fachleute, die aus dieser Offenbarung Nutzen ziehen, werden jedoch erkennen, daß alternative Verfahren zur Deletion von Teilen der Polyhedrin-Kodierungssequenzen oder aller Polyhedrin-Kodierungssequenzen zugänglich sind, daß an der Stelle der Deletion alternative, synthetische oder in der Natur vorkommende Oligonukleotid-Linker-Sequenzen insertiert werden können und daß alternative, modifizierte Polyhedrin-Transfervektoren, in die ein ausgewähltes Gen oder ein Teil desselben eingebaut werden kann, in der vorliegenden Erfindung auf geeignete Weise verwendet werden können.
- Gemäß Standard-Klonierungsverfahren wird anschließend zur Herstellung eines rekombinanten Transfervektors ein ausgewähltes Gen, z.B. das Human-β-Interferon-Synthese kodierende IFN-β-Gen, das die Chloramphenicol-Acetyltransferase-Synthese kodierende CAT-Gen und das die Human-Interleukin-2-Synthese kodierende IL2-Gen, an einer zugänglichen Restriktionsstelle in den Polyhedrin-Transfervektor insertiert. Die Insertion des β-Interferon-Gens in den Transfervektor pAc380 ist in der Fig. 4 schematisch gezeigt.
- Wenn auch IFN-β, CAT und Interleukin-2 beispielhafte Gene zum Klonieren in den Polyhedrin-Transfervektor und zum Verknüpfen mit der Polyhedrin-Promotor-Sequenz sind, ist zu erkennen, daß potentiell ein beliebiges ausgewähltes Gen in der vorliegenden Erfindung oder ihrer oben beschriebenen alternativen Formen verwendet werden kann.
- Das hybride Polyhedrin-Auswahl-Gen des rekombinanten Transfervektors wird anschließend in das Genom eines geeigneten Baculovirus, z.B. des Baculovirus AcMNPV, transferiert, um einen rekombinanten Virus-Expressionsvektor herzustellen, der zur Expression des β-Interferon kodierenden Gens in einer Wirtsinsektenzelle befähigt ist. Der Transfer des Hybrid-Gens wird nach dem Verfahren der Transfektion in Wirtsinsektenzellen, z.B. Spodoptera frugiperda, durchgeführt. J.P. Burand et al, 101, Virology, 286-290 (1980). Dieses Verfahren ist in der Fig. 5 schematisch gezeigt, wobei der rekombinante Transfervektor pAc380-IFN-β verwendet wird. Während der Replizierung der AcMNPV-DNA nach der Transfektion wird das Hybrid-Gen durch Rekombination zwischen dem rekombinanten Transfervektor und AcMNPV-DNA auf AcMNPV-DNA transferiert. Demgemäß wird ein Gemisch hergestellt, das nicht-rekombinante und rekombinante Baculoviren umfaßt, von denen die letzteren das IFN-β-Gen exprimieren können. Wenn auch die Transfektion das bevorzugte Verfahren zum Transfer des Hybrid-Gens in das Baculovirus-Genom ist, werden die Fachleute erkennen, daß andere Verfahren zum Insertieren des Hybrid-Gens in das Baculovirus-Genom geeignet sind. Weiterhin kann die Rekombination zwischen dem rekombinanten Transfervektor und anderen Stämmen von Baculoviren durchgeführt werden, soweit es eine ausreichende Homologie zwischen der Sequenz des Hybrid-Gens und der ensprechenden Sequenz der anderen Stämme gibt, so daß die Durchführung der Rekombination ermöglicht wird. Zum Beispiel kann solch eine Rekombination zwischen Genen stattfinden, die aus einem beliebigen der oben beschriebenen Stämme Trichoplusia ni MNPV, Rachiplusia ou MNPV und Galeria mellonella MNPV sowie der AcMNPV-Stämme E2, R9, S1 und S3 isoliert sind. Die Rekombination kann auch in Regionen des Genoms stattfinden, die scheinbar keine homologen Sequenzen enthalten. Der Mechanismus dafür ist nicht bekannt.
- Der rekombinante AcMNPV-Expessionsvektor, der das in das AcMNPV-Genom eingebaute Hybrid-Polyhedrin-Auswahl-Gen umfaßt, wird anschließend aus dem Gemisch von nicht-rekombinanten und rekombinanten Baculoviren selektiert. Ein Mittel der Selektion ist das Screenen nach Plaquen, die von Wirtsinsektenzellen gebildet werden, die mit keine viralen Einschlüsse herstellenden Viren (bezeichnet als 0&supmin; ) infiziert sind. Die Selektion wird auf diese Weise erleichtert, da rekombinante Viren wegen der Insertions-Inaktivierung des Polyhedrin-Gens bezüglich der Bildung von Virus-Einschlüssen defekt sind. Von den Virusplaquen, die von Nachkommen-Viren aus transfizierten Zellen hergestellt werden, stammen im Mittel 0,5 % von mutmaßlichen rekombinanten 0&supmin;-Viren. Demgemäß wird die DNA von einem 0&supmin;-plaquenbildenden, rekombinanten Virus anschließend gereinigt und mit geeigneten Restriktionsenzymen analysiert, um zu bestätigen, daß der rekombinante AcMNPV-Vektor eine Insertion des ausgewählten Gens in der richtigen EcoRI-I-Stelle aufweist.
- Das oben beschriebene Selektionsverfahren stellt ein effektives und bequemes Mittel zur Selektion von rekombinanten Baculovirus-Auswahl-Gen-Expressionsvektoren zur Verfügung; die Fachleute werden jedoch erkennen, daß alternative Selektionsverfahren ebenfalls gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Ein relativ bequemes Verfahren zur in-situ- Detektion fremder DNA in Eukaryonten-Zellen (d.h. Hybridisieren einer markierten DNA-Sonde mit Virus-DNA, die in Plaquen vorliegt, die in infizierten Tierzellen hergestellt sind) wird von Villarreal und Berg, 196, Science, 183-186 (1977) und Hayday et al., 15, Gene, 53-65 (1981), beschrieben.
- Die Expression des ausgewählten Gens wird durch Infizieren empfindlicher Wirtsinsektenzellen, z .B. Spodoptera frugiperda, mit dem rekombinanten Baculovirus-Auswahl-Gen-Expressionsvektor in einem geeigneten Wachstums-Medium durchgeführt. Ein AcMNPV-Expressionsvektor wird in Insektenzellen oder Insekten durch Replikation und Zusammenbau von infektiösen Viruspartikeln vermehrt. Diese infektiösen AcMNPV-Expressionsvektoren können zur Herstellung des ausgewählten Gens in geeigneten Insektenzellen verwendet werden, wobei auf diese Weise die effiziente Expression der ausgewählten DNA-Sequenz in der infizierten Zelle erleichtert wird.
- Während der Infektion wird AcMNPV-Expressionsvektor-spezifische mRNA hergestellt, die mit der DNA-Sequenz des ausgewählten Gens komplementär ist. Die Vektor-spezifische mRNA wird üblicherweise in infizierten Zellen translatiert, um ein Protein herzustellen, das vollständig oder teilweise von dem ausgewählten Gen kodiert wird; in einigen Fällen wird das ausgewählte Gen einem Processing unterworfen sein, z.B. Glykosylierung, Sekretion, Phosphorylierung oder anderen post-translationalen Modifikationen.
- Ob das von dem rekombinanten AcMNPV-Expressionsvektor hergestellte Genprodukt nur aus den Aminosäuresequenzen des ausgewählten Proteins besteht, ob es ein Hybrid-Protein mit einer zusätzlichen, von dem aminoterminalen Ende von AcMNPV-Polyhedrin abgeleiteten Aminosäurerest oder mehreren ist oder ob sowohl die ausgewählten als auch die hybriden Proteinprodukte hergestellt werden, hängt von der Weise ab, in der die Polyhedrin-Transfervektoren modifiziert sind. Wenn nur ein einzelnes, von dem ausgewählten Gen abgeleitetes Translations-Start- Signal (ATG) in den Hybrid-Gen-Sequenzen vorliegt und das ausgewählte Gen in den Hybrid-Gen-Sequenzen etwa zwischen den -75- und +1-Positionen vorliegt, wird nur das ausgewählte Protein, z.B. β-Interferon, hergestellt (siehe Fig. 3). Alternativ können sowohl die hybriden als auch die ausgewählten Proteine hergestellt werden, wenn das ausgewählte Gen mit dem Polyhedrinpromotor so fusioniert ist, daß es zwei Translations-Start-Stellen gibt und sich das Polyhedrin-ATG- Signal bei +1 sowie das Auswahl-Gen-ATG-Signal zwischen +3 und dem Ende der Polyhedrin-Kodierungs-Sequenzen befindet. Der Anteil jedes hergestellten Proteins kann jedoch abhängig von der Position des zweiten ATG-Signals und der Art der ausgewählten Gensequenzen variieren. Wenn alternativ ein Gen ohne sein eigenes ATG-Start-Signal mit dem Polyhedrin-Promotor fusioniert wird, ist es erforderlich, daß entweder ein synthetisches ATG- oder das Polyhedrin-ATG-Translations-Start-Signal mit den Protein-kodierenden Sequenzen auf solche Weise fusioniert wird, daß das korrekte Translations-Leseraster für das ausgewählte Gen erhalten bleibt. Die hergestellten Proteinprodukte hängen wiederum von den oben beschriebenen Faktoren ab.
- Der rekombinante Baculovirus-Expressionsvektor Ac380-IFN-β wurde bei der American Type Culture Collection (Rockville, Maryland) am 13. Mai 1983 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer ATCC 40071. Das modifizierte Polyhedrin-Transfervektoren-pAc380-Plasmid in E.coli K-12 und der rekombinante Transfervektor pAc380-IFN-β in E.coli K-12 wurden beide bei der Agricultural Research Culture Collection (Peoria, Illinois) am 13. Mai 1983 hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummern NRRL B-15428 bzw. NRRL B-15427. Der modifizierte Polyhedrin-Transfervektor pAc373 wurde bei der Agricultural Research Culture Collection am 7. Mai 1984 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer NRRL B-15778.
- Die in den folgenden Beispielen verwendeten Plasmide waren pBR325 und pUC8 in E.coli; die Plasmide wurden von Bethesda Resarch Labs, Gaithersburg, Maryland, erhalten.
- AcMNPV, Stamm M3, der in den Beispielen als Originalquelle von Virus-DNA verwendet wird, sowie AcMNPV, Stamm E2 und Wildtyp, wurden in diesem Laboratorium nach den von G.E. Smith und M.D. Summers, 89, Virology, 517-520 (1978) und G.E. Smith und M.D. Summers, 39, J. Virol., 125-137 (1981) beschriebenen Verfahren isoliert.
- Das DNA-Fragment mit dem in den Beispielen verwendeten IFN-β-Gen wurde aus dem von Dr. John Collins, Gesellschaft für Biotechnologische Forschung (GBF), Braunschweig-Stockheim, West-Deutschland, erhaltenen Plasmid pBR13 isoliert.
- Das DNA-Fragment mit dem Chloramphenicol-Acetyltransferase(CAT)-Gen wurde aus dem von Drs. Bernard Moss und Mark Cockran, National Cancer Institute, Bethesda, Maryland, erhaltenen Plasmid pBR328 isoliert.
- Das DNA-Fragment mit dem Human-Interleukin-2 (IL2) kodierenden Gen wurde aus dem von Drs. Grace Ju und Peter Lomedico, Hoffmann LaRoche Research Center, Nutley, New Jersey, erhaltenen Plasmid pIL2-2B isoliert.
- E.coli JM83, das in den Beispielen zum Klonieren von pUC8-Plasmiden verwendet wird, wurde von Bethesda Research Labs, Gaithersburg, Maryland, erhalten.
- E.coli RR1, das in den Beispielen zum Klonieren von pBR325-Plasmiden verwendet wurde, wurde von Dr. Savio Woo, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, erhalten.
- Die folgenden Restriktionsendonukleasen wurden von Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland, erhalten und gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet: EcoRI, XhoI, BamHI, SmaI, PstI, BstEII, EcoRV, KpnI und HindIII. Die folgenden Enzyme wurden ebenfalls von Bethesda Research Laboratories erhalten: alkalische Phosphatase vom Kälberdarm (CAP), DNA-Ligase, Bal31-Exonuklease, S1-Nuklease und T4-Polynukleotidkinase.
- Die Standardverfahren, die in Übereinstimmung mit den in den Beispielen beschriebenen Klonierungsverfahren verwendet werden, sind in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, beschrieben. Diese Veröffentlichung schließt Verfahrensweisen für die folgenden Standardverfahren ein: Klonierungsverfahren mit E.coli-Plasmiden, Transformation von E.coli-Zellen, Plasmid-DNA-Reinigung, Phenolextraktion von DNA, Ethanolfällung von DNA, Agarose-Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen sowie Restriktionsendonuklease-Reaktionen und Reaktionen anderer DNA-modifizierender Enzyme. In allen Fällen wurde die DNA durch Phenolextraktion, gefolgt von Ethanolfällung, gereinigt.
- In den Beispielen verwendete Virus-Vorräte wurden hergestellt und titriert in Spodoptera-frugiperda-Zellen (IPLB-Sf 21-AE) mit TNM-FH-Medium (siehe W.F. Hink, 226, Nature (London), 466-467 (1970)) plus 10 % fötalem Rinderserum. Verfahren für die Kultivierung von Viren und Zellen sind in L.E. Volkman und M.D. Summers, 19, J. Virol., 820-832 (1975) und L.E. Volkman, M.D. Summers und C.H. Hsieh, 19, J. Virol., 820-832 (1976 beschrieben. Viruswachstum-Kinetiken wurden wie von Volkman et al., siehe oben, beschrieben unter Verwendung von S. frugiperda und einem 1,5 %-igen Agarose-Überzug bestimmt.
- Zum Konstruieren eines Polyhedrin-Transfervektors gemäß der vorliegenden Erfindung wurde ein das AcMNPV-Polyhedrin-Gen umfassendes DNA-Fragment in die EcoRI-Stelle des Plasmids pUC8 kloniert. Dies wurde unter Verwendung eines Plaquen-gereinigten Stamms von AcMNPV, genannt M3 (G.E. Smith und M.D. Summers, 89, Virology, 517-527 (1978)), als Originalquelle der Virus-DNA durchgeführt. AcMNPV-DNA wurde aus dem Virus extrahiert und wie in der oben zitierten Veröffentlichung von Smith und Summers beschrieben durch Gleichgewichtszentrifugation in Cäsiumchlorid-Dichtegradienten gereinigt. AcMNPV-DNA wurde vollständig mit EcoRI-Restriktionsendonuklease verdaut. Das resultierende AcMNPV-EcoRI-I-Fragment wurde zuerst zur Bildung von pI10 in pBR325 kloniert und anschließend unter Verwendung von Standardklonierungsverfahren zur Bildung von pI8 in pUC8 subkloniert (siehe Fig. 1).
- Das rekombinante Plasmid pI8 wies drei BamHI-Erkennungsstellen (siehe Fig. 1) auf: eine in dem Polyhedrin-Gen an der Position 4210, eine in pUC8 bei 7300 und eine in dem EcoRI-I-Fragment an der Position 6160. Die Stellen bei 6160 und 7300 wurden von pI8 entfernt, so daß das gewünschte Gen, z.B. die beispielhaften CAT-, IL2- oder IFN-β-Gene, in leichter Weise in pI8 in der gewünschten, dem Polyhedrin-Promotor benachbarten Stelle (Position 4210) kloniert werden kann.
- Die pUC8-BamHI-Restriktionsstelle in pI8 bei etwa 7300, die nicht in dem Polyhedrin-Gen lokalisiert ist, wurde wie folgt entfernt: 10 µg pI8 wurden mit PstI und SmaI verdaut; die DNA wurde gereinigt und in S1-Nuklease-Puffer (0,03 M Natriumacetat, pH 4,4, 0,25 M NaCl und 0,0045 M ZnCl&sub2;) plus 500 Einheiten S1-Nuklease/ml resuspendiert. Das Reaktionsgemisch wurde 15 min bei 37ºC inkubiert; anschließend wurde die DNA einer Elektrophorese auf einem 0,8 %-igen Agarosegel unterworfen. Lineare DNA mit hohem Molekulargewicht wurde von dem Gel gereinigt und zum Transformieren von E.coli-JM83-Zellen zur Ampicillin-Resistenz (amr) und Galaktose-Negativität (gal&supmin;) verwendet. Ein Plasmid wurde isoliert, dem die PstI-, BamHI-, SmaI- und EcoRI-Stellen in der pUC8-Klonierungs-Region fehlen. Dieses Plasmid wurde pI8SPS genannt (siehe Fig. 1).
- Die BamHI-Stelle an der Stelle 6160 (Smith, G.E., J.M. Vlak und M.D. Summers, J. Virol., 45:215-225) in AcMNPV-EcoRI-I (einem Teil von pI8SPS) wurde wie folgt entfernt: 10 µg pI8SPS wurden mit 10 Einheiten BamHI in 50 µl Puffer gemischt und bei 37ºC inkubiert. 10 µl-Aliquote wurden nach 3, 6, 12, 20 und 30 Minuten entnommen und die Reaktionen durch Zugabe von EDTA mit 10 mM gestoppt. Die Aliquote wurden gepoolt und in 0,7 %-iger Agarose einer Elektrophorese unterzogen. Lineare DNA mit voller Länge wurde aus den Gelen isoliert, wie oben mit S1-Nuklease behandelt und anschließend mit T4-DNA-Ligase zirkularisiert. JM83-Zellen wurden zu amr, gal&supmin; transformiert; ein rekombinantes Plasmid wurde identifiziert, dem die BamHI- Restriktionsstelle an der Position 6160 fehlte. Dieses Plasmid weist eine einzige BamHI-Klonierungsstelle an der Position 4210, lokalisiert +175 Basen von der Translations-Start-Stelle des Polyhedrin-Gens, auf (siehe Fig. 3) und wurde pAc101, der "Eltern" -AcMNPV-Polyhedrin-Gen-Transfer-Vektor, genannt (Fig. 1).
- Zur Bestimmung geeigneter Stellen in dem Polyhedrin-Gen für die Insertion eines ausgewählten Gens wurde zusätzlich zu pAc101 eine Anzahl von Transfervektoren konstruiert (siehe Fig. 2). Diese Transfervektoren wurden durch Deletieren eines Teils der DNA-Sequenz oder der gesamten DNA-Sequenz, die die 86 aminoterminalen Reste von Polyhedrin und die 5'-nichttranslatierten Polyhedrin-mRNA-Sequenzen kodiert, und anschließendes Insertieren eines synthetischen Oligonukleotid- DNA-Linkers mit einer BamHI-Erkennungsstelle an der Stelle der Deletion nach den folgenden Verfahren konstruiert.
- Das Fragment von EcoRI bis BamHI (0 bis 4210) von pI10 wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel I beschrieben in pUC8 subkloniert und das resultierende Plasmid pB' genannt (siehe Fig. 2). Dieses Fragment enthält das Polyhedrin-Gen bis zu +175 und zusätzlich zu dem Polyhedrin-Gen etwa 4000 Basenpaare von AcMNPV-DNA-Sequenzen. Deletionen um die BamHI-Stelle an der Position 4210 herum wurden dann wie folgt in pB' eingeführt (Fig. 2): 40 µg pB' wurden mit BamHI verdaut; die DNA wurde gereinigt und auf einem 0,7%-igen Agarosegel einer Elektrophorese unterworfen. Das lineare DNA-Fragment wurde aus dem Gel extrahiert und 40 Minuten bei 30ºC in 100 µl Puffer mit 0,5 Einheiten Bal31-Exonuklease inkubiert. 10 µl-Aliquote wurden in Abständen von 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 und 40 Minuten gesammelt und die Reaktion durch Zugabe von 10 µl 0,25 M EDTA zu jedem Aliquot gestoppt. Die Aliquote wurden gepoolt und die DNA gereinigt. Die Enden der DNA wurden durch 30 Minuten Inkubieren bei 23ºC in 100 µl Puffer mit 4 Einheiten E.coli-DNA-Polymerase (Klenow-Fragment) repariert. Die DNA wurde gereinigt und 1 µg eines phosphorylierten BamHI-Linkers (5'-pCGGATCCG-3') plus 20 Einheiten T4-DNA-Ligase in 100 µl Reaktionsgemisch zugegeben. Nach 2 Stunden Inkubation bei Umgebungstemperatur wurde die DNA gereinigt.
- Als nächstes wurde das DNA-Pellet in 100 µl Puffer plus 20 Einheiten BamHI resuspendiert und 4 Stunden bei 37ºC verdaut. Die verdaute DNA wurde in 0,7 %-iger Agarose einer Elektrophorese unterworfen und aus dem Gel pB'-gestutzte Plasmide mit Deletionen von bis zu 800 Basenpaaren gereinigt. Die DNA wurde mit T4-DNA-Ligase zirkularisiert und zum Transformieren von JM83-Zellen zu amr, gal&supmin; verwendet. Die resultierenden Klone stellten die "Bibliothek" von Mutant-Plasmiden dar, genannt pB'Bal 1, 2, 3 usw., abhängig von der Lokalisierung der BamHI-Erkennungsstelle.
- Verschiedene pB'Bal-Deletions-Mutant-Plasmide wurden selektiert; von jedem wurde das Fragment von dem XhoI (1900) bis zu dem BamHI-Linker (bei den Positionen 4000 bis 4210) von einem Agarosegel gereinigt (A-Fragmente) (Fig. 2). Das Fragment von XhoI (1900) bis BamHI (4210) wurde von pAc101 entfernt; die zurückbleibenden Sequenzen wurden von einem Agarosegel gereinigt (B-Fragment) (Fig. 2). Etwa 0,1 µg von jedem der A-Fragmente wurde mit 0,1 µg des Fragments B gemischt, durch Inkubieren in 20 µl Puffer mit einer Einheit T4-DNA-Ligase inkubiert und anschließend zum Transformieren von JM83-Zellen zu amr, gal&supmin; verwendet. Die resultierenden Plasmide stellten die modifizierten Transfervektoren dar und werden z.B. bezeichnet als pAc311 bei Herstellung aus pB'Bal 11, pAc360 bei Herstellung aus pB'Bal 60 usw. Auf diese Weise wurde eine Gruppe von "modifizierten" Transfervektoren konstruiert, bei denen typische Vertreter BamHI-Klonierungsstellen an Positionen zwischen +175 und -100 in dem Polyhedrin-Gen aufweisen. Die Lokalisierung der BamHI-Erkennungsstelle in vier der modifizierten Transfervektoren, pAc380, pAc373, pAc311 und pAc360, sowie deren Lokalisierung in dem Eltern- Transfervektor, pAc101, ist in der Fig. 3 gezeigt.
- Es kann ein beliebiger, gemäß den Verfahren der Beispiele I oder II hergestellter Transfervektor bei der Konstruktion eines rekombinanten Transfervektors, in dem das gewünschte Gen mit dem Polyhedrin-Gen an verschiedenen Stellen verknüpft ist, verwendet werden, abhängig von dem speziellen, modifizierten, verwendeten Transfervektor. Die Insertion des Human-β-Interferon-Synthese kodierenden IFN-β-Gens in einen der modifizierten Transfervektoren, pAc380, an einer einzelnen BamHI-Klonierungsstelle unter Verwendung von oben beschriebenen Standardklonierungsverfahren zur Bildung des pAc380-IFN-β genannten Plasmids ist in der Fig. 4 schematisch gezeigt.
- Das IFN-β-Gen kann als ein 0,767 Kilobasen-HincII-Fragment charakterisiert werden, das aus einem genomischen Klon von Human-IFN-β (pBR13 genannt, siehe H. Hauser et al., 297, Nature (London), 650-654 (1982) und G. Gross et al, 9, Nucleic Acids Res., 2495-2507 (1981)) hergestellt wird sowie die gesamten Protein-kodierenden Sequenzen für IFN-β, drei zusätzliche Basen vor dem ATG-Translations-Start-Signal und die gesamten nicht-translatierten 3'-Sequenzen einschließlich des Signals für die Polyadenylation umfaßt. Die Nukleotidsequenz für IFN-β und die Lokalisierung verschiedener Transkriptions- und Translations-Signale werden von R. Derynck et al., 285, Nature (London), 542-547 (1980); G. Gross et al., 9, Nucleic Acids Res., 2495-2507 (1981) sowie S. Ohno und T. Taniguchi, 78, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 3505-3509 (1981), beschrieben.
- Das HincII-DNA-Fragment mit dem IFN-β-Gen wird unter Verwendung synthetischer Oligonukleotid-Linker an dem IFN-β-Genfragment so in die zugängliche BamHI-Restriktionsstelle von pAc380 insertiert, daß die Insertion an den AcMNPV-Polyhedrin-Promotor grenzt und sich in der gleichen 5'- nach 3'-Richtung wie das Polyhedrin-Gen befindet.
- Auf im wesentlichen die gleiche Weise wird das IFN-β-Gen in die anderen modifizierten Transfervektoren pAc311, pAc360 und pAc373 sowie den Eltern-Transfervektor pAc101 kloniert, um die pAc311-IFN-β, pAc360-IFN-β, pAc373-IFN-β bzw. pAc101-IFN-β genannten, rekombinanten Transfervektoren zu bilden. Potentiell könnte dieses Gen oder ein beliebiges anderes ausgewähltes Gen in einen beliebigen Transfervektor kloniert werden, wobei die BamHI-Erkennungsstelle oder eine beliebige andere geeignete Restriktionsendonuklease-Spaltungstelle an einer beliebigen Stelle in den Transfervektor insertiert wird. Weiterhin ist es nicht erforderlich, einen Teil der oder die gesamte Polyhedrin-Struktur-Sequenz zu entfernen, um die BamHI-Erkennungsstelle zu insertieren, da geeignete Restriktionsendonuklease-Klonierungsstellen an einem beliebigen Punkt in einem beliebigen Fragment des AcMNPV-Genoms, das wie in Beispiel I beschrieben in ein Plasmid eingebaut werden könnte, induziert werden könnten.
- Anschließend kann ein beliebiger, nach dem Verfahren von Beispiel III hergestellter, rekombinanter Transfervektor zum Transferieren des IFN-β-Gens in das Genom von AcMNPV verwendet werden, um einen rekombinanten Baculovirus-Expressionsvektor zu bilden. Der Transfer wird durch Transfektion in Anwesenheit von Ca&spplus;&spplus; und empfindlicher Insekten-Wirts-Zellen wie S. frugiperda bewirkt.
- Eine Modifikation des von F.L. Graham und A.J. Van Der Eb, 52, Virology, 456-467 (1973), beschriebenen Verfahrens wurde wie folgt verwendet: aus AcMNPV (1ug) extrahierte und gereinigte DNA wurde mit 1 bis 10 ug der rekombinanten Transfervektor-DNA, insbesondere des rekombinanten Transfervektors pAc380-IFN-β, gemischt und in 1-HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure)-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,05) mit 15 ug Träger-Kälberthymus-DNA pro Milliliter auf 950 ul gebracht. Während das Gemisch in einem Vortex-Mixer gemischt wurde, wurden 50 ml von 2,5 M CaCl&sub2; tropfenweise zugegeben; man ließ 30 Minuten lang bei Umgebungstemperatur einen Niederschlag bilden. Ein Milliliter der gefällten DNA wurde zu empfindlichen Insekten-Wirts-Zellen, in diesem Fall S. frugiperda, in 2 ml des Mediums in 60 mm-Kulturplatten gegeben. Nach 4 Stunden wurde die Zell-Monoschicht mit dem Medium gewaschen und in 2 ml des Mediums mit 10 % fötalem Rinderserum 3 Tage inkubiert. Die resultierenden Nachkommen stellten ein Gemisch von rekombinanten und nicht-rekombinanten AcMNPV-Viren dar.
- Als nächstes war es erforderlich, einen AcMNPV-rekombinanten Expressionsvektor aus dem in Beispiel IV beschriebenen, resultierenden Gemisch von nicht-rekombinanten und rekombinanten Baculoviren zu isolieren. Das Verfahren, nach dem diese Isolation in den Rekombinanten, in denen das gesamte oder ein Teil des Polyhedrin-Strukturgens entfernt wurde, durchgeführt wurde, macht sich die Tatsachen zunutze, (1) daß von diesen Viren kein Polyhedrin gebildet wird und (2) daß die nicht eingeschlossene (ohne eine Polyhedrin-Umhüllung) Virusform in Insektenzellkulturen lebensfähig und infektiös ist.
- Bei den rekombinanten AcMNPV-Viren, bei denen das gesamte oder ein Teil des Polyhedrin-Struktur-Gens entfernt wurde, z.B. die sich aus der Transfektion mit den rekombinanten Transfervektoren pAc101-IFN-β, pAc311-IFN-β, pAc360-IFN-β, pAc373-IFN-β und pAc380-IFN-β ergebenden, wurden die rekombinanten AcMNPV-Viren wie folgt isoliert.
- Das in dem Medium nach drei Tagen nach der Transfektion vorliegende extrazelluläre Virus wurde in einem von L.E. Volkman, M.D. Summers und C.H. Hsieh, 19, J. Virol., 820-832 (1976), beschriebenen Standard-AcMNPV-Polyhedrin-Plaquen-Assay verwendet. Die entwickelten Plaquen stammten entweder von mit nicht-rekombinantem AcMNPV infizierten Zellen, die Virus-Einschlüsse bildeten, oder waren das Ergebnis von mit rekombinanten AcMNPV-Viren infizierten Zellen, die keine Virus-Einschlüsse bilden. Die Plaquen des letzteren Typs (0&supmin;-Plaquen) wurden zuerst durch ihr Erscheinen unter einem Niederspannungs-Binokular-Mikroskop von den ersteren (0&spplus;-Plaquen) unterschieden. 0&supmin;-Plaquen wurden markiert und mit Hilfe eines Umkehrphasen-Mikroskops untersucht, bei dem vorliegende, einzelne Virus-Einschlüsse in dem Zellkern der infizierten Zellen gesehen werden konnten.
- Die Viren aus einer 0&supmin;-Plaque wurden plaquengereinigt; die DNA wurde zur Bestätigung, daß der rekombinante AcMNPV-Vektor eine Insertion des fremden Gens an der richtigen Stelle in EcoRI-I aufwies, mit den geeigneten Restriktionsenzymen analysiert. Es wurden keine anderen Änderungen der Virus-Genome nachgewiesen. Große Vorräte des gewünschten rekombinanten Virus wurden dann durch Infizieren empfindlicher Insektenzellen unter Verwendung von Standardverfahren erhalten.
- Zur Herstellung des gewünschten Genprodukts müssen die rekombinanten Baculoviren in empfindliche Wirtsinsektenzellen infiziert werden. Das folgende Verfahren wurde für die beispielhaften AcMNPV-Expressionsvektoren verwendet, die durch Rekombination mit den rekombinanten Transfervektoren pAc101-IFN-β, pAc311-IFN-β, pAc360-IFN-β, pAc373-IFN-β und pAc380-IFN-β gebildet wurden (siehe Fig. 5).
- Empfindliche S. frugiperda-Wirtszellen wurden als erstes entweder in Suspensionskultur oder in Monoschichten zu einer Dichte von 1 bis 5 x 10&sup6; Zellen/ml gezüchtet (die Konzentration der Zellen für die optimale Expression kann für jeden verschiedenen AcMNPV-Expressionsvektor variieren). Das Züchtungsmedium wurde entfernt und für etwa 1 Stunde bei 23ºC durch ein Medium ersetzt, das 0,1 bis 100 (die optimale Konzentration kann variieren) plaquenbildende Einheiten des rekombinanten Virus pro Zelle, z.B. Ac380-IFN-β (Fig. 5), enthält. Man kann das Inoculum auf den Zellen lassen oder entfernen und durch die geeignete Menge von frischem Medium ersetzen.
- Das Protein aus dem klonierten IFN-β-Gen wurde im Zeitraum von etwa 12 Stunden bis 3 Tage nach der Infektion in S. frugiperda-Zellen hergestellt, die mit dem Ac380-IFN-β-Expressionsvektor infiziert waren. Das gesamte Infektionsverfahren, einschließlich Virusproteinsynthese, Viruszusammenbau und Zell- Lyse war nach etwa 72 Stunden beendet. Es gab eine deutliche Abnahme der Proteinsynthese zwischen 50 und 60 Stunden nach der Infektion; die Zell-Lyse wurde etwa 50 Stunden nach der Infektion zum ersten Mal nachgewiesen. Die Kinetik der Expression des IFN-β-Gens variierte abhängig von der Wirtszelle und der Stelle, an der das Gen in das Polyhedrin-Gen kloniert wurde.
- Die Kinetik der IFN-β-Expression für jeden der rekombinanten Viren ist in der Tabelle 1 zusammengefaßt. Signifikante Spiegel von Interferon wurden 48 Stunden nach der Infektion in mit jedem der Expressionsvektoren infizierten Zellen nachgewiesen. Von den untersuchten Expressionsvektoren ergaben Ac373-IFN-β und Ac380-IFN-β die höchsten Titer der Interferonaktivität (Tab. 1).
- Die intrazellulären Spiegel der Interferonaktivität wurden auch gemessen und sind in Tabelle 1 gezeigt. Weniger als 5 % der gesamten Interferonaktivität verblieb bei 48 Stunden nach der Infektion innerhalb der Ac373-IFN-β- und Ac380-IFN-β-infizierten Zellen; dies zeigt, daß die IFN-β-Sekretionssignale erkannt wurden und das Protein während der Infektion effizient in die Medien freigesetzt wurde. Bei 12 Stunden nach der Infektion wies das Medium von Ac373-IFN-β- und Ac380-IFN-β-infizierten Zellen etwa 10.000 IU/ml Interferon auf, diese stiegen bis zu einem Maximum von annähernd 5 x 10&sup6; IU/ml bei 42 Stunden nach der Infektion an.
- Die Kinetik der Interferonexpression wurde in mit den verschiedenen Expressionsvektoren infizierten S. frugiperda-Zellen untersucht. Die Ergebnisse dieser Experimente waren wie folgt: Innerhalb der Zelle Außerhalb der Zelle Viren 10&sup6; IU/10&sup7; Zellen 10&sup6; IU/Liter (%)
- Es ist bekannt, daß die Synthese von Polyhedrin in AcMNPV-infizierten Zellen einem ähnlichen zeitlichen Muster folgt. Wenn auch in Ac360-IFN-β-Virus-infizierten Zellen weniger und in Ac311-IFN-β-Virus-infizierten Zellen noch weniger Interferon hergestellt wird, liegt mehr als 95 % der Aktivität in dem Medium vor (Tabelle 1). Ein relativ geringer Interferon-Spiegel wurde in Ac101-IFN-β-infizierten Zellen festgestellt, von dem sich das meiste intrazellulär befand (Tabelle 1).
- Der Titer von mit rekombinanten Viren infizierten Zellen erreichte ein Maximum von 3 bis 8 x 10&sup8; plaquenbildenden Einheiten pro ml des Mediums, der typisch für AcMNPV-infizierte Zellen ist. So zeigt sich, daß die Insertion des IFN-β-Gens in das Polyhedrin-Gen keinen größeren Einfluß auf die Replikation des Virus hat. Um dies zu testen, wurden 2 x 10&sup6; S. frugiperda-Zellen 12 Stunden mit bis zu 5 x 10&sup6; IU/ml von in Ac380-IFN-infiziertem Zellmedium hergestelltem Interferon oder 5 x 10³ IU/ml eines internationalen Standards von Human-Interferon behandelt; anschließend wurden die behandelten Zellen mit 100 plaquenbildenden Einheiten AcMNPV oder Ac380-IFN-β infiziert. Die Exposition der Zellen mit Interferon hatte keine meßbare Wirkung auf die Zahl der Virusplaquen, die sich entwickelten.
- Der Virusplaquen-Reduktions-Assay bei durch vesiculäre Stomatitis-Viren hervorgerufenen Human-Amnion-WISH-Zellen wurde zur Bestimmung der Interferonaktivität verwendet. Wenn die Viruspartikel durch Zentrifugieren entfernt wurden, wurde in Medien von AcMNPV-infizierten Zellen keine Interferonaktivität gemessen. Wenn jedoch während der Interferon-Assays AcMNPV-Viren-enthaltende Medien verwendet wurden, wurden 1000 bis 3000 internationale Vergleichseinheiten (IU)/ml an Interferon gebildet; dies zeigt, daß AcMNPV-Virionen offenbar endogenes Interferon in WISH-Zellen induzierten. Weil bei vielen Arten von umhüllten Viren bekannt ist, daß sie die Interferon-Bildung stellung in Humanzellen induzieren, wurden diese Ergebnisse erwartet. Zur Vermeidung dieses Effekts wurden alle folgenden Proben vor der Untersuchung zentrifugiert.
- Es wurde ein Experiment durchgeführt, um zu bestimmen, ob das in dem Medium (siehe W.F. Hink, 226, Nature (London), 466-467 (1970)) vorliegende Serumalbumin (6mg/ml) und Kälberserum (10 %) für die Expression von IFN-β in mit Ac380-IFN-β-infizierten S. frugiperda-Zellen erforderlich war. Bei 8 Stunden nach der Infektion wurde das Medium durch Grace's Medium ersetzt (kein Serumalbumin, siehe T.C.C. Grace, 195, Nature (London), 788-789 (1962)), das 0 bis 10 % fötales Rinderserum enthält. Jedes der modifizierten Medien wurde bei 48 Stunden nach der Infektion einem Assay auf die Interferon-Aktivität unterworfen. Ohne Serum gab es eine etwa 10-fache Reduktion der Interferon-Aktivität. Bei Zugabe von 0,5 % Serum wurde der gleiche Spiegel der Aktivität hergestellt wie in 10 % Serum enthaltenden Vergleichsmedien. Die spezifische Aktivität von IFN-β in Ac380-IFN-β-infizierten Zellen betrug bei Herstellung in 0,5 % Serum enthaltendem Grace's Medium etwa 5 x 10&sup6; IU/mg. Unter der Annahme, daß die Aktivität von gereinigtem β-Interferon 2 x 10&sup8; IU/ml ist (siehe E. Knight Jr., 73, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 520-523 (1976)), würde β-Interferon etwa 1 % des Gesamtproteins in dem Medium darstellen.
- Eine weitere Analyse der in dem Medium vom Ac373-IFN-β- und Ac380-IFN-β-infizierten Zellen gemessenen Interferon-Aktivität ließ zwei Polypeptide mit einem Molekulargewicht von 17.000 (17 K) und 20,5 K erkennen. Die Größen der nicht-glycosylierten und glycosylierten Human-IFN-β-Proteine wurden als mit den 17K- bzw. 20,5K-Polypeptiden vergleichbar beschrieben. 30 Stunden nach der Infektion wurde in Ac360-IFN-β-infizierten Zellen das 17K-Polypeptid hergestellt; bei 48 Stunden nach der Infektion wurden beide 17K- und 20,5K-Polypeptide nachgewiesen. In Ac311-IFN-β-infizierten Zellen konnte bei 30 und 48 Stunden nach der Infektion nur das 17K-Polypeptid nachgewiesen werden. In Ac360-IFN-β-infizierten Zellen wurde ein in großer Menge hergestelltes 23,5K-Protein festgestellt. Diese Größe wurde für ein aus dem gesamten Interferon-Protein bestehendes Hybrid-Protein erwartet, das das 21 Aminosäuren-Signal-Peptid plus zusätzlicher, in den ersten 10 Kodons des Polyhedrin-Gens und der BamHI-Linker-Sequenzen erhaltener 14 Aminosäuren einschließt.
- Die in Ac380-IFN-β-infizierten Zellen und in geringerem Umfang in Ac360-IFN-β-infizierten Zellen hergestellten 17K- und 20,5K-Proteine reagierten mit human-IFN-β-monoklonalen Antikörpern. (Die IFN-β-monoklonalen Antikörper wurden von P.W. Trown und Hoffmann-La Roche Inc. erhalten.) Es wurde eine verminderte Reaktion dieses Antikörpers mit dem 20,5K-Protein im Vergleich zu der des 17K-Proteins festgestellt. Dies war teilweise eine Folge der Tatsache, daß das 17K sich in Zellen in höheren Spiegeln ansammelt als das 20,5K. Zusätzlich kann der Antikörper mit einem Epitop auf dem 17K-Polypeptid, das teilweise, z.B. durch Glycosylierung des 20,5K-Polypeptids, maskiert ist, reagieren. Die putativen Hybrid-23,5K- und -32K-Proteine reagierten ebenfalls mit IFN-β-Antikörpern. Polyklonale Antikörper zu Polyhedrin erkannten die 10 Aminosäuren des 23,5K-Proteins und die 57 Aminosäuren des 32K-Proteins, die aus den DNA-Sequenzen, die an den N-terminalen Enden der Hybrid-Proteine vorliegen, vorhergesagt würden.
- Zum Nachweis, daß 20,5K-IFN glycosyliert war, wurden Ac380-IFN-β-infizierte Zellen im späten Stadium der Infektion mit (³H)-Mannose markiert. Das 20,5K-IFN und drei zusätzliche Proteine waren die hauptsächlichen Mannose-enthaltenden Glycoproteine, die in Ac380-IFN-β-infizierten Zellen markiert waren.
- Das E.coli-transponierbare Element Tn9 enthält das Gen für das Enzym Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT), das die Resistenz gegen das Antibiotikum Chloramphenicol verleiht. Es zeigte sich, daß die Expression von CAT in eukaryontischen Zellen ein geeignetes Mittel zur Messung der Expression von Promotoren in tierischen Zellen darstellt (siehe Mackett, M., G. Smith und B. Moss., 1984, J. Virol., 49:857-864 und die Zitate darin). Die AcMNPV-CAT-Expressionsvektoren waren bei Experimenten verwendbar, die zur Optimierung der Herstellung fremder Gene in Baculovirus-Vektoren bestimmt waren.
- Ein die CAT-Kodierungs-Sequenz enthaltendes 770 Basenpaar- TaqI-DNA-Fragment wurde aus pBR328 isoliert und in die AccI- Stelle von pUC7 kloniert. Die CAT-Kodierungs-Sequenz wurde mit BamHI ausgeschnitten und in die BamHI-Stelle in pAc373 insertiert. Der resultierende Plasmid-Transfervektor wird pAc373-CAT genannt.
- Human-Interleukin-2 (IL2) wird in sehr kleinen Mengen in Human-Lymphocyten hergestellt, die durch Mitogene oder Antigene stimuliert wurden. IL-2 wurde ursprünglich als ein zur Aufrechterhaltung des Langzeit-Wachstums von T-Lymphocyten- Zellen in Kultur befähigter Faktor beschrieben (Morgan, D.A., Ruscetti, F.W. und Gallo, R., Science, 193:1007-1008 (1976)). Es scheint eine zentrale Rolle bei der Stimulierung und Aufrechterhaltung von Immunreaktionen zu spielen und wurde als bei verschiedenen Human-Krankheiten beteiligt angesehen (Altman, A., Theofilopoulos, A.N., Weiner, R., Katz, D.H. und Dixon, F.J., J. Expl. Med., 154:1403-1417 (1981)). Es wird erwartet, daß die Verwendung von AcMNPV-Expressionsvektoren für die Herstellung großer Mengen von IL-2 die klinische Diagnostik und therapeutische Behandlung des Human-Immunsystems in grobem Male erleichtert. Verschiedene Laboratorien haben vor kurzem die Isolation des Gens für IL2 und die Herstellung von biologisch aktivem IL-2 in Bakterienzellen unter Verwendung von Plasmidvektoren beschrieben (siehe Rosenberg et al., Science, 223:1412-1415 (1984), und die Zitate darin).
- Ein die IL2-Kodierungssequenzen enthaltendes 1000 Basenpaar- BamHI-Fragment wurde aus pIL2-2B isoliert und in die BamHI- Stelle in pAc373 und pAc380 insertiert. Die resultierenden Plasmid-Transfervektoren werden pAc373-IL2 und pAc380-IL2 genannt.
- Der Transfer der Polyhedrin-IL2- und CAT-Gene in das AcMNPV- Genom und die Selektion von rekombinanten AcMNPV-Expressionsvektoren wurde wie oben in Beispiel IV beschrieben durchgeführt. Die aus pAc373-IL2, pAc380-Il2 bzw. pAc373-CAT hergestellten, resultierenden AcMNPV-Expressionsvektoren werden Ac373-IL2, Ac380-IL2 bzw. Ac373-CAT genannt.
- S. frugiperda-Zellen wurden wie für Ac380-IFN-β beschrieben mit Ac373-IL2- oder Ac380-IL2-Expressionsvektoren infiziert. Bei 48 Stunden nach der Infektion wurden die Medien und die infizierten Zellen gesammelt und die Spiegel der biologischen Interleukin-Aktivität unter Verwendung des von Gillis et al., J. Immunol., 120:2027-2032 (1978), beschriebenen IL2-Assays gemessen. Bei Verwendung dieses Assays wurde die spezifische Aktitivät von IL2 als 1 x 10&sup8; Einheiten pro mg Protein bestimmt. Beide Expressionsvektoren stellten hohe Spiegel von Interleukin-Aktivität her, aber Ac373-IL2 stellte etwa 4mal mehr Interleukin her als Ac380-TL2 (siehe Tabelle 2). Etwa 80 % der Interleukin-Aktivität lag in den Medien vor; dies zeigt, daß das Protein von den Zellen während der Infektion effizient sekretiert wird. In einem getrennten, von Dr. Grace Ju, Hoffmann-La Roche Research Center, durchgeführten Experiment wurden S. frugiperda-Zellen mit Ac373-IL2 und Ac380-IL2 infiziert und in den Medien die Spiegel der Interleukin-Aktivität bei 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden nach der Infektion gemessen. Bei 24 Stunden und 48 Stunden wurden frische Medien verwendet. Praktisch die gesamte Aktivität wurde zwischen 0 bis 24 Stunden und 24 bis 48 Stunden nach der Infektion hergestellt (Tabelle 2). Aus der spezifischen Aktivität von IL2 wurde berechnet, daß mindestens 1 g IL2-Protein pro Liter der Ac373-IL2-infizierten Zellen hergestellt und sekretiert wird.
- Es wurde eine Analyse der in Ac373-IL2- und Ac380-IL2-infizierten Zellen hergestellten Proteine durchgeführt. Es gab zwei von diesen AcMNPV-Expressionsvektoren in großer Menge hergestellte Proteine, die nicht in AcMNPV-infizierten Zellen hergestellt werden. Diese neuen Proteine haben eine Größe von 15,5K und 16K Dalton. Dies steht im Einklang mit der Tatsache, daß die aus der DNA-Sequenz vorhergesagte Größe von Interleukin etwa 15,5K beträgt (unter der Annahme, daß das 20 Aminosäuren-Signalpeptid an dem aminoterminalen Ende des Proteins entfernt ist).
- Die Herstellung der Interleukin-2-Aktivität in mit AcMNPV- Expressionsvektoren infizierten S. frugiperda-Zellen. Bei der Infektion Nr. 1 wurden die Proben der Medien und der infizierten Zellen bei 48 Stunden nach der Infektion gesammelt. Bei der Infektion Nr. 2 wurden die Proben der Medien bei 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden nach der Infektion gesammelt und bei 24 Stunden und 48 Stunden nach der Infektion frische Medien verwendet. Infektion Nr. 1a Vektor Zellen (Einheiten/l) Medien (Einheiten/l) Total mg/l % sekretierte Aktivität Infektion Nr. 2b Vektor Stunden p.i. Medien (Einheiten/l) Total mg/l a hergestellt an der Texas A & M University b hergestellt am Hoffmann-La Roche Research Center
- S. frugiperda-Zellen wurden wie für Ac380-IFN-β beschrieben mit Ac373-CAT infiziert; bei 24 Stunden nach der Infektion wurde wie von Mackett et al.,ebenda, beschrieben, in den Zellen und dem Medium die CAT-Enzym-Aktivität gemessen. In nicht infizierten Zellen oder mit AcMNPV infizierten Zellen gab es keine nachweisbare CAT-Enzym-Aktivität; hohe Spiegel der Aktivität wurden jedoch von Ac373-CAT sowohl in den Zellen als auch in dem Medium hergestellt.
- Es wurde eine Analyse der in Ac373-CAT-infizierten Zellen hergestellten Proteine durchgeführt. Ein neues Protein mit 27K Dalton wurde von diesem Expressionsvektor gebildet, das nicht in AcMNPV-infizierten Zellen gebildet wurde. Aus der DNA- Sequenz kann vorhergesagt werden, daß die Größe von CAT 27K ist. Sowohl in den infizierten Zellen als auch in dem Medium war reichlich 27K-Protein vorhanden. Aus der Proteinmenge, die auf Polyacrylamidgelen bestimmt wurde, wird berechnet, daß etwa 40 mg des CAT-Enzyms pro Liter der Ac373-CAT-infizierten Zellen hergestellt wird.
- Die Erfindung und die dadurch vorhandenen Vorteile und Möglichkeiten werden aus der obigen Beschreibung erkannt, die nur verschiedene bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beschreibt. Es ist offensichtlich, daß viele Änderungen der verwendeten Materialien, Verfahren und Mengen von Materialien vorgenommen werden können, ohne den Bereich der Erfindung zu verlassen und vom Sinn der Erfindung abzuweichen oder irgendeinen ihrer Vorteile zu gefährden. Weiterhin ist zu erkennen, daß die oben beschriebene Erfindung Anwendungen aufweist, die darauf beruhen, daß ein vorteilhafter Gebrauch von der Tatsache gemacht wird, daß die vorliegende Erfindung zum Insertieren eines beliebigen, ausgewählten Gens an einer beliebigen von verschiedenen Stellen in einem Baculovirus-Genom verwendet werden kann.
- Zum Beispiel macht die Tatsache, daß Verfahren für die Isolation von rekombinanten AcMNPV-Viren, in denen das gesamte oder ein Teil des Polyhedrin-Gens nicht entfernt wurde, erhältlich sind, eine vielfältige Verwendung der vorliegenden Erfindung möglich. Diese Anwendungen können einen Vorteil aus der Tatsache ziehen, daß der Polyhedrin-Überzug der eingeschlossenen Form des AcMNPV-Virus sehr resistent gegen äußere Einflüsse ist. Zum Beispiel könnte, wie in Beispiel III beschrieben, ein ausgewähltes Gen in das Virus-Genom an einer anderen Stelle als in dem Polyhedrin-Gen kloniert werden, insbesondere an einer solchen Stelle, daß die Expression des ausgewählten Gens von dem 10K-Promotor kontrolliert würde, so daß es mit hohen Spiegeln exprimiert würde. Dieses rekombinante AcMNPV- Virus könnte dann isoliert und als ein stabiler Expressionsvektor verwendet werden.
- Solch ein stabiler Expressionsvektor kann als stabile Form verwendet werden, in der ein rekombinanter AcMNPV-Virus zusammen mit einer Kultur der geeigneten Wirtszellen und geeigneten Medien für die eventuelle Verwendung bei der Herstellung eines gewünschten Proteins zu einer bestimmten Zeit in der Zukunft von einem Laboratorium zu einem anderen transferiert werden könnte.
- Der Expressionsvektor kann auch in einem System zur Kontrolle von Schadinsekten-Populationen durch Selektion eines Gens, das ein zu einer besonderen Wirtsinsektenart oder einem breiten Spektrum von empfindlichen Wirtsinsektenarten toxisches Protein herstellt, und Klonieren dieses Gens in den AcMNPV- Expressionsvektor verwendet werden (diese Möglichkeiten werden von L.K. Miller et al., 219, Science, 715-721 (1983), diskutiert). Der rekombinante Expressionsvektor könnte der Pflanze oder dem Tier verabreicht werden, für das das Insekt ein Schädling ist; wenn dieser von dem Schadinsekt aufgenommen wird, wird wie oben beschrieben der Einschluß in dem Lumen des Darms dissoziieren und der rekombinante Virus die Zellen der Darmwand durchbrechen und mit der Replikation beginnen.
- Während der Replikation wird das für das Schadinsekt toxische Protein exprimiert; dadurch ergibt sich die Unschädlichmachung oder der Tod des Insekts in einer wesentlich kürzeren Zeit, als wenn das Insekt den Wildtyp-AcMNPV-Virus aufgenommen hätte; in diesem Fall würde das Insekt nach einem Zeitraum lysiert werden, der von dem Ausmaß der viralen Infektion abhängen würde. Bei Experimenten in diesem und anderen Laboratorien zeigt sich, daß die Expression des 10K-Proteins schon bei 24 Stunden nach der Infektion und in hohen Spiegeln bei etwa 48 Stunden stattfindet. Folglich würde von einem Gen, das ein gewünschtes, in das AcMNPV-Genom unter der Kontrolle des 10K-Promotors kloniertes Insektentoxin kodiert, erwartet werden, daß es gemäß diesem zeitlichen Schema exprimiert würde. Der Tod oder die Unschädlichmachung des Insekts könnte bald nach der Initiierung der Expression dieses ausgewählten Gens erwartet werden, wobei sich verglichen mit einer Infektion des Insekts mit dem Wildtyp-Baculovirus eine gleichzeitige Abnahme der Schädigung der Pflanzen oder Tiere, die dieses Schädlingsinsekt frißt, ergibt.
- Das Gen konnte auch in das Baculovirusgenom eingesetzt werden, so daß es mit der Polyhedrin-Struktur-Sequenz auf solche Weise fusioniert war, daß beim Dissoziieren des Polyhedrinüberzugs durch die alkalischen Bedingungen des Insektendarms das toxische Genprodukt freigesetzt würde. Diese Anwendung der vorliegenden Erfindung würde zu einer Vergiftung des Insekts ohne Expression des rekombinanten Gens in den Insektendarmzellen führen.
- Weiterhin ist ersichtlich, daß bei der Verwendung der vorliegenden Erfindung auch höhere Spiegel der Genexpression als die in den oben beschriebenen Beispielen gemessenen möglich sind. Zum Beispiel könnte das IFN-β-Gen (oder ein beliebiges anderes Gen) mehr als einmal in das Baculovirus-Genom kloniert werden. Insbesondere könnten Kopien eingesetzt werden, so daß sich die Expression unter der Kontrolle des Polyhedrin-Promotors befindet; es könnten andere Kopien eingesetzt werden, so daß sich die Expression unter der Kontrolle des 10K-Promotors befindet; anschließend könnten mehrere weitere Kopien an verschiedenen anderen Restriktionsstellen eingesetzt werden, wobei jede Kopie entweder ihren eigenen Promotor oder irgend eine andere von dem Baculovirus als Promotor erkannte DNA-Sequenz einschließen würde. Nach der Infektion in empfindliche Insektenzellen könnte die hergestellte Menge an Interferon (oder jedes anderen Polypeptids) in hohem Maße über die oben gemessenen Spiegel erhöht werden.
- Weitere Modifikationen der hier beschriebenen Erfindung werden den Fachleuten, die den Nutzen aus dieser Beschreibung ziehen, einfallen; alle diese Modifikationen werden als im Sinne und im Umfang der durch die angefügten Ansprüche definierten Erfindung angesehen.
Claims (21)
1. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten
Baculovirus-Expressionsvektors, der ein ausgewähltes,
nicht-fusioniertes, rekombinantes, heterologes Gen in einer
Wirtsinsektenzelle exprimieren kann, dadurch gekennzeichnet, daß
es:
(a) die Spaltung von Baculovirus-DNA zur Herstellung
eines DNA-Fragments, das ein mit einer in Fig. 3
gezeigten Nukleotid-Sequenz ausreichende Homologie
aufweisendes Baculovirus-Polyhedrin-Gen und
ausreichende, flankierende Baculovirus-DNA-Sequenzen zur
Erleichterung der homologen Rekombination umfaßt;
(b) das Insertieren des Baculovirus-DNA-Fragments in ein
Klonierungs-Vehikel zur Bildung eines
Baculovirus-Gen-Transfervektors;
(c) die Erzeugung einer speziellen Restriktionsstelle
zum Klonieren eines ausgewählten heterologen Gens,
wobei die spezielle Restriktionsstelle innerhalb des
Polyhedrin-Gens lokalisiert ist;
(d) die Entfernung aller die Polyhedrin-Protein-Synthese
kodierender Sequenzen aus dem
Baculovirus-DNA-Fragment und gegebenenfalls das Entfernen einiger
Sequenzen aus dem Baculovirus-DNA-Fragment
stromaufwärts der Polyhedrin-ATG-Translations-Initiations-
Start-Stelle, so daß die spezielle
Restriktionsstelle in dem Polyhedrin-Gen an einer Stelle im Bereich
von dem Polyhedrin-Transkriptions-Startsignal zu der
ATG-Translations-Initiations-Start-Stelle
lokalisiert ist;
(e) die Herstellung eines rekombinanten Baculovirus-
Transfervektors durch Insertieren von mindestens
einem ausgewählten, heterologen Gen in die spezielle
Restriktionsstelle, so daß sich das ausgewählte Gen
unter der Transkriptions-Kontrolle des
Baculovirus-Polyhedrin-Promotors befindet;
(f) das In-Berührung-Bringen des rekombinanten
Baculovirus-Transfervektors mit Baculovirus-DNA, um die
Rekombination zu bewirken und auf diese Weise ein
Gemisch von rekombinanten und nicht-rekombinanten
Baculoviren herzustellen; und
(g) das Isolieren eines rekombinanten
Baculovirus-Expressionsvektors aus dem Gemisch
umfaßt.
2. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Baculovirus-
Transfervektors, der mindestens ein ausgewähltes
heterologes Gen aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß es
(a) die Spaltung von Baculovirus-DNA zur Herstellung
eines DNA-Fragments, das ein mit einer in Fig. 3
gezeigten Nukleotid-Sequenz ausreichende Homologie
aufweisendes Baculovirus-Polyhedrin-Gen und
ausreichende, flankierende Baculovirus-DNA-Sequenzen zur
Erleichterung der homologen Rekombination umfaßt;
(b) das Insertieren des Baculovirus-DNA-Fragments in ein
Klonierungs-Vehikel zur Bildung eines
Baculovirus-Gen-Transfervektors;
(c) die Erzeugung einer speziellen Restriktionsstelle
zum Klonieren eines ausgewählten heterologen Gens,
wobei die spezielle Restriktionsstelle innerhalb des
Polyhedrin-Gens lokalisiert ist;
(d) die Entfernung aller die Polyhedrin-Protein-Synthese
kodierender Sequenzen aus dem
Baculovirus-DNA-Fragment und gegebenenfalls das Entfernen einiger
Sequenzen aus dem Baculovirus-DNA-Fragment
stromaufwärts der Polyhedrin-ATG-Translations-Initiations-
Start-Stelle, so daß die spezielle
Restriktionsstelle in dem Polyhedrin-Gen an einer Stelle im Bereich
von dem Polyhedrin-Transkriptions-Startsignal zu der
ATG-Translations-Initiations-Start-Stelle
lokalisiert ist; und
(e) das Insertieren von mindestens einem ausgewählten,
heterologen Gen in die spezielle Restriktionsstelle,
so daß sich das ausgewählte Gen unter der
Transkriptions-Kontrolle des Baculovirus-Polyhedrin-Promotors
befindet,
umfaßt.
3. Verfahren zur Herstellung eines
Baculovirus-Transfervektors, der eine spezielle Restriktionsstelle unter der
Transkriptions-Kontrolle des Polyhedrin-Promotors
aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß es:
- die Spaltung von Baculovirus-DNA zur Herstellung eines
DNA-Fragments, das ein mit einer in Fig. 3 gezeigten
Nukleotid-Sequenz ausreichende Homologie aufweisendes
Baculovirus-Polyhedrin-Gen und ausreichende,
flankierende Baculovirus-DNA-Sequenzen zur Erleichterung der
homologen Rekombination umfaßt;
- das Insertieren des DNA-Fragments in ein Klonierungs-
Vehikel, um einen Baculovirus-Gen-Transfervektor
herzustellen;
- die Erzeugung einer speziellen Restriktionsstelle zum
Klonieren eines ausgewählten heterologen Gens, wobei
die spezielle Restriktionsstelle innerhalb des
Polyhedrin-Gens lokalisiert ist; und
- die Entfernung aller die Polyhedrin-Protein-Synthese
kodierender Sequenzen aus dem Baculovirus-DNA-Fragment
und gegebenenfalls das Entfernen einiger Sequenzen aus
dem Baculovirus-DNA-Fragment stromaufwärts der
Polyhedrin-ATG-Translations-Initiations-Start-Stelle, so
daß die spezielle Restriktionsstelle in dem
Polyhedrin-Gen an einer Stelle im Bereich von dem
Polyhedrin-Transkriptions-Startsignal zu der
ATG-Translations-Initiations-Start-Stelle lokalisiert ist,
umfaßt.
4. Verfahren zur Herstellung eines ausgewählten, nicht
fusionierten, heterologen Polypeptids, dadurch gekennzeichnet,
daß es das Infizieren einer empfindlichen Wirtszelle mit
einem rekombinanten Baculovirus-Expressionsvektor umfaßt,
der mindestens ein ausgewähltes, heterologes Gen,
insertiert in ein Baculovirus-Polyhedrin-Gen zwischen das
Polyhedrin-Transkriptions-Start-Signal und die
Polyhedrin-ATG-Translations-Initiations-Start-Stelle, umfaßt
sowie sich unter der Transkriptions-Kontrolle eines
ausreichende Homologie mit einer in Fig. 3 gezeigten
Polynukleotidsequenz aufweisenden
Baculovirus-Polyhedrin-Promotors befindet.
5. Verfahren gemäß einem jeden der Ansprüche 1 bis 3, bei dem
die spezielle Restriktionsstelle eine BamHI-Stelle ist.
6. Verfahren gemäß einem jeden der Ansprüche 1 bis 3, bei dem
die spezielle Restriktionsstelle an einer Stelle im
Bereich vom Nukleotid -1 zum Nukleotid -10 des
Baculovirus-Polyhedrin-Gens lokalisiert ist.
7. Verfahren gemäß einem jeden der Ansprüche 1 bis 4, wobei
das Baculovirus-Polyhedrin-Gen von Autographa californica
MNPV, Trichoplusia ni MNPV, Rachiplusia ou MNPV oder
Galleria mellonella MNPV abgeleitet ist.
8. Verfahren gemäß einem jeden der Ansprüche 1 bis 4, bei dem
das Baculovirus-Gen von Autographa californica MNPV
abgeleitet ist.
9. Verfahren gemäß Anspruch 4, bei dem das ausgewählte,
heterologe Gen an einer BamHI-Stelle eingesetzt wird.
10. Rekombinanter Baculovirus-Expressionsvektor, der ein
ausgewähltes, heterologes Gen in einer Wirtsinsektenzelle
exprimieren kann, dadurch gekennzeichnet, daß er
mindestens ein ausgewähltes, heterologes Gen umfaßt, das in ein
Baculovirus-Polyhedrin-Gen an einer Stelle im Bereich von
dem Polyhedrin-Transkriptions-Start-Signal zu der
Polyhedrin-ATG-Translations-Initiations-Start-Stelle
eingesetzt ist und sich unter der Transkriptions-Kontrolle
eines ausreichende Homologie mit einer in Fig. 3 gezeigten
Nukleotid-Sequenz aufweisenden
Baculovirus-Polyhedrin-Promotors befindet.
11. Rekombinanter Transfervektor, der zum Einführen eines
ausgewählten, heterologen Gens in ein Baculovirus-Genom
befähigt ist, dadurch gekennzeichnet, daß er ein
Klonierungs-Vehikel umfaßt, das eine DNA-Sequenz aufweist, die
ein Baculovirus-Polyhedrin-Gen und mindestens ein
ausgewähltes, heterologes Gen, das mit dem
Baculovirus-Polyhedrin-Gen an einer Stelle im Bereich von dem Polyhedrin-
Transkriptions-Start-Signal zu der Polyhedrin-ATG-
Translations-Initiations-Start-Stelle verknüpft ist und
sich unter der Transkriptions-Kontrolle eines Promotors
des Baculovirus-Polyhedrin-Gens befindet, umfaßt, wobei
der Baculovirus-Polyhedrin-Promotor eine ausreichende
Homologie mit einer in Fig. 3 gezeigten Nukleotid-Sequenz
und ausreichende flankierende Baculovirus-DNA-Sequenzen
zur Erleichterung der homologen Rekombination aufweist.
12. Baculovirus-Transfervektor, dadurch gekennzeichnet, daß er
einen ausreichende Homologie mit einer in Fig. 3 gezeigten
Nukleotid-Sequenz aufweisenden
Baculovirus-Polyhedrin-Promotor, ausreichende flankierende Baculovirus-DNA-Sequenzen
zur Erleichterung der homologen Rekombination und eine
spezielle Restriktionsstelle zum Klonieren eines
ausgewählten, heterologen Gens aufweist, wobei die spezielle
Restriktionsstelle in dem Polyhedrin-Gen an einer Stelle
im Bereich von dem Polyhedrin-Transkriptions-Start-Signal
zu der
Polyhedrin-ATG-Translations-Initiations-Start-Stelle lokalisiert ist.
13. Rekombinanter Baculovirus-Expressionsvektor, der zur
Herstellung eines ausgewählten, nicht-fusionierten,
heterologen Proteins in einer Wirtsinsektenzelle befähigt
ist, wobei der Expressionsvektor ein Baculovirus-Genom
ist, das ein ausgewähltes, sein eigenes ATG-Signal
einschließendes heterologes Gen unter der
Transkriptionskontrolle eines ausreichende Homologie mit einer in Fig. 3
gezeigten Nukleotid-Sequenz aufweisenden
Baculovirus-Polyhedrin-Promotors umfaßt.
14. Vektor gemäß einem jeden der Ansprüche 10 bis 13, bei dem
der Baculovirus-Promotor von Autographa californica MNPV,
Trichoplusia ni MNPV, Rachiplusia ou MNPV oder Galleria
mellonella MNPV abgeleitet ist.
15. Vektor gemäß einem jeden der Ansprüche 10 bis 13, bei dem
der Baculovirus-Promotor von Autographa californica MNPV
abgeleitet ist.
16. Vektor gemäß einem jeden der Ansprüche 10 bis 13, bei dem
das ausgewählte, heterologe Gen an einer BamHI-Stelle
eingesetzt ist.
17. Vektor gemäß Anspruch 12, bei dem die spezielle
Restriktionsstelle eine BamHI-Stelle ist.
18. Vektor gemäß einem jeden der Ansprüche 10 oder 11, bei dem
das ausgewählte, heterologe Gen an einer Stelle im Bereich
von dem Nukleotid -1 zu dem Nukleotid -10 des
Baculovirus-Polyhedrin-Gens eingefügt ist.
19. Vektor gemäß Anspruch 12, bei dem die spezielle
Restriktionsstelle an einer Stelle im Bereich von dem Nukleotid -1
zu dem Nukleotid -10 des Baculovirus-Polyhedrin-Gens
lokalisiert ist.
20. Rekombinanter Baculovirus-Expressionsvektor von Anspruch
13, bei dem die gesamte oder ein Teil der DNA-Sequenz, die
das Baculovirus-Polyhedrin-Struktur-Gen unter der
Transkriptions-Kontrolle des Promotors kodiert, entfernt ist.
21. Baculovirus-Transfervektor von Anspruch 12, der als NRRL
B-15428 oder NRRL B-15778, hinterlegt bei der Agricultural
Research Culture Collection, bezeichnet ist.
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