JP2565668B2 - ペプチド類の製造用ベクター - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】ペプチド生産用組換ＤＮＡウイル
スベクターに関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】カイコ
核多角体病ウイルス(BmNPV) を利用するペプチド類の生
産方法は既に報告されている（文献１〜３。なお引用文
献はまとめて最後に示す）。

【０００３】その方法の中心は組換 DNA技術により多角
体蛋白の構造遺伝子部分を所望の蛋白の構造遺伝子と置
換した型の組換BmNPV を作製し、これをカイコ培養細胞
またはカイコ生体中で増殖させて目的蛋白を生産させる
ものであった。

【０００４】しかしながら、この方法では目的蛋白の生
産量が未だ充分とは言えない。そこで本発明者は更に優
れた方法を開発すべく研究を重ね本発明を完成した。

【０００５】なお、融合蛋白の製造は既に大腸菌を利用
して行われているが、収量が著しく良くなるとは言えな
い（文献４〜１０）。

【０００６】

【課題を解決しようとする手段】

（１）本発明は、カイコ核多角体病ウイルスDNA(BmNPV
DNA)の多角体蛋白構造遺伝子部分に、（）その遺伝子
の全部または一部と、（）所望の蛋白の構造遺伝子を
（）結合手塩基配列を介してまたは介さずに連結した
型の塩基配列を有する、組換カイコ核多角体病ウイル
ス、に関するものである。

【０００７】（２）本発明は、カイコ核多角体病ウイル
スDNA(BmNPV DNA)の（）プロモーター部分を含む５′
上流塩基配列に続いて（）多角体蛋白構造遺伝子の全
部または一部があり、次に（）結合手塩基配列がある
こともあり、さらに（）所望の蛋白の構造遺伝子
（（）その蛋白のターミネイターを含んでもよい）お
よび（）カイコ核多角体病ウイルスDNA のターミネイ
ター配列を含むまたは含まない（） ３′下流塩基配
列を有するプラスミド、に関するものである。

【０００８】（３）本発明は、カイコ核多角体病ウイル
スDNA(BmNPV DNA)の（）プロモーター部分を含む5 ′
上流塩基配列に続いて（）多角体蛋白構造遺伝子の全
部または一部があり、次に（）結合手塩基配列がある
こともあり、さらに（）所望の蛋白の構造遺伝子
（（）その蛋白のターミネイターを含んでもよい）お
よび（）カイコ核多角体病ウイルスDNA のターミネイ
ター配列を含むまたは含まない（）3 ′下流塩基配列
を有するプラスミドとBmNPV DNA とでカイコ培養細胞ま
たはカイコを混合感染させることを特徴とする組換BmNP
V DNA の製造法、に関するものである。（４）本発明は、結合手塩基配列（）が、特定のアミ
ノ酸配列を認識して切断する蛋白分解酵素又は化学試薬
により認識・切断されるようなその特定アミノ酸配列を
コ−ドする塩基配列を一部に含むＤＮＡ塩基配列からな
る、前記項目（１）に記載の組換カイコ核多角体病ウイ
ルスに関する。 特定塩基配列とは、蛋白分解酵素又は化
学試薬が、その反応を生じるために認識する特異的なア
ミノ酸配列をコ−ドするＤＮＡ塩基配列（以下、同
義。） をいう。 （５）本発明は、結合手塩基配列（）が、特定のアミ
ノ酸配列を認識して切断する蛋白分解酵素又は化学試薬
により認識・切断されるようなその特定アミノ酸配列を
コ−ドする塩基配列を一部に含むＤＮＡ塩基配列からな
る、 前記項目（２）に記載のプラスミド、に関するもの
である。 （６）本発明は、結合手塩基配列（）が、特定のアミ
ノ酸配列を認識して切断する蛋白分解酵素又は化学試薬
により認識・切断されるようなその特定アミノ酸配列を
コ−ドする塩基配列を一部に含むＤＮＡ塩基配列からな
る、 前記項目（３）に記載の組換BmNPV DNA の製造法、
関する。 （７）本発明は、蛋白分解酵素がコラゲナ−ゼ、又は、
ファクタ−Ｘａである前記項目（４）に記載の組換カイ
コ核多角体病ウイルスに関するものである 。（８）本発明は、蛋白分解酵素がコラゲナ−ゼ、又はフ
ァクタ−Ｘａである前記項目（５）に記載のプラスミド
に関するものである 。（９）本発明は、蛋白分解酵素がコラゲナ−ゼ、又はフ
ァクタ−Ｘａである前 記項目（６）に記載の組換BmNPV
DNA の製造法に関するものである 。（１０）本発明は、化学試薬が臭化シアンである前記項
目（４）に記載の組換カイコ核多角体病ウイルスに関す
るものである 。（１１）本発明は、化学試薬が臭化シアンである前記項
目（５）に記載のプラスミドに関するものである 。（１２）本発明は、化学試薬が臭化シアンである前記項
目（６）に記載の組換BmNPV DNA の製造法に関するもの
である 。

【０００９】BmNPV は養蚕業者に広く知られているが、
本発明者が単離した代表的な株としてT3株があり、この
株のウイルスDNA (BmNPV DNA) は米国のATCCにATCC No.
40188 として寄託されている。

【００１０】このウイルスDNA から多角体蛋白の構造遺
伝子を含む部分を取出すには、文献１〜３の記載の如く
EcoRI 処理等が適当であり、このEcoRI-EcoRI 断片（約
10.5kb）をpBR322のEcoRI 切断点に導入したプラスミド
pBmE36を有する大腸菌 (E.coli K12 JM83 DGB-0036)は
FERM BP-813 として微生物工業技術研究所に寄託されて
いる。

【００１１】更に、文献１に記載があるように、pBmE36
をHind III処理して多角体蛋白構造遺伝子を含有する約
3.9kb の断片をとってこれを市販のプラスミドpUC9(Pha
rmacia P-L Biochemical社）に組込み、EcoRI で切断
後、 Bal31 で処理し（処理時間を調節すれば種々の長さ
の断片が製造できる)、 更に Hind IIIで切断する等の
操作で多角体蛋白遺伝子の全部または一部を有する断片
を製造することができる。多角体蛋白遺伝子の全部また
は一部に、所望の蛋白の構造遺伝子を結合するには、適
当な結合手(DNA) を用いることができ、生産された融合
蛋白のうちこの結合手塩基配列に対応して翻訳されたペ
プチドまたはアミノ酸（連結部）を適当な手段で切断す
れば所望の蛋白が生産され、これを常法により単離する
ことができる。融合蛋白それ自体で有用な場合は当然切
断操作は不用であり結合手がなくてもよい。

【００１２】結合手に対応したペプチドまたはアミノ酸
（連結部）と、その切断・分解法としては、Ile-Glu-Gl
y-Arg の配列を切断する血液凝固因子Xa（F-Xaと略示す
る)、Pro-Ama-Gly-Pro (Amaは任意のアミノ酸）のアミノ
酸配列を AmaとGly の間で切断するコラゲナーゼ、 Arg
またはPhe の後を切断するトリプシン、 Tyr またはPhe
の後を切断するキモトリプシン、 Pro-Arg の後を切断す
るスロンビン、トリプトファンを分解するＮ−ブロムコ
ハク酸イミドまたはメチオニンを分解する臭化シアン等
がよく知られている（文献４〜１３）。

【００１３】連結部とその切断・分解法は必ずしもこれ
らに限定はされず、種々のペプチドまたはアミノ酸と化
学的あるいは酵素的方法を組合せて利用すればよい。

【００１４】所望の蛋白中には上記の連結部の切断・分
解法で分解されるべきペプチドあるいはアミノ酸が含ま
れていないのが望ましい。しかし、適当に緩和な条件を
設定して限定的に分解し、目的を達することも可能であ
る。

【００１５】所望の蛋白とは種々の生理活性物質、診断
用試薬物質、工業的に有用な酵素類等、食品添加物およ
び飼料添加物等を意味し、例えばインターフェロン（IF
N)類、腫瘍壊死因子(TNF)、インターロイキン等のリン
ホカイン類、インシュリン、成長ホルモン等のホルモン
類、肝炎ワクチン、インフルエンザワクチン等の多種の
抗原蛋白類、さらに組織プラスミノーゲン活性因子(TP
A) やソマトメジン、アシラーゼ、リパーゼ、アミラー
ゼ、ステロイド変換酵素等の酵素類を挙げることができ
る。

【００１６】また物質によってはこれらに糖鎖等が付加
している場合もあるが、真核細胞によりペプチド類を生
産させる本発明の方法では、真核生物遺伝子を使用した
場合にその生体内におけると同様の種々の修飾を受ける
ので、細菌類を用いる方法よりも有用性が高いと言え
る。

【００１７】これらの蛋白をコードする遺伝子は、天然
の原材料から取り出された染色体 DNAもしくはmRNAを経
て作られたcDNA、または化学合成した DNAあるいはそれ
らの手段を組合せて製造したものの何れでもよい。

【００１８】また、目的の物質は、その生理活性等必要
な機能が得られるかぎり、アミノ酸配列に多少の違い
（置換、脱落、付加）が生じても、あるいは意図的にそ
のような修飾をするものであってもよい。例えば、前記
の連結部との関係で、臭化シアンでのメチオニンの分解
を予定するときは、所望の蛋白中のメチオニンを他のア
ミノ酸に替えるか除去することが考えられ、そのような
塩基配列に基いて生産されたペプチド類の活性が目的に
合うか否かを検討すればよい。

【００１９】さらに、２−ニトロ−５−チオシアノ安息
香酸を用いたシステインの化学的分解等で起こるよう
な、アミノ酸の一部分が所望の蛋白に残存することもあ
り得るが、この場合には同様に活性を検討して目的に合
うか否かを決定すればよい。

【００２０】カイコ核多角体病ウイルスDNA(BmNPV DNA)
の多角体蛋白遺伝子の全部または一部と、所望の蛋白の
構造遺伝子を連結した型の（結合手塩基配列を介しまた
は介さない）塩基配列、すなわち融合蛋白の遺伝子、が
組込まれたプラスミド（組換用プラスミド）の製造は、
市販のプラスミド及び制限酵素等を利用して通常のDNA
操作で可能であり、また後述の実施例を参考にすれば容
易に行なうことができる。

【００２１】これを用いて組換ウイルスを製造するに
は、例えばカイコ培養細胞を組換用プラスミドとBmNPV
とで混合感染し、必要に応じてプラーク法（文献１４）
や希釈法（文献15）等により組換ウイルスを単離する。

【００２２】カイコ培養細胞としては、Bm細胞（文献
１、文献１４および文献１６のBM-N細胞:ATCC No.CRL89
10) やATCC No.CRL-8851として寄託されているBM-N細胞
等が知られている。目的物質である蛋白をカイコを用い
て生産するには、培養細胞中で増殖したウイルス（組換
ウイルスと非組換ウイルスの混合物または組換ウイルス
を単離したもの）をカイコに経皮的にまたは体腔内に注
射して感染させ、あるいは人工飼料あるいはクワ葉にウ
イルスを混ぜて与えて感染させ、人工飼料あるいはクワ
葉で適当日数飼育し、目的の融合蛋白を蓄積させ、体液
を採取して遠心分離等で沈殿を集める、あるいはカイコ
を摺りつぶしてドデシル硫酸ナトリウム(SDS) 水溶液、
尿素水溶液、もしくはアルカリ性水溶液で抽出して常法
処理によって得ることができる。融合蛋白を切断する場
合は、先述の如くに切断・分解操作を行えばよい。

【００２３】次に、所望の蛋白としてインシュリン様成
長因子(IGF-I、IGF-II)とインターフェロン（α-IFN) の
実施例を挙げて説明するが、これらは例示にすぎず、限
定的意味はない。プラスミド構築の概略は図１５乃至図
２０に示す。DNA 配列は特に示す以外は慣例により左側
を５´（上流）として、 右側を３´（下流）として示
す。

【００２４】多角体蛋白遺伝子や所望蛋白の遺伝子およ
び融合蛋白遺伝子等の DNA断片の合成、切断、スクリー
ニング、単離等は文献１〜３および一般的遺伝子操作技
術（例えば文献２１及び２２参照）を応用して行うこと
ができる。

【００２５】

【発明の効果】本発明に係る組換カイコ核多角体病ウイ
ルスは、カイコ核多角体遺伝子配列の一部と生産を希望
する蛋白の構造遺伝子の配列を融合させた融合遺伝子に
より構成されることを特徴とする組換カイコ核多角体病
ウイルスであるが、その組換カイコ核多角体病ウイルス
をベクターとして用いることにより、希望する蛋白生産
を行うことができる。

【００２６】つまり、生産を希望する蛋白の構造遺伝子
をカイコウイルス(BmNPV) の規定の部位に導入した組換
カイコ核多角体病ウイルスをカイコ培養細胞又はカイコ
生体に感染させ、一定期間、感染した細胞を培養するこ
とによりその培養細胞内又は細胞外液に、またはカイコ
生体に感染させた場合には感染したカイコを一定期間飼
育することによりそのカイコ生体内に、各々希望する蛋
白を生産することができる。その生産された蛋白は、融
合遺伝子ベクターを用いていない場合に比較して著しく
生産量が多く、更に、その蛋白は真核細胞特有の糖鎖等
が修飾されたものである。

【００２７】更に、本発明に係るプラスミドは、上記の
有用蛋白を生産することのできる組換カイコ核多角体病
ウイルスを作製するための中間的な材料として有用性が
ある。本発明によるベクターの生産方法によれば、その
カイコ組換ウイルスＤＮＡを作製することができる。

【００２８】

【実施例】実施例１ Ａ．多角体遺伝子を除去したプラスミドの構築 プラスミドpBmE36（文献１〜３）をEcoRＩで切断後dNTP
s(４種のデオキシヌクレオシド・トリ・ホスフェート）
存在下 DNAポリメラーゼＩ（クレノーフラグメント）で
平滑末端にした。これをHindIIIで部分分解後アガロー
スゲル電気泳動によって多角体遺伝子を含むフラグメン
トを分離した。これを、pUC9をEcoRI で切断後クレノー
フラグメントによって平滑末端とし、更にHindIIIで切
断したものとT4リガーゼにより結合させた。これで大腸
菌K-12 JM83を形質転換させて、プラスミドを採りp9BmE
36とした（図１５）。

【００２９】開始コドンATG及び終止コドンTAAのところ
にそれぞれEcoRV 及びAatIで認識される部位をインビト
ロミュータゲネシス(in vitro mutagenesis、文献１７）
で導入した（図１５）。すなわち、p9BmE36をエチジウム
ブロマイド存在下で DNaseＩ処理して、ニックドプラス
ミドを作り、これに予め化学合成した次の二種のDNAフ
ラグメントをアニールした（図１）。

【００３０】次いでこれをポリメラーゼＩおよびT4リガ
ーゼで処理し、生じたヘテロデュプレックスプラスミド
で大腸菌K-12 JM83を形質転換し、求めるミュータント
を得るため再度形質転換をおこなってプラスミドp9BmM3
6を得た（図１５）。

【００３１】p9BmM36から多角体遺伝子を除き、ポリリ
ンカーを挿入するために次のDNAフラグメント(38mer二
種）を化学合成した（図２）。

【００３２】これら二本のフラグメントは互いに相補的
であり、アニールした後には SacI、 SmaI、EcoRI、Nco
I、EcoRVおよびXbaIによって認識される部位を生ずる。

【００３３】上記二本のフラグメントをT4カイネースで
５′末端をリン酸化した後アニールさせた。これを、p9
BmM36をEcoRV及びAatIで切断後多角体遺伝子部分を除い
たフラグメントとT4リガーゼにより結合させた。この操
作により新たにリンカーの５′側に BglII、 ３′側にAa
tIで認識される部位が生じる。このプラスミドで大腸菌
K-12 JM83を形質転換しプラスミドを取りpBM030とした
（図１５）。

【００３４】pBM030のポリリンカー部の DNA配列と切断
点をp9BmE36 の多角体遺伝子部分と対応させて示す（図
３）。

【００３５】Ｂ．部分的欠損多角体遺伝子を持つプラス
ミドの作製 プラスミドp9H18（文献１〜３）をEcoRIで切断後Bal31
処理して切断点から両側を削り取らせた。Bal31の処理
時間を変えて、種々の長さの断片を製した。これをHind
IIIで処理し、0.7%アガロースゲル電気泳動で分離、抽
出し、種々の長さのウイルス由来の DNA断片を得た（図
１６）。

【００３６】pUC9をSmaI及びHindIIIで処理し、先に得
た DNA断片（平滑末端及びHindIII末端を有する）とラ
イゲートしてプラスミドを製し、大腸菌K-12 JM83を形
質転換させた。これを増殖させた後プラスミドを採り、
挿入したウイルス由来のDNA断片の３′側からの塩基配
列をプライマー（M13 用 15 base sequencing primer)
を用いて、ダイデオキシ法(dideoxy法：文献１８）によ
り決定し、ウイルスの多角体遺伝子部分を同定した（図
１６）。即ち、セレブリアニらの文献（文献１９）記載
の多角体蛋白のアミノ酸配列に対応する塩基配列をウイ
ルス由来のDNA断片の塩基配列中に見出し、翻訳開始コ
ドンATG及び終止コドンTAAを決定した。

【００３７】Bal31 の処理時間に対応して得られた種々
のプラスミド(p9Bシリーズプラスミド）の内、多角体遺
伝子の翻訳開始コドンATGの下流212bp、338bp、662bp及
び727bp以下が欠損しているものを夫々p9B240、p9B12
0、p9B115及びp9B086とした。なお多角体遺伝子は終止
コドンTAAまで含めて738bpある（図４および図１６）。

【００３８】Ｃ．α−インターフェロンと多角体蛋白と
の融合蛋白の遺伝子の作製 pIFN2B310（文献１〜３）をSmaIで切断しα-IFN-Jフラ
グメントをアガロースゲル電気泳動で分離した。これ
と、 Sma Ｉで切断したpBM030をT4リガーゼで結合し、生
じたプラスミドで大腸菌K-12 JM83を形質転換した。得
られた組換体プラスミドが正しい方向に挿入されたα-I
FN-J遺伝子を持っていることを確認してpBT310とした
（図１７）。

【００３９】pBT310をBglIIで切断後、dNTPs 存在下ク
レノーフラグメントを用いて平滑末端としたのちScaIで
切断した。アガロースゲル電気泳動を行なってα-IFN-J
遺伝子を含むフラグメントを分離した（図１７）。

【００４０】p9B086をEcoRＩ及びScaIで切断し、アガロ
ースゲル電気泳動によって多角体遺伝子を含むフラグメ
ントを分離し、これをS1ヌクレアーゼで平滑末端とした
ものと、先に得たα-IFN-J遺伝子を含む断片とをT4リガ
ーゼで結合した。生じたプラスミドで大腸菌K-12 JM83
を形質転換して、得たプラスミドの結合部の DNA配列が
正しいことをダイデオキシ法で確認してpIFNF086を得た
（図５および図１７）。

【００４１】Ｄ．ＩＧＦ-Iと多角体蛋白との融合蛋白の
遺伝子の作製 大腸菌K12 MC1061 IGF001(FERM BP-932)よりプラスミド
pIGF001を採取し、SalIで切断後dNTPs 存在下クレノー
フラグメントで平滑末端とした後 AvaIIで切断したもの
をポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ないIGF-I 遺伝
子を含むフラグメントを分離した（図１８）。

【００４２】別にpBM030をEcoRV 及び SacI で切断した
（図１８）。

【００４３】融合蛋白を血液凝固因子Xa (F-Xa) が認識
して切断できるように、多角体蛋白とIGF-Ｉとの融合蛋
白を作る際、両者の間にIle-Glu-Gly-Arg のアミノ酸配
列を導入することとした。そのために次の二本のDNA フ
ラグメントを化学合成した（図６）。

【００４４】これら二本のフラグメントは互いに相補的
であり、アニールした後に上流側にSacI切断点と結合で
きる末端を、下流側に AvaII切断点と結合できる粘着末
端を生じる。

【００４５】これらの二本のフラグメントをT4カイネー
スで５′末端をリン酸化した後アニールさせ、上記のIG
F-Ｉのフラグメントおよび切断されたpBM030とをT4リガ
ーゼを用いて結合させた。これで大腸菌K-12 JM83を形
質転換させ組換プラスミドを得た。このプラスミド pIG
F-Ｉ030 は、F-Xa認識部位とIGF-Ｉ遺伝子を正しく結合
していることをダイデオキシ法でDNA 配列を決定して確
認した。 pIGF-Ｉ030を BglIIで切断後dNTPs 存在下ク
レノーフラグメントで平滑末端とした後、ScaIで切断し
アガロースゲル電気泳動でIGF-I 遺伝子を含むフラグメ
ントを分離した（図１８）。

【００４６】別に、p9B086をEcoRI 及びScaIで切断後S1
ヌクレアーゼで平滑末端とし、アガロースゲル電気泳動
で多角体遺伝子を含むフラグメントを分離し、これと先
のIGF-I 遺伝子を含むフラグメントとをT4リガーゼで結
合した。生じたプラスミドで大腸菌K-12 JM83を形質転
換させ、正しく結合した融合蛋白遺伝子を持っているプ
ラスミドpIGF-IF086を得た（図１８）。結合部分の DNA
配列を示す（図７）。

【００４７】Ｅ．ＩＧＦ−IIと種々の長さの多角体蛋白
との融合蛋白の遺伝子の作製大腸菌K12 MC1061 IGF002
(FERM BP-933) よりプラスミドpIGF002 を採取し、SalＩ
で部分分解後、dNTPs 存在下クレノーフラグメントで平
滑末端となし、次いで HaeIIIで切断したものをポリア
クリルアミドゲル電気泳動を行ない、IGF−II遺伝子を
含んだフラグメントを分離した。これを、pBM030をSmaI
で切断したものとT4リガーゼを用いて結合させ、大腸菌
K-12 JM83を形質転換した。得られた形質転換体がIGF-I
I遺伝子が正しい方向に挿入されているプラスミド pIGF
-II 030 を持っていることを確認した（図１９）。

【００４８】pIGF-II 030 をEcoRI で部分分解後ScaIで
切断し、アガロースゲル電気泳動でIGF-II遺伝子を含む
フラグメントを分離した。これと、 p9B240、 p9B120ある
いはp9B115をEcoRI 及びScaIで切断した後アガロースゲ
ル電気泳動で分離した多角体遺伝子の一部を含むフラグ
メントとを、Ｔ４リガーゼで結合させた（図１９）。

【００４９】生じたプラスミドで大腸菌K-12 JM83を形
質転換し、得られた形質転換体がもつプラスミドは、正
しく結合した融合蛋白の遺伝子をもっていることをダイ
デオキシ法でDNA 配列を調べて確認した。

【００５０】これらのプラスミドをおのおの pIGF-II F
240、pIGF-II F120あるいは pIGF-II F115とした（図１
９）。

【００５１】各プラスミドの結合部分の DNA配列を示す
（図８）。

【００５２】実施例２：Bm細胞へのトランスフェクショ
ン BmNPV T3株のウイルス DNA（ATCC N0.40188)とpIFN F08
6 をモル比で１：１００になるようにし、下記組成液Ｉ
とIIを混合した。

【００５３】 Ｉ． 蒸留水 2.1 ml キャリアDNA （鮭精巣、1mg/ml) 50 μl BmNPV DNA (1mg/ml) 10 μl pIFN F086 DNA 50 μg 2M塩化カルシウム液 300 μg II． 0.28M 塩化ナトリウム含有の50mM HEPES緩衝液(pH 7.1) 2.5 ml リン酸緩衝液 (35mM Na₂HPO₄-35mM NaH₂PO₄) 50μl

【００５４】生じた懸濁液の１mlをBm細胞培養用培地(1
0%牛胎児血清を含む TC-10培地（文献２０）４mlに加
え、これをBm細胞(ATCC No.CRL 8910:2×10⁶ 個）が培
養されている（５mlの培地が残っている）培養器中に加
えることにより、上記DNAをBm細胞内へ導入した。２０
時間後に新鮮な培地と交換し、更に５日間培養後、培地
を回収した。これを遠心して上清をとり、プラークアッ
セイ法（文献１４）によってクローン化した組換ウイル
スを採取し、これをvIFN F086とした。

【００５５】同様にして、pIGF-Ｉ F086、pIGF-II F24
0、pIGF-II F120およびpIGF-II F115より組換ウイルスv
IGF-ＩF086、vIGF-II F240、vIGF-II F120およびvIGF-I
I F115を得た。

【００５６】実施例３： Bm細胞での融合蛋白の発現 Bm細胞(ATCC No. CRL 8910:2×10⁶ 個）に vIFNF086 懸
濁液(5×10⁷pfu)を加えて感染させ、３０分後に上清を
除去し、新鮮な培地 4.5mlを加えて２５℃で４日間培養
後、培養物を集めて遠心し（1,000rpm,10分）沈殿を採
取した。これに新鮮な培地 500μl を加え、凍結−融解
を 5回繰り返した後遠心（15,000rpm,10分）して沈殿を
採取した。これに４％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)-１
０％メルカプトエタノール 200μl を加えて溶かし、そ
のうち５μl をSDS-１４％アクリルアミドゲル電気泳動
のサンプルとした。

【００５７】電気泳動後、 ゲルに融合蛋白に相当するバ
ンドが認められたので、その濃さをデンシトメーターで
測定し、マーカー（各バンド 1μg の蛋白を含む）の濃
さとの比較によって生産量を測定したところ、最初の細
胞培養液 1mlあたり0.3mg であった（この融合蛋白のう
ち、IFN部分は分子量の計算から約 40%を占めているの
で、IFNを分離すれば 0.12mg/ml 生産されていることに
なる）。これを従来のカイコ細胞で IFNを発現させた報
告（文献1)に示された値 5×10⁶ U/ml（これは0.00５mg
/ml になる）と比較すると２０倍以上に相当する。

【００５８】同様にして、vIGF-Ｉ F086、vIGF-II F24
0、vIGF-II F120 及びvIGF-II F115を感染させたBm細胞
が生産する融合蛋白の量を測定したところ各々の細胞培
養液１ml当り0.5mg、0.1mg、0.4mg及び0.5mgであった
（分子量から計算するとこれらの融合蛋白中に含まれる
IGF-ＩあるいはIGF-IIの量は0.1mg/ml、 0.05mg/ml、0.1m
g/ml及び0.1mg/mlである）。

【００５９】実施例４：Bm細胞での融合蛋白の発現およ
び臭化シアン（BrCN) による切断 Bm細胞(2×10⁶ 個）に vIGF-II F120懸濁液(5×10⁷pf
u）を加えて感染させ、30分後ウイルスを除き、新鮮な
培地4.5mlを加えて２５℃で４日間培養後培養物を集め
て遠心(1,000rpm、１０分）し沈殿を採取した。これに新
鮮な培地500μlを加え、凍結−融解を５回繰り返した後
遠心(15,000rpm、１０分）し沈殿を採取した。この沈殿
を蒸留水で洗浄後、0.5％ SDSで溶解させ、高速液体ク
ロマトグラフィー(TSKゲル フェニル5PWRP(東洋曹達
（株））溶媒系：0.1%トリフルオロ酢酸−アセトニトリ
ル 20%〜75% の直線濃度勾配）によって融合蛋白を含む
2mlのフラクションを取つた。これに1% SDSを50μl 加
え濃縮乾固させた後50μl の蒸留水に溶かし、このうち
15μl をとり、蟻酸35μl および70% 蟻酸45μl を加え
る。これに臭化シアンの70% 蟻酸溶液(200μmol/ml)5μ
l を加え、室温で24時間反応後濃縮乾固させ、 7.5μl
の蒸留水に溶かし、電気泳動を行ったところIGF-IIに相
当するバンドを検出できた。

【００６０】すなわち、SDS-16% ポリアクリルアミドゲ
ルを用いた電気泳動では、vIGF-II F120を感染させたBm
細胞よりSDS 水溶液で抽出し、高速液体クロマトグラフ
ィーで部分精製したフラクションには、多角体蛋白（部
分）とIGF-IIとの融合蛋白に相当するバンドが約２３Ｋ
に、これを臭化シアンで分解したものには、IGF-IIに相
当する約7Kのバンドおよび多角体蛋白の分解物と推定さ
れる１０〜１４K の数本のバンドが認められた。

【００６１】IGF-IIのアミノ末端の決定 上記の方法と同様にして、vIGF-II F120に感染させたBm
細胞50ml培養より約20mgの融合蛋白を取り臭化シアンで
切断した後、反応液を濃縮した。

【００６２】この濃縮液を200mM ピリジン−酢酸バッフ
ァー(pH 3.0)に溶かし、カラムクロマトグラフィ(SP-ト
ヨパール（東洋曹達（株））溶媒系：200mM ピリジン−
酢酸バッファー（pH 3.0）〜2.0Mピリジン−酢酸バッフ
ァー（pH 5.0）の直線濃度勾配）によってIGF-IIを含む
フラクションを採った。このフラクションを凍結乾燥し
た後、蒸留水に溶解し、高速液体クロマトグラフィ( OD
S-120T（東洋曹達（株））溶媒系：0.1%トリフルオロ酢
酸−アセトニトリル 10%〜65% の直線濃度勾配）によっ
て精製してIGF-IIを得た。ペプチドシーケンサー（470A
プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステムズ
社))によってこのIGF-IIのアミノ末端側のアミノ酸配列
を調べた。確認された配列は以下に示す通りである（図
９）。

【００６３】実施例５: Bm細胞による融合蛋白の生産
とコラゲナーゼによる切断 大腸菌K12 MC1061 IGF001(FERM BP-932) よりプラスミ
ド pIGF001を採取した。これをSalIで切断し、dNTPs 存
在下クレノーフラグメントで平滑末端とした後Ava IIで
切断したものをポリアクリルアミドゲル電気泳動を行な
い、IGF-I 遺伝子を含むフラグメントを分離した（図２
０）。

【００６４】別に pIGF-II F120をEcoRＶ及び EcoRIで
切断しIGF-II遺伝子を取除いた（図２０）。

【００６５】Pro-Ama-Gly-Pro（Ama は任意のアミノ
酸）のアミノ酸配列をAma とGly の間で切断するコラゲ
ナーゼが認識して切断できるように、多角体蛋白とIGF-
IIとの融合蛋白を作る際、両者の間にGly-Pro-Ala-Gly-
Pro-Ala のアミノ酸配列を導入することとした。そのた
めに次の二本の DNAフラグメントを化学合成した（図１
１）。

【００６６】これら二本のフラグメントは互いに相補的
であり、アニールした後に上流側にEcoRＩ切断点と結合
できる末端が、下流側にAva II切断点と結合できる粘着
末端が生じる。

【００６７】これら二本のフラグメントを、Ｔ４カイネ
ースで５′末端をリン酸化した後アニールさせ、これと
上記のIGF-Ｉのフラグメント及び切断された pIGF-II F
120とをＴ４リガーゼを用いて結合させた。これで大腸
菌K-12 JM83を形質転換させ、組換プラスミドを得た
（図２０）。このプラスミド pIGF-IF120 は、コラゲナ
ーゼ認識部位とIGF-Ｉ遺伝子が正しく結合していること
をダイデオキシ法で DNA配列を決定して確認した。

【００６８】結合部分の DNA配列及び対応アミノ酸を示
す（図１１）。

【００６９】実施例２に述べた方法と同様にしてpIGF-I
F120を用いて組換えウイルスvIGF-IF120を得た。

【００７０】実施例４に述べた方法と同様に、vIGF-IF1
20に感染したBm細胞を50ml培養より集め、凍結−融解処
理を行ない遠心し（15,000rpm、１０分）、沈殿を採取
した。これを6M塩酸グアニジンで抽出し、遠心して(15,
000rpm、５分）残渣を除いた後、透析を行ない、生じた
沈殿を遠心(15,000rpm、１０分）で集めた。

【００７１】これを800μlの10M尿素に溶かし、200mM
塩化カルシウム 100μl、 250mMトリス−塩酸(pH 7.4) 2
00μl を加えた。これにコラゲナーゼ水溶液(1,500U/m
l: シグマケミカル社製)900μl を加え、３０℃で２時
間反応後、遠心（15,000rpm、５分）し、上清を採っ
た。これをイオン交換クロマトグラフィ（DEAE−トヨパ
ール（東洋曹達（株）））溶媒系: 25mMトリス−塩酸
（pH 7.4）にかけ、N末端に余分のアミノ酸配列をもつIG
F-I(IGF-IPと略示する）を含むフラクションを取った。
これを濃縮後高速液体クロマトグラフィ(RPSC(ベックマ
ン社）溶媒系: 0.1%トリフルオロ酢酸−アセトニトリル
10%〜65% 直線濃度勾配）によってIGF-IPを精製した。
このIGF-IPの N末側のアミノ酸配列を470Aプロテインシ
ーケンサー（アプライドバイオシステム社）を用いて調
べたところ、融合蛋白は、コラゲナーゼによって正しい
位置で切断されていることが判った。

【００７２】確認されたIGF-IPのアミノ末側のアミノ酸
配列は次の通りである（図１２）。

【００７３】実施例６：カイコ個体での多角体−ＩＧＦ
−Ｉ融合蛋白の発現 ５令 1日目のカイコに、vIGF-ＩF086懸濁液 0.5ml/ 匹
（10⁷pfu）を経皮的に注射し、２５℃で３日間、クワ葉
を与えて飼育後、腹脚に採取針をさして体液を氷冷した
エッペンドルフ・チューブに採取し、遠心（15,000rpm,
１０分）し沈殿を採った。これに4% SDS-10%メルカプト
エタノール 200μl を加えて溶かし、そのうちの 2μl
をSDS-14% アクリルアミドゲル電気泳動のサンプルとし
た。電気泳動後ゲルに融合蛋白に相当するバンドが認め
られたので、その濃さをデンシトメーターで測定し、マ
ーカー（各バンド 1μg の蛋白を含む）の濃さとの比較
によって生産量を測定したところ、体液 1mlあたり5mg
であった（この融合蛋白からIGF-Iを分離するとすれ
ば、分子量の計算から 1mg/ml とれることになる）。

【００７４】SDS-14% ポリアクリルアミドゲルを用いた
電気泳動では、 BmNPV-T3株感染カイコ体液が約30K に多
角体蛋白に相当する明瞭なバンドを示すのに対し、vIGF
-ＩF086感染カイコ体液には多角体蛋白に相当するバン
ドがなく多角体蛋白とIGF-Iとの融合蛋白の特徴あるバ
ンドが約36K に認められた。実施例で用いたIGF-Ｉ及び
IGF-IIの合成遺伝子のDNA 配列とアミノ酸配列を次に示
す（図１３〜２０）。

【００７５】文献 1: Nature 315 592(1985) 文献 2: 特開昭61-9288 号公報 文献 3: 特開昭61-9297 号公報 文献 ４： Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８ １０５６（１９
７７） 文献 ５： 特開昭54-145289 号公報 文献 6: 特開昭55-19092号公報 文献 7: 特開昭55-45395号公報 文献 8: 特開昭55-104886 号公報 文献 9: 特開昭56-145221 号公報 文献10: 特開昭56-166200 号公報 文献11: Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,4692(1984) 文献12: Nature 309 810(1984) 文献13: Nature 285 456(1980) 文献14: J.Seric.Sci.Jpn.,53 547(1984) 文献15: J.Invertebr.Pathol.,29 304(1977) 文献16: Appl.Environ.Microbiol.,44 227(1982) 文献17: Nucle.Acids Res.,9 3647(1981) 文献18: Science 214 1205(1981) 文献19: J.Invertebr.Pathol.,30 442(1977) 文献20: J.Invertebr.Pathol.,25 363(1975) 文献21: Am.J.Hum.Genet.,31 531(1979) 文献22: T.Maniatis et al.Molecular Cloning; Cold S
pring Harbor Laboratory(1982)

【図面の簡単な説明】

【図１】 インビトロミュータゲネシスに用いた二種類
のフラグメントのＤＮＡ配列

【図２】 ポリリンカーを挿入するためのフラグメント
のＤＮＡ配列

【図３】 pBM030のポリリンカー部のＤＮＡ配列及び切
断点

【図４】 部分的欠損多角体遺伝子をもつプラスミドの
ＤＮＡ配列

【図５】 pIFN086 の結合部のＤＮＡ配列

【図６】 Ｆ−Ｘａ認識アミノ酸配列を導入するための
フラグメントのＤＮＡ配列

【図７】 pIGF-IF086の結合部のＤＮＡ配列

【図８】 各プラスミドノ結合部のＤＮＡ配列

【図９】 IGF-IIのアミノ末端側のアミノ酸配列

【図１０】 コラゲナーゼ認識アミノ酸配列を導入する
ためのＤＮＡフラグメントの配列

【図１１】 pIGF-IF120の結合部のＤＮＡ配列および対
応するアミノ酸配列

【図１２】 IGF-IPのアミノ末端側のアミノ酸配列

【図１３】 IGF-Ｉの合成遺伝子のＤＮＡ配列と対応ア
ミノ酸配列

【図１４】 IGF-IIの合成遺伝子のＤＮＡ配列と対応ア
ミノ酸配列

【図１５】 組換ウイルス製造用プラスミド作成例の概
略

【図１６】 組換ウイルス製造用プラスミド作成例の概
略

【図１７】 組換ウイルス製造用プラスミド作成例の概
略

【図１８】 組換ウイルス製造用プラスミド作成例の概
略

【図１９】 組換ウイルス製造用プラスミド作成例の概
略

【図２０】 組換ウイルス製造用プラスミド作成例の概
略

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 佐藤 嘉生 東京都江戸川区北葛西一丁目16番13号 第一製薬中央研究所内 (72)発明者 佐伯 欣之 東京都江戸川区北葛西一丁目16番13号 第一製薬中央研究所内 審査官 斎藤 真由美

Claims (12)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カイコ核多角体病ウイルスDNA(BmNPV DN
   A)の多角体蛋白構造遺伝子部分に、（）その遺伝子の
   全部または一部と、（）所望の蛋白の構造遺伝子を、
   （）結合手塩基配列を介してまたは介さずに連結した
   型の塩基配列を有する、組換カイコ核多角体病ウイル
   ス。
2. 【請求項２】 カイコ核多角体病ウイルスDNA(BmNPV DN
   A)の（）プロモーター部分を含む5 ′上流塩基配列に
   続いて、（）多角体蛋白構造遺伝子の全部または一部
   があり、次に（）結合手塩基配列があることもあり、
   さらに（）所望の蛋白の構造遺伝子（（）その蛋白
   のターミネイターを含んでもよい）および（）カイコ
   核多角体病ウイルスDNA のターミネイター配列を含むま
   たは含まない（）3 ′下流塩基配列を有するプラスミ
   ド。
3. 【請求項３】 カイコ核多角体病ウイルスDNA(BmNPV DN
   A)の（）プロモーター部分を含む5 ′上流塩基配列に
   続いて（）多角体蛋白構造遺伝子の全部または一部が
   あり、次に（）結合手塩基配列があることもあり、さ
   らに（）所望の蛋白の構造遺伝子（（）その蛋白の
   ターミネイターを含んでもよい）および（）カイコ核
   多角体病ウイルスDNA のターミネイター配列を含むまた
   は含まない（）3 ′下流塩基配列を有するプラスミド
   とBmNPV DNA とでカイコ培養細胞またはカイコを混合感
   染させることを特徴とする組換BmNPV DNA の製造法。
4. 【請求項４】 結合手塩基配列（）が、特定のアミノ
   酸配列を認識して切断する蛋白分解酵素又は化学試薬に
   より認識・切断されるようなその特定アミノ酸配列をコ
   −ドする塩基配列を一部に含むＤＮＡ塩基配列からな
   る、請求項１に記載の組換カイコ核多角体病ウイルス。
5. 【請求項５】 結合手塩基配列（）が、特定のアミノ
   酸配列を認識して切断する蛋白分解酵素又は化学試薬に
   より認識・切断されるようなその特定アミノ酸配列をコ
   −ドする塩基配列を一部に含むＤＮＡ塩基配列からな
   る、請求項２に記載のプラスミド。
6. 【請求項６】 結合手塩基配列（）が、特定のアミノ
   酸配列を認識して切断する蛋白分解酵素又は化学試薬に
   より認識・切断されるようなその特定アミノ酸配列をコ
   −ドする塩基配列を一部に含むＤＮＡ塩基配列からな
   る、請求項３に 記載の組換BmNPV DNA の製造法。
7. 【請求項７】 蛋白分解酵素がコラゲナ−ゼ、又は、フ
   ァクタ−Ｘａである請求項４に記載の組換カイコ核多角
   体病ウイルス。
8. 【請求項８】 蛋白分解酵素がコラゲナ−ゼ、又はファ
   クタ−Ｘａである請求項５に記載のプラスミド。
9. 【請求項９】 蛋白分解酵素がコラゲナ−ゼ、又はファ
   クタ−Ｘａである請求項６に記載の組換BmNPV DNA の製
   造法。
10. 【請求項１０】 化学試薬が臭化シアンである請求項４
    に記載の組換カイコ核多角体病ウイルス 。
11. 【請求項１１】 化学試薬が臭化シアンである請求項５
    に記載のプラスミド 。
12. 【請求項１２】 化学試薬が臭化シアンである請求項６
    に記載の組換BmNPVDNA の製造法 。