JPH06504036A - 精製が向上される組換えポリペプチドの発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 がａ　される　えボッペプチドの １籠立Ｉ 本発明は、ホルモンペプチド因子の分子生物学および組換えＤＮＡ技術に関する 。より詳しくは、本発明は、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）と、その 治療上の用途と、活性ＡＮＰの産生方法とに関する。

及匪亘！１ 組換え発現によるタンパク質およびペプチドの産生は比較的一般的にはなってき たが、薬学的投与または診断アッセイに十分なほどの純度を有する、活性型のタ ンパク質およびペプチドの発現、およびそれに続く精製は、まだ、困難で複雑な 作業である。さらに、商業的に入手可能な方法のみを用いざるを得ない場合には 、この作業はさらに困難である。

ペプチドの組換え発現は、典型的には、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列 を、発現ベクターに挿入することによって行われる。発現ベクターは、通常、宿 主細胞によって認識される調節配列を含有し、これによって、ペプチドに挿入さ れたＤＮＡの転写および翻訳を行う。発現ベクターは、適切な宿主細胞、典型的 には細菌、酵母、または培ＩＩ＠乳動物細胞に挿入される。さらに、発現ベク゛ ターは、通常、選択マーカーを含有し、それによって、うまく形質転換され、ベ クターを有する細胞を同定し得、そしてその細胞を、ベクターを有しない細胞か ら分離し得る。

ペプチドは、「直接に」、あるいは、融合タンパク質の形態で発現させ得る。直 接発現では、改変のない所望のペプチドが産生されるが、収率が低く、小さなペ プチドとなることが多い。大半の宿主細胞は、異種ペプチドを認識し、その分解 をもたらすことができるように思われる。

融合タンパク質は、問題のペプチドに結合する、相当な大きさのリーダータンパ ク質を有する。このリーダータンパク質は、β−ガラクトシダーゼの場合によう に、宿主に自生であることが多い。融合タンパク質は、同じリーディングフレー ムに結合した、ペプチドのコード配列に結合するリーダータンパク質のコード配 列を含有するベクターの発現によって得られる。内在性リーダータンパク質を用 いると、異種ペプチドの分解を阻止する傾向があるため、融合タンパク質は、小 さなペプチドと共に用いられることが多い。しかし、宿主細胞に不溶性の封入体 が形成されることが多いため、融合タンパク質の精製は困難であることが多い。

また、内在性リーダータンパク質を用いると、細胞に内在性のその他のタンパク 質からの融合タンパク質の分離も妨げる。さらに、ちとのペプチドを得るために は、リーダータンパク質を切断し、それを所望のペプチドから分離しなければな らない。従って、重要なことに、より多（の工程が必要であり、これが生成物の 損失につながる。

Ｆ、Ｊ、Ｂａ１ｌｅｙら、Ｊ　Ｉｎｄｕｓｔ　Ｍ　ｃ　ｏｂｌｏ　（１９８７） 　ｉ：４７−５２は、ＣｂｅＹをリーダータンパク質として用いた、融合タンパ ク質としての、Ｅ、　ｃｏｉｌにおける心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ ）の発現を開示した。

Ｂｒｅｗｅｒら、米国特許第４．８８０．９１１号は、高い電荷を持つアミノ酸 ポリマーを有する融合タンパク質としての、ウロガストロン（上皮増殖因子）の 発現を開示した。このペプチドは、塩基性アミノ酸、好ましくは２−３０個のＡ ｒｇ残基のＣ−末端伸長で発現する。発現に続いて、ポリ〜Ａｒｇテールによっ て伝えられた高い正の電荷を用いて、融合タンパク質を単離し得る。

このテールは、カルボキシペプチダーゼＣなどのエキソペプチダーゼを用いて除 去し得る。

ｆ、Ｌ、Ｓｕｎｇら、ｒｏｅ　Ｎａｔ　Ａｅａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳ　（１９８６） 　Ｌｌ：５６１−６５は、各アミノ酸の６個または７個の繰り返しに続いてｓ　 ＣＮＢｒでの切断が可能なリンカ−によってプロインシュリンのアミノ末端に融 合された、短い（８個のアミノ酸）β−ガラクトシダーゼリーダーを有する融合 タンパク質としての、プロインシュリンの発現を開示した。Ｓｕｎｇは、ヘキサ マーまたはヘプタマーがＧｉｎ、　ＡａｎＳＴｈｒ、　Ｓｅｒ％Ａｌａ、　Ｈｌ ｇまたはＣｙｓである融合タンパク質（たとえば、β−ｇａｌ−Ｇｉｎｓ−プロ インシュリン）が、最も高い割合で発現することを見いだした。

５ｈｅｎら、ＥＰ　１６３，４０６は、リーダータンパク質およびタンデム繰り 返しにそのペプチドの多重コピーを含有する、融合タンパク質としての、小さな ペプチドの発現方法を開示した。

５ｈｅｎは、β−ガラクトシダーゼをリーダータンパク質として用い、インシュ リンの多重コピーを、切断可能なリンカ−配列（トリプシンおよびカルボキシペ プチダーゼＢで切断する）で分離した。Ｃｏｃｋｌｅら、−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐ ｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：　Ｍｉｃｒｏ　ｔ。

Ｍａｃｒｏ−（１９８７，Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ）　ｐｐ、３７５ −８１も参照のこと。

Ｃｏｈｅｎら、米国特許第４．７４３．６７９号は、２００個までのアミノ酸（ 好ましくは７５個まで）のリーダーを有する融合タンパク質としての、上皮増殖 因子（ＥＧＦ）の発現を開示した。このリーダーおよびＥＧＦペプチドは、Ｇｌ ｕ残基によって結合され、５ｔａｐｈ　Ｖ８によって切断される。ＥＧＦの三次 構造は、明らかに、ｖ８による切断から、その内部のＧｌｕ残基を保護した。こ の融合タンパク質は、不溶性封入体として細菌に発現された。リーダーポリペプ チドは、　（ト末端に）　Ｍｅｔを１個だけ、　（ＥＧＦに結合される部分に） 　Ｇｌｕを１個だけ有し、Ｃｙｓを有さないように選択された。

Ｈｏｂｄｅｎら、ＧＢ　２，１８０，５３９は、キャリアポリペプチドを有する 融合タンパク質としてペプチドを発現させることによる、八ＮＰの産生方法を開 示した。このキャリアポリペプチドは、短いへＮＰペプチドの分解を抑制した。

この融合タンパク質は、プロテアーゼによって切断される部位を含有するリンカ −を介して、ＡＭＰペプチドに結合したキャリアポリペプチドからなっていた。

開示されたプロテアーゼは、哺乳動物消化管タン／（り質分解酵素エンテロキナ ーゼ、トロンビン、プラスミン、コラゲナーゼ、５ｔａｐｈ　Ｖ８、Ｘａ因子お よびエンドペプチダーゼｌｙｓ　Ｃであった。好ましいキャリアポリペプチドは 、Ｅ、　ｃｏｌｔクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ） 遺伝子に由来していた。この融合タンパク質は、タンパク質分解前に精製され得 、キャリアポリペプチドの免疫学的特性に基づいてアッセイされ得るとＨｏｂｄ ｅｎは示唆した。

Ｍａｔら、Ｅ／Ｐ　２Ｇ７，０４４は、内在性ポリペプチドリーダーと、エンド ペプチダーゼ「トリガーシグナル」　（切断部位）と、ペプチドとを含有する融 合タンパク質としての、小さなペプチドの発現を開示した。Ｍａｔは、ペプチド を完全放出し得るように、リーダータンパク質においてはトリガーシグナルを除 くことが好ましいと教示した。内在性タンパク質の完全な状態を維持することに よっても、その後のペプチドの精製が簡略化される。

Ｍａｉが開示したプロテアーゼは、トリプシン、プラスミン、エンテロキナーゼ 、カリクレイン、ウロキナーゼ、ｔＰＡ、クロストリパイン、キモトリプシン、 ペプシン、キモシン、コラゲナーゼ、う・１セルクサリヘビ蛇毒プロテアーゼ、 ポストプロリン分解酵素、５ｔａｐＨＶ８、Ｘａ因子、および、５ｔａｐｈ　Ｖ ８、Ｘａ因子を有するトロンビンであり、トロンビンが好ましい。開示されてい る、リーダーとして用いるのに適切な内在性タンパク質は、クロラムフェニコー ルアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）　、　β−ガラクトシダーゼおよびｒ ｅｃＡであった。

ＲｅｃＡは、ＤＮＡと相互作用する、Ｅ、　ｅｏｌｉおよびその他の微生物に見 られる核タンパク質であり、高い負の電荷を有する。

ｒｅｃＡをリーダータンパク質として用いると、ｒｅｃＡタンノ寸り質をその他 の細菌タンパク質から単離するのに、アニオン交換クロマトグラフィーなどの方 法を用い得るため、その後の融合タンパク質の精製が向上されるとＭａｉは開示 した。Ｍａｉは、細胞ペースト抽出物をアニオン交換カラムに供し、　Ｎａｃｌ グラジェントまたはＮＨｊＣｌグラジェントで溶出し、これによって約８０％の 細菌タンパク質を除去することによって、ｒｅｃＡ融合タ融合タンパクモの他の 細菌タンパク質から分離した。融合タンパク質をｖ８プロテアーゼで分解した後 、アニオン交換樹脂に結合させることによって、または逆相ＨＰＬＣによって、 異種タンパク質をｒｅｃＡ部分から分離した。

心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）は、潜在的利尿活性およびナトリウム 利尿活性、並びに血圧降下を示す、心房筋肉細胞に見られる３　ｋＤａのペプチ ドである。これは、通常、アミノ末端に長いｐｒｏセグメント（１４−１６のｋ Ｄａ）を有する、プロペプチドの盟で発現される。八ＮＰは、１９８５年５月８ 日出願のＪｏｈｎｓｏｎら、米国特許第４．７０．５０４号、および１９Ｂ６年 ６月５日出願のＵＳＳＮ　８７０．７９５に開示されているが、これらは、参考 として本明細書に援用されている。

ｌ肌ｑ皿示 我々は、異種ペプチドのキャリアとして、ヒトｐｒｏＡＮＰのｐｒＯ部分を用い ることによる、融合タンパク質としてペプチドを発現する改良方法を開発した。

この方法において、通常ｐｒｏＡＮＰ＜７）ｐｒｏ部分に存在する各Ｇｌｕ残基 が、たとえば、部位特異的変異誘発によって、Ｇｉｎに変換される口ｐｒｏＡＮ Ｐのｐｒｏ部分および異種ペプチドは、ｖ８切断部位によって結合されるが、こ の部位は、５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｅｃｕｓ　ａｕｒｅａｓ　Ｖ８プロテアーゼを 用いた切断が可能である。あるいは、本明細書に記載のペプチド発現方法を用い て、本発明の最終ペプチドを得るためには、その池のプロテアーゼおよび化学的 切断方法も用い得る。変換されたｐｒｏＡＮＰのｐｒｏ部分は、高い等電点を示 し、これによって、その他の全ての宿主細胞タンパク質、核酸、パイロジエン等 からの融合タンパク質の分離、および切断後のペプチドからのキャリアの分離が 促進される。

の　な曇　Ｉ 図１は、ベクターｐｈＮＦ１１７のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す 。β−ｇａｌ−（ｔｈｒ）６リーダーベブチドアミノ酸配列は、イタリック体で 示し、ｐｒｏ−ＡＮＰ配列は通常の字体で示している。アミノ酸配列のＡＮＰ部 分は太字で示している。ＧｌｕからＧｉｎへ変換された残基には、下線を施した 。

図２は、ベクター１１１ｈＮＦＩＺＯ−１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配 列を示す。β−ｇａｌ−（ｔｈｒ）８リーダーペプチドアミノ酸配列は、イタリ ック体で示し、ｐｒｏ−へＨＰ配列は通常の字体で示している。アミノ酸配列の ＡＮＰ部分は太字で示している。ＧｌｕからＧｉｎへ変換された残基には、下線 を施した。

図３は、５ｔａｐｈ　Ｖ８切断部位を有するＡＮＰコード配列を調製するのに用 いられた、合成オリゴヌクレオチドを示している。

図４は、実施例１（ｂ）に示した、ｐｈＮＦ１１７に用いられる５ｔａｐｈｖ８ 切断部位を有するβ−ｇａｌ−（ｔｈｒ）６リーダーペプチドコード配列を調製 するのに用いられる、合成オリゴヌクレオチドを示す。

図５は、実施例１（ｃ）に示した、ｐｈＮＦ１１７に用いられる５ｔａｐｈｖ８ 切断部位を有する合成ｐｒｏＡＮＰペプチドコード配列を調製するのに用いられ る、合成オリゴヌクレオチドを示す。

図６は、実施例１（ｄ）に示した、ｐｈＮＦ１１７に用いられる５ｔａｐｈｖ８ 切断部位を有する合成ｐｒｏ八Ｎへペプチドコード配列を調製するのに用いられ る、合成オリゴヌクレオチドを示す。

図７は、ＲＰ−ＨＰＬＣで得られた３つのクロマトグラムを示す。

図７　（Ａ）は、カルボキシメチル−セファローズ（登録商標）で精製された、 本発明のＡＮＰ融合タンパク質から得たクロマトグラムを示す。図７（Ｂ）は、 ５ｔａｐｈ−Ｖ８プロテアーゼによる、分解前後のＲＰ−ＦＩＰＬＣによって得 られた、本発明のＡＮＰ融合タンパク質から得たクロマトグラムを示す。図７（ Ｃ）は、本発明のへＮＰ融合タンパク質から得た精製ＡＮＰのクロマトグラムを 示す。

日を　るためのり Ａ、定義 本明細書における用語「融合タンパク質」とは、　（リーダー）−キャリアー切 断部位−異種ペプチドという一般形態を有するキメラポリペプチドを指し；ここ で、「異種ペプチド」とは、生物学的活性、抗原活性などを示す、約１０までの ｋＤａまでのポリペプチドを示し；　「切断部位」は、５ｔａｐｈｙｔｏｃｏｃ ｃｕｓ　ａｕｒｅａｓ　Ｖ８プロテアーゼまたはその他の選択された特異的プロ テアーゼあるいはタンパク質分解法によって加水分解されるアミノ酸配列を指し ；　「キャリア」は、約１０から約５０　ｋＤａのポリペプチドを指し；　「リ ーダー」は、任意のリーダー配列を指す。場合によっては、リーダー配列は、融 合タンパク質の直接分泌に用い得る。

本明細書における用語「異種ペプチド」は、一般に、選択された宿主に内在性で はないペプチドを指すが、その過剰発現を所望する場合には、この定義に内在性 ペプチドをも包含する。異種ペプチドは、はとんどのタンパク質に比べて短く、 一般に、約１０ｋＤａ未満の分子量を有し、グリコジル化、シアリル化、ホスホ リル化などされ得る。このペプチドは、また、組換えワクチンおよび／または免 疫アッセイに用いるのに有用な活性、典型的には生物学的活性（たとえばペプチ ドホルモンとして）、または抗原活性の形態を示す。このペプチドは、キャリア タンパク質からの分離の際に細かくされないように、接触可能なり８切断部位を 有さない。このペプチドは、あらゆる切断部位を省略してもよいし、あるいは、 ペプチドの接触不可能な部分（たとえば、ペプチドのその他の部分によってマス クされた、またはグリコジル化、ホスホリル化などによってマスクされた部分） に部位を有してもよい。ペプチドの活性が維持され得る場合には、選択されたプ ロテアーゼに対する切断部位を本来的に有するペプチドを、たとえば、部位特異 的変異誘発によって、部位が存在しない形態に変換し得る。本発明の範囲に含ま れる代表ペプチドは、制限な（、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳 性ナトリウム利尿ペプチド、ソマトスタチン、グルカゴン様ペプチド、カルシト ニン、肺表面活性剤、インシュリン、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、ブラジ キニン、エンドルフィン、エンケファリン等を包含する。

用ｆ！［キャリアタンパク質」とは、異種ペプチドの発現を安定させるタンパク 質を指し、異種ペプチドと共に本発明の融合タンパク質を形成する。一般に、キ ャリアタンノくり質は、約１０から約５０ｋＤａの分子量を有し、接触可能な内 部切断部位を有さないことが好ましい。キャリアタンパク質は、融合タンパク質 が、内在性宿主細胞タンパク質から容易に分離する範囲にまで、得られる融合タ ンパク質のｐｉを向上させる作用も果たす。約８，０またはそれ以上のｐｌが本 発明では好ましい。キャリアタンパク質は、内在性宿主タンノ（り質にも、その フラグメントにも由来し得、あるいは、塩基性の度合の高いランダム配列でも構 成し得る。好ましくは、キャリアタン、ｆり質は、ＧｌｕまたはＡｓｐ−Ｇｌｙ 残基を含有せず、ｖ８によって多数のフラグメントに切断されるのを抑制してい る。本発明で好ましいキャリアタンパク質は、各Ｇｌｕ残基を中性または塩基性 アミノ酸に変換することによって、ヒトｐｒｏＡＮＰのｐｒｏ領域に由来する。

好ましいキャリアタンパク質は本質的に、以下の配列を有している： （以下余白） ここで、ｘト９は中性または塩基性のアミノ酸であり、スＩおよびＬ＋はＧｌｕ 以外のアミノ酸であり、ジペプチド配列Ａｓｐ−Ｇｌｙを避けて選択される（つ まり、ス１１はＡｓｐではな（、Ｘ＋ａがＡｓｐである場合には、Ｘ＋Ｉはａｔ ｙまたはＡｓｐではない）。本発明の好ましい実施態様においては、ｘト９はそ れぞれＧｌｎである。

Ｂ、−膜力法 二久又二ΩＩＩ： 所望のコードおよび制御配列を含有する適切なベクターの構築には、当業者に周 知の標準的連結反応および制限技術が採用される。単離したプラスミド、ＤＮＡ 配列または合成オリゴヌクレオチドを所望の形態に開裂、調整、および再連結す る。

部位特異的なりＮＡの開裂は、一般には製造者の指示に従って一般に当業者に公 知の条件下で、適切な制限酵素（１つまたは複数の酵素）を用いた処理により行 われ得る。例えば、Ｔ。

Ｍａｎｉａｔｉｓら、”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ−（Ｎｅｖ　Ｙｏｒｋ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２）参照。一般には、約ｌμｇ のプラスミドまたはＤＮＡ配列を約２０μＬの緩衝溶液中で１単位の酵素で開裂 する。本明細書の実施例では、典型的には、過剰な量の制限酵素がＤＮＡ基質を 完全に消化するために用いられる。い（らかの変動は許容範囲であるが、約３７ ℃で約１時間から２時間のインキコバー９９フ時間を行う。

インキコベーシｌンの終了毎に、フェノール／クロロフォルムで抽出、次にジエ チルエーテルで抽出することによりタンパク質を取り除き、そして次にセファデ ックス０Ｇ−５０スピンカラムで分離してエタノール沈澱させることにより、水 性画分から核酸を回収する。所望であれば、開裂したフラグメントのサイズ分離 を、標準技術を用いてポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動に より行い得る。サイズ分離の一般的記述は■植」■■虹（１９８０）廷：４９９ −５６０にある。

制限開裂フラグメントは、５０ｍＭのＴｒｉｓ、　ｐＨ７，６，５（ｌｓＭのＮ ａＣ１，６ｍＭのＭｇＣｌ２．６ｍＭのＤＴＴおよび５−１０ＰＭの４種のデオ キシリボヌクレオチド三リン酸塩（ｄＮＴＰｓ）を含む溶液中で２０から２５℃ で約１５から２５分インキニベーシ箇ンし、Ｅ、　ｅｏｌｉ　ＤＮＡポリメラー ゼ■の大きなフラグメント（フレノウ）で処理することにより平滑末端化され得 る。４種のｄＮＴＰｓが存在するにもかかわらず、フレノウフラグメントは５° 付着末端をうめるが、突出した３°一本鎖に戻る。所望であれば、付着末端の性 質により指示された制限の範囲内で、１−３のｄＮＴＰｓのみを供給することに より、選択的修復が行われ得る。フレノウフラグメントで処理した後、混合物を フェノール／クロロフォルムで抽出し、次にセファデックスＯａ−ｓｏススピン カラム上走査してエタノールを沈澱させる。適切な条件下で３１ヌクレアーゼで 処理すると、どのような一本鎖部分でも加水分解が生じる。

合成オリグヌクレオチドを、Ｍａｔｔｅｕｅｃｉら（ＪｍＣｅｓ＋Ｓ匹（１９８ １）　ｌｑ：３１８５）　ノ）リエステル方法、または市販の自動オリゴヌクレ オチド合成機を用いて調製する。アニーリングの前にまたは標識を行うために、 一本鎖のリン酸化を行う。

反応は、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７，６，１０ｍＭのＭｇＣｌ２．５ｍＭのジ チオトレイトール、１−２ｍＭの＾ＴＰ、１．７μｍｏｌｅの３２Ｐ−ＡＴＰ（ ２，９ｍＣ１／ｖａｏｌｅ）、０．１■Ｍのスペルミジン、および０．１ｍＭの ＥＤＴ＾の存在下で、ポリヌクレオチドキナーゼの過剰な量、例えばＯ，ｉｎ■ ｏｌｅの基質に対して約ｌＯ単位を用いて行う。

連結反応を、１５−３０μＬの容量中で以下の標準条件および温度で行う：　２ ０ｍＭノＴｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，５，１０ｍＭノＭｇＣｌ２．１０ｍＭ＋７ ）ＤＴＴ、　３３μｇ／ｍＬノＢｓＡ、　１０ｍＭ−５０ｍＭ（７）ＮａＣ１， およびＯ”Ｃテ（Ｄ４０ｕＭのＡＴＰ、０．０１−０．０２　（Ｗｅｉｓｓ）単 位のＴ４　ＤＮＡリガーゼ（「付着末端」連結反応用）または１４℃テノ１ｍＭ ノ訂Ｐ％０．３−０．６　（ＩＦｅｉｓｓ）単位のＴ４　ＤＮＡ！Ｊガーゼ（「 平滑末端」連結反応用）。分子間の「付着末端」連結反応は通常、全ＤＮＡ濃度 が３３−１００μｇ／ｍＬで行う（全最終濃度が５−５−１Ｏ０ｎ。分子間の平 滑末端連結反応（通常１０−３０倍モルの過剰なリンカ−を用いる）は全最終濃 度が１８Ｍで行う。

［ベクターフラグメント」を用いるベクターの構築において、ベクターフラグメ ントを通常、バクチリアルアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）で処理し、５°リ ン酸塩を取り除き、ベクターの再連結を防ぐ。ＢＡＰによる消化は、Ｎａ’およ びｙ　ｇ２４を添加した約１５０ｍＭのＴｒｉｓＳｐＨ８中で、ベクターｌμｇ 当り約１単位のＢＡＰを用いて６０℃で約１時間行う。調製物をフェノール／ク ロロフォルムで抽出し、エタノール沈澱させ、セファデックス■Ｇ−５０スピン カラムにかけることにより脱塩して、核酸フラグメントを回収する。他の方法と しては、所望でないフラグメントをさらに制限酵素を加えて二重に消化させるこ とにより、ベクター中での再連結を阻害し得る。

配列の修飾を必要とするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから誘導したベクタ一部分 には、突然変異誘発を導く部位特異的プライマーが用いられ得る。これは、一本 鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドのプライマーを用いること により行われ、所望の突然変異を表す、限定的なミスマツチの突然変異が起こる 。簡潔に言えば、合成オリゴヌクレオチドがファージに相補的な鎖の合成を指示 するプライマーとして用いられ、得られた二重鎖ＤＮＡはファージを支持する宿 主細菌に形質転換される。形質転換された細菌の培養物をトップアガーにプレー トすることにより、ファージを宿す単細胞からのプラークの形成が可能になる。

理論的には、新しいプラークの５０％は一本鎖として突然変異型を有するファー ジを含有し、５０％はもとの配列を有する。

得られたプラークをアレル（ａｌｌｅｌｅ）特異的条件下でキナーゼ化した合成 プライマーとハイブリダイズさせる。一般には、ハイブリダイゼーション溶液中 のカオトロピック剤（１つまたは複数）の温度、イオン強度、および濃度を変え ることにより、「正確な対」が存在しないとプローブは実質的にはハイブリダイ ズしないという条件が得られる。プローブをＤＮＡヘハイブリダイズするための 、標準条件（０，９ＭのＮａＣ１）下での最適温度を計算する実験式は、 Ｔ（”Ｃ）　＊　４（Ｈａ　＋　Ｎｃ）　＋　２（ＮＯ＋ＮＴ）　−５℃であり 、式中Ｎ（１％　ＮＣ％　Ｎｏ、およびＮＴは、プローブ中のＧ、、Ｃ。

Ａ１およびＴ塩基の数である（Ｊ、　Ｍｅｉｎｋｏｔｈら、Ａｎａｏｃｍ（１９ ８４）口８：２６７−８４）。

次に、プローブとハイブリダイズするプラークを取り出して培養し、そしてＤＮ Ａを回収する。

１策凱立豊旦ニ プラスミド構築のための正確な連結反応は、最初に、Ｅ、　ｃｏ１ｉ菌株ＭＭ２ ９４または他の適切な宿主を、連結反応混合物で形質転換することにより確認し 得る。Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４は、Ｅ、　ｃ。

■遺伝子保存センター、ＣＧＳＣ＃１ｉ１３５から得られた。生じた形質転換体 を、当業者に認識されているように、アンピシリン、テトラサイクリンまたは他 の抗生物質耐性によって、あるいはプラスミドの構築に依存する他のマーカーを 用いて選択する。次に、形質転換体からのプラスミドをり、Ｂ、　Ｃ１ｅｗｅｌ ｌら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃ’　ＵＳＡ　（１９６９）　ｉｉ：１ １５９の方法に、次に任意にクロラムフェニコール増幅（Ｄ、　Ｂ、　Ｃｌｅｖ ｅｌｌ％Ｌ力劇ｌ吐虹（１９７２）　、ｌｌ：６６７）によって調製する。単離 したＤＮＡを制限酵素により分析し、そして／あるいはＦ、　Ｓａｎｇｅｒら、 ｕ侭」ｌＬ紅ａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９７？）　７４：５４６３のジデオキ シ方法（この方法はＭｓｓｓｉｎｇら、Ｎｕ　’ｅ　ｃｉｄｓ　Ｒ（１９８ｆ） 　ｉ：３０９にさらに記載されている）、またはＭａｘａｍら、ｔ　ｄｓ　’　 １ｉＬ（１９８０）　旦５：４９９の方法により配列を決定する。

ｌ曵： 本発明のタンパク質は原核生物または真核生物系中のいずれかで発現し得る。原 核生物で最も頻繁に代表されるのは種々のＥ、　ｃｏｌｔ菌株である。しかし、 他の微生物菌株もまた用いられ得る。例えば、バチルス（例えばＢａｃｉｌｌｕ ｓ　５ｕｂｔｔｌｉｓ）、シュードモナスの様々な種、および他の細菌菌株があ る。このような原核生物系には、宿主と適合する種由来の、複製部位および制御 配列を含有するプラスミドベクターを用いる。

例えば、典型的には、Ｅ、　ｃｏｌｔを、Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇａｙ　（１９７ ７）Ｚ：９５によるＥ、　ｃｏｌｉ種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘 導体を用いて形質転換する。通常用いられる原核生物の制御配列は、本明細書で はリポソーム結合部位配列に沿っての転写開始のためのプロモーターを含むもの と定義する。この中には、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース （ｌａｃ）プロモーター系（Ｃｈａｎｇら、■ｕＢ（１９７７）　ｌｊｊ二１０ ５６）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅ　ｌら、Ｎｕ ｃ　ＡｃｔｄｓＲｅｓ　（１９８０）　ｊｊ：４０５７）、およびラムダ由来Ｐ ＬプロモーターおよびＮ−遺伝子リポソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら、 ■■■（１９８１）　出：１２Ｂ）として通常用いられるプロモーターを含む。

しかし、原核生物と適合する入手可能なプロモーター系であればすべて用いられ 得る。

本発明の真核生物系中で有用な発現系は適切な真核遺伝子由来のプロモーターを 包含する。酵母菌中で有用なプロモーターの種類としては、例えば、糖分解酵素 ３−ホスホグリセリレートキナーゼＣＨｉｔｚｅｓａｎら、ＬＬ回」１聾（１９ ８０）　釘」：２０７３）を含む解糖系酵素の合成のためのプロモーターを含む 。他のプロモーターとしてエノラーゼ遺伝子（Ｍ、Ｊ、　Ｈｏ１ｌａｎｄら、Ｌ Ｌ劇」１競（１９８１）　２５６：１３８５）またはＹＥｐ１３から得られたＬ ｅｕ２遺伝子（Ｊ、　Ｂｒｏａｃｈら、Ｇｅｎｅ　（１９７８）　ｉ：１２１） からのプロモーターを含む。

適切な哺乳類のプロモーターは、ＳＶ４０　（Ｐｉｅｒｓら、■口■（１９７ｇ ）　２７３：１１３）からの初期のプロモーターおよび後期のプロモーター、ま たはポリオーマウィルス、アデノウィルス！■、ボビンパピロマウイルス、また はエビアンザルコマウィルスのような他のウィルス性プロモーターを含む。適切 なウィルスおよび哺乳類のエンハンサ−は上述の通りである。植物細胞を発現系 として用いる場合には、ツバリン（ｎｏｐａｌｉｎｅ）合成プロモーターが適切 である（Ａ、　Ｄｅｐｉｅｋｅｒら、Ｌｌｄ−ｕ劇。

Ｇｅｎ　（１９８２）　ｌ：５６１）。昆虫細胞培養物中での発現は、バキニロ ウイルスベクター、例えばバキユロウィルスのＡｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｌｆ ｏｒｎｉｃａ核多角体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）由来の転移ベクターを用いるこ とにより都合よく達成され得る（ＰＣＴ　ＷＯ３９１０４６６９９＃照）。

ＬｉＬＪＸＪＬ＝ 用いる宿主細胞により、その細胞に適切な標準的な技術を用いて、形質転換を行 う。Ｓ、Ｎ、　ＣｏｈｅｎＳｒｏｅ　Ｎａｔ　Ａｅａｄ　５ｃｌＩＪｓＡ　（１ ９７２）　６９：２１１０に記載されているように、塩化カルシウムを用いるカ ルシウム処理、またはＭａｎｉａｔｉｓら、前出、ｐ、２５４に記載のＲｂＣ１ 方法は、原核生物、または細胞壁バリヤーを本質的に有する他の細胞に用いられ る。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ■ｔＬＩｌｅｆａｃ！ｅｎｓ　（Ｃ，Ｈ，５ｈａ ｖら、０３３ｇ　（１９Ｂ３）　２３：３１５）による感染は特定の植物細胞に 用いられる。細胞壁がない哺乳類細胞には、Ｇ　ｒａｈａｍおよびｖａｎ　ｄｅ ｒ　ＥｂＳ■匹旦訂（１９７８）　５２：５４６のリン酸カルシウム沈殿方法が 好ましい。酵母菌への形質転換はＰ、　Ｖａｎ　Ｓｏｌｉｎｇｅｎら、Ｊ　Ｂａ ｃｔｅｒ　（１９）７）　Ｉに：９４６およびＣ，Ｌ、Ｈｓｉａ。

ら、Ｐｒｏｃ　Ｍａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｅｔ　ＵＳＡ　（１９７９）　７６：３８ ２９の方法に従って行われる。

Ｃ１実施例 以下に示す実施例は当業者が実施する際にさらなる指針となるよう提供するもの であって、本発明をいかなる形であれ制限するものではない。

実１」Ｄ− （プラスミドｐｈＮＦ７５の構築） 接合部にエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ（Ｓｔａｐｈ　Ｖ８）開裂部位（Ｂｏ ｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｗ）を有するＥ、　ｃｏｌｉ　βガラクトシ ダーゼ（ＥｅｏＲ１部位でのアミノ酸１００５）に、ヒト心房性のナトリウム尿 排泄充進ペプチド（ｈＡＭＰ４−２１１）を融合するプラスミドを構築した。ハ イブリブト遺伝子を、ｐＢＲ３２２をベースにしたプラスミド上で１ａｃＺプロ モーター／オペレーター領域から転写する。

最初に、開裂部位、ｈＡＮＩ’　（４−２８）、および翻訳終了シグナルをコー ドする合成りＮＡフラグメントを、Ｇ、Ｐ、　Ｖｌａｓｕｋら、ＬＢｉｏｌ　Ｃ ｈｅｗ　（１９８６）　出：４７８９−９６の方法で８つのオリゴデオキシリボ ヌクレオチドから集めて、８％のポリアクリルアミドゲル（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔ ｉｓら、前出、９．１７３−１７８）から精製した。ｈＡＭＰ”（＊はタンパク 質分解性開裂部位の存在を示す）と命名した合成遺伝子の設計には、いくつかの Ｅ、　ｃｏｌｉに好適なコドンの選択（１，Ｇｏｕｙら、　ｕｃ　Ａｃ　ｄｓ　 ｓ　（１９８２）　ｌｉニア０５５−７４）を利用した。このフラグメント約２ ００ｎｇを２０ｎｇのＭ１３請ｐ１９　（Ｃ。

Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、Ｇ！Ｍ（１９８５）　３３：１０３−１９） と混合した。

このＭ１３■ｐ１９は、ベクターを線状化するために制限エンドヌクレアーゼＥ ｅｏＲＩおよび５ｅａｌ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、製造業 者が推奨する条件を用いる）で消化している。４００Ｕの７４　ＤＮＡリガーゼ （Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）およびリガーゼ緩衝液（最終濃度 ５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＢＣＩ、ｐＨ７，４，１０ｍＭのＭｇＣｌ２．１０ｍＭの ＤＴＴ、０゜３ｄのＡＴＰ　）を加えて、ＤＮＡを１５℃で一晩インキユベート した。

ＣａＣｌ２による工程（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出、９．２５０−５１）により コンピテントとなったＥ、　ｃｏｌｔ　ＪＭＩＯＩ　（０，１ｍＬ）を連結物で トランスフェクトし、　０．２＋＊ＬのＪＭＩＯＩと混合して一晩培養し、５− ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド、すなわちＸ−ｇ ａｌ　（２％のジメチルホルムアミド溶液中に５０μＬ）およびイソプロピル− β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）　（１００ｍＭ水溶液中に１０μ Ｌ）を有するＬ−トｙプアガロースに添加し、Ｌプレートの表面に注いだ。３７ ℃で一晩インキニベーシ１ンし３−６７の方法により配列を決定するために、白 いプラークを選択して（Ｍ２Ｓ−ｈＮＦ７）　、ファージのストックを増殖させ て、−重鎖ＤＮＡを調製した（Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｍ　ｔ　ｚ　ｍ　（１ ９８３）ＩＪＩＩ：２Ｏ−７８）。合成ｈＡＮＰ”フラグメントのＤＮＡ配列は 正確であることが示された。

次に、Ｍ２Ｓ−ｈＮＰ７　（Ｍｅｓｓｉｎｇ、前出）からの二本重鎖ＤＮＡを調 製して、制限エンドヌクレアーゼＢａ＋ｅ旧およびＢｇｌｌｌ　（Ｎｅｗ　Ｅｎ ｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、ｈＡＮＰ”配列を含有する約７００ｂ ｐのＤＭＡフラグメントを０．６％のアガロースゲル（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前 出、ｐｐ、１５７−１６１）から精製した。プラスミドｐＴｒｐ−２３３（ＵＳ 　４，７６４、５０４に記載のように調製）を制限エンドヌクレアーゼＢａ■旧 で消化し、その末端をＭａｎｉａｔｉｓら（前出、ｐ、　１３３）の方法でバク チリアルアルカリホスファターゼ（Ａ■ｅｒｓｈａ■）と−緒にインキユベーシ ヲンすることにより脱リン酸化し、線状化したプラスミドを０．６％のアガロー スゲルから精製した。約１１００ｎのＢａ−旧−ＢｇｌｌｌのＤＮＡフラグメン トを２０ｎｇの線状化したプラスミドおよび４００ＵのＴ４　ＤＮＡリガーゼと 混合し、連結用緩衝液を加えて１５℃で一晩インキュベーシ曹ンした。コンピテ ントなＥ、　ｃｏｌｔ　ＭＣ１０６１を連結物で形質転換し、１００μｇ／ｍＬ のアンピシリンを有するしプレート上で３７℃で一晩インキコベートした。

コロニーヲ１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬブロスに接種し、−晩 増殖させ、そして１ｍＬ回収することにより、Ｍａｎｉａｔｉｓら（前出、９． ３６８−３６９）のアルカリ溶解方法によりプラスミドＤＮＡを調製した。プラ スミド内のＢａ■）ＩＩ−Ｂｇｌｌ＋フラグメントの方向を制限エンドヌクレア ーゼＰｖｕｌｌおよび旧ｎｄｌｌｌ　（Ｎｅｖ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ ｓ）による消化、ならびに０．６％のアガロースゲル上でのＤＮＡフラグメント のサイズ化により決定した。所望の方向は、プラスミドのＥｃｏＲＩ認識部位の 次の、フラグメントのＢａｍＨＩ認識部位の位置であって、ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ ｄｌｌｌ、　ＥｃｏＲＩ−Ｂａ■■■、またはＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩフラグメ ントとして分離し得るｈＡＮＰ−カセットを創出する。このような方向を有する プラスミドをｐｈＮＦ７３と命名した。

次に、ｐｈＮＦ７３を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで消化し、約１００ｂ ｐのＥｃｏＲＩ−ＥｅｏＲＩフラグメントをコードするｈＡＮＰ”を８％のポリ アクリルアミドゲルから精製した。次に、２μｇのプラスミドｐＢｇａｌを制限 エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで消化し、線状化したプラスミドを０．６％のア ガロースゲルから精製し、バクチリアルアルカリホスファターゼと一緒にインキ ニベーシッンすることにより、その末端を脱リン酸化した。次に、約２０ｎｇの 線状化したプラスミドを約ＳＯｎｇのＥｅｏＲＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントおよ び４００ＵのＴ４　ＤＮＡリガーゼと混合し、連結用緩衝液を加丸で１５℃で一 晩インキュベーシ讐ンした。コンピテントなＥ、　ｅｏｆｔ　ＭＣ１０６１を連 結物で形質転換し、１００μｇ／■Ｌのアンピシリンと一緒にＬプレート上で３ ７℃で一晩インキコベートした。Ｅｃ。

Ｒ１による消化により、ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲ［フラグメントを含有することが 示された１つのプラスミドをｐｈＮＦ７５と命名した。い（っかのＥ、　ｃｏｌ ｉ菌株では、ｐｈＮＦ７５はβ−ガラクトシダーゼとｈＡＮＰ（４−２８）とが 融合した場合に予想されるサイズを有するハイブリッドタンパク質を産生ずるこ とが、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｕ、　Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｎａ ｔｕｒｅ　（１９７０）　２２７＋８８０−８５）によって示された。融合タン パク質を部分的に精製し、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ（Ｓｔａｐｈ　Ｖ８ ）で消化し、精製すると、正確なアミノ酸配列を有することが示されたくデータ は図示せず）。

（ｂ）吐旺■」至璽ｌニ トリブトファンプロモーターから短いβ−ｇａｌ−リーダーペプチドを発現する 、プラスミドｐＴＲＰ８３−１を以下のように構築した。

Ｅ、　ｃｏ開目トリプトファンプロモーターオペレーター領域の制御下、ｐＢＲ ３２２をベースにしたプラスミド上で、プラスミドｐＴｒｐ−２３３（ＵＳ　４ ，７６４，５０４に記載のように調製）を用いて、Ｅ。

ｃｏｌｉβ−ガラクトシダーゼの５つのアミノ末端残基に続いて一＾５ｎ−Ｌｅ ｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−（す なわち、β−ガル−（ｔｈｒ）６リーダーペプチド）配列をコードする発現ベク ターを構築した。図４は、４つの合成オリゴヌクレオチドからのこの配列の調製 物を示す。所望であれば、図４に示す適切なオリゴヌクレオチドを変えることに より、上記の代わりに−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔ ｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇ　Ｉｎ−Ｐｈｅ−配列を用いてもよい。この配列の下流のＥｃ ｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌ＋認識部位は、フレームで、遺伝子が短いリーダーペ プチドと融合することを可能にする。このペプチドおよび他の関連ペプチドはＥ 、　ｃｏｌｔ中でのプロインシュリンの発現を安定させることが示された　（Ｗ 、　Ｌ、Ｓｕｎｇら、ｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｅｔ　ＵＳＡ　（１９８６） 　８３＋５６１−６５）。

最初に、２８ｇのｐＴｒｐ−２３３をＥｃｏＲＩで消化し、線状化したプラスミ ドを０．６％のアガロースゲルから精製した。次に、Ｅ。

ｃｏｌ　ｉのＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｂｏｅｈｒｆｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉ ｍ、Ｉｎｃ、）のフレノウフラグメントを用いて、Ｍａｎｉａｔｉｓら（前出、 ｐ、　３９４）の方法で末端をうめた。次に、混合物を７０℃で５分間加熱して 、酵素を不活性化した。そして、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを連結用緩衝液に加えて 、１５℃で一晩インキコベーシッンした。Ｅ、　ｃ。

１ｉ　ＭＣ１０６１をＣａＣｌ２法でコンピテントとし、Ｍａｎｉａｔｉｓら（ 前出、ｐｐ、　２５０−２５１）に記載のように形質転換した。得られたアンピ シリン耐性コロニーを１００μｇ／ｍＬのアンビンリンを育するしグロス中で一 晩増殖させ、１■Ｌの培養液を回収して、ＭａｎｉａｔｉＳら（前出、ｐ、　０ ８−３６９）のアルカリ溶解方法によりプラスミドＤＮＡを調製した。ＥｃｏＲ Ｉで消化出来なかったことによりＥｃｏＲＩ認識部位がないプラスミドを決定し て、これをｐＴＲＰ８１−６と命名した。

次に、２ｕＨのプラスミドｐＴＲＰ８１−６をＨｉｎｄｌｌｌおよびＮｄｅｌで 消化し、線状化したプラスミドを０．６％のアガロースゲルから精製した。β− ｇａｌ−（ｔｈｒ）６リーダーペプチドをコードする合成Ｎｄｅｌ−旧ｎｄｌｌ ｌのＤＮＡフラグメントを、Ｖｌａｓｕｋらの方法（前出）で、４つのオリゴデ オキシリボヌクレオチド（図４）から集めて、２０％のポリアクリルアミドゲル （ＭＨｉａｔｉｓら、前出）から精製した。このフラグメントは、フレーム中に 、遺伝子がβ−ガラクトシダーゼと融合するためのＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌ １１認識部位をコードし、そして末端はリン酸化されない。千倍過剰な量の合成 フラグメントを、線状化したプラスミドに加丸、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼおよび連 結用緩衝液と混合し、１５℃で一晩インキユベートした。連結物を用いてコンピ テントなＥ、　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１をアンピシリン耐性に形質転換させた。

コロニーを増殖し、プラスミドＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩによる消化を用い８ ３−１と命名した。リーダーペプチドをコードする合成りＮＡフラグメントの正 確な配列をＳａｎｇｅｒら（前出）の方法で確認した。

（以下余白） （ｅ）吐１１鼾（社）ｌｌ： β−ｇａｌ−（ｔｈｒ）６−ｐｒｏＡＮＰ＊ハイブリッドタンパク質をトリプト ファンプロモータから発現する、プラスミドｐｈＮＦ８６を以下のように構築し たニ プラスミドｐｈＮＦ−２３３（米国特許第４．７６４．５０４号に記載ノヨウに 調製した）、ｐｈＮＦ７５　（上記のセクションａ参照）およびｐＴＲＰ８３− １　（上記のセクションｂ参照）を用いて、ｐｒｏとｈＡＮＰ　（４−２８）配 列との間にエンドブロティナーゼＧｌｕ−Ｃ（Ｓｔａｐｈ　Ｖ８）開裂部位を有 するｐｒｏＡＮＰ８がβ−ｇａｌ−（ｔｈｒ）６リーダーベブチドの後ろに結合 している配列をコードする発現ベクターを構築した。このハイブリッドタンパク 質は、ｐＢＲ３２２を基礎とするプラスミド上のＥ、ｃｏｌｉ）リブトラアンプ ロモータ／オペレータ領域に制御されている。

まず、プラスミドｐｈＮＦ−２３３を部分的にＡｖａ　Ｉで消化し、■１ｎｄＩ Ｉ＋で完全に消化して、プラスミドを線状化し、ｐｒｏＡＮＰ遺伝子の３゛末端 （Ａｖａ　ｌから旧ｎｄｌｌ＋）を除去した。線状化されたプラスミドを、０． ６％アガロースゲルを用いて精製した。プラスミドｐｈＮＦ７５を、ＥｃｏＲＩ および旧ｎｄｌｌ＋で消化し、そしてエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ（Ｓｔａ ｐｈ　Ｖ８）開裂領域を有するｈＡＮＰ　（４−２８）遺伝子をコードするフラ グメントを、２０％ポリアクリルアミドゲルを用いて精製した。Ａｖａｌ認識部 位がらｈＡＮＰＩフラグメントのＥｃｏＲ１部位までのｐｒｏＡＮＰ配列をコー ドする合成りＮＡフラグメント（図５）を、Ｙｌａｓｕｋら（上述）の方法によ って、８つのオリゴデオキシリボヌクレオチドから組み立て、８％ポリアクリル アミドゲルを用いて精製した。このＤＮＡ配列を、−重鎖テールを相補的Ｅｃｏ ＲＩテールと連結させて、ＥｃｏＲ１部位を破壊するように、このフラグメント 上で改変した（　ＧＡＡＴＴＣをＡＡＡＴＴＣに変えた）；この末端もまた、リ ン酸化されていない。３つのＤＮＡ（約５０ｎＨのプラスミド骨格、１００ｎＨ の合成フラグメント、および少なくとも１１００ｎのｈＡ　ＮＰ中７ラグメント ）を、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼおよび連結用緩衝液と混合し、１５℃で一晩インキ ユベートした。連結物は、コンピテントＥ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１を形質転換 し、アンピシリン耐性コロニーを培地で成長させ、プラスミドＤＮＡを調製し、 ＥｃｏＲｌおよび旧ｎｄｌｌ＋による制限エンドヌクレアーゼで消化して、２つ のＤＮＡフラグメントがプラスミドに挿入されていることを確認した。Ｓａｎｇ ｅｒら（上述）の方法を用いて、ｐｈＮＦ８２と命名したプラスミド中にある新 しいｐｒｏＡＮＰＩの配列が正しいことを確認した。

次に、プラスミドｐｈＮＦ８２をＮｄｅ　Ｉで消化し、末端をＥ、ｃｏｌｉ　Ｄ ＮＡポリメラーゼ１のｌｌ：１ｅｎｏ曹フラグメントで満たした；平滑末端を有 する線状化プラスミドを、リン酸化されていないＥｃｏＲ１リンカ−（５−ＣＧ ＧＡＡＴＴＣＣＧ−３’、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＴ ４　ＤＮＡリガーゼと混合し、−晩１５℃でインキュベートした。その後、この 連結物を、フェノール：クロロホルムで抽出し、エタノール沈澱物をＥｅｏＲＩ および旧ｎｄｌｌ＋で消化して、ｐｒｏＡＮＰ遺伝子をＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｌ 　ｌ！フラグメントとして切出し、０．６％アガロースゲルを用いて精製した。

プラスミドｐＴＲＰ８３−１をＥｃｏＲＩおよびｌ１ｉｎｄｌｌ＋で消化し、こ のプラスミドを線状化し、０．６％のアガロースゲルを用いて精製した。このＤ ＮＡフラグメントおよび線状化プラスミドを７４　ＤＮＡリガーゼおよび連結用 緩衝液と混合し、１５℃で一晩インキコベートした。コンピテントＥ、　ｃ。

１ｉ　ＭＣ１０６１を連結物で形質転換し、プラスミドＤＮＡを得るためにアン ピシリン耐性コロニーを一晩培養して成長させた。プラスミドＤＮＡのＥｃｏＲ Ｉおよび旧ｎｄｌｌｌで消化して、ｐｈＮＦ８６と命名したｐｒｐＡＮＰ遺伝子 を含有するプラスミドを同定した。３−β−インドールアクリル酸（２５μｇ／ ｍ＋Ｌ）を加えて、トリプトファンプロモータを誘発し、プラスミドｐｈＮＦ８ ６を有し、ハイブリッドタンパク質を振とうフラスコ培養物中の全細胞タンパク 質の１０−１５％を発現する、Ｅ、ｃｏｌｉを数株得た（データは示されていな い）。発現レベルを、クマーシーブルーで染色したＳＯＳポリアクリルアミドゲ ルのデンシトメータースキャンによって推定した。

（ｄ）プラスミドｈＬＥＩＬ？の　： β−ｇａｌ−（ｔｈｒ）−ｐｒｏＡＮＰ＊ｇｌｎハイブリッドタンパク質をトリ プトファンプロモーターから発現する、プラスミドｐｈＮＦ１１７を以下のよう に構築したニ プラスミドｐｈＮＦＳ６を改変して、ｐｒｏＡＮＰ領域内のエンドプロテイナー ゼＧｌｕ−Ｃ（Ｓｔａｐｈ　Ｖ８）開裂部位（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎ ｈｅｉ簡）数を減らした。改変されたプラスミド内には、２つの部位だけが残る ：第１番目は、β−ｇａｌ−（ｔｈｒ）ａリーダーペプチドとｐｒｏＡＮＰ領域 の間の接合部であり、第２番目はｐｒｏＡＮＰ領域およびｈＡＮＰ（４−２８） ペプチドの間である（図１）。これは９つのグルタミン酸残基をグルタミン残基 に変えることによって達成された：好ましいＥ、　ｃｏｔ　Ｉコドンの選択（Ｇ ｏｕｙら、上述）もまた、改変された領域に導入した。

先ず、プラスミドｐｈＮＦ８６を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌｌで消化し、 ｐｒｏＡＮＰ傘をフードするフラグメントを０．６％アガロースゲルを用いて精 製した。プラスミドｐＵｃ８　（Ｊ、　Ｖｉｅｉｒａら、ｍ　（１９ｇ２）　ｌ ：２５２）を、ＥｃｏＲＩおよび旧ｎｄｌ１１で消化し、線状化したプラスミド を０．６％アガロースゲルを用いて精製した。ＤＮＡフラグメント（５００ｎｇ ）および線状化プラスミド（１０１００ｎを混合し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼおよ び連結用緩衝液を用いて１５℃で一晩インキユベートし、連結物でコンピテント Ｅ、　ｃｏｌ　ｌ　ＭＣ１０６１ヲ形質転換し、アンピシリン耐性にした。ｐｒ ｏＡＮＰ＊フラグメントを含有するプラスミドを、ｐＵＣ−ｈＮＰ１１４と命名 した。

次に、ｐｒｏＡＮＰフラグメントのＥｃｏＲＩ−Ａｖａｌ　ＤＮＡ配列を、Ｅｃ ｏＲＩおよびＡｖａｌによる消化で除去し、プラスミドを０．６％ポリアクリル アミドゲルを用いて精製した。この領域を置換するための合成りＮＡフラグメン トを、Ｖｌａｓｕｋら（上述）の方法を用ｔ１で１６個のオリゴデオキシリボヌ クレオチドから組み立てた（図６）。このフラグメントの配列は、好ましいｇ、 ｃｏｌｉコドンおよび９個のグルタミン酸残基がグルタミン残基で置換されたも のの両方を有している。リン酸化されていない合成りＮＡフラグメントを８％ポ リアクリルアミドゲルを用いて精製し、少なくとも２００ｎｇを５ｏｎＨの線状 化プラスミドｐＵＣ−ｈＮＦ１１４と混合した。

Ｔ４　ＤＮＡリガーゼおよび連結用緩衝液を加え、混合物を１５℃で一晩インキ ユベートした。この連結物をＥ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１をアンピシリン耐性に 形質転換するために使用した。ｐＵＣ−ｈＮＦ１１６と命名した１つのプラスミ ドが、ＳａｎｇｅｒらのＤＮＡ配列決定方法（上述）を用いて、置換された領域 （ｐｒｏＡＮＰ＊ｇｌｎ）を含有することが示された。

ＥｅｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌｌで消化したプラスミドｐｈＮＦ８６を、０．６ ％アガロースゲルから線状分子として精製し、その５０　ｎｇと、ＥｃｏＲＩお よび旧ｎｄ［Ｉ！消化物から０．６％アガロースゲルを用いて精製した少なくと も１１００ｎのＥｅｏＲＩ−旧ｎｄｌｌｌ　ｐｒｏＡＮＰ＊ｇｌｎフラグメント と混合した。Ｔ４　ＤＮＡリガーゼおよび連結用緩衝液を用いて１５℃で一晩イ ンキニペートした後、コンピテントＥ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１をアンピシリン 耐性に形質転換して、−晩培養し、プラスミドＤＮＡを調製した。ｐｈＮＦ１１ ７と命名した１つの発現ベクターは、β−ｇａｌ（ｔｈｒ）６リーダーベブチド に融合した新しいｐｒｏＡＮＰ参ｇｌｎ遺伝子をコードしていた。このプラスミ ドを有するＥ、　ｃ。

１ｉ　Ｗ３１１０は、３−β−インドールアクリル酸を添加すると、振とうフラ スコ培養でハイブリッドタンパク質を発現することを示した：クマーシーブルー 染色したＳＤＳポリアクリルアミドゲルをデシトメ−ターで追跡して、このハイ ブリッドタンパク質は全細胞タンパク質の１０％であると推定した。

（ｅ）プラスミド　ＦＯ−の　ニ ブラスミドｐｈＮＦ１２０−１は、β−ｇａｌ−（ｔｈｒ）６リーダーに存在す るＧｌｕがＧｉｎに改変され、それによって発現産物には１つの５ｔａｐｈ　Ｖ ８開裂部位のみが残存すること以外は、ｐｈＮＰ１１？と同一である。プラスミ ドを、ｐｈＮＦ１１７の部位特異的突然変異誘発で構築し、構築物が図２に示さ れる配列を有することを確認した。

Ｄ）プラスミドｈＮ１２０−３の　ニ ブラスミドＩ）ｈＮＦ１２０−３は、発現産物が５ｔａｐｈ　Ｖ８開裂部位を有 さないこと以外は、ｐｈＮＦ１２０−１と同一である。

支胤且Ｉ （組換えヒトＡＮＰ−融合タンパク質の精製）Ｕ： ｐｈＮＦ１１７で形質転換したＥ、　ｃｏｌｔ　Ｗ３１１０細胞を、５．０ｇ／ Ｌの初期濃度のグルコースを含む複合培地において、フエドノイ・ノチ（ｆｅｄ −ｂａｔｅｈ）培養工程によって培養した。残留糖が０．５ｇ／Ｌ、未滴になっ たとき、濃縮グルコースの添加を開始した。添加速度を、残留グルコース濃度が １．０ｇ／Ｌ未満、および最低溶存酸素が２０％を維持するように調整した。細 胞密度が４０．００Ｄｓ９＠になったとき、１００■ｇ／Ｌのインドールアクリ ル酸（ＩＡＡ）を加えて、融合タンパク質を誘導した。培養をさらに１４．５時 間続け、７３．００Ｄ６９１１の細胞濃度で集菌した。全培養時間は、約２８， ５時間であった。

紐ＪＩＬ収： １８す、トルの培養液を、６個の１す２）ルボトルに分割し、５ｏｒｖａｌｌ　 ＲＣ−３Ｂ遠心分離機を用いて、５．００Ｏｒｐｍ、４℃で、３０分間遠心分離 した。上清を捨て、培養液を再びボトルに入れ、再度遠心分離した。この工程を ３回繰り返した結果、１．２３Ｋｇの細胞（湿潤重量）を得た。すべての細胞を 、−８５℃で凍結し、次のプロセッシンングに使用した。また、０．１μ票の膜 を有するクロスフロー　（ｃｒｏｓｓ−ｆ　ｌｏｗ）ミクロ濾過器（Ｓａｒｔｏ ｒｉｕｓ、　１ｎｃ、、　Ｙａｕｃｏ、　Ｐ、Ｒ，）を用いて、１回の遠心分離 工程のみで細胞が回収されるように、培養液量を減少させた。

ホモジェナイゼーション： ２００グラムの細胞を解凍して、４℃とし、２リツトルのＯ，ＯＩＭＭＥＳ　（ ２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）、ｐＨ６，０に、４℃で１時間懸濁 した（１：１０．　ｖ／ｖ）。細胞懸濁液を、１０．０ＯＯｐｓｉで作動するミ クロフルイダイザ−（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）　（ＭｏｄｅｌＩＬＯＹ 、　Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ　ｃｏｒｐ、、　Ｎｅｗｔｏｎ、　ＭＡ）を用 いて、冷却しながら、毎分３００■して３回再還流させた。フルイダイザーは、 ７５−および１５０ミクロンの混合室を有しており、細胞を破壊して細胞内タン パク質を放出させた。細胞破壊は、顕微鏡試験によって、９０％以上であること が判明した。

細胞溶解物を、１リツトルボトルに分割し、５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ−３Ｂ遠心分 離機で５，０ＯＯｒｐｓ＋、４℃で３０分間遠心分離にかけた。不溶性ＡＭＰ融 合タンパク質（顆粒画分）を含むベレットを残し、可溶性Ｅ、　ｃｏｌｔタンパ ク質を含む上清を捨てた。

Ｍ−拉１」Ｂ（社）丸浸： 溶解ベレット（顆粒画分）を、４℃で３０分間マグネットで攪拌しながら、０． ５Ｍ尿素を含む０．０４ＭのＨ２Ｓ０ｎ７５０■Ｌに再懸濁した（１：１０．豐 ／ｖ）。懸濁した顆粒画分を、ミクロフルイダイザーを用いて２回再還流して均 一な混合物を生成し、顆粒画分と共にペレット状にされたすべての残留細胞を破 壊した。混合物を、５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ−３Ｂ遠心分離機で５．ＯＯＯｒｐｍ 、４℃で２０分間遠心分離にかけ、ベレットを残した。洗浄したベレットは、− ７０℃で次のプロセッシングまで、保存し得る。

これらの顆粒画分を、以下の２つの理由により、低ｐｔｌ溶液で洗浄した。すな わち、（１）残留可溶性タンパク質を除去するため、および（２）より高いｐｔ ｌで、ＡＭＰ融合タンパク質を分解することが示されている内因性タンパク質分 解酵素を阻害するためである。

頴Ｉｔ分Ａ日１脛： 洗浄した顆粒画分を、４℃で３０分間マグネ・ｙ）攪拌しながら、６Ｍ尿素を含 む、０．４ＭＨ２Ｓ０ａ　Ｏ，ＳＬに懸濁しく１：５．　ｗ／ｖ）、次いで、ミ クロフルイダイザーで２回置還流させ、顆粒をホモジナイズし、ＡＮＰ融合タン パク質を溶解した。得られた抽出物を、５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ−３ＢＯ−ターで ５．ＯＯＯｒｐｍ、４℃で１時間遠心分離にかけ、残留する不溶性物質を除去し た。上清は、すばやくプロセ・ノシングし得るか、またはさらなるプロセッシン グまで一７０℃で保存し得る。または、抽出物は、５００Ｃ■２の表面積を有す るＭｌｎｉｊａｎユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｉｎｃ、、Ｂｅｄｆｏｒｄ、 　ＭＡ）のような、０．２μｍフィルターを用いたクロスフロー濾過によって、 精製され得る。

カチオン　りロマトグラフ　−： 新しいへＮＰ融合タンパク質は、塩基性の等電点を有することが示された。従っ て、カチオン交換クロマトグラフィーを選択してタンパク質をさらに精製し、５ ｔａｐｈ　Ｖ８開裂前にほぼ均一になるようにした。溶解したＡＮＰ融合タンパ ク質の試料（０，５ＬＨ１６，０ｗｇり：／ハク質／ｍＬ）を、６Ｍ尿素を含む ０．０℃Ｍ＋７）ＭＥＳ４、ＯＬに希釈し、４℃で、水酸化ナトリウムを用いて 、ｐＨを６．０に調整した。希釈した試料を、毎分５ｏ■Ｌ（毎時３８．２ｃｍ の直線速度）で、６Ｍ尿素を含む０．ＯＩＭ　ＭＥＳ、　ｐＨ６、ｏ、　４°ｃ −ｃ’平衡化したＣＭ（カルボキシメチル）−セファロ−迎ファーストフロー（ Ｐｈａｒｖａｃｉａ、　Ｉｎｃ、、　Ｐｉｓｃａｔａｖａｙ、　ＮＪ）の１０　 ｘ　１６．５　ａｍ　（１，３Ｌ）カラムに負荷した。（または、スルホプロピ ル−セファロース０、もしくは他のカチオン交換物質が使用され得る。）負荷後 、結合しなかったタンパク質を、さらに平衡緩衝液を加えて、２８０ｎ園におけ る吸光度がベースラインに戻るまで洗浄し、フロースルー（ｆ　ｌｏｗ−ｔｈｒ ｏｕｇｈ）画分とした。次いで、融合タンパク質を、６Ｍ尿素、Ｏから０．０６ ＭのＮａＣｌの直線勾配を有する０、ＯＩＭのＭＥＳ溶液（または０．０６Ｍの ＮａＣ１を含むＯ，ＯＩＭのＭＥＳ）、ｐＨ６，０テ毎分１００ｍＬ　（毎時７ ６、４ｃｍ（Ｄ直線速度）で溶出し、４００■Ｌの画分を回収した。開裂用プー リング（ｐｏｏｌｉｎｇ）の前に、５ＤＳ−ＰＡＧＥで、画分の純度を分析し、 ２．７ｇを回収したくステップ収率３４％）。他のｐＩＩ値を用いることも有利 であり得る。ここでは、高いｐＨで尿素の分解の結果化じるカルバミル化反応を 最小限にするために、６．０のｐＨを用いた。

５ｔａｖ８によ　： Ｃトセファロース［Ｆ］を用いて精製した融合タンパク質は、微量のＥ、　ｃｏ ｌｔタンパク質分解酵素を含むことが示された。このタンパク質分解酵素は、固 定化した５ｔａｐｈ　Ｙ８による長期にわたるインキニベーシ璽ン中に融合物の 産物のロスおよび非特異的分解を引き起こした。これらの非特異的プロテアーゼ は、ＣＭを用いて精製した融合タンパク質を以下のように８０℃に加熱すること によって、不活性化した。まず、０．１ＭのＴｒ　ｉ　５−５Ｏａ、ｐＨ９，０ を８０℃に加熱し、等量の精製融合タンパク質溶液と混合する。この溶液を８０ ℃で３０分間保ち、室温に冷却する。この処理の間、尿素濃度を３Ｍに減少し、 開裂反応を阻害しないようにする。必要に応じて、開裂前に、１Ｇ、　ＯＯＯＭ ＷＣＯ膜で限外濾過を行うことによって、この溶液の容量を減少させ得る。

５ｔａｐｈ　Ｖ８　（エンドプロテイナーゼＧｌｕ−ＣＳＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ 　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｇｗｂｌ’１．　Ｗｅｓｔ　Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＩＣｍ ２の膜当り約０．２ｗ＋Ｈの酵素密度になるように、グルタルアルデヒドで活性 化したＰＶＣ−シワ力複合体膜（Ａｍｅｒａｃｅ、　Ｉｎｃ、、　Ｂａｃｋｅｔ ｔｓｔｏｖｎ、　ＮＪ）に固定した。　（または、臭化シアンで活性化したセフ ァロース■、もしくは他の活性化樹脂、膜または基質も用いられる。）約１５■ ｇの５ｔａｐｈ　Ｖ８を含む３つの直径４７ｍｍの膜を平行に結合し、０．０５ ＭのＴｒｉｓ−ＳＯａ、ｐａ９．０で、室温、毎分２■して平衡化した。１００ ０■ｇのタンパク質を含む、熱処理した融合タンパク質溶液（２００■Ｌ）を、 膜系に通して、毎分２ｍＬｓ　室温で１６時間還流させた。

開裂を、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣによってモニターした。図７Ａ は、上記により調製した試料をカルボキシメチルセフ１０−ス［Ｆ］を用いて精 製した後の、ＨＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す０図７Ｂは、５ｔａｐｈ　Ｙ ８で開裂した後の、試料のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。別の方法とし て、可溶性（固定されていない）酵素を用いて開裂も行うこともできる。

サイズによる　°　： 固定化５ｔａｐｈ　Ｖ８で開裂した後、簡単なサイズ分離によって、ＡＮＰを高 分子量の開裂産物から分離した。Ａｗｉｃｏｎ　ＹＭＩＧ膜（１０、ＯＯＯＭＷ ＣＯ）で、洗浄しながら開裂混合物を限外濾過すると、高分子量フラグメントを 含まない、濾過物ストリーム（ｓｔｒｅａ■）中の約８０％の産物が回収された 。

ＡＮＰに加えて、すべての限外濾過物ストリームは、Ｎ末端ペプチド（ｐｈＮＦ １１７が使用されるとき）、および開裂反応からの尿素を含み得る。Ｎ末端ペプ チドは、β−ｇａｌ−（ｔｈｒ）６リーダーペプチドを上記のＧｌｕ→Ｇｌｎ変 異体に置換することにより除去され得る。ＡＮＰをこれらの物質から分離するた めに、第二のカチオン交換クロマトグラフィ一工程が使用され得る。別の方法と して、ゲル濾過クロマトグラフィーは、ＡＮＰを高分子量開裂産物から分離する ために使用され得る。

カチオン　クロマドグ　フ　−二 カチオン交換クロマトグラフィーを用いて、開裂または限外濾過後に、ＡＮＰを その開裂産物から分離した。この工程では、ＡＮＰを、酢酸アンモニウムの塩お よびｐＨ勾配を用いてＣＭ−セファロース■ファストフローカラムを用いるクロ マトグラフィーにより分離した。

別の方法として、ＡＮＰを、逆相高速液体クロマトグラフィーによって分離し、 凍結乾燥して有機溶媒を除去した。

ミｔｌｐｎ　’、’ａ Ｓｔａｐｈ　Ｖ８ ζτＧ　ＡＴ’Ｔ　ＣＣＡ　Ａ Ｐｈ＠ＧＬｕ　Ａｒｑ　Ｓｅｒ　Ｓａｒ　Ｃｙｓ　Ｐｈａ　にｌｙ　Ｇｌｙ　Ａ ｘｑ　Ｍ・ｔ　Ａｓｐ　Ａｒｑ　ｌ１ａＥ＝ｃＲ工　３ Ｇｌｙ　Ａｌａ　にｉｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌ＠ｕ　Ｃ１ｙ　ＣＹ！Ｉ　Ａｓｎ 　５ａｒ　Ｐｈ＠Ａｒｇ　’ｒｙｒ　５ＴＰ５　７　ＨよｎｄＸ工工 ａ ｔ４＠ｔ　Ｔｈｒ　Ｍａｔ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ 　ＴｈｒＴ　ＡＴＧ　ＡＣＣＡＴＧ　ＡＴＴ　ＡｃＧ　ＡＡＴ　ＴＴＡ　ＡＣＣ Ａｃｅ　ＡｃｅＡＣＴＧＧ　ＴＡＣ７Ｍ　ＴにＣＴＴＡ　ＡＡＴ　ＴＧＧ　ＴＧ Ｇ　ＴＣＧＴｈｒ　Ｔ’ｈｒ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ ＥｃｏＲ工　ＨｉｎｄエエＩ ＴＧＧ　ＴＧＧ　ＣＴＴ　ＡＡＧ　ＧＣＡ　ＴＴＣＧＡＬａｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｑ 　ＧＡＹ　ｐｒ口Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｓ＠ｒ　Ｓａｒ　Ａｓｐ　ｋｘｑ　Ｓ＠ｒ　 Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　ＬｙｓＳａｒ　Ｌｙｅ　Ｌ＠ｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｌ ａｕ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｓａｒ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｐ ｈ・５　７　ＥｃｏＲ工 Ｃ，Ｌｕ　ｐｈ＠　Ａｒｇ　Ｍａｔ　ｘｓｎ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ 　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｓａｒ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｌａ■ ＥＣ：Ｒ工　１３ 時間（６す 国際調査報告 フロントベージの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｐ　２１１０２　 ＺＮＡ　Ｃ８２１４−４Ｂ（７２）発明者　ウイレット、ダブリュー、スコツト アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４１１７サンフランシスコ、ピアス　スト リートＩ

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. １．精製の向上のために設計された融合タンパク質であって、Ｎ−末端からＣ− 末端において、 切断部位を含まない約１０から約５０ｋＤａのキャリアタンパク質； 該キャリアのＣ−末端に位置する切断部位；および切断部位を含まず、且つ、該 切断部位に融合されたペプチドを含み、 そこにおいて、約８．０以上のｐｌを示す、融合タンパク質。
2. ２．前記切断部位が、Ｓｔａｐｈ　Ｖ８切断部位である、請求項１に記載の融合 タンパク質。
3. ３．前記キャリアタンパク質が、Ｇｌｕ残基あるいはＡｓｐ−Ｇｌｙ配列を含ま ない、請求項２に記載の融合タンパク質。
4. ４．前記キャリアタンパク質が、本質的に以下の配列からなる、請求項３に記載 の融合タンパク質：【配列があります】 そこにおいて、 Ｘ１−９は、各々、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ 、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ 、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒからなる群から独立して選択され；そ してＸ１０およびＸ１１は、各々、【配列があります】およびＴｙｒからなる群 から独立して選択され、Ｘ１１はＡｓｐではなく、Ｘ１０がＡｓｐであればＸ１ １はＧｌｙではない。
5. ５．Ｘ１−９が、各々Ｇｌｎである、請求項４に記載の融合タンパク質。
6. ６．前記融合タンパク質が、約６個から約２０個のアミノ酸のＮ−末端リーダー をさらに含む、請求項５に記載の融合タンパク質。
7. ７．前記リーダーが、約３個から約９個のＴｈｒ残基を含む、請求項６に記載の 融合タンパク質。
8. ８．前記リーダーが、本質的に以下の配列【配列があります】 からなる、請求項７に記載の融合タンパク質。
9. ９．前記ペプチドが、ＡＮＰ、ＡＮＰの類似体、脳性ナトリウム利尿ペプチド、 ソマトスタチン、グルカゴン様ペプチド、カルシトニン、肺表面活性剤、インシ ュリン、成長ホルモン放出因子、プラジキニン、エンドルフィン、およびエンケ ファリンからなる群から選択される、請求項８に記載の融合タンパク質。
10. １０．前記ペプチドが、ヒトＡＮＰである、請求項９に記載の融合タンパク質。
11. １１．前記ペプチドが、本質的に以下の配列【配列があります】 からなる、請求項８に記載の融合タンパク質。
12. １２．精製の向上のために設計された融合タンパク質をコードするＤＮＡ組成物 であって： 切断部位を含まない約１０から約５０ｋＤａのキャリアタンパク質、該キャリア のＣ−末端に位置する切断部位、および切断部位を含まず、且つ、該切断部位に 融合されるペプチドを含み、そこにおいて、約８．０以上のｐｌを示す、融合タ ンパク質をコードするＤＮＡを含む、ＤＮＡ組成物。
13. １３．前記切断部位が、Ｓｔａｐｈ　Ｖ８切断部位である、請求項１２に記載の ＤＮＡ組成物。
14. １４．前記キャリアタンパク質が、本質的に以下の配列からなる、請求項１３に 記載のＤＮＡ組成物：【配列があります】 そこにおいて、 Ｘ１−９は、各々、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ 、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ 、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒからなる群から独立して選択され；そ してＸ１０およびＸ１１は、各々、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、 Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、 Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒからなる群から独立し て選択され、Ｘ１１はＡｓｐではなく、Ｘ１０がＡｓｐであれはＸ１１はＧｌｙ ではない。
15. １５．精製の向上のために設計された融合タンパク質を適切なホストにおいて組 換え発現させるための発現ベクターであって： 該ホスト中において機能するプロモーター、切断部位を含まない約１０から約５ ０ｋＤａのキャリアタンパク質、該キャリアのＣ−末端に位置する切断部位、お よび切断部位を含まず、且つ、該切断部位に融合されるペプチドを含み、そこに おいて、約８．０以上のｐｌを示す、融合タンパク質、および 終止配列、 をコードするＤＮＡを含む、発現ベクター。
16. １６．前記切断部位が、Ｓｔａｐｈ　Ｖ８切断部位である、請求項１５に記載の ベクター。
17. １７．前記キャリアタンパク質が、本質的に以下の配列からなる、請求項１６に 記載のベクター： 【配列があります】 そこにおいて、 Ｘ１−９は、各々、【配列があります】およびＴｙｒからなる群から独立して選 択され；そしてＸ１０およびＸ１１は、各々、【配列があります】およびＴｙｒ からなる群から独立して選択され、Ｘ１１はＡｓｐではなく、Ｘ１０がＡｓｐで あればＸ１１はＧｌｙではない。
18. １８．前記ＤＮＡが、前記キャリアと前記プロモーターとの間の、約６個から約 ２０個のアミノ酸のリーダー配列をさらにコードする、請求項１７に記載のベク ター。
19. １９．前記リーダーが、約３個から約９個のＴｈｒ残基を含む、請求項１８に記 載のベクター。
20. ２０．前記リーダーが、本質的に以下の配列【配列があります】 からなる、請求項１９に記載のベクター。
21. ２１．前記プロモーターが、Ｅ．ｃｏｌｉ　β−ガラクトシダーゼプロモーター を含む、請求項２０に記載のベクター。
22. ２２．選択マーカーをさらに含む、請求項１６に記載のベクター。
23. ２３．前記ベクターが、プラスミドである、請求項１６に記載のベクター。
24. ２４．ｐｈＮＦ１０−３を含む、請求項１６に記載のベクター。
25. ２５．精製の向上のために設計された融合タンパク質を組換え発現させるための 宿主細胞であって：該宿主細胞中において機能するプロモーター、切断部位を含 まない約１０から約５０ＫＤａのキャリアタンパク質、該キャリアのＣ−末端に 位置する切断部位、および切断部位を含まず、且つ、該切断部位に融合されるペ プチドを含み、そこにおいて、約８．０以上のｐｌを示す、融合タンパク質、お よび 終止配列、 をコードする組換えＤＮＡを含む、宿主細胞。
26. ２６．前記切断部位が、Ｓｔａｐｈ　Ｖ８切断部位である、請求項２５に記載の 宿主細胞。
27. ２７．前記組換えＤＮＡが、染色体外因子上に存在する、請求項２５に記載の宿 主細胞。
28. ２８．前記組換えＤＭが、前記宿主細胞のゲノムに組み込まれている、請求項２ ６に記載の宿主細胞。
29. ２９．精製ペプチドを生産する方法であって：宿主細胞内に融合タンパク質を発 現させ、そこにおいて、該融合タンパク質が、切断部位を含まない約１０から約 ５０　ｋＤａのキャリアタンパク質、該キャリアのＣ−末端に位置する切断部位 、および切断部位を含まず、且つ、該切断部位に融合されるペプチドを含み、そ こにおいて、約８．０以上のｐｌを示す、工程； 該融合タンパク質を、該宿主細胞内在性のタンパク質から、ｐｌによって単離す る工程； 該キャリアタンパク質を、該ペプチドからから切断する工程；および 該ペプチドを、該キャリアタンパク質から分離する工程；を含む、方法。
30. ３０．前記切断部位が、Ｓｔａｐｈ　Ｖ８切断部位である、請求項２９に記載の 方法。
31. ３１．前記キャリアタンパク質が、Ｇｌｕ残基あるいはＡｓｐ−Ｇｌｙ配列を含 まない、請求項３０に記載の方法。
32. ３２．該キャリアタンパク質が、本質的に以下の配列からなる、請求項３１に記 載の方法： 【配列があります】 そこにおいて、 Ｘ１−９は、各々、【配列があります】およびＴｙｒからなる群から独立して選 択され；そしてＸ１０およびＸ１１は、各々、【配列があります】およびＴｙｒ からなる群から独立して選択され、Ｘ１１はＡｓｐではなく、Ｘ１０がＡｓｐで あればＸ１１はＧｌｙではない。
33. ３３．Ｘ１−９が、各々Ｇｌｎである、請求項３２に記載の方法。
34. ３４．前記融合タンパク質が、約６個から約２０個のアミノ酸のＮ−末端リーダ ーをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
35. ３５．前記リーダーが、約３個から約９個のＴｈｒ残基を含む、請求項３４に記 載の方法。
36. ３６．前記リーダーが、本質的に以下の配列からなる、請求項３５に記載の方法 。
37. ３７．前記ペプチドが、ＡＮＰ、脳性ナトリウム利尿ペプチド、ソマトスタチン 、グルカゴン様ペプチド、カルシトニン、肺表面活性剤、インシュリン、成長ホ ルモン放出因子、プラジキニン、エンドルフィン、およびエンケファリンからな る群から選択される、請求項３６に記載の方法。
38. ３８．前記ペプチドが、ヒトＡＮＰまたはＡＮＰの類似体である、請求項３７に 記載の方法。
39. ３９．前記ペプチドが、本質的に以下の配列【配列があります】 からなる、請求項３８に記載の方法。