JP2574146B2 - ポリペプチド発現ベクタ−、該ベクタ−で形質転換した宿主及び該宿主によるポリペプチドの製造法 - Google Patents
ポリペプチド発現ベクタ−、該ベクタ−で形質転換した宿主及び該宿主によるポリペプチドの製造法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はポリペプチドの製造法、より詳しくは遺伝子
工学的手法によるポリペプチドの製造法に関する。
工学的手法によるポリペプチドの製造法に関する。
従来の技術 遺伝子工学的手法により、大腸菌、枯草菌等の細菌類
や酵母、動物細胞等を宿主として、インターフエロン、
成長ホルモン等の有用な各種ポリペプチドを製造する方
法は既に種々提案されている。しかしながら提案された
方法は、いずれもそれぞれ何らかの未解決の問題点を残
している。例えばλPL、trp等の強力なプロモーターを
用いて大腸菌を宿主として菌体細胞質内で有用産物を発
現させる系では、時として菌体蛋白の数十%に達する産
物が得られる〔D.C.Williams et al.,Science,215,687-
689(1982);池原森男ら,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,8
1,5956-5960(1984)〕が、この系により得られる産物
の多くはそのN末端に不要なメチオニン残基を有してお
り、目的とする天然型ポリペプチドと同一のポリペプチ
ドは製造できず、また上記系では有用産物は菌体内で不
溶性の粒子を形成するため、その回収がはなはだ困難な
不利がある。
や酵母、動物細胞等を宿主として、インターフエロン、
成長ホルモン等の有用な各種ポリペプチドを製造する方
法は既に種々提案されている。しかしながら提案された
方法は、いずれもそれぞれ何らかの未解決の問題点を残
している。例えばλPL、trp等の強力なプロモーターを
用いて大腸菌を宿主として菌体細胞質内で有用産物を発
現させる系では、時として菌体蛋白の数十%に達する産
物が得られる〔D.C.Williams et al.,Science,215,687-
689(1982);池原森男ら,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,8
1,5956-5960(1984)〕が、この系により得られる産物
の多くはそのN末端に不要なメチオニン残基を有してお
り、目的とする天然型ポリペプチドと同一のポリペプチ
ドは製造できず、また上記系では有用産物は菌体内で不
溶性の粒子を形成するため、その回収がはなはだ困難な
不利がある。
また上記系においては、目的ポリペプチドをコードす
る遺伝子を、他のポリペプチドをコードする遺伝子と結
合させて、融合ポリペプチドとして発現させる方法も知
られている。この方法では、得られる融合ポリペプチド
からの目的ポリペプチドの分離は、トリプシン等の酵素
による処理やシアノゲンブロマイド等を用いた化学的処
理によつている。しかしながらこの方法では目的のポリ
ペプチド鎖内に使用する酵素又は化学薬品の標的となる
アミノ酸配列が存在すれば、その個所でペプチド鎖が切
断され、結局目的ポリペプチドは製造はできない。ま
た、上記方法により融合ポリペプチドからの目的ポリペ
プチドの分離が可能な場合といえども、目的ポリペプチ
ドの単離のためには、通常菌体粗抽出液から融合ポリペ
プチドを分離する工程及び融合ポリペプチドを切断した
反応組成物から目的ポリペプチドを分離する工程の2回
の精製操作が必要となり、その操作及び工程自体煩雑と
なり、しかも目的物の収率の低下は避けられない。
る遺伝子を、他のポリペプチドをコードする遺伝子と結
合させて、融合ポリペプチドとして発現させる方法も知
られている。この方法では、得られる融合ポリペプチド
からの目的ポリペプチドの分離は、トリプシン等の酵素
による処理やシアノゲンブロマイド等を用いた化学的処
理によつている。しかしながらこの方法では目的のポリ
ペプチド鎖内に使用する酵素又は化学薬品の標的となる
アミノ酸配列が存在すれば、その個所でペプチド鎖が切
断され、結局目的ポリペプチドは製造はできない。ま
た、上記方法により融合ポリペプチドからの目的ポリペ
プチドの分離が可能な場合といえども、目的ポリペプチ
ドの単離のためには、通常菌体粗抽出液から融合ポリペ
プチドを分離する工程及び融合ポリペプチドを切断した
反応組成物から目的ポリペプチドを分離する工程の2回
の精製操作が必要となり、その操作及び工程自体煩雑と
なり、しかも目的物の収率の低下は避けられない。
更に天然型と同一のアミノ酸配列を有する有用産物を
容易に回収できる系として、シグナルペプチドを利用
し、大腸菌、枯草菌等を宿主として有用産物を分泌発現
させる系も知られているが、慨してこの方法により得ら
れる有用産物の量は多くない。大腸菌等を宿主とした系
においては、産物の生産量を高める手段として例えば培
養温度の上昇によりプロモーターを活性化させる方法、
ベクターのコピー数を高める方法等の手段も提案されて
いる。しかしながら細菌の蛋白分泌機構は、動物等で見
られるのと類似の機構であって、細胞膜に埋めこまれた
多くの蛋白質等の共同作用によるものであることが解明
されつつあり、上記各種の手段では細胞の正常な機能と
しての分泌機能が損われる可能性が高く、事実之等の手
段の採用によっても有用産物が多量に生産された例は殆
んど報告されていない。
容易に回収できる系として、シグナルペプチドを利用
し、大腸菌、枯草菌等を宿主として有用産物を分泌発現
させる系も知られているが、慨してこの方法により得ら
れる有用産物の量は多くない。大腸菌等を宿主とした系
においては、産物の生産量を高める手段として例えば培
養温度の上昇によりプロモーターを活性化させる方法、
ベクターのコピー数を高める方法等の手段も提案されて
いる。しかしながら細菌の蛋白分泌機構は、動物等で見
られるのと類似の機構であって、細胞膜に埋めこまれた
多くの蛋白質等の共同作用によるものであることが解明
されつつあり、上記各種の手段では細胞の正常な機能と
しての分泌機能が損われる可能性が高く、事実之等の手
段の採用によっても有用産物が多量に生産された例は殆
んど報告されていない。
また、大腸菌、酵母等以外の動植物を宿主とする系で
は、動植物細胞の増殖速度が遅いこと及び大腸菌のλ
PL、tacプロモーター等を用いた高発現系に匹敵する系
が未だ得られていないこと等の理由により、有用産物を
多量に発現させるシステムは尚確立されるには至ってい
ない。
は、動植物細胞の増殖速度が遅いこと及び大腸菌のλ
PL、tacプロモーター等を用いた高発現系に匹敵する系
が未だ得られていないこと等の理由により、有用産物を
多量に発現させるシステムは尚確立されるには至ってい
ない。
発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、殊に有用産物の発現量を高めること
のできる改良されたポリペプチド発現ベクター、該ベク
ターを保有する宿主及び該宿主の培養による目的ポリペ
プチドの製造技術を提供することにある。
のできる改良されたポリペプチド発現ベクター、該ベク
ターを保有する宿主及び該宿主の培養による目的ポリペ
プチドの製造技術を提供することにある。
問題点を解決するための手段 本発明によれば、プロモーター、リボゾーム結合部
位、開始コドンと停止コドンと外来ポリペプチドのN末
端にシグナルペプチドを連結された融合ポリペプチドを
コードするDNA塩基配列とを含む構造遺伝子、及び転写
終結信号を、この順序で連結した情報単位の複数個を含
む菌体外排出用ポリペプチド発現ベクターで形質転換さ
れた大腸菌を培養し、菌体外に排出されるポリペプチド
を採取することを特徴とするポリペプチドの製造法が提
供される。
位、開始コドンと停止コドンと外来ポリペプチドのN末
端にシグナルペプチドを連結された融合ポリペプチドを
コードするDNA塩基配列とを含む構造遺伝子、及び転写
終結信号を、この順序で連結した情報単位の複数個を含
む菌体外排出用ポリペプチド発現ベクターで形質転換さ
れた大腸菌を培養し、菌体外に排出されるポリペプチド
を採取することを特徴とするポリペプチドの製造法が提
供される。
本明細書において、アミノ酸、核酸塩基、その他に関
して略号で表示する場合はIUPAC、IUBの規定或いは当該
分野における慣用記号に従うものとし、その例を次に挙
げる。
して略号で表示する場合はIUPAC、IUBの規定或いは当該
分野における慣用記号に従うものとし、その例を次に挙
げる。
Ser;セリン Leu;ロイシン Arg;アルギニン Cys;システイン Gln;グルタミン Ile;イソロイシン Pro;プロリン Val;バリン His;ヒスチジン Met;メチオニン Ala;アラニン Phe;フエニルアラニン Gly;グリシン Asp;アスパラギン酸 Asn;アスパラギン Trp;トリプトフアン Try;チロシン Thr;スレオニン A ;アデニン T ;チミン G ;グアニン C ;シトシン 本発明者らは、前記シグナルペプチドを利用した分泌
発現系として、先に実際に宿主細胞内に導入することに
よつて目的ポリペプチドを成熟ポリペプチド、即ち細胞
外に分泌され不要アミノ酸を持たない形態の目的ポリペ
プチドとして分泌させ得る新しいポリペプチド分泌発現
ベクターの構築及び該ベクターの利用による目的ポリペ
プチドの製造に成功し、この知見に基づく発明を特許出
願した(特願昭59-271206号)。上記発明に係わる代表
的なひとつのベクターは、プロモーター、リボゾーム結
合部位、β−ラクタマーゼのシグナルペプチドをコード
する塩基配列(開始コドンを含む)、β−ウロガストロ
ンをコードする塩基配列(停止コドンを含む)及び転写
終結信号を正確にこの順序で配列された一個の情報単位
を含むものであった。
発現系として、先に実際に宿主細胞内に導入することに
よつて目的ポリペプチドを成熟ポリペプチド、即ち細胞
外に分泌され不要アミノ酸を持たない形態の目的ポリペ
プチドとして分泌させ得る新しいポリペプチド分泌発現
ベクターの構築及び該ベクターの利用による目的ポリペ
プチドの製造に成功し、この知見に基づく発明を特許出
願した(特願昭59-271206号)。上記発明に係わる代表
的なひとつのベクターは、プロモーター、リボゾーム結
合部位、β−ラクタマーゼのシグナルペプチドをコード
する塩基配列(開始コドンを含む)、β−ウロガストロ
ンをコードする塩基配列(停止コドンを含む)及び転写
終結信号を正確にこの順序で配列された一個の情報単位
を含むものであった。
本発明者らは、引続く研究において、上記ベクターの
有する情報単位を同一ベクター内に複数個導入したベク
ターの構築に成功すると共に、該ベクターで形質転換し
た宿主によれば、先に開発した上記単一個の情報単位を
含むベクターで形質転換したそれに比し、より著量の目
的ポリペプチドが発現されるという事実を発見し、ここ
に本発明を完成した。
有する情報単位を同一ベクター内に複数個導入したベク
ターの構築に成功すると共に、該ベクターで形質転換し
た宿主によれば、先に開発した上記単一個の情報単位を
含むベクターで形質転換したそれに比し、より著量の目
的ポリペプチドが発現されるという事実を発見し、ここ
に本発明を完成した。
本発明に利用するベクター(以下これを単に「本発明
ベクター」という)は、プロモーター、リボゾーム結合
部位、開始コドンと停止コドンと外来ポリペプチドとシ
グナルペプチドとの融合ポリペプチドをコードするDNA
塩基配列)とを含む構造遺伝子及び転写終結信号をこの
順序で連結した情報単位を複数個含むことをその必須構
成要件とする。
ベクター」という)は、プロモーター、リボゾーム結合
部位、開始コドンと停止コドンと外来ポリペプチドとシ
グナルペプチドとの融合ポリペプチドをコードするDNA
塩基配列)とを含む構造遺伝子及び転写終結信号をこの
順序で連結した情報単位を複数個含むことをその必須構
成要件とする。
上記情報単位を構成するプロモーターを始めとする各
エレメントは、之等が上記順序で並んでいることが外来
ポリペプチドの発現にとり必須ではあるが、全てのエレ
メントが直接に連結されている必要はなく、例えば、プ
ロモーターとリボゾーム結合部位の間、リボゾーム結合
部位と外来ポリペプチドをコードするDNA塩基配列との
間、該ポリペプチドをコードするDNA塩基配列と転写終
結信号との間等には、通常のこの種ポリペプチド発現ベ
クターと同様に任意のDNA塩基配列が挿入されていても
よい。
エレメントは、之等が上記順序で並んでいることが外来
ポリペプチドの発現にとり必須ではあるが、全てのエレ
メントが直接に連結されている必要はなく、例えば、プ
ロモーターとリボゾーム結合部位の間、リボゾーム結合
部位と外来ポリペプチドをコードするDNA塩基配列との
間、該ポリペプチドをコードするDNA塩基配列と転写終
結信号との間等には、通常のこの種ポリペプチド発現ベ
クターと同様に任意のDNA塩基配列が挿入されていても
よい。
また、上記複数個の情報単位は、之等が同一の外来ポ
リペプチドをコードするDNA塩基配列を含んでいる限
り、プロモーター等の発現を指示するDNA塩基配列まで
完全に同一である必要はなく、上記ポリペプチドをコー
ドするDNA塩基配列もコドンの選択の許される範囲で異
なるものであってもよい。またシグナルペプチドのアミ
ノ酸配列及びアミノ酸残基数も異なっていてもよい。更
に上記情報単位は、同一の起源ベクター内に単純に繰返
し連結されていてもよく、該ベクター内の任意の複数位
置に別々に導入されていてもよい。また上記情報単位を
複数個導入すべき起源ベクターは、大腸菌等の原核細胞
由来のものである必要はなく、動植物、酵母等の真核細
胞のベクターであってもよく、本発明ベクターを導入し
て形質転換する宿主も原核細胞に限定されず、動植物、
酵母等の真核細胞であることができる。
リペプチドをコードするDNA塩基配列を含んでいる限
り、プロモーター等の発現を指示するDNA塩基配列まで
完全に同一である必要はなく、上記ポリペプチドをコー
ドするDNA塩基配列もコドンの選択の許される範囲で異
なるものであってもよい。またシグナルペプチドのアミ
ノ酸配列及びアミノ酸残基数も異なっていてもよい。更
に上記情報単位は、同一の起源ベクター内に単純に繰返
し連結されていてもよく、該ベクター内の任意の複数位
置に別々に導入されていてもよい。また上記情報単位を
複数個導入すべき起源ベクターは、大腸菌等の原核細胞
由来のものである必要はなく、動植物、酵母等の真核細
胞のベクターであってもよく、本発明ベクターを導入し
て形質転換する宿主も原核細胞に限定されず、動植物、
酵母等の真核細胞であることができる。
以下、本発明ベクターの製造技術につき詳述する。
本発明ベクターの起源ベクターとしては、従来より外
来遺伝子のクローニングに用いられている各種のもの、
例えばプラスミド、バクテリオフアージ、ウイルスDN
A、コスミド等に由来する各種のものでよい。特に好適
な起源ベクターの具体例としては、大腸菌由来のプラス
ミドベクターであるpBR322、後記参考例に示すpGH54、p
GH55等、枯草菌−大腸菌シヤトルベクターpKK01〔第8
回日本分子生物学会年会・講演要旨集第173頁、昭和60
年11月15日発行〕及び之等の誘導体を例示できる。他の
具体例としては、例えはバクテリオフアージ由来のベク
ターとしてM13mp8〔Messing,J.,Methods in Enzymolog
y,101,20-78(1983)〕を、ウイルスDNA由来のベクター
としてpHSV-106〔Mc Knight,S.L.and Grace,E.R.,Nucle
ic Acids Res.,8,5931(1980)〕を、コスミドベクター
としてpJB8〔Ish-Horowicz,D.and Burke,J.F.,Nucleic
Acids Res.,9,2989(1981)〕を及びこれらの誘導体を
各々例示できる。
来遺伝子のクローニングに用いられている各種のもの、
例えばプラスミド、バクテリオフアージ、ウイルスDN
A、コスミド等に由来する各種のものでよい。特に好適
な起源ベクターの具体例としては、大腸菌由来のプラス
ミドベクターであるpBR322、後記参考例に示すpGH54、p
GH55等、枯草菌−大腸菌シヤトルベクターpKK01〔第8
回日本分子生物学会年会・講演要旨集第173頁、昭和60
年11月15日発行〕及び之等の誘導体を例示できる。他の
具体例としては、例えはバクテリオフアージ由来のベク
ターとしてM13mp8〔Messing,J.,Methods in Enzymolog
y,101,20-78(1983)〕を、ウイルスDNA由来のベクター
としてpHSV-106〔Mc Knight,S.L.and Grace,E.R.,Nucle
ic Acids Res.,8,5931(1980)〕を、コスミドベクター
としてpJB8〔Ish-Horowicz,D.and Burke,J.F.,Nucleic
Acids Res.,9,2989(1981)〕を及びこれらの誘導体を
各々例示できる。
本発明ポリペプチド発現ベクターに含まれる情報単位
を構成する、プロモーター、リボゾーム結合部位及び転
写終結信号としては、上記起源ベクターに含まれている
ものをそのまま用いることができるが、これに限定され
ることなく、従来公知の各種微生物又はウイルス由来の
これらの調節因子をも用いることができる。
を構成する、プロモーター、リボゾーム結合部位及び転
写終結信号としては、上記起源ベクターに含まれている
ものをそのまま用いることができるが、これに限定され
ることなく、従来公知の各種微生物又はウイルス由来の
これらの調節因子をも用いることができる。
プロモーターの例としては、例えば大腸菌のλPL、λ
PR、tac、trp、lacUV5、lac、bla等のプロモーターや枯
草菌のSPO2プロモーター等を挙げることができる。
PR、tac、trp、lacUV5、lac、bla等のプロモーターや枯
草菌のSPO2プロモーター等を挙げることができる。
リボゾーム結合部位としては、大腸菌β−ガラクトシ
ダーゼやβ−ラクタマーゼのSD配列等を例示できる。
ダーゼやβ−ラクタマーゼのSD配列等を例示できる。
転写終結信号としては、大腸菌のβ−ラクタマーゼの
転写終結信号、λフアージのtL1等を例示できる。
転写終結信号、λフアージのtL1等を例示できる。
上記各調節因子は、これらを含むDNAより常法に従い
取り出した後、適切に外来ポリペプチドをコードするDN
A塩基配列と結合させて情報単位を構成させることもで
き、また必要なものを適当に起源ベクターに導入するこ
ともできる。之等の各操作は、常法に従えばよい。
取り出した後、適切に外来ポリペプチドをコードするDN
A塩基配列と結合させて情報単位を構成させることもで
き、また必要なものを適当に起源ベクターに導入するこ
ともできる。之等の各操作は、常法に従えばよい。
本発明のポリペプチド発現ベクターに、情報単位を構
成する遺伝子として保有される外来ポリペプチドをコー
ドするDNA塩基配列としては、ヒト、動物、植物、微生
物に由来し、何らかの生理機能を有する各種のポリペプ
チドをコードするDNA塩基配列がいずれも利用できる。
上記ポリペプチドの例としては、例えば上皮細胞成長因
子、ソマトスタチン、インシュリン、GIP、R-MSA、サイ
モシンβ4、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子等の
ホルモン及び成長因子類、インターフエロン、インター
ロイキン2、腫瘍壊死因子等のリンフオカイン免疫調節
物質類、血清アルブミン、プラスミノーゲンアクテイベ
ーター、アポリポプロテイン等の血液構成物質、B型肝
炎ウイルス表面抗原等のワクチン用抗原蛋白質等を例示
できる。
成する遺伝子として保有される外来ポリペプチドをコー
ドするDNA塩基配列としては、ヒト、動物、植物、微生
物に由来し、何らかの生理機能を有する各種のポリペプ
チドをコードするDNA塩基配列がいずれも利用できる。
上記ポリペプチドの例としては、例えば上皮細胞成長因
子、ソマトスタチン、インシュリン、GIP、R-MSA、サイ
モシンβ4、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子等の
ホルモン及び成長因子類、インターフエロン、インター
ロイキン2、腫瘍壊死因子等のリンフオカイン免疫調節
物質類、血清アルブミン、プラスミノーゲンアクテイベ
ーター、アポリポプロテイン等の血液構成物質、B型肝
炎ウイルス表面抗原等のワクチン用抗原蛋白質等を例示
できる。
之等の各種ポリペプチドをコードするDNA塩基配列
は、それらの起源とする細胞等から通常の方法に従い抽
出単離してもよく、之等細胞等から抽出したmRNAを鋳型
としてcDNAとして製造されてもよく、また之等ポリペプ
チドのアミノ酸配列に従い化学合成されてもよく、之等
各方法の組合せにより製造されてもよい。
は、それらの起源とする細胞等から通常の方法に従い抽
出単離してもよく、之等細胞等から抽出したmRNAを鋳型
としてcDNAとして製造されてもよく、また之等ポリペプ
チドのアミノ酸配列に従い化学合成されてもよく、之等
各方法の組合せにより製造されてもよい。
上記ポリペプチドをコードするDNA塩基配列は、また
真核細胞を宿主ベクターとする場合には、そのDNA塩基
配列中に介在配列(イントロン)を含んでいてもよい。
真核細胞を宿主ベクターとする場合には、そのDNA塩基
配列中に介在配列(イントロン)を含んでいてもよい。
本発明ベクターにおいて、情報単位を構成する上記遺
伝子は、開始コドン(ATG)と停止コドン(TAA、TAG又
はTGA)とを有する外来ポリペプチドをコードするDNA塩
基配列(介在配列を含むものを包含する)と共に、外来
ポリペプチドを成熟(天然型)ポリペプチドとして分泌
発現させるために、該ポリペプチドのN末端にシグナル
ペプチドが連結された融合ポリペプチドをコードするDN
A塩基配列であるのがよい。
伝子は、開始コドン(ATG)と停止コドン(TAA、TAG又
はTGA)とを有する外来ポリペプチドをコードするDNA塩
基配列(介在配列を含むものを包含する)と共に、外来
ポリペプチドを成熟(天然型)ポリペプチドとして分泌
発現させるために、該ポリペプチドのN末端にシグナル
ペプチドが連結された融合ポリペプチドをコードするDN
A塩基配列であるのがよい。
上記において、シグナルペプチドとしては、従来より
知られているシグナルペプチド、例えば代表的には下記
式(1)で示されるアミノ酸配列を有する大腸菌のβ−
ラクタマーゼのシグナルペプチドを例示することができ
る。
知られているシグナルペプチド、例えば代表的には下記
式(1)で示されるアミノ酸配列を有する大腸菌のβ−
ラクタマーゼのシグナルペプチドを例示することができ
る。
Met-Ser-Ile-Gln-His-Phe-Arg-Val-Ala-Leu-Ile-Pro-Ph
e-Phe-Ala-Ala-Phe-Cys-Leu-Pro-Val-Phe-Ala (1) 他のシグナルペプチドとしては、大腸菌リン酸結合蛋
白(PhoS)のシグナルペプチドや枯草菌α−アミラーゼ
のシグナルペプチド等を例示できる。之等及びその他の
シグナルペプチドを含むプラスミドとしては、以下のも
のを例示できる。
e-Phe-Ala-Ala-Phe-Cys-Leu-Pro-Val-Phe-Ala (1) 他のシグナルペプチドとしては、大腸菌リン酸結合蛋
白(PhoS)のシグナルペプチドや枯草菌α−アミラーゼ
のシグナルペプチド等を例示できる。之等及びその他の
シグナルペプチドを含むプラスミドとしては、以下のも
のを例示できる。
プラスミドpTUB4〔バチルス・ズブチリス由来のα−
アミラーゼのシグナルペプチド、H.Yamazaki et al.,J.
Bacteriol.,156,327-337(1983)〕、 プラスミドpHC5〔大腸菌由来のマルトース結合蛋白の
シグナルペプチド、H.Bedouelle et al.,Nature,285,78
-81(1980)〕、 プラスミドpSN518〔大腸菌由来のリン酸結合蛋白のシ
グナルペプチド、K.Magota et al.,J.Bacteriol.,157,9
09-917(1984)〕、 プラスミドpJP12〔大腸菌由来のリン酸制限下に誘導
される外膜蛋白のシグナルペプチド、N.Overbeeke et a
l.,J.Mol.Biol.,163,513-532(1983)〕等。
アミラーゼのシグナルペプチド、H.Yamazaki et al.,J.
Bacteriol.,156,327-337(1983)〕、 プラスミドpHC5〔大腸菌由来のマルトース結合蛋白の
シグナルペプチド、H.Bedouelle et al.,Nature,285,78
-81(1980)〕、 プラスミドpSN518〔大腸菌由来のリン酸結合蛋白のシ
グナルペプチド、K.Magota et al.,J.Bacteriol.,157,9
09-917(1984)〕、 プラスミドpJP12〔大腸菌由来のリン酸制限下に誘導
される外膜蛋白のシグナルペプチド、N.Overbeeke et a
l.,J.Mol.Biol.,163,513-532(1983)〕等。
上記シグナルペプチドをコードするDNA塩基配列は、
コドンの選択の許される範囲内で任意に選択することが
できる。また該シグナルペプチドをコードするDNA塩基
配列又はこれを含む塩基配列は、従来公知の各種の方
法、例えばこれを含有する微生物、それから単離された
プラスミド等、好ましくは例えばpBR322等から制限酵素
等を利用して切断単離する方法、そのDNA塩基配列に従
い化学合成する方法、之等の方法の組合せ等により容易
に製造することができ、該シグナルペプチドをコードす
るDNA塩基配列と、外来ポリペプチドをコードするDNA塩
基配列との連結乃至結合も、従来公知の各種方法、例え
ばT4 DNAリガーゼ等を用いる酵素反応等に従つて行なう
ことができる。
コドンの選択の許される範囲内で任意に選択することが
できる。また該シグナルペプチドをコードするDNA塩基
配列又はこれを含む塩基配列は、従来公知の各種の方
法、例えばこれを含有する微生物、それから単離された
プラスミド等、好ましくは例えばpBR322等から制限酵素
等を利用して切断単離する方法、そのDNA塩基配列に従
い化学合成する方法、之等の方法の組合せ等により容易
に製造することができ、該シグナルペプチドをコードす
るDNA塩基配列と、外来ポリペプチドをコードするDNA塩
基配列との連結乃至結合も、従来公知の各種方法、例え
ばT4 DNAリガーゼ等を用いる酵素反応等に従つて行なう
ことができる。
上記シグナルペプチドをコードするDNA塩基配列又は
これと外来ポリペプチドとの融合ポリペプチドをコード
するDNA塩基配列と、前記各調節因子との結合による情
報単位の構築操作及び/又は各調節因子を保有する起源
ベクターへの上記DNA塩基配列の導入操作は、従来より
よく知られている通常の方法及びこの種外来遺伝子をベ
クターに組込む際に用いられる公知のこれら操作に従う
ことができる。
これと外来ポリペプチドとの融合ポリペプチドをコード
するDNA塩基配列と、前記各調節因子との結合による情
報単位の構築操作及び/又は各調節因子を保有する起源
ベクターへの上記DNA塩基配列の導入操作は、従来より
よく知られている通常の方法及びこの種外来遺伝子をベ
クターに組込む際に用いられる公知のこれら操作に従う
ことができる。
本発明に利用できる特に好ましい上記シグナルペプチ
ドを保有するベクターの具体例としては、pBR322を起源
ベクターとして構築されたpGH54及びpGH55を例示でき
る。これらのプラスミドの内でpGH54は、β−ラクタマ
ーゼのプロモーター及びリボゾーム結合部位に続いてβ
−ラクタマーゼのシグナルペプチドをコードするDNA塩
基配列を有し、この塩基配列の3′末端にNru I及びPvu
IIの制限酵素認識配列を有するものである。その特性
は、その製造概略操作と共に第1図に示した通りであ
る。
ドを保有するベクターの具体例としては、pBR322を起源
ベクターとして構築されたpGH54及びpGH55を例示でき
る。これらのプラスミドの内でpGH54は、β−ラクタマ
ーゼのプロモーター及びリボゾーム結合部位に続いてβ
−ラクタマーゼのシグナルペプチドをコードするDNA塩
基配列を有し、この塩基配列の3′末端にNru I及びPvu
IIの制限酵素認識配列を有するものである。その特性
は、その製造概略操作と共に第1図に示した通りであ
る。
第1図より、pGH54は図示された制限酵素開裂地図に
より特徴付けられ、その大きさは、1.0%アガロースゲ
ル電気泳動による測定の結果、約3.9kbである。このプ
ラスミドpGH54を保有する大腸菌HB101株は、通商産業省
工業技術院微生物工業技術研究所に「HB101〔pGH54〕」
なる表示で、微工研条寄第679号(FERM BP-679)として
寄託されている。
より特徴付けられ、その大きさは、1.0%アガロースゲ
ル電気泳動による測定の結果、約3.9kbである。このプ
ラスミドpGH54を保有する大腸菌HB101株は、通商産業省
工業技術院微生物工業技術研究所に「HB101〔pGH54〕」
なる表示で、微工研条寄第679号(FERM BP-679)として
寄託されている。
またpGH55は、β−ラクタマーゼのプロモーター及び
リボゾーム結合部位に続いてβ−ラクタマーゼのシグナ
ルペプチドをコードするDNA塩基配列を有している点に
おいてpGH54と共通するが、該pGH54における第2のPvu
II制限サイトを含む637塩基のDNAを欠くものであり、第
1のPvu II制限サイトをシグナルペプチドをコードする
DNA塩基配列の3′末端付近に有している。その特性
は、その製造概略操作と共に第2図に示した通りであ
る。
リボゾーム結合部位に続いてβ−ラクタマーゼのシグナ
ルペプチドをコードするDNA塩基配列を有している点に
おいてpGH54と共通するが、該pGH54における第2のPvu
II制限サイトを含む637塩基のDNAを欠くものであり、第
1のPvu II制限サイトをシグナルペプチドをコードする
DNA塩基配列の3′末端付近に有している。その特性
は、その製造概略操作と共に第2図に示した通りであ
る。
第2図より、pGH55は図示された制限酵素開裂地図に
より特徴付けられ、その大きさは、上記方法に従い測定
した結果、約3.3kbである。このプラスミドpGH55を保有
する大腸菌HB101株は、通商産業省工業技術院微生物工
業技術研究所に「HB101〔pGH55〕」なる表示で、微工研
条寄第680号(FERM BP-680)として寄託されている。
より特徴付けられ、その大きさは、上記方法に従い測定
した結果、約3.3kbである。このプラスミドpGH55を保有
する大腸菌HB101株は、通商産業省工業技術院微生物工
業技術研究所に「HB101〔pGH55〕」なる表示で、微工研
条寄第680号(FERM BP-680)として寄託されている。
上記pGH54、pGH55等のプロモーター等の調節因子とシ
グナルペプチドのDNA塩基配列とを保有するプラスミド
ベクターへの外来ポリペプチドをコードするDNA塩基配
列の導入操作は、通常の方法に従い制限酵素を用いる酵
素反応やT4 DNAリガーゼを用いる酵素反応等を利用して
実施できる。また、予め上記ポリペプチドとシグナルペ
プチドとの融合ポリペプチドのDNA塩基配列を化学合成
した後、このDNA塩基配列を、適当な調節因子を保有す
る起源ベクターに導入することもできる。
グナルペプチドのDNA塩基配列とを保有するプラスミド
ベクターへの外来ポリペプチドをコードするDNA塩基配
列の導入操作は、通常の方法に従い制限酵素を用いる酵
素反応やT4 DNAリガーゼを用いる酵素反応等を利用して
実施できる。また、予め上記ポリペプチドとシグナルペ
プチドとの融合ポリペプチドのDNA塩基配列を化学合成
した後、このDNA塩基配列を、適当な調節因子を保有す
る起源ベクターに導入することもできる。
かくして単一個の情報単位を保有するポリペプチド発
現ベクターを得ることができる。
現ベクターを得ることができる。
上記単一個の情報単位を有するポリペプチド発現ベク
ターの好ましい例としては、pUG201、pUGT150及びpUGT1
50Sを例示できる。
ターの好ましい例としては、pUG201、pUGT150及びpUGT1
50Sを例示できる。
pUG201は、大きさ約3.7kbであり、β−ラクタマーゼ
のプロモーター、リボゾーム結合部位、開始コドンを含
むβ−ラクタマーゼのシグナルペプチドのDNA塩基配
列、β−ウロガストロン(外来ポリペプチド)のDNA塩
基配列、その停止コドン及び転写終結信号が正確にこの
順序で配列されたDNA塩基配列を有している。その配列
は、後記参考例において第4表として示した通りであ
る。該プラスミドpUG201を保有する大腸菌HB101株は、
「HB101〔pUG201〕」なる表示で、微工研条寄第681号
(FERM BP-681)として寄託されている。
のプロモーター、リボゾーム結合部位、開始コドンを含
むβ−ラクタマーゼのシグナルペプチドのDNA塩基配
列、β−ウロガストロン(外来ポリペプチド)のDNA塩
基配列、その停止コドン及び転写終結信号が正確にこの
順序で配列されたDNA塩基配列を有している。その配列
は、後記参考例において第4表として示した通りであ
る。該プラスミドpUG201を保有する大腸菌HB101株は、
「HB101〔pUG201〕」なる表示で、微工研条寄第681号
(FERM BP-681)として寄託されている。
pUGT150は、大きさ約3.9kbであり、pUG201の配列か
ら、β−ラクタマーゼのプロモーター及びリボゾーム結
合部位を除き、代りにベクターpDR540〔D.R.Russellと
G.N.Bennett.,Gene,20,231-243(1982)〕に含まれるta
cプロモーターと、これに付属するlacオペレーター及び
リボゾーム結合部位が挿入されたベクターである。該ベ
クター構築の詳細は、後記参考例に述べる通りであり、
またその概略図を第5図に示す。該pUG150を保有する大
腸菌JM103株は、「JM103〔pUGT150〕」なる表示で、微
工研条寄第974号(FERM BP-974)として寄託されてい
る。
ら、β−ラクタマーゼのプロモーター及びリボゾーム結
合部位を除き、代りにベクターpDR540〔D.R.Russellと
G.N.Bennett.,Gene,20,231-243(1982)〕に含まれるta
cプロモーターと、これに付属するlacオペレーター及び
リボゾーム結合部位が挿入されたベクターである。該ベ
クター構築の詳細は、後記参考例に述べる通りであり、
またその概略図を第5図に示す。該pUG150を保有する大
腸菌JM103株は、「JM103〔pUGT150〕」なる表示で、微
工研条寄第974号(FERM BP-974)として寄託されてい
る。
pUGT150Sは、大きさ約3.0kbであり、β−ウロガスト
ロンをコードするDNA塩基配列の3′末端付近の塩基配
列が一部異なる以外は、pUGT150と同一の構造を有して
いる。該pUGT150Sにおけるβ−ウロガストロンをコード
するDNA塩基配列及び該pUGT150Sの構築例を後記参考例
に示す。また該構築の概略図を第6図に示す。
ロンをコードするDNA塩基配列の3′末端付近の塩基配
列が一部異なる以外は、pUGT150と同一の構造を有して
いる。該pUGT150Sにおけるβ−ウロガストロンをコード
するDNA塩基配列及び該pUGT150Sの構築例を後記参考例
に示す。また該構築の概略図を第6図に示す。
上記pUG201、pUGT150及びpUGT150Sにおいては、之等
各ベクターにより生成されるmRNAは、β−ラクタマーゼ
のシグナルペプチドのN端アミノ酸に相当する、メチオ
ニン(Met)をコードする開始コドンの上流から転写が
開始され、シグナルペプチド部分、β−ウロガストロン
部分を経て、更にその下流へと転写がなされ、転写の終
結は、之等ベクターの起源ベクターであるpBR322におけ
るβ−ラクタマーゼの遺伝子の転写終結信号によりなさ
れる。その位置は、β−ウロガストロンをコードするDN
A塩基配列末端の停止コドンの下流約0.6kb付近であると
考えられる。mRNAは転写が終結して始めて機能すると考
えられるため、遺伝子の下流に転写終結信号を有するこ
とは該遺伝子の発現にとり必須であり、上記pUG201等で
はこの転写終結信号としてβ−ラクタマーゼの発現に関
するmRNA転写の終結のための信号を利用しているが、こ
れは同様の機能を有する他の公知のDNA塩基配列、例え
ばλフアージのtL1や大腸菌のtrpA転写終結信号等に代
替することができる。
各ベクターにより生成されるmRNAは、β−ラクタマーゼ
のシグナルペプチドのN端アミノ酸に相当する、メチオ
ニン(Met)をコードする開始コドンの上流から転写が
開始され、シグナルペプチド部分、β−ウロガストロン
部分を経て、更にその下流へと転写がなされ、転写の終
結は、之等ベクターの起源ベクターであるpBR322におけ
るβ−ラクタマーゼの遺伝子の転写終結信号によりなさ
れる。その位置は、β−ウロガストロンをコードするDN
A塩基配列末端の停止コドンの下流約0.6kb付近であると
考えられる。mRNAは転写が終結して始めて機能すると考
えられるため、遺伝子の下流に転写終結信号を有するこ
とは該遺伝子の発現にとり必須であり、上記pUG201等で
はこの転写終結信号としてβ−ラクタマーゼの発現に関
するmRNA転写の終結のための信号を利用しているが、こ
れは同様の機能を有する他の公知のDNA塩基配列、例え
ばλフアージのtL1や大腸菌のtrpA転写終結信号等に代
替することができる。
本発明のポリペプチド発現ベクターは、上記pUG201、
pUGT150、pUGT150S等の、プロモーター、リボゾーム結
合部位、開始コドンと外来ポリペプチドをコードするDN
A塩基配列(シグナルペプチドと外来ポリペプチドとが
連結された融合ポリペプチドをコードするDNA塩基配
列)と停止コドン及び転写終結信号をこの順序で連結さ
せて情報単位の単一個を有するベクターを起源として、
これらより上記情報単位又はこれを含むDNA塩基配列を
取り出し、これらを適当なベクターに複数個挿入するこ
とにより製造される。
pUGT150、pUGT150S等の、プロモーター、リボゾーム結
合部位、開始コドンと外来ポリペプチドをコードするDN
A塩基配列(シグナルペプチドと外来ポリペプチドとが
連結された融合ポリペプチドをコードするDNA塩基配
列)と停止コドン及び転写終結信号をこの順序で連結さ
せて情報単位の単一個を有するベクターを起源として、
これらより上記情報単位又はこれを含むDNA塩基配列を
取り出し、これらを適当なベクターに複数個挿入するこ
とにより製造される。
上記複数個の情報単位は、互いに同一である必要はな
く、同一の外来ポリペプチドをコードするDNA塩基配列
を含有するものである限り、他の遺伝情報は異なるもの
であってもよい。之等複数個の情報単位は、予め之等が
同一方向に直列するように連結した後、この形態でひと
つのベクターに挿入することもでき、ひとつのベクター
の任意の複数個所に、単一の情報単位として又はこれを
予め連結した複数の情報単位としてを別個に挿入しても
よく、更に挿入される各情報単位の方向性を異ならせる
こともできる。所望DNA塩基配列部位の取り出し及びそ
の挿入操作は、前記したこの種操作と同様にして実施で
きる。
く、同一の外来ポリペプチドをコードするDNA塩基配列
を含有するものである限り、他の遺伝情報は異なるもの
であってもよい。之等複数個の情報単位は、予め之等が
同一方向に直列するように連結した後、この形態でひと
つのベクターに挿入することもでき、ひとつのベクター
の任意の複数個所に、単一の情報単位として又はこれを
予め連結した複数の情報単位としてを別個に挿入しても
よく、更に挿入される各情報単位の方向性を異ならせる
こともできる。所望DNA塩基配列部位の取り出し及びそ
の挿入操作は、前記したこの種操作と同様にして実施で
きる。
本発明ベクターの代表的具体例としては、例えばpUGT
150S-2、pUGT150S-3及びpUGT150S-4を例示できる。
150S-2、pUGT150S-3及びpUGT150S-4を例示できる。
pUGT150S-2は、大きさ約5.0kbであり、pUGT150Sの有
する情報単位を含むDNA塩基配列を同一方向に2個連結
されたDNA塩基配列を含有するものである。該pUGT150S-
2の構築例は、後記実施例に示される通りであり、また
その概略図を第7図として示す。
する情報単位を含むDNA塩基配列を同一方向に2個連結
されたDNA塩基配列を含有するものである。該pUGT150S-
2の構築例は、後記実施例に示される通りであり、また
その概略図を第7図として示す。
pUGT150S-3及びpUGT150S-4は、各々上記pUGT150S-2と
同様にして構築され、pUGT150Sの有する情報単位を含む
DNA塩基配列の3個及び4個を同一方向に直列に連結さ
せたDNA塩基配列を有するものであり、各々大きさ約6.1
kb及び約7.2kbである。之等の構築例及びその概略は後
記実施例並びに第8図及び第9図に示す通りである。
同様にして構築され、pUGT150Sの有する情報単位を含む
DNA塩基配列の3個及び4個を同一方向に直列に連結さ
せたDNA塩基配列を有するものであり、各々大きさ約6.1
kb及び約7.2kbである。之等の構築例及びその概略は後
記実施例並びに第8図及び第9図に示す通りである。
また上記各ベクターを保有する大腸菌JM103株は、各
々実施例に示される名称及び寄託番号で、通商産業省工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。
々実施例に示される名称及び寄託番号で、通商産業省工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。
本発明のポリペプチド発現ベクターの宿主細胞(大腸
菌)への導入は、公知の各種方法に従って行なうことが
でき、大腸菌としても限定はないが、特に大腸菌K12株
由来のHB101株〔H.W.Boyer and D.Roulland-Dussoix.,
J.Mol.Biol.,41,459-472(1969)〕及びJM103株〔J.Mes
sing et al.,Nucleic Acids Res.,9,309(1981)〕は好
ましい。
菌)への導入は、公知の各種方法に従って行なうことが
でき、大腸菌としても限定はないが、特に大腸菌K12株
由来のHB101株〔H.W.Boyer and D.Roulland-Dussoix.,
J.Mol.Biol.,41,459-472(1969)〕及びJM103株〔J.Mes
sing et al.,Nucleic Acids Res.,9,309(1981)〕は好
ましい。
前記各種の宿主細胞はいずれも菌体外分泌成分、外膜
構成成分等の、細胞の正常な機能維持に必要なポリペプ
チドの分泌のための機構としてそれぞれシグナルペプチ
ダーゼを有しており、之等シグナルペプチダーゼの基質
特異性には殆んど差のないことが知られている〔D.Perl
man and H.O.Halvorson,J.Mol.Biol.,167,391(198
3)〕。
構成成分等の、細胞の正常な機能維持に必要なポリペプ
チドの分泌のための機構としてそれぞれシグナルペプチ
ダーゼを有しており、之等シグナルペプチダーゼの基質
特異性には殆んど差のないことが知られている〔D.Perl
man and H.O.Halvorson,J.Mol.Biol.,167,391(198
3)〕。
上記宿主細胞への本発明ベクターの導入方法の具体例
としては、例えば宿主細胞を低温で塩化カルシウムを含
む水溶液中で処理し、該溶液中にベクターを添加する方
法〔E.Lederberg and S.Cohen,J.Bacteriol.,119,1072
(1974)〕を例示できる。
としては、例えば宿主細胞を低温で塩化カルシウムを含
む水溶液中で処理し、該溶液中にベクターを添加する方
法〔E.Lederberg and S.Cohen,J.Bacteriol.,119,1072
(1974)〕を例示できる。
上記のようにして、本発明ベクターの導入により形質
転換した細胞を収得することができ、本発明は、かかる
形質転換された宿主細胞をも提供するものである。
転換した細胞を収得することができ、本発明は、かかる
形質転換された宿主細胞をも提供するものである。
本発明の上記ベクターにより形質転換された細胞は、
通常の細胞を培養するために用いられる適当な培地を用
いて培養することができる。該培地としては、例えばL
培地、E培地、M9培地、M63培地等の各種の培地を好ま
しく用いることができる。また之等の培地には、更に通
常知られている各種の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミ
ン類、天然物抽出物、生理活性物質等を添加することも
でき、かかる培地も好ましく利用できる。培養は、前記
宿主細胞の生育に適したpH、温度、通気、攪拌等の条件
を採用した各種の方法により実施できる。例えば大腸菌
の場合には、pH約5〜8の範囲、特にpH7が適当であ
り、約20〜43℃の温度で、通気攪拌条件で培養すること
が望ましく、培養のスケールには特に限定はない。更に
目的ポリペプチドの発現量乃至分泌量を高めるため、ま
た菌体外への目的ポリペプチドの排出を促進乃至抑制す
る目的等に応じて上記培地組成や培養条件等は適宜変更
設定することもできる。
通常の細胞を培養するために用いられる適当な培地を用
いて培養することができる。該培地としては、例えばL
培地、E培地、M9培地、M63培地等の各種の培地を好ま
しく用いることができる。また之等の培地には、更に通
常知られている各種の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミ
ン類、天然物抽出物、生理活性物質等を添加することも
でき、かかる培地も好ましく利用できる。培養は、前記
宿主細胞の生育に適したpH、温度、通気、攪拌等の条件
を採用した各種の方法により実施できる。例えば大腸菌
の場合には、pH約5〜8の範囲、特にpH7が適当であ
り、約20〜43℃の温度で、通気攪拌条件で培養すること
が望ましく、培養のスケールには特に限定はない。更に
目的ポリペプチドの発現量乃至分泌量を高めるため、ま
た菌体外への目的ポリペプチドの排出を促進乃至抑制す
る目的等に応じて上記培地組成や培養条件等は適宜変更
設定することもできる。
上記培養により、細胞質内で融合ポリペプチドが生産
され、続いて細胞外に目的のポリペプチドが成熟ポリペ
プチドの形で分泌蓄積される。即ち、まず、ベクター中
の融合ポリペプチドをコードする遺伝子から、ベクター
中の転写調節因子並びに宿主細胞中の諸因子の作用でmR
NAが生産される。次いで、mRNAから翻訳調節因子並びに
宿主細胞中の諸々因子の作用で融合ポリペプチドが生産
される。更にここで生産される融合ポリペプチドは、シ
グナルペプチドの作用により、細胞外に分泌され、同時
にシグナルペプチダーゼの作用により、融合ポリペプチ
ドからシグナルペプチドが切り離されるのである。その
結果、シグナルペプチドも、また他の如何なる不要なア
ミノ酸配列をも含まない成熟ポリペプチドが細胞外に排
出、蓄積される。
され、続いて細胞外に目的のポリペプチドが成熟ポリペ
プチドの形で分泌蓄積される。即ち、まず、ベクター中
の融合ポリペプチドをコードする遺伝子から、ベクター
中の転写調節因子並びに宿主細胞中の諸因子の作用でmR
NAが生産される。次いで、mRNAから翻訳調節因子並びに
宿主細胞中の諸々因子の作用で融合ポリペプチドが生産
される。更にここで生産される融合ポリペプチドは、シ
グナルペプチドの作用により、細胞外に分泌され、同時
にシグナルペプチダーゼの作用により、融合ポリペプチ
ドからシグナルペプチドが切り離されるのである。その
結果、シグナルペプチドも、また他の如何なる不要なア
ミノ酸配列をも含まない成熟ポリペプチドが細胞外に排
出、蓄積される。
かくして蓄積された目的のポリペプチドは、これを常
法に従い分離することができ、また精製することができ
る。この分離、精製操作は、例えば培養上澄、浸透圧シ
ヨツク法により調製したペリプラズム画分、超音波破砕
により調製した細胞内画分等につき、ゲル過、吸着ク
ロマトグラフイー、イオン交換クロマトグラフイー、高
速液体クロマトグラフイー等を適宜組合せる方法により
実施することができる。特に成熟ポリペプチドして分泌
乃至培養上澄に排出されるものは、上記分離、精製が比
較的容易である利点がある。
法に従い分離することができ、また精製することができ
る。この分離、精製操作は、例えば培養上澄、浸透圧シ
ヨツク法により調製したペリプラズム画分、超音波破砕
により調製した細胞内画分等につき、ゲル過、吸着ク
ロマトグラフイー、イオン交換クロマトグラフイー、高
速液体クロマトグラフイー等を適宜組合せる方法により
実施することができる。特に成熟ポリペプチドして分泌
乃至培養上澄に排出されるものは、上記分離、精製が比
較的容易である利点がある。
実施例 以下、本発明を更に詳しく説明するため参考例及び実
施例を挙げる。尚、各例において用いられる各方法及び
操作は、特に明記しない限り、以下の通り行なわれたも
のとする。
施例を挙げる。尚、各例において用いられる各方法及び
操作は、特に明記しない限り、以下の通り行なわれたも
のとする。
1.制限酵素によるDNAの切断操作 DNAの水溶液(又は緩衝液溶液)或いは粉末に、下記
第1表に示した各緩衝液の濃縮液及び水を混和し、次い
で制限酵素を加え、37℃の水浴中で3時間静置して反応
させる。制限酵素の標準的使用量は、DNA1μgに対して
1ユニツトであり、最終液量は10μl以上となるように
する。
第1表に示した各緩衝液の濃縮液及び水を混和し、次い
で制限酵素を加え、37℃の水浴中で3時間静置して反応
させる。制限酵素の標準的使用量は、DNA1μgに対して
1ユニツトであり、最終液量は10μl以上となるように
する。
2.フエノール抽出法 酵素反応の終了後、酵素を失活させ反応を停止させる
ためにこの抽出法を行なつた。即ち、反応液に、その液
量の半量となるTE飽和フエノール(1mM EDTAを含む10mM
トリス塩酸(pH8.0)緩衝液をフエノールに飽和させた
もの)を加えて充分混和した後、同じく半量のクロロホ
ルムを加えて更に混和し、次いで遠心分離してDNAの含
まれる緩衝液層を取る。更に0.1倍量の3M酢酸ナトリウ
ム緩衝液(pH5.0)と2倍量の冷エタノールとを加えて
混和して、−20℃で1時間以上放置してDNAを沈澱とし
て回収することによりフエノールを完全に除去する。
ためにこの抽出法を行なつた。即ち、反応液に、その液
量の半量となるTE飽和フエノール(1mM EDTAを含む10mM
トリス塩酸(pH8.0)緩衝液をフエノールに飽和させた
もの)を加えて充分混和した後、同じく半量のクロロホ
ルムを加えて更に混和し、次いで遠心分離してDNAの含
まれる緩衝液層を取る。更に0.1倍量の3M酢酸ナトリウ
ム緩衝液(pH5.0)と2倍量の冷エタノールとを加えて
混和して、−20℃で1時間以上放置してDNAを沈澱とし
て回収することによりフエノールを完全に除去する。
3.T4 DNAリガーゼによるDNA断片の結合(環状化)操作 66mMトリス塩酸(pH7.5)、6.6mM塩化マグネシウム、
10mMジチオスレイトール及び1mM ATPに0.01%の牛血清
アルブミンを添加した水溶液中で、DNA断片と、その1
μg当り3ユニツトとなる量のT4 DNAリガーゼ(宝酒造
(株)製)とを、12℃で5時間以上反応させることによ
りDNAを結合(環状化)させる。
10mMジチオスレイトール及び1mM ATPに0.01%の牛血清
アルブミンを添加した水溶液中で、DNA断片と、その1
μg当り3ユニツトとなる量のT4 DNAリガーゼ(宝酒造
(株)製)とを、12℃で5時間以上反応させることによ
りDNAを結合(環状化)させる。
4.DNA修飾酵素の使用方法 (1)DNAポリメーゼIのクレノー断片によるDNAのブラ
ントエンド化 40mMリン酸カリウム(pH7.4)、6mM塩化マグネシウ
ム、1mM β−メルカプトエタノール、1mM ATP及び各1mM
のdATP、dCTP、dGTP及びdTTPを含む水溶液中に、DNAを
溶かし、DNA1μgに対して1ユニツトとなる量のDNAポ
リメラーゼI(クレノー断片、宝酒造(株)製)を加
え、12℃で30分間反応させ、必要に応じてフエノール抽
出を行なう。
ントエンド化 40mMリン酸カリウム(pH7.4)、6mM塩化マグネシウ
ム、1mM β−メルカプトエタノール、1mM ATP及び各1mM
のdATP、dCTP、dGTP及びdTTPを含む水溶液中に、DNAを
溶かし、DNA1μgに対して1ユニツトとなる量のDNAポ
リメラーゼI(クレノー断片、宝酒造(株)製)を加
え、12℃で30分間反応させ、必要に応じてフエノール抽
出を行なう。
(2)S1ヌクレアーゼによるDNAのブラントエンド化 DNA1μgにつき、6mM酢酸ナトリウム、40mM塩化ナト
リウム及び1mM硫酸亜鉛を含む緩衝液(pH4.5)100μl
を用いて、上記DNAの緩衝液溶液を作成し、これに2000
ユニツトのS1ヌクレアーゼ(BRL社製)を加えて20℃で3
0分間反応させ、反応終了後、フエノール抽出を行ない
酵素を完全に失活させる。
リウム及び1mM硫酸亜鉛を含む緩衝液(pH4.5)100μl
を用いて、上記DNAの緩衝液溶液を作成し、これに2000
ユニツトのS1ヌクレアーゼ(BRL社製)を加えて20℃で3
0分間反応させ、反応終了後、フエノール抽出を行ない
酵素を完全に失活させる。
(3)T4ポリヌクレオチドキナーゼによるDNA5′端のリ
ン酸化 1〜10μgのDNAを、10mM塩化マグネシウム、5mMジチ
オスレイトール、1mM ATPを含む50mMトリス塩酸緩衝液
(pH9.5)50μlに溶かし、これにT4ポリヌクレオチド
キナーゼ5ユニツトを加え、37℃で30分間反応させ、次
いでフエノール抽出により酵素を失活させる。
ン酸化 1〜10μgのDNAを、10mM塩化マグネシウム、5mMジチ
オスレイトール、1mM ATPを含む50mMトリス塩酸緩衝液
(pH9.5)50μlに溶かし、これにT4ポリヌクレオチド
キナーゼ5ユニツトを加え、37℃で30分間反応させ、次
いでフエノール抽出により酵素を失活させる。
5.形質転換方法 宿主細胞としては、大腸菌K12株由来のHB101株又はJM
103株を用いる。
103株を用いる。
宿主細胞株を、LB培地(1%バクトトリプトン、0.5
%バクトイーストエキス、0.5%塩化ナトリウム)で、3
7℃下、610nmの吸光度が0.25になるまで増殖させる。こ
の培養液40mlを遠心分離(6000回転/分×10分)して菌
体を回収し、次いで氷冷する。これを0.1M塩化マグネシ
ウム20mlで洗浄し、続いて氷冷した0.1M塩化カルシウム
及び0.05M塩化マグネシウム溶液20mlに懸濁させ、1時
間氷冷する。遠心分離(6000回転/分×10分)後、菌体
を氷冷した0.1M塩化カルシウム及び0.05M塩化マグネシ
ウム溶液2mlに再懸濁させる。この懸濁液0.2mlに、T4 D
NAリガーゼを用いて結合させたDNA断片の反応組成液0.0
1mlを加え、1時間氷冷する。次いで42.5℃の水浴で90
秒間加温し、LB培地2.8mlを加え、これを37℃の水浴中
で1時間静置する。
%バクトイーストエキス、0.5%塩化ナトリウム)で、3
7℃下、610nmの吸光度が0.25になるまで増殖させる。こ
の培養液40mlを遠心分離(6000回転/分×10分)して菌
体を回収し、次いで氷冷する。これを0.1M塩化マグネシ
ウム20mlで洗浄し、続いて氷冷した0.1M塩化カルシウム
及び0.05M塩化マグネシウム溶液20mlに懸濁させ、1時
間氷冷する。遠心分離(6000回転/分×10分)後、菌体
を氷冷した0.1M塩化カルシウム及び0.05M塩化マグネシ
ウム溶液2mlに再懸濁させる。この懸濁液0.2mlに、T4 D
NAリガーゼを用いて結合させたDNA断片の反応組成液0.0
1mlを加え、1時間氷冷する。次いで42.5℃の水浴で90
秒間加温し、LB培地2.8mlを加え、これを37℃の水浴中
で1時間静置する。
次に、得られる形質転換株を以下の抗生物質耐性で選
択する。即ち、1.5%寒天を含むLB培地にアンピシリン5
0μg/ml又はテトラサイクリン20μg/mlを添加して調製
した平板培地に、上記で得た反応組成液の溶液各0.3ml
ずつを拡げ、これを37℃で一晩培養し、生育する大腸菌
コロニーを分離する。
択する。即ち、1.5%寒天を含むLB培地にアンピシリン5
0μg/ml又はテトラサイクリン20μg/mlを添加して調製
した平板培地に、上記で得た反応組成液の溶液各0.3ml
ずつを拡げ、これを37℃で一晩培養し、生育する大腸菌
コロニーを分離する。
6.プラスミドの単離 プラスミドを保有する菌株を、アンピシリン50μg/ml
又はテトラサイクリン20μg/mlを添加したLB培地500ml
で、610nmでの吸光度が約0.6になるまで37℃で振盪培養
する。次いでクロラムフエニコール80mgを加え、37℃で
12〜16時間振盪培養する。これを遠心分離(6000回転/
分×10分)して菌体を集め、0.85%塩化ナトリウム水溶
液で洗浄する。菌体を20%蔗糖を含む50mMトリス塩酸
(pH8.0)緩衝液2.5mlに懸濁させ、次に1%リゾチーム
を含む0.25Mトリス塩酸(pH8.0)緩衝液0.5mlを加え、1
0分間氷冷する。更に0.25M EDTA(pH8.0)1mlを加え、1
0分間氷冷する。次に6mMトリス塩酸(pH8.0)、60mM ED
TA及び0.1%トリトンX-100の溶液4mlを加える。これを
超遠心(25000回転/分×90分)して上清を採取する。
この上清8.2mlに塩化セシウム9.0gを加えて溶かし、次
いで1%エチジウムブロマイド溶液0.8mlを加える。こ
れを遠心分離(2000回転/分×10分)して浮遊物を除
き、溶液を超遠心(50000回転/分×15時間)する。次
いで紫外線照射により螢光を発するプラスミド部分を分
離する。これを5M塩化ナトリウム溶液で飽和したイソプ
ロパノールで5〜6回抽出してこれからエチジウムブロ
マイドを除去する。最後に1mM EDTAを含む10mMトリス塩
酸(pH8.0)緩衝液に対して透析して塩化セシウムを除
去する。
又はテトラサイクリン20μg/mlを添加したLB培地500ml
で、610nmでの吸光度が約0.6になるまで37℃で振盪培養
する。次いでクロラムフエニコール80mgを加え、37℃で
12〜16時間振盪培養する。これを遠心分離(6000回転/
分×10分)して菌体を集め、0.85%塩化ナトリウム水溶
液で洗浄する。菌体を20%蔗糖を含む50mMトリス塩酸
(pH8.0)緩衝液2.5mlに懸濁させ、次に1%リゾチーム
を含む0.25Mトリス塩酸(pH8.0)緩衝液0.5mlを加え、1
0分間氷冷する。更に0.25M EDTA(pH8.0)1mlを加え、1
0分間氷冷する。次に6mMトリス塩酸(pH8.0)、60mM ED
TA及び0.1%トリトンX-100の溶液4mlを加える。これを
超遠心(25000回転/分×90分)して上清を採取する。
この上清8.2mlに塩化セシウム9.0gを加えて溶かし、次
いで1%エチジウムブロマイド溶液0.8mlを加える。こ
れを遠心分離(2000回転/分×10分)して浮遊物を除
き、溶液を超遠心(50000回転/分×15時間)する。次
いで紫外線照射により螢光を発するプラスミド部分を分
離する。これを5M塩化ナトリウム溶液で飽和したイソプ
ロパノールで5〜6回抽出してこれからエチジウムブロ
マイドを除去する。最後に1mM EDTAを含む10mMトリス塩
酸(pH8.0)緩衝液に対して透析して塩化セシウムを除
去する。
7.オリゴヌクレオチドの合成 下記に示す固相合成法(固相リン酸トリエステル法)
により行なつた〔H.Ito et al,Necleic Acids Researc
h,10,1755-1769(1982)〕。
により行なつた〔H.Ito et al,Necleic Acids Researc
h,10,1755-1769(1982)〕。
即ち、まず1%架橋ポリスチレン樹脂S-X1(200〜400
メツシユ、バイオラドラボラトリーズ社製)をアミノメ
チル化したものと、5′−O−ジメトキシトリチルヌク
レオシドのモノコハク酸エステルとを反応させて、ヌク
レオシド担持樹脂を得る。次に、バーチエム社製DNA合
成機を用いて以下の操作を行なう。
メツシユ、バイオラドラボラトリーズ社製)をアミノメ
チル化したものと、5′−O−ジメトキシトリチルヌク
レオシドのモノコハク酸エステルとを反応させて、ヌク
レオシド担持樹脂を得る。次に、バーチエム社製DNA合
成機を用いて以下の操作を行なう。
上記樹脂40mgを反応管に入れ、1M臭化亜鉛のジクロロ
メタン−イソプロパノール(85:15)溶液を用いて5′
位のジメトキシトリチル基を脱離させる。次に完全に保
護されたジヌクレオチド〔C.Broka et al,Nucleic Acid
s Research,8,5461-5471(1980)の方法により調製し
た〕のトリエチルアンモニウム塩50mgを加え、縮合剤
(メシチレンスルホニル−5−ニトロトリアゾール)を
用いて縮合させる。以上の操作を繰返して、順次鎖長を
のばして、保護されたオリゴヌクレオチドを担持した樹
脂を得る。尚、最後の縮合工程では、必要に応じてジヌ
クレオチドの代りに、前記文献に記載の方法により調製
されるモノヌクレオチドのトリエチルアンモニウム塩25
mgを使用する。
メタン−イソプロパノール(85:15)溶液を用いて5′
位のジメトキシトリチル基を脱離させる。次に完全に保
護されたジヌクレオチド〔C.Broka et al,Nucleic Acid
s Research,8,5461-5471(1980)の方法により調製し
た〕のトリエチルアンモニウム塩50mgを加え、縮合剤
(メシチレンスルホニル−5−ニトロトリアゾール)を
用いて縮合させる。以上の操作を繰返して、順次鎖長を
のばして、保護されたオリゴヌクレオチドを担持した樹
脂を得る。尚、最後の縮合工程では、必要に応じてジヌ
クレオチドの代りに、前記文献に記載の方法により調製
されるモノヌクレオチドのトリエチルアンモニウム塩25
mgを使用する。
次に0.5Mピリジンカルドキシメートのピリジン−水
(1:1)溶液を用いて、保護されたオリゴヌクレオチド
を樹脂から脱離させる。これをセフアデツクスG-50カラ
ム(フアルマシア社製、2×100cm)で、更に高速液体
クロマトグラフイー(ポンプ;ウオーターズ社製6000A
型、検出器;440型デイテクター、カラム;マイクロボン
ダーパツクC18、溶出溶媒;(5→40%)アセトニトリ
ル−0.1M酢酸トリエチルアンモニウム水溶液)で精製す
る。次に80%酢酸により脱保護反応を行ない、再度高速
液体クロマトグラフイーにより単一ピークになるまで精
製する。この高速液体クロマトグラフイーの条件は、溶
出溶媒として(5→25%)アセトニトリル−0.1M酢酸ト
リエチルアンモニアム水溶液を用いる以外は、上記と同
一とする。
(1:1)溶液を用いて、保護されたオリゴヌクレオチド
を樹脂から脱離させる。これをセフアデツクスG-50カラ
ム(フアルマシア社製、2×100cm)で、更に高速液体
クロマトグラフイー(ポンプ;ウオーターズ社製6000A
型、検出器;440型デイテクター、カラム;マイクロボン
ダーパツクC18、溶出溶媒;(5→40%)アセトニトリ
ル−0.1M酢酸トリエチルアンモニウム水溶液)で精製す
る。次に80%酢酸により脱保護反応を行ない、再度高速
液体クロマトグラフイーにより単一ピークになるまで精
製する。この高速液体クロマトグラフイーの条件は、溶
出溶媒として(5→25%)アセトニトリル−0.1M酢酸ト
リエチルアンモニアム水溶液を用いる以外は、上記と同
一とする。
8.DNA塩基配列の分析 DNA塩基配列の分析は、メシング(Messing)の方法
〔M13法、Methods Enzymol.,101,20(1983)〕に従い、
以下のように行なつた。即ち、まずDNA断片を制限酵素
により切り出し、1%アガロースゲル電気泳動により分
離する。このDNA断片をM13mp8RF(アマーシヤム社製)
をベクターとしてクローニングする。得られる組換えフ
アージDNAをマンデル(Mandel)とヒガ(Higa)の方法
〔J.Mol.Biol.,53,154(1970)〕により、大腸菌JM107
株へ形質導入する。この菌体懸濁液0.2mlに、25mg/mlの
イソプロピル−β−D−チオガラクトシド(以下「IPT
G」という)25μl及び20mg/mlの5−ブロモ−4−クロ
ロ−3−インドリル−β−D−ガラクトシド40μlを加
えた。次いでこの菌体懸濁液に、予め過熱溶解させ次い
で50℃で保温したH−トツプアガー液(1%バクトトリ
プトン、0.8%塩化ナトリウム及び0.5%寒天)3mlを加
え、1.5%寒天を加えて固化させた2×YT培地(1.6%バ
クトトリプトン、1%酵母エキス及び0.5%塩化ナトリ
ウム)の平板に重層し、37℃で一晩培養する。DNA断片
の挿入された組換えフアージは無色のプラークを生じる
のに対し、親株のM13mp8は青色のプラークを生じるの
で、目的の組換えフアージは容易に選別できる。
〔M13法、Methods Enzymol.,101,20(1983)〕に従い、
以下のように行なつた。即ち、まずDNA断片を制限酵素
により切り出し、1%アガロースゲル電気泳動により分
離する。このDNA断片をM13mp8RF(アマーシヤム社製)
をベクターとしてクローニングする。得られる組換えフ
アージDNAをマンデル(Mandel)とヒガ(Higa)の方法
〔J.Mol.Biol.,53,154(1970)〕により、大腸菌JM107
株へ形質導入する。この菌体懸濁液0.2mlに、25mg/mlの
イソプロピル−β−D−チオガラクトシド(以下「IPT
G」という)25μl及び20mg/mlの5−ブロモ−4−クロ
ロ−3−インドリル−β−D−ガラクトシド40μlを加
えた。次いでこの菌体懸濁液に、予め過熱溶解させ次い
で50℃で保温したH−トツプアガー液(1%バクトトリ
プトン、0.8%塩化ナトリウム及び0.5%寒天)3mlを加
え、1.5%寒天を加えて固化させた2×YT培地(1.6%バ
クトトリプトン、1%酵母エキス及び0.5%塩化ナトリ
ウム)の平板に重層し、37℃で一晩培養する。DNA断片
の挿入された組換えフアージは無色のプラークを生じる
のに対し、親株のM13mp8は青色のプラークを生じるの
で、目的の組換えフアージは容易に選別できる。
次に単一の無色プラークをパスツールピペツトにて取
り出し、これとJM103株の培養液0.01mlとを2×YT培地1
mlに加え、約5時間、37℃で振盪培養して組換えフアー
ジを増殖させる。培養後、遠心にて菌体を除き、上清に
20%ポリエチレングリコール6000の0.2mlを混合し、室
温で15分以上静置した後、遠心にて沈澱するフアージを
集め、フエノール抽出によつて、フアージから一本鎖DN
Aを抽出し、これを鋳型一本鎖DNAとして用いる。
り出し、これとJM103株の培養液0.01mlとを2×YT培地1
mlに加え、約5時間、37℃で振盪培養して組換えフアー
ジを増殖させる。培養後、遠心にて菌体を除き、上清に
20%ポリエチレングリコール6000の0.2mlを混合し、室
温で15分以上静置した後、遠心にて沈澱するフアージを
集め、フエノール抽出によつて、フアージから一本鎖DN
Aを抽出し、これを鋳型一本鎖DNAとして用いる。
鋳型一本鎖DNAと、プライマー(宝酒造(株)製、M13
の15塩基プライマー〔5′AGTCACGACGTTGTA3′〕)との
各々0.5p molずつを混合し、60℃で20分間熱処理後、徐
冷する。次にこの混合液にα32P-dCTP(アマシヤム社
製、400Ci/m mol)2μlとDNAポリメラーゼI(クレノ
ー、宝酒造(株)製)2ユニツトとを加え、充分に混合
した後、その3.2μlずつを、下記第2表に示した4種
のdNTP-ddNTP混合液のそれぞれ2μlを含む反応管に加
える。室温で20分間反応させた後、チエース反応液(dA
TP、dCTP、dGTP及びdTTPの各1mM)の1μlをそれぞれ
に加え、更に20分間反応させる。ホルムアミド停止液
(95%v/vホルムアミド、0.1%キシレンシアノール及び
0.1%ブロムフエノールブルー)を6μlずつ加え、95
℃で3分間加熱した後、急冷する。次にサンプル2μl
ずつを6%又は8%ポリアクリルアミドゲルにより電気
泳動(1800V、30mA、2〜3時間)を行なう。泳動後、
ゲルを紙(ワツトマン3MM)に移し、ゲル乾燥器にて
乾燥し、オートラジオグラムをとり、DNA塩基配列を解
読する。
の15塩基プライマー〔5′AGTCACGACGTTGTA3′〕)との
各々0.5p molずつを混合し、60℃で20分間熱処理後、徐
冷する。次にこの混合液にα32P-dCTP(アマシヤム社
製、400Ci/m mol)2μlとDNAポリメラーゼI(クレノ
ー、宝酒造(株)製)2ユニツトとを加え、充分に混合
した後、その3.2μlずつを、下記第2表に示した4種
のdNTP-ddNTP混合液のそれぞれ2μlを含む反応管に加
える。室温で20分間反応させた後、チエース反応液(dA
TP、dCTP、dGTP及びdTTPの各1mM)の1μlをそれぞれ
に加え、更に20分間反応させる。ホルムアミド停止液
(95%v/vホルムアミド、0.1%キシレンシアノール及び
0.1%ブロムフエノールブルー)を6μlずつ加え、95
℃で3分間加熱した後、急冷する。次にサンプル2μl
ずつを6%又は8%ポリアクリルアミドゲルにより電気
泳動(1800V、30mA、2〜3時間)を行なう。泳動後、
ゲルを紙(ワツトマン3MM)に移し、ゲル乾燥器にて
乾燥し、オートラジオグラムをとり、DNA塩基配列を解
読する。
但し第2表中、ddAはジデオキシアデノシンを、ddCは
ジデオキシシチジンを、ddGはジデオキシグアノシン
を、またddTはジデオキシチミジンをそれぞれ示す。
ジデオキシシチジンを、ddGはジデオキシグアノシン
を、またddTはジデオキシチミジンをそれぞれ示す。
9.アガロースゲル電気泳動 シユライフ(Schleif)とウエンシンク(Wensink)の
手引書〔“Practical Methods in Molecular Biology"
(1981),Springer-Verlag社、pp114-125〕に記載の方
法に従つて、アガロースゲル電気泳動及び泳動後のゲル
からのDNA断片の分離を行なう。泳動用電源としては、
アトー社製コンスターパワーSJ1065型を、泳動槽として
は12×15cmのプラスチツク製水槽(白金電極付)を、ア
ガロースとしてはアガロースI(同仁化学研究所製)
を、また泳動用緩衝液としては40mMトリス塩酸(5mM酢
酸ナトリウム及び1mM EDTA含有、pH7.9)をそれぞれ用
いる。
手引書〔“Practical Methods in Molecular Biology"
(1981),Springer-Verlag社、pp114-125〕に記載の方
法に従つて、アガロースゲル電気泳動及び泳動後のゲル
からのDNA断片の分離を行なう。泳動用電源としては、
アトー社製コンスターパワーSJ1065型を、泳動槽として
は12×15cmのプラスチツク製水槽(白金電極付)を、ア
ガロースとしてはアガロースI(同仁化学研究所製)
を、また泳動用緩衝液としては40mMトリス塩酸(5mM酢
酸ナトリウム及び1mM EDTA含有、pH7.9)をそれぞれ用
いる。
10.ポリアクリルアミドゲル電気泳動 上記手引書の第78-87頁及び第114-125頁に記載の方法
に従い、ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び泳動後の
ゲルからのDNA断片の分離を行なう。泳動用電源として
は、アトー社製コンスターパワーSJ1065型を、泳動槽と
してはアトー社製SJ1060SD型を用いる。アクリルアミド
溶液として、アクリルアミドとN,N′−メチレンビスア
クリルアミド(29:1)との水溶液を、重合促進剤として
N,N,N′,N′−テトラメチレンエチレンジアミンを、重
合触媒として過硫酸アンモニウムをそれぞれ用いる。ま
た泳動用緩衝液として2.5mM EDTAを含有する90mMトリス
ホウ酸緩衝液(pH8.3)を用いる。
に従い、ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び泳動後の
ゲルからのDNA断片の分離を行なう。泳動用電源として
は、アトー社製コンスターパワーSJ1065型を、泳動槽と
してはアトー社製SJ1060SD型を用いる。アクリルアミド
溶液として、アクリルアミドとN,N′−メチレンビスア
クリルアミド(29:1)との水溶液を、重合促進剤として
N,N,N′,N′−テトラメチレンエチレンジアミンを、重
合触媒として過硫酸アンモニウムをそれぞれ用いる。ま
た泳動用緩衝液として2.5mM EDTAを含有する90mMトリス
ホウ酸緩衝液(pH8.3)を用いる。
参考例1 I)β−ウロガストロン発現用ベクターpGH54及びpGH55
の構築 (A)中間体プラスミドpGH53の構築 大腸菌のβ−ラクタマーゼのシグナルペプチドの一部
をコードするDNA塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
の合成のために、以下の塩基配列を有する4種のオリゴ
ヌクレオチドのそれぞれを前記した固相リン酸トリエス
テル法により合成した。
の構築 (A)中間体プラスミドpGH53の構築 大腸菌のβ−ラクタマーゼのシグナルペプチドの一部
をコードするDNA塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
の合成のために、以下の塩基配列を有する4種のオリゴ
ヌクレオチドのそれぞれを前記した固相リン酸トリエス
テル法により合成した。
〈1〉(5′)CGCCGGCCTTTTGCCTTCCTGTC(3′) 〈2〉TTCGCGAACTCAGCTGCA 〈3〉GCTGAGTTCGCGAAGACAG 〈4〉GAAGGCAAAAGGCCGGCGAT 上記オリゴヌクレオチド〈2〉及び〈4〉の5′端を
それぞれT4ポリヌクレオチドキナーゼ(BRL社製)を用
いてリン酸化した。
それぞれT4ポリヌクレオチドキナーゼ(BRL社製)を用
いてリン酸化した。
クローニングベクターとして、プラスミドpBR322〔Bo
livar et al,Gene,2,95-113(1977)〕を利用した。
livar et al,Gene,2,95-113(1977)〕を利用した。
該プラスミドpBR322の10μgを、制限酵素Pst I(宝
酒造(株)製)とPvu I(NEB社製)とを用いて高塩濃度
緩衝液中で切断し、1.0%アガロースゲル電気泳動を行
ない、約4.24kbのDNA断片を分離した。
酒造(株)製)とPvu I(NEB社製)とを用いて高塩濃度
緩衝液中で切断し、1.0%アガロースゲル電気泳動を行
ない、約4.24kbのDNA断片を分離した。
上記で得たDNA断片を、上記で調製されたリン酸
化したオリゴヌクレオチド〈2〉及び〈4〉並びにリン
酸化していないオリゴヌクレオチド〈1〉及び〈3〉の
それぞれ約1μgずつと合せて、T4 DNAリガーゼで結合
反応させた。反応終了後、この反応組成液で大腸菌K-12
株由来のHB101株を形質転換させた。得られたテトラサ
イクリン耐性を示す形質転換株の中から1株を選び、こ
れからプラスミドを単離し、目的のpGH53を得た。
化したオリゴヌクレオチド〈2〉及び〈4〉並びにリン
酸化していないオリゴヌクレオチド〈1〉及び〈3〉の
それぞれ約1μgずつと合せて、T4 DNAリガーゼで結合
反応させた。反応終了後、この反応組成液で大腸菌K-12
株由来のHB101株を形質転換させた。得られたテトラサ
イクリン耐性を示す形質転換株の中から1株を選び、こ
れからプラスミドを単離し、目的のpGH53を得た。
一連の操作の概略は第1図に示す通りである。
得られたpGH53は、1.0%アガロースゲル電気泳動の結
果、4.3kbの大きさを有しており、そのDNA塩基配列をM1
3法により分析した結果、pBR322のPst I及びPvu Iの両
制限サイト間が欠失し、代りに次に示すように、オリゴ
ヌクレオチド〈1〉、〈2〉、〈3〉及び〈4〉が挿入
されていることが確認された。
果、4.3kbの大きさを有しており、そのDNA塩基配列をM1
3法により分析した結果、pBR322のPst I及びPvu Iの両
制限サイト間が欠失し、代りに次に示すように、オリゴ
ヌクレオチド〈1〉、〈2〉、〈3〉及び〈4〉が挿入
されていることが確認された。
該pGH53を保有するHB101株は、通商産業省工業技術院
微生物工業技術研究所に「HB101〔pGH53〕」なる表示で
微工研条寄第678号(FERM BP-678)として寄託されてい
る。
微生物工業技術研究所に「HB101〔pGH53〕」なる表示で
微工研条寄第678号(FERM BP-678)として寄託されてい
る。
(B)β−ウロガストロン発現用ベクターpGH54の構築 上記(A)で得たpGH53の10μgを制限酵素Nae I(NE
B社製)及びAva I(宝酒造(株)製)を用いて中塩濃度
緩衝液中で切断し、次いで1.0%アガロースゲル電気泳
動を行なつて、約2.22kbのDNA断片《A》を分離した。
B社製)及びAva I(宝酒造(株)製)を用いて中塩濃度
緩衝液中で切断し、次いで1.0%アガロースゲル電気泳
動を行なつて、約2.22kbのDNA断片《A》を分離した。
この断片は、合成オリゴヌクレオチド由来のDNA配列
の大部分とプラスミドの複製開始領域を含んでいる。
の大部分とプラスミドの複製開始領域を含んでいる。
pBR322を制限酵素Ava I及びHind III(いずれも宝酒
造(株)製)で、中塩濃度緩衝液を用いて切断し、1.0
%アガロースゲル電気泳動を行なつて、約1.40kbのDNA
断片《B》を得た。
造(株)製)で、中塩濃度緩衝液を用いて切断し、1.0
%アガロースゲル電気泳動を行なつて、約1.40kbのDNA
断片《B》を得た。
この断片には、テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモ
ーターの一部及びその構造遺伝子の全てが含まれてい
る。
ーターの一部及びその構造遺伝子の全てが含まれてい
る。
pBR322の20μgを制限酵素Fnu4HI(NEB社製)で低塩
濃度緩衝液を用いて切断し、次いでS1ヌクレアーゼによ
りDNA断片末端の突出塩基を分解除去した。次いで、得
られたDNAを制限酵素Hind IIIを用いて中塩濃度緩衝液
中にて切断し、6%ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行ない、約0.28kbのDNA断片《C》を得た。
濃度緩衝液を用いて切断し、次いでS1ヌクレアーゼによ
りDNA断片末端の突出塩基を分解除去した。次いで、得
られたDNAを制限酵素Hind IIIを用いて中塩濃度緩衝液
中にて切断し、6%ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行ない、約0.28kbのDNA断片《C》を得た。
この断片には、β−ラクタマーゼのプロモーター、リ
ボゾーム結合部位、シグナルペプチドをコードする遺伝
子の一部の他、テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモー
ターの一部が含まれている。
ボゾーム結合部位、シグナルペプチドをコードする遺伝
子の一部の他、テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモー
ターの一部が含まれている。
上記で得た3つの断片《A》、《B》及び《C》を、
T4 DNAリガーゼを用いて結合させた。反応後、この反応
組成液でHB101株を形質転換した。得られたテトラサイ
クリン耐性を示す形質転換株の中から1株を選びプラス
ミドを単離した。かくしてpGH54を得た。
T4 DNAリガーゼを用いて結合させた。反応後、この反応
組成液でHB101株を形質転換した。得られたテトラサイ
クリン耐性を示す形質転換株の中から1株を選びプラス
ミドを単離した。かくしてpGH54を得た。
pGH54は、M13法による塩基配列分析の結果、β−ラク
タマーゼのプロモーター及びリボゾーム結合部位に続い
てシグナルペプチドをコードするDNA塩基配列を有し、
この塩基配列の3′末端の上流側にNru I及び下流側にP
vu IIのそれぞれの制限酵素認識配列を有していること
が確認された。
タマーゼのプロモーター及びリボゾーム結合部位に続い
てシグナルペプチドをコードするDNA塩基配列を有し、
この塩基配列の3′末端の上流側にNru I及び下流側にP
vu IIのそれぞれの制限酵素認識配列を有していること
が確認された。
一連の操作の概略は、第2図に示される通りである。
pGH54は、前記した通り約3.9kbの大きさ及び第2図に
示す制限酵素開裂地図により特徴付けられ、またM13法
による塩基配列分析の結果、下式(2)に示した塩基配
列によりコードされるβ−ラクタマーゼシグナルペプチ
ドの遺伝子を有することが確認された。
示す制限酵素開裂地図により特徴付けられ、またM13法
による塩基配列分析の結果、下式(2)に示した塩基配
列によりコードされるβ−ラクタマーゼシグナルペプチ
ドの遺伝子を有することが確認された。
ATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCCTT
TTGCCTTCCTGTCTTCGCGAACTCAGCTG (2) (C)β−ウロガストロン発現用ベクターpGH55の構築 pBR322のAva I及びPvu II制限サイト間の塩基配列を
欠失させたプラスミドであるpBRH02を次の操作により作
成した。即ちpBR322の5μgを、中塩濃度緩衝液中で、
制限酵素Ava I及びPvu II(いずれも宝酒造(株)製)
で切断し、フエノール抽出後、DNAポリメラーゼIのク
レノー断片(宝酒造(株)製)で切断断片をブラントエ
ンド化した。次に1.0%アガロースゲル電気泳動で約3.7
2kbのDNA断片を分離し、この断片をT4 DNAリガーゼで環
状化させた。反応終了後、この反応組成液でHB101株を
形質転換し、得られるアンピシリン耐性及びテトラサイ
クリン耐性を示す形質転換株の中から一株を選択してプ
ラスミドを単離しpBRH02を得た。得られたpBRH02はpBR3
22とは異なつて、Ava IでもPvu IIでも切断されなかつ
た。
TTGCCTTCCTGTCTTCGCGAACTCAGCTG (2) (C)β−ウロガストロン発現用ベクターpGH55の構築 pBR322のAva I及びPvu II制限サイト間の塩基配列を
欠失させたプラスミドであるpBRH02を次の操作により作
成した。即ちpBR322の5μgを、中塩濃度緩衝液中で、
制限酵素Ava I及びPvu II(いずれも宝酒造(株)製)
で切断し、フエノール抽出後、DNAポリメラーゼIのク
レノー断片(宝酒造(株)製)で切断断片をブラントエ
ンド化した。次に1.0%アガロースゲル電気泳動で約3.7
2kbのDNA断片を分離し、この断片をT4 DNAリガーゼで環
状化させた。反応終了後、この反応組成液でHB101株を
形質転換し、得られるアンピシリン耐性及びテトラサイ
クリン耐性を示す形質転換株の中から一株を選択してプ
ラスミドを単離しpBRH02を得た。得られたpBRH02はpBR3
22とは異なつて、Ava IでもPvu IIでも切断されなかつ
た。
上記で得たpBRH02の5μgを制限酵素Pst I及びBam
HI(いずれも宝酒造(株)製)を用いて中塩濃度緩衝液
で切断し、次いで1.0%アガロースゲル電気泳動を行な
つて、約2.60kbのDNA断片《D》を分離した。
HI(いずれも宝酒造(株)製)を用いて中塩濃度緩衝液
で切断し、次いで1.0%アガロースゲル電気泳動を行な
つて、約2.60kbのDNA断片《D》を分離した。
この断片は、テトラサイクリン耐性遺伝子の一部及び
プラスミドの複製開始領域を含んでいる。
プラスミドの複製開始領域を含んでいる。
pGH54の10μgを制限酵素Pst I及びBamHIを用いて中
塩濃度緩衝液中にて切断し、次いで1.0%アガロースゲ
ル電気泳動を行ない、約0.66kbのDNA断片《E》を得
た。
塩濃度緩衝液中にて切断し、次いで1.0%アガロースゲ
ル電気泳動を行ない、約0.66kbのDNA断片《E》を得
た。
この断片には、β−ラクタマーゼのプロモーター、リ
ボゾーム結合部位、シグナルペプチドをコードするDNA
配列及びテトラサイクリン耐性遺伝子の一部が含まれて
いる。
ボゾーム結合部位、シグナルペプチドをコードするDNA
配列及びテトラサイクリン耐性遺伝子の一部が含まれて
いる。
上記で得た2つの断片《D》及び《E》を、T4 DNAリ
ガーゼを用いて結合させた。反応後、この反応組成液で
HB101株を形質転換した。得られたテトラサイクリン耐
性を示す形質転換株の中から1株を選びプラスミドを単
離した。かくしてpGH55を得た。
ガーゼを用いて結合させた。反応後、この反応組成液で
HB101株を形質転換した。得られたテトラサイクリン耐
性を示す形質転換株の中から1株を選びプラスミドを単
離した。かくしてpGH55を得た。
一連の操作の概略は、第3図に示される通りである。
pGH55は、上記第3図に示される制限酵素開裂地図に
より特徴付けられ、1.0%アガロースゲル電気泳動の結
果、約3.3kbの大きさを有していた。また該pGH55は、M1
3法による塩基配列分析の結果、pGH54における第2のPv
u II制限サイトを含む約0.64kbのDNAを欠く以外は、該p
GH54と同様であり、その第1のPvu II制限サイトは、シ
グナルペプチドをコードするDNA塩基配列の3′末端の
近傍に存在していることが確認された。
より特徴付けられ、1.0%アガロースゲル電気泳動の結
果、約3.3kbの大きさを有していた。また該pGH55は、M1
3法による塩基配列分析の結果、pGH54における第2のPv
u II制限サイトを含む約0.64kbのDNAを欠く以外は、該p
GH54と同様であり、その第1のPvu II制限サイトは、シ
グナルペプチドをコードするDNA塩基配列の3′末端の
近傍に存在していることが確認された。
II)シグナルペプチド−β−ウロガストロン融合ポリペ
プチドをコードするDNA塩基配列を有するベクターの構
築 (A)β−ウロガストロンをコードするDNA塩基配列の
合成 この塩基配列は、グレゴリー(H.Gregory)により報
告されたアミノ酸配列〔Nature,257,325-327(1975)〕
を参考にして、まずβ−ウロガストロンをコードするDN
A塩基配列の前後に開始コドン、終止コドン及び制限酵
素認識部位を付加してなる下記第3表に示すDNA塩基配
列を構築することにより行なつた。このDNA塩基配列
は、本発明者らにより既に特願昭59-137691号として特
許出願されている。
プチドをコードするDNA塩基配列を有するベクターの構
築 (A)β−ウロガストロンをコードするDNA塩基配列の
合成 この塩基配列は、グレゴリー(H.Gregory)により報
告されたアミノ酸配列〔Nature,257,325-327(1975)〕
を参考にして、まずβ−ウロガストロンをコードするDN
A塩基配列の前後に開始コドン、終止コドン及び制限酵
素認識部位を付加してなる下記第3表に示すDNA塩基配
列を構築することにより行なつた。このDNA塩基配列
は、本発明者らにより既に特願昭59-137691号として特
許出願されている。
(B)β−ウロガストロンをコードするDNA塩基配列を
保有するプラスミドの構築 pBR322の10μgを、まず高塩濃度緩衝液中でEcoRI
(宝酒造(株)製)とBamHIとで切断し、次いで1.0%ア
ガロースゲル電気泳動を行ない、約3.99kbのDNA断片を
単離した。
保有するプラスミドの構築 pBR322の10μgを、まず高塩濃度緩衝液中でEcoRI
(宝酒造(株)製)とBamHIとで切断し、次いで1.0%ア
ガロースゲル電気泳動を行ない、約3.99kbのDNA断片を
単離した。
上記で得たDNA断片と、上記(A)で得たβ−ウロ
ガストロンをコードするDNA塩基配列とを、T4 DNAリガ
ーゼで結合させた。反応後、反応組成物でHB101株を形
質転換し、得られるアンピシリン耐性を示す形質転換株
の中から一株を選びプラスミドを単離した。かくしてβ
−ウロガストロンをコードするDNA塩基配列がpBR322のE
coRI及びBamHI制限サイト間に挿入されたプラスミドpUG
3を得た。
ガストロンをコードするDNA塩基配列とを、T4 DNAリガ
ーゼで結合させた。反応後、反応組成物でHB101株を形
質転換し、得られるアンピシリン耐性を示す形質転換株
の中から一株を選びプラスミドを単離した。かくしてβ
−ウロガストロンをコードするDNA塩基配列がpBR322のE
coRI及びBamHI制限サイト間に挿入されたプラスミドpUG
3を得た。
このプラスミドpUG3を保有するHB101株は、「HB101
〔pUG3〕」なる表示で微工研菌条第543号(FERM BP-54
3)として寄託されている。
〔pUG3〕」なる表示で微工研菌条第543号(FERM BP-54
3)として寄託されている。
(C)pUG201の構築 この操作の概略は、第4図に示す通りである。上記
(B)で得たpUG3を制限酵素Hinf Iで切断して得られる
DNA断片を、pGH55のPvu II制限サイトに挿入して、シグ
ナルペプチド−β−ウロガストロン融合ポリペプチドを
コードするDNA塩基配列を含むベクターであるpUG201
を、以下の方法により構築した。
(B)で得たpUG3を制限酵素Hinf Iで切断して得られる
DNA断片を、pGH55のPvu II制限サイトに挿入して、シグ
ナルペプチド−β−ウロガストロン融合ポリペプチドを
コードするDNA塩基配列を含むベクターであるpUG201
を、以下の方法により構築した。
pUG3の15μgを、高塩濃度緩衝液中でHinf I(宝酒造
(株)製)で切断し、フエノール抽出後、DNAポリメラ
ーゼIのクレノー断片で切断断片をブラントエンド化し
た。次いで6%ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行な
い、約0.43kbのDNA断片《F》を単離した。
(株)製)で切断し、フエノール抽出後、DNAポリメラ
ーゼIのクレノー断片で切断断片をブラントエンド化し
た。次いで6%ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行な
い、約0.43kbのDNA断片《F》を単離した。
この断片には、β−ウロガストロンをコードするDNA
塩基配列(翻訳停止コドンを含む)のうち5′端の7塩
基を除く塩基配列が含まれていた。
塩基配列(翻訳停止コドンを含む)のうち5′端の7塩
基を除く塩基配列が含まれていた。
pGH55は、β−ラクタマーゼのシグナルペプチドをコ
ードするDNA塩基配列の後に、β−ウロガストロンのN
端領域をコードする最初の7個のDNA塩基配列が直結
し、且つその直後で制限酵素Pvu IIにより切断されるよ
うに構成されたDNA塩基配列を有するものであり、該pGH
55の5μgの中塩濃度緩衝液中で、Pvu IIで切断して、
約3.26kbのDNA断片《G》を得た。
ードするDNA塩基配列の後に、β−ウロガストロンのN
端領域をコードする最初の7個のDNA塩基配列が直結
し、且つその直後で制限酵素Pvu IIにより切断されるよ
うに構成されたDNA塩基配列を有するものであり、該pGH
55の5μgの中塩濃度緩衝液中で、Pvu IIで切断して、
約3.26kbのDNA断片《G》を得た。
この断片は、pGH55の全ての遺伝情報を有している。
上記で得た断片《F》の約1μgと上記で得た断
片《G》の約0.5μgとをT4 DNAリガーゼで結合させ
た。反応後、この反応組成液でHB101株を形質転換し、
得られるテトラサイクリン耐性の形質転換株の中から一
株を選び、プラスミドpUG201を単離した。
片《G》の約0.5μgとをT4 DNAリガーゼで結合させ
た。反応後、この反応組成液でHB101株を形質転換し、
得られるテトラサイクリン耐性の形質転換株の中から一
株を選び、プラスミドpUG201を単離した。
pUG201は、1.0%アガロースゲル電気泳動の結果、約
3.8kbの大きさを有していた。これをBamH I又はHind II
Iで切断すると、それぞれ2種類のDNA断片が得られるこ
とから、該pUG201にはβ−ウロガストロン遺伝子が含ま
れていることが判り、また該断片の大きさを調べた結果
より、目的のプラスミドであることが判った。更に、pU
G201について、β−ラクタマーゼのプロモーター部分か
らβ−ウロガストロン遺伝子までを含むDNA断片の塩基
配列を、M13法による塩基配列分析により調べた。その
結果、該DNA塩基配列は下記第4表の通りであり、pUG20
1がプロモーター、リボゾーム結合部位並びにβ−ラク
タマーゼのシグナルペプチドをコードする塩基配列及び
β−ウロガストロンをコードする塩基配列が、正確にこ
の順序で配列されていることが確認された。また第4表
にはDNA塩基配列に対応するアミノ酸配列も併記する。
3.8kbの大きさを有していた。これをBamH I又はHind II
Iで切断すると、それぞれ2種類のDNA断片が得られるこ
とから、該pUG201にはβ−ウロガストロン遺伝子が含ま
れていることが判り、また該断片の大きさを調べた結果
より、目的のプラスミドであることが判った。更に、pU
G201について、β−ラクタマーゼのプロモーター部分か
らβ−ウロガストロン遺伝子までを含むDNA断片の塩基
配列を、M13法による塩基配列分析により調べた。その
結果、該DNA塩基配列は下記第4表の通りであり、pUG20
1がプロモーター、リボゾーム結合部位並びにβ−ラク
タマーゼのシグナルペプチドをコードする塩基配列及び
β−ウロガストロンをコードする塩基配列が、正確にこ
の順序で配列されていることが確認された。また第4表
にはDNA塩基配列に対応するアミノ酸配列も併記する。
上記pUG201を保有する大腸菌HB101は、「HB101〔pGH2
01〕」なる表示で通商産業省工業技術院微生物工業研究
所に寄託されている。その寄託番号は、微工研条寄第68
1号(FERM BP-681)である。
01〕」なる表示で通商産業省工業技術院微生物工業研究
所に寄託されている。その寄託番号は、微工研条寄第68
1号(FERM BP-681)である。
(D)pUGT150の構築 この例に従うpUGT150構築の概略図を第5図に示す。t
acプロモーターの起源ベクターとしてpDR540(フアルマ
シア社製)を選択した。
acプロモーターの起源ベクターとしてpDR540(フアルマ
シア社製)を選択した。
該pDR540の15μgを、制限酵素BamH Iを用い、中塩濃
度緩衝液中で切断後、得れたDNA断片の末端をS1ヌクレ
アーゼにより平滑末端とし、次いで制限酵素EcoR Iを用
いて、高塩濃度緩衝液中で切断した。次に5%ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を行ない、約0.38kbのDNA断片
《H》を得た。この断片にはtacプロモーター及びSD配
列が含まれている。
度緩衝液中で切断後、得れたDNA断片の末端をS1ヌクレ
アーゼにより平滑末端とし、次いで制限酵素EcoR Iを用
いて、高塩濃度緩衝液中で切断した。次に5%ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を行ない、約0.38kbのDNA断片
《H》を得た。この断片にはtacプロモーター及びSD配
列が含まれている。
pUG201の22μgを、制限酵素Pst I及びEcoR Iを用い
て、それぞれ中塩濃度緩衝液中及び高塩濃度緩衝液中で
切断した。得られたDNA断片のうち、2μg相当分か
ら、0.9%アガロースゲル電気泳動により約2.97kbのDNA
断片《I》を得た。この断片には、テトラサイクリン耐
性遺伝子及びベクターの複製開始領域が含まれている。
て、それぞれ中塩濃度緩衝液中及び高塩濃度緩衝液中で
切断した。得られたDNA断片のうち、2μg相当分か
ら、0.9%アガロースゲル電気泳動により約2.97kbのDNA
断片《I》を得た。この断片には、テトラサイクリン耐
性遺伝子及びベクターの複製開始領域が含まれている。
上記pUG201をPst I及びEcoR Iで切断して得たDNA断片
の残り20μg相当分を、制限酵素Mbo IIを用いて低塩濃
度緩衝液中で部分切断した。即ち、Mbo II(NEB社製)
の10ユニツトを反応液中に加え、37℃で30分間反応させ
ることにより、上記部分切断を行なつた。次いで5%ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、約0.49kbのDN
A断片《J》を得た。この断片にはβ−ラクタマーゼの
シグナルペプチドをコードするDNA塩基配列のうち、
5′末端の6塩基を欠く部分配列の3′末端にβ−ウロ
ガストロンをコードするDNA塩基配列が連なった配列を
含んでいる。
の残り20μg相当分を、制限酵素Mbo IIを用いて低塩濃
度緩衝液中で部分切断した。即ち、Mbo II(NEB社製)
の10ユニツトを反応液中に加え、37℃で30分間反応させ
ることにより、上記部分切断を行なつた。次いで5%ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、約0.49kbのDN
A断片《J》を得た。この断片にはβ−ラクタマーゼの
シグナルペプチドをコードするDNA塩基配列のうち、
5′末端の6塩基を欠く部分配列の3′末端にβ−ウロ
ガストロンをコードするDNA塩基配列が連なった配列を
含んでいる。
上記DNA断片《J》において不足するβ−ラクタマー
ゼのシグナルペプチドをコードするDNA塩基配列の5′
末端より6塩基を含み、且つDNA断片《H》と《J》と
の接続の役割を果たす下記オリゴヌクレオチドI-3及びI
-4を、固相リン酸トリエステル法に従い合成した。
ゼのシグナルペプチドをコードするDNA塩基配列の5′
末端より6塩基を含み、且つDNA断片《H》と《J》と
の接続の役割を果たす下記オリゴヌクレオチドI-3及びI
-4を、固相リン酸トリエステル法に従い合成した。
I-3 5′TCGACAATGAGT 3′ I-4 3′AGCTGTTACTC 5′ 上記の通りオリゴヌクレオチドI-3及びI-4は、互いに
相補的であり、これらがDNA断片《H》と正しく結合さ
れるときには、この結合領域で、制限酵素Sal Iによる
認識配列が新たに形成される。
相補的であり、これらがDNA断片《H》と正しく結合さ
れるときには、この結合領域で、制限酵素Sal Iによる
認識配列が新たに形成される。
上記で得た断片《H》、《I》及び《J》並びにオリ
ゴヌクレオチドI-3及びI-4の各々1μgを混合して、50
μlの反応溶液中にて、T4 DNAリガーゼを用いて連結さ
せた。次いでこの反応組成液で大腸菌JM103株を形質転
換させ、テトラサイクリン耐性を示す形質転換体を得
た。かくして得られた形質転換体から一株を選び、該株
からプラスミドpUGT150を単離した。
ゴヌクレオチドI-3及びI-4の各々1μgを混合して、50
μlの反応溶液中にて、T4 DNAリガーゼを用いて連結さ
せた。次いでこの反応組成液で大腸菌JM103株を形質転
換させ、テトラサイクリン耐性を示す形質転換体を得
た。かくして得られた形質転換体から一株を選び、該株
からプラスミドpUGT150を単離した。
該pUGT150は、1.0%アガロースゲル電気泳動の結果、
約3.9kbの大きさを有していた。またこのもののSal I、
Hind III等の制限酵素による切断パターンを調べた結
果、該pUGT150は、テトラサイクリン耐性遺伝子の他、p
UG201の有する情報単位、即ち、pDR540の有するtacプロ
モーター及びその下流のSD配列、pUG201の有するβ−ラ
クタマーゼのシグナルペプチドとβ−ウロガストロンと
が直接結合した融合ポリペプチドをコードするDNA塩基
配列及びβ−ラクタマーゼの転写終結信号がこの順序で
連結された情報単位を含むものであり、上記SD配列と融
合ポリペプチドをコードするDNA塩基配列との間には、S
al Iサイトを有することが確認された。
約3.9kbの大きさを有していた。またこのもののSal I、
Hind III等の制限酵素による切断パターンを調べた結
果、該pUGT150は、テトラサイクリン耐性遺伝子の他、p
UG201の有する情報単位、即ち、pDR540の有するtacプロ
モーター及びその下流のSD配列、pUG201の有するβ−ラ
クタマーゼのシグナルペプチドとβ−ウロガストロンと
が直接結合した融合ポリペプチドをコードするDNA塩基
配列及びβ−ラクタマーゼの転写終結信号がこの順序で
連結された情報単位を含むものであり、上記SD配列と融
合ポリペプチドをコードするDNA塩基配列との間には、S
al Iサイトを有することが確認された。
該pUGT150を保有する大腸菌JM103株は、「JM103〔pUG
T150〕」なる表示で、微工研菌寄第974号(FERM BP 97
4)として寄託されている。
T150〕」なる表示で、微工研菌寄第974号(FERM BP 97
4)として寄託されている。
(E)pUGT150Sの構築 この例に従うpUGT150S構築の概略図を第6図に示す。
pUGT150の5μgを、制限酵素Bgl II(宝酒造社製)
を用いて高塩濃度緩衝液中で切断した後、得られたDNA
断片を、DNAポリメラーゼIのクレノー断片(宝酒造社
製)によりブラントエンド化し、次に制限酵素EcoR Iを
用いて高塩濃度緩衝液中で切断した。次いで0.9%アガ
ロースゲル電気泳動を行ない、約3.24kbのDNA断片
《K》を得た。この断片には、テトラサイクリン耐性遺
伝子及びベクターの複製開始領域が含まれている。
を用いて高塩濃度緩衝液中で切断した後、得られたDNA
断片を、DNAポリメラーゼIのクレノー断片(宝酒造社
製)によりブラントエンド化し、次に制限酵素EcoR Iを
用いて高塩濃度緩衝液中で切断した。次いで0.9%アガ
ロースゲル電気泳動を行ない、約3.24kbのDNA断片
《K》を得た。この断片には、テトラサイクリン耐性遺
伝子及びベクターの複製開始領域が含まれている。
pUGT150の5μgを、EcoR I及びSal I(宝酒造社製)
を用いて高塩濃度緩衝液中で切断し、次いで5%ポリア
クリルアミドゲル電気泳動を行ない、約0.39kbのDNA断
片《L》を得た。この断片にはtacプロモーターが含ま
れている。
を用いて高塩濃度緩衝液中で切断し、次いで5%ポリア
クリルアミドゲル電気泳動を行ない、約0.39kbのDNA断
片《L》を得た。この断片にはtacプロモーターが含ま
れている。
pUGT150の32μgを、Bgl II及びSal Iを用いて高塩濃
度緩衝液中で切断し、次いで4%ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を行ない、約0.24kbのDNA断片を得た。更に
この断片を制限酵素Sau3A I(宝酒造社製)を用いて中
塩濃度緩衝液中で切断し、次いで6%ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を行なって、約0.21kbのDNA断片《M》
を得た。この断片にはpUGT150に含まれる情報単位のう
ち、シグナルペプチドとβ−ウロガストロンの融合ポリ
ペプチドをコードするDNA塩基配列のうちの3′末端部2
4塩基以外の部分が含まれている。
度緩衝液中で切断し、次いで4%ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を行ない、約0.24kbのDNA断片を得た。更に
この断片を制限酵素Sau3A I(宝酒造社製)を用いて中
塩濃度緩衝液中で切断し、次いで6%ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を行なって、約0.21kbのDNA断片《M》
を得た。この断片にはpUGT150に含まれる情報単位のう
ち、シグナルペプチドとβ−ウロガストロンの融合ポリ
ペプチドをコードするDNA塩基配列のうちの3′末端部2
4塩基以外の部分が含まれている。
以下に示すオリゴヌクレオチドDE1、DE2、DE3及びDE4
を固相リン酸トリエステル法に従い合成した。
を固相リン酸トリエステル法に従い合成した。
DE1 5′GATCTGAAATGGTGG 3 DE2 5′GAACTGCGCTAGGAGGACTCGA 3′ DE3 5′TAGCGCAGTTCCCACCATTTCA 3′ DE4 5′TCGAGTCCTCC 3′ 之等のオリゴヌクレオチドは、下式に示すように、互
いに相補的な2本鎖を形成するように設計されたもので
あり、これらが前記DNA断片《K》と正しく結合される
ときには、該個所において新たにXho Iサイトが形成さ
れる。
いに相補的な2本鎖を形成するように設計されたもので
あり、これらが前記DNA断片《K》と正しく結合される
ときには、該個所において新たにXho Iサイトが形成さ
れる。
上記DE2とDE3との5′末端を、各々T4ポリヌクレオチ
ドキナーゼ(宝酒造社製)を用いてリン酸化した。次い
で、リン酸化されたDE2及びDE3の各々1μgに、各々1
μgのDE1及びDE4を加え、T4 DNAリガーゼにより之等を
連結させた。次いで8%ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行ない、約0.04kbのDNA断片《N》を得た。このも
のは、β−ウロガストロンをコードするDNA塩基配列の
3′末端前後の部分に対応する配列を有している。
ドキナーゼ(宝酒造社製)を用いてリン酸化した。次い
で、リン酸化されたDE2及びDE3の各々1μgに、各々1
μgのDE1及びDE4を加え、T4 DNAリガーゼにより之等を
連結させた。次いで8%ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行ない、約0.04kbのDNA断片《N》を得た。このも
のは、β−ウロガストロンをコードするDNA塩基配列の
3′末端前後の部分に対応する配列を有している。
上記〜で得た4種のDNA断片《K》、《L》、
《M》及び《N》を混合し、T4 DNAリガーゼにより連結
させた。反応終了後、この反応組成液でJM103株を形質
転換し、得られるテトラサイクリン耐性の形質転換株の
うちから、一株を選び、プラスミドpUGT150Sを単離し
た。
《M》及び《N》を混合し、T4 DNAリガーゼにより連結
させた。反応終了後、この反応組成液でJM103株を形質
転換し、得られるテトラサイクリン耐性の形質転換株の
うちから、一株を選び、プラスミドpUGT150Sを単離し
た。
かくして得られたpUGT150Sは、1.0%アガロースゲル
電気泳動の結果、約3.9kbの大きさを有していた。またS
al I、Xho I(宝酒造社製)等の制限酵素による切断パ
ターンを調べた結果、これはpUGT150と同様に、テトラ
サイクリン耐性遺伝子の他に、tacプロモーター、SD配
列、β−ラクタマーゼのシグナルペプチドをコードする
DNA塩基配列、β−ウロガストロンをコードするDNA塩基
配列及び転写終結信号がこの順序で連結された情報単位
を含むものであることが確認された。
電気泳動の結果、約3.9kbの大きさを有していた。またS
al I、Xho I(宝酒造社製)等の制限酵素による切断パ
ターンを調べた結果、これはpUGT150と同様に、テトラ
サイクリン耐性遺伝子の他に、tacプロモーター、SD配
列、β−ラクタマーゼのシグナルペプチドをコードする
DNA塩基配列、β−ウロガストロンをコードするDNA塩基
配列及び転写終結信号がこの順序で連結された情報単位
を含むものであることが確認された。
上記で得られたpUGT150Sを保有する大腸菌JM103株
は、「JM103〔pUGT150S〕」なる表示で、微工研菌寄第9
75号(FERM FP975)として寄託されている。
は、「JM103〔pUGT150S〕」なる表示で、微工研菌寄第9
75号(FERM FP975)として寄託されている。
また該pUGT150Sの有するβ−ウロガストロンをコード
するDNA塩基配列は、M13法による分析の結果、下記第5
表に示す新規なものであることが確認された。
するDNA塩基配列は、M13法による分析の結果、下記第5
表に示す新規なものであることが確認された。
実施例1 本発明ベクターpUGT150S-2の構築 この例に従う本発明ベクターの構築の概略図を第7図
に示す。
に示す。
pUGT150Sの20μgを、制限酵素Xho II(ベーリンガー
マンハイム社製)を用いて低塩濃度緩衝液中で切断し、
次いでこれにより得られた断片をS1ヌクレアーゼを用い
てブラントエンド化した。
マンハイム社製)を用いて低塩濃度緩衝液中で切断し、
次いでこれにより得られた断片をS1ヌクレアーゼを用い
てブラントエンド化した。
上記ブラントエンド化断片を、制限酵素Pst Iを用い
て、高塩濃度緩衝塩中で切断し、次いで1.6%アガロー
スゲル電気泳動を行なって、約0.39kbのDNA断片《O》
を得た。
て、高塩濃度緩衝塩中で切断し、次いで1.6%アガロー
スゲル電気泳動を行なって、約0.39kbのDNA断片《O》
を得た。
この断片には転写終結信号が含まれている。
pUGT150Sの8μgを、制限酵素Pst I及びEcoR Iを用
いて高塩濃度緩衝液中で切断し、次いで1.6%アガロー
スゲル電気泳動を行ない、約0.91kbのDNA断片《P》を
得た。この断片にはtacプロモーター、SD配列及びシグ
ナルペプチドとβ−ウロガストロンとをコードするDNA
塩基配列が含まれている。
いて高塩濃度緩衝液中で切断し、次いで1.6%アガロー
スゲル電気泳動を行ない、約0.91kbのDNA断片《P》を
得た。この断片にはtacプロモーター、SD配列及びシグ
ナルペプチドとβ−ウロガストロンとをコードするDNA
塩基配列が含まれている。
上記及びで得た各DNA断片《O》及び《P》を混
合し、これをT4 DNAリガーゼで連結させた。次いで1.6
%アガロースゲル電気泳動を行なって約1.29kbのDNA断
片《Q》を得た。この断片はpUGT150Sの保有する前記情
報単位と同一の1個の完全な情報単位を含んでいる。
合し、これをT4 DNAリガーゼで連結させた。次いで1.6
%アガロースゲル電気泳動を行なって約1.29kbのDNA断
片《Q》を得た。この断片はpUGT150Sの保有する前記情
報単位と同一の1個の完全な情報単位を含んでいる。
pUGT150Sの6μgを、制限酵素Pst I及びEcoRV(NEB
社製)を用いて高塩濃度緩衝液中で切断し、次いで1.6
%アガロースゲル電気泳動を行ない、約0.72kbのDNA断
片《R》を得た。この断片もまた上記で得た断片と同
様に、tacプロモーター、SD配列及びシグナルペプチド
とβ−ウロガストロンとをコードするDNA塩基配列を含
んでいる。
社製)を用いて高塩濃度緩衝液中で切断し、次いで1.6
%アガロースゲル電気泳動を行ない、約0.72kbのDNA断
片《R》を得た。この断片もまた上記で得た断片と同
様に、tacプロモーター、SD配列及びシグナルペプチド
とβ−ウロガストロンとをコードするDNA塩基配列を含
んでいる。
pUGT150Sの2μgを、制限酵素Pst I及びEcoR Iを用
いて高塩濃度緩衝液中で切断し、次いで0.9%アガロー
スゲル電気泳動を行ない、約2.97kbのDNA断片《S》を
得た。この断片にはテトラサイクリン耐性遺伝子、ベク
ターの複製開始領域及び転写終結信号が含まれている。
いて高塩濃度緩衝液中で切断し、次いで0.9%アガロー
スゲル電気泳動を行ない、約2.97kbのDNA断片《S》を
得た。この断片にはテトラサイクリン耐性遺伝子、ベク
ターの複製開始領域及び転写終結信号が含まれている。
上記〜で得た各DNA断片《Q》、《R》及び
《S》を混合し、これらをT4 DNAリガーゼで連結させ
た。反応終了後、この反応組成液で大腸菌JM103株を形
質転換し、得られるテトラサイクリン耐性の形質転換株
の中から一株を選びプラスミドpUGT150S-2を単離した。
《S》を混合し、これらをT4 DNAリガーゼで連結させ
た。反応終了後、この反応組成液で大腸菌JM103株を形
質転換し、得られるテトラサイクリン耐性の形質転換株
の中から一株を選びプラスミドpUGT150S-2を単離した。
かくして得られたpUGT150S-2は、1.0%アガロースゲ
ル電気泳動の結果、約5.0kbの大きさを有していた。ま
たPst I、Sal I等の制限酵素による切断パターンを調べ
た結果、pUGT150S-2は、テトラサイクリン耐性遺伝子の
他に、tacプロモーター、SD配列、β−ラクタマーゼの
シグナルペプチドをコードするDNA塩基配列、β−ウロ
ガストロンをコードするDNA塩基配列及び転写終結信号
がこの順序で連結された情報単位の2組を含むものであ
ることが確認された。
ル電気泳動の結果、約5.0kbの大きさを有していた。ま
たPst I、Sal I等の制限酵素による切断パターンを調べ
た結果、pUGT150S-2は、テトラサイクリン耐性遺伝子の
他に、tacプロモーター、SD配列、β−ラクタマーゼの
シグナルペプチドをコードするDNA塩基配列、β−ウロ
ガストロンをコードするDNA塩基配列及び転写終結信号
がこの順序で連結された情報単位の2組を含むものであ
ることが確認された。
上記で得られたpUGT150S-2を保有する大腸菌JM103株
は、「JM103〔pUGT150S-2〕」なる表示で、微工研菌寄
第976号(FERM BP976)として寄託されている。
は、「JM103〔pUGT150S-2〕」なる表示で、微工研菌寄
第976号(FERM BP976)として寄託されている。
実施例2 本発明ベクターpUGT150S-3の構築 この例に従う本発明ベクターの構築の概略図を第8図
に示す。
に示す。
実施例1で得たpUGT150S-2の12μgを、制限酵素EcoR
Vを用いて高塩濃度緩衝液中で切断し、次いで制限酵素
Pst Iで部分切断した。即ち、Pst Iの6ユニツトを中塩
濃度緩衝液を含む反応液中に加え、37℃で30分間反応さ
せることにより、上記部分切断を行なった。次いでフエ
ノール抽出後、0.9%アガロースゲル電気泳動を行な
い、約1.82kbのDNA断片《T》を得た。
Vを用いて高塩濃度緩衝液中で切断し、次いで制限酵素
Pst Iで部分切断した。即ち、Pst Iの6ユニツトを中塩
濃度緩衝液を含む反応液中に加え、37℃で30分間反応さ
せることにより、上記部分切断を行なった。次いでフエ
ノール抽出後、0.9%アガロースゲル電気泳動を行な
い、約1.82kbのDNA断片《T》を得た。
この断片にはpUGT150Sの保有する前記情報単位と同一
の1個の完全な情報単位と、これに連結したもう1個の
情報単位であって転写終結信号部分を欠くものとが含ま
れている。
の1個の完全な情報単位と、これに連結したもう1個の
情報単位であって転写終結信号部分を欠くものとが含ま
れている。
実施例1の及びで得たDNA断片《Q》及び《S》
と上記で得たDNA断片《T》とを、T4 DNAリガーゼを
用いて連結させた。反応終了後、この反応組成液で大腸
菌JM103株を形質転換し、得られるテトラサイクリン耐
性の形質転換株の中から一株を選びプラスミドpUGT150S
-3を単離した。
と上記で得たDNA断片《T》とを、T4 DNAリガーゼを
用いて連結させた。反応終了後、この反応組成液で大腸
菌JM103株を形質転換し、得られるテトラサイクリン耐
性の形質転換株の中から一株を選びプラスミドpUGT150S
-3を単離した。
かくして得られたpUGT150S-3は、1.0%アガロースゲ
ル電気泳動の結果、約6.08kbの大きさを有していた。ま
たPst I、Sal I等の制限酵素による切断パターンを調べ
た結果、pUGT150S-3は、テトラサイクリン耐性遺伝子の
他に、tacプロモーター、SD配列、β−ラクタマーゼの
シグナルペプチドをコードするDNA塩基配列、β−ウロ
ガストロンをコードするDNA塩基配列及び転写終結信号
がこの順序で連結された情報単位の3組を含むものであ
ることが確認された。
ル電気泳動の結果、約6.08kbの大きさを有していた。ま
たPst I、Sal I等の制限酵素による切断パターンを調べ
た結果、pUGT150S-3は、テトラサイクリン耐性遺伝子の
他に、tacプロモーター、SD配列、β−ラクタマーゼの
シグナルペプチドをコードするDNA塩基配列、β−ウロ
ガストロンをコードするDNA塩基配列及び転写終結信号
がこの順序で連結された情報単位の3組を含むものであ
ることが確認された。
このpUGT150S-3を保有する大腸菌JM103株は、「JM103
〔pUGT150S-3〕」なる表示で、微工研菌寄第977号(FER
M BP977)として寄託されている。
〔pUGT150S-3〕」なる表示で、微工研菌寄第977号(FER
M BP977)として寄託されている。
実施例3 本発明ベクターpUGT150S-4の構築 この例に従う本発明ベクターの構築の概略図を第9図
に示す。
に示す。
実施例2で得たpUGT150S-3の2μgを、制限酵素EcoR
Vを用いて高塩濃度緩衝液中で切断し、次いで制限酵素
Eco52 I(宝酒造社製)を用いて、50mMの塩化ナトリウ
ムを添加した中塩濃度緩衝液中で切断した。次いで0.9
%アガロースゲル電気泳動を行ない、約4.95kbのDNA断
片《U》を得た。
Vを用いて高塩濃度緩衝液中で切断し、次いで制限酵素
Eco52 I(宝酒造社製)を用いて、50mMの塩化ナトリウ
ムを添加した中塩濃度緩衝液中で切断した。次いで0.9
%アガロースゲル電気泳動を行ない、約4.95kbのDNA断
片《U》を得た。
この断片には実施例2で得たpUGT150S-3と同一の、情
報単位の3組、テトラサイクリン耐性遺伝子の後半部及
びベクターの複製開始領域が含まれている。
報単位の3組、テトラサイクリン耐性遺伝子の後半部及
びベクターの複製開始領域が含まれている。
pBR322の6μgをEcoR Iを用いて高塩濃度緩衝液中で
切断し、次いで制限酵素Eco52 Iを用いて、50mMの塩化
ナトリウムを添加した中塩濃度緩衝液中で切断した。こ
れにより1.6%アガロースゲル電気泳動の結果、約0.94k
bのDNA断片《V》を得た。この断片には、テトラサイク
リン耐性遺伝子の前半部が含まれている。
切断し、次いで制限酵素Eco52 Iを用いて、50mMの塩化
ナトリウムを添加した中塩濃度緩衝液中で切断した。こ
れにより1.6%アガロースゲル電気泳動の結果、約0.94k
bのDNA断片《V》を得た。この断片には、テトラサイク
リン耐性遺伝子の前半部が含まれている。
実施例1ので得たDNA断片《Q》と、上記及び
で得たDNA断片《U》及び《V》とを、T4 DNAリガーゼ
により連結させた。反応終了後、この反応組成液で大腸
菌JM103株を形質転換し、得られるテトラサイクリン耐
性の形質転換株の中から一株を選びプラスミドpUGT150S
-4を単離した。
で得たDNA断片《U》及び《V》とを、T4 DNAリガーゼ
により連結させた。反応終了後、この反応組成液で大腸
菌JM103株を形質転換し、得られるテトラサイクリン耐
性の形質転換株の中から一株を選びプラスミドpUGT150S
-4を単離した。
かくして得られたpUGT150S-4は、1.0%アガロースゲ
ル電気泳動の結果、約7.18kbの大きさを有していた。ま
たPst I、Sal I等の制限酵素による切断パターンを調べ
た結果、pUGT150S-4は、テトラサイクリン耐性遺伝子の
他に、tacプロモーター、SD配列、β−ラクタマーゼの
シグナルペプチドをコードするDNA塩基配列、β−ウロ
ガストロンをコードするDNA塩基配列及び転写終結信号
がこの順序で連結された情報単位の4組を含むものであ
ることが確認された。
ル電気泳動の結果、約7.18kbの大きさを有していた。ま
たPst I、Sal I等の制限酵素による切断パターンを調べ
た結果、pUGT150S-4は、テトラサイクリン耐性遺伝子の
他に、tacプロモーター、SD配列、β−ラクタマーゼの
シグナルペプチドをコードするDNA塩基配列、β−ウロ
ガストロンをコードするDNA塩基配列及び転写終結信号
がこの順序で連結された情報単位の4組を含むものであ
ることが確認された。
このpUGT150S-4を保有する大腸菌JM103株は、「JM103
〔pUGT150S-4〕」なる表示で、微工研菌寄第978号(FER
M BP978)として寄託されている。
〔pUGT150S-4〕」なる表示で、微工研菌寄第978号(FER
M BP978)として寄託されている。
〈目的ポリペプチドの製造〉 (A)pUGT201、pUGT150及びpUGT150Sによるβ−ウロガ
ストロンの分泌発現 菌の培養 参考例1 II)の(C)、(D)及び(E)の各々で得
た各ベクターを保有する大腸菌JM103株を、以下の通り
培養した。
ストロンの分泌発現 菌の培養 参考例1 II)の(C)、(D)及び(E)の各々で得
た各ベクターを保有する大腸菌JM103株を、以下の通り
培養した。
培地としては、グルコース、カザミノ酸、プロリン、
サイアミン、及びテトラサイクリンを添加したM9培地を
用いた。その組成は下記の通りである。
サイアミン、及びテトラサイクリンを添加したM9培地を
用いた。その組成は下記の通りである。
リン酸二ナトリウム・12水塩 13.4g リン酸−カリウム 3.0g 塩化ナトリウム 0.5g 塩化アンモニウム 1.0g 塩化カルシウム・2水塩 14.7mg 塩化マグネシウム・6水塩 203mg グルコース 5.0g カザミノ酸 5.0g L−プロリン 50mg サイアミン・塩酸塩 1mg テトラサイクリン 15mg 1 上記培地200mlを含むフラスコに菌を接種して、37℃
にて振盪培養を行なった。培養開始4時間後に、IPTGを
1mMとなるように添加して培養を継続し、その1、3、
5及び20時間後に、一定量(10ml)を採取して、610nm
での吸光度を測定し、次いで遠心分離(6000回転/分×
10分、4℃)により、菌体と培養上澄とを分離した。得
られた培養上澄を菌体外画分とする。
にて振盪培養を行なった。培養開始4時間後に、IPTGを
1mMとなるように添加して培養を継続し、その1、3、
5及び20時間後に、一定量(10ml)を採取して、610nm
での吸光度を測定し、次いで遠心分離(6000回転/分×
10分、4℃)により、菌体と培養上澄とを分離した。得
られた培養上澄を菌体外画分とする。
また菌体を、PBS(150mM塩化ナトリウムを含む20mMリ
ン酸ナトリウム、pH7.0)10mlに懸濁させ、超音波破砕
機(大岳製作所製5202型)を用いて出力100Wにて、30秒
ずつ3回破砕処理し、遠心分離(18000回転/分×20
分、4℃)として上澄を得た。これを菌体内画分とす
る。
ン酸ナトリウム、pH7.0)10mlに懸濁させ、超音波破砕
機(大岳製作所製5202型)を用いて出力100Wにて、30秒
ずつ3回破砕処理し、遠心分離(18000回転/分×20
分、4℃)として上澄を得た。これを菌体内画分とす
る。
RIAによるβ−ウロガストロンの測定 上記で得たそれぞれの画分につき、以下の通りβ−
ウロガストロンの存在を、β−ウロガストロン特異ラジ
オイムノアツセイ(RIA)により検討した。RIAの方法は
次の通りである。即ち、精製ヒトβ−ウロガストロンを
抗原として、家兎を免疫し抗血清を作成した。即ち、β
−ウロガストロン300μgを蒸留水0.2mlに溶解後、50%
ポリビニルピロリドン液1.5mlを加え室温で2時間攪拌
した。コンプリート・フロインド・アジユバント2.0ml
を加えて乳化し、家兎3匹の胸部に皮下注射した。2週
間毎に免疫を4回くり返した後、さらに50μgの抗原を
静注し、3日後に全採血を行ない、血清を分離した。
ウロガストロンの存在を、β−ウロガストロン特異ラジ
オイムノアツセイ(RIA)により検討した。RIAの方法は
次の通りである。即ち、精製ヒトβ−ウロガストロンを
抗原として、家兎を免疫し抗血清を作成した。即ち、β
−ウロガストロン300μgを蒸留水0.2mlに溶解後、50%
ポリビニルピロリドン液1.5mlを加え室温で2時間攪拌
した。コンプリート・フロインド・アジユバント2.0ml
を加えて乳化し、家兎3匹の胸部に皮下注射した。2週
間毎に免疫を4回くり返した後、さらに50μgの抗原を
静注し、3日後に全採血を行ない、血清を分離した。
次にアツセイに用いる抗血清の希釈倍率を求めるタイ
トレーシヨンカーブ、アツセイ条件を最適化するためイ
ンキユベーシヨン時間、抗体結合標識抗原(バウンド)
と遊離標識抗原(フリー)の分離方法等の検討を加え、
下記測定条件を設定した。
トレーシヨンカーブ、アツセイ条件を最適化するためイ
ンキユベーシヨン時間、抗体結合標識抗原(バウンド)
と遊離標識抗原(フリー)の分離方法等の検討を加え、
下記測定条件を設定した。
即ち、0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)、140mM塩化
ナトリウム、25mM EDTA二ナトリウムを含む10mMリン酸
緩衝液(pH7.4)を希釈液として用い、該希釈液400μ
l、測定試料又は標準ヒトβ−ウロガストロン100μl
及び抗ヒトβ−ウロガストロン血清100μlを加えて4
℃にて24時間インキユベートした後、125I標識ヒトβ−
ウロガストロン100μl(約5000cpm)を加えた。更に4
℃にて48時間インキユベートした後、第2抗体(抗家兎
γ−グロブリンヤギ血清)(1:20)100μl、正常家兎
血清(1:200)100μl及び5%ポリエチレングリコール
を含む10mM PBS液900μlを加えて4℃にて3時間イン
キユベートした。次に3000回転/分で30分間遠心分離
し、上清を除き沈澱物をカウントした。標準ヒトβ−ウ
ロガストロンより得られた標準曲線より試料中のヒトβ
−フロガストロン免疫活性物の含量を求めた。
ナトリウム、25mM EDTA二ナトリウムを含む10mMリン酸
緩衝液(pH7.4)を希釈液として用い、該希釈液400μ
l、測定試料又は標準ヒトβ−ウロガストロン100μl
及び抗ヒトβ−ウロガストロン血清100μlを加えて4
℃にて24時間インキユベートした後、125I標識ヒトβ−
ウロガストロン100μl(約5000cpm)を加えた。更に4
℃にて48時間インキユベートした後、第2抗体(抗家兎
γ−グロブリンヤギ血清)(1:20)100μl、正常家兎
血清(1:200)100μl及び5%ポリエチレングリコール
を含む10mM PBS液900μlを加えて4℃にて3時間イン
キユベートした。次に3000回転/分で30分間遠心分離
し、上清を除き沈澱物をカウントした。標準ヒトβ−ウ
ロガストロンより得られた標準曲線より試料中のヒトβ
−フロガストロン免疫活性物の含量を求めた。
上記RIAの結果を第10図及び第6表に示す。図におい
て横軸は培養時間(hr)を示し、縦軸はグラフ(1)で
示される菌体外β−ウロガストロン量(mg/l)、グラフ
(2)で示される菌体内β−ウロガストロン量(mg/l)
及びグラフ(3)で示される610nmにおける吸光度(O
D)を各々示す。尚、各図においてはIPTG添加時期を白
矢印で示す。
て横軸は培養時間(hr)を示し、縦軸はグラフ(1)で
示される菌体外β−ウロガストロン量(mg/l)、グラフ
(2)で示される菌体内β−ウロガストロン量(mg/l)
及びグラフ(3)で示される610nmにおける吸光度(O
D)を各々示す。尚、各図においてはIPTG添加時期を白
矢印で示す。
また第6表においては、菌体内及び菌体外β−ウロガ
ストロン量の合計量(μg/l)を示す。
ストロン量の合計量(μg/l)を示す。
第10図及び第6表より、pUGT150及びpUGT150Sを保有
する菌株は、IPTG添加の後1時間以内に、β−ウロガス
トロンの分泌発現がはじまり、その発現量は、pUG201を
保有する菌株のそれを大きく上回ることが確認できる。
また之等の菌株ではIPTG添加により菌の増殖が実質的に
停止し、それに伴って著量のβ−ウロガストロンが菌体
外に排出されることが確認される。更にpUGT150S株はpU
GT150株に比べて、多量のβ−ウロガストロンを分泌発
現し、特に菌体外において、その差が顕著であることも
確認された。尚上記両株は、これらをIPTG無添加の系で
培養したときには、菌体内及び菌体外のいずれにおいて
もβ−ウロガストロンは検出されなかった。
する菌株は、IPTG添加の後1時間以内に、β−ウロガス
トロンの分泌発現がはじまり、その発現量は、pUG201を
保有する菌株のそれを大きく上回ることが確認できる。
また之等の菌株ではIPTG添加により菌の増殖が実質的に
停止し、それに伴って著量のβ−ウロガストロンが菌体
外に排出されることが確認される。更にpUGT150S株はpU
GT150株に比べて、多量のβ−ウロガストロンを分泌発
現し、特に菌体外において、その差が顕著であることも
確認された。尚上記両株は、これらをIPTG無添加の系で
培養したときには、菌体内及び菌体外のいずれにおいて
もβ−ウロガストロンは検出されなかった。
(B)pUGT150を保有する菌株によるβ−ウロガストロ
ンの分泌発現 菌の培養 ベクターpUGT150を保有する大腸菌HB101株を、上記
(A)のに示した組成のM9培地に更に50mg/lのL−ロ
イシンを添加した培地200mlを入れたフラスコ内で、37
℃にて振盪培養した。
ンの分泌発現 菌の培養 ベクターpUGT150を保有する大腸菌HB101株を、上記
(A)のに示した組成のM9培地に更に50mg/lのL−ロ
イシンを添加した培地200mlを入れたフラスコ内で、37
℃にて振盪培養した。
培養開始5、6.5、8及び24時間目に、培養液の一定
量(10ml)を採取し、各々の610mでの吸光度を測定し
た。また前記(A)と同様にして菌体内画分と菌体外画
分とを分離し、之等の各々についてに示す方法に従い
β−ウロガストロン量を測定した。
量(10ml)を採取し、各々の610mでの吸光度を測定し
た。また前記(A)と同様にして菌体内画分と菌体外画
分とを分離し、之等の各々についてに示す方法に従い
β−ウロガストロン量を測定した。
結果を、第10図と同様にして第11図に示す。
第11図より、この培養においてはIPTGを添加しなかっ
たにもかかわらず、著量のβ−ウロガストロンが菌体内
及び菌体外に生成することが確認できた。また菌体外で
のβ−ウロガストロンの生成は、菌の増殖がほぼ停止し
た6.5〜8時間目にかけて顕著であることが判る。
たにもかかわらず、著量のβ−ウロガストロンが菌体内
及び菌体外に生成することが確認できた。また菌体外で
のβ−ウロガストロンの生成は、菌の増殖がほぼ停止し
た6.5〜8時間目にかけて顕著であることが判る。
(C)pUGT150S、pUGT150S-2、pUGT150S-3及びpUGT150S
-4を保有する菌株によるβ−ウロガストロンの分泌発現 菌の培養 上記各ベクターを保有する大腸菌JM103株の各々を、
前記(A)で用いたと同一組成の培地200mlを入れた
フラスコ内に接種して、37℃にて振盪培養した。
-4を保有する菌株によるβ−ウロガストロンの分泌発現 菌の培養 上記各ベクターを保有する大腸菌JM103株の各々を、
前記(A)で用いたと同一組成の培地200mlを入れた
フラスコ内に接種して、37℃にて振盪培養した。
培養開始4.5〜5時間目に、フラスコ内にIPTGを1mM濃
度となるように添加して培養を継続し、経時的に培養液
の一定量(10ml)を採取し、610nmでの吸光度を測定し
た。
度となるように添加して培養を継続し、経時的に培養液
の一定量(10ml)を採取し、610nmでの吸光度を測定し
た。
また、前記(A)と同様にして菌体内画分と菌体外画
分とを分離し、それらの各々について、同様にしてβ−
ウロガストロン量を測定した。
分とを分離し、それらの各々について、同様にしてβ−
ウロガストロン量を測定した。
結果を同様にして第12図及び第7表に示す。尚、第7
表では菌体内及び菌体外画分のβ−ウロガストロン量の
合計量(μg/l)を示す。
表では菌体内及び菌体外画分のβ−ウロガストロン量の
合計量(μg/l)を示す。
第12図及び第7表より、この試験で用いた各菌株は、
いずれもIPTG添加により、1〜1.5時間後には、菌の増
殖が停止すると共に、菌体内に著量のβ−ウロガストロ
ンを生成し、更に時間の経過に従って菌体外に著量のβ
−ウロガストロンを生成することが確認できる。
いずれもIPTG添加により、1〜1.5時間後には、菌の増
殖が停止すると共に、菌体内に著量のβ−ウロガストロ
ンを生成し、更に時間の経過に従って菌体外に著量のβ
−ウロガストロンを生成することが確認できる。
また、各々の菌株における菌体内及び菌体外β−ウロ
ガストロン合計量の最大値を比較すると、pUGT150S株が
816μg/lであるのに対し、pUGT150S-2株では1604μg/
l、pUGT150S-3株では、2240μg/l及びpUGT150S-4株で
は、1920μg/lであり、之等は各々pUGT150S株の約2
倍、約3倍及び約2.5倍の値であることが判る。
ガストロン合計量の最大値を比較すると、pUGT150S株が
816μg/lであるのに対し、pUGT150S-2株では1604μg/
l、pUGT150S-3株では、2240μg/l及びpUGT150S-4株で
は、1920μg/lであり、之等は各々pUGT150S株の約2
倍、約3倍及び約2.5倍の値であることが判る。
(D)β−ウロガストロンの精製及び確認 上記(A)〜(C)で得られた菌体内(ペリプラズム
内)乃至菌体外画分中のβ−ウロガストロン免疫活性物
質を、精製してβ−ウロガストロンの確認を行なった。
内)乃至菌体外画分中のβ−ウロガストロン免疫活性物
質を、精製してβ−ウロガストロンの確認を行なった。
その例として、上記(C)で用いた菌株のうちpUGT15
0S-2を保有するJM103株につき、これを24時間培養後得
られる培養液20lから、オスモテイツクシヨツク法によ
り抽出したペリプラズム画分からの精製及び確認を以下
に詳述する。
0S-2を保有するJM103株につき、これを24時間培養後得
られる培養液20lから、オスモテイツクシヨツク法によ
り抽出したペリプラズム画分からの精製及び確認を以下
に詳述する。
ヘリプラズム画分中のβ−ウロガストロン免疫活性物
質を、ブチルトヨパール650C(東洋曹達社製)を用いた
吸着クロマトグラフイー、DEAE−トヨパール650M(同上
社製)を用いた陰イオン交換クロマトグラフイー、CM−
トヨパール650M(同上社製)を用いた陽イオン交換クロ
マトグラフイー及びセフアデツクスG-25(フアルマシア
社製)を用いたゲル過クロマトグラフイー操作を順次
行なうにより分画精製し、純度99%以上の単一のポリペ
プチド134mgを得た。
質を、ブチルトヨパール650C(東洋曹達社製)を用いた
吸着クロマトグラフイー、DEAE−トヨパール650M(同上
社製)を用いた陰イオン交換クロマトグラフイー、CM−
トヨパール650M(同上社製)を用いた陽イオン交換クロ
マトグラフイー及びセフアデツクスG-25(フアルマシア
社製)を用いたゲル過クロマトグラフイー操作を順次
行なうにより分画精製し、純度99%以上の単一のポリペ
プチド134mgを得た。
得られたポリペプチドとヒト尿より単離精製された天
然β−ウロガストロン(日本ケミカルリサーチ社製)の
逆相高速液体クロマトグラフイーによる溶出パターンを
第13図に示す。該第13図はTSKゲル−ODS-120Tカラム
(東洋曹達社製)を用いて、22%アセトニトリルを含む
50mMリン酸緩衝液(pH7.0)により、毎分1.0mlの流速で
溶出させた結果であり、図におい縦軸は280nmでの吸光
度及び横軸はリテンシヨンタイム(分)を示し、(1)
は本発明に係わる上記ポリペプチドの結果及び(2)は
天然β−ウロガストロンの結果である。
然β−ウロガストロン(日本ケミカルリサーチ社製)の
逆相高速液体クロマトグラフイーによる溶出パターンを
第13図に示す。該第13図はTSKゲル−ODS-120Tカラム
(東洋曹達社製)を用いて、22%アセトニトリルを含む
50mMリン酸緩衝液(pH7.0)により、毎分1.0mlの流速で
溶出させた結果であり、図におい縦軸は280nmでの吸光
度及び横軸はリテンシヨンタイム(分)を示し、(1)
は本発明に係わる上記ポリペプチドの結果及び(2)は
天然β−ウロガストロンの結果である。
該図より両者のリテンシヨンタイムは完全に一致して
いることが判る。
いることが判る。
また、上記で得たポリペプチドを、4Mメタンスルホン
酸により加水分解し、日立アミノ酸分析機モデル835型
を用いた、オルトフタルアルデヒド法により求めたアミ
ノ酸分析結果を下記第8表に示す。
酸により加水分解し、日立アミノ酸分析機モデル835型
を用いた、オルトフタルアルデヒド法により求めたアミ
ノ酸分析結果を下記第8表に示す。
第 8 表 アミノ酸 実測残基数 理論残基数 Asx 7.1 7 Thr 検出されず 0 Ser 2.5 3 Glx 5.0 5 Pro − 1 Gly 4.0 4 Ala 2.0 2 1/2Cys − 6 Val 2.5 3 Met 0.9 1 Ile 1.9 2 Leu 4.9 5 Tyr 4.9 5 Phe 検出されず 0 Lys 2.0 2 His 2.1 2 Trp 2.3 2 Arg 2.9 3 該表より、実測残基数は理論残基数とよく一致している
ことが判る。
ことが判る。
更に、上記で得たポリペプチドの細胞増殖促進活性の
確認試験を以下の通り行なった。
確認試験を以下の通り行なった。
この試験は、中村らの方法〔J.Biochem.,94(1983)1
029-1035〕に従い、成熟ラツトの初代培養肝細胞による
〔3H〕−チミジンの高分子DNAへの取り込みを測定する
ことにより行なわれた。
029-1035〕に従い、成熟ラツトの初代培養肝細胞による
〔3H〕−チミジンの高分子DNAへの取り込みを測定する
ことにより行なわれた。
結果を第14図に示す。図中(1)は本発明により得ら
れたポリペプチドの結果であり、(2)は同様の活性を
有することが知られているマウスEGF(コラボレイテイ
ブリサーチ社製)につき同一試験を行なった結果であ
る。
れたポリペプチドの結果であり、(2)は同様の活性を
有することが知られているマウスEGF(コラボレイテイ
ブリサーチ社製)につき同一試験を行なった結果であ
る。
上記図より、本発明に係わるポリペプチドはマウスEG
Fよりも強い細胞増殖促進活性を示すことが明らかであ
る。
Fよりも強い細胞増殖促進活性を示すことが明らかであ
る。
尚、上記以外にもポリアクリルアミドゲル電気泳動、
アミノ酸配列分析、新生マウスの早期眼瞼開裂活性試験
等を行なった結果、それらのいずれにおいても本発明ポ
リペプチドは、天然β−ウロガストロンに一致すること
が認められた。
アミノ酸配列分析、新生マウスの早期眼瞼開裂活性試験
等を行なった結果、それらのいずれにおいても本発明ポ
リペプチドは、天然β−ウロガストロンに一致すること
が認められた。
また、上記pUGT150S-2を保有するJM103株を24時間培
養後、遠心分離(6000回転/分×10分、4℃)して得ら
れる培養上澄を菌体外画分とし、更に上記遠心分離後の
菌体を洗浄緩衝液(30mM塩化ナトリウムを含む10mMトリ
ス塩酸、pH8.0)で洗浄後、PBS(150mM塩化ナトリウム
を含む20mMリン酸ナトリウム、pH7.0)に懸濁させ、超
音波破砕機(大岳製作所製5202型)にて100Wにで30秒ず
つ3回粉砕処理後、遠心分離(18000回転/分×20分、
4℃)して得られる上澄を菌体内画分とし、之等の各々
につき上記と同一の精製及び確認試験を行なった。
養後、遠心分離(6000回転/分×10分、4℃)して得ら
れる培養上澄を菌体外画分とし、更に上記遠心分離後の
菌体を洗浄緩衝液(30mM塩化ナトリウムを含む10mMトリ
ス塩酸、pH8.0)で洗浄後、PBS(150mM塩化ナトリウム
を含む20mMリン酸ナトリウム、pH7.0)に懸濁させ、超
音波破砕機(大岳製作所製5202型)にて100Wにで30秒ず
つ3回粉砕処理後、遠心分離(18000回転/分×20分、
4℃)して得られる上澄を菌体内画分とし、之等の各々
につき上記と同一の精製及び確認試験を行なった。
更に上記(C)で用いたpUGT150S-2を保有するJM103
株以外の菌株の菌体内画分、ペリプラズム画分及び菌体
外画分についても同様の精製及び確認を行なった。
株以外の菌株の菌体内画分、ペリプラズム画分及び菌体
外画分についても同様の精製及び確認を行なった。
その結果、いずれの菌株を培養する場合も各画分の生
成物は、β−ウロガストロンであることが確認された。
成物は、β−ウロガストロンであることが確認された。
第1図は起源ベクターpBR322に合成オリゴヌクレオチド
〈1〉、〈2〉、〈3〉及び〈4〉をクローニングして
プラスミドpGH53を得る工程及びこれにより得られるpGH
53の特徴を示す図であり、図中 は合成オリゴヌクレオチド由来の塩基配列を示してい
る。また図中、Aprはアンピシリン耐性遺伝子を、Tcrは
テトラサイクリン耐性遺伝子を各々示し、以下の図にお
いても同じである。 第2図はpGH53とpBR322とからβ−ウロガストロン発
現用ベクターpGH54を得る工程及び得られたベクターpGH
54の特性を示す図であり、図中 はシグナルペプチドをコードする塩基配列を示す。また
図において(F)は、Fnn4H Iサイトを示し、この括弧
を付して示した制限酵素サイトは、ベクター上に複数個
存在する該制限酵素サイトのうちの該当するサイトを示
すものであり、以下の図でも同様とする。 第3図はpBR322からpBRH02を得、該pBRH02とpGH54と
からβ−ウロガストロン発現用ベクターpGH55を得る工
程及び得られるpGH55の特性を示す図である。 第4図はpGH55とpUG3とからシグナルペプチドとβ−
ウロガストロンとの融合ポリペプチドをコードするDNA
塩基配列を含むベクターpUG201を得る工程及び得られる
ベクターpUG201の特性を示す図であり、図中白ヌキの矢
印はβ−ウロガストロンをコードするDNA塩基配列を示
す。 第5図はpUG201、pDR540並びにオリゴヌクレオチドI
−3及びI−4からpUGT150を得る工程及び得られるpUG
T150の特性を示す図である。図中黒塗の矢印はβ−ラク
タマーゼのプロモーターを、斜線を入れた矢印はtacプ
ロモーターを示し、またOriは複製開始領域を示し、之
等は以下の図でも同様とする。 第6図はpUGT150とオリゴヌクレオチドDE1、DE2、DE3
及びDE4とからpUGT150Sを得る工程及び得られるベクタ
ーの特性を示す図であり、各オリゴヌクレオチドにおい
て白丸はリン酸化されていない5′末端を、黒丸はリン
酸化された5′末端を示す。 第7図はpUGT150SからpUGT150S-2を得る工程及び得ら
れるベクターの特性を示す図であり、白抜きの矢印は、
tacプロモーター、SD配列、β−ラクタマーゼのシグナ
ルペプチドをコードするDNA塩基配列、β−ウロガスト
ロンをコードするDNA塩基配列及び転写終結信号がこの
順序で連結された情報単位を示す。 第8図はpUGT150S-2とDNA断片《Q》及び《S》とか
らpUGT150S-3を得る工程及び得られるベクターの特性を
示す図である。 第9図はpUGT150S-3、pBR322及びDNA断片《Q》からp
UGT150S-4を得る工程及び得られるベクターの特性を示
す図である。 第10図はpUG201、pUGT150及びpUGT150Sを夫々保有す
るJM103株の培養による菌体内及び菌体外β−ウロガス
トロン生産量を示すグラフである。 第11図はpUGT150を保有するHB101株の培養による菌体
内及び菌体外β−ウロガストロン生産量を示すグラフで
ある。 第12図はpUGT150S、pUGT150S-2、pUGT150S-3及びpUGT
150S-4を夫々保有するJM103株の培養による菌体内及び
菌体外β−ウロガストロン生産量を示すグラフである。 第13図は菌体内(ペリプラズム画分)より精製したβ
−ウロガストロン及び天然型β−ウロガストロンの逆相
高速液体クロマトグラフイーによる溶出パターンを示
す。 第14図はペリプラズム画分より精製したβ−ウロガス
トロン及びマウスEGFにより、成熟ラツトの初代培養肝
細胞の高分子DNAへの〔3H〕−チミジン取り込みが促進
されることを示すグラフである。
〈1〉、〈2〉、〈3〉及び〈4〉をクローニングして
プラスミドpGH53を得る工程及びこれにより得られるpGH
53の特徴を示す図であり、図中 は合成オリゴヌクレオチド由来の塩基配列を示してい
る。また図中、Aprはアンピシリン耐性遺伝子を、Tcrは
テトラサイクリン耐性遺伝子を各々示し、以下の図にお
いても同じである。 第2図はpGH53とpBR322とからβ−ウロガストロン発
現用ベクターpGH54を得る工程及び得られたベクターpGH
54の特性を示す図であり、図中 はシグナルペプチドをコードする塩基配列を示す。また
図において(F)は、Fnn4H Iサイトを示し、この括弧
を付して示した制限酵素サイトは、ベクター上に複数個
存在する該制限酵素サイトのうちの該当するサイトを示
すものであり、以下の図でも同様とする。 第3図はpBR322からpBRH02を得、該pBRH02とpGH54と
からβ−ウロガストロン発現用ベクターpGH55を得る工
程及び得られるpGH55の特性を示す図である。 第4図はpGH55とpUG3とからシグナルペプチドとβ−
ウロガストロンとの融合ポリペプチドをコードするDNA
塩基配列を含むベクターpUG201を得る工程及び得られる
ベクターpUG201の特性を示す図であり、図中白ヌキの矢
印はβ−ウロガストロンをコードするDNA塩基配列を示
す。 第5図はpUG201、pDR540並びにオリゴヌクレオチドI
−3及びI−4からpUGT150を得る工程及び得られるpUG
T150の特性を示す図である。図中黒塗の矢印はβ−ラク
タマーゼのプロモーターを、斜線を入れた矢印はtacプ
ロモーターを示し、またOriは複製開始領域を示し、之
等は以下の図でも同様とする。 第6図はpUGT150とオリゴヌクレオチドDE1、DE2、DE3
及びDE4とからpUGT150Sを得る工程及び得られるベクタ
ーの特性を示す図であり、各オリゴヌクレオチドにおい
て白丸はリン酸化されていない5′末端を、黒丸はリン
酸化された5′末端を示す。 第7図はpUGT150SからpUGT150S-2を得る工程及び得ら
れるベクターの特性を示す図であり、白抜きの矢印は、
tacプロモーター、SD配列、β−ラクタマーゼのシグナ
ルペプチドをコードするDNA塩基配列、β−ウロガスト
ロンをコードするDNA塩基配列及び転写終結信号がこの
順序で連結された情報単位を示す。 第8図はpUGT150S-2とDNA断片《Q》及び《S》とか
らpUGT150S-3を得る工程及び得られるベクターの特性を
示す図である。 第9図はpUGT150S-3、pBR322及びDNA断片《Q》からp
UGT150S-4を得る工程及び得られるベクターの特性を示
す図である。 第10図はpUG201、pUGT150及びpUGT150Sを夫々保有す
るJM103株の培養による菌体内及び菌体外β−ウロガス
トロン生産量を示すグラフである。 第11図はpUGT150を保有するHB101株の培養による菌体
内及び菌体外β−ウロガストロン生産量を示すグラフで
ある。 第12図はpUGT150S、pUGT150S-2、pUGT150S-3及びpUGT
150S-4を夫々保有するJM103株の培養による菌体内及び
菌体外β−ウロガストロン生産量を示すグラフである。 第13図は菌体内(ペリプラズム画分)より精製したβ
−ウロガストロン及び天然型β−ウロガストロンの逆相
高速液体クロマトグラフイーによる溶出パターンを示
す。 第14図はペリプラズム画分より精製したβ−ウロガス
トロン及びマウスEGFにより、成熟ラツトの初代培養肝
細胞の高分子DNAへの〔3H〕−チミジン取り込みが促進
されることを示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 (C12P 21/02 C12R 1:19) 審判番号 平7−121 (72)発明者 小出 隆生 静岡市大谷3697−1 大村ハイツ2F− 5号 (72)発明者 百田 裕 赤穂市坂越3218−12 (56)参考文献 欧州特許出願公開170266 Molecular & Gener al Genetics Vol.168, No.2(1979)P.173−184
Claims (1)
- 【請求項1】プロモーター、リボゾーム結合部位、開始
コドンと停止コドンと外来ポリペプチドのN末端にシグ
ナルペプチドを連結された融合ポリペプチドをコードす
るDNA塩基配列とを含む構造遺伝子、及び転写終結信号
を、この順序で連結した情報単位の複数個を含む菌体外
排出用ポリペプチド発現ベクターで形質転換された大腸
菌を培養し、菌体外に排出されるポリペプチドを採取す
ることを特徴とするポリペリチドの製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61031415A JP2574146B2 (ja) | 1986-02-14 | 1986-02-14 | ポリペプチド発現ベクタ−、該ベクタ−で形質転換した宿主及び該宿主によるポリペプチドの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61031415A JP2574146B2 (ja) | 1986-02-14 | 1986-02-14 | ポリペプチド発現ベクタ−、該ベクタ−で形質転換した宿主及び該宿主によるポリペプチドの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS62190083A JPS62190083A (ja) | 1987-08-20 |
JP2574146B2 true JP2574146B2 (ja) | 1997-01-22 |
Family
ID=12330623
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61031415A Expired - Fee Related JP2574146B2 (ja) | 1986-02-14 | 1986-02-14 | ポリペプチド発現ベクタ−、該ベクタ−で形質転換した宿主及び該宿主によるポリペプチドの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2574146B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2561674B2 (ja) * | 1987-10-06 | 1996-12-11 | 三菱化学株式会社 | 蛋白質の産生方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0170266B1 (en) * | 1984-07-30 | 1993-03-24 | Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha | Process for producing protein, and vector, recombinant dna and transformant used therefor |
-
1986
- 1986-02-14 JP JP61031415A patent/JP2574146B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Molecular & General Genetics Vol.168,No.2(1979)P.173−184 |
欧州特許出願公開170266 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS62190083A (ja) | 1987-08-20 |
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